JP2005224120A - 構成的発現プロモーター - Google Patents
構成的発現プロモーター Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005224120A JP2005224120A JP2004033675A JP2004033675A JP2005224120A JP 2005224120 A JP2005224120 A JP 2005224120A JP 2004033675 A JP2004033675 A JP 2004033675A JP 2004033675 A JP2004033675 A JP 2004033675A JP 2005224120 A JP2005224120 A JP 2005224120A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- dna
- rice
- plant
- promoter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 108
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 63
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 50
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 42
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 19
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 108
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 99
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 99
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 98
- 238000000034 method Methods 0.000 description 31
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 30
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 27
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 27
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 26
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 22
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 20
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 20
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 17
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 13
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 101710084735 Osmotin-like protein Proteins 0.000 description 11
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 10
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101150091750 HMG1 gene Proteins 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 8
- 101150047747 SEC13 gene Proteins 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 101150078442 RPL5 gene Proteins 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 6
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 4
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 3
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 3
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 3
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 3
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 3
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000005648 plant growth regulator Substances 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000617296 Homo sapiens Protein SEC13 homolog Proteins 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 2
- 102100021725 Protein SEC13 homolog Human genes 0.000 description 2
- -1 RPL5 Proteins 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 2
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 2
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 2
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N (2r,3r,6s)-3-[[(3s)-3-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoyl]amino]-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,6-dihydro-2h-pyran-2-carboxylic acid Chemical compound O1[C@@H](C(O)=O)[C@H](NC(=O)C[C@@H](N)CCN(C)C(N)=N)C=C[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N 0.000 description 1
- 102000004899 14-3-3 Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710112812 14-3-3 protein Proteins 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 2,2-dichloro-n-[(1s,2s)-1,3-dihydroxy-1-(4-nitrophenyl)propan-2-yl]acetamide Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@@H](CO)[C@@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- DHJFFLKPAYHPHU-BYNIDDHOSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glucuronide Chemical compound O1[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 DHJFFLKPAYHPHU-BYNIDDHOSA-N 0.000 description 1
- 108020005075 5S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 6-[(5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl)oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid;cyclohexanamine Chemical compound [NH3+]C1CCCCC1.O1C(C([O-])=O)C(O)C(O)C(O)C1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 235000005254 Allium ampeloprasum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006108 Allium ampeloprasum Species 0.000 description 1
- 101100178203 Arabidopsis thaliana HMGB3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000702286 Bean golden mosaic virus Species 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 1
- 244000189548 Chrysanthemum x morifolium Species 0.000 description 1
- 241000612152 Cyclamen hederifolium Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 108010076804 DNA Restriction Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 1
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 235000009419 Fagopyrum esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008620 Fagopyrum esculentum Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001316290 Gypsophila Species 0.000 description 1
- 108700010013 HMGB1 Proteins 0.000 description 1
- 101150021904 HMGB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037907 High mobility group protein B1 Human genes 0.000 description 1
- 101100506223 Homo sapiens HAP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108700001097 Insect Genes Proteins 0.000 description 1
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012218 Kunkel's method Methods 0.000 description 1
- 241000234435 Lilium Species 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 101100017567 Mycoplasma gallisepticum (strain R(low / passage 15 / clone 2)) hlp1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000233855 Orchidaceae Species 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 108010031944 Tryptophan Hydroxylase Proteins 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N blasticidin-S Natural products O1C(C(O)=O)C(NC(=O)CC(N)CCN(C)C(N)=N)C=CC1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940027138 cambia Drugs 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 229930186364 cyclamen Natural products 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008832 photodamage Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 235000021251 pulses Nutrition 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
【課題】 目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA、該DNAを含有し、目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させることを可能にした組換えプラスミド、該組換えベクターを導入した形質転換植物体を提供すること。
【解決手段】 以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示す、プロモーターとして機能しうるDNA。（ａ）特定の塩基配列からなるDNA（ｂ）特定の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA（ｃ）特定の塩基配列の一部の塩基配列からなり、かつ目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA。
【選択図】 なし
【解決手段】 以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示す、プロモーターとして機能しうるDNA。（ａ）特定の塩基配列からなるDNA（ｂ）特定の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA（ｃ）特定の塩基配列の一部の塩基配列からなり、かつ目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA。
【選択図】 なし
Description
本発明は、目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター及びその使用に関するものである。
植物細胞内で機能可能なプロモーターの下流に発現させたい目的タンパク質をコードする遺伝子を連結させた融合遺伝子を植物細胞に導入し、得られた植物細胞を通常の植物組織培養技術により再生させる方法によって、所望の形質を有する改良植物体を作出することが行われている。
プロモーターの種類としては、構成的、誘導的、組織・器官特異的、時期特異的プロモーターがある。プロモーターは、遺伝子発現の目的に応じて選択され、例えば、特定の刺激に応答して目的遺伝子を発現させる場合は誘導的プロモーター、必要な時期に特定の組織・器官に目的遺伝子の発現を局所化させたい場合は、組織・器官特異的又は時期特異的プロモーターが用いられる。しかしながら、そのような特異性が高くなく、全ての組織において常時目的遺伝子を発現させるプロモーター、すなわち、構成的プロモーターは植物遺伝子工学において最も汎用されており、ニーズも多い。
構成的プロモーターには、例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35S RNA遺伝子のプロモーター（非特許文献１）、アグロバクテリウムTiプラスミド由来ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Pnos)（非特許文献２）、トウモロコシ由来ユビキチン遺伝子のプロモーター（非特許文献３）、イネ由来のアクチン遺伝子のプロモーター（非特許文献４）等が報告されている。
構成的プロモーターには、例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35S RNA遺伝子のプロモーター（非特許文献１）、アグロバクテリウムTiプラスミド由来ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Pnos)（非特許文献２）、トウモロコシ由来ユビキチン遺伝子のプロモーター（非特許文献３）、イネ由来のアクチン遺伝子のプロモーター（非特許文献４）等が報告されている。
Odell J.T., et al., Nature, 313, 810-812 (1985)
Shaw, C.H., Nucleic Acids Res., 12(20):7831-7846 (1984)
Cornejo MJ., et al．, Plant Mol Biol, 23(3), 567-581 (1993)
McElroy, D. et al., Plant Cell, 2, 163-171 (1990)
従って、本発明の目的は、目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA、該DNAを含有する遺伝子を植物体内で構成的に発現させることを可能にした組換えプラスミド、該組換えベクターを導入した形質転換植物体を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく、イネゲノム配列情報、イネESTの出現頻度情報、イネ完全長cDNA配列情報等（http://www.dna.affrc.go.jp/）を参考にしつつ鋭意研究を重ねた結果、種々の組織に特異的な発現パターンを有すると期待されるイネ遺伝子を約100種選定し、選定された各遺伝子の５’上流域をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で増幅した断片の中から、目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA断片を得ることに成功し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) 以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示す、プロモーターとして機能しうるDNA。
（ａ）配列表の配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列表の配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA
（ｃ）配列表の配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列の一部の塩基配列からなり、かつ目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA
(2) (1)に記載のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA。
(3) (1)又は(2)に記載のDNAを含有する組換えベクター。
(4) (1)又は(2)に記載のDNAと目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクター。
(5) (3)又は(4)に記載の組換えベクターを導入した形質転換植物体。
(1) 以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示す、プロモーターとして機能しうるDNA。
（ａ）配列表の配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列表の配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA
（ｃ）配列表の配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列の一部の塩基配列からなり、かつ目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA
(2) (1)に記載のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA。
(3) (1)又は(2)に記載のDNAを含有する組換えベクター。
(4) (1)又は(2)に記載のDNAと目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクター。
(5) (3)又は(4)に記載の組換えベクターを導入した形質転換植物体。
本発明によれば、目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNAが提供される。このプロモーター活性を有するDNAを利用すれば、特定の組織・器官（葉、茎、根、花、雌蕊、雄蕊、カルスなど）、時期（生育初期、中期、後期）、刺激誘導（光、病害、環境ストレスなど）などに限定されることなく、植物の多様な組織・器官、かつ生育の多様な時期において目的遺伝子を発現させることができる。
従って、本発明は、植物における有用物質の生産性向上、植物の生長制御、耐病性遺伝子の発現による耐病性付与、環境ストレス抵抗性遺伝子の発現による環境ストレス抵抗性の付与、植物における物質（水、栄養塩、糖など）輸送・分配の制御等に有用である。
１．プロモーター及びその単離
本発明に係るプロモーターとして機能しうるDNA（以下、「プロモーター」という）は、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列からなるDNAである。
本発明に係るプロモーターとして機能しうるDNA（以下、「プロモーター」という）は、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列からなるDNAである。
本発明のDNAは、目的タンパク質をコードする遺伝子（以下、「目的遺伝子」という）の翻訳開始点の５’側に挿入することにより、該目的遺伝子の植物体における構成的発現を誘導し、又は該目的遺伝子を植物体の各組織・器官において高レベルで発現させることができる。
また、本発明のDNAには、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなり、かつ目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNAも含まれる。ここで、置換、欠失、付加又は挿入されてもよい塩基の数は特に限定されないが、好ましくは１個〜数個である。例えば、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が欠失してもよく、配列番号１、４、７、１０、又は１３に示す塩基配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が付加してもよく、あるいは、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が他の塩基に置換してもよい。
さらに、本発明のDNAには、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列の一部の塩基配列からなり、かつ目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNAも含まれる。
配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列からなるDNAにおけるプロモーター活性に必須な部分は、該DNAの様々な欠失体、例えば、５’上流側から様々な長さに欠損させたDNA断片をベータグルクロニダーゼ（GUS）遺伝子等のリポーター遺伝子を融合させたプラスミドを宿主に導入し、プロモーター活性を測定することによって特定でき、そのような活性部分の特定のための手法は、当業者には公知である。
配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列からなるDNAにおけるプロモーター活性に必須な部分は、該DNAの様々な欠失体、例えば、５’上流側から様々な長さに欠損させたDNA断片をベータグルクロニダーゼ（GUS）遺伝子等のリポーター遺伝子を融合させたプラスミドを宿主に導入し、プロモーター活性を測定することによって特定でき、そのような活性部分の特定のための手法は、当業者には公知である。
このような変異体DNAは、目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性（以下、「構成的発現プロモーター活性」という）を有していればよく、その活性の大きさは特に限定されないが、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列からなるDNAの構成的発現プロモーター活性を実質的に保持することが好ましい。「配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列からなるDNAの構成的発現プロモーター活性を実質的に保持する」とは、該プロモーター活性を利用した実際の使用態様において、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列からなるDNAと、同一の条件でほぼ同様の利用が可能な程度の活性が維持されていることをいう。
本発明において「構成的発現プロモーター活性」とは、目的遺伝子を植物体の多様な組織・器官において、生育時期（あるいは生育ステージ）に限定されることなく高度に発現させる活性をいう。
全ての組織・器官とは、葉、花（雌蕊、雄蕊）、茎、根、維管束（根などの植物体地下部組織の維管束系、茎や葉脈などの地上部組織（シュート）の維管束系）、カルスなどを含む。
全ての組織・器官とは、葉、花（雌蕊、雄蕊）、茎、根、維管束（根などの植物体地下部組織の維管束系、茎や葉脈などの地上部組織（シュート）の維管束系）、カルスなどを含む。
上記のような変異体DNAを取得するための遺伝子変異導入は、Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法によって行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを利用することができる。
さらに、当業者であれば、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列の全部又は一部からなるDNAを用いて、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列からなるDNAと同様の機能、すなわち、構成的発現プロモーター活性を有する他の塩基配列からなるDNAを種々の生物から新たに取得し、利用することも容易である。このような他の塩基配列からなるDNAの取得は、例えば、配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列の全部又は一部からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるハイブリダイゼーション、該塩基配列の一部をプライマーとして用いるPCR等によって行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列と90％以上、好ましくは95%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が10〜300mM、好ましくは15〜75mMであり、温度が25℃〜70℃、好ましくは42℃〜55℃での条件をいう。
上記のように取得した変異体DNAやハイブリダイゼーションにより得られるホモログがプロモーターとしての活性を有するか否かは、種々のレポーター遺伝子、例えばベータグルクロニダーゼ（GUS）、ルシフェラーゼ（LUC）、Green fluorescent protein（GFP）、
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ベータガラクトシダーゼ（LacZ）、ノパリン合成酵素（NOS）、オクトピン合成酵素（OCS）等の遺伝子を上記プロモーターの下流域に連結したベクターを作製し、該ベクターを用いて従来から周知慣用されている種々の形質転換法（後述）により植物細胞のゲノムに挿入した後、該レポーター遺伝子の発現を測定することにより確認できる。
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ベータガラクトシダーゼ（LacZ）、ノパリン合成酵素（NOS）、オクトピン合成酵素（OCS）等の遺伝子を上記プロモーターの下流域に連結したベクターを作製し、該ベクターを用いて従来から周知慣用されている種々の形質転換法（後述）により植物細胞のゲノムに挿入した後、該レポーター遺伝子の発現を測定することにより確認できる。
例えば、レポーター遺伝子がGUSの場合には、宿主細胞内でのプロモーター活性は、(ｉ)ヒストケミカルなGUS染色による方法（EMBO J. 6, 3901-3907 (1987）)により、及び／又は(ii)蛍光基質を用いるCastle＆Morrisの方法（Plant Molecular Biology Manual, B5, 1-16 (1994); S.B.Gelvin & R.A.Schilperoort, Kluwer Academic Publishers）に従ってGUS活性を測定し、さらにBradfordの方法（Anal. Biochem. 72, 248-254（1976)）に従ってタンパク質量を測定して、GUS活性をタンパク量当たりに換算する（nmole 4-MU/min/mg proteinとして算出する）ことにより、それぞれ確認することができる。
本発明のプロモーターは、以下の(i)〜(vi)のいずれかのイネ遺伝子の５’上流ゲノム領域（あるいは配列）を単離することによって取得できる。
(i)イネSEC13遺伝子
イネ（日本晴）の第7番染色体ゲノム上に存在し、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するSEC13タンパク質をコードするイネ遺伝子〔DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK111786〕（塩基配列：配列番号２）
(ii)イネRPL5遺伝子
イネ（日本晴）の第1番染色体ゲノム上に存在し、配列番号６に示すアミノ酸配列を有する5S リボソームRNA結合タンパク質L5（RPL5）をコードするイネ遺伝子〔DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK065268〕（塩基配列：配列番号５）
（iii)イネHMG1遺伝子
イネ（日本晴）の第6番染色体ゲノム上に存在し、配列番号９に示すアミノ酸配列を有するDNA結合タンパク質（High mobility group protein：HMG1）をコードするイネ遺伝子〔DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK068898〕（塩基配列：配列番号８）
(i)イネSEC13遺伝子
イネ（日本晴）の第7番染色体ゲノム上に存在し、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するSEC13タンパク質をコードするイネ遺伝子〔DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK111786〕（塩基配列：配列番号２）
(ii)イネRPL5遺伝子
イネ（日本晴）の第1番染色体ゲノム上に存在し、配列番号６に示すアミノ酸配列を有する5S リボソームRNA結合タンパク質L5（RPL5）をコードするイネ遺伝子〔DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK065268〕（塩基配列：配列番号５）
（iii)イネHMG1遺伝子
イネ（日本晴）の第6番染色体ゲノム上に存在し、配列番号９に示すアミノ酸配列を有するDNA結合タンパク質（High mobility group protein：HMG1）をコードするイネ遺伝子〔DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK068898〕（塩基配列：配列番号８）
(iv)イネOLP1遺伝子
イネ（日本晴）の第1番染色体ゲノム上に存在し、配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するオスモチン様タンパク質（osmotin-like protein：OLP1）をコードするイネ遺伝子〔DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK060655〕（塩基配列：配列番号１１）
(v)イネGF14b遺伝子
イネ（日本晴）の第4番染色体ゲノム上に存在し、配列番号１５に示すアミノ酸配列を有する14-3-3タンパク質（GF14ｂ）をコードするイネ遺伝子〔DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK071822〕（塩基配列：配列番号１４）
(vi)イネGAPDH遺伝子
イネ（日本晴）の第2番染色体ゲノム上に存在し、配列番号１８に示すアミノ酸配列を有するグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（GAPDH）をコードするイネ遺伝子〔DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK099086〕（塩基配列：配列番号１７）
イネ（日本晴）の第1番染色体ゲノム上に存在し、配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するオスモチン様タンパク質（osmotin-like protein：OLP1）をコードするイネ遺伝子〔DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK060655〕（塩基配列：配列番号１１）
(v)イネGF14b遺伝子
イネ（日本晴）の第4番染色体ゲノム上に存在し、配列番号１５に示すアミノ酸配列を有する14-3-3タンパク質（GF14ｂ）をコードするイネ遺伝子〔DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK071822〕（塩基配列：配列番号１４）
(vi)イネGAPDH遺伝子
イネ（日本晴）の第2番染色体ゲノム上に存在し、配列番号１８に示すアミノ酸配列を有するグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（GAPDH）をコードするイネ遺伝子〔DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK099086〕（塩基配列：配列番号１７）
プロモーター領域を単離する方法としては、特に限定されないが、例えば、インバースPCR、ゲノムDNAライブラリーから単離する方法等を例示することができる。
インバースPCRによる場合は、上記の（i)〜(vi）のイネ遺伝子（以下、「イネ遺伝子」という）の塩基配列情報に基づいて一対のプライマーを合成し、これら一対のプライマーと所定の制限酵素で処理した後にセルフライゲーションさせたゲノムDNA断片とを用いてPCRを行うことによって、イネ遺伝子の上流領域を増幅することができる。その後、イネ遺伝子の上流領域をクローニングし塩基配列を決定することによって、イネ遺伝子のプロモーター領域の単離、及び塩基配列（配列番号１、４、７、１０、１３又は１６）の決定を行うことができる。
また、ゲノムDNAライブラリーから単離する場合には、イネ遺伝子を含むcDNAをプローブとして、定法に従って調製したゲノムDNAライブラリーからイネ遺伝子を含むゲノムDNAをスクリーニングする。その後、スクリーニングしたゲノムDNAの塩基配列を決定することによってイネ遺伝子の上流領域に存在するプロモーター領域を特定することができ、さらに、該プロモーター領域のみをPCR等によって増幅してクローニングすることによって単離することができる。
いったん本発明のプロモーターの塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、あるいはその塩基配列の一部からなるDNAをプライマーとして合成し、イネの全DNAを鋳型として用いて、該プライマーを用いるPCRによって容易に得ることができる。
さらに、単離したプロモーター領域（配列番号１、４、７、１０、１３又は１６）の一部を用いてプロモーター活性を測定することによって、単離したプロモーター領域（配列番号１、４、７、１０、１３又は１６）において、プロモーター活性に寄与している領域を特定することができる。プロモーター領域の一部は、該プロモーター領域の一部をPCRによって増幅する方法、プロモーター領域を所定の制限酵素で処理して断片化する方法等を適宜使用して得ることができる。
得られたプロモーター領域の一部は、発現量を定量できる遺伝子の上流に組み込み、該遺伝子の発現量を定量することによってプロモーター活性を測定することができる。すなわち、得られたプロモーター領域の一部及び所定の遺伝子を組み込んでなる組換えベクターを構築し、該組換えベクターを用いて形質転換した細胞における該遺伝子の発現量を定量することによって、得られたプロモーター領域の一部におけるプロモーター活性を測定することができる。
２. 組換えベクター
本発明の組換えベクターは、上記１．のプロモーターに目的遺伝子を連結した遺伝子を適当なベクターに導入することにより構築することができる。ここで、ベクターとしては、アグロバクテリウムを介して植物に目的遺伝子を導入することができる、pBI系、pPZP系（Hajdukiewicz P, Svab Z, Maliga P.: The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation., Plant Mol Biol., 25: 989-94, 1994）、pCAMBIA系（http://www.cambia.org/main/r_et_camvec.htm）、pSMA系のベクターなどが好適に用いられる。特にpBI系のバイナリーベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、例えば、pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3等が挙げられる。バイナリーベクターとは大腸菌（Escherichia coli）及びアグロバクテリウムにおいて複製可能なシャトルベクターで、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリムを植物に感染させると、ベクター上にあるLB配列とRB配列より成るボーダー配列で囲まれた部分のDNAを植物核DNAに組み込むことが可能である（EMBO Journal, 10(3), 697-704 (1991)）。一方、pUC系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入することができ、例えば、pUC18、pUC19、pUC9等が挙げられる。また、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV)、インゲンマメモザイクウイルス（BGMV)、タバコモザイクウイルス（TMV）等の植物ウイルスベクターも用いることができる。
本発明の組換えベクターは、上記１．のプロモーターに目的遺伝子を連結した遺伝子を適当なベクターに導入することにより構築することができる。ここで、ベクターとしては、アグロバクテリウムを介して植物に目的遺伝子を導入することができる、pBI系、pPZP系（Hajdukiewicz P, Svab Z, Maliga P.: The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation., Plant Mol Biol., 25: 989-94, 1994）、pCAMBIA系（http://www.cambia.org/main/r_et_camvec.htm）、pSMA系のベクターなどが好適に用いられる。特にpBI系のバイナリーベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、例えば、pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3等が挙げられる。バイナリーベクターとは大腸菌（Escherichia coli）及びアグロバクテリウムにおいて複製可能なシャトルベクターで、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリムを植物に感染させると、ベクター上にあるLB配列とRB配列より成るボーダー配列で囲まれた部分のDNAを植物核DNAに組み込むことが可能である（EMBO Journal, 10(3), 697-704 (1991)）。一方、pUC系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入することができ、例えば、pUC18、pUC19、pUC9等が挙げられる。また、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV)、インゲンマメモザイクウイルス（BGMV)、タバコモザイクウイルス（TMV）等の植物ウイルスベクターも用いることができる。
ベクターに目的遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
目的遺伝子としては、対象となる植物における内因性遺伝子、または外来遺伝子であって、その遺伝子産物の発現が植物体内の各組織・器官において所望される任意の遺伝子をいう。かかる遺伝子としては、有用物質（医薬、色素、芳香成分など）生産遺伝子、植物生長制御（促進/抑制）遺伝子、耐病虫害性〔昆虫食害抵抗性、カビ（菌類）及び細菌病抵抗性、ウイルス（病）抵抗性など〕遺伝子、環境ストレス（低温、高温、乾燥、光障害、紫外線）抵抗性遺伝子、糖代謝関連遺伝子、糖、窒素源、イオンなどのトランスポーター遺伝子等が挙げられるが、これらに限定はされない。
上記の目的遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、ベクターには、目的遺伝子の上流、内部、あるいは下流に、本発明のプロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリA付加シグナル、5'-UTR配列、選抜マーカー遺伝子などを連結することができる。
エンハンサーとしては、例えば、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、CaMV35Sプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域などが挙げられる。
ターミネーターとしては、前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、例えば、ノパリン合成酵素（NOS)遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素(OCS)遺伝子のターミネーター、CaMV 35S RNA遺伝子のターミネーター等が挙げられる。
選抜マーカー遺伝子としては、例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ブラストサイジンS耐性遺伝子、アセト乳酸合成酵素（Acetolactate synthase）遺伝子などが挙げられる。
また、選抜マーカー遺伝子は、上記のように目的遺伝子とともに同一のプラスミドに連結させて組換えベクターを調製してもよいが、あるいは、選抜マーカー遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターと、目的遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターとを別々に調製してもよい。別々に調製した場合は、各ベクターを宿主にコトランスフェクト（共導入）する。
また、選抜マーカー遺伝子は、上記のように目的遺伝子とともに同一のプラスミドに連結させて組換えベクターを調製してもよいが、あるいは、選抜マーカー遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターと、目的遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターとを別々に調製してもよい。別々に調製した場合は、各ベクターを宿主にコトランスフェクト（共導入）する。
３．形質転換植物体
上記２．で調製した組換えベクターを用いて、対象植物を形質転換し、形質転換植物体を調製することができる。
形質転換植物体を調製する際には、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができ、その好ましい例として、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。アグロバクテリウム法を用いる場合は、プロトプラストを用いる場合、組織片を用いる場合、及び植物体そのものを用いる場合（in planta法）がある。プロトプラストを用いる場合は、Tiプラスミドをもつアグロバクテリウムと共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、組織片を用いる場合は、対象植物の無菌培養葉片（リーフディスク）に感染させる方法やカルスに感染させる等により行うことができる。また種子あるいは植物体を用いるin planta法を適用する場合、すなわち植物ホルモン添加の組織培養を介さない系では、吸水種子、幼植物（幼苗）、鉢植え植物などへのアグロバクテリウムの直接処理等にて実施可能である。
上記２．で調製した組換えベクターを用いて、対象植物を形質転換し、形質転換植物体を調製することができる。
形質転換植物体を調製する際には、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができ、その好ましい例として、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。アグロバクテリウム法を用いる場合は、プロトプラストを用いる場合、組織片を用いる場合、及び植物体そのものを用いる場合（in planta法）がある。プロトプラストを用いる場合は、Tiプラスミドをもつアグロバクテリウムと共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、組織片を用いる場合は、対象植物の無菌培養葉片（リーフディスク）に感染させる方法やカルスに感染させる等により行うことができる。また種子あるいは植物体を用いるin planta法を適用する場合、すなわち植物ホルモン添加の組織培養を介さない系では、吸水種子、幼植物（幼苗）、鉢植え植物などへのアグロバクテリウムの直接処理等にて実施可能である。
遺伝子が植物体に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロッティング法等により行うことができる。例えば、形質転換植物体からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。PCRを行った後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法でもよい。
本発明において形質転換に用いられる植物としては、イネ、ムギ、トウモロコシ、ネギ、ユリ、ラン等の単子葉植物、ダイズ、ナタネ、トマト、バレイショ、キク、バラ、カーネーション、ペチュニア、カスミソウ、シクラメン等の双子葉植物などの植物が挙げられ、特に限定はされない。好ましくは、本発明のDNAが単離されたイネ科の植物、例えば、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、サトウキビ、シバ、ソルガム、アワ、及びヒエなどの植物が挙げられる。
本発明において、形質転換の対象とする植物材料としては、例えば、根、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂（植物の芽の先端の生長点）、葯、花粉等の植物組織やその切片、未分化のカルス、それを酵素処置して細胞壁を除いたプロプラスト等の植物培養細胞が挙げられる。またin planta法適用の場合、吸水種子や植物体全体を利用し得る。
また、本発明において形質転換植物体とは、植物体全体、植物器官（例えば根、茎、葉、花弁、種子、種子、実等）、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等)、植物培養細胞のいずれをも意味するものである。
植物培養細胞を対象とする場合において、得られた形質転換細胞から形質転換体を再生させるためには既知の組織培養法により器官又は個体を再生させればよい。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば、以下のように行うことができる。
まず、形質転換の対象とする植物材料して植物組織又はプロトプラストを用いた場合、これらを無機要素、ビタミン、炭素源、エネルギー源としての糖類、植物生長調節物質（オーキシン、サイトカイニン等の植物ホルモン）等を加えて滅菌したカルス形成用培地中で培養し、不定形に増殖する脱分化したカルスを形成させる（以下「カルス誘導」という）。このように形成されたカルスをオーキシン等の植物生長調節物質を含む新しい培地に移しかえて更に増殖（継代培養）させる。
カルス誘導は寒天等の固型培地で行い、継代培養は例えば液体培養で行うと、それぞれの培養を効率良くかつ大量に行うことができる。次に、上記の継代培養により増殖したカルスを適当な条件下で培養することにより器官の再分化を誘導し（以下、「再分化誘導」という）、最終的に完全な植物体を再生させる。再分化誘導は、培地におけるオーキシンやサイトカイニン等の植物生長調節物質、炭素源等の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することにより行うことができる。かかる再分化誘導により、不定胚、不定根、不定芽、不定茎葉等が形成され、更に完全な植物体へと育成させる。あるいは、完全な植物体になる前の状態（例えばカプセル化された人工種子、乾燥胚、凍結乾燥細胞及び組織等）で貯蔵等を行ってもよい。
本発明の形質転換植物体は、形質転換処理を施した再分化当代である「T1世代」のほか、その植物の種子から得られた後代である「T2世代」、薬剤選抜あるいはサザン法等による解析によりトランスジェニックであることが判明した「T2世代」植物の花を自家受粉して得られる次世代（T3世代）などの後代植物をも含む。
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでない。
（実施例１） イネ遺伝子プロモーター配列の単離及び形質転換用ベクターへの導入
（１）プロモーターの単離
(i)イネSEC13遺伝子プロモーター
配列番号２に示す塩基配列を有するイネSEC13遺伝子（DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK111786）の5’上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp：アクセッション番号AP003821）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーSEC13-5［5’- ATGCAAGCTTCGACGGATAGTAGCATCATC -3’（下線部はHindIII制限酵素認識部位）：配列番号１９］とSEC13-3 [5’- ATGCCCTAGGTTCAAAGCTATAGTGTGCC -3’（下線部は、AvrII制限酵素認識部位）：配列番号２０]をプライマーとして用い、PCRを行った。mRNAの情報から予測される開始コドンATGのAの位置を+1、一つ前の塩基の位置を-1とすると、プライマーは、SEC13遺伝子の-1787位から-1位までに位置する1787塩基対［配列番号１において7位（1-6位はHindIII認識配列）の塩基から1794位（1794-1799位はAvrII認識配列）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。なお、この1787塩基対の配列中、配列番号１において818位-1750位の933塩基対の配列は転写後、イントロンとして除去されることがゲノム配列とmRNAの情報の比較から予測される配列である。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5’末端（SEC13-5）及び3’末端（SEC13-3）に、それぞれ唯一のHindIII及びAvrII制限酵素認識部位を導入した。
（１）プロモーターの単離
(i)イネSEC13遺伝子プロモーター
配列番号２に示す塩基配列を有するイネSEC13遺伝子（DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK111786）の5’上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp：アクセッション番号AP003821）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーSEC13-5［5’- ATGCAAGCTTCGACGGATAGTAGCATCATC -3’（下線部はHindIII制限酵素認識部位）：配列番号１９］とSEC13-3 [5’- ATGCCCTAGGTTCAAAGCTATAGTGTGCC -3’（下線部は、AvrII制限酵素認識部位）：配列番号２０]をプライマーとして用い、PCRを行った。mRNAの情報から予測される開始コドンATGのAの位置を+1、一つ前の塩基の位置を-1とすると、プライマーは、SEC13遺伝子の-1787位から-1位までに位置する1787塩基対［配列番号１において7位（1-6位はHindIII認識配列）の塩基から1794位（1794-1799位はAvrII認識配列）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。なお、この1787塩基対の配列中、配列番号１において818位-1750位の933塩基対の配列は転写後、イントロンとして除去されることがゲノム配列とmRNAの情報の比較から予測される配列である。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5’末端（SEC13-5）及び3’末端（SEC13-3）に、それぞれ唯一のHindIII及びAvrII制限酵素認識部位を導入した。
PCR後、増幅断片（約1.8kb）をEx Taqポリメラーゼ（Takara）を用いてdATP存在下で72℃、5分間処理して末端にAを付加し、Promega社のpGEM-T easy vector systemを用いてpGEM-T easyベクターにクローニングした。
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号１にその塩基配列を示す。なお、配列番号１の塩基配列において1位〜6位までの塩基配列、1794位〜1799位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位であり、1869位以降の塩基配列が転写領域である。
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号１にその塩基配列を示す。なお、配列番号１の塩基配列において1位〜6位までの塩基配列、1794位〜1799位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位であり、1869位以降の塩基配列が転写領域である。
(ii)イネRPL5遺伝子
配列番号５に示す塩基配列を有するイネRPL5遺伝子（DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK065268）の5’上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp：アクセッション番号AP003349）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーRPL5-5［5’- ATGCAAGCTTACCGCAACTAGAAGGGAGTC -3’（下線部はHindIII制限酵素認識部位）：配列番号２１］とRPL5-3 [5’- ATGCCCATGGCTCCCTGGAGAGACATTATC -3’（下線部は、NcoI制限酵素認識部位）：配列番号２２]をプライマーとして用い、PCRを行った。プライマーは、-1949位から+690位までに位置する2639塩基対［配列番号４において7位（1-6位はHindIII認識配列）の塩基から2645位（2646-2651位はNcoI認識配列）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。なお、この2639塩基対の配列中、配列番号４において1959位-2641位の683塩基対の配列は転写後、イントロンとして除去されることがゲノム配列とmRNAの情報の比較から予測される配列である。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5’末端（RPL5-5）及び3’末端（RPL5-3）に、それぞれ唯一のHindIII及びNcoI制限酵素認識部位を導入した。
配列番号５に示す塩基配列を有するイネRPL5遺伝子（DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK065268）の5’上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp：アクセッション番号AP003349）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーRPL5-5［5’- ATGCAAGCTTACCGCAACTAGAAGGGAGTC -3’（下線部はHindIII制限酵素認識部位）：配列番号２１］とRPL5-3 [5’- ATGCCCATGGCTCCCTGGAGAGACATTATC -3’（下線部は、NcoI制限酵素認識部位）：配列番号２２]をプライマーとして用い、PCRを行った。プライマーは、-1949位から+690位までに位置する2639塩基対［配列番号４において7位（1-6位はHindIII認識配列）の塩基から2645位（2646-2651位はNcoI認識配列）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。なお、この2639塩基対の配列中、配列番号４において1959位-2641位の683塩基対の配列は転写後、イントロンとして除去されることがゲノム配列とmRNAの情報の比較から予測される配列である。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5’末端（RPL5-5）及び3’末端（RPL5-3）に、それぞれ唯一のHindIII及びNcoI制限酵素認識部位を導入した。
PCR後、増幅断片（約2.6kb）をEx Taqポリメラーゼ（Takara）を用いてdATP存在下で72℃、5分間処理して末端にAを付加し、Promega社のpGEM-T easy vector systemを用いてpGEM-T easyベクターにクローニングした。
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号４にその塩基配列を示す。なお、配列番号４の塩基配列において1位〜6位までの塩基配列、2646位〜2651位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位であり、1869位以降の塩基配列が転写領域である。
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号４にその塩基配列を示す。なお、配列番号４の塩基配列において1位〜6位までの塩基配列、2646位〜2651位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位であり、1869位以降の塩基配列が転写領域である。
(iii)イネHMG1遺伝子
配列番号８に示す塩基配列を有するイネHMG1遺伝子（DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK068898）の5’上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp：アクセッション番号AP004685）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーHMG1-5［5’- ATGCAAGCTTTAATATTGGGCCTAGTAGCC -3’（下線部はHindIII制限酵素認識部位）：配列番号２３］とHMG1-3 [5’- ATGCTCTAGATGGCTGAATCCTGCGAGAAG -3’（下線部は、AvrII制限酵素認識部位）：配列番号２４]をプライマーとして用い、PCRを行った。プライマーは、HMG1遺伝子の-1593位から+2位までに位置する1595塩基対［配列番号７において7位（1-6位はHindIII認識配列）の塩基から1601位（うち1601位はXbaI 認識配列TCTAGAの一部）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5’末端（HMG1-5）及び3’末端（HMG1-3）に、それぞれ唯一のHindIII及びXbaI制限酵素認識部位を導入した。
配列番号８に示す塩基配列を有するイネHMG1遺伝子（DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK068898）の5’上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp：アクセッション番号AP004685）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーHMG1-5［5’- ATGCAAGCTTTAATATTGGGCCTAGTAGCC -3’（下線部はHindIII制限酵素認識部位）：配列番号２３］とHMG1-3 [5’- ATGCTCTAGATGGCTGAATCCTGCGAGAAG -3’（下線部は、AvrII制限酵素認識部位）：配列番号２４]をプライマーとして用い、PCRを行った。プライマーは、HMG1遺伝子の-1593位から+2位までに位置する1595塩基対［配列番号７において7位（1-6位はHindIII認識配列）の塩基から1601位（うち1601位はXbaI 認識配列TCTAGAの一部）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5’末端（HMG1-5）及び3’末端（HMG1-3）に、それぞれ唯一のHindIII及びXbaI制限酵素認識部位を導入した。
PCR後、増幅断片（約1.6kb）をEx Taqポリメラーゼ（Takara）を用いてdATP存在下で72℃、5分間処理して末端にAを付加し、Promega社のpGEM-T easy vector systemを用いてpGEM-T easyベクターにクローニングした。
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号７にその塩基配列を示す。なお、配列番号７の塩基配列において1位〜6位までの塩基配列、1601位〜1606位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位であり、1364位以降の塩基配列が転写領域である。
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号７にその塩基配列を示す。なお、配列番号７の塩基配列において1位〜6位までの塩基配列、1601位〜1606位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位であり、1364位以降の塩基配列が転写領域である。
(iv)イネOLP1遺伝子
配列番号１１に示す塩基配列を有するイネOLP1遺伝子（DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK060655）の5’上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp：アクセッション番号AP003241）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーOLP1-5［5’-ATGCAAGCTTATATCCGCAGGTTGTTTCC-3’（下線部はHindIII制限酵素認識部位）：配列番号２５］とOLP1-3 [5’-ATGCCCTAGGGAGCTGACCAGGTCTCGAGC-3’（下線部は、AvrII制限酵素認識部位）：配列番号２６]をプライマーとして用い、PCRを行った。プライマーは、OLP1遺伝子の-2060位から-7位までに位置する2054塩基対［配列番号１０において6位（6位はHindIII認識配列AAGCTTの一部）の塩基から2059位（2060-2065位はAvrII認識配列）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5’末端（OLP1-5）及び3’末端（OLP1-3）に、それぞれ唯一のHindIII及びAvrII制限酵素認識部位を導入した。
配列番号１１に示す塩基配列を有するイネOLP1遺伝子（DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK060655）の5’上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp：アクセッション番号AP003241）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーOLP1-5［5’-ATGCAAGCTTATATCCGCAGGTTGTTTCC-3’（下線部はHindIII制限酵素認識部位）：配列番号２５］とOLP1-3 [5’-ATGCCCTAGGGAGCTGACCAGGTCTCGAGC-3’（下線部は、AvrII制限酵素認識部位）：配列番号２６]をプライマーとして用い、PCRを行った。プライマーは、OLP1遺伝子の-2060位から-7位までに位置する2054塩基対［配列番号１０において6位（6位はHindIII認識配列AAGCTTの一部）の塩基から2059位（2060-2065位はAvrII認識配列）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5’末端（OLP1-5）及び3’末端（OLP1-3）に、それぞれ唯一のHindIII及びAvrII制限酵素認識部位を導入した。
PCR後、増幅断片（約2.1kb）をEx Taqポリメラーゼ（Takara）を用いてdATP存在下で72℃、5分間処理して末端にAを付加し、Promega社のpGEM-T easy vector systemを用いてpGEM-T easyベクターにクローニングした。
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号１０にその塩基配列を示す。なお、配列番号１０の塩基配列において1位〜6位までの塩基配列、2060位〜2065位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位であり、2002位以降の塩基配列が転写領域である。
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号１０にその塩基配列を示す。なお、配列番号１０の塩基配列において1位〜6位までの塩基配列、2060位〜2065位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位であり、2002位以降の塩基配列が転写領域である。
(v)イネGF14b遺伝子
配列番号１４に示す塩基配列を有するイネGF14ｂ遺伝子（DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK071822）の5’上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp：アクセッション番号AL606460）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーGF14b-5［5’-ATGCAAGCTTGAATGACATCACGGAAGATG-3’（下線部はHindIII制限酵素認識部位）：配列番号２７］とGF14b-3 [5’-ATGCCCATGGTTGCTATCTATAAATCTAAAAACTCTACAAATGCCAAGTCTGCA-3’（下線部は、NcoI制限酵素認識部位）：配列番号２８]をプライマーとして用い、PCRを行った。プライマーは、HMG1遺伝子の-2124位から-3位までに位置する2122塩基対［配列番号１３において8位（1-6位はHindIII認識配列）の塩基から2129位（2130-2135位はNcoI認識配列）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5’末端（GF14b-5）及び3’末端（GF14b-3）に、それぞれ唯一のHindIII及びNcoI制限酵素認識部位を導入した。
配列番号１４に示す塩基配列を有するイネGF14ｂ遺伝子（DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK071822）の5’上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp：アクセッション番号AL606460）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーGF14b-5［5’-ATGCAAGCTTGAATGACATCACGGAAGATG-3’（下線部はHindIII制限酵素認識部位）：配列番号２７］とGF14b-3 [5’-ATGCCCATGGTTGCTATCTATAAATCTAAAAACTCTACAAATGCCAAGTCTGCA-3’（下線部は、NcoI制限酵素認識部位）：配列番号２８]をプライマーとして用い、PCRを行った。プライマーは、HMG1遺伝子の-2124位から-3位までに位置する2122塩基対［配列番号１３において8位（1-6位はHindIII認識配列）の塩基から2129位（2130-2135位はNcoI認識配列）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5’末端（GF14b-5）及び3’末端（GF14b-3）に、それぞれ唯一のHindIII及びNcoI制限酵素認識部位を導入した。
PCR後、増幅断片（約2.1kb）をEx Taqポリメラーゼ（Takara）を用いてdATP存在下で72℃、5分間処理して末端にAを付加し、Promega社のpGEM-T easy vector systemを用いてpGEM-T easyベクターにクローニングした。
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号１３にその塩基配列を示す。なお、配列番号１３の塩基配列において1位〜6位までの塩基配列、2130位〜2135位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位であり、1321位以降の塩基配列が転写領域である。
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号１３にその塩基配列を示す。なお、配列番号１３の塩基配列において1位〜6位までの塩基配列、2130位〜2135位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位であり、1321位以降の塩基配列が転写領域である。
(vi)イネGAPDH遺伝子
配列番号１７に示す塩基配列を有するイネGAPDH遺伝子（DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK099086）の5’上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp：アクセッション番号AP005385）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーGAPDH5-5［5’-ATGCAAGCTTTTGCGTTGACAACAATTGGC-3’（下線部はHindIII制限酵素認識部位）：配列番号２９］とGAPDH5-3 [5’-ATGCCCATGGGTGAAAGAGAGGCGGAGC-3’（下線部は、NcoI制限酵素認識部位）：配列番号３０]をプライマーとして用い、PCRを行った。プライマーは、-967位から-3位までに位置する969塩基対［配列番号１６において7位（1-6位はHindIII認識配列）の塩基から975位（976-981位はNcoI認識配列）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5’末端（GAPDH5-5）及び3’末端（GAPDH5-3）に、それぞれ唯一のHindIII及びNcoI制限酵素認識部位を導入した。
配列番号１７に示す塩基配列を有するイネGAPDH遺伝子（DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp）:アクセッション番号AK099086）の5’上流域に位置するプロモーター配列の単離をゲノミックPCR法にて行った。イネ（品種：日本晴）幼植物体の緑葉よりDNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を使って抽出したゲノムDNAを鋳型とし、DDBJ（http://www.ddbj.nig.ac.jp：アクセッション番号AP005385）に登録されているイネゲノム配列情報から設計されたプライマーGAPDH5-5［5’-ATGCAAGCTTTTGCGTTGACAACAATTGGC-3’（下線部はHindIII制限酵素認識部位）：配列番号２９］とGAPDH5-3 [5’-ATGCCCATGGGTGAAAGAGAGGCGGAGC-3’（下線部は、NcoI制限酵素認識部位）：配列番号３０]をプライマーとして用い、PCRを行った。プライマーは、-967位から-3位までに位置する969塩基対［配列番号１６において7位（1-6位はHindIII認識配列）の塩基から975位（976-981位はNcoI認識配列）までの塩基に対応］の配列を増幅するように設計した。また、プライマーは増幅断片のクローニングを容易にするため、増幅断片の5’末端（GAPDH5-5）及び3’末端（GAPDH5-3）に、それぞれ唯一のHindIII及びNcoI制限酵素認識部位を導入した。
PCR後、増幅断片（約1.0kb）をEx Taqポリメラーゼ（Takara）を用いてdATP存在下で72℃、5分間処理して末端にAを付加し、Promega社のpGEM-T easy vector systemを用いてpGEM-T easyベクターにクローニングした。
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号１６にその塩基配列を示す。なお、配列番号１６の塩基配列において1位〜6位までの塩基配列、976位〜981位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位であり、761位以降の塩基配列が転写領域である。
以上のイネ遺伝子プロモーター配列のクローニング手順を図１に示す。
クローニング後、インサートの塩基配列を解読し、上記の登録イネゲノム配列情報と同一であることを確認した。配列番号１６にその塩基配列を示す。なお、配列番号１６の塩基配列において1位〜6位までの塩基配列、976位〜981位までの塩基配列がクローニングに用いた制限酵素部位であり、761位以降の塩基配列が転写領域である。
以上のイネ遺伝子プロモーター配列のクローニング手順を図１に示す。
（２）植物形質転換用バイナリーTiプラスミドベクターの構築
上記のプロモーター配列をイネに導入するために、植物形質転換用バイナリーTiプラスミドベクターpSMAHdN627-M2GUSを構築した（図２）。図２に示すように、本バイナリーベクターには、T-DNA上に植物用選抜マーカー遺伝子として、アグロバクテリウムTiプラスミド由来Nos（ノパリン合成酵素遺伝子）プロモーター：：大腸菌由来HPT（ハイグロマシン耐性）遺伝子のコード領域：：Tiプラスミド由来TiaaM（トリプトファンモノオキシゲナーゼ遺伝子）ターミネーターを配置し、形質転換された植物体がハイグロマイシンB耐性を示すようにした。また、その隣接部位にベータグルクロニダーゼ（GUS）遺伝子のコード領域：：Tiプラスミド由来Nosターミネーターから構成されるキメラ遺伝子を配置し、GUS遺伝子の5’上流側にプロモーター配列を挿入できるようにマルチクローニング部位を設けた。また、left border（LB）配列とright border（RB）の配列の外側には、微生物細胞で機能し得るスペクチノマイシン耐性（SpR）遺伝子、大腸菌で機能するpBR322由来（ColE1型）複製開始領域、アグロバクテリウム細胞内においてプラスミドが安定に保持されるための配列Sta、及び複製開始領域Repを設けた。
上記のプロモーター配列をイネに導入するために、植物形質転換用バイナリーTiプラスミドベクターpSMAHdN627-M2GUSを構築した（図２）。図２に示すように、本バイナリーベクターには、T-DNA上に植物用選抜マーカー遺伝子として、アグロバクテリウムTiプラスミド由来Nos（ノパリン合成酵素遺伝子）プロモーター：：大腸菌由来HPT（ハイグロマシン耐性）遺伝子のコード領域：：Tiプラスミド由来TiaaM（トリプトファンモノオキシゲナーゼ遺伝子）ターミネーターを配置し、形質転換された植物体がハイグロマイシンB耐性を示すようにした。また、その隣接部位にベータグルクロニダーゼ（GUS）遺伝子のコード領域：：Tiプラスミド由来Nosターミネーターから構成されるキメラ遺伝子を配置し、GUS遺伝子の5’上流側にプロモーター配列を挿入できるようにマルチクローニング部位を設けた。また、left border（LB）配列とright border（RB）の配列の外側には、微生物細胞で機能し得るスペクチノマイシン耐性（SpR）遺伝子、大腸菌で機能するpBR322由来（ColE1型）複製開始領域、アグロバクテリウム細胞内においてプラスミドが安定に保持されるための配列Sta、及び複製開始領域Repを設けた。
（３）バイナリーベクターへのプロモーター配列の導入
pGEM-T easyベクターをHindIII及びNcoIで二重消化することにより、イネSEC13遺伝子、イネRPL5遺伝子、イネHMG1遺伝子、イネOLP1遺伝子、イネGF14b遺伝子、イネGAPDH遺伝子の各プロモーター断片をそれぞれ切り出し、（２）で構築したpSMAHdN627-M2GUSベクターの対応する部位にクローニングした。得られたプラスミドをpSMAHdN627-SEC13GUS、pSMAHdN627-RPL5GUS、pSMAHdN627-HMG1GUS、pSMAHdN627-OLP1GUS、pSMAHdN627-GF14bGUS、pSMAHdN627-GAPDHGUSとそれぞれ命名し、バイオラッド社のE. coliパルサーを用いたエレクトロポレーション法（0.2 cmキュベット、パルス条件：2.4kV/cm、25μF、200Ω）により、アグロバクテリウムEHA105系統に導入した。
pGEM-T easyベクターをHindIII及びNcoIで二重消化することにより、イネSEC13遺伝子、イネRPL5遺伝子、イネHMG1遺伝子、イネOLP1遺伝子、イネGF14b遺伝子、イネGAPDH遺伝子の各プロモーター断片をそれぞれ切り出し、（２）で構築したpSMAHdN627-M2GUSベクターの対応する部位にクローニングした。得られたプラスミドをpSMAHdN627-SEC13GUS、pSMAHdN627-RPL5GUS、pSMAHdN627-HMG1GUS、pSMAHdN627-OLP1GUS、pSMAHdN627-GF14bGUS、pSMAHdN627-GAPDHGUSとそれぞれ命名し、バイオラッド社のE. coliパルサーを用いたエレクトロポレーション法（0.2 cmキュベット、パルス条件：2.4kV/cm、25μF、200Ω）により、アグロバクテリウムEHA105系統に導入した。
（実施例２） イネ形質転換
イネの形質転換は超迅速形質転換法（WO 01/06844 A1 (2001)参照）により行った。イネ（品種：日本晴）種子を、70 ％エタノール、続いて次亜塩素酸ナトリウムで殺菌し、滅菌蒸留水ですすいで水を切った後、胚が上向きになるようN6D寒天培地〔N6 salts 及びvitamins (Chu C.C., C.S.Wang, C.C.Sun, C. Hsu, K.C. Yin, C.Y. Chu, Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources, Sci. Sinica, 18, 659-668 (1975))、30 g/L ショ糖、 0.3 g/L カザミノ酸、2.8 g/L プロリン、2 mg/L 2,4-D, 2 g/L ゲルライト、pH5.7〕に置床し、30℃かつ明条件下で5日間培養した。
イネの形質転換は超迅速形質転換法（WO 01/06844 A1 (2001)参照）により行った。イネ（品種：日本晴）種子を、70 ％エタノール、続いて次亜塩素酸ナトリウムで殺菌し、滅菌蒸留水ですすいで水を切った後、胚が上向きになるようN6D寒天培地〔N6 salts 及びvitamins (Chu C.C., C.S.Wang, C.C.Sun, C. Hsu, K.C. Yin, C.Y. Chu, Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources, Sci. Sinica, 18, 659-668 (1975))、30 g/L ショ糖、 0.3 g/L カザミノ酸、2.8 g/L プロリン、2 mg/L 2,4-D, 2 g/L ゲルライト、pH5.7〕に置床し、30℃かつ明条件下で5日間培養した。
一方、イネSEC13遺伝子プロモーター断片を挿入したプラスミドpSMAHdN627-SEC13GUS、イネRPL5遺伝子プロモーター断片を挿入したプラスミドpSMAHdN627-RPL5GUS、イネHMG1遺伝子プロモーター断片を挿入したプラスミドpSMAHdN627-HMG1GUS、イネOLP1遺伝子プロモーター断片を挿入したプラスミドpSMAHdN627-OLP1GUS、イネGF14b遺伝子プロモーター断片を挿入したプラスミドpSMAHdN627-GF14bGUS、イネGAPDH遺伝子プロモーター断片を挿入したプラスミドpSMAHdN627-GAPDHGUSをそれぞれ保持するアグロバクテリウムEHA105系統を、25 mg/Lクロラムフェニコール、25 mg/Lリファンピシン、及び100 mg/Lスペクチノマイシンを含むLB寒天培地にて28 ℃で3日間培養した。続いて増殖した菌体をミクロスパーテルで少量かきとり、20 mg/Lアセトシリンゴンを含むAAM液体培地 〔Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T., Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA, Plant J., 6, 271-282 (1994)〕に懸濁した。このアグロバクテリウム懸濁液に、N6D培地で5日間培養したイネ発芽種子を浸し、菌液をよく切ったあと、20 mg/Lアセトシリンゴンを含むAAM寒天培地に置床し、25℃の暗条件下で3日間培養した（共存培養）。共存培養後のイネ発芽種子を滅菌水、続いて500 mg/Lカルベニシリンを含む滅菌水で洗浄し、滅菌ろ紙上で余分な水分を切った後にシュート基部を四分割し、500 mg/Lカルベニシリン及び30 mg/LハイグロマイシンBを含むN6D寒天培地に置床し、30℃の明条件下で14日間培養した。その後、成長してきたシュート基部を、組換え体再分化及び選択培地〔植物体再分化培地：MS salts及びvitamins (Murashige, T., Skoog, F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol. Plant, 15, 473-497 (1962))、 30 g/l ショ糖、30 g/l ソルビトール、2 g/l カザミノ酸、0.02 mg/l NAA、2 mg/l カイネチン、2 g/l ゲルライト、pH 5.8〕に、300 mg/Lカルベニシリン + 30 mg/LハイグロマイシンBを添加したもの； Toki, S., 1997, Rapid and Efficient Agrobacterium-mediated transfomation of rice, Plant Mol Biol. Rep., 15: 16-21参照〕に移し、30℃かつ明条件下で14日間培養し、さらにこの操作をもう一度繰り返し、ハイグロマイシン耐性を有する植物体を再分化させた。このようにして得られた再分化個体をMSホルモンフリー寒天培地〔MS salts 及びvitamins（Murashige, T.ら、前掲）、30g/l ショ糖、4 g/l ゲルライト、pH5.8〕に移植し、30℃、明条件下で1〜2週間生育させ、シュート（地上部）の伸長、及び発根とその伸長を促した。シャーレ（直径9 cm）内で形質転換体のシュート及び根の長さが約10 cmあるいはそれ以上の長さに到達した際、培養土に移植し、遺伝子組換え体育成用グロースチャンバーにて明期14時間（30℃）- 暗期10時間（25℃）のサイクルでさらに生育させた。
（実施例３） 植物組織切片の作製とGUS染色による導入遺伝子の発現の観察
イネに導入したイネSEC13、RPL5、HMG1、OLP1、GF14b、GAPDH遺伝子プロモーターの活性を観察するため、GUS酵素活性の組織化学的染色を実施した。実験に用いた植物組織材料のうち、カルス、花器官、根についてはイネ個体あるいはカルス（培養細胞）から切り取った材料をそのまま反応液に浸漬した。葉身については展開葉を5〜10 mmの幅で切り取り５％の寒天に包埋し、マイクロスライサー（堂阪イーエム、DTK1000）を用いて80μmの厚さの切片を作製した〔植物細胞工学 第4巻281-285頁(1992)〕。稈基部については、根を切り取った稈（かん：イネ科植物の茎を表す用語）の根元から5-10 mmの組織を切り取り、また茎頂については前出の稈基部の直上部分を10 mmほど切り取り、葉身と同様の方法で80μmの厚さの切片を作製した。こうして作製した植物材料をGUS活性測定用の反応液〔50 mMリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.0)、1 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc)、5%(v/v) メタノール、10μg/mlシクロヘキシミド、1 mMジチオスレイトール〕に浸漬し、37℃で穏やかに振盪しながら24時間置いた。その後、100％エタノールで反応液を置換して反応を停止し、さらに24時間静置することにより緑色組織の細胞より葉緑素を除去した。次にエタノールを純水で置換した後、実体顕微鏡あるいは光学顕微鏡で染色パターンを観察した。
イネに導入したイネSEC13、RPL5、HMG1、OLP1、GF14b、GAPDH遺伝子プロモーターの活性を観察するため、GUS酵素活性の組織化学的染色を実施した。実験に用いた植物組織材料のうち、カルス、花器官、根についてはイネ個体あるいはカルス（培養細胞）から切り取った材料をそのまま反応液に浸漬した。葉身については展開葉を5〜10 mmの幅で切り取り５％の寒天に包埋し、マイクロスライサー（堂阪イーエム、DTK1000）を用いて80μmの厚さの切片を作製した〔植物細胞工学 第4巻281-285頁(1992)〕。稈基部については、根を切り取った稈（かん：イネ科植物の茎を表す用語）の根元から5-10 mmの組織を切り取り、また茎頂については前出の稈基部の直上部分を10 mmほど切り取り、葉身と同様の方法で80μmの厚さの切片を作製した。こうして作製した植物材料をGUS活性測定用の反応液〔50 mMリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.0)、1 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc)、5%(v/v) メタノール、10μg/mlシクロヘキシミド、1 mMジチオスレイトール〕に浸漬し、37℃で穏やかに振盪しながら24時間置いた。その後、100％エタノールで反応液を置換して反応を停止し、さらに24時間静置することにより緑色組織の細胞より葉緑素を除去した。次にエタノールを純水で置換した後、実体顕微鏡あるいは光学顕微鏡で染色パターンを観察した。
その結果、イネSEC13遺伝子プロモーターを導入した場合、茎頂付近、稈基部、葉身、頴花、根、カルスで発現が認められた。頴花では特に花粉で発現が見られた（図３）。
イネRPL5遺伝子プロモーターを導入した場合は、稈基部、茎頂付近、葉身、根、カルスで発現が認められた。特に、根原基、根の先端で発現が著しかった（図４）。
イネHMG1遺伝子プロモーターを導入した場合は、根、葉身、稈基部、頴花、カルスで発現が認められた。頴花においては雄蕊、雌蕊、外頴、内頴ともに発現が見られた（図５）。
イネOLP1遺伝子プロモーターを導入した場合は、根、葉身、茎頂付近、稈基部、頴花、カルスで発現が認められた。特に根端部で非常に強い発現が見られた（図６）。
イネGF14b遺伝子プロモーターを導入した場合は、根、稈基部、葉身、カルスで発現が認められた。側根分裂組織では発現されなかった（図７）。
イネGAPDH遺伝子プロモーターを導入した場合は、稈基部、葉身、根、頴花、再分化個体（T1世代）を育成して得られたT2後代種子及びT2種子由来カルスで発現が検出された。根では先端部分で強い発現が見られた（図８）。
イネRPL5遺伝子プロモーターを導入した場合は、稈基部、茎頂付近、葉身、根、カルスで発現が認められた。特に、根原基、根の先端で発現が著しかった（図４）。
イネHMG1遺伝子プロモーターを導入した場合は、根、葉身、稈基部、頴花、カルスで発現が認められた。頴花においては雄蕊、雌蕊、外頴、内頴ともに発現が見られた（図５）。
イネOLP1遺伝子プロモーターを導入した場合は、根、葉身、茎頂付近、稈基部、頴花、カルスで発現が認められた。特に根端部で非常に強い発現が見られた（図６）。
イネGF14b遺伝子プロモーターを導入した場合は、根、稈基部、葉身、カルスで発現が認められた。側根分裂組織では発現されなかった（図７）。
イネGAPDH遺伝子プロモーターを導入した場合は、稈基部、葉身、根、頴花、再分化個体（T1世代）を育成して得られたT2後代種子及びT2種子由来カルスで発現が検出された。根では先端部分で強い発現が見られた（図８）。
Claims (5)
- 以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に示す、プロモーターとして機能しうるDNA。
（ａ）配列表の配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列表の配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA
（ｃ）配列表の配列番号１、４、７、１０、１３又は１６に示す塩基配列の一部の塩基配列からなり、かつ目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA - 請求項１に記載のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ目的遺伝子を植物体内で構成的に発現させるプロモーター活性を有するDNA。
- 請求項１又は２に記載のDNAを含有する組換えベクター。
- 請求項１又は２に記載のDNAと目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項３又は４に記載の組換えベクターを導入した形質転換植物体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004033675A JP4474542B2 (ja) | 2004-02-10 | 2004-02-10 | 構成的発現プロモーター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004033675A JP4474542B2 (ja) | 2004-02-10 | 2004-02-10 | 構成的発現プロモーター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005224120A true JP2005224120A (ja) | 2005-08-25 |
| JP4474542B2 JP4474542B2 (ja) | 2010-06-09 |
Family
ID=34999313
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004033675A Expired - Lifetime JP4474542B2 (ja) | 2004-02-10 | 2004-02-10 | 構成的発現プロモーター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4474542B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109943574A (zh) * | 2019-04-09 | 2019-06-28 | 贵州大学 | 一种高粱14-3-3蛋白GF14b基因及其重组载体和表达方法 |
-
2004
- 2004-02-10 JP JP2004033675A patent/JP4474542B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109943574A (zh) * | 2019-04-09 | 2019-06-28 | 贵州大学 | 一种高粱14-3-3蛋白GF14b基因及其重组载体和表达方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4474542B2 (ja) | 2010-06-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100228918B1 (ko) | 헬리안티닌의 상부 조절요소를 기초로 한 키메릭 식물 유전자 | |
| RU2692924C2 (ru) | Регуляторные молекулы нуклеиновых кислот для усиления семя-специфичной и/или семя-предпочтительной генной экспрессии в растениях | |
| JP5655947B2 (ja) | 成葉特異的プロモーター | |
| Yamchi et al. | Proline accumulation in transgenic tobacco as a result of expression of Arabidopsis Δ 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) during osmotic stress | |
| WO2011049243A1 (ja) | バイオマスが増大し、かつ環境ストレス耐性が向上した形質転換植物およびその作出方法 | |
| JP5828302B2 (ja) | サトウキビ花成制御技術 | |
| Hong et al. | Promoter of chrysanthemum actin confers high-level constitutive gene expression in Arabidopsis and chrysanthemum | |
| US20090210969A1 (en) | Antiporter gene from porteresia coarctata for conferring stress tolerance | |
| KR20060022054A (ko) | 고구마 유래 식물체 당 유도성 프로모터 염기서열 및 이를포함하는 식물체 당 유도성 발현 벡터 | |
| JP4474540B2 (ja) | シュート維管束特異的発現プロモーター | |
| JP4452823B2 (ja) | カルス及び種子胚特異的発現活性を有するプロモーター | |
| JPWO2009072676A1 (ja) | 成長が促進された形質転換植物 | |
| KR20020055540A (ko) | 식물 번역 조절 종양 단백질 유전자의 프로모터 시스템 | |
| JP4474542B2 (ja) | 構成的発現プロモーター | |
| JP4919305B2 (ja) | 葉特異的発現活性を有するプロモーター | |
| JP4505626B2 (ja) | 花粉特異的発現活性を有するプロモーター | |
| JP2010142156A (ja) | ＯｓＰＩＰ１；３遺伝子を導入した耐冷性イネ | |
| JP4474541B2 (ja) | 維管束特異的発現プロモーター | |
| KR101522603B1 (ko) | 식물 뿌리의 중심주조직에 주요하게 목적단백질을 발현시키는 OsRS 프로모터 및 이의 용도 | |
| JP5472089B2 (ja) | 光合成組織における遺伝子発現制御に関わるｄｎａ | |
| JP4505627B2 (ja) | 緑色組織特異的発現活性を有するプロモーター | |
| JP4505628B2 (ja) | 葉特異的発現活性を有するプロモーター | |
| JP2004528854A (ja) | 新規構成的植物プロモーター | |
| WO2011074553A1 (ja) | 植物の生育促進およびバイオマス量の増加に関与する遺伝子ならびにその利用方法 | |
| CN112048490B (zh) | 棉花丝/苏氨酸蛋白磷酸酶GhTOPP6及其编码基因和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070125 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091027 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091208 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100209 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4474542 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |