CN102732553A

CN102732553A - 提高植物产量的基因工程方法及材料

Info

Publication number: CN102732553A
Application number: CN2012100941133A
Authority: CN
Inventors: 陈晓亚; 徐冰; 林芝萍; 王凌健; 上官小霞; 单淳敏
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2011-03-31
Filing date: 2012-03-31
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2032-03-31
Also published as: WO2012130174A1; BR112013025239A2; AU2016200894A1; EP2692866A1; AR085832A1; ZA201307758B; US20150203863A1; AU2012237785A1; CN102732553B; CA2831829A1; MX2013011188A; EP2692866A4

Abstract

本发明涉及提高植物产量的基因工程方法及材料。公开了上调EXPA1基因表达或EXPA1多肽的活性或共表达GhRDL1和GhEXPA1基因可以改良植物的性状，在农作物和花卉生产中具有应用价值。

Description

提高植物产量的基因工程方法及材料

技术领域

本发明属于植物生物工程和植物改良基因工程领域。具体地说，本发明涉及提高植物产量的基因工程方法及材料。

背景技术

棉花是一种重要的经济作物，棉纤维是纺织工业重要的原材料。最近3年，世界棉花产量连年降低，2009年全年世界共生产2190万吨棉花，其中中国的产量为640万吨，是近6年来最低点。现在的情况变得更有利棉花产业发展，由于棉花库存减少，国际棉价已经攀升至近50年以来最高点。同时，棉纺织工业对棉纤维的品质要求越来越高，如纤维更长，硬度更强，纤维更细并且更整齐，提高棉花的品质和产量至关重要，是棉花育种研究的主要目标。

棉纤维是由胚珠表皮细胞经分化、发育形成的单细胞纤维，其发育过程可分为4个时期：纤维发育的起始期、伸长期、次生壁增厚期和成熟期，其中伸长期与次生壁增厚期具有相互重叠的时域。在这4个时期中，纤维细胞形态结构改变，伴随着重要生理生化过程，其间，有大量基因参与纤维发育过程的调控。研究这些基因的表达以及调控具有重要的意义。

先前本发明人通过cDNA array和RT-PCR分析筛选到一个棉纤维特异表达的、与拟南芥RD22同源的基因RDL1。陆地棉GhRDL1在开花后3～15天快速伸长的棉纤维中高表达，约18天以后表达迅速下降。因此，RDL1有可能在棉纤维伸长等方面起作用。之前已经申请专利《一种利用棉花RDL1基因促进植物种子增大和棉纤维增长的基因工程方法》(200810033537.2；PCT/CN2009/070355)，其主要内容为：在棉花中过量表达RDL1基因得到种子增大和纤维增长等表型。转基因棉花的分析结果表明：RDL1基因的过量表达导致其种子增大和棉纤维增长的优良性状；转基因拟南芥的结果也表明RDL1基因的过量表达导致其种子体积增大。种子增大的优良性状对粮、油、果实作物的开发利用具有重要应用价值。

作物种子是粮、棉、油等农业和工业中重要的原料，本领域迫切需要找到有效的手段，对作物种子的性状进行改良，以实现粮、棉、油等作物种子产量和品质的提高。另一方面，在花卉生产中，增加单株植物的花朵数量是提高花卉观赏价值的重要途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新颖的提高植物产量的基因工程方法及材料。

在本发明的第一方面，提供一种改良植物性状的方法，所述方法包括：增加(如上调)所述植物EXPA1基因的表达或EXPA1多肽的活性。

在另一优选例中，所述的增加是通过在植物中引入并表达EXPA1基因实现。

在另一优选例中，所述方法还包括：增加所述植物中RDL1基因的表达或RDL1多肽的活性。

在另一优选例中，所述的增加是通过在植物中引入并表达RDL1基因实现。

在另一优选例中，所述的EXPA1多肽选自以下一项或多项：

(a)SEQ ID NO：8或10所示的氨基酸序列的多肽；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-100个，较佳地1-80个，较佳地1-50个，较佳地1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个)氨基酸且具有改良植物性状的功能的由(a)衍生的蛋白质。

在另一优选例中，所述的EXPA1多肽的选自以下一项或多项：

(a)具有EXPA1蛋白序列的第197-258位的连续氨基酸；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-20个，较佳地1-10个，较佳地1-5个，例如2、3、4、5、6、7、8、9个)氨基酸且具有改良植物性状的功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述的RDL1多肽选自以下一项或多项：

(a1)SEQ ID NO：2、4或6所示的氨基酸序列的多肽；

(b1)在(a1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-100个，较佳地1-80个，较佳地1-50个，较佳地1-30个，较佳地1-20个，较佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个)氨基酸且具有改良植物性状的功能的由(a1)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述的EXPA1基因具有如下核苷酸序列：

(a2)SEQ ID NO：7或9(或如AF043284、DQ204495中记载的序列)所示的核苷酸序列；

(b2)在严格条件下与(a2)限定的核苷酸杂交且具有改良植物性状功能的核苷酸序列。

(c2)与(a2)限定的序列以增加的优选顺序具有40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、98％或更高的序列一致性的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的RDL1基因具有如下核苷酸序列：

(a3)SEQ ID NO：1、3或5(或如GenBank登录号AY072821、AY641990、AY641991中记载的序列)所示的核苷酸序列；

(b3)在严格条件下与(a3)限定的序列杂交且具有改良植物性状功能的核苷酸序列。

(c3)与(a3)限定的序列以增加的优选顺序具有40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、98％或更高的序列一致性的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的方法包括：

(1)提供构建物，所述构建物包括：EXPA1多肽的表达盒；

(2)将所述构建物转入植物，从而改良植物性状。

在另一优选例中，步骤(1)的构建物中还包括：RDL1蛋白的表达盒；

附加条件是：所述的RDL1多肽的表达盒以及EXPA1多肽的表达盒位于同一构建物中，或位于不同的构建物中。

在另一优选例中，所述的构建物是表达载体。

在另一优选例中，(1)中，所述的EXPA1多肽的表达盒包括(5’→3’)：启动子序列，EXPA1基因序列以及终止子。

所述的RDL1多肽的表达盒包括(5’→3’)：启动子序列，RDL1基因序列以及终止子；或

在另一优选例中，所述的表达盒的各元件是操作性相连的。

在另一优选例中，所述的启动子是CaMV 35S启动子。

在另一优选例中，所述的终止子是Nos PloyA终止子。

在另一优选例中，步骤(2)包括：

(a)将所述的构建物转化农杆菌，获得携带所述构建物的农杆菌；和

(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的携带所述构建物的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物。

在另一优选例中，还包括步骤：

(c)选择出转入了所述构建物的植物细胞或组织或器官；以及

(d)将步骤(c)中的植物细胞或组织或器官再生成植物。

在另一优选例中，所述的改良植物性状包括：改良植物产量相关性状。

在另一优选例中，上调EXPA1基因的表达后，所述的改良植物产量相关性状选自以下一项或多项：

种子纤维增长、分枝数增加、种子体积增大、种子重量增加、结实数增加、产量增加。

在另一优选例中，上调EXPA1基因和RDL1基因的表达后，所述的改良植物产量相关性状性状选自以下一项或多项：

种子体积增大、种子重量增加、种子纤维增长、种子纤维强度增大、分枝数增加、花数量增加、结实数增加、生长速度提高、加快现蕾、生物量增加、产量增加。

在另一优选例中，所述的改良植物产量相关性状包括：种子纤维增长或分枝数增加；或

种子体积增大、种子重量增加、结实数增加或产量增加。

在另一优选例中，所述的改良植物产量相关性状包括：种子体积增大、种子重量增加、种子纤维增长、种子纤维强度增大、分枝数增加、花数量增加、结实数增加、生长速度提高、加快现蕾、生物量增加、和/或产量增加。

在另一优选例中，所述的性状为农艺性状，更优选的，所述的性状为产量相关性状。

在另一优选例中，所述的植物是棉花，所述的改良植物性状包括：棉铃数增加、棉纤维长度增加、棉纤维强度增强、棉花产量增加、皮棉产量增加、或/和棉纤维品质提高。

在本发明的另一方面，提供一种由上述方法获得的转基因植物；或该转基因植物的杂交后代。与对照植物(如野生型)相比，所述的转基因植物或其后代的性状得到了改良。

在本发明的另一方面，提供一种构建物，所述构建物包括：EXPA1蛋白的表达盒。

在另一优选例中，所述的构建物还包括：RDL1蛋白的表达盒。

在本发明的另一方面，提供所述的构建物的用途，用于制备产量相关性状改良的植物。

在另一优选例中，所述构建物用于导入植物，形成EXPA1基因超表达、或RDL1基因和EXPA1基因同时超表达的植物，从而改良植物的产量相关性状。

在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，它含有所述的构建物。

在本发明的另一方面，提供所述的方法制得的转基因植物的用途，用于产生具有改良的性状的植物种子。

在本发明的另一方面，提供一种用于改良植物性状的基因组合，其包括RDL1基因和EXPA1基因。

在本发明的另一方面，提供所述的基因组合的用途，用于改良植物性状。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、酵母双杂交筛选得到的陆地棉GhEXPA1基因。

图2、35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因载体的构建。

图3、35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因棉花的分子鉴定之一。由于该载体不含GUS基因，GhRDL1和GhEXPA1又属于棉花自身基因，这里基因组PCR检测的是Kanamycin(NPTII)基因的序列(扩增片段为680bp)。四个转基因棉花株系均表型转基因阳性。

图4、35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因棉花分枝数(左图)和棉铃数目(右图)分析。这里分析的棉花株系设计野生型R15以及GhRDL1转基因棉花(R-105#，R-117#和R-119#)，GhEXPA1转基因棉花(E-202#，E-213#，E-216#和E-218#)和GhRDL1GhEXPA1共表达转基因棉花(RE-302#，RE-303#，RE-305#和RE-308#)。与R15比较的T检验，*：p＜0.05；**：p＜0.01。

图5、35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因棉花的结实情况。WT:R15。

图6、35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因棉花部分单株的株高和真叶数。其中，WT为野生型R15棉花；R117和R119为转化GhRDL1转基因棉花单株“3-X-X(X为1-9正整数)”为35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因棉花单株。统计日期为2011.2.21。

图7、35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因棉花部分单株的花蕾数和果枝数。其中，WT为野生型R15棉花；R117和R119为转化GhRDL1转基因棉花单株RE3-X-X为35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因棉花单株。统计日期为2011.3.28。

图8、35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因拟南芥的分子鉴定之一。其中，R3-2、R5-5、R8-1代表转化GhRDL1的转基因拟南芥；E1-6、E2-3、E3-1代表转化GhEXPA1的转基因拟南芥；RE1-5、RE9-1、RE12-4代表35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因拟南芥。

图9、35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因拟南芥的种子大小分析。

A，显示拟南芥成熟种子。WT，野生型；Vector，空载体(pCAMBIA2301)转基因植物；R3-2和R5-5，GhRDL1转基因植物；E1-6和E2-3，GhEXPA1转基因植物；RE1-5和RE12-4，GhRDL1和GhEXPA1共表达转基因植物。Bar＝500μm。

B，扫描电镜观察拟南芥成熟种子表皮细胞。Bar＝20μm。

图10、35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因拟南芥的生物量分析。A，鲜重；B，干重。

图11、转基因拟南芥生长状况的比较分析。

A，植物生长期21-，26-和33-DAG(DAG表示萌发后生长天数)表型分析。21-DAG植物显示莲座叶；26-DAG植物显示莲座叶和伸长的茎；33-DAG植物显示茎和果荚。植物(株系)为野生型、载体对照、R3-2、E1-6、RE1-5和RE12-4。比例尺代表2cm。

B，18至46-DAG生长过程中植物的抽苔(茎)高度随时间的变化曲线。植物(株系)为野生型、R3-2、E1-6和RE12-4。数据来源于每个株系的10株植物。

图12、35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因棉花铃数和皮棉产量分析。

A，35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因棉花铃数，其中，WT为野生型R15棉花；RE3-X-X为35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因棉花单株，数值为20株的平均值。棉花种植地点：海南三亚。

B，35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因棉花铃数，其中，WT为野生型R15棉花；RE3-X-X为35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因棉花单株，数值为30株的平均值。棉花种植地点：上海松江。

C，35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因棉花皮棉产量(以种植小区为单位)，其中，WT为野生型R15棉花；RE3-X-X为35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因棉花单株，数值为3个小区的平均值。棉花种植地点：上海松江。注：海南三亚和上海松江为两次重复试验。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示并论证了在植物中过表达GhEXPA1基因或同时表达GhRDL1基因和GhEXPA1基因可以显著地改善植物的性状，因此其在增加植物花朵和果实数目，提高农作物产量性状方面的具有良好的应用价值。

术语

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可相互交换使用，是指由肽键连接起来的任意长度聚合物形式的氨基酸。

术语“多核甘酸”、“核酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”在本文中可相互交换使用，是指任意长度聚合非分支形式的核苷酸，及核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这两者的组合。

如本文所用，所述的“植物”包括任何种类的植物，只要该植物适合进行基因的转化操作(转基因操作)，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。例如但不限于：十字花科芸薹属的大白菜、小白菜，十字花科鼠耳芥属植物，禾本科的水稻，此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。

作为本发明的优选方式，所述的“植物”是“作物”，所述的“作物”是指在粮、棉、油等农业和工业中具有经济价值的植物，其经济价值主要体现在该植物的种子或生物量上。作物包括但不限于：双子叶植物或单子叶植物。优选的单子叶植物为禾本科植物，更优选水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等。优选的双子叶植物包括但不限于：锦葵科棉属植物、十字花科芸苔属植物等，更优选棉花、大豆、油菜、拟南芥等。

如本文所用，植物的“性状”包括但不限于：种子体积、种子重量、种子纤维长度、种子纤维的强度、植物(植株)分枝数、植物结实数、植物生物量和/或植物产量等。

如本文所用，“植物性状的改良”、“改良的性状”“改良的植物性状”、“性状改良”、“植物性状改良”等可以等同替代，是指与未改良前植物相比，经本发明改良的种子体积增大、种子重量增加、种子纤维增长、种子纤维强度增大、植物分枝数增加、植物结实数增加、植物生物量增加和/或植物产量等。

如本文所用，术语“产量”可以涉及植物的营养生物量(根和/或枝条、叶片生物量)，涉及繁殖器官和/或涉及繁殖体(如种子)。

“产量相关性状”包括但不限于种子体积、种子重量、种子纤维强度、植物分枝数、植物结实数、植物生物量、植物产量等。

如本文所用，术语“提高”、“改良”或“增强”是相互可以交换的并且在应用含义上应当意指与本文中定义的对照植物相比较，至少2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选的至少15％或20％、更优选25％、30％、35％或40％更多的产量和/或生长等其他农艺性状。

如本文所用，术语“籽指”或“百粒重”可互换使用，均指每百粒种子的重量，该数据反映了种子的籽粒大小和饱满程度。

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”或“调控元件”或“调控序列”可以相互交换使用，并且在广泛含义上意指能够实现与它们相连接的序列表达的调节性核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。本领域的普通技术人员知晓，根据不同的需要，可以选择不同类型的启动子，如组成型启动子，诱导性启动子、发育调节性启动子、组织或器官特异型等。组织或器官特异型启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中。

如本文所用，所述的“可操作(性)地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“转基因植物(作物)”、“转化子”或“转化植物”可互换使用，均指通过常规转基因的方法获得的转入本发明的两种基因的细胞、器官或植株。

关于“对照植物”，选择合适的对照植物是实验设计的例行部分，可以包括对应的野生型植物或无目的基因的相应植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同的品种。对照植物也可以是因分离而丢失转基因植物的个体。如本文所用的对照植物不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。

如本文所用，术语“表达”或“基因表达”是指某个特定基因或多个特定基因或特定基因构建体的转录，由其是指某个基因或某些基因或基因构建体转录成结构性RNA或mRNA的任何类型的表达，所述RNA随后翻译成或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。

本文所用的术语“增加的表达”或“过量表达”是指相对于原有的野生表达水平外额外的任何形式的表达。

RDL1编码基因及蛋白

如本文所用，术语“RDL1基因”、“编码RDL1多肽的基因”、“编码RDL1多肽的多核苷酸”可以等同替代，是指一种与编码棉花RDL1蛋白序列高度同源的基因、或在严格条件下与所述基因序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因的表达对植物性状具有一定的改善作用，例如使种子体积增大、重量增加、纤维增长和/或纤维强度增大等。该定义中还包含在严格条件下与棉花RDL1基因序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子。

如本文所用，术语“棉花RDL1基因”是指与编码棉花RDL1蛋白的序列高度同源，该定义中包含在严格条件下与棉花RDL1基因序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子，且优选所述基因在棉纤维伸长期特异性高表达。例如，陆地棉RDL1编码基因(GhRDL1)编码一个含有335个氨基酸残基、C末端含一个植物特有的BURP结构域的蛋白。

NCBI已公开了RDL1及其同源基因的序列，例如AY072821[(Li C-H，Gossypiumhirsutum dehydration-induced protein RD22-like protein(RDL)mRNA，complete cds。“陆地棉脱水诱导蛋白RD22样蛋白(RDL1)”mRNA、全长cds]；AY641990[Wang S，Gossypium arboreum dehydration-induced protein RD22-like protein 1(RDL1)mRNA，RDL1-1 allele，complete cds。“亚洲棉脱水诱导蛋白RD22样蛋白1(RDL1)”mRNA、RDL1-1等位基因、全长cds]；AY641991[Wang S Gossypium arboreumdehydration-induced protein RD22-like protein 2(RDL2)mRNA，RDL2-2 allele，completecds，“亚洲棉脱水诱导蛋白RD22样蛋白2(RDL2)”mRNA、RDL1-1同源基因、全长cds]。这些基因均包括在本发明中。

本发明的RDL1基因可选自：(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：5(其分别对应于AY072821、AY641990和AY641991)；或(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交且具有改良植物性状的活性的分子。如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列。

本发明的RDL1基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

应理解，本发明的RDL1基因优选获自棉花，获自其它植物的与棉花RDL1基因高度同源(如具有50％以上，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。

在本发明中，术语“RDL1蛋白”指具有由本发明RDL1基因编码的的多肽，该定义中也包括具有改良植物性状功能的上述多肽的变异形式。本发明的蛋白质可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明中RDL1蛋白优选由棉花RDL1基因或其同源基因或家族基因编码。本发明中RDL1蛋白的序列可选自：(a)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：6；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有改良植物性状的活性的由(a)衍生的蛋白质。

所述变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。氨基酸的保守性取代是本领域熟知的(见例如Creighton(1984)proteins.W.H.Freeman and Company(编著))。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能，例如本发明的RDL1蛋白质可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有改良植物性状的活性。

可采用辐射或暴露于诱变剂下来产生随机诱变，也可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术来获得上述(b)中的蛋白质。可利用编码所述蛋白质的编码序列来构建转基因植物，并观察该转基因植物中性状是否有所改良来筛选和鉴别所得蛋白质(例如参照本发明实施例中的方法)。

根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。该术语还包括RDL1蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与RDL1蛋白编码序列杂交的序列所编码的蛋白、以及利用抗RDL1蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还可使用其它多肽，如包含RDL1蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了RDL1蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有RDL1蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

EXPA1编码基因及蛋白

如本文所用，“EXPA1基因”、“编码EXPA1多肽的基因”、“编码EXPA1多肽的多核苷酸”可以等同替代，是指一种与编码棉花EXPA1蛋白序列高度同源的基因、或在严格条件下与所述基因序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因的表达对植物性状具有一定的改善作用，例如使体积增大、重量增加、纤维增长和/或纤维强度增大等。该定义中还包含在严格条件下与棉花EXPA1基因序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子。

如本文所用，术语“棉花EXPA1基因”是指与编码棉花EXPA1蛋白的序列高度同源，该定义中包含在严格条件下与棉花EXPA1基因序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子。

NCBI已公开了EXPA1及其同源基因的序列，例如AF043284、DQ204495(Gossypium hirsutum alpha-expansin 1)。这些基因均包括在本发明中。

本发明的EXPA1基因可选自：(a)SEQ ID NO：7、或SEQ ID NO：9(其分别对应于AF043284或DQ204495)；或(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交且具有改良植物性状的活性的分子。如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列。

本发明的EXPA1基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

应理解，本发明的EXPA1基因优选获自棉花，获自其它植物的与棉花EXPA1基因高度同源(如具有50％以上，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。优选的，按照默认参数进行比对。

在本发明中，术语“EXPA1蛋白”指具有由本发明EXPA1基因编码的的多肽，该定义中也包括具有改良植物性状功能的上述多肽的变异形式。本发明的蛋白质可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明中EXPA1蛋白优选由棉花EXPA1基因或其同源基因或家族基因编码。本发明中EXPA1蛋白的序列可选自：(a)SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有改良植物性状的活性的由(a)衍生的蛋白质。

所述变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能，例如本发明的EXPA1蛋白质可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有改良植物性状的活性。

根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。该术语还包括EXPA1蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与EXPA1蛋白编码序列杂交的序列所编码的蛋白、以及利用抗EXPA1蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还可使用其它多肽，如包含EXPA1蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了EXPA1蛋白的活性片段。通常，该片段具有EXPA1蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。优选的，该片段具有EXPA1蛋白序列的197-258的连续氨基酸。该片段是跟RDL1相互作用的部位，提示该片段具有EXPA1生物学活性，且具有跟全长相似的生物学功能。更有选的该片段具有SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10所述蛋白序列的197-258的连续氨基酸。

构建物和宿主

为了特异性地改良植物的性状，特别是种子性状以及生物量，本发明人作了广泛地研究，找到了适合于性状改良的基因，并构建了相应的构建物。

因此，本发明提供了一种构建物，所述构建物包括：RDL1蛋白的表达盒，以及EXPA1蛋白的表达盒。所述的表达盒具备基因表达所需的所有元件(包括启动子、编码DNA以及终止子等)，从而可完整地表达出相应的蛋白。所述的RDL1蛋白的表达盒以及EXPA1蛋白的表达盒可以位于同一构建物上，也可以位于不同的构建物上。较佳地，所述的RDL1蛋白的表达盒以及EXPA1蛋白的表达盒位于同一构建物上以简化转化细胞的操作。

通常，所述的构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的构建物。所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本发明中优选使用pEGFP-1、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301、或pBI121等。在本发明的具体实例中，所述的重组载体是pCAMBIA系列的载体。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主可以是任何适合于携带所述表达载体并能够将所述表达载体传递给植物细胞的宿主。优选的，所述的宿主为农杆菌。作为一种方式，制备转基因植物的方法是：将携带所述构建物的表达载体转入农杆菌，农杆菌再将所述构建体的片段整合到植物的染色体上。

转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状改良的植物。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

改良植物性状的方法

本发明中还提供了一种生产具有改良性状的作物种子的方法，所述方法包括：提高所述作物中RDL1基因和EXPA1基因的表达水平，即所述改良是通过提高作物中RDL1基因表达水平或RDL1蛋白和EXPA1蛋白的含量来实现的。本领域技术人员可根据所要达到的目的，选择适当的改良方法。例如可采用转基因的方法，该方法通常包括构建转入RDL1基因和EXPA1基因的载体、转入植物和育种等步骤。

作为本发明特别优选的方式，采用农杆菌转化技术将所述的构建物转入植物(如植物的愈伤组织)中。

其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施以上的方法。

本发明还包括利用前述方法获得的植物，所述的植物包括：转入了所述构建物的转基因植物；或者细胞中RDL1基因和EXPA1基因的表达水平上调(包括高表达或过表达)的植物等。

可以从这些转基因植物中选择RDL1基因和EXPA1基因的表达水平上调的种子，用于培植植物的后代(如杂交后代)，所述的植物后代中RDL1基因和EXPA1基因的表达水平同样上调。

可以从能育的转基因植物收获转基因植物的种子并且可以用于培育本发明的转化植物的后代，包括用于选择具有改良的农艺性状的植物的杂交植物系。除了用重组DNA直接转化植物外，通过使具有重组DNA的第一种植物与缺乏所述DNA的第二种植物杂交可以制备转基因植物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

为了进一步研究RDL1的功能和提高棉花的品质和产量，为棉花育种提供分子依据，本发明人用酵母双杂交筛选与GhRDL1相互作用的蛋白，得到一个棉花α-expansin蛋白，GhEXPA1。与GhRDL1相似，GhEXPA1也在棉纤维快速伸长期高表达。GhRDL1与GhEXPA1的相互作用被进一步的酵母双杂交和半分子荧光互补实验(BiFC)证实。本发明人在拟南芥和棉花中分别或同时过量表达GhRDL1和GhEXPA1，获得了增产有关的表型；特别是共表达这两个基因时，转基因植物生长旺盛，花多果多，增产效果显著。如在转基因棉花中，棉铃数增多，且棉纤维长度有所增长，籽棉产量增加；在转基因拟南芥中，整株植物的果荚数增多，种子数量、种子大小和种子重量都显著增加。

实施例1、GhRDL1和GhEXP1 cDNA的分离

棉花RNA提取采用冷酚法。2g棉花材料，在液氮中磨成粉末，转移到50ml离心管中，加入8ml提取缓冲液(1M Tris·HCl，50mM EDTA，1％SDS，pH9.0)和等体积的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，震荡混匀，冰上放置1h，每隔10min混匀一次。4℃，13000g离心20min。重复酚∶氯仿∶异戊醇抽提2～4次，最后用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次。取上清液，加入1/2体积的高盐溶液(0.8M柠檬酸钠，1.2M NaCl)和1/2体积异丙醇，混匀，-70℃放置1h。4℃，13000g离心20min，去上清液，沉淀溶于1ml DEPC处理水，4℃，13000g离心10min。上清液转入1.5mlEppendorf管，加入1/3体积的8M LiCl和1/10体积的NaAC，-20℃放置过夜。4℃，13000g离心20min。去上清液，用1ml 70％乙醇清洗沉淀2次，室温吹20min，溶于100～200μL DEPC处理水。

根据GhRDL1和GhEXP1 cDNA(分别是GenBank登录号：AY072821和DQ204495)的序列，分别合成专一引物(含酶切位点和保护碱基)：

RDL1-F-PstI：5’-AACTGCAGGGAATTAGTCACTCCTGTTCTA-3’(SEQ ID NO：11)，

RDL1-R-KpnI：5’-GGGGTACCGATTTCACATAACTAAACTCGG-3’(SEQ ID NO：12)；

EXP1-F-NcoI：5’-CATGCCATGGGTCAGCCAATTGTTTGAGCTAGC-3’(SEQ IDNO：13)，

EXP1-R-BamHI-BstEII：

5’-GGGTTACCGGATCCCTACCTCGGCATAAAACGCTCA-3’(SEQ ID NO：14)；

以9-DPA(“9-DPA”代表棉花开花后第9天)纤维总RNA的反转录产物为模板进行PCR扩增反应，反应条件为：94℃预变性5min；然后94℃预变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。亚克隆后经测序确认序列正确。

实施例2、利用酵母双杂交筛选与GhRDL1相互作用的蛋白

利用酵母双杂交筛选与目标蛋白相互作用的蛋白采用MATCHMAKER libraryconstruction kit(Clontech)。

pGBKT7-GhRDL1的构建：

GhRDL1基因(ATG-TAA完整编码序列)用KOD-Plus高保真聚合酶扩增出来，同时分别引入EcoRI-BamHI酶切位点，核对读码框后，GhEXPA1片段经EcoRI和BamHI双酶切后，连到pGBKT7载体(购自Clontech公司)的相应位点中，形成pGBKT7-GhRDL1。

pGADT7-Rec载体(购自Clontech公司)的SmaI位点两端分别含有SMART III和CDS III重组序列；棉花开花后6天(d)纤维的总RNA经反转录(反转录体系添加SMART III 链5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3′(SEQ ID NO：21)和CDS III 反转录引物5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN(SEQ ID NO：22)-3′N＝A，G，Cor T；V＝A，G或C)，生成的双链cDNA(ds cDNA)库用引物(5′PCR引物5′-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3′(SEQ ID NO：23)和3′PCR引物5′-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGA CA-3′(SEQ ID NO：24))扩增形成修饰的cDNA库。修饰的cDNA库和pGBKT7-GhRDL1、以及线性化(用SmaI单酶切)的pGADT7-Rec载体(含有同样的重组位点)一起转化酵母AH109菌株(Clontech)。在酵母中pGADT7-Rec载体与cDNA库重组重新形成载体pGADT7-Rec-cDNA。共转pGBKT7-GhRDL1和pGADT7-Rec-cDNA载体的酵母在SD/-Thr/-Leu/-His/-Arg培养基(指Thr、Leu、His、Arg缺陷的培养基)上培养，筛选阳性克隆。

通过酵母双杂交筛选与GhRDL1相互作用的蛋白，得到59个阳性克隆，对其中的14个进行测序，6个克隆包含编码α-expansin蛋白的基因片段(从ATG开始的第591bp至poly A的序列，对应于α-expansin蛋白(EXPA1)197-258的氨基酸序列)，该基因为GhEXPA1。

实施例3、35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1共表达载体(RE)的构建和农杆菌转化

GhRDL1和GhEXPA1目的片段用KOD-Plus高保真聚合酶扩增出来，同时分别引入相应酶切位点(见实施例1，引物设计)，核对读码框后，GhEXPA1片段经NcoI和BstEII双酶切后，连到pCAMBIA1301载体(购自CAMBIA公司)的相应位点中，形成p1301-EXP1中间载体(E)，并经测序验证；GhRDL1片段经PstI和KpnI双酶切后连到经改装的pCAMBIA2301载体(pCAMBIA2301购自CAMBIA，如下改装：在多克隆位点的HindIII-PstI和SacI-EcoRI中分别引入35S(PCR扩增自pBI121载体，同时引入HindIII-PstI位点，pBI121载体购自Clontech)和NOS(PCR扩增自pBI121载体，同时引入SacI-EcoRI位点)形成p2301-RDL1中间载体(R)，测序验证；p1301-EXP1中间载体以HindIII和BstEII双酶切后，切出的片段(包括启动子)连入p2301-RDL1中间载体的对应位点，形成最终表达载体35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1(RE，图2)。

根癌农杆菌的转化采用冻融法。一个单菌落LBA4404或GV3101(Invitrogen)，3mlLB培养基(25μg/ml利福霉素Rif和50μg/ml卡那霉素Kan或庆大霉素Gen)，28℃，220rpm，过夜培养。2ml菌液，50ml LB培养基(25μg/ml Rif和50μg/ml Gen)，28℃，220rpm，培养到OD600＝0.5(约6h)。在冰上放置30min，4℃，5000g离心5min。重悬于10ml 0.15M NaCl。4℃，5000g离心5min。重悬于1ml 20mM CaCl₂，50μl/管分装，液氮速冻，-70℃保存感受态细胞。混合前述构建的任一含目的基因的表达载体和50μl/管感受态细胞，在冰上放置30分钟，液氮速冻1min。在37℃水浴中5min使菌液融化，加1ml LB培养基，28℃，220rpm，培养2～4h。取50～100μl涂LB培养基平板(25μg/ml Rif、50μg/ml Gen和50μg/ml卡那霉素Kan或潮霉素Hyg)，2天(d)后挑单菌落进行PCR鉴定。

实施例4、植物转化以及转基因后代的筛选

a.棉花的转基因

含载体质粒的农杆菌于添加卡那霉素50mg/L、利福平100mg/L、链霉素300mg/L的YEB细菌培养基上培养2～3d后，挑单菌落接种于含相同抗生素的YEB液体培养基中，于28℃、200rpm/min的摇床上悬浮培养过夜。菌液于4000rpm/min离心10min，沉淀用含葡萄糖30g/L和乙酰丁香酮100μmol/L的1/2MS液体培养基重新悬浮，调OD₆₀₀值为0.4～0.6左右，作为感染液备用。

棉花R15种子(一种四倍体的野生型陆地棉，作为转基因的母本)经常规消毒后置于1/2MS0(1/2MS盐+5g/L葡萄糖+7g/L琼脂粉，pH 6.0)培养基，在黑暗中萌发培养，5～7d后将无菌苗下胚轴切成1.0cm左右的切段作为转化外植体备用。

外植体在农杆菌菌液中浸泡感染15～20min，转移到共培养培养基MSB1(MS盐+B5有机+30g/L葡萄糖+0.1mg/L KT+0.1mg/L 2,4-D+2.2g/L Gelrite，pH 6.0)上，22℃暗培养2d后，将外植体转移到培养基MSB2(MSB1+500mg/L头孢霉素+80mg/L卡那霉素)上进行愈伤组织的诱导。外植体经过抗性愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖及胚性愈伤的诱导(培养基MSB3：MS盐+B5有机+30g/L葡萄糖+2.5g/LGelrite，pH 6.0)、体细胞胚胎发生(培养基MSB4：MS盐+B5有机+30g/L葡萄糖+1.0g/L天门冬酰氨胺+2.0g/L谷氨酰胺+3.0g/L Gelrite，pH 6.0；MS盐中KNO₃加倍，去除NH₄NO₃)，再生抗性试管苗。待试管苗长到3-4片真叶时，移栽到花盆中，放入人工气候室生长。

b.拟南芥的转基因

拟南芥植物的转化采用花芽浸泡法(floral dip)(Clough和Bent，1998，Plant J.16，735-743)。农杆菌培养方法同上，菌液于4000rpm/min离心10min后，菌体重悬于500ml含0.02％Silwet L-77的5％蔗糖溶液中。野生型植株(Col-0)地上部分在菌液中浸泡5s，平放于塑料盆内，保湿，避光，16～24h。T0代种子在4℃春化2～4d，用20％漂水处理15min，无菌水清洗3～4遍。悬于0.5％的琼脂糖(55℃)，铺在0.6％琼脂的LB培养基(50μg/ml Kan或Hyg)，22℃，连续光照，约一周后，绿色抗性苗移栽到营养土(泥炭∶蛭石∶珍珠岩1∶1∶1)中生长。

实施例5、转基因植物的分子生物学鉴定

a.PCR

DNA提取采用冷酚法。2g材料，在液氮中磨成粉末，转移到50ml离心管中，加入8ml提取缓冲液(1M Tris-HCl，50mM EDTA，1％SDS，pH9.0)和等体积的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，震荡混匀，冰上放置1h，每隔10min混匀一次。4℃，13000g离心20min。重复酚∶氯仿∶异戊醇抽提2～4次，最后用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次。取上清液，加入1/2体积的高盐溶液(0.8M柠檬酸钠，1.2M NaCl)和1/2体积异丙醇，混匀，-70℃放置1h。4℃，13000g离心20min，去上清液，用1ml 70％乙醇清洗沉淀2次，室温吹20min，沉淀溶于1ml无菌水。4℃，13000g离心10min。取上清液，加5～10μl RNase(10mg/ml)，37℃，30min。

PCR鉴定采用NPTII或基因特异的引物(对应于棉花为Kanamycin(NPTII)基因特异的引物，引物序列为NPTII-F：GGCGATACCGTAAAGCACGAGGAA(SEQ ID NO：15)和NPTII-R：GCTATGACTGGGCACAACAGACAAT(SEQ ID NO：16)。对应于拟南芥为基因特异引物，引物序列为GhRDL1-RT-F：

CAAATACTCCAATGCCAAAG(SEQ ID NO：17)和GhRDL1-RT-R：

GAGTTTCACTGGCTGCATAT(SEQ ID NO：18)；GhEXP1-RT-F：AAGGGTATG

GAACGAGCACAG(SEQ ID NO：19)和GhEXP1-RT-R：

CCATCGCTGGCAGTCACTTTA(SEQ ID NO：20)，其反应条件为：94℃预变性5min；

然后94℃预变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1s，共35个循环；最后72℃延伸10s。

几个转基因棉花植株(RE302、RE303、RE305、RE308)以及R15野生型植株的PCR产物的电泳结果见图3。

b.卡那霉素(Kanamycin，Kan)抗性检测分析

转基因棉花种子萌发后约3周(出现3片左右的真叶)时，用0.5％Kanamycin水溶液涂抹新叶(嫩叶)，正常生长1周左右，观察Kanamycin涂抹处叶面的颜色，仍为绿色，表明该植株具有Kan抗性，为转基因阳性植株；反之出现明显黄色，表明该植株不具有Kan抗性，为转基因阴性植株。

实施例6、转基因植物的性状分析

a.转基因棉花的性状分析

R(即GhRDL1转基因棉花；35S::GhRDL1)，E(即GhEXPA1转基因棉花；35S::GhEXPA1)和RE(即GhRDL1和GhEXPA1转基因棉花；35S::GhRDL135S::GhEXPA1)转基因棉花和野生型R15在上海五厍农场种植(2010年4月)。转基因株系的T1代植物选取长势平均的植株进行就地拍照。分别单株收取成熟棉桃，尽量保持收取部位的一致性，分别随机地从单株收取的成熟棉桃中取出100粒种子，取一定数量的种子将其纤维梳平并测量其纤维长度，然后称重这100粒种子(不含纤维)；将单株棉花分枝数和棉铃数进行计数，并统计分析。将以上数据统计作图。LineRE-302#，RE-303#，RE-305#和RE-308#的T1代数据为5株统计结果，如图4。可见相较于野生型棉花以及单转入35S::GhRDL1(R系列)或35S::GhEXPA1(E系列)的转基因棉花植株，35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因棉花(RE系列)的分枝数显著增加，平均棉铃数也显著增加。另外，种子百粒重以及棉花纤维长度见表1。与对照相比，E系列转基因棉花和RE序列的转基因棉花的棉纤维增长。与对照相比，E系列转基因植物的分枝数也增加。

同时，本发明人还比较了转基因棉花植株的结实情况，如图5所示。可见，相较于野生型棉花，35S::GhRDL1 35S::GhEXPA1转基因棉花的结实数量明显增加。

表1、各组转基因棉花纤维长度和籽指分析

虽然棉花种子百粒重没有显著增加，但由于果实多，种子数量多，植株种子的总重量还是显著增加。

收取T1代具有优良性状的20个RE转基因单株在海南三亚大茅中棉所试验田种植(2010年12月8日)，共计0.5亩地，约900株植物，包含R15、R105、R117和R119约100株。以是否有卡那霉素抗性区分转基因阳性株以及遗传分离株，初筛显示阳性率在50％以上。

两个半月统计植株株高和真叶数，结果显示RE转基因植物在株高和真叶数具有明显优势(图6)，且部分单株已开始现蕾，而同时对照R15绝无现蕾。提示RE转基因植物长势更佳。

三个半月统计植株花蕾数和果枝数，结果显示RE转基因植物的三个株系在花蕾数和果枝数上具有明显优势(图7)。另外本发明人也记录了各株系现蕾期(出现第一个蕾的天数)、初花期(出现第一朵花的天数)和开花期(所统计的植株有半数开花的天数)，具体见表2。可见RE转基因棉花较亲本R15现蕾期提前1-6天，初花期提前1-5天，开花期提前2-5天。

成熟期统计转基因棉花各株系的单株棉铃数，结果显示RE转基因植物在铃数上具有明显优势(图12A)。上海松江农场的重复试验也验证了这一点(图12B)。对上海松江农场种植的棉花以小区为单位统计了皮棉产量，结果显示部分株系的皮棉产量也具有明显优势(图12C)，株系RE3-8-7的皮棉产量比对照增加40％。为了了解RE转基因棉花的纤维品质，我们将收获的棉纤维送往中国棉纤维品质检测中心(中棉所，河南安阳)检测，结果显示总体上RE转基因棉花的纤维品质优于对照R15(表3)。

表2、转基因棉花各株系现蕾期、初花期和开花期的统计

株系	现蕾期	初花期	开花期
				R15-1	80	104	109
R15-2	80	104	107
				R117	77	99	103
R119	77	98	103
				RE3-2-5	74	99	106
RE3-2-6	79	99	103
				RE3-3-1	78	102	106
RE3-3-2	76	102	105
				RE3-8-8	78	103	108
RE3-8-9	74	102	105

表3、转基因棉花各株系的纤维品质

b.转基因拟南芥的性状分析

R，E和RE转基因载体也通过农杆菌介导的方法转入拟南芥，T0代转基因拟南芥种子经过抗生素筛选，选出抗性T1代植株，RT-PCR鉴定转基因表达情况，单株收取T1代种子，取12个单株，将这些单株种子(T2代的植物)分别经过抗生素筛选，全抗的(在含抗生素的培养基上全长的，即后代不分离的)为纯合阳性的。通过抗性筛选和RT-PCR的方法(图8)鉴定出T2或T3代纯合的转基因阳性植株。

成熟拟南芥种子收获后，干燥3天。20倍镜下对种子显微拍照(n＞50)，见图9。用ImageJ(Rasband W.，NIH，USA)软件测量种子长和宽，并做统计分析(图9和表3)。结果显示，RE转基因拟南芥的种子颗粒明显较对照增大；且其成熟种子表皮细胞表现为体积增大，表观则无明显变化。通过分批测量1000粒种子的质量来确定种子的千粒重。每份种子样品作5次重复。可见RE转基因拟南芥的种子的千粒重显著增加，RE转基因拟南芥的种子的千粒重几乎是野生型对照的两倍(表3)。此外，E转基因拟南芥的种子颗粒也较对照有明显增大，种子的千粒重显著增加、单一植物果荚数、单一植物种子量增加。

随机取生长50天的拟南芥主茎上发育良好的果荚，测量长度，统计每个果荚中的种子数，每个转基因株系至少统计5株植物；将一个纸袋套于单株拟南芥上，以保证完全收获种子，称量成熟干燥的单株种子被用来统计种子生物量(产量)，每个转基因株系至少统计10株植物。可见RE转基因拟南芥的种子生物量(产量)显著高于野生型及R或E转基因型。

称量生长40或46天的拟南芥地上部分的鲜重和干重被用来统计营养生长的生物量，每个转基因株系至少统计10株植物(图10)。可见RE转基因拟南芥的生物量明显增多。

测量拟南芥生长18～46天(萌发后生长天数)抽苔高度的变化，以此反应拟南芥生长速率，每个转基因株系至少统计10株植物(图11)。可见RE转基因拟南芥的生长速率明显大于对照。

表3、各组转基因拟南芥果荚数目和种子产量分析¹

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种改良植物性状的方法，所述方法包括：增加所述植物EXPA1基因的表达或EXPA1多肽的活性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：增加所述植物中RDL1基因的表达或RDL1多肽的活性。

3.如权利要求1所述的方法，所述的增加是通过在植物中引入并表达EXPA1基因实现。

4.如权利要求2所述的方法，所述的增加是通过在植物中引入并表达RDL1基因实现。

5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述的EXPA1多肽选自以下一项或多项：

(a)具有SEQ ID NO：8或10所示的氨基酸序列的多肽；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有改良植物性状的功能的由(a)衍生的蛋白质；或

所述的RDL1多肽选自以下一项或多项：

(a1)具有SEQ ID NO：2、4或6所示的氨基酸序列的多肽；

(b1)在(a1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有改良植物性状的功能的由(a1)衍生的多肽。

6.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述的EXPA1基因具有如下多核苷酸序列：

(a2)如SEQ ID NO：7或9所示的核苷酸序列；

(b2)在严格条件下与(a2)限定的序列杂交且具有改良植物性状功能的核苷酸序列；

(c2)与(a2)限定的序列以增加的优选顺序具有40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、98％或更高的序列一致性的核苷酸序列；或

所述的RDL1基因具有如下核苷酸序列：

(a3)如SEQ ID NO：1、3或5所示的核苷酸序列；

(b3)在严格条件下与(a3)限定的序列杂交且具有改良植物性状功能的核苷酸序列；

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(1)提供构建物，所述构建物包括：EXPA1多肽的表达盒；

(2)将所述构建物转入植物，从而改良植物性状。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(1)提供构建物，所述构建物包括：EXPA1多肽的表达盒和RDL1多肽的表达盒；

(2)将所述构建物转入植物，从而改良植物性状。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述的EXPA1多肽的表达盒包括：启动子序列，EXPA1基因序列以及终止子；或

所述的RDL1多肽的表达盒包括：启动子序列，RDL1基因序列以及终止子。

10.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：

11.如权利要求1，2，7任一项所述的方法，其特征在于，所述的改良植物性状包括：改良植物产量相关性状。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的改良植物产量相关性状包括：

增长种子纤维、增加分枝数、增大种子体积、增加种子重量、增加结实数、和/或增加产量。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的改良植物产量相关性状包括：

增大种子体积、增加种子重量、增长种子纤维、增大种子纤维强度、增加分枝数、增加花数量、增加结实数、提高生长速度、加快现蕾、增加生物量、和/或增加产量。

14.用权利要求1-13任一所述的方法获得的转基因植物或其杂交后代，与对照植物相比，所述的转基因植物或其杂交后代具有改良的产量相关性状。

15.如权利要求14所述的转基因植物或其杂交后代，其特征在于，所述的改良的性状包括：种子体积增大、种子重量增加、种子纤维增长、种子纤维强度增大、分枝数增加、花数量增加、结实数增加、生长速度提高、加快现蕾、生物量增加、和/或产量增加。

16.一种构建物，所述构建物包括：EXPA1多肽的表达盒。

17.如权利要求16所述的构建物，其特征在于，所述的构建物还包括：RDL1多肽的表达盒。

18.EXPA1基因或EXPA1基因和RDL1基因组合或权利要求16或17所述的构建物的用途，用于制备具有改良的性状的植物。

19.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求16或17所述的构建物。

20.用权利要求1-13任一所述的方法制得的转基因植物的用途，用于产生具有改良的性状的植物种子。

21.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述的改良的性状包括：种子体积增大、种子重量增加、种子纤维增长、和/或种子纤维强度增大。

22.一种用于改良植物性状的基因组合，其包括RDL1基因和EXPA1基因。