KR20030052244A - 쌀-기원의 높은 발현 폴리펩타이드 체인 신장 인자프로모터 및 그의 이용방법 - Google Patents

Abstract

식물 조직(특히 왕성한 세포 증식을 지닌 조직) 내에서 외부 유전자를 강하게 발현하는 프로모터 활성을 지닌 DNA. 이러한 DNA는 서열번호: 1에 나타난 서열 또는 그의 일부분을 포함한 서열을 지니고 서열번호: 1의 서열 활성과 비교가능한 프로모터 활성을 지니 쌀 OsEF1β1 유전자 프로모터이다. 이러한 프로모터 및 발현을 가능하게 하는 방식으로 이에 연결된 외부 유전자를 포함한 발현 벡터 ; 이러한 발현 벡터에 의해 형질전환된 식물 세포 ; 이들 식물 세포로부터 재생된 식물 ; 식물의 자손 및 번식자 ; 이들 자손으로부터 수득된 종자 ; 및 상기 발현 벡터를 이용함으로서 식물 내로 외부 유전자를 도입시키는 방법

Description

쌀-기원의 높은 발현 폴리펩타이드 체인 신장 인자 프로모터 및 그의 이용방법{Rice-origin high expression polypeptide chain elongation factor promoter and method of using the same}

최근 식물 내로 목적 유전자를 도입하고 그 안에서 유전자가 발현되게 하는 방법이 식물에 원하는 특징을 부여하기 위한 수단으로 일반적으로 사용되고 있다. 그러나 이러한 발현은 식물 생장 및 발달 단계에서 변화한다. 예를 들어 유전자는 어린 식물 기간에 발현되나 생장 및 발달 단계가 진행됨에 따라 발현이 감소된다. 따라서 식물의 생장 및 발달 단계에 관계없이 안정한 방식으로 도입된 유전자를 발현하는 프로모터가 요구된다.

폴리펩타이드 체인 신장 인자는 리보솜에 의한 아미노산의 중합에 관련되고 단백질 합성을 수행하는 세포 내에서 발현된다. 폴리펩타이드 체인 신장 인자 1β(eEF-1β)의 프로모터 구역 및 5' 말단 구역이 β-글루쿠로니다제(GUS) 유전자와 융합된 키메릭(chimeric) 유전자는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 내에서 수행되었다. 이러한 키메릭 유전자는 형질전환 식물에서 유전자의 발현을 조사하는데 사용되었다(Gene, 170, (1996) 201-206). 유전자의 첫 번째 인트론이 높은 레벨의 발현에 요구됨이 발견되었다. 이러한 실험은 인핸서(enhance)-유사 요소가 아라비돕시스 탈리아나의 eEF-1β의 첫 번째 인트론 내에 존재함을 나타내었다.

쌀 폴리펩타이드 체인 신장 인자의 연구는 FEBS Letters 311(1992) 46-48, FEBS Letters 338(1994) 103-106 및 Biochemica et Biophysica Acta 1442(1998) 369-372 에 보고되었다. FEBS Letters 311(1992) 46-48는 쌀 폴리펩타이드 체인 신장 인자 1β'(EF-1β')을 인코딩하는 cDNA의 클로닝 및 분리에 대해 보고하였다. FEBS Letters 338(1994) 103-106은 쌀 폴리펩타이드 체인 신장 인자 1β(EF-1β)를 인코딩하는 cDNA의 클로닝 및 분리에 대해 보고하였다. Biochemica et Biophysica Acta 1442(1998) 369-372는 쌀 폴리펩타이드 체인 신장 인자 1β(EF-1β)에 의해 형성된 멀티유전자 패밀리의 신규한 유전자로서의 EF-1β2의 분리 및 특성화에 대해 보고하였다. 그러나 이들 발표는 상기-기술된 인자의 서열이 폴리펩타이드 신장 인자 패밀리의 다른 멤버의 서열과 비교만 되었다. 프로모터 활성에 대한 언급은 전혀 없었다.

따라서 식물의 생장 및 발달 단계에 관계없이 영구적이고 매우 활성적이며 실질적으로 이용가능한 쌀의 프로모터는 쌀과 같은 농작물을 포함한 유용한 식물의 육종에 광범위하게 기여할 것이다.

발명의 개요

본 발명은 유전공학 기술을 이용한 식물 육종에 관한 것이다. 본 발명의 목적은 식물 조직 내에서 발형을 유효하게 증진시키는 것이 가능한 식물 유전자 프로모터, 상기 프로모터를 포함한 발현 벡터 및 프로모터를 이용하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 쌀 폴리펩타이드 체인 신장 인자(OsEF1β1)가 영구적이고 상당히 높은 활성을 지님을 발견하였고, 이러한 발견에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 식물 내에서 외생적 유전자를 강하게 발현하는 프로모터 활성을 지닌 DNA를 제공한다. DNA는 서열번호: 1에 나타난 서열(도 2a 내지 2c) 또는 서열번호: 1에 나타난 서열과 동일한 프로모터 활성을 지닌 서열의 일부분을 지닌다. 서열번호: 1에 나타난 서열은 OsEF1β1 구조 유전자의 5' 구역 업스트림, 첫 번째 엑손, 첫 번째 인트론 및 두 번째 엑손의 일부를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서 프로모터는 식물의 생장 분열 조직 내에서 특이적으로 외생적 유전자를 발현하는 것을 촉진시킨다. 본 발명의 하나에서 DNA는 스트린전트 조건 하에서 서열번호: 1에 나타난 서열 또는 그의 일부분에 하이브리다이즈하는 것이 가능하다.

본 발명은 식물 조직에서 외생적 유전자를 강하게 발현하기 위한 발현 벡터를 제공한다. 발현 벡터는 서열번호: 1에 나타난 서열을 지니거나(도 2a 내지 2c) 또는 프로모터 활성이 서열번호: 1에 나타난 서열의 프로모터 활성과 동일한 서열의 일부를 지닌 쌀 OsEF1β1 유전자 프로모터로 구성된다. 발현 벡터는 DNA에 발현적으로 연결된 외생적 유전자로 더욱 구성된다. 본 발명은 단자엽식물 또는 쌍자엽식물 세포인 발현 벡터에 의해 형질전환된 식물 세포를 제공한다. 본 발명은 이러한 식물 세포로부터 재생된 식물 이러한 식물의 자손 및 번식자 및 이러한 자손으로부터 수득된 종자를 제공한다.

본 발명은 외생적 유전자가 식물에서 특이적으로 발현되는 것이 바람직한, 식물 내로 외생적 유전자를 도입시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 : 상기-기술된 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환시키고 ; 형질전환된 식물 세포의 재분화에의한 식물을 수득하는 단계로 구성된다. 식물 세포는 단자엽식물 또는 쌍자엽식물 세포이다.

본 발명은 식물 유전자 프로모터를 이용한 유용한 식물 육종에 관한 것이다. 더욱 특별하게는 본 발명은 쌀 폴리펩타이드 체인 신장 인자 β1(이후 OsEF1β1로 표기함)의 프로모터를 이용한 유용한 식물 육종에 관한 것이다.

도 1은 λOsEF1β1 삽입 단편의 제한 지도를 나타낸 것이다.

도 2a 내지 2c는 OsEF1β1의 5' 말단 구역의 서열을 나타내는 도면이다. 도면에서 "n"은 A, T, C 또는 G를 나타낸다. 도면에서 대문자의 염기는 엑손 사이트를 나타낸다(포지션 1671 내지 1876 및 포지션 2639 내지 2651).

도 3은 OsEF1β1 : GUS 융합된 구조물을 나타내는 개략도이다.

도 4는 프로모터로서 35S 프로모터를 함유한 벡터로 형질전환된 형질전환 식물 및 대조군 식물의 GUS 조직학적 염색의 결과를 나타내는 사진이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

쌀 OsEF1β1 유전자 프로모터의 분리

쌀 OsEF1β1 유전자 프로모터는 쌀 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로서 수득될 수 있다. CLONTECH Laboratories Inc., Palo Alto, CA사로부터 상용화된 쌀 게놈 DNA 라이브러리(쌀 게놈 라이브러리)가 사용될 수 있다.

스크리닝을 위한 프로브로서 본 발명자에 의해 분리된 쌀 OsEF1β1 cDNA가 사용될 수 있다.

먼저E. coli가 파지 λ를 이용하여 생성된 쌀 게놈 라이브러리로 감염되고, 플라크가 형성된다. 이러한 플라크는 통상적으로 사용되는 방법에 따라 니트로셀룰로스와 같은 멤브레인으로 옮겨지고 표지된 스크리닝 프로브와 하이브리디제이션된다. 하이브리디제이션 후 멤브레인은 세척되고 방사능사진촬영된다. DNA는하이브리디제이션을 확인하는 파지로부터 제조된다.

제조된 파지 DNA는 적당한 제한효소의 조합으로 분해되고 결과적인 단편은 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리된다. 분리된 DNA 단편은 나일론 멤브레인으로 옮겨져 상기-기술된 스크리닝 프로브와 하이브리디제이션된다. 스크리닝은 시그널 강도 및 밴드 패턴 차이에 기초하여 수행된다.

가장 강한 시그널을 지닌 클론이 OsEF1β1 유전자를 포함하는 반면 더 약한 시그널을 지닌 클론은 OsEF1β1과 유사하나 이는 아닌 유전자를 포함하는 것으로 여겨진다. 또한 밴드 패턴을 비교함으로서 유전자의 일부가 없는 클론을 확인하는 것이 가능하다. 더욱이 그의 밴드 패턴에 기초한 각각의 클론의 물리적 지도(physical map)를 생성함으로서 프로모터를 포함하는 것으로 추론되는 약 1.6 Kbp 길이의 구조적 유전자의 업스트림의 5' 구역을 지닌 클론을 확인하는 것이 가능하다.

상기-기술된 방법에서 완전한 OsEF1β1 게놈 유전자가 분리될 수 있다.

OsEF1β1 게놈 유전자의 염기 서열과 OsEF1β1 cDNA의 염기 서열을 비교함으로서 프로모터 구역이 확인될 수 있다. 게놈 유전자가 인트론을 지니면 프로모터 서열은 구조 유전자의 5' 구역 업스트림 뿐만 아니라 첫 번째 인트론과 같은 구역을 포함한다. 이러한 프로모터 서열은 바람직하게는 서열번호: 1에 나타난 서열이다(도 2a 내지 2c 참조) ; 서열번호: 1 및 도 2에 나타난 서열에서 "n"은 아데닌(A), 티미딘(T), 구아닌(G) 및 시티딘(C)을 나타낸다. 서열번호: 1에 나타나 서열은 쌀 OsEF1β1 구조 유전자의 5' 구역 업스트림, 첫 번째 엑손, 첫 번째 인트론 및 두 번째 엑손의 일부분을 포함한다.

GUS 활성 측정에 의한 프로모터의 활성 부분의 확인

OsEF1β1 유전자의 프로모터 구역이 확인될 때 그의 서열은 식물 발현 벡터 내로 삭제되거나 통합될 수 있다. 통합된 프로모터의 활성을 평가하기 위해 적당한 효소를 인코딩하는 유전자와 같은 수용체 유전자가 프로모터의 다운스트림에 연결된 플라스미드가 생성될 수 있다. 이러한 플라스미드는 식물 세포 내로 도입되고, 예를 들어 효소 활성 측정에 의해 유전자 발현이 관찰된다. 예를 들어 식물이 숙주로 이용될 때 지표로서 β-글루쿠로니다제(GUS)의 발현을 측정하기 위해 pBI101과 같은 플라스미드를 이용하는 것이 유용하다. 이러한 GUS 발현을 이용한 측정 방법은 여기서 사용될 수 있다.

GUS 활성은 예를 들어 Syokubutsu-saibo-kogaku [Plant Cell Engineering], Vol. 4, No. 4, pp. 281-286(1992); Syokubutsu-saibo-kogaku [Plant Cell Engineering], Vol. 5, No. 5, pp. 407-413(1992); 및 Plant Mole. Biol. Report5(4) 387-405(1987). 측정 방법은 매우 제한적이지 않다. 간단히 식물의 조직 또는 섹션이 측정되고 반응의 진행에 적당한 온도와 시간(즉, GUS와 CaMV 프로모터의 융합 유전자가 도입될 때 37℃에서 30분 내지 4시간 동안)에서 1mM 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-β-D-글루쿠로니드(X-Gluc), 7%(v/v) 메탄올 및 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)을 함유한 조직학적 기질 용액 내에 침수되고 인큐베이트된다. 갈변 및 GUS 불활성화를 방지하기 위해 디티오트레이톨(dithiothreitol, DDT) 등과 같은 환원제가 첨가된다. 예를 들어 2mM DTT가 한천 내에 섹션을 박는 단계 ; 섹션을 얇게 조각내는 단계 ; 또는 감소된 압력하에서 섹션을 공기제거시 섹션화 후(섹션이 제조될 때) 바로 첨가된다. 또한 5mM DTT는 37℃에서 GUS 반응시 첨가된다. 이후 반응은 에탄올 첨가에 의해 정지되고 탈색된다. 결과적인 조직 또는 섹션은 현미경 또는 입체 현미경 하에서 관찰된다.

OsEF1β1 유전자의 프로모터 구역의 다양한 삭제 돌연변이(즉, 5' 업스트림 사이드로부터 다양한 길이로 부분적으로 삭제된 OsEF1β1 유전자의 프로모터 구역)가 플라스미드 내에서 GUS 유전자와 융합된다. 이러한 플라스미드는 프로모터 활성을 측정하는데 이용된다. 그 결과로서 프로모터 활성에 필수적인 부분이 확인될 수 있다. 이러한 활성 부분의 확인을 위한 방법은 당분야에 알려져 있다. 따라서 예를 들어 OsEF1β1 유전자의 프로모터 구역에 필요하지 않은 서열을 제거함으로서 수득되고 OsEF1β1 유전자의 프로모터와 동일한 활성을 지닌 서열이 본 발명의 범위 내에 있다.

OsEF1β1 유전자의 프로모터 구역 및 그의 활성 부분이 확인되면 그의 서열은 프로모터 활성을 증가시키고 발현이 수행되는 조직에 대한 특이성을 변화시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어 OsEF1β1 유전자의 프로모터 구역 또는 그의 활성 부분을 부분적으로 변형시킴으로서 수득되고 변형전과 동일한 활성을 지닌 서열이 본 발명의 범위 내에 있다.

서열번호: 1의 서열을 지닌 프로모터 구역(도 2a 내지 2c)은 영양생장 조직 내에서 특이적으로 활성을 발현한다. 따라서 여기에 사용된 바와 같이 "강한" 프로모터 활성은 활성 강도가 적어도 통상의 프로모터(즉, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 신타제 프로모터 등)의 강도 보다 더 크고, 바람직하게는 이보다 적어도 2배 이상 더 크고, 더욱 바람직하게는 이보다 적어도 5배 이상 더 크고 더욱 더 바람직하게는 이보다 적어도 10배 이상 더 큼을 의미한다. 이러한 강도는 GUS 활성 측정 방법에 의해 측정될 수 있다.

본 발명의 프로모터는 식물의 생장 분열 조직 내에서 외생적 유전자의 발현을 특이적으로 촉진시킬 수 있다. 여기 사용된 바와 같이 생장 분열 조직 내에서 외생적 유전자의 발현을 "특이적으로" 촉진시킨다는 것은 목적 유전자가 동일한 식물 내 다른 조직 또는 기관 보다 생장 분열 조직 내에서 더 높게 발현됨을 의미한다. "생장 분열 조직"은 세포 분열이 활성적이고 단백질 합성이 높은 레벨에 있는 조직을 나타낸다. 본 발명의 프로모터로 외생적 유전자는 예를 들어 줄기 정점 또는 뿌리 끝과 같은 생장점 내에서 강하게 발현된다. 일반적으로 식물의 가장 높은 부분의 분열 조직은 특정한 단계, 줄기 신장 및 잎 확장 때까지 줄기 또는 잎을 형성한다. 가장 낮은 부분의 분열 조직은 전체 수명동안 뿌리만을 형성한다. 본 발명의 프로모터에 의한 외생적 유전자의 발현은 특히 분열 조직 내에서 촉진될 수 있다. 이러한 발현 특이성은 하기의 실시예에 기술된 바와 같은 조건 하에서 형질전환된 식물을 제조함으로서 평가될 수 있다.

본 발명의 프로모터는 외생적 유전자가 식물의 생장 및 발달 단계에 관계없이 일정하게 발현되도록 한다. 즉, 외생적 유전자는 식물의 영양생장 기간 전체에 발현된다. 이러한 발현 일정성은 하기의 실시예에 기술된 바와 같은 조건 하에서 형질전환된 식물을 제조함으로서 평가될 수 있다.

따라서 프로모터 활성 내 "동일한"이라는 용어는 활성 강도가 참조로서 적어도 프로모터 구역의 활성 강도와 실질적으로 동일하고, 그동안 활성의 특이성은 참조로서 프로모터 구역의 활성 특이성과 실질적으로 동일함을 나타낸다. "동일한"이라는 용어는 활성의 강도 및 특이성이 참조로서 프로모터 구역 보다 명백히 더 높은 경우를 배제시키는 것이 아님이 주지되어야 한다. "서열번호: 1의 서열과 동일한 프로모터 활성을 지닌"은 예를 들어 GUS 유전자가 하기 기술된 조건하에서 원형질체 내에서 발현될 때 GUS 활성은 서열번호: 1의 서열의 GUS 활성의 적어도50% 이상, 바람직하게는 적어도 약 70% 이상 및 더욱 바람직하게는 약 90% 이상임을 나타낸다.

본 발명의 범위는 스트린전트 조건하에서 OsEF1β1 유전자의 프로모터 구역 또는 그의 활성 부분에 하이브리다이즈할 수 있는 서열을 포함한다. 여기에 사용된 바와 같이 스트린전트 하이브리디제이션 조건" 또는 "스트린젠시(stringency)"는 타겟에 대한 정확하거나 거의 정확한 상보성을 지닌 타겟 서열 또는 프로브의 녹는점(T_m) 이하인 약 5℃ 내지 20℃ 또는 25℃의 범위 내의 조건을 나타낸다. 여기에 사용된 바와 같이 녹는점은 이중-나선의 핵산 분자군이 단일나선으로 반-분리되는 온도이다. 핵산의 T_m의 산출 방법은 당분야에 잘 알려져 있다(즉, Berger and Kimmel, 1987, Methods In Enzymology, Vol. 152: Guide To Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc., and Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory, 이후 "Sambrook"으로 표기됨, 이 둘 모두 참고문헌으로 여기에 통합됨). 표준 참조문헌으로서 나타난 바와 같이 핵산이 1M NaCl 수용액 내에 있을 때 T_m수치의 간단한 측정은 등식 : T_m= 81.5 + 0.41(% G + C) 에 의해 산출된다(즉, Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization in NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION(1985) 참조). 다른 참고문헌은 T_m의 산출을 위해 서열 특성뿐만 아니라 구조를 고려하는 더욱 정교한 계산을 포함한다. 하이브리드의 녹는점( 및 그의 스트린전트 하이브리디제이션 조건)은 프로브의 길이 및 성질(DNA, RNA, 염기 조성) 및 타겟의 성질(DNA, RNA, 염기 조성, 용액 내 존재 또는 고정 등) 및 염 농도 및 다른 구성성분(즉, 포름아마이드, 덱스트란 설페이트, 폴리에틸렌 글리콜의 존재여부)과 같은 다양한 인자에 의해 영향 받는다. 이들 인자의 영향은 잘 알려져 있고, 당 분야의 표준 참고문헌에서 논의된다(Sambrook(상동) 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York(1997) 참조). 일반적으로 스트린전트 하이브리디제이션 조건은 1.0M 나트륨 이온 이하의 염 농도 일반적으로 pH 7.0∼8.3에서의 약 0.01∼1.0M 나트륨 이온, 짧은 프로브(즉, 10∼50 뉴클레오타이드)를 위한 적어도 약 30℃ 이상의 온도, 긴 프로브(즉, 50 뉴클레오타이드 이상)를 위한 적어도 약 60℃ 이상의 온도이다. 논의된 바와 같이 스트린전트 조건은 또한 더 낮은 온도가 사용되어 포름아마이드와 같은 불안정화제의 첨가에 의해 달성된다. 예를 들어 2개의 폴리뉴클레오타이드가 스트린전트 하이브리디제이션 조건 하에서 서로 특이적으로 하이브리다이즈될 때 이들은 실질적인 서열 동일성을 지닌 것으로 확인된다. 여기서 사용된 바와 같은 "실질적인 동일성", "실질적인 서열 동일성" 또는 "실질적인 유사성"이라는 용어는 핵산 문맥 내에 2개의 폴리뉴클레오타이드 사이의 서열 유사성 정도를 나타낸다. 또한 실질적인 서열 동일성은 2개의 뉴클레오타이드(또는 폴리펩타이드) 서열 사이의 퍼센트 동일성으로 기술된다. 2개의 서열이 적어도 약 60% 이상 동일성, 바람직하게는 약 70% 이상 동일성, 적어도 약 80% 이상 동일성 또는 적어도 약 90% 이상 동일성, 적어도 약 95% 또는 98% - 100% 이상 동일성을 지니는 경우 서로 실질적으로 동일하다고 여겨진다. 또다른 서열 동일성의 정도(즉, "실질적으로" 보다 적은)는 다른 스트린젠시 조건하에서의 하이브리디제이션에 의해 특성화될 수 있다. 서열의 퍼센트 동일성(뉴클레오타이드 또는 아미노산)은 일반적으로 2개의 서열의 최적 정렬을 측정함으로서 산출된다. 예를 들어 단백질 발현에 사용되는 외생적 전사체는 참조 서열(즉, 상응하는 내생적 서열)과 비교될 때 특정한 퍼센트 동일성 또는 유사성을 지닌 것으로 기술된다. 서열의 최적 정렬은 Needleman and Wunsch(1970) J. Mol. Biol. 48:443의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson and Lipman(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444의 유사성 방법을 위한 검색, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575, Science Dr., Madison, WI) 또는 Smith adn Waterman(1981) Adv. Appl. Math. 2:482의 국부 상동성 알고리즘에 의한 조사에 의해 수행된다. 최상의 정렬(즉, 가장 높은 퍼센트 동일성이 수득됨)은 다양한 방법에 의해 수득된 것으로부터 선택된다. 일반적으로 이들 알고리즘은 서열 유사성의 국부 구역을 확인하고 비교하기 위해 "비교 윈도우(comparison window)"에 대해 2개의 서열을 비교하여(일반적으로 적어도 18 뉴클레오타이드 길이 이상) 작은 첨가 또는 삭제(즉, 갭)를 가능하게 한다. 일반적으로 첨가 및 삭제는 첨가 또는 삭제가 없는 참조 서열과 비교하여 20 퍼센트 이하의 길이를 지닌다. 때로는 특정한 길이 또는 구역을 참조로 함으로서 2개 서열 사이의 서열 동일성을 기술하는 것이 바람직하다(즉, 2개 서열은 적어도 약 500 염기쌍의 길이의 적어도 95% 이상 동일성을 지닌 것으로 기술됨). 일반적으로 길이는 적어도 약 50, 100,200, 300, 400 또는 500 염기쌍, 아미노산, 또는 다른 잔기이다. 서열 동일성의 퍼센트는 두 서열 내에 동일한 핵산 염기(즉, A, T, C, G 또는 U)가 발생한 많은 사이트가 많은 매칭 사이트를 수득하도록 측정되는 비교 구역을 따라 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교하고, 참조 서열 또는 비교 구역의 총 염기수(또는 퍼센트)와 이를 비교함으로서 산출된다. 서열 유사성의 측정에 적당한 또다른 알고리즘은 Altschul(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; 및 Shpaer(1996) Genomics 38:179-191 내에 기술된 BLAST 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/)을 통해 공개적으로 이용가능하다. 이러한 알고리즘은 데이터베이스 서열 내에 동일한 길이의 문자와 정렬될 때 일부 양성-평가된 역치 스코어 T를 매치하거나 만족시키는 질문 서열 내 길이 W의 짧은 문자를 확인함으로서 높은 스코어 서열 쌍(HSPs)를 먼저 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 문자 스코어 역치로 표기된다(Altschul et al., 상동). 이들 초기 이웃 문자 히트(hit)는 초기 검색이 이들을 함유한 더 긴 HSPs를 찾는 씨드(seed)로서 작용한다. 이후 문자 히트는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는데 까지 각각의 서열을 따라 양방향으로 연장된다. 각 방향에서의 문자 히트의 연장은 : 누적 정렬 스코어가 최대 달성된 수치로부터의 알려지지 않은 양 X에 의해 감소될 때 ; 하나 이상의 음성-스코어링 잔기 정렬의 축적에 기인하여 누적 스코어가 제로 이하로 될 때 ; 또는 서열의 말단에 연장이 도달할 때 정지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 디폴트로서 11의 문자길이(W), BLOSUM62 스코어링 매트릭스(Henikoff(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919 참조), 50의 정렬(B), 10의 기대치(E), M=5, N=-4 및 두 스트랜드의 비교를 이용한다. BLAST라는 용어는 2개의 서열간의 유사성을 통계적으로 분석하는 BLAST 알고리즘을 나타낸다. Karlin(1993) Proc. Natl. Acd. Sci. USA 90:5873-5787 참조. BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 측정의 하나는 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이에서 매치가 우연히 발생하는 가능성의 표시를 제공하는 가장 작은 총계 가능성(P(N))이다. 또는 2개의 핵산 서열이 유사한 또다른 표시는 첫 번째 핵산에 의해 인코드된 폴리펩타이드가 두 번째 핵산에 의해 인코드된 폴리펩타이드와 면역적으로 교차 반응한다는 것이다.

발현 카세트 및 재조합 플라스미드의 구조 및 이용

확인된 활성 또는 그의 활성 부분을 지닌 OsEF1β1 유전자의 프로모터 구역의 서열은 적당한 식물 발현 벡터 내에 통합될 수 있다.

본 발명의 식물 발현 벡터는 당분야에 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 식물 발현 벡터는 바람직하게는 예를 들어 pBI 벡터를 이용하여 구조된다. 본 발명은 이에 제한적이지는 않다.

"식물 발현 벡터"는 숙주 세포 내에서 유전자의 발현을 조절하는 다양한 조절 요소와 같이 프로모터에 실시가능하게 연결된 핵산 서열을 나타낸다. 바람직하게는 이러한 벡터는 본 발명의 식물 유전자 프로모터, 종결자, 약물 저항성 유전자를 포함한다. 사용되는 발현 벡터의 타입 및 조적 요소(들)의 타입은 당분야에 잘 알려진 숙주 세포에 따라 달라진다. 본 발명의 식물 발현 벡터는 T-DNA 구역을 더욱 포함한다. T-DNA 구역은 특히 아그로박테리움이 식물을 형질전환시키는데 이용되는 경우 유전자 도입의 효율성을 강화시킨다. 이러한 발현 카세트는 사용되는 특정한 숙주 생물체에 대해 적당한 선택가능한 마커 유전자를 더욱 포함한다.

"종결자"는 유전자의 단백질을 인코딩하는 구역의 다운스트림에 위치하고 DNS가 mRNA로 전사될 때 전사의 종결 및 폴리 A 서열의 첨가에 관련된 서열이다. 종결자는 mRNA의 안정성에 기여하고 유전자 발현량에 영향을 미치는 것을 알려져 있다. 이러한 종결자의 예는 CaMV35S 종결자 및 노팔린 신타제 유전자의 종결자(Tnos)를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

"약물 저항성 유전자"는 바람직하게는 형질전환된 식물의 선택을 촉진시킨다. 카나마이신(kanamycin) 저항성을 부여하는 네오마이신(neomycin) 인산전이효소Ⅱ(NPTⅡ) 유전자 및 하이그로마이신 저항성을 부여하는 하이그로마이신 인산전이효소 유전자가 사용될 수 있다. 본 발명은 이에 제한적이지는 않다.

발현되는 외생적 유전자는 다수의 클로닝 사이트와 같은 상기-기술된 프로모터의 3' 구역 다운스트림에 발현적으로 연결되어 재조합 플라스미드를 초래하게 된다. 여기에 사용된 바와 같이 "외생적 유전자"는 OsEF1β1 유전자 이외의 쌀 또는 다른 식물의 내생적 유전자 또는 유전자 생성물 발현이 식물에 바람직하고 특히 활성적인 세포 증식을 지닌 식물 조직인 식물에 대한 외부 유전자인 유전자이다.

결과적인 재조합 플라스미드로 식물 세포가 형질전환될 수 있다. 식물 세포의 형질전환은 아그로박테리움을 이용한 방법, 원형질체로의 일렉트로포레이션 등과 같은 당분야에 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어 식물 세포 원형질체는 Kyozuka et al., Mol. Gen. Genet. 206:408-412(1987)에 따라 제조될 수 있다. 단자엽식물에 바람직한 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법의 예는 PCT/JP/03920호에 기술된 본 발명자들에 의해 개발된 기술이다. 이러한 방법으로 단자엽식물이 빠르고 효율적으로 형질전환될 수 있다. 식물을 위한 형질전환 방법은 제한적이지는 않다.

형질전환된 식물 세포는 통상적으로 사용되는 방법에 의해 형질전환된 식물 및 전체 식물로 재분화될 수 있다. 형질전환을 위한 재조합 플라스미드의 생성시 OsEF1β1 유전자 프로모터는 박테리아 및 식물 숙주 모두에서 발현가능한 이원(binary) 벡터 내로 통합될 수 있다. 이러한 이원 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어 pBI 벡터 등(아그로박테리움 발현 시스템을 포함)이 사용될 때 미생물로 식물을 감염시키기 위한 시스템이 이용될 수 있다. 적당한 재조합 플라스미드를 이용함으로서 목적 외생적 유전자가 단자엽식물(즉, 쌀 등) 및 쌍자엽식물(즉, 담배 등)을 포함한 형질전환가능한 식물 내로 도입될 수 있다.

"식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. 본 발명의 생성 방법에 사용될 수 있는 식물종은 유전자가 도입될 수 있는 어떤 식물종도 된다.

본 발명의 생성에 사용될 수 있는 식물종의 예는 가지과(Solanaceae), 화본과(Poaeae), 겨자과(Brassicaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 호박과(Cucurbitaceae), 꿀풀과(Lamiaceae), 백합과(Liliaceae), 명아주과(Chenopodiaceae) 및 산형과(Umbelliferae) 식물을 포함한다.

가지과 식물의 예는 니코티아나속(Nicotiana), 솔라눔속(Solanum), 다투라속(Datura), 리코페르시온속(Lycopersion) 및 페튜니아속 식물을 포함한다. 특별한 예는 담배, 가지나무, 감자, 토마토, 칠리페퍼 및 페튜니아를 포함한다.

화본과 식물의 예는 벼속, 보리속, 호밀속, 사탕수수속,에키노클로아속(Echinochloa) 및 옥수수속 식물을 포함한다. 특별한 예는 쌀, 보리, 호밀, 돌피, 사탕수수 및 옥수수를 포함한다.

겨자과 식물의 예는 무속, 브라시카속, 아라비돕시스속, 와사비아속(Wasabia) 및 캅셀라속(Capsella) 식물을 포함한다. 특별한 예는 일본 백무(white radish), 평지씨, 아라비돕시스 탈리아나, 일본 양고추냉이 및 냉이를 포함한다.

장미과 식물이 예는 오루누스속(Orunus), 능금나무속, 피누스속(Pynus), 프라가리아속(Fragaria) 및 장미속 식물을 포함한다. 특별한 예는 서양자두, 복숭아, 사과, 배, 덴마크 딸기 및 장미를 포함한다.

콩과 식물이 예는 콩속, 비그나속(Vigna), 강낭콩속, 완두속, 갈퀴덩굴속, 낙화생속, 토끼풀속, 알팔파속(Alphalfa) 및 개자리속 식물을 포함한다. 특별한 예는 대두, 아드주키콩(adzuki bean), 강낭콩, 완두콩, 잠두, 땅콩, 클로버 및 버클로버(bur clover)를 포함한다.

호박과 식물은 수세미속(Luffa), 호박속 및 박속 식물을 포함한다. 특별한 예는 조롱박, 호박, 오이 및 메론을 포함한다.

꿀풀과 식물은 라반둘라속, 박하속 및 차즈기속 식물을 포함한다. 특별한 예는 라벤다, 페퍼민트 및 비프스테이크 식물을 포함한다.

백합과 식물은 마늘속, 나리속 및 튤립속 식물을 포함한다. 특별한 예는 양파, 마늘, 백합 및 튤립을 포함한다.

명아주과 식물은 시금치속(Spinacia) 식물을 포함한다. 특별한 예는 시금치이다.

산형과 식물은 구릿대속, 당근속, 크립토테니아속(Cryptotaenia) 및 샐러리속 식물을 포함한다. 특별한 예는 일본 우도(udo), 당근, 혼워트(honewort) 및 샐러리를 포함한다.

본 발명의 프로모터가 작용하는 "식물"은 유전자가 도입될 수 있는 어떠한 식물도 포함한다. "식물"은 단자엽식물 및 쌍자엽식물을 포함한다. 이러한 식물은 유용한 식물, 특히 농작식물, 야채식물 및 정원 품종의 개화 식물을 포함한다. 바림직한 식물은 쌀, 옥수수, 사탕수수, 보리, 밀, 호밀, 돌피, 조, 아스파라거스, 감자, 일본 백무, 대두, 완두, 평지씨, 시금치, 토마토 및 페튜니아를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 본 발명이 적용되는 가장 바람직한 식물은 쌀, 특히 자포니카(Japonica) 쌀이다.

상기에 기술된 바와 같이 OsEF1β1 유전자 프로모터는 식물 조직 내에서 외생적 유전자를 강하게 발현할 수 있다. 따라서 외생적 유전자로서 형질전환체 선택가능한 마커 유전자를 이용함으로서 형질전환된 식물 선택을 더욱 용이하게 한다. 예를 들어 외생적 유전자로서 독성 단백질을 인코딩하는 외생적 유전자가 사용될 때 줄기 및 잎을 먹는 해충을 제어하는 것이 가능하다. 질병 저항성 유전자가 외생적 유전자로서 사용될 때 우수한 질병 저항성을 지닌 식물을 수득하는 것이 가능하다. 또한 본 발명은 영양생장 조직에 특이적인 유전자 발현의 이용에 의한 유용한 식물의 제조를 포함한다. 본 발명의 프로모터에 의해 발현된 유전자의 예는 활성적인 세포 증식을 지닌 조직 내에서 발현되는 것이 바람직한 어떠한 유전자도 포함한다.

본 발명의 프로모터의 작용은 식물의 다음 세대뿐만 아니라 형질전환된 식물의 초기 세대에 의해 유전된다. 프로모터의 작용은 형질전환된 식물의 초기 세대 및 상기 식물의 다음 세대, 그의 번식자(즉, 화분) 및 번식자로부터 생성된 종자에 나타난다. 도입된 프로모터 유전자의 다음 세대로의 유전은 프로브로서 본 발명의 프로모터의 서열을 이용한 서던 분석에 의해 확인될 수 있다.

본 발명에 따라 식물 조직(특히 생장 분열 조직, 활성적인 세포 증식을 지닌 조직 등) 내에서 높은 레벨의 활성을 지닌 쌀 유전자로부터의 프로모터의 이용이제공된다. 따라서 본 발명은 쌀의 육종뿐만 아니라 다른 다양한 식물의 육종에 이용될 수 있다.

본 발명은 실시예에 의해 상세히 기술된다. 이러한 실시예는 본 발명을 제한하지는 않는다. 실시예에서 사용된 물질, 시약은 기술되지 않는한 상업적으로사용가능 한 것이다.

(실시예 1) 쌀 OsEF1β1 게놈 유전자의 분리 : 게놈 라이브러리의 스크리닝

쌀 EF 프로모터를 분리하기 위해 알려진 cDNA 서열(Matsumoto et al., 상동)이 프라이머 쌍을 합성하는데 사용되었고 쌀 캘러스로부터 추출된 mRNA는 RT-PCR을 수행하기 위해 주형으로서 사용되어 cDNA 단편을 초래하였다. 이들 PCR 생성물은 Nipponbare Sam3A를 부분적으로 분해함으로서 제조된 게놈 라이브러리(EMBL3 파지 벡터)를 스크린하기 위해 동위원소로 표지되었고 프로브로서 사용되었다.E. coli(XLI Blue)는 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 파지(EMBL3)로 감염되었고 플라크가 형성되었다. 플라크는 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 나일론 멤브레인으로 옮겨졌다. 멤브레인은 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여³²P로 표지된 상기 기술된 프로브로 하이브리디제이션 되었다(Molecular Cloning, 2nd Ed.). 하이브리디제이션 후 멤브레인은 세척되고 방사능사진촬영된다. DNA는 하이브리디제이션을 확인하는 파지로부터 제조된다.

제조된 파지 DNA는 적당한 제한효소, SalI, EcoRI, HindⅡ, BamHI 및 Xhol와 조합하여 분해되고 결과적인 단편은 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리되었다. 분리된 DNA 단편은 나일론 멤브레인으로 옮겨졌고 상기-기술된 스크리닝 프로브로하이브리디제이션 되었다. 멤브레인은 프로브에 하이브리다이즈 하는 DNA 단편이 검출되도록 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 방사능사진촬영되었다.

스크리닝은 시그널 강도 및 밴드 패턴 차이에 기초하여 수행되었다. 가장 강한 시그널을 지닌 클론은 OsEF1β1 유전자를 포함한 반면 더 약한 시그널을 지닌 클론은 OsEF1β1과 유사하나 이는 아닌 유전자를 포함한 것으로 여겨졌다. 또한 밴드 패턴을 비교함으로서 유전자의 일부가 없는 클론을 확인하는 것이 가능하다. 더욱이 그의 밴드 패턴에 기초한 각각의 클론의 물리적 지도(physical map)를 생성함으로서 프로모터를 포함하는 것으로 추론되는 약 1.6 Kbp 길이의 구조적 유전자의 업스트림의 5' 구역을 지닌 클론을 확인하는 것이 가능하다. 클론은 λOsEF1β1로 명명되었다. 도 1은 λOsEF1β1 삽입 단편의 제한 지도를 나타낸다. 도 1에 나타난 바와 같이 7개의 엑손이 λOsEF1β1 삽입 내에 존재한다.

상세한 서던 분석, 부분적 염기 서열의 분석, OsEF1β1 cDNA의 염기 서열에 기초한 PCR 분석에 의해 OsEF1β1 cDNA에 상응하는 유전자를 지닌 λOsEF1β1 클론 및 프로모터 구역으로 추론되는 유전자의 약 1.6 Kbp 길이의 업스트림 5' 구역이 수득되었다. 그의 서열은 도 2a 내지 2c에 나타나 있다.

(실시예 2) OsEF1β1 유전자 프로모터를 지닌 발현 벡터의 제조

실시예 1에서 수득된 OsEF1β1 유전자의 5' 말단 구역을 포함한 발현 벡터는 2,651 bp 서열을 지녔다. 첫 번째 엑손은 서열의 포지션 1,671 내지 1,876 내에 존재하고 두 번째 부분은 포지션 2,639 내지 2,651에 존재하고 첫 번째 인트론은 각 엑손 내에 존재함이 발견되었다(서열번호: 1 및 도 2a 내지 2c 참조).

도 3은 쌀 OsEF1β1 유전자 프로모터를 지닌 벡터의 제조를 나타낸다.

쌀 OsEF1β1 유전자의 5' 비번역 구역을 포함한 단편을 수득하기 위해 실시예 1에서 수득된 클론 OsEF1β1이 사용되었다(SalI(5' 말단) 및 SmaI(3' 말단)). 단편은 클론 삽입 서열의 포지션 1 내지 2,651의 서열을 지녔고 5' 비번역 서열, 첫 번째 엑손, 첫 번째 인트론 및 두 번째 엑손의 일부를 포함하였다. OsEF1β1 유전자의 프로모터 기능은 식물 세포 발현 벡터 pBI101(CLONTECH Laboratories Inc., Palo Alto, CA)을 이용하여 확인되었다. 이러한 벡터는 노팔린 신타제 프로모터(NOS-Pro), 카나마이신 저항성을 부여하기 위한 네오마이신 인산전이효소Ⅱ 코딩 구역(NPTⅡ(KON R), 노팔린 신타제의 종결자(NOS-T), β-글루쿠로니다제(GUS) 코딩 구역 및 노팔린 신타제의 종결자(NOS-T)의 순서로 포함한다. 상기-기술된 단편은 상기 기술된 바와 같이 제한 분해된 발현 벡터에 연결되어 GUS 수용체 유전자와의 융합을 포함한 pBI101-Hm3을 초래한다. 또한 하이그로마이신 저항성을 부여하기 위해 이러한 발현 벡터에서 하이그로마이신 인산전이효소(HPT) 유전자(콜리플라워 모자이크 바이러스 35S(35S)와 노팔린 신타제 유전자의 종결자(Tnos) 사이에 위치)도 GUS 코딩 구역의 다운스트림에 삽입되었다.

(실시예 3) 쌀 종자의 형질전환

대표적 쌀의 재배종인 Nipponbare의 종자는 겨를 제거한 후 완전한 상태로 10초 동안 70% 에탄올에 침수되었다. 종자는 물로 세척되었고, 멸균을 위해 0.1% Tween20 및 2.5% 차아염소산나트륨(NaClO) 수용액에 30분간 침수되었다. 물로 완전히 세척한 후 쌀은 하기 멸균 처리되었다.

예비배양

종자는 2,4-D 함유 N6D 배지(30g/l 슈크로스, 0.3g/l 카사미노산, 2.8g/l 프롤린, 2mg/l 2,4-D, 4g/l 겔라이트 pH 5.8) 상에 뿌려졌고 27∼32℃에서 5일간 인큐베이트되었다. 이러한 기간 동안 종자는 발아되었다.

식물 발현 벡터

아그로박테리움 EHA101이 상기 제조된 바와 같이 pBI101-Hm3으로 형질전환되었다(Hood et al., J. Bacteriol. 168:1291-1301(1986)). EHA101은 헬퍼(helper) 플라스미드의 버(vir) 구역이 효능있는 병원성 아그로박테리움 A281로부터 유래된박테리움이다. 아그로박테리움은 하이그로마이신(50mg/L)이 추가된 AB 배지(글루코스(5g/L), K₂HPO₄(3g/L), NaH₂PO₄·2H₂O(1.3g/L), NH₄CI(1g/L), KCI(150mg/L), CaCl₂·2H₂O(10mg/L), F₂SO₄·7H₂O(2.5mg/L), pH 7.2, 박토 한천(bacto agar)(1.5%)(3g/200ml), 1M MgSO₄·7H₂O(120㎕/100ml))에서 암조건으로 25℃에서 2∼3일 동안 배양되었다.

아그로박테리움으로의 감염

형질전환된 아그로박테리움은 2㎍/ml의 아세토시린곤(acetosyringone)이 추가된 AAM 배지(AA-1( ×1000) 1ml (MnSO₄·4-6H₂O(1000mg/100ml), H₃BO₃(300mg/100ml), ZnSO₄·7H₂O(200mg.100ml), Na₂MoO₄·2H₂O(25mg/100ml), CuSO₄·5H₂O(2.5mg/100ml), CoCl₂·6H₂O(2.5mg/100ml), KI(75mg/100ml)) ; AA-2( ×1000) 1ml (CaCl₂·2H₂O(15.0g/100ml)) ; AA-3( ×1000) 1ml(MgSO₄·7H₂O(25g/100ml)) ;, AA-4( ×1000) 1ml (Fe-EDTA(4.0g/100ml)) ; AA-5( ×1000) 1ml (NaH₂PO₄·2H₂O(15.0g/100ml)) ; AA-6( ×200) 5ml (니코틴산(20mg/100ml), 티아민 HCl(200mg/100ml), 피리독신 HCl(20mg/ml), 미오-이노시톨(2000mg/100ml)) ; AA-Sol( ×100) 10ml (L-아르기닌(5300mg/300ml), 글리신(225mg/300ml) ; AA-KCl( ×50) 20ml (KCl(3g/20ml)), 카사미노산(500mg/L) ; 슈크로스(68.5g/L) ; 글루코스(36g/L) ; L-글루타민(900mg/L) ; L-아스파르트산(300mg/L) ; pH 5.2)내에 현탁되었다. 상기-기술된 예비배양된 종자는 본 현탁액에 90초간 침수된후 2N6-AS 배지(30g/L의 슈크로스, 10g/L의 글루코스, 0.3g/L의 카사미노산, 2mg/L의 2,4-D, 10mg/L의 아세토시린곤, 4g/L의 겔라이트, pH 5.2)로 옮겨졌다. 배양은 25℃에서 인큐베이트하는 동안 암조건으로 3일 동안 수행되었다.

박테리아의 제거 및 스크리닝

동시배양의 완료후 아그로박테리움은 500mg/l의 카베니실린(carbenicillin)을 함유한 N6D 배지로 세척함으로서 종자로부터 제거되었다. 이후 형질전환된 종자의 스크리닝은 하기의 조건하에서 수행되었다.

첫 번째 스크리닝 : 종자는 카베니실린(500mg/L) 및 하이그로마이신(50mg/L)이 추가된 2mg/L의 2,4-D를 함유한 N6D 배지에 놓여졌고 7일간 30℃에서 인큐베이트되었다.

두 번째 스크리닝 : 종자는 종자는 카베니실린(500mg/L) 및 하이그로마이신(50mg/L)이 추가된 2mg/L의 2,4-D를 함유한 N6D 배지에 놓여졌고 추가로 7일간 30℃에서 인큐베이트되었다.

재분화

선택된 형질전환된 종자는 하기의 조건하에서 재분화되었다.

첫 번째 재분화 : 선택된 종자는 카베니실린(500mg/L) 및 하이그로마이신(25mg/L)이 추가된 재분화 배지(MS 배지(30g/L의 슈크로스, 30g/L의 솔비톨, 2g/L의 카사미노산, 2mg/L의 키네틴(kinetin), 0.002mg/L의 NAA, 4g/L의 겔라이트, pH 5.8)내에 30℃에서 2주간 놓여졌다.

두 번째 재분화 : 종자는 첫 번째 분화에 사용된 것과 동일한 재분화 배지 내에서 추가로 2주간 30℃에서 인큐베이트되었다.

화분에 심기

재분화된 형질전환체는 뿌리 배지(하이그로마이신(25mg/L)이 추가된 호르몬-없는 MS 배지)로 옮겨졌다. 뿌리 생장이 확인된 후 형질전환체가 화분에 심어졌다.

(실시예 4) GUS 염색에 의해 관찰된 조직 발현

본 발명의 쌀 OsEF1β1 유전자 프로모터에 의한 상기 프로모터를 지닌 벡터에 의해 형질전환된 식물의 조직 내에서의 유전자 발현을 연구하기 위해(씨 뿌려진지 약 6주후의 쌀) GUS 활성의 조직학적 분석인 수행되었다. 대조군으로서 식물 발현 프로모터로 통상적으로 사용되는 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터를 포함한 pBI121이 식물을 형질전환하는데 사용되었고 프로모터에 의한 유전자 발현은 서로 비교되었다.

GUS 활성의 조직학적 분석은 식물 조직 내에서 상기-기술된 프로모터에 의한 유전자 발현을 연구하기 위해 수행되었다. 이러한 조직학적 분석은 Syokubutsu-saibo-kogaku[Plant Cell Engineering], Vol. 4, No. 4, pp. 281-286에 기술된 절차에 의해 수행되었다. 이러한 방법은 Jefferson et al.(EMBO J 6:3901-3907(1987)) 및 Kosugi et al., Plant Science 70:133-140(1990)에 기초한다. 간단히 절제된 섹션은 5%(w/w) 한천 내에 박히고, 한천 블록은 마이크로슬라이서를 이용하여 얇게 썰린다. 100∼130㎛의 두께를 지닌 조직 슬라이스는 1mM 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루쿠로니드(X-Gluc), 7%(v/v) 메탄올 및 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)을 함유한 조직학적 기질 용액 내에 침수되고 37℃에서 2∼24시간 동안 인큐베이트되었다. 2mM DTT가 섹셔닝후 한천 내에 섹션을 박는 단계 ; 섹션을 얇게 써는 단계 또는 감소된 압력하에서 섹션의 공기를 제거하는 단계에서 바로 첨가되었다. 5mM DTT는 37℃에서 GUS 반응에 첨가되었다. 이후 반응은 에탄올 첨가에 의해 정지되고 공기 제거되었다. 슬라이스는 현미경으로 관찰되었다.

결과는 도 4에 나타나 있다. 도 4의 우측에는 본 발명의 프로모터로 형질전환된 식물의 다양한 조직 내에서의 GUS 활성이 나타나 있다. 도 4의 좌측에는 대조군 식물의 다양한 조직 내에서의 GUS 활성이 나타나 있다(위부터 줄기, 잎, 뿌리). 도 3은 강한 발현이 대조군 식물과 비교하여 본 발명의 형질전환된 식물의 줄기, 잎 및 뿌리에 나타났음을 나타낸다. 본 발명의 형질전환된 식물의 GUS 활성은 대조군 식물 내의 35S 프로모터의 GUS 활성의 5배 이상 강하였다. 더욱이 본 발명의 형질전환된 식물에서 강한 발현은 줄기의 중심 근처 부분(관다발), 잎의 기저부분, 뿌리의 말단 부분에서 관찰되었다. 이는 본 발명의 프로모터가 특히 분열 조직 내에서 강하게 발현됨을 나타낸다.

본 발명의 OsEF1β1 유전자 프로모터는 식물 조직 내에서 유전자 발현을 강하게 촉진시킨다. 따라서 본 발명은 식물의 유전자 조작에 의해 쌀과 같은 식물 육종에 유용하다.

Claims (14)

1. 서열번호: 1에 나타난 서열 또는 프로모터 활성이 서열번호: 1에 나타난 서열과 동일한 서열의 일부분을 지니고, 식물 내에서 외생적 유전자를 강하게 발현하는 프로모터 활성을 지닌 DNA
2. 제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 식물의 생장 분열 조직 내에서 특이적으로 외생적 유전자의 발현을 촉진시킴을 특징으로 하는 DNA
3. 제 1항에 있어서, 상기 DNA는 스트린전트 조건하에서 서열번호: 1에 나타난 서열 또는 그의 일부분에 하이브리다이즈 가능함을 특징으로 하는 DNA
4. 제 1항에 따른 DNA 및 상기 DNA에 발현적으로 연결된 외생적 유전자로 구성된 발현 벡터
5. 제 4항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 식물 세포
6. 제 5항에 있어서, 상기 식물 세포는 단자엽식물 세포임을 특징으로 하는 식물 세포
7. 제 5항에 있어서, 상기 식물 세포는 쌍자엽식물 세포임을 특징으로 하는 식물 세포
8. 제 5항에 따른 식물 세포로부터 재생된 식물
9. 제 8항에 따른 식물의 자손
10. 제 8항에 따른 식물의 번식자
11. 제 9항에 따른 자손으로부터 수득된 종자
12. 제 3항에 따른 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환시키고 ;

    형질전환된 식물 세포의 재분화에 의해 식물을 수득하는 단계 :

    로 구성되고, 외생적 유전자가 식물 영양생장 조직 내에서 특이적으로 발현되는, 외생적 유전자를 식물 내로 도입시키는 방법
13. 제 12항에 있어서, 상기 식물 세포는 단자엽식물 세포임을 특징으로 하는 방법
14. 제 12항에 있어서, 상기 식물 세포는 쌍자엽식물 세포임을 특징으로 하는 방법