JPWO2012121093A1 - 農業形質を最適化した複合病害抵抗性単子葉植物 - Google Patents
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Abstract
本発明者らは、単子葉植物から様々な発現特性を持つプロモーターを多数単離し、それらの下流にOsWRKY45遺伝子を接続して単子葉植物（イネ）に再導入することにより、複合病害抵抗性と良好な農業形質とが両立したイネ系統の作出を図った。その結果、本発明者らは、EF1α、OsUbi7遺伝子の上流配列をプロモーターとして用いてOsWRKY45を発現させることにより、病害抵抗性と農業形質が両立した形質転換植物体の作出に成功した。
Description
本発明は、単子葉植物の病害への抵抗性を向上させる機能を有する単子葉植物由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および、単子葉植物の病害抵抗性と農業形質が両立するように、該ポリヌクレオチドの発現を制御する機能を有するプロモーターを含む核酸構築物、並びに、該核酸構築物を含み単子葉植物の病害への抵抗性が向上した形質転換植物体に関する。さらに、該核酸構築物を利用した、単子葉植物の病害への抵抗性を向上させる方法に関する。
農作物生産においては一般に、高品質植物の安定生産および農薬依存度の軽減が要望されている。そのため、植物細胞融合技術や組換えＤＮＡ技術などの有用な植物バイオテクノロジー技術を利用し、病害虫および病原菌に対して抵抗性を示す植物の品種の改良、育種および開発が盛んに行われている。既に除草剤耐性を示す形質転換植物（特許文献１）、ウイルス抵抗性を示す形質転換植物（特許文献２）および害虫抵抗性を示す形質転換植物（特許文献３）が、組換えＤＮＡ技術を利用して作出されている。さらに、病原糸状菌の産生する毒素を不活化する酵素の遺伝子の導入により、病原糸状菌に対して抵抗性を示す形質転換植物（非特許文献１）や、昆虫由来の抗菌性タンパク質の遺伝子の導入により、少なくとも１つの病原菌に抵抗性を示す形質転換植物（特許文献４）、コマツナ由来の遺伝子の導入による複合病害抵抗性植物の作出（特許文献５）、チオニン遺伝子を用いた複数病害抵抗性植物の作出方法（特許文献６）、酸性型タウマチン様タンパク質遺伝子を用いた複合病害抵抗性植物の作出方法（特許文献７）のように、植物病原菌に対して抵抗性を示す形質転換植物も数種作出されている。しかしながら、単一の抵抗性遺伝子の導入によって得られる病害抵抗性は、効果が十分でないともいわれている。また、導入遺伝子が形質転換体の生育や稔性等に悪影響を及ぼす場合もあり、実用化を妨げる原因となっている。
WRKY転写因子に関して、アラビドプシスなどの双子葉植物では病害抵抗性に関与していることなどが報告されている（非特許文献２〜６）。イネのOsWRKY遺伝子に関しては、近年病害抵抗性を与えるものがいくつか報告されているが（非特許文献７〜１４）、病害抵抗性の効果がより強い遺伝子の特定が望まれていた。
本発明者らは、これまでに、過剰発現によって複合病害抵抗性（例えば、糸状菌によるいもち病または細菌による白葉枯病に対する抵抗性）をイネに付与する遺伝子OsWRKY45を単離し、トウモロコシのユビキチン・プロモーター(Pmaize Ubi)を用いOsWRKY45を過剰発現する組換えイネ植物体の作出に成功している（特許文献８、非特許文献１５）。しかしながら、トウモロコシのユビキチン・プロモーターを用いてOsWRKY45を過剰発現させた場合には、組換えイネ植物体に複合病害に対する強い抵抗性（複合抵抗性）は付与されるものの、栽培条件によってはイネの生育遅延等の現象が見られることが明らかとなっていた（非特許文献１５）。
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
Windhovel, U. et al., Plant Physiol., 104, 119-125 (1994)
Kalde, M. et al., Mol. Plant Microbe Interact., 16, 295-305 (2003)
Li, J. et al., Plant Cell, 16, 319-331 (2004)
Robatzek, S. et al., Genes Dev., 16, 1139-1149 (2002)
Yu, D. et al., Plant Cell, 13, 1527-1540 (2001)
Chen, C. et al., Plant Physiol., 129, 706-716 (2002)
Xie, Z. et al., Plant Physiol., 137, 176-189 (2005)
Qiu, Y. et al., Chinese Science Bulletin, 49(20), 2159-2168 (2004)
Qiu, D. et al., Mol Plant Microbe Interact, 20(5), 492-499 (2007)
Liu, X. et al., J Plant Physiol, 164(8)、 969-979 （2007）
Chujo, T. et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression, 1769(7-8), 497-505 (2007)
Chujo, T. et al., Biosci Biotechnol Biochem, 72(1), 240-245 (2008)
Tao, Z. et al., Plant Phys., 151, 936-948 (2009)
Qiu, Y. and D. Yu, Environmental and Experimental Botany, 65(1), 35-47 (2009)
Shimono, M. et al., Plant Cell, 19, 2064-2076 （2007）
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、単子葉植物の生育又は単子葉植物の繁殖材料（種子）の収量に影響を受けることのない、複合病害抵抗性を有する組換え単子葉植物を作出することにある。
より具体的には、本発明の課題は、単子葉植物の病害への抵抗性を向上させる機能を有する単子葉植物由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および、単子葉植物の病害抵抗性と農業形質が両立するように該ポリヌクレオチドの発現を制御する機能を有するプロモーター、を含む核酸構築物、並びに、該核酸構築物を含み単子葉植物の病害への抵抗性が向上した形質転換植物体を提供することにある。さらに、該核酸構築物を利用した、単子葉植物の病害への抵抗性を向上させる方法の提供を課題とする。
本発明者らは、上記の課題を解決するために、単子葉植物から様々な発現特性をもつプロモーターを多数単離し、それらの下流にOsWRKY45遺伝子を接続して単子葉植物（イネ）に再導入することにより、複合病害抵抗性と良好な農業形質とが両立したイネ系統の作出を図った。その結果、様々なレベルでOsWRKY45遺伝子を発現するイネ系統が得られた（図１、３）。このうち、OsUbi1、eEF1α、OsUbi7遺伝子の上流配列（POsUbi1, PEF1α, POsUbi7）をプロモーターとして用いてOsWRKY45を発現させたイネにおいて、いもち病および白葉枯病に対して顕著な抵抗性を示した（図４）。また、POsUbi7を用いたOsWRKY45発現イネは、気温および湿度が外環境に追随する温室において、Pmaize UbiによるOsWRKY45発現イネよりはるかに良好で、非形質転換イネと較べて遜色ない生育（草丈および有効分げつ数）と収量を示した（図５、６）。なお、PEF1αはPOsUbi7に次ぐ良好な結果を示した。これらの結果により、本発明では、実用利用の可能性のある複合抵抗性イネを作出することができた。
即ち、本発明者らは単子葉植物の病害への抵抗性を向上させる転写因子遺伝子に適切なプロモーターを組み合わせることにより、病害抵抗性と農業形質が両立した形質転換植物体の作出に成功し、これにより本発明を完成するに至った。
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔１６〕 を提供するものである。
〔１〕下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載された、単子葉植物の病害への抵抗性を向上させる機能を有する単子葉植物由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および、単子葉植物の病害抵抗性と農業形質が両立するように該ポリヌクレオチドの発現を制御する機能を有するプロモーターを含む核酸構築物；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
〔２〕前記プロモーターが、前記ポリヌクレオチドの植物体における発現量の、植物体内在性OsUbi1の発現量に対する相対値を、 0.95〜0.17に制御する機能を有するプロモーターであることを特徴とする、〔１〕に記載の核酸構築物。
〔３〕前記プロモーターが、イネ植物体のユビキチン・プロモーター又はイネ植物体のペプチド伸長因子遺伝子プロモーターであることを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載の核酸構築物。
〔４〕前記プロモーターが、配列番号：３または５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることを特徴とする、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の核酸構築物。
〔５〕前記単子葉植物の病害が糸状菌性の病害であることを特徴とする、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の核酸構築物。
〔６〕前記単子葉植物の病害が細菌性の病害であることを特徴とする、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の核酸構築物。
〔７〕〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
〔８〕〔７〕に記載のベクターが導入された宿主細胞。
〔９〕〔７〕に記載のベクターが導入された植物細胞。
〔１０〕〔９〕に記載の植物細胞を含む形質転換植物体。
〔１１〕〔１０〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔１２〕〔１０〕または〔１１〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔１３〕〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の核酸構築物を植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む、形質転換植物体の製造方法。
〔１４〕〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の核酸構築物を単子葉植物の細胞内で発現させる工程を含む、単子葉植物の病害への抵抗性を向上させる方法。
〔１５〕〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の核酸構築物、または〔７〕に記載のベクターを有効成分とする、単子葉植物の病害への抵抗性を向上させる薬剤。
〔１６〕〔１０〕または〔１１〕に記載の形質転換植物体、若しくは〔１２〕に記載の繁殖材料を含む飲食品組成物および加工品。
〔１〕下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載された、単子葉植物の病害への抵抗性を向上させる機能を有する単子葉植物由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および、単子葉植物の病害抵抗性と農業形質が両立するように該ポリヌクレオチドの発現を制御する機能を有するプロモーターを含む核酸構築物；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
〔２〕前記プロモーターが、前記ポリヌクレオチドの植物体における発現量の、植物体内在性OsUbi1の発現量に対する相対値を、 0.95〜0.17に制御する機能を有するプロモーターであることを特徴とする、〔１〕に記載の核酸構築物。
〔３〕前記プロモーターが、イネ植物体のユビキチン・プロモーター又はイネ植物体のペプチド伸長因子遺伝子プロモーターであることを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載の核酸構築物。
〔４〕前記プロモーターが、配列番号：３または５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることを特徴とする、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の核酸構築物。
〔５〕前記単子葉植物の病害が糸状菌性の病害であることを特徴とする、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の核酸構築物。
〔６〕前記単子葉植物の病害が細菌性の病害であることを特徴とする、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の核酸構築物。
〔７〕〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
〔８〕〔７〕に記載のベクターが導入された宿主細胞。
〔９〕〔７〕に記載のベクターが導入された植物細胞。
〔１０〕〔９〕に記載の植物細胞を含む形質転換植物体。
〔１１〕〔１０〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔１２〕〔１０〕または〔１１〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔１３〕〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の核酸構築物を植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む、形質転換植物体の製造方法。
〔１４〕〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の核酸構築物を単子葉植物の細胞内で発現させる工程を含む、単子葉植物の病害への抵抗性を向上させる方法。
〔１５〕〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の核酸構築物、または〔７〕に記載のベクターを有効成分とする、単子葉植物の病害への抵抗性を向上させる薬剤。
〔１６〕〔１０〕または〔１１〕に記載の形質転換植物体、若しくは〔１２〕に記載の繁殖材料を含む飲食品組成物および加工品。
本発明は、単子葉植物の病害への抵抗性を向上させる機能を有する単子葉植物由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および、単子葉植物の病害抵抗性と農業形質が両立するように、該ポリヌクレオチドの発現を制御する機能を有するプロモーターを含む核酸構築物を提供する。
本発明において、「単子葉植物の病害」とは、糸状菌（主にカビ）、細菌、ウイルスなどの病原体によって引き起こされる植物の生理障害に相当し、農業生産や生態環境を損なう危険性のあるものをいう。病原体は特に限定されず、上記３つの病原体の他に、放線菌類、藻類、ファイトプラズマ(植物病原微生物)等による病害も存在する。
本発明において、病害が発症する単子葉植物は特に限定されるものではないが、好ましくはイネ科植物であり、より好ましくはイネである。
以下、単子葉植物の病害の代表的な３つの病原体（糸状菌、細菌、ウイルス）、およびこれらの病原体による病害の態様を説明する。本発明の「病害」は特に制限されないが、以下に説明する病害のいずれかであってもよい。
糸状菌は、多細胞の「菌糸」から成る微生物で、胞子を作って増殖する。キチン質による強固な細胞壁を持ち、そのため薬剤に強いとされている。糸状菌は、形態・性質などにより、藻菌類（カビ）、不完全菌類（カビ）、子のう菌類（カビ・キノコ）、担子菌類（キノコ）に分類される。藻菌類はさらに、鞭毛菌類、接合菌類に分かれている。
糸状菌類の病害には様々な症状が存在し、茎葉に病斑を作るものや腐敗させるもの、地際や根を侵して立ち枯れを招くもの、コブなどのできものを作るもの、などがある。糸状菌性の病態の大きな傾向としては、発病部分に粉のようなカビや、黒い粒々（菌核＝菌糸の塊）を生じることがよくある。イネにおける糸状菌性の代表的な病害としては、イネ褐色米病、イネ褐色菌核病、イネ黄化萎縮病、イネ褐色葉枯病、イネ褐色小粒菌核病、イネ眼斑病、イネ黒しゅ病、イネごま葉枯病、イネシナモン色かび病、イネ小球菌核病、イネシナモン色かび病、イネ墨黒穂病、イネ赤色菌核病などを挙げることが出来る。実施例におけるモデル病態であるイネいもち病も、糸状菌性病害にあたるが、この病態に制限されるものではない。
細菌は、一個の細胞から成る微生物で、種類によってさまざまな形状をしている。細菌は、水中を泳いで移動し、株にできた傷口や、葉裏の気孔などから植物体に侵入する。細菌性の病害には、茎葉を腐敗させるもの、急な立ち枯れを招くもの、がんしゅ状のできものを作るもの、などがある。病態の大きな傾向としては、病斑の輪郭がやや不鮮明で、病斑の周辺が黄色く変色する傾向が挙げられる。イネにおける細菌性の代表的な病害としては、イネ褐条病、イネ白葉枯病、イネ内穎褐変病、イネもみ枯細菌病、イネ苗立枯細菌病などを挙げることが出来る。実施例におけるモデル病態であるイネ白葉枯病は、細菌性病害にあたるが、この病態に制限されるものではない。
ウイルスは、基本的に核酸とタンパク質から成り、種類により様々な形状を持つ。DNAまたはRNAのいずれか一方しか持たず、他の生物の細胞内に侵入し、その細胞の核酸合成・タンパク質合成機能を利用しなければ増殖できない。ウイルスに性質が似ており、同様の病害をもたらすものとして、ウイロイドというものが存在する。ウイロイドは、核酸部分はRNAのみでタンパク質を持たず、ウイルスよりさらに小型である。ウイルスやウイロイドによる病害は、多くの場合、葉や花に淡い斑模様が入るモザイク症状や、萎縮・変形などの奇形化、小さな褐色の壊疽斑点などを伴う。また、株全体が黄色くなって小型化し、著しく生育が阻害されることもある。イネにおけるウイルス性の代表的な病害としては、イネ黒条萎縮病、イネトランジトリーイエローイング病、イネわい化病などを挙げることが出来る。
本発明において、「単子葉植物の病害への抵抗性を向上させる」とは、本発明の核酸構築物を単子葉植物内で発現させることにより、上記に記載の病害の症状が生じないようにする、もしくは症状が生じにくくなる形質・効果を単子葉植物に獲得させることをいう。また、病原体に対する抵抗力を向上させ、病原体の感染を低下させるという形質・効果にも相当する。
病害への抵抗性の向上効果は、単子葉植物の生存期間内は継続的に続く効果であってもよいし、ある一定期間（例えば、生育初期段階のみ）に発現する効果であってもよい。
また、複数の病原体に対して抵抗性を持つものであってもよいし、ある特定の病原体にのみ抵抗性を持つものであってもよい。
本発明の「単子葉植物の病害への抵抗性を向上させる機能を有する単子葉植物由来のタンパク質」としては、好ましくは転写因子、より好ましくはWRKY型転写因子を挙げることが出来る。
本発明の転写因子遺伝子のcDNAの塩基配列を配列番号：１に、該ポリヌクレオチドがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
本発明の転写因子は、単子葉植物の病害への抵抗性を向上させる作用を有していることから、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドで植物を形質転換することにより、病原体に対する抵抗力を持った単子葉植物の育成が可能である。
本発明は、配列番号：２に記載の転写因子タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含する。ここで「転写因子タンパク質と同等の機能を有する」とは、対象となるタンパク質が単子葉植物の病害に対する抵抗性を向上させる機能を有することを指す。このようなポリヌクレオチドは、好ましくはイネ科植物由来であり、より好ましくはイネ由来である。
このようなポリヌクレオチドには、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アレル、バリアントおよびホモログが含まれる。
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、site-directed mutagenesis法が挙げられる。また、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても生じ得る。このように天然型の転写因子タンパク質をコードするアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであっても、天然型の転写因子タンパク質（配列番号：２）と同等の機能を有するタンパク質をコードする限り、本発明のポリヌクレオチドに含まれる。また、たとえ、塩基配列が変異した場合でも、それがタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）もあり、このような縮重変異体も本発明のポリヌクレオチドに含まれる。
あるポリヌクレオチドが植物の病害への抵抗性を向上させる機能を有するタンパク質をコードするか否かは以下のようにして評価することができる。最も一般的な方法としては、該ポリヌクレオチドが導入された植物に、病害を引き起こすことが分かっている既知の病原体を添加し、グロースチャンバーで栽培しながら、その後の病態を調べる手法である。病原体を添加したにも関わらず、病害の症状が表れない場合には、導入したポリヌクレオチドが植物の病害への抵抗性を向上させる機能を有するタンパク質をコードしていることが分かる。病害の症状を抑制・減少していた場合であっても、植物の病害への抵抗性を向上させる機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入されたと解釈してもよい。
配列番号：２に記載の転写因子タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、転写因子遺伝子の塩基配列（配列番号：１）もしくはその一部をプローブとして、また転写因子遺伝子（配列番号：１）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネや他の植物から転写因子遺伝子と高い相同性を有するポリヌクレオチドを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やPCR技術により単離しうる転写因子タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた本発明のポリヌクレオチドに含まれる。
このようなポリヌクレオチドを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、6M尿素、 0.4%SDS、0.5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件を用いることにより、より相同性の高いポリヌクレオチドの単離を期待することができる。これにより単離されたDNAは、アミノ酸レベルにおいて、転写因子タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%,96%,97%,98%,99%以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J. Mol. Biol. 215: 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
本発明において用いられるプロモーターは、単子葉植物の病害抵抗性と農業形質が両立するように、単子葉植物の病害への抵抗性を向上させる機能を有する単子葉植物由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を制御する機能を有するプロモーターである。
本発明において、上記プロモーターの下流に、単子葉植物の病害への抵抗性を向上させる機能を有する単子葉植物由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが機能的に結合されていることが好ましい。上記プロモーターの活性化を通じて、該タンパク質および該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、宿主細胞、植物細胞、形質転換植物体、又は形質転換植物体の繁殖材料において発現させることができる。
上記プロモーターの活性については、当業者はレポーター遺伝子を用いた周知のレポーターアッセイ等により確認することが可能である。該レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるCAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）及びGFP遺伝子等を挙げることができる。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるGlucuron（ICN社）の発光や5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-グルクロニド（X-Gluc）の発色を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
本発明において、「機能的に結合した」とは、本発明のプロモーターに転写因子が結合することにより、下流の該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現が誘導されるように、本発明のプロモーターと該タンパク質をコードするポリヌクレオチドとが結合していることをいう。従って、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、本発明のプロモーターに転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
本発明において、「単子葉植物の病害抵抗性と農業形質が両立する」とは、単子葉植物が上述の病害抵抗性（病害への抵抗性が向上した性質）を有しつつ、農業形質が天然由来の単子葉植物と同等であること、または改良されていることを示す。本発明において、「農業形質が天然由来の単子葉植物と同等であること、または改良されていること」とは、植物のあらゆる器官（組織）、例えば、穂、稈、種子、籾、米、穎果、分げつ、小穂などのサイズ、総重量、数量などが天然由来の単子葉植物と同等であること、又は天然由来の単子葉植物と比較して増大することを意味する。また、本発明において「農業形質が天然由来の単子葉植物と同等であること、または改良されていること」とは、該器官（組織）に関わる形質（例えば、イネ、トウモロコシなどは穂、稈の数や大きさ、イネ、トウモロコシなどは種子（胚乳）の数や大きさ、その他、形の変化、着色など）が同等であること、または改良されていることを意味する。
上記、農業形質の評価は、例えばイネ植物体の穂、稈については、トランスジェニックイネ科植物、またはトランスジェニックイネ科植物の自家受粉で得られたＴ１種子又はＴ２種子を適当な生育培地又は生育土壌に定植あるいは播種し、長日条件下（昼／夜：１６時間／８時間日長）、２０〜３０℃で生育させて穂、稈（例えば分けつ）の数、大きさ、形等を調べることにより評価することができる。また、イネ植物体の花序、穎果、種子、穀粒、籾、米については、トランスジェニックイネ科植物、またはトランスジェニックイネ科植物の自家受粉で得られたＴ１種子又はＴ２種子を適当な生育培地又は生育土壌に定植あるいは播種し、長日条件下（昼／夜：１６時間／８時間日長）、２０〜３０℃で生育させて花序、穎果、種子、穀粒、籾、米の数、大きさ、形等を調べることにより評価することができる。単子葉植物の育成は、閉鎖系又は非閉鎖系の温室、（完全人工光の）グロースチャンバー、温度および湿度が室外の気温および湿度に追随するガラス温室（擬似田圃）、若しくは実験農場等で行うことが出来る。
本発明のプロモーターの好ましい例としては、本発明のポリヌクレオチドの植物体における発現量の、植物体内在性OsUbi1の発現量に対する相対値を、1未満に制御する機能を有するプロモーターを例示することができる。本発明において「内在性OsUbi1」とは、イネユビキチン１遺伝子（rice ubiquitin 1 gene、Rubq1と表記されることもある）のことであり、DDBJ Accession_No. AK121590としてGenbankに登録されている遺伝子のことを意味する。「内在性OsUbi1」の発現量は、リアルタイム定量RT-PCR解析法（検量線法）等により測定され、発現量コントロールとして利用される。本発明において「相対値」は、植物体における「内在性OsUbi1」の発現量に対する「相対値」として計算され、植物体における「内在性OsUbi1」の発現量を１とした際の、当該プロモーターによる前記ポリヌクレオチドの発現量の割合（発現レベル）が計算される。内在性OsUbi1遺伝子または該プロモーターによる前記ポリヌクレオチドの発現量の測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該遺伝子または前記ポリヌクレオチドのmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはRT-PCR法（例えば、リアルタイム定量RT-PCR解析法）を実施することによって該遺伝子または前記ポリヌクレオチドの発現量の測定を行うことができる。上記「相対値」は1未満であれば特に制限されることはないが、好ましくは0.99〜0.10の範囲、より好ましくは0.95〜0.17の範囲を例示することができる。
本発明のプロモーターの好ましい例としては、イネ植物体のユビキチン・プロモーター又はイネ植物体のペプチド伸長因子遺伝子プロモーターを例示することができる。
本発明のプロモーターのより好ましい例としては、OsUbi7遺伝子プロモーターまたはeEF1α遺伝子プロモーターを例示することができる。より具体的には、本発明のプロモーターとしては、下記（ａ）または（ｂ）に記載されたポリヌクレオチドを例示することができる。
（ａ）配列番号：３または５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、または
（ｂ）配列番号：３または５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：３または５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、または
（ｂ）配列番号：３または５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
本発明の核酸構築物は、例えば、組換えタンパク質の調製や病害に対する抵抗性が向上した形質転換植物体の作出などに利用することが可能である。
本発明の核酸構築物を利用して植物の病害への抵抗性が向上した形質転換植物体を作製する場合には、本発明の核酸構築物を適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。本発明者等により単離された転写因子遺伝子は、植物の病害への抵抗性を向上させる作用を有するが、この転写因子遺伝子を任意の品種に導入し、プロモーターにより発現を制御することによりそれらの系統の病害への抵抗性を向上させることが可能である。この形質転換に要する期間は、従来のような交配による遺伝子移入に比較して極めて短期間であり、また、他の形質の変化を伴わない点で有利である。
また、本発明は、上記本発明の核酸構築物が挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターとしては、組み換えタンパク質の生産に用いる上記したベクターの他、形質転換植物体作製のために植物細胞内で本発明の核酸構築物を発現させるためのベクターも含まれる。このようなベクターとしては、転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列を含んでいれば特に制限されず、例えば、プラスミド「pBI121」、「pBI221」、「pBI101」（いずれもClontech社製）などが挙げられる。植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。ここでいう「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
また、本発明は、本発明のベクターが導入された形質転換細胞を提供する。本発明のベクターが導入される細胞には、組み換えタンパク質の生産に用いる上記した細胞の他に、形質転換植物体作製のための植物細胞が含まれる。植物細胞としては特に制限はなく、例えば、イネ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、ジャガイモ、タバコなどの細胞が挙げられる。本発明の植物細胞には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。また、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法、およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
形質転換された植物細胞は、再分化させることにより植物体を再生させることが可能である。再分化の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えば、イネであればFujimuraら（Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995)）の方法が挙げられ、トウモロコシであればShillitoら（Bio/Technology 7:581 (1989)）の方法やGorden-Kammら（Plant Cell 2:603(1990)）が挙げられ、ジャガイモであればVisserら（Theor.Appl.Genet 78:594 (1989)）の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe（Planta 99:12(1971)）の方法が挙げられ、シロイヌナズナであればAkamaら（Plant Cell Reports 12:7-11 (1992)）の方法が挙げられ、ユーカリであれば土肥ら（特開平8-89113号公報）の方法が挙げられる。
一旦、ゲノム内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNAが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
このようにして作出された病害への抵抗性が向上した単子葉植物体は、野生型単子葉植物体と比較して、病原体への抵抗性が向上している。例えば、転写因子OsWRKY45をコードするDNAが導入された単子葉植物体は、いもち病菌に対して非常に高い抵抗性を示すことが明らかになった。本発明の手法を用いれば、有用農作物であるイネにおいては、無農薬栽培が可能となり、環境破壊の予防や生産性の向上に繋がるものと考えられる。
本発明は、該核酸構築物、もしくは該ベクターを有効成分とする、植物の病害への抵抗性を向上させる薬剤に関する。
本発明の薬剤においては、有効成分である核酸構築物またはベクター以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
また本発明は、本発明の上記形質転換植物体または繁殖材料を含む飲食品組成物および加工品を提供する。本発明の単子葉植物（例えば、イネ植物体）の繁殖材料としては米を例示することができる。本発明の当該米は、通常の米と同様の用途に使用することができる。例えば米そのものを、炊く、煮る、炒める、蒸す、あるいは揚げる等の処理をすることにより食用とすることができる。また、米以外の飲食品組成物と組み合わせて使用することもできる。例えば、炊き込みご飯、雑炊、炒飯等に利用しても構わない。また、米を粉砕することにより、米粉、白玉粉、うどん、そば、スパゲティ、マカロニ、ビーフン、パン、又はせんべい、あられ、クッキー等の米菓子等の加工原料としてもよい。また米油等の抽出原料として用いても構わない。さらに、醸造または発酵等の原料として利用してもよい。米ぬかも飲食品を漬けるための用途に利用されても構わない。勿論本発明の形質転換植物体または繁殖材料は、人間だけでなく、動物用飼料（例えばペットフード）として用いても構わない。また当該飲食品組成物および加工品は、容器包装した形態であってもよい。例えば、プラスチック成型容器などの容器に封入された形態であったり、レトルトパウチなどの容器に封入され密封後に殺菌された飲食品も本発明に含まれる。つまり、本発明の形質転換植物体または繁殖材料の用途および用法は特に制限されない。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕ベクター構築
OsWRKY45を植物で構成的に発現させるためのベクターは以下のような手順で作製した。まず、pZH1をHindIII-PacIで消化し、pZH1-Ubi-WRKY45-NT (Shimono, M. et al., Plant Cell, 19, 2064-2076 (2007))由来のSfiI-PacI断片と相補的オリゴ DNA (top 鎖：AGCTTGGCCAAAT（配列番号：９） 及びbottom 鎖：TGGCCAをアニールしたもの)を挿入してプラスミドベクターpZH1-WRKY45-NT-1を構築した。このベクターをHindIIIで消化し、相補的オリゴ DNA (top 鎖：AGCTGGCGCGCCATTTAAATA（配列番号：１０） 及びbottom 鎖：AGCTTATTTAAATGGCGCGCC（配列番号：１１）をアニールしたもの)を挿入してpZH1-WRKY45-NT-2を構築した。
OsWRKY45の発現に用いるプロモーターを取得するための遺伝子の候補をデータベース（NCBI、RiceXPro）における遺伝子発現レベルの情報等を参考にして10個（ChaC、SADP、AAT、CBS、NONE、LTP、OsUbi1、eEF1α、OsUbi7、ACT8）選定した。データベース（RAP-DB）の情報に基づき、これらの遺伝子の翻訳開始点上流約2kbの配列をプライマーを用いてPCR増幅し、HindIIIで消化したpZH1-WRKY45-NT-2にin fusion kit（タカラバイオ）を用いて挿入してOsWRKY45恒常発現形質転換ベクターを構築した（図１）。PCR増幅させた配列はシークエンスによって、その配列を確認した。pZH1-POsUbi7-WRKY45-NT（POsUbi7プロモーターを導入したベクター）のPOsUbi7-WRKY45部分の塩基配列を配列番号：４に、pZH1-PeEF1a-WRKY45-NT(PeEF1aプロモーターを導入したベクター)のPeEF1a-WRKY45部分の塩基配列を配列番号：６に、pZH1-POsUbi1-WRKY45-NT（POsUbi1プロモーターを導入したベクター）のPOsUbi1-WRKY45部分の塩基配列を配列番号：８に示す。
〔実施例１〕ベクター構築
OsWRKY45を植物で構成的に発現させるためのベクターは以下のような手順で作製した。まず、pZH1をHindIII-PacIで消化し、pZH1-Ubi-WRKY45-NT (Shimono, M. et al., Plant Cell, 19, 2064-2076 (2007))由来のSfiI-PacI断片と相補的オリゴ DNA (top 鎖：AGCTTGGCCAAAT（配列番号：９） 及びbottom 鎖：TGGCCAをアニールしたもの)を挿入してプラスミドベクターpZH1-WRKY45-NT-1を構築した。このベクターをHindIIIで消化し、相補的オリゴ DNA (top 鎖：AGCTGGCGCGCCATTTAAATA（配列番号：１０） 及びbottom 鎖：AGCTTATTTAAATGGCGCGCC（配列番号：１１）をアニールしたもの)を挿入してpZH1-WRKY45-NT-2を構築した。
OsWRKY45の発現に用いるプロモーターを取得するための遺伝子の候補をデータベース（NCBI、RiceXPro）における遺伝子発現レベルの情報等を参考にして10個（ChaC、SADP、AAT、CBS、NONE、LTP、OsUbi1、eEF1α、OsUbi7、ACT8）選定した。データベース（RAP-DB）の情報に基づき、これらの遺伝子の翻訳開始点上流約2kbの配列をプライマーを用いてPCR増幅し、HindIIIで消化したpZH1-WRKY45-NT-2にin fusion kit（タカラバイオ）を用いて挿入してOsWRKY45恒常発現形質転換ベクターを構築した（図１）。PCR増幅させた配列はシークエンスによって、その配列を確認した。pZH1-POsUbi7-WRKY45-NT（POsUbi7プロモーターを導入したベクター）のPOsUbi7-WRKY45部分の塩基配列を配列番号：４に、pZH1-PeEF1a-WRKY45-NT(PeEF1aプロモーターを導入したベクター)のPeEF1a-WRKY45部分の塩基配列を配列番号：６に、pZH1-POsUbi1-WRKY45-NT（POsUbi1プロモーターを導入したベクター）のPOsUbi1-WRKY45部分の塩基配列を配列番号：８に示す。
〔実施例２〕プロモーター解析
POsUbi1およびPOsUbi7プロモーターの制御下にβ-グルクロニダーゼ（GUS）レポーター遺伝子を発現させるためのベクター（pZH1-POsUbi1-GUS-NTおよびpZH1-POsUbi7-GUS-NT）を作製するには、pZH1-POsUbi1-WRKY45-NTをXbaIおよび BamHI で、pZH1-POsUbi7-WRKY45-NTをHindIII（partial）および BamHIでそれぞれ切断し、PCRで増幅したGUS断片をin fusion kit（タカラバイオ）を用いて切断サイト挿入した（図２）。
作製した形質転換イネを用いたGUS活性の組織化学的染色は、基本的にはJefferson の方法（Jefferson, R.A. (1989). The GUS reporter gene system. Nature 342, 837-838.）を用いて行った。具体的には、T1形質転換イネの幼苗（4.5〜5葉期）を、アセトン中で1分間静置した後、GUS染色液（100 mMリン酸ナトリウムバッファーpH7.0、10 mM EDTA pH7.0、0.5 mM K Ferricyanide pH7.0、0.5 mM K Ferrocyanide pH7.0、1 mM X-Glucuronide、0.05% Silwet L-77）に浸し、減圧デシケーター中で1時間脱気した後、37℃で24時間静置して染色反応を行った。その後、染色液を除き、70%エタノール中、37℃で24時間静置して脱色し、染色パターンを観察した。
GUS染色の結果、いずれのプロモーターによるイネ系統においても、植物体全体で染色が認められた。この結果は、これらのプロモーターをWRKY45遺伝子の発現に用いた時、植物体全体でWRKY45が発現することを示しており、多様な部位への病原体の感染に対応できることを示す。
POsUbi1およびPOsUbi7プロモーターの制御下にβ-グルクロニダーゼ（GUS）レポーター遺伝子を発現させるためのベクター（pZH1-POsUbi1-GUS-NTおよびpZH1-POsUbi7-GUS-NT）を作製するには、pZH1-POsUbi1-WRKY45-NTをXbaIおよび BamHI で、pZH1-POsUbi7-WRKY45-NTをHindIII（partial）および BamHIでそれぞれ切断し、PCRで増幅したGUS断片をin fusion kit（タカラバイオ）を用いて切断サイト挿入した（図２）。
作製した形質転換イネを用いたGUS活性の組織化学的染色は、基本的にはJefferson の方法（Jefferson, R.A. (1989). The GUS reporter gene system. Nature 342, 837-838.）を用いて行った。具体的には、T1形質転換イネの幼苗（4.5〜5葉期）を、アセトン中で1分間静置した後、GUS染色液（100 mMリン酸ナトリウムバッファーpH7.0、10 mM EDTA pH7.0、0.5 mM K Ferricyanide pH7.0、0.5 mM K Ferrocyanide pH7.0、1 mM X-Glucuronide、0.05% Silwet L-77）に浸し、減圧デシケーター中で1時間脱気した後、37℃で24時間静置して染色反応を行った。その後、染色液を除き、70%エタノール中、37℃で24時間静置して脱色し、染色パターンを観察した。
GUS染色の結果、いずれのプロモーターによるイネ系統においても、植物体全体で染色が認められた。この結果は、これらのプロモーターをWRKY45遺伝子の発現に用いた時、植物体全体でWRKY45が発現することを示しており、多様な部位への病原体の感染に対応できることを示す。
〔実施例３〕OsWRKY45導入遺伝子の発現解析
作製したOsWRKY45過剰発現体におけるOsWRKY45導入遺伝子の発現解析を行うには、アグロバクテリウム感染によって作製した形質転換体のT1世代と非形質転換体を培土（ボンソル2号）に植え換え、グロースチャンバー内で栽培を行った。1ヶ月半後、最上位完全展開葉をサンプリングし、RNA抽出後、リアルタイムRT-PCRによって導入したOsWRKY45の発現解析を行った（図３）。プライマーはForward鎖TGTGTGACAAGCAAGAGAAGAGGA（配列番号：１２）、Reverse鎖AACGATCGGGGAAATTCGAG（配列番号：１３）を用いた。図３においては、実施例４及び５において複合病害抵抗性を示した、3種のプロモーター（POsUbi1, PeEF1α, POsUbi7）による発現結果のみを示す。
作製したOsWRKY45過剰発現体におけるOsWRKY45導入遺伝子の発現解析を行うには、アグロバクテリウム感染によって作製した形質転換体のT1世代と非形質転換体を培土（ボンソル2号）に植え換え、グロースチャンバー内で栽培を行った。1ヶ月半後、最上位完全展開葉をサンプリングし、RNA抽出後、リアルタイムRT-PCRによって導入したOsWRKY45の発現解析を行った（図３）。プライマーはForward鎖TGTGTGACAAGCAAGAGAAGAGGA（配列番号：１２）、Reverse鎖AACGATCGGGGAAATTCGAG（配列番号：１３）を用いた。図３においては、実施例４及び５において複合病害抵抗性を示した、3種のプロモーター（POsUbi1, PeEF1α, POsUbi7）による発現結果のみを示す。
〔実施例４〕いもち病接種検定
T1世代のOsWRKY45過剰発現体におけるいもち病抵抗性の変化を検定するには、非形質転換体種子をMS培地に、T1形質転換体種子を30μg/mlハイグロマイシン含有のMS培地にそれぞれ無菌的に播種し、30℃で5日間培養した後、隔離温室内で培土（ボンソル2号）に植え換えた。その後、13日間育てたOsWRKY45過剰発現体と非形質転換体のイネ幼苗（5葉期）に1.0×105 spore/mlに調製したいもち菌胞子（race 007）をスプレー接種し、７日後に第5葉中心付近10cm長における病斑数を計数した。その結果、3種のプロモーター（POsUbi1, PeEF1α, POsUbi7）によるOsWRKY45過剰発現体において、いもち病感染による病斑数が非形質転換体に比べて顕著に減少しており、いもち病抵抗性が改善していることがわかった（図４）。一方、POsUbi1, PeEF1α, POsUbi7以外の７種のプロモーターをそれぞれ有するコンストラクトを導入した形質転換個体系統は、より弱いいもち病抵抗性を示した。
T1世代のOsWRKY45過剰発現体におけるいもち病抵抗性の変化を検定するには、非形質転換体種子をMS培地に、T1形質転換体種子を30μg/mlハイグロマイシン含有のMS培地にそれぞれ無菌的に播種し、30℃で5日間培養した後、隔離温室内で培土（ボンソル2号）に植え換えた。その後、13日間育てたOsWRKY45過剰発現体と非形質転換体のイネ幼苗（5葉期）に1.0×105 spore/mlに調製したいもち菌胞子（race 007）をスプレー接種し、７日後に第5葉中心付近10cm長における病斑数を計数した。その結果、3種のプロモーター（POsUbi1, PeEF1α, POsUbi7）によるOsWRKY45過剰発現体において、いもち病感染による病斑数が非形質転換体に比べて顕著に減少しており、いもち病抵抗性が改善していることがわかった（図４）。一方、POsUbi1, PeEF1α, POsUbi7以外の７種のプロモーターをそれぞれ有するコンストラクトを導入した形質転換個体系統は、より弱いいもち病抵抗性を示した。
〔実施例５〕白葉枯病接種検定
T1世代のOsWRKY45過剰発現体における白葉枯病抵抗性の変化を検定するには、非形質転換体種子をMS培地に、T1形質転換体種子を30 μg/mlハイグロマイシン含有のMS培地に、それぞれ無菌的に播種し、5日間30℃で培養した後、隔離温室内でボンソル2号に植え換えた。その後、30日間育てたOsWRKY45過剰発現体と非形質転換体にOD600 = 0.03の濃度に調製した白葉枯病菌細菌浮遊液（T7174株）に浸漬した外科用鋏で剪葉接種を行った。接種イネは隔離温室で管理し、接種後２週間後に葉先からの病斑長を測定した。その結果、3種のプロモーター（POsUbi1, PeEF1α, POsUbi7）によるOsWRKY45過剰発現体において、白葉枯病感染による病斑の進展が顕著に抑制されていた。この結果から、OsWRKY45過剰発現体は、白葉枯病に対しても強い抵抗性を示すことが明らかになった（図４）。一方、POsUbi1, PeEF1α, POsUbi7以外の７種のプロモーターをそれぞれ有するコンストラクトを導入した形質転換個体系統は、より弱い白葉枯病抵抗性を示した。
T1世代のOsWRKY45過剰発現体における白葉枯病抵抗性の変化を検定するには、非形質転換体種子をMS培地に、T1形質転換体種子を30 μg/mlハイグロマイシン含有のMS培地に、それぞれ無菌的に播種し、5日間30℃で培養した後、隔離温室内でボンソル2号に植え換えた。その後、30日間育てたOsWRKY45過剰発現体と非形質転換体にOD600 = 0.03の濃度に調製した白葉枯病菌細菌浮遊液（T7174株）に浸漬した外科用鋏で剪葉接種を行った。接種イネは隔離温室で管理し、接種後２週間後に葉先からの病斑長を測定した。その結果、3種のプロモーター（POsUbi1, PeEF1α, POsUbi7）によるOsWRKY45過剰発現体において、白葉枯病感染による病斑の進展が顕著に抑制されていた。この結果から、OsWRKY45過剰発現体は、白葉枯病に対しても強い抵抗性を示すことが明らかになった（図４）。一方、POsUbi1, PeEF1α, POsUbi7以外の７種のプロモーターをそれぞれ有するコンストラクトを導入した形質転換個体系統は、より弱い白葉枯病抵抗性を示した。
〔実施例６〕擬似田圃温室での生育評価
形質転換体の農業形質を圃場環境下に近い条件で評価するため、温度および湿度が室外の気温および湿度に追随するガラス温室（擬似田圃）を用いて、T1世代の各形質転換体の栽培を行った。2010年5月24日に、非形質転換体種子をMS培地に、T1形質転換体種子を30 μg/mlハイグロマイシン含有のMS培地にそれぞれ無菌的に播種し、17日間30℃で培養した後、擬似田圃内でボンソル2号に植え換えた。温室内の場所による影響を避けるため、週に2回場所のローテーションを行った。9月24日に草丈の計測および有効分げつ数の計数を行った。10月6日に収穫を行い、粒数を計数した。導入遺伝子のホモ・ヘテロ性に関する個体選抜は、ゲノムDNAを用いたリアルタイムPCRと収穫した種子の発芽・生育を指標にしたハイグロマイシンによる選抜によって行った。これら評価の結果、POsUbi1プロモーターによるOsWRKY45過剰発現イネは、トウモロコシ・ユビキチン・プロモーター(PmaizeUbi)によるOsWRKY45過剰発現イネよりは改善されているが、依然として農業形質の悪化が見られた。それに対し、POsUbi7プロモーターによるOsWRKY45過剰発現イネは、トウモロコシ・ユビキチン・プロモーターやPOsUbi1プロモーターによるOsWRKY45過剰発現イネより、自然環境に近い温室（擬似田圃）においてはるかに良好な農業形質を示し、非形質転換体と比較して遜色なかった（図５、６）。これにより、これらのイネ系統は自然環境に近い環境において複合抵抗性と生育が両立した形質をもつことが示され、これらのイネ系統が実用化に適していることが明らかとなった。また、PeEF1αプロモーターによるOsWRKY45過剰発現イネは、平均ではPOsUbi7プロモーターによるOsWRKY45過剰発現イネに次ぐ生育を自然環境に近い温室（擬似田圃）において示しており、系統によっては非形質転換体と比較して遜色なかった（図５、６）。
形質転換体の農業形質を圃場環境下に近い条件で評価するため、温度および湿度が室外の気温および湿度に追随するガラス温室（擬似田圃）を用いて、T1世代の各形質転換体の栽培を行った。2010年5月24日に、非形質転換体種子をMS培地に、T1形質転換体種子を30 μg/mlハイグロマイシン含有のMS培地にそれぞれ無菌的に播種し、17日間30℃で培養した後、擬似田圃内でボンソル2号に植え換えた。温室内の場所による影響を避けるため、週に2回場所のローテーションを行った。9月24日に草丈の計測および有効分げつ数の計数を行った。10月6日に収穫を行い、粒数を計数した。導入遺伝子のホモ・ヘテロ性に関する個体選抜は、ゲノムDNAを用いたリアルタイムPCRと収穫した種子の発芽・生育を指標にしたハイグロマイシンによる選抜によって行った。これら評価の結果、POsUbi1プロモーターによるOsWRKY45過剰発現イネは、トウモロコシ・ユビキチン・プロモーター(PmaizeUbi)によるOsWRKY45過剰発現イネよりは改善されているが、依然として農業形質の悪化が見られた。それに対し、POsUbi7プロモーターによるOsWRKY45過剰発現イネは、トウモロコシ・ユビキチン・プロモーターやPOsUbi1プロモーターによるOsWRKY45過剰発現イネより、自然環境に近い温室（擬似田圃）においてはるかに良好な農業形質を示し、非形質転換体と比較して遜色なかった（図５、６）。これにより、これらのイネ系統は自然環境に近い環境において複合抵抗性と生育が両立した形質をもつことが示され、これらのイネ系統が実用化に適していることが明らかとなった。また、PeEF1αプロモーターによるOsWRKY45過剰発現イネは、平均ではPOsUbi7プロモーターによるOsWRKY45過剰発現イネに次ぐ生育を自然環境に近い温室（擬似田圃）において示しており、系統によっては非形質転換体と比較して遜色なかった（図５、６）。
本発明において、イネの転写因子OsWRKY45の遺伝子を単子葉植物において、適切なプロモーター制御下で高発現させることによって、病害抵抗性と農業形質が両立した形質転換植物体の作出に成功した。
本発明により作出された複合病害抵抗性と農業形質のバランスがとれた遺伝子組換え単子葉植物は、飼料用や食用、バイオ燃料用などの作物の栽培現場で用いられる実用技術に発展する可能性があるものと考えられる。
本発明の方法を発展させて実用化することが出来れば、減農薬粗放栽培が可能になり、経済性および安全性における効果は大きいものと考えられる。
Claims (16)
- 下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載された、単子葉植物の病害への抵抗性を向上させる機能を有する単子葉植物由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および、単子葉植物の病害抵抗性と農業形質が両立するように該ポリヌクレオチドの発現を制御する機能を有するプロモーターを含む核酸構築物；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。 - 前記プロモーターが、前記ポリヌクレオチドの植物体における発現量の、植物体内在性OsUbi1の発現量に対する相対値を、0.95〜0.17に制御する機能を有するプロモーターであることを特徴とする、請求項１に記載の核酸構築物。
- 前記プロモーターが、イネ植物体のユビキチン・プロモーター又はイネ植物体のペプチド伸長因子遺伝子プロモーターであることを特徴とする、請求項１または２に記載の核酸構築物。
- 前記プロモーターが、配列番号：３または５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸構築物。
- 前記単子葉植物の病害が糸状菌性の病害であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸構築物。
- 前記単子葉植物の病害が細菌性の病害であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸構築物。
- 請求項１から６のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
- 請求項７に記載のベクターが導入された宿主細胞。
- 請求項７に記載のベクターが導入された植物細胞。
- 請求項９に記載の植物細胞を含む形質転換植物体。
- 請求項１０に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
- 請求項１０または１１に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
- 請求項１から６のいずれかに記載の核酸構築物を植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む、形質転換植物体の製造方法。
- 請求項１から６のいずれかに記載の核酸構築物を単子葉植物の細胞内で発現させる工程を含む、単子葉植物の病害への抵抗性を向上させる方法。
- 請求項１から６のいずれかに記載の核酸構築物、または請求項７に記載のベクターを有効成分とする、単子葉植物の病害への抵抗性を向上させる薬剤。
- 請求項１０または１１に記載の形質転換植物体、若しくは請求項１２に記載の繁殖材料を含む飲食品組成物および加工品。
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