KR100228918B1 - 헬리안티닌의 상부 조절요소를 기초로 한 키메릭 식물 유전자 - Google Patents

헬리안티닌의 상부 조절요소를 기초로 한 키메릭 식물 유전자 Download PDF

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Abstract

헬리안티닌은 해바라기 배의 11S 종자저장 단백질이다.
본 발명은 헬리안티닌 유전자의 5' 조절영역에 관한 것이다. 특히 조직 특이적이거나 일시적으로 조절되거나 앱스시신산에 반응하는 유전자 발현을 지시하는, 이 조절 영역의 특정 시스-조절 요소에 관한 것이다. 본 발명은 이종 유전자(heterologous gene)의 발현을 조절하기 위해 이 유전자의 옆에 연결된 시스-조절인자로 이루어지는 키메릭 유전자를 제공한다. 이 키메릭 유전자는 트랜스제닉 식물에 제초제 내성 및 종자유(seed lipid)의 질 개선을 부여한다.

Description

헬리안티닌의 상부 조절요소를 기초로 한 키메릭 식물 유전자
제1도는 헬리안티닌 유전자 HaG3-A 상부 조절앙상블(upstream regulatory ensemble; URE)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 제1도의 뉴클레오타이드 번호 -2377 ∼+24는 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오타이드 번호 1∼2401에 대응된다.
제2도는 헬리안티닌 유전자 HaG3-D 의 URE 중 일부의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 제2도의 뉴클레오타이드 -2457∼-726은 SEQ ID NO:2의 뉴클레오타이드 1∼1732에 대응된다.
제3도는 헤리안티닌 유전자 HaG3-D의 URE중 일부의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 제3도의 뉴클레오타이드 -725∼-322는 SEQ ID NO:3의 뉴클레오타이드 1∼404에 대응된다. 헬리안티닌 유전자 HaG3-D에서, 제3도의 클레오타이드 서열은 제2도의 서열로부터 3'으로 바로 아래에 위치한다.
제4도는 HaG3-FL/GUS와, 조절 구조체인 pBI 121.1과 pBI 101.1을 나타낸다.
제5도는 헬리안티닌 게놈 유전자인 HaG3-A와 HaG3-D의 제한효소 지도와 모플라즈미드(parental plasmid)를 구성하는데 사용된 제한 단편을 나타낸다.
제6도는 HaG3-A 및 HaG3-D의 유도체 구조체를 전체 길이의 구조체에 대해 나타낸 것이다.
제7도는 HaG3-D-N와 HaG3-A-SB/R 구조체를 포함하는 트랜스제닉 묘종(seedling)에서 GUS의 세포화학적 분포를 나타낸다.
제7(a)도 : HaG3-D-404N, 흡수 8일 후(8DPI:days post-imbibition); 제7(b)도 : HaG3-A-SB/R, 8 DPI; 제7(c)도 : HaG3-D-404N, 14 DIP; 제7(d)도 : HaG3-A-SB/R, 14 DIP; E: HaG3-A-SB/R, 8 DIP; F: HaG3-A-SB/R, 6 DIP.
제8도는 점진적인 탈수 및, 물결핍으로부터 연속적으로 회복되는 동안 HaG3-D-404N을 포함하는 트랜스제닉 담배잎에서의 GUS활성 유도를 그래프로 나타낸 것이다.
제9도는 HaG3-D-404N을 포함하는 담배잎에서, GUS의 ABA유도를 그래프로 나타낸 것이다.
헬리안티닌은 해바리기 배의 11S 종자 저장 단백질이다.
본 발명은 헬리안티닌 유전자의 5' 조절영역에 관한 것이다. 특히 조직 특이적이거나 일시적으로 조절되거나 앱스시신산(abscicicacid; ABA)에 반응하는 유전자 발현을 지시하는, 이 조절 영역의 특정 시스-조절 요소에 관한 것이다. 본 발명은 이 종 유전자(heterologous gene)의 발현을 조절하기 위해 이 유전자의 옆에 연결된 시스-조절인자도 이루어지는 키메릭 유전자를 제공한다. 이 키메릭 유전자는 트랜스제닉 식물에 제초제 내성 및 종자 지방(seedlipid)의 질 개선을 부여한다.
고등 식물에서는 독특하게, 종자 발육은 배 발육 뿐 아니라 발육하는 묘종의 발아를 보장해 주기 위해 종자 내에서 일어나는 생리적 적응 과정에도 관련이 있다. 수정된 후 배와 내배유는 빠르게 성장 및 분화하며, 그 이후 종자 발육의 성숙단계 동안 양분이 축적된다. 이러한 저장물은 나중에 발육 묘종에 의해 사용되기 위해, 발육 억제 기간동안 저장된다. 이 억제 기간은 종자 발육의 탈수단계에 앞선다.
저장 단백질, 렉틴, 트립신 억제제를 포함하는 종자 단백질의 몇몇 군은 배발생(embryogenesis) 동안 축적된다. 종자 저장 단백질의 주기능은 발육 묘종의 발아를 위해, 배발생 동안 탄소 및 질소 저장물을 축적, 저장하는 것이다. 이들 단백질 및 이들을 지정하는 유전자들은 광범위하게 연구되었다(Shotwell 등, (1989) The Biochemistry of plants, 15, Academic Press, NY. 297 참고).
종자 저장 단백질을 지정하는 유전자는 종자 발육 중에 매우 조절되고 분화되어 발현된다. 배발생의 성숙 단계 동안, 발현은 mRNA 축적에 의해 빠르게 일시적으로 조절된다. 이 발현은 또한, 발육 종자의 내배유 또는 떡잎에서 1차적으로 일어나는 조직 특이적 발현이다.
결과물인 저장 단백질은 프로세스되며 단백질 몸체에 표적이 된다. 저장 단백질은 건조 및 배의 동면 동안에 유지된다. 발아시 묘종은 이 저장 단백질을 탄소원 및 질소원으로 이용한다(Higgins (1984) Ann. Rev. Plant Physiol. 35, 191).
저장단백질, 렉틴 및 트립신 억제제를 포함하는 종자 단백질은 발육 중에 구조적으로 변화하거나 증가되지 않는, 비동질적 다유전자군에 의해 지정된다(Goldberg et al. (1989) Cell, 56,149 참고). 이 유전자들은 일시적으로 또 공간적으로 조절되나 연결될 필요는 없다.
전사 후 기작에 의해 이들 중 몇몇 단백질의 축적이 조절되기도 하지만, 조절은 기본적으로 전사 수준에서 일어난다. 따라서 종자 단백질 유전자는 유전적 조절 요소, 특히 조직 특이성, 일시적인 조절, 환경 및 화학적 요소에 대한 반응 정도를 부여하는 요소를 제공하기 위한 뛰어난 시스템을 제공한다.
종자 단백질 유전자의 일시적이고 공간적인 조절을 관찰함에 의해 종자 단백질이 트랜스-작용(trans-acting) 인자로 알려진 공통된 세포 인자에 의해서 조절된 것이라는 것이 제안되었다. 그러나 개개의 종자 단백질 유전자의 발현 형태에 있어서 양적 및 질적인 차이가 나타나기 때문에, 이러한 종자 단백질 군의 다양한 발현 양상을 위한 수단을 제공하기 위해 더욱 특이적인 인자도 존재하여야 한다. 분화된 발현 양상은 평지씨의 주 저장 단백질인 크루시페린과 내핀(Crouch et al. (1981) Planta 153, 64; Finkelstein et al. (1985) Plant Physiol. 78 630) 사이에서, 또 완두 쿠니츠(Kunitz) 트립신 억제자 유전자군 (Jofuku et al. (1989) Plant Cell 1, 1079) 사이에서 관찰되었다. 완두의 주요 종자 저장 단백질 유전자들 각각을 비교한 결과 β-콘글리시닌(7S)와 글리시닌(11S)의 발현이 시간과 세포형에 특이적임을 알게 되었다. 7S 서브유니트 mRNA는 11S mRNA가 나타나기 며칠 전에 나타냈다. 또, 글리시닌 유전자군은 모두 동시에 활성화 되는데 비해 (Nielsen et al. (1989) Plant Cell 1, 313), β-콘글리시닌 유전자군은 차별적으로 조절되었다(Barker et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85, 458; Chen et al. (1989) Dev. Genet. 10, 112). 이들 유전자 각각은 이들 유전자군 사이 및 이들 내에 다른 발현 형태를 부여하는 시스-조절 요소의 배열이 다르다.
헬리안티닌은 해바라기(Helianthus annuus)의 주요 11S 글로빈 종자 저장 단백질이다. 다른 종자 저장 단백질처럼 헬리안티닌의 발현은 조직 특이적이며 발육의 조절을 받는다. 그러나 이러한 특이성을 부여하는 헬리안티닌 조절요소는 지금까지 알려지지 않았다. 헬리안티닌 mRNA는 개화 후(days post-flowering DPF) 7일 째에 배에서 처음 발견되며, 12-15DPF에 mRNA는 최고 농도의 도달한다. 이 후에 헬리안티닌의 전사체 농도는 감소하기 시작한다. 성숙 종자나 발아하는 묘종에는 헬리안티닌 전사체가 존재하지 않는다. 헬리안티닌 폴리펩타이드는 7DPF-19DPF에서 빠르게 축적되나 종자가 후성숙 단계에 도달하면 그 축적은 느려진다(Allen et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5, 165).
대부분의 종자 단백질처럼 헬리안티닌도 적은 유전자군에 의해 지정된다. 최소한 2종류의 발산하는 서브군(subfamily) 알려져 있으며 각각 Ha2와 Ha10으로 명명된다. 2개의 클론, HaG3-A와 HaG3-D는 Ha2 서브군의 비-대립형질 일원을 나타내는데, 이들을 분리하여 부분적으로 특성을 알아보았다(Vonder Haar et al. (1988) Gene 74, 433). 그러나 , 이것 또는 모든 헬리안티닌 유전자의 조절 인자에 대한 자세한 분석은 아직까지 알려지지 않았다.
본 발명과 관련하여 헬리안티닌 유전자로부터의 조절 인자가 종자 특이적 유전자의 발현, 뿌리 특이적 유전자의 발현 및/또는 일시적으로 변형되는 유전자의 발현에 지향됨이 밝혀졌다. 이들 조절 요소들은 트랜스제닉 식물에서 특정 유전자 산물이 조절되어 발현되도록 한다.본 발명은 트랜스제닉 식물에서 유전자가 더욱 조절되어 발현되도록 함으로써 종자이 질을 높이고, 가뭄 등의 환경 조건에 대한 내성을 향상시키며 제초제 내성 유전자를 더욱 조절되도록 한다.
본 발명은 헬리안티닌 유전자의 5’조절 영역에 관한 것이다. 이 영역은 본 명세서에서 상부 조절 앙상블(upstream regulatory ensemble (URE)로 지칭되며, 헬리안티닌 단백질을 지시하는데 유용하다. URE는 트랜스제닉 식물에서 발현되는 이종 유전자의 지정부위(coding region)에 연결될 때 뛰어난 조절 발현 양상을 부여하는 다수 조절 인자로 구성된다.
본 발명은 특히, 종자 특이적 유전자의 발현, 뿌리 특이적 유전자의 발현, 앱스시신산(abscisic acid; ABA)에 반응하는 유전자의 발현, 및/또는 일시적으로 변형되는 유전자의 발현을 지시하는 헬리안티닌 조절 요소를 포함하는 분리된 DNA를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 이 조절 요소를 포함하는 키메릭 식물 유전자에 관한 것이다. 이종 유전자 산물의 조절할 수 있도록 이 조절 요소는 그 이종 유전자의 지정 서열에 자동 가능하도록 연결된다. 필요하다면 프로모터 요소 또는 그 일부를 키메릭 유전자에 넣을 수 있다. 또한 식물 세포의 형질전환을 위한, 본 발명의 키메릭 유전자를 포함하는 식물 형질전환벡터와, 이들 키메릭 유전자를 포함하는 식물 및 그것의 자손도 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면은, 종자 지방의 질이 개선된 식물을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 지방 대사 효소를 지정하는 유전자의 지정 부위에 종자 특이적 발현을 지시하는 조절 요소가 연결된 키메릭 유전자가 제조된다. 이 키메릭 유전자를 식물 세포에 형질전환시키면 종자지방의 질이 개선된 식물을 얻을 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 제초제 내성인 식물을 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 제초제 내성 유전자의 발현을 지시하는 뿌리 특이적 조절 요소를 포함하는 키메릭 유전자를 만들고, 이 키메릭 유전자로 식물 세포를 형질전환시키면 제초제 내성인 식물을 얻을 수 있다.
본 발명은, 해바라기의 헬리안티닌 유전자의 상부 조절 앙상블(URE)의 시스-조절 요소로 이루어진다. 이 시스-조절 요소는 이들이 조절을 받는 유전자의 발현을 조절하는, URE에 흩어져 있는 부분이다. 특히 본 발명은 다음 중 최소한 하나를 지시하는, 헬리안티닌 유전자의 최소한 하나의 조절 요소를 포함하는 분리된 핵산을 제공한다. 종자 특이적 유전자의 발현, 뿌리 특이적 유전자의 발현, ABA에 반응하는 유전자의 발현 또는 일시적으로 변형되는 유전자의 발현. 어떠한 헬리안티닌 유전자라도 2개의 발산하는 헬리안티닌 유전자 서브군을 나타내는 Ha2와 Ha10을 포함하는 조절 요소를 제공할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 헬리안티닌 유전자는 Ha2 서브군의 일원인 HaG3-A이다.
본 발명의 조절 요소 중 하나는 종자 특이적 발현을 지시한다. 종자 특이적 조절 요소는 종자에서 그것의 조절하에서 유전자를 발현시킬 수 있는 즉, 생산된 유전자 산물이 종자내에서 검출되도록 할 수 있는 특정 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 종자 특이적 발현은 제한적인 의미에서가 아니라 한 예로써 떡잎과, 배의 배축, 내배유와 같이 종자의 한 부분에서 일어난다.
종자 특이적으로 조절되는 유전자는 묘종 또는 성숙 식물의 체조직에서는 발현되지 않는다.
종자 특이적 발현을 지시하는 조절 요소는 동정하기 위하여 헬리안티닌 유전자의 천체 URE에 대해 결실 분석을 할 수 있다. 결실 실험에서 전체 URE로부터 뉴클레오타이드를 연속적으로 제거하면서 남은 단편을 리포터 유전자 또는 다른 이종 유전자의 지정 부위에 연결시킨다. 이 구조체를 이용하여, 리포터 유전자의 산물이 종자 조직에는 존재하나 다른 조직에는 존재하지 않음을 알아봄으로써 종자 특이적 발현을 지시하는 능력을 분석한다. 동정된 종자 특이적 요소는 사이트-디렉트 돌연변이 등에 의해 변형될 수 있다. 변형된 조절 요소의 종자 특이적 발현을 지시하는 능력을 분석할 수 있으며, 이것에 의해 종자 특이성을 부여하는 선택적 서열을 알아낼 수 있다. 조절 요소를 동정하기 위한 이러한 기술은 모든 헬리안티닌 유전자에 적용할 수 있다. 예를 들면 한 바람직한 구체예에서, 헬리안티닌 HaG3-A유전자의 URE를 분석한 결과 종자 특이적 조절 요소는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 851-2401 및 1-2401에 의해 제공됨을 알게 되었다.
또, 본 발명에 의해서 뿌리 특이적 발현을 위한 조절 인자가 제공된다. 뿌리 특이적 발현은 특히 중요하며 흥미롭다. 보통 해바라기 헬리안티닌 유전자는 종자에서만 발현된다. 본 발명에 따라 전체 URE에서 헬리안티닌 URE의 특정 영역을 분리하면, 식물의 뿌리에서만 발현된다, 뿌리 특이적 조절 요소는 그것의 조절하에 있는 유전자가 식물의 뿌리에서만 발현되도록하고 식물의 다른 조직에서는 발현되지 않도록 하는 특정 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 뿌리 특이적 발현을 지시하는 조절 요소는, 뿌리조직에서 발현을 조사하는 것을 제외하고는 종자 특이적 조절 요소의 동정에 이용된 방법과 같은 방법을 이용하여 헬리안티닌 URE의 단편을 뿌리 특이적 발현을 부여하는 능력에 대해 분석함으로써 동정된다. 뿌리 특이적 발현을 가능하게 하는 뉴클레오타이드 서열의 변형도 앞의 방법에 의해 가능하다. 이러한 기술에 의해 모든 헬리안티닌 유전자로부터 뿌리 특이적 조절 요소를 동정할 수 있다. 예를 들면, 바람직한 구체예에서, 헬리안티닌 HaG3-A 유전자의 URE를 분석한 결과 뿌리 특이적 조절 요소는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 1-1639 및 뉴클레오타이드 851-1639에 의해 제공됨을 알게 되었다.
헬리안티닌의 발현은 매우 엄격하게 일시적으로 조절되며, 12DPF에 처음 mRNA가 검출된다. 따라서 4DPF정도에 검출될 수 있는, 일시적으로 변형되는 유전자 발현을 지시하는 시스-조절 요소를 발견하였다.
일시적으로 변형되는 유전자의 발현을 지시하는 조절 요소를 동정하기 위하여 헬리안티닌 유전자의 전체 URE에 대해 결실 분석을 할 수 있다. URE단편을 이종 유전의 코딩 서열에 연결시켜 이 키메릭 구조물로 식물을 형질전환시켰다. 형질전환된 식물의 종자를 DPF(days post flowering)단계로 두고, 이 종자에서 이종 유전자가 발현되는지 알아보았다. 10DPF 전에 이종 유전자의 발현을 지시하는 요소를 일시적으로 변형되는 발현을 부여하는 인자로 동정되었다. 원하는 표현형을 부여하는, 뉴클레오타이드 서열 변형도 위의 방법에 따라 동정할 수 있다. 이러한 기술에 의해 모든 헬리안티닌 유전자로부터의 일시적으로 변형되는 유전자의 발현을 부여하는 조절 요소를 동정할 수 있다. 예를 들면, 바람직한 구체예에서, 헬리안티닌 HaG3-A유전자의 URE를 분석한 결과 일시적으로 변형되는 유전자의 발현을 부여하는 조절 요소는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 1-851 및 뉴클레오타이드 1639-2303에 의해 제공됨을 알게 되었다.
본 발명은 또다른 측면은 앱스시신 산(ABA)에 반응하는 유전자의 발현을 지시하는 헬리안티닌의 URE영역에 관한 것이다. ABA에 반응하여 발현되도록 할 수 있는 특정 뉴클레오타이드 서열이다. ABA에 반응하는 요소는 그것5의 조절하에 있는 유전자가 ABA에 반응하는 요소의 조절을 받는 유전자의 발현은 ABA로 처리함에 의해 또는 ABA생합성을 야기한다고 알려진 외부 자극에 의해 유도될 수 있다. 예를 들면, ABA생합성은 물부족, 물-억압 및 염-억압 등의 환경적 스트레스에 의해 야기되는 팽합 손실의 결과로 시작된다. (Zeevaart et al. (1988) Annu. Rev. Plant Physiol. 39, 439). 상처가 생겨도 ABA의 농도는 증가한다(et al. (1988)Proc. Natl. Acad Sci. USA 86, 9851).
앞의 다른 조절요소의 동정에 이용된 방법을 이용하여 ABA에 반응하는 요소를 동정한다. 예를 들면 결실 실험으로 그것의 조절하에 있는 유전자가 ABA에 반응하여 발현되도록 유도하는 헬리안티닌 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 알아낼 수 있다.
위에 기재된 방법으로 그 서열은 변형될 수 있으며, ABA-반응 발현을 부여하는 변형된 서열을 알아낼 수 있다. 한 바람직한 구체예에서, 헬리안티닌 HaG3-A유전자의 URE를 분석한 결과 종자에서 ABA-반응 발현을 부여하는 요소는 SEQ ID NO:1 의 뉴클레오타이드 1-2041에 의해 제공됨을 알게 되었다. 다른 바람직한 구체예에서, SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 851-1639 또는 1639-2303이 성숙 식물의 잎에서 ABA-반응 발현을 부여하는 요소를 제공하였다. 다른 바람직한 구체예에서 헬리안티닌 HaG3- D 유전자의 URE를 분석한 결과 식물의 배가 아닌 조직에서 ABA-반응 발현을 SEQ ID NO: 3의 뉴클레오타이드 1-404가 제공함을 알게 되었다.
따라서 ABA-반응 요소는 ABA생합성을 시작할 수 있고, 나아가서 ABA-반응 요소에 의해 조절되는 유전자의 발현을 유도할 수 있는 특별한 환경에서 유용하다. 헬리안티닌 URE 의 ABA-반응 요소에 의해 조절되는 이종 유전자의 발현은 종자에 한정되지 않고 성숙 식물의 잎과 묘종 조직에서도 관찰된다.
헬리안티닌 유전자의 URE를 지정하는 분리된 핵산은 아래와 같이 제공될 수 있다. 헬리안티닌 mRNA를 나타내는 cDNA 재조합체를 이용하여 해바라기 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝하여 헬리안티닌 재조합 게놈 클론을 분리한다(Vonder Haar (1988) Gene 74, 433). 헬리안티닌 게놈 재조합 DNA를 얻기 위한 유용한 방법은 Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY등을 비롯한 재조합 DNA기술에 관한 실험실용 매뉴얼에 의해 광범위하게 얻을 수 있다. 뉴클레오타이드 서열 결정을 위해 공지된 많은 기술을 이용할 수 있다. 예를 들면, 헬리안티닌 URE를 포함하는, 제한 효소로 자른 단편을 pBluescript (Stratagene)와 같은 서열 결정용 백터의 폴리링커 위치에 서브클로닝시키고, 이 pBluescript서브클론의 서열을 이중선 다이디옥시 방법(Chen and Seeburg (1985) DNA 4, 165)으로 결정한다.
헬리안티닌 유전자 클론 HaG3A의 URE를 지정하는 DNA를 제1도에 기재하였으며 SEQ ID NO:1로 표시하였다. 헬리안티닌 유전자 클론 HaG3B의 URE를 지정하는 DNA의 뉴클레오타이드 서열을 제2도에 기재하였으며 SEQ ID NO:2 로 표시하였다. 같은 방법으로 다른 헬리안티닌 유전자의 URE로 얻을 수 있다. 선택적으로, 헬리안티닌 게놈 라이브러리를 스크리닝하고 추가의 헬리안티닌 유전자를 동정하기 위해 본 발명의 HaG3A 또는 HaG3D의 지정 서열 또는 URE 서열을 하이브리디제이션 프로브로 사용할 수 있으며 이렇게 하여 헬리안티닌 유저자군의 다른 일원을 나타내는 클론을 얻을 수 있다.
일시적으로 조직 특이적이며 ABA에 반응하는 조저를 하는 시스-조절 서열의 동정을 이종 유전자의 지정 서열과 특정 서열을 전사 융합시키고, 이 키메릭 유전자를 적당한 숙주에 옮기고, 상기 이종 유전자의 발현을 알아봄으로 가능하다. 발현을 알아보는 분석법은 이종 유전자으 서열에 따라 다르다. 예를 들면, 키메릭 구조체의 전사 및 번역 적성을 평가하기 위해 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼레이즈와 β-글루쿠로니데이즈(GUS)등의 리포터 유전자가 이용된다. 표준 방법에 의해 트랜스제닉 개체에서 리포터 효소를 민감하게 검출할 수 있다. 고등 식물에서는 GUS활성이 내재하지 않으며, 담배세포에서 GUS가 매우 안정되고, 정량적인 형광 분석과 조직화학적 분포 기술을 이용할 수 있으므로 트랜스제틱 담배에서 프로모터 활성에 대한 리포터로 GUS를 사용하는 것이 유용하다. Jefferson 등은 EMBO J, 6. 3901 (1987)에서 식물 조직에서 GUS 활성을 생화학 분서은 세포 용혈물을 GUS의 형광 측정 기질인 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루쿠로나이드와 섞어 37℃에서 1시간 반응시키고 결과로 생성된 4-메틸-움벨리페론의 형광을 측정함으로써 수행된다. GUS활성의 조직 화학적 위치 결정은 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-글루쿠로나이드(X-Gluc)에서 식물 조직 시료를 37℃에서 18시간 반응시키고 X-Gluc의 염색 양태를 관찰함으로써 결정된다. 이러한 키메릭 유전자를 만듦으로써 발현 조절을 위해 필요한 특정 조절 서열을 결정할 수 있으며, 이들 서열이 다음 분석에서와 같은 방법에서 이종 유전자의 발현을 지시한다는 것을 증명 할 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 종자 특이적 유전자의 발현, 뿌리 특이적 유전자의 발현, ABA-반응적 유전자의 발현 또는 일시적으로 변형되는 유전자의 발현을 지시하는, 헬리안티닌 유전자로부터 얻은 조절 요소를 이종 유전자 산물의 발현을 조절할 수 있도록 그 이종 유전자와 연결시킨 키메릭 식물 유전자에 관한 것이다. 이종 유전자로는 헬리안티닌 외에도 어떤 유전자도 가능하다. 필요하다면 이종 유전자에 의해 지정되는 폴리펩타이드를 충분히 생산할 수 있도록 도와주는 프로모터 요소 또는 그것의 일부를 추가로 키메릭 구조체내에 포함시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 예를 들면 불포화화효소(deseturase)와 같은 지방 대사 효소를 지정하는 서열에 연결된, 종자 특이적 발현을 부여하는 헬리안티닌 URE영역으로 이루어지는 키메릭 유전자를 제공한다. 바람직한 구체예에서, URE영역은 SEQ ID NO:1 로 표시된 HaG3-A의 뉴클레오타이드 851-2401 또는 1-2401롤 이루어진다. 종자 특이적 발현을 부여하도록 이들 서열을 변형시킬 수도 있다. 종자는 작물학적으로 중요한 저장 단백질 및 지방을 축적한다. 헬리안티닌 URE요소는 발육 중인 종자에서 매우 조절된 발현을 지시하므로 이들 요소는 종자 지방 및/또는 단백질의 질 향상에 유용하다. 이들 요소는 예를 들어 지방산의 연장과 불포화화에 관련된 지방 대사 효소 및/또는 단백질을 지정하는, 특히 라이신과 메티오닌 함량이 높은 효소 및/또는 단백질을 지정하는 유전자의 발현 조절에 유용하다. 이러한 요소를 포함하는 키메릭 유전자는 특정한 지방 및/또는 단백질군을 많이 축적하고 저장하는 트랜스제닉 식물주를 제공하는데 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 뿌리 특이적 유전자의 발현을 가능하게 하는 헬리안티닌 URE영역과 이것이 연결된 이종 유전자를 포함하는 키메릭 유전자를 제공한다. 이 구조물은 "정상적인" 헬리안티닌 발현과 공간적으로 구별되게, 이종 유전자를 식물 뿌리에서만 발현되도록 한다. 즉, 전체 URE에서 특정 서열을 제거하면 조직 특이적 조절이 변한다. 바람직한 구체예에서, HaG3-A URE의 이 부분은 SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 1-1639 또는 851-1639로 이루어지며, 이들 요소는 어떤 방향으로도 작용할 수 있지만 그 프로모터에 역방향으로 융합된다. 또다른 바람직한 실시예에서 제초제 내성을 제공하는 서열이 최소한 aroA 유전자의 일부이다. 뿌리 특이적 발현을 부여하도록 이들 서열을 변형시킬 수 있다.
제초제 내성을 부여하는 키메릭 구조물의 이용이 특히 중요하다. 대부분의 제초제가 잡초와 곡물을 구별하지 않으므로 제초제 내성인 곡물을 얻는 것은 광범위한 범위의 제초제를 사용할 수 있다는 점에서 작물학적으로 중요하다. 따라서, 본 발명은 식물 내에서 기능을 발휘하는 프로모터의 최소한 일부분에 융합된, 또는 추가로 최소한 aroA 유전자의 일부 또는 제초제 내성을 부여하는 폴리펩타이드를 지정하는 서열에 융합된, 뿌리 특이적 발현을 부여하는 헬리안티닌 URE 요소로 이루어지는 키메릭 유전자를 제공한다. 글라이포세이트, 5-에놀파이로빌쉬키민산-3-포스페이트 합성효소(EPSP 합성효소)의 관련억제자, 이미다졸리논류 및 아세토락테이즈 합성효소(ALS)와 아세토하이드록시산 합성효소(AHS)의 억제제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩타이드가 고려된다. 바람직한 실시예에서 URE중 이 부분은 SEQ ID NO:1로 표시된 HaG3-A의 1-1639 또는 851-1639이며, 그 프로모터에 역방향으로 융합된다. 뿌리 특이적 발현을 부여하는 이들 서열을 변형할 수 있다.
또한 본 발명은 일시적으로 변형되는 발현을 가능하게 하는 헬리안티닌 URE영역이 식물 내에서 기능을 발휘하는 프로모터의 최소한 일부에 연결되고, 또 추가로 이종 유전자의 지정 영역에 연결된 것으로 이루어지는 키메릭 유전자를 제공한다. 바람직한 실시예에서 URE중 이 요소는 SEQ ID NO:1로 표시되는 HaG3-A의 뉴클레오타이드 1-851 또는 1639-2303이다. 일시적으로 변형되는 유전자 발현이 가능하도록 이들 서열을 변형할 수 있다.
또한 본 발명은 ABA-반응적 발현을 부여하는 헬리안티닌 URE 요소가 식물 내에서 기능을 발휘하는 프로모터의 최소한 일부에 임의로 정방향 또는 역방향으로 연결되고, 또는 추가로 이종 유전자에 융합된 것으로 이루어지는 키메릭 유전자를 제공한다.
바람직한 실시예에서 URE중 이 요소는 SEQ ID NO:1로 표시된 HaG3-A의 851-1639 또는 1639-2303, 또는 SEQ ID NO: 3으로 표시된 HaG3-D의 1-404로 이루어진다. ABA-반응적 발현을 부여하는 이 구조체는 식물의 수분 억압에 대한 내성을 개선시키는데에 특히 중요하다.
본 발명의 키메릭 유전자는 헬리안티닌 게논 DNA의 5' 옆쪽 서열을 이종 유전자의 지정 서열에 용합시켜 제조한다. 이들 서열의 병렬 연결은 여러 방법으로 가능하다. 바람직한 실시예에서 5' -> 3'으로 볼 때 헬리안티닌 URE영역, 프로모터 영역, 지정 영역 및 폴리아델닐화 자리 순서이다.
이러한 키메릭 유전자를 만드는 표준 방법은 이 분야에서 잘 알려져 있으며 Sambrook 등 (1989)의 책에도 기재되어 있다. DNA단편을 연결하는 방법은 다양하며, 각 DNA단편 말단의 특성에 따라 달라진다. 이 분야의 통상의 전문가는 이 종 유전자를 발현시키기 위하여 프로모터와 전사체의 효율적인 폴리아데닐화 시그널의 필요함을 알 수 있을 것이다. 따라서 CAAT 및 TATA 박스로 알려진 프로모터 서열을 포함하는 5' 헬리안티닌 URE영역을 프로모터가 없는 이종 유전자의 지정 서열에 바로 연결시킬 수 있다. 선택적으로 CAAT 및 TATA박스를 포함하지 않는 헬리안티닌 URE영역은 식물 내에서 기능을 발휘하는 프로모터를 지정하는 DNA단편에 연결될 수 있다. 식물 프로모터는 상업적으로 구입살 수 있으며, 공지된 서열을 바탕으로 화학적으로 합성할 수도 있다. 이러한 서열의 한 예가 CAAT와 TATA박스를 가지도록 절단된 콜리플라우어 모자익 바이러스(CaMV) 35S 프로모터이다. 기타 대표적인 프로모터에는 노팔린 합성효소 및 라이불로즈 1,5 비스포스페이트 카르복실레이즈 프로모터가 있다. 프로모터 단편은 추가로 이종의 지정 서열에 연결될 수 있다. 지정 서열의 3' 말단을, 예를 들어 노팔린 합성효소의 폴리아데닐화 자리에 연결한다. 또 식물의 형질전환에 필요한 서열에 의해 경계지워진 폴리아데닐화 자리를 하나 이상 가지는 중단단계 식물 형질전환 벡터도 이용할 수 있다. 본 발명의 헬리안티닌 URE와 이종 유전자의 지정 서열은 키메릭 유전자를 얻기 위해 식물 형질전환 벡터의 폴리링커 자리에 서브클로닝될 수 있다.
본 발명의 5' 옆쪽 요소는 헬리안티닌 게놈 클론을 엔도뉴클레이즈 또는 엑소뉴클레이즈로 잘라 얻을 수 있다. 헬리안티닌 CAAT 및 TATA 박스를 포함하는 단편을 GUS의 지정 서열과 같이 프로모터가 없는 이종 유전자에 정방향으로 연결한다. 이 분야의 통상의 전문가는 5' 헬리안티닌 조절 서열을 다른 방법, 예를 들면 화학적 또는 효소적 합성 방법에 의해서 얻을 수 있음을 알 것이다. 이종 유전자 서열은 이러한 구조체에서 발현되는 유전자는 모두 가능하다. 본 발명에 의해 그러한 구체예가 고려되어진다. 지정 서열의 3' 말단은 예를 들면(제한적이지 않음) 노팔린 합성효소의 폴리아데닐화 자리 또는 옥토파인 T-DNA유전자의 폴리아데닐화 자리 등의 폴리아데닐화 자리에 임의로 융합된다. 선택적으로 폴리아데닐화 자리가 이종 유전자에 의해 제공될 수 있다.
TATA 박스를 포함하지 않는 5' 헬리안티닌 조절 요소는 최소한 CAAT 와 TATA 서열을 포함하는 식물 프로모터 서열에 바로 또는 역방향으로 연결될 수 있다. 바람직한 실시예에서 이 프로모터는 잘려진 콜리플라우어 모자익 바이러스(CaMV) 35S 프로모터이다. 이 결과로 얻은 키메릭 구조물을 이종 지정 서열과 폴리아데닐화 서열에 연결할 수 있다.
이종 유전자의 조절된 발현을 위해서 식물을 본 발명의 키메릭 유전자로 형질변환시킨다. 트랜스제닉 식물에서 이종 유전자를 발현시키기 위한 방법은 이 분야에서 잘 알려져 있다. 담배는 쉽게 재생(regeration)되고 식물 당 얻을 수 있는 발육 종자 수가 많으며 Agrobacterium에서 유도된 Ti 플라즈미드 벡터로 형질전환시킬 때 형질전환 빈도가 높기때문에(Klee, et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38, 467) 숙주 세포로는 담배가 많이 이용된다. 면화, 기름 종자 평지 및 완두 등을 포함하는 쌍자엽 식물이 트랜스제닉 숙주로 바람직하다. 그러나 이 분야의 통상의 전문가들은 효율적으로 형질환되고 재생되는 식물은 모두 본 발명의 트랜스제닉 숙주로 사용될 수 있다는 것을 알 것이다.
다양한 형질전환 방법이 알려져 있다. Horsch et al. (1985) Science 227, 1229에 기재된 잎 디스크 형질전환 재생 방법에 의해 키메릭 유전자를 식물에 도입시킬 수 있다. 다른 형질전환 방법들 즉, 프로토플라스트 배양 (Horsch et al., (1984) Science 223, 496; DeBlock et al. (1984) EMBO J. 2, 2134; Barton et al. (1983) Cell 32, 1033) 시험관 내에서 줄기 또는 뿌리 배양 (Zambryski et al. (1983) EMBO J. 2, 2143; Barton et al. (1983) Cell 32, 1033) 등도 이용될 수 있으며 이러한 것도 본 발명의 범위에 속한다. 바람직한 실시예에서 식물은 Agrobacterium에서 유도된 벡터로 형질전환된다. 그러나 본 발명의 키메릭 유전자를 식물에 도입하기 위해 다른 방법도 사용할 수 있다. 그러나 선택적인 방법에는 바이오리스틱 접근(Klein et al. (1987) Nature 327, 70), 일릭트로포레이션, 화학적으로 유도되는 DNA도입 및 벡터로 바이러스나 꽃가루를 이용하는 방법이 포함된다.
형질전환을 위해 필요한 경우 본 발명의 키멜릭 유전자는 식물 형질전환 벡터 즉, Bevan (1984)에 의해 공개된 이원(binary)벡터에 도입될 수 있다. 식물 형질전환 벡터는 Agrobacterium tumefaciens의 천연적인 유전자 전달 시스템을 변형시킨 것에서 유래될 수 있다. 이 천연 시스템은 형질전환되는 식물로 이동되는 T-DNA로 알려진 큰 조각을 포함하는 큰 Ti(종양 유도) 플라즈미드로 이루어진다. Ti 플라즈미드의 다른 조각인 Vir 영역은 T-DNA의 이동에 관련된다. T-DNA영역은 말단 반복부로 경계지워진다. 변형된 이원 벡터에서 종양 유도 유전자는 제거되며 Vir 영역의 기능을 T-DNA경계 서열에 의해 싸여진 외부 DNA를 이동시키는데 이용된다. T-영역도 역시 항생제 내성 마커와, 이동을 위한 삽입을 위한 다 클로닝 자리를 가진다. 이와 같이 만들어진 종은 "무장 해제된" A. tumefaciens종으로 알려져 있으며, T-영역에 의해 경계지워진 서열을 식물의 핵 게놈으로 효율적으로 형질전환되도록 돕는다.
표면을 살균한 리프 쇠스크(leaf disk)에 외부 DNA를 포함하는 "무장 해제된" A. tumefaciens를 접종시키고 2일간 배양하였다. 적절한 항생제를 함유하는 배지에서 뿌리를 내리게 한 후 형질전환된 새싹을 골라 토양으로 옮겼다. 트랜스제닉 식물을 자가수분시키고 이들의 종자를 모아 항생제를 함유하는 배지에서 길렀다.
발육하는 종자, 어린 새싹 및 성숙 식물에서의 이종 유전자 또는 리포터 유전자의 발현은 면역학적, 조직화학적 또는 활성 분석에 의해 모니터될 수 있다.
키메릭 유전자 발현을 분석하는 방법은 이종 지정 영역의 특성에 따라 선택된다. 예를 들면, 적당한 뉴클레오타이드 프로브가 있다면 전사를 평가하기 위해 노던 분석이 이용될 수 있으며, 이종 유전자가 지정하는 폴리펩타이드에 대한 항체가 있다면 그 폴리펩타이드의 생산 및 위치를 알아보기 위해 웨스턴 분석 및 면역조직화 학적 위치 분석법이 이용될 수 있다. 이종 유전자에 따라 적당한 생화학적 분석법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 아세틸 전이효소는 표준 기질의 아세틸화를 측정함으로써 검출될 수 있으며, 제초제 내성 유전자의 발현을 트랜스제닉 식물의 제초제 내성을 결정함으로써 검출될 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 키메릭 유전자를 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 그것의 자손을 제공하는 것이다. 쌍떡잎 식물과 외떡잎 식물 모두 고려된다. 우에 기재된 방법 중 하나에 의해 키메릭 유전자로 식물 세포를 형질전환시킨다. 현질전환 식물 세포를 많은 경우 캘러스 배양 또는 리프 디스크에서 이 분야에서 공지된 여러 방법 중 하나에 의해(예를 들면 Horsch et al. (1985) Science 227, (129)) 완전한 트랜스제닉 식물로 재생시킨다. 바람직한 실시예에서 트랜스제닉 식물은 면화, 기름 종자 평지, 옥수수, 담배 또는 완두이다. 형질전환된 식물의 자손은 그 키메릭 유전자를 물려받으므로, 그 트랜스제닉 식물주를 유지하는데 형질전환된 식물의 절단체 또는 종자가 사용된다.
또한 본 발명은 종자 지방의 질이 개선된 식물의 생산방법을 제공한다. 이 방법은 불포화효소와 같은 지방 대사 효소의 지정 서열과 연결된 종자 특이적 조절요소로 이루어지는 키메릭 유전자를 포함하는 벡터로 식물세포를 형질전환시키고, 원하는 특성을 가진 식물을 선택하는 것으로 이루어진다. 바람직한 실시예에서 조절요소는 SEQ ID NO:1 로 표시되는 HaG3A URE의 뉴클레오타이드 1-2401 또는 851-2401에 의해 제공된다. 형질전환된 식물세포는 종자 지방의 질이 개선된 식물로 재생된다.
본 발명의 또 다른 측면은 종자 단백질의 질이 개선된 식물의 생산 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 라이신 및/또는 메티오닌 잔기의 함량이 높은 종자 저장 단백질의 지정 서열과 연결된, 종자 특이적 조절요소로 이루어지는 키메릭 유전자를 포함하는 벡터로 식물세포를 형질전환시키고, 원하는 특성을 가진 식물을 선택하는 것으로 이루어진다. 바람직한 실시예어서 조절요소는 SEQ ID NO:1로 표시되는 HaG3A URE의 뉴클레오타이드 1-2401 또는 851-2401에 의해 제공된다. 형질전환된 식물세포는 종자 단백질의 질이 개선된 식물로 재생된다.
본 발명의 또 다른 측면은 제초제 내성 식물의 생산 방법을 제공하는 것이다. 글라이포세이트 내성 유전자와 같은 제초제 내성 유전자의 지정 서열에 연결된 뿌리 특이적 조절요소로 이루어지는 키메릭 유전자를 포함하는 벡터로 식물세포를 형질전환시키고, 제초제 내성을 가지는 식물 선택한다. 선택된 식물은 같은 조건에서 형질전환되지 않은 같은 종류의 식물을 죽이는 제초제를 처리했을 때 살아남는 식물들이다.
바람직한 실시예에서 조절요소는 SEQ ID NO:1로 표시되는 HaG3A URE의 뉴클레오타이드 1-1639 또는 851-1639에 의해 제공된다. 형질전환된 식물세포는 종자 지방의 질이 개선된 식물로 재생된다. 이종 유전자는 EPST합성요소, 아세토락테이즈 합성효소 또는 아세토하이드록시산 합성효소를 지정하는 유전자에 의해 제공된다. 바람직한 실시예어서 HaG3-A의 뉴클레오타이드 851-1639 와 aroA 제초제 내성 유전자로 이루어진 뿌리 특이적 조절 요소를 포함하는 벡터 pRPA-ML-803으로 식물을 형질전환시킨다.
다음의 실시예를 통해 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
[일반적 방법]
아래 실시예에서 언급되는 뉴클레오타이드 번호는 제1도 내지 제3도에 다른다.
GUS리포터 유전자 구조체
본 실시예에 사용되는 GUS리포터 카세트의 일반적 목적은 이미 공개되어 있다(Jefferson et al. (1987) EMBO J. 6, 3901). 간단히 언급하면, GUS 의 지정 영역을 A. tumerfaciens에서 유래된 벡터 pBIN19 의 폴리링커 자리에 있는 노팔린 합성효소의 폴리아데닐화 자리의 5'에 연결시켰다(Bevan(1984) Nucleic Acids Res. 12, 8711). pBIN19는 식물 형질전환에 필요한 T-DNA의 왼쪽 및 오른쪽 경계부분과 카나마 이신 내성 유전자를 포함한다. 제조된 구조체인 pBIN101.1을 제4에 표시하였다. GUS의 AUG개시 코돈 윗쪽에 있는 독특한 제한 효소 위치에 프로모터 DNA 단편이 삽입될 수 있다.
제4도에 표시된 바와 같이 pBI101.1의 HindIII 와 BamHI 자리에 CaMV 35S 프로모터를 넣어 pBI121.1을 만들었다. pBI120을 만들기 위해 CaMV 35S 프로모터를 -90의 EcoRV 자리에 잘라(CAAT 와 TATA 박스는 남김) pBI101.1의 폴리링커에 클로닝시켰다.
표 1은 모(patental) 플라즈미드와 유도된 구조물을 보여준다. HaG3-A-FL과 조절 구조체인 pBI121.1 과 pBI101.1은 제4도에 나타낸다. 제5도는 모 플라즈미드를 만드는데 사용한 게놈 클론인 HaG3-A와 HaG3-D의 제한 효소 단편을 나타낸다. 제6도는 전체 길이의 구조체와, 유도체인 구조물을 도식적으로 나타낸 것이다.
HaG3-A/GUS 구조체는 전체 길이(full length: FL)의 조절 영역(제1도의 -2377∼+24)에 미치는 겹치는 큰 단편을 나타낸다. 몇몇 구조물의 3' 말단은 pBluescript(Stratagene)을 액소뉴클레이즈 III으로 잘라 얻은 2.8kb Hag3-A 단편에서 유래된다. [pHag3-A-2.8 (BanHI-PstI), 표 1]. 이러한 결실(deletion)은 제4도의 윗쪽에 표시된다. 첫 번째 결실인 pHag3-A-2.4는 3' 말단 -75에 HaG3-A CAAT 와 TATA 박스를 갖는다. HaG3-A CAAT와 TATA 박스를 포함하는 단편은 프로모터가 없는 GUS 카세트 pBI101.1에 정방향으로 연결되었다. HaG3-A TATA 박스를 포함하지 않는 단편은 pBI120의 잘려진 CaMV 35S 프로모터의 윗쪽에 정방향 및 역방향으로 연결되었다. 이들 단편을 적당한 GUS 카세트에 서브클로닝시켰다. 구조물들은 각 구조물의 말단 위치 뒤에 정방향(F), 역방향(R)을 표시하여 명명되었다. 화살표는 GUS지정 영역의 관점에서 단편의 방향을 나타낸다(제4도).
HaG3-D/GUS 구조물은 404bp 단편 (Sal1-Hpal)을 양쪽 방향으로 (정상방향(N), 역방향(I))으로 포함한다. 각 구조물의 방향과 정확성을 GUS 카세트의 영역에 대한 프라이머를 이용한 (Advanced DNA Technologies Lab, Texas A & M University) 이중선 다이디옥시 서열 결정 방법 (Chen and Seeburg, 1985)에 의해 확인되었다.
[식물 형질전환]
BIN-19를 기초로 한 플라즈미드를 사용하여, 최초 형질전환체를 50㎍ 카나마이신/ml에서 선택하고 이들을 100㎍ 카나마이신/ml 에 옮기는 것을 제외하고는 Horsch 등(1985)의 표준 방법에 의해 담배(Nicotiana tabacum cv. Xanthi)를 형질전환시켰다. 식물을 자가수분시켰다. BIN019 를 기초로 한 구조체는 항생제인 카나마이신에 대한 내성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼레이즈(NPTII) 유전자를 가지므로, 형질전환체를 식별하기 위해 카나미아신 400g/ml에서 종자를 발아시켰다. 각 형질전환제에 대한, 담배 게놈에 인터그레이션된 각 GUS 구조체의 복제수는 NPTII 유전자의 분리 빈도에 으해 측정되었다. 대부분의 형질전환체가 구조물 분리 로커스를 단 1개만 가지고 있었다. 동형접합체인 자손(filial) 식물이 사용되었다. H-2 의 역구조체를 제외한 모든 실험 구조체를 나타내는 트랜스제닉 식물을 얻었다. 트랜스제닉 식물을 Conviron 챔버에서 70-80% 상대습도, 24℃, 광조건에서 16시간, 암조건에서 8시간 유지시켰다. 시험전에 건조되는 것을 방지하기 위하여 모든 식물을 엄격한 일정표에 따라 물을 주었다.
[표 1]
구조체 설명
모 플라즈미드
pBI101.1 BIN19에서 유도된, 프로모터가 없는 GUS리포더 유전자 카세트
pBI121.1 pBI101.1 내에서 GUS카세트에 CaMV 35S 프로모터를 연결하였다.
pBI120 CAAT 와 TATA 박스는 남겨둔채 EcoRV 자리에서 잘려진 CaMV 35S를 GUS 지정 영역에 연결시켰다.
pHaG3-A-2.8 pBluescript 에서의 HaG3-A의 2.8kb BamHI-PstI 단편; HaG3-A지정 영역의 윗쪽 2.4kb와 전사 출발자리의 아래쪽 0.38kb를 포함한다; 엑소뉴클레이즈III 결실물을 얻기 위해 사용된다.
pHaG3-A-2.4 3' 엑소뉴클레이즈 III로 처리하여 +24까지 잘라얻은 2.4kb HaG3-A 단편; HaG3-A CAAT 와 TATA 박스를 포함한다.
pHaG3-A-2.3 3' 엑소뉴클레이즈 III으로 -75까지 잘라 얻은 2.3kb HaG3-A 단편; HaG3-A CAAT와 TATA 박스를 포함한다.
유도체 구조물
HaG3-A-FL pBI101.1에 정방향으로 연결된 pHaG3A-2.4의 2.4kb 삽입물(insert)
HaG3-A-HS/F-HS/R pBI120의 절단된 CaMV 35S 프로모터의 관점에서 정방향 및 역방향으로 클로닝된, pHaG3A-2.3의 0.85KB BamHI-SalI 단편
HaG3-A-HS/R HaG3A-HS/F에서 잘려진 0.85kb SacI 단편. pBI120의 절단된 CaMV 35S 프로모터의 관점에서 역방향으로 클로닝됨.
HaG3-A-HB/F-HB/R pBI120의 절단된 CaMV 35S 프로모터의 관점에서 정방향 및 역방향으로 클로닝된, pHaG3A-2.3의 1.6kb BamHI-BalI 단편.
HaG3-A-S 2/F-S 2/R pBI120의 절단된 CaMV 35S 프로모터의 관점에서 정방향 및 역방향으로 클로닝된, HaG3-A의 0.6kb SalI-BalI 단편; 각각 HaG3-A-HB/F 와 HaG3-A-HB/R에서 SalI-BamHI 단편을 제거하여 만들었다.
HaG3-A-S 2/F-S 2/R pBI120의 절단된 CaMV 35S 프로모터의 관점에서 정방향 및 역방향으로 클로닝된, pHaG3A-2.3의 1.4kb BamHI-BalI 단편.
HaG3-A-B 2/F-B 2/R pBI120의 절단된 CaMV 35S 프로모터의 관점에서 정방향 및 역방향으로 클로닝된, pHaG3A-2.3의 0.66kb BalI-BalI 단편.
HaG3-A-H 2 pBI120의 절단된 CaMV 35S 프로모터의 관점에서 정방향으로 클로닝된, pHaG3-A-2.3의 2.3kb 삽입물.
HaG3-A-S 1 pBI101.1의 관점에서 정방향으로 클로닝된, pHaG3-A-2.4의 1.5kb SalI 단편.
HaG3-D-404N-404I pBI120의 절단된 CaMV 35S 프로모터의 관점에서 정방향 및 역방향으로 클로닝된, HaG3-D의 0.4kb SalI - Hpa I 단편.
[실시예 2]
[GUS 활성의 생화학적 검출 : 종자 특이적 및 뿌리 특이적 발현]
표1의 각 구조체를 가지는 트랜스제닉 담배의 배조직 및 비배조직에서 GUS 활성을결정하였다. Jefferson 등(1987)의 방법을 이용하였다.
식물 조직을 추출 완충액(50mM NaPO4, 10mM EDTA, 0.1% Sarkosy1, 0.1% Triton X-100, 10mM β-멜캡토에탄올) 내에서 갈았다. 이것을 원심분리하여 상징액을 깨끗한 튜브에 담아 100㎕씩 나누었다. 2mM 4-메틸움벨리페닐-β-D-글루쿠로나이드를 함유하는 추출 완충액을 같은 부피로 첨가하여 37℃에서 1시간 두었다. 0.2M Ma2CO30.8ml을 첨가하여 반응을 중지시켰다. Jefferson 등(1987)의 방법에 따라 Hoeffer TKO-100 소형 형광측정기로, 결과로 얻은 4-메틸움벨리페론(4-MU)의 형광을 측정하였다. GUS 활성은 4-MU picomoles/총 단백질시료의 단위질량/분으로 나타낸다.
흡수 후(days post imbiition: DPI) 18-20일에서, GUS 발현을 촉진시키는 HaG3-A의 다양한 서열(제4도에 요약)을 포함하는 트랜스제닉 묘종의 떡잎, 배축, 잎 및 뿌리에서 GUS 활성을 분석하였다. 결과를 표 2에 기재하였다. 헬리안티닌 유전자 HaG3-A와 HaG3-D URE의 부분을 포함하는 모든 구조체가 트랜스제닉 담배 종자에 GUS 활성을 부여하였다. 완전한 CaMV 35S 프로모터 복합체 (pBI121)에 의해 구동되는 GUS 발현과 비교할 때, 전체 길이의 조절 영역(FL)과 이것에 유도된 단편들 뿐 아니라 HaG3-D/GUS 구조물은 모두 성숙 종자에 상당한 GUS 활성을 부여하였다. 그러나 -75 ∼+24 범위 가까운 상부 영역을 포함하는 구조체의 경우에만 (FL, S-1와 비교) 종자 특이적으로 제한된 발현이 가능하였다. 뉴클레오타이드 -2377 ∼ +24 또는 -1527 ∼ +24를 포함하는 구조체의 경우, 트랜스제닉 묘종의 다른 조직에서는 GUS 활성이 전혀 검출되지 않는 조직특이적 GUS 발현이 증명되었다. 그러나 FL 건조물은 성숙종자에서 S-1에 비해 6배 더 발현되었다. 완전한 CaMV 35S 프로모터 복합체 (pBI121)을 포함하는 묘종 프로모터를 가지는 (pBI120) 또는 프로모터가 없는 (pBI101) 묘종 조직에서의 GUS 활성을 비교예로 분석하였다. 등일한 구조물을 포함하는 잎에서는 종자에서의 발현에 비해 거의 발현되지 않았다. FL과 S-1 이외의 대부분의 구조체는 트랜스제닉 묘종의 뿌리에서 상당한 정도로 발현되었다.
뿌리 이외의 체조직에서 완전한 CaMV 35S 프로모터 복합체에 의해 부여된 전체 활성은 다른 구조체에 의해 부여된 활성보다 높았다. 특히, HB/R (-2377 ∼ -739)와 SB/R (-1527~739)구조체를 가지는 묘종의 뿌리는 완전한 CaMV 35S 프로모터의 조절하에서 GUS를 발현시키는 뿌리보다 GUS 활성이 7-8배 높았다.
[표 2]
a : 제1도는 지제된 구조물을 포함하는 트렌스제닉 담배의 성숙 종자와 묘종조직에서 GUS 활성을 분석하였다.
b : 구조물을 제1도에 기재한다. 정방향(F), 역방향(R), 정상(N) 및 역전(I)은 절단된 35S CaMV 프로모터의 관점에서 각 헬리안티닌 단편의 방향을 나타낸다.
c : 제1도에 기재된 정방향 구조물을 포함하는 프랜스제닉 담배의 발육종자에서 8-24 DPF에서 2일 간격으로 GUS 활성을 측정하였다. I, II, III 형은 실시예 3에 정의된다.
d : ND는 이 실험에서 결정되지 않았음을 뜻한다.
e : 모든 실험을 통해 GUS분석은 각 구조물에 대한 4-10개의 독립적인 형질전환 식물에서 얻은 값의 평균이다. 표준편차를 표시하였다.
f : 성숙(30DPF) 트랜스제닉 담배 종자에서의 GUS 활성
g : 트랜스제닉 담배 묘종을 배지에서 무균적으로 배양하였다.
묘종(18-20DPF)의 조직을 모아 GUS 활성을 특정하였다.
h : 발육 종자(12-18DPF) 에서만 FL ABA 반응적이었다(명세서 및 표3 참고). 다른 것은 모두 건조된 잎의 GUS 발현 및 계속되는 증명으로부터, ABA-반응은 나타내어진 식물의 묘종이 외래 ABA에 직접 반응함을 증명한다. +는 기초수준보다 높은 GUS 활성이 유도되었음을, -는 GUS 활성이 검출가능하도록 유도되지 않았음을 나타낸다.
[실시예 3]
[GUS 활성의 생화학적 검출 : 일시적으로 조절되는 발현 ]
각 정방향 구조체에 의해 부여되는 일시적 프로파일을 결정하였으며 그 결과를 표 2에 나타내었다. 섬모 동형 배우자인 자손 식물을 성장시키고 개화시켰다. 깍지대 단계의 종자에서의 GUS 활성을 실시예 2의 방법으로 측정하였다. 발육 배에서 GUS 활성이 처음 나타나는 시간과 발현된 양상의 질적, 양적 특성을 기초로 3종류의 발육 프로파일로 나누었다; 1형 프로파일은 12DPF에서 GUS 축적이 시작되는, 올바른 일시적 조절을 나타낸다. 2형 프로파일은 12DPF 근처에서 GUS 축적이 시작되거나 14DPF 근처에서 피크를 이루고 그 이후 GUS 활성이 감소함을 보인다. 3형 프로파일은 10DPF 전에 GUS 활성이 나타나며 12DPF 정도에서 피크를 이룬다. 뉴클레오타이드 -2377 ∼ -1527 또는 -739∼ -75에 해당하는 HaG3-A URE 영역을 가지는 구조체는 이 일시적으로 더 빠른 프로파일을 부여한다.
[실시예 4]
[GUS 활성의 조조기화학적 국지화]
HaG3-A-SB/R과 HaG3-D-404N을 가지는 묘종에서 GUS 활성은 조직화학적으로 국지화되었다. 시료를 50mM NaPO4로 씻고 100㎕ 반응 완충액 [50mM NaPO4,, pH 7.0, 2mM 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-글루쿠로나이드(X-Gluc),0.1mM 포타슘 페로시아나이드]에서 37℃에서 24시간 배양하였다. 시료를 80% 글리세롤과 같이 현미경 슬라이드 위에 놓았다.
1% 설탕을 함유하는 기초 배지에서 키운 HaG3-D-404N (제7a도)와 HaG3-A-SB/R (제7b도)의 묘종은 발현 패턴이 약간 달랐다. HaG3-D-N에의한 GUS 발현을 떡잎에서는 낮았으며 배축에서는 검출되지 않았고 말단 뿌리에서는 상당히 높은 수준이었다. HaG-3A-SB/R 묘종도 GUS활성이 말단 뿌리에서 상당히 높았으며 떡잎 및 배축에서는 검출되지 않았다. 덜포화된 (sub-saturated) 여과지에서 수분 부족 상태로 키운, HaG3-D-404N을 포함하는 묘종의 경우 14DPI에서 GUS 활성이 세포화학적으로 국지화되었다; GUS활성은 이들 묘종의 잎과 뿌리에서 주로 나타났다(제7(c)도).
HaG3-A-SB/R을 포함하는 묘종의 GUS 활성 양상을 결정하였다. SB/R 묘종에서 GUS 활성의 주요 위치는 발육하는 뿌리끝이었다(제7(b)도, 제7(c)도). HaG3-A-SB/R을 포함하는 6DPI 묘종에서 GUS는 길어지는 뿌리의 길이 전반에서 발현되었으며, 특히 뿌리 끝의 분열조직 부위에서 높게 발현되었다(제7(d)도). HaG3-A-SB/R 묘종(12DPI)의 조직화학적 국지화는 주뿌리의 분열조직 부위에서 지속적인 활성을 가짐과 함께 새로 형성된 측면 뿌리에서도 활성이 있음을 보여준다(제7(b)도). 16DPI 묘종도 이러한 발현 양상을 보여주었다(제7(c)도); 뿌리털과 뿌리의 말단 부분에서 GUS활성이 높았다.
[실시예 5]
[ABA-반응적 발현]
제4도에 나타난 구조물을 포함하는 트랜스제닉 담배에 대한 식물 실험에서, HaG3-A 및 HaG3-D의 몇몇 부분들이 식물의 수분 포텐셜의 변화에 반응한다는 것을 알게 되었다(표 2). ABA 는 물 결핍반응의 공지된 매개체으므로, 이들 요소에 의한 GUS발현에 대한 ABA의 효과를 알아보았다. HaG3-A중 두 영역(-1527 ∼ -739와 -739 ∼ -75)가 묘종과 성숙 트랜스제닉 담배의 잎에서의 ABA-반응적 발현을 부여하였다. 그밖에 HaG3-D의 -739 ∼-322 영역도 ABA-반응적 요소로 밝혀졌다.
HaG3-D-404N(정방향)을 포함하는 트랜스제닉 담배에서의 GUS활성유도는 진행적인 탈수 및 수분 결핍으로부터의 연속적 회복 동안의 수분 포텐셜가 관계가 있다. 전체 길이 HaG3-A URE는 종자 발육 기간외에는 어떠한 조건에서도 발현되지 않기 때문에 이 키메릭 GUS구조물을 포함하는 식물을 음성 대조구로 사용하였다. 각 구조물을 포함하는 동형배우자 자손 식물을 토양에서 길렀다. 각 식물에 정상적인 양의 1/3까지 물을 주면서 다양한 정도로 억압하였다. 약 36시간 경에 GUS활성 피크를 나타내는, HaG3-D-404N을 포함하는 완전히 억압된 식물이 유도되었다(제8도). 계속해서 24시간 후에 GUS 활성을 측정했을 때, 그 식물이 수분 포텐셜 4bars 정도의 열악한 수분 결핍 조건에 있는 경우에도 GUS 활성이 재생가능하게 감소하였음을 알 수 있었다. 완전히 억압된 식물에 3일째 샘플링이 끝난 후 수분을 공급하여 회복시켰다. 수분공급 후 수분 포텐셜이 비-억압 수분으로 돌아옴에 따라 식물은 빠르게 회복되었으며 남은 기간동안 GUS활성은 계속 감소하였다. HaG3-D-N을 포함하는 1/3억압된 식물에서의 GUS활성은 수분 포텐셜이 감소함에 따라 3.일 간격동안 더욱 온화하게 상승하였다(제8도). 완전히 억압된 식물에서와 마찬가지로 물 결핍이 회복되기 전에 GUS활성이 감소하였다. 어떠한 경우에도 FL 식물은 비배 조직에서 GUS를 발현되지 않았다.
HaG3-D의 404 bp 단편이 ABA에 직접 반응하는지 알아보기 위하여, HaG3-D-404N을 포함하는 트랜스제닉 담배의 리프 디스크를 처리 시간을 늘이면서 ABA로 처리하고, GUS 발현을 분석하였다. 약 3.5시간의 유도기 후에 10mM ABA로 처리한 결과 GUS발현이 빠르게 증가하였다. 8시간 동안 GUS는 계속 축적되었고, 8시간 째에는 축적속도가 상당히 감소하였다(제9도). ABA처리는 하지 않고 같은 조건에서 유지시킨 같은 식물의 리프 티스크에서는 GUS 활성이 검출되지 않았다. HaG3-A전체 길이(full length: FL) URE를 포함하는 식물의 리프 디스크에서도 실험 과정동안 GUS리포터 유전자를 가지는 키메릭 유전자가 잎에서 전사 수준에서 활성이 있으므로(표 1), pBI121을 가지는 식물의 리프 디스크는 실험을 통해 외래 ABA에 반응하여 GUS활성이 증가하지 않았다(+ABA: 12.6±3.3pmole 4-MU/㎍/분 ; -ABA: 13.5±3.6pmole 4-MU/㎍/분).
HaG3-D-404N과 HaG3-A-FL을 포함하는 트랜스제닉 담배 묘종에 대해 비슷한 일련을 실험을 수행하였다. 18DPI 묘종을 0-10mM ABA를 함유하는 배지에 옮기고 1,2,3일 후에 GUS 활성을 측정하였다(표 3). 모든 ABA 농도에서 ABA에 의해 1일째에 HaG3-D-404N를 포함하는 묘종이 유도되었다; 병행된 실험에서 HaG3-A-FL의 경우 별로 유도되지 않았다. 유도는 시간과 농도에 의존하였다. ABA농도 10mM에서 2-3일 째에 200배가 넘는 최고 유도가 관찰되었다(표 3). ABA농도 0.1mM, 1.0mM에서 각각 19배, 70배 유도되었다.
발육중인 종자에서 전체길이(FL) 헬리안티닌 HaG3-A URE (-2377 ∼+24)가 ABA에 의해 유도되는지 알아보았다. GUS를 발현시키는 전체 길이 조절 영역(제4도)를 가지는 종자에 대해, 11, 14, 18, 24 DPF(days post flowering)에서 ABA에 대한 반응성을 알아보았다.
ABA에 의한 유도는 기초 배지에서 얻어진 GUS활성 수준보다 높은 GUS활성에 의해 표시되었으며 그 결과를 표 3에 기재하였다. ABA에 대한 반응 정도는 발육 단계에 따라 달랐다. 11DPF 인 종자는 실험 과정 중 ABA에 반응하지 않았으나 더 성숙된 종자는 반응하였다. 14DPF인 종자는 약 1.5시간만에 기초 수준보다 높게 유도되기 시작하였다. 14DPF 종자의 경우 ABA로 처리했을 때 GUS활성이 한결 같이 증가하였다. 처리 3일 후까지 GUS활성이, 18 및 24 DPF종자를 ABA를 처리하거나 처리하지 않은 경우의 GUS활성보다 높았다. 18DPF 종자는 14DPF 종자(+ABA)보다 ABA에 늦게 반응하였다. 24DPF 종자는 ABA로 처리한 5일 동안 ABA에 덜 반응적이다. 기초 배지에서 배양한 종자에서도 GUS활성 수준이 달랐다. 기초 배지에서 배양했을 때 14DPF 종자는 약 4pmole 4-MU/종자/일 정도로 GUS 활성이 증가하였다.
이러한 결과는 HaG3 UREs 에 포함된 ABA-반응 요소가 적절한 발육 프로그램의 단계에서 즉 종자 발육 단계에서 기능을 발휘하기 위하여 헬리안티닌 유전자의 발현이 단계적으로 조절된다는 것을 증명한다. HaG3-A또는 HaG3-D의 UREs에서 ABA-반응적 요소는 제거하면 단계적 조절이 상실되어 이들 요소들이 ABA에 직접 반응하지 않거나 트랜스제닉 담배의 잎과 묘종에서 탈수에 간접적으로 반응하지 않는다.
[표 3]
a 트랜스제닉 담배 종자를 표시된 DPF(days post flowering)일 때 수집하여 기초 배지 또는 1μM ABA를 함유하는 기초배지에서 배양하였다. 처리 후 0, 3, 5일 째에 GUS 활성을 알아보았다. 발육 중인 세포(정상)에서의, HaG3-A-FL에 의한 생체내 GUS발현을 참고로 표시한다.
[실시예 6]
[제초제 내성을 담배로 도입함]
모 플라즈미드 pHaG3-A-2.3(표1)에서 얻은 0.66kb BalI-SalI 단편을 5'말단은 Hind III 부위에 3'말단은 EcoRI 부위에 연결시켰다. pRPA-BL -410(1991. 3. 5에 출원된 프랑스 특허출원 91 02872에 기재되어 있음)을 Hind III와 EcoRI으로 자른 후 이중 CaMV 프로모터 영역 대신 위 카세트를 서브클로닝시켰다. 결과로 얻은 구조체를 pRPA-ML-803으로 명명하였으며 이것의 전사 플레임은 헬리안티닌 조절요소, 적정화된 운반 펩타이드(optimized transit peptide; OTP), aroA 유전자, nos 테미네이터로 이루어진다.
삼중모체(triparental) 교배에 의해 pRPA-ML-803을 Agrobacterium tumefaciens EHA 101 (Hood et al. (1986). J. Bacteriol, 168 1291)에 넣고, 얻어진 Agrobacterium을 담배의 리프 디스크 형질전환에 사용하였다.
온실에서, 재생된 약 20㎝의 담배에 ROUNDUP으로 제제화된 글라이포세이트를 0.6kg 활성성분/헥타르의 양으로 뿌렸다. 이와 같은 양으로 글라이포세이트를 뿌렸을 때 형질전환되지 않은 대조구 식물은 죽었으나 형질변환된 식물은 건강하게 살았으므로 글라이포세이트에대한 내성이 향상되었음을 보여주었다.

Claims (14)

  1. a) SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 2304-2401의 핵산을 갖는 종자 특이적 유전자 발현을 지시하는 조절요소, b) SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 851-1639, 또는 1-1639의 핵산을 갖는 뿌리 특이적 유전자 발현을 지시하는 조절요소, c) SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 1-2401, 851-1639, 또는 1639-2303의 핵산을 갖는 앱스시신산(ABA)-반응적 유전자 발현을 지시하는 조절요소로 구성되는 군에서 선택되는 하나이상의 조절요소로 이루어지는, 헬리안티닌 유전자로부터 분리된 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 뿌리 특이적 유전자 발현을 지시하는 조절 요소가 그것의 조절하에 있는 유전자를 뿌리에서 검출가능하도록 발현시키는 것이 특징인 핵산.
  3. 제1항에 있어서, 상기 ABA-반응적 유전자 발현을 지시하는 조절 요소가 그것의 조절하에 있는 유전자를 ABA처리 또는 ABA생합성을 유도하는 조건에 반응하여 종자에서 검출 가능하도록 발현시키는 것이 특징인 핵산.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절 요소가 이종 유전자의 지정 서열(coding seguence) 생성물의 발현에 영향을 주고 키메릭 식물 유전자를 제공하기 위하여 상기 이종 유전자의 지정 서열에 작동가능 하도록 결합된 핵산.
  5. 이종 유전자 지정 서열의 종자 특이적 발현을 지시하는, 헬리안티닌 유전자로부터 얻은 조절요소인 뉴클레오타이드 SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 2304-2401로 이루어지는 5'옆쪽 영역과, 이것에 작동 가능하도록 연결된 상기 이종 유전자의 지정 서열과, 상기 지정 서열에 작동가능하도록 연결된 3' 폴리아데닐화 자리로 이루어지는 키메릭 식물 유전자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조절요소의 3'와 상기 지정 서열의 5'에 작동가능하도록 연결된 프로모터를 추가로 가지는 키메릭 식물 유전자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 프로모터가 식물 바이러스 프로모터 또는 콜리플라우어 모자이크 바이러스(CaMV) 프로모터인 키메릭 식물 유전자.
  8. 제5항, 제6항 및 제7항중 어느 한항에 따른 키메릭 식물 유전자로 이루어지는 식물 형질전환 벡터.
  9. 제5항에 따른 키메릭 식물 유전자로 이루어지는 식물세포.
  10. 제1항에 따른 조절요소로 이루어지는 5'옆쪽 영역과, 이것에 작동 가능하도록 연결된 상기 이종 유전자의 지정 서열과, 상기 지정 서열에 작동 가능하다록 연결된 3' 폴리아데닐화 자리로 이루어지는 키메릭 식물 유전자를 포함하는 식물세포로부터 재생되고, 접지 또는 조직 배양에 의해서 무성번식되는 면화, 담배, 기름 종자 평지 옥수수 또는 완두의 변조 식물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 식물이 면화, 담배, 기름 종자 평지, 옥수수 또는 완두인 식물세포.
  12. a) 제8항의 형질전환 벡터로 식물세포를 형질전환시키고; b) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재생시키는 것으로 이루어지는 제초제 내성을 가지는 식물의 생산방법.
  13. 제4항에 따른 핵산으로 이루어지는 식물 형질전환 벡터.
  14. a) 제13항의 형질전환 벡터로 식물세포를 형질전환시키고; b) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재생시키는 것으로 이루어지는 제초제 내성을 가지는 식물의 생산방법.
KR1019930703055A 1991-04-08 1992-04-07 헬리안티닌의 상부 조절요소를 기초로 한 키메릭 식물 유전자 KR100228918B1 (ko)

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