JPH06509939A - ヘリアンチニンの上流側調節要素に基づくキメラ植物遺伝子 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ヘリアンチニンの上流調節要素に基づくキメラ植物遺伝子へりアンチニン（ｈｅ ｌｉａｎｔｈｉｎｉｎ）は、ヒマワリ胚のＩＩｓ種子貯蔵タンパクである。本発 明は、ヘリアチニン遺伝子の５′調節領域に関する。さらに詳しくは、本発明は 、組織特異的な、時間的に調節された、あるいはアプシジン酸応答性の遺伝子発 現を制御する、この調節領域の特別なシス−調節要素に関する０本発明は、これ らの遺伝子の発現を調整するために、異型の遺伝子からのコード化配列に結合し たシス−調節要素からなるキメラ遺伝子を提供する。この発明で提供されるキメ ラ遺伝子は、トランスジェニック植物（遺伝子導入植物）に対して、耐除草剤性 及び改良された種子脂質の品質を改善するのに有用である。

高度な植物に特有な種子の発達は、発芽に際して、種子中で発達する若芽が生き 残る生理学的適応過程のみならず、胚の発達をも含んでいる。授精の後、胚と胚 乳の急速な成長と分化があり、その後、種子発達の成熟段階の間、栄養分留保が 蓄えられる。これらの留保は、発達若芽によって後に使用されるように、発展的 拘留の期間中にわたって蓄えられる。この拘留期間は、種子発達の乾燥段階に先 立って起こる。

貯蔵タンパク、レクチン、及びトリプシン阻害剤を含むいくつかの頚の種子タン パクが、胚形成の間に蓄えられる１種子貯蔵タンパクの主な機能は、胚形成中に 蓄えることと、発達若芽の発芽のための炭素及び窒素留保を貯蔵することである 。これらのタンパクは、それらをコード化する多くの遺伝子と同様に、広く研究 されている（総説として、Ｓｈｏｔｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｅ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｇｔｒ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ。

１５、＾ｅａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ、　２９７（１９ｇ９）を参照） 。

種子貯蔵タンパクをコード化する遺伝子は、高度に調節され、種子発達の間に分 化されて発現される。発現は、胚形成の成熟段階の間急速に貯蔵されるｍＲＮＡ で時間的にＩＩＩＷＢされる。この発現はまた、主として発達種子の子葉または 胚乳で起こる組織特異的なものである。その結果得られた貯蔵タンパクは、処理 され、胚の乾燥及び休眠の間その貯蔵タンパクが残るタンパク体に向かう０発芽 に際して、若芽はこれらの貯蔵タンパクを炭素及び窒素の供給源として使用する 。（Ｈｉｇｇｉｎｓ、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ　５ｉｏ１．、３５ ．１９１４１９８４））。

貯蔵タンパク、レクチン、トリプシン阻害剤を含む種子タンパクは、発達中に拡 大されたり構造的に変化したりしない非相同性のマルチ遺伝子ファミリー（＋＊ ｕｌｔｉｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ）によってフード化される（Ｊｌ！説として、 Ｇｏｌｄｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌＬ５６、１４９（１９８９１を参 照）、これらの遺伝子は、時間的に及び空間的に調節されているが、結合してい る必要はない。ポスト転写機構が、これらのタンパクのうちのいくつかの貯蔵を 制御するために働くけれども、調節は主として転写レベルで起こる。従って、種 子タンパク遺伝子は、遺伝的調節要素、特に組織特異性、時間的な調節性、環境 または化学的な合図に対する応答性を与えるような要素を提供する優れた体系を 供給する。

種子タンパクの時間的及び空間的な調節の観察は、種子タンパク遺伝子が、トラ ンスジェニック要素として知られている通常の細胞要素に部分的に調節されてい ることを示唆している。しかし、個々の種子タンパク遺伝子の発現型には、定量 的、定性的な相違が存在するので、種子タンパクのこれらの組の間には、分化し た発現型のための手段を提供する、さらに特異的な要素が存在しているに違いな い０分化した発現型は、ナタネ主要種子貯蔵タンパクの、クルジフェリン（ｃｒ ｕｃｉｆｅｒｉｎｌと、ナビン（ｎａｐｉｎ　）の間に、（Ｃｒｏｕｃｈ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｐｌａｎｔａ、　１５３．６４（１９８１１゜Ｆｉｎｋａｌｓｔｅ ｉｎ　ａｔ　ａｌ、、　ＰｌａｎｔＰｈｓｌＯｌ、、　７８．６３０（１９８５ ））　、あるいは、ダイズクニツットリブシン阻害剤遺伝子ファミリーの個々の 成員の間に（Ｊｏｆｕｋｕ　ａｔ　ａｌ、。

Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、　、Ｌ＋　１０７９（＋９８９１）観察される。ダイズ 主要種子貯蔵’）＞）＜’）１１伝子の比較は、β−コングリシニン（７Ｓ）と グリシニン（ＩＩＳ）の発現の、タイミング及び細胞型特異性における相違を明 らかにした。７ＳサブユニットｍＲＮＡは、ＩＬＳｍＲＮＡより数日早く現れた 。さらに、グリシニン遺伝子ファミリーの成員は、すべて同時に活性化される（ Ｎｉｅｌｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、　Ｌ、　３１３（１ ９８９））のに対し、β−コングリシニンの成員は、分化して調節された（　Ｂ ａｒｋｅｒｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、 　８５．４５８（１９８ｇ）、　Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｄｅｖ、fｅｎｅ ｔ、。

１０、１１２＋１９８９１）　、これら各々の遺伝子は、異なったシスー謂節要 素の配列を含んでおり、それは、これらの遺伝子ファミリー間及び内に分化した 発現型を与える。

ヘリアンチコンは、ヒマワリの主要な１１Ｓグロブリン種子貯蔵タンパクである （ヘリアンサスアンヌース（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ａｎｎｕｕｓ））。へりア ンチコン発現は、他の種子貯蔵タンパクと同様に、組織特異的であり、発育制御 の下にある。しかし、そのような特異性を与えるヘリアンチン調節要素は、これ まで決して同定されなかった。へりアンチコンは、花成後の日数（ＤＰＦ）７の 胚の中に検出され、１２−１５ＤＰＦに番よｍＲＮＡは量大レベルに達した。そ の後、へりアンチコン転写のレベルは衰退しはじめる。成熟した種子中または発 芽している若芽中では、へりアンチコン転写は存在しない、ヘリアンチニンボリ ペプチド貯蔵は７ＤＰＦから１９ＤＰＦにかけて早いが、種子が後期の成熟段階 に達すると遅い（＾ｌｌｅ口ａｔ　ａｌ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 、　５．１６５（１９８５））　。

へりアンチコンは、はとんどの種子タンパクと同様に、小さな遺伝子ファミリー にコード化される。少なくとも２つの異なったサブファミリーが知られており、 それらは、Ｈｅ２及びＨａｌｏと称されている。Ｈｅ２サブフアミリーの非アレ リックな成員である２つのクローン、ＨａＧ３−Ａ及びＨａｇ３−Ｄが、単離さ れ、部分的に同定されている（Ｙｏｎｄｅｒ　Ｈａａｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅ ｎｅ、　７４．４３３（１９８８））　。

しかし、これらのあるいは他のへりアンチコン遺伝子の調節要素の詳細な分析は 、今まで知られていない。

本発明によって、へりアンチコン遺伝子からの調節要素が、種子特異的遺伝子発 現、接待異的遺伝子発現、アブシジン酸応答性遺伝子発現、及び／又は時期を変 化する遺伝子発現を制御できることが見いだされた。これらの調節要素は、トラ ンスジェニック植物において、特別な遺伝子生成物の制御された発現を可能にす る。本発明は、トランスジェニック植物における遺伝子発現の、より優れた制御 を提供し、それは、改良された種子性能、干ばつのような環境に対する改良され た耐性、及び耐除草剤性遺伝子のより良い制御を可能にする。

本発明は、へりアンチコンの５ｌ調節領域を指向している。ここで、この領域は 上流側調節総体（ＵＲＥ）とし、それは異種タンパクの発現の制御に有用である 。ＵＲＥは、トランスジェニック植物で発現される異種遺伝子のコード化領域に 結合されたとき、明らかに調節された発現型を与える多重調節要素からなる。

特に、本発明は、種子特異的遺伝子発現、接待異的遺伝子発現、アブシジン酸（ ＡＢＡ）応答性遺伝子発現、及び／又は時間的に変化する遺伝子発現を制御する へりアンチコン調節要素を含む、単離されたＤＮＡを提供する。

本発明の他の態様は、これらの調節要素を含むキメラ植物遺伝子を指向する。

その調節要素は、その調節要素が、異種遺伝子によってコード化された生成物の 発現制御を可能にするように、異種遺伝子のコード配列に結合している。必要な らば、付加的なプロモーター要素またはこれらの要素の一部は、キメラ遺伝子構 造に含まれている６Ｍ物細胞がそれらのベクターによって遺伝子変換されるよう な、本発明のキメラ遺伝子からなる植物形質転換ベクター、及びそのキメラ遺伝 子を含んでいる植物とその後代もまた提供される。

さらに、本発明の他の態様において、改良された種子脂質性能を有する植物の製 造方法を提供する。キメラ遺伝子は本発明に従って構成され、種子特異的発現を 制御する調節要素が、脂質代謝酵素をコード化する遺伝子のコード化領域に結合 している。　［＃［胞が、このキメラ遺伝子で形質転換されたとき、改良された 種子脂質品質を有する植物が再生できる。

本発明のさらなる態様は、耐除草剤性植物の製造方法を提供する。本発明によれ ば、例えば、キメラ遺伝子が、接待異的な調節要素が耐除草剤性遺伝子の発現を 制御するように構成される。植物細胞は、このキメラ遺伝子で形質転換され、耐 除草剤性の植物が再生される。

図１は、へりアンチコン遺伝子ＨａＧ３−ＡのＵＲＥのヌクレオチド配列を示す ・図１のヌクレオチド番号−２３７７から＋２４は、配列番号１　（ＳＥＱ　１ ０　Ｎｏ・１）のヌクレオチド番号１かも２４０１に相当する。

図２は、へりアンチコン遺伝子ＨａＧ３−ＤのＵＲＥ部分のヌクレオチド配列を 示す。図２のヌクレオチド番号−２４５７から−７２６は配列番号２　（ＳＥＱ 　ＩＤＮ０：２）のヌクレオチド番号１かも１７３２に相当する。

図３は、へりアンチコン遺伝子ＨａＧ３−ＤのＵＲＥ部分のヌクレオチド配列を 示す０図３のヌクレオチド番号−７２５から−３２２は配列番号３　（ＳＥＱ　 ＩＤＮ０：３）のヌクレオチド番号１かも４０４に相当する。へりアンチコンＨ ａＧ３−Ｄにおいて、図３のヌクレオチド配列は、図２の配列のすぐ下流側（３ ″）である。

図４は、Ｈａｇ３−Ａ　ＦＬ／ＧＵＳ構造と、対照構造ｐＢ１１２１．１及びｐ Ｂｌｌｏｌ、１を示す。

図５は、ヘリアンチコンゲノムクローンＨａＧ３−ＡとＨａＧ３−Ｄの制限地図 及び親プラスミドの構成に用いられる制限フラグメントを示す。

図６は、全長構造に関連したＨａＧ３−ＡとＨａＧ３−Ｄの誘導構造を示す。

図７は、Ｉ（ａＧ３−Ｄ−ＮとＨａＧ３−Ａ−９Ｂ／Ｒ構造を含むトランスジェ ニック若芽におけるＧＵＳ活性の組織化学的局在化を示す、Ａ：ＨａＧ３−Ｄ− ４０４Ｎ、吸収後の日数（ＤＰＩ）８；　Ｂ：ＨａＧ３−Ａ−３Ｂ／Ｒ１８ＤＰ Ｉ；　Ｃ：ＨａＧ３−Ｄ−４０４Ｎ、１４ＤＰＩ；　Ｄ：ＨａＧ３−Ａ−３Ｂ／ Ｒ，１４ＤＰＩ；　Ｅ：ＨａＧ３−Ａ−８Ｂ／Ｒ，８ＤＰＩ；　Ｆ：ＨａＧ３− Ａ−３Ｂ／Ｒ１６ＤＰＩ。

１！１８は、ＨａＧ３−Ｄ−４０４Ｎを含むトランスジェニックタバコ葉におけ る、乾燥進行中及びそれに引き続く水分欠乏からの回復中での、ＧＵＳ活性誘発 のグラフ的表現である。

図９は、ＨａＧ３−Ｄ−４０４Ｎを含むタバコ葉における、ＧＵＳ活性のＡＢＡ 誘発を示すグラフである。

本発明は、ヒマワリのへりアンチコン遺伝子の上流側調節総体（ＵＲＥ）のシス −調節要素からなる。これらのシス−調節要素は、それらの制御下にある遺伝子 に対して調節された発現を与えるＵＲＥの不連続な領域である。特に、この発明 は、以下の種子特異的遺伝子発現、接待異的遺伝子発現、ＡＢＡ応答性遺伝子発 現あるいは時期変化遺伝子発現のうちの少なくともひとつを制御するへりアンチ コン遺伝子からの少なくともひとつの調節要素を含む単離された核酸を提供する 。すべてのへりアンチコン遺伝子は、異なるへりアンチコン遺伝子サブファミリ ーを表すＨｅ２とＨａｌｏを含む調節要素を提供することができる。好ましい具 体例では、へりアンチコン遺伝子は、Ｈｅ２サブフアミリーのＨａＧ３−ＡとＨ ａｇ３−Ｄである。

本題の調節要素の一つが種子に特異的な発現を規定する０種子に特異的な調節要 素は、その調節下に遺伝子、すなわち、種子中に検出されるべく生産された遺伝 子に対して、その発現を種子中に起こさせる能力がある特定のヌクレオチド配列 を表している０種子に特異的な発現は、例えば、子葉および胚の萌芽軸、また胚 乳などに現れるが、これに限られるものではなく、種子の如何なる部分に現れて いてもよい、この遺伝子発現は、種子に特異的な調節下にある遺伝子にとって、 生育した植物の実生または植物体組織中には全く検出されないものである。

種子に特異的発現を規定する調節要素を同定するには、へりアンチコン遺伝子の 全ＵＲＥの削除分析を行うことができる。削除試験において、ヌクレオチドは全 ＵＲＥかも順次除去され、得られた断片がリポータ遺伝子または他の異型遺伝子 のコード化配列に結ばれる。この構成は、次いで、種子組織中に生じ他の組織に は生じないリポータ遺伝子生産物の存在を検圧することによって、種子特異的発 現を規定するそれらの能力が分析される。すでに同定された種子に特異的な要素 はまた、例えば部位が規定された変異誘発によって変型することができる。この 変型された調節要素は、次に種子特異的発現の規定能力が測定され、これによっ て種子特異性をもたらす別の配列が同定される。これらの調節要素を同定する技 術は、すべてのへりアンチコン遺伝子に適用可能である１例えば、好ましい実施 例において、へりアンチコンＨａＧ３−Ａ遺伝子のＵＲＥの分析は、種子に特異 的な調節要素が配列番号１のヌクレオチド８５１〜２４０１によって、またヌク レオチド１〜２４０１によって与えられていることを示している。

本発明によって与えられる他の調節要素は、椙に特異的な発現を与えるものであ る。接待異的発現は特に興味深くかつ重要なものである。普通、ヒマワリのへり アンチコン遺伝子は、種子においてのみ発現される０本発明に従って全ＵＲＥか ら単離されたへりアンチコンＵＲＥの特定の領域は、植物根に全面的に分布され る。根に特異的な調節要素は、その調節下に植物根中に生じ他の組繊には生じな い遺伝子の発現をもたらす能力がある特定のヌクレオチド配列を示している。

接待異的発現を規定する調節要素は、ヘリアンテコンＵＲＥの断片について、上 記の種子に特異的な調節要素の同定で述べたと同様にして、たたし発現が根組織 に検出されるものとして、接待異的発現を与える能力を分析することで同定され る。接待異的発現を許容するヌクレオチド配列の変型も、上記と同様に同定され る。任意のへりアンチコン遺伝子からの根に特異的な調節要素が同様の技術によ り同定できる１例えば、好ましい実施例において、へりアンチコンＨａＧ３−Ａ 遺伝子のＵＲＥの分析は配列番号１のヌクレオチド１〜１６３９およびヌクレオ チド８５１〜１６３９が根に特異的な調節要素であることを示している。

へりアンチコン発現は、１２ＤＰＦにおいて最初に検圧されるｍＲＮＡによって 、精密な経時的制御下にある。従って、約４ＤＰＦ程度の早期に検出し得る時期 変化遺伝子発現を与えるンスー調節要素が存在することが見いだされた。

時期変化遺伝子発現を与える調節要素を同定するには、へりアンチコン遺伝子の 全ＵＲＥの削除分析を行うことができる。ＵＲＥの断片は、異種の遺伝子のコー ド化配列に連結しており、そこで、得られたキメラ構成は植物の形質転換に用い られる。形質転換された植物からの種子は開花日数にずれを生じ、これを起こし た種子は、分析すると異種の遺伝子の発現が検出される。約１０ＤＰＦ前の異種 の遺伝子の発現を規定する要素は、時期変化の発現を与える要素として同定され る。望ましい発現型を与えるこれら要素のヌクレオチド配列の変型は、上記のよ うにして同定することができる０時期変化遺伝子発現を与える調節要素を同定す るこれらの技術は、全てのへりアンチコン遺伝子に適用可能である。好ましい実 施例においては、へりアンチコン遺伝子ＨａＧ３−ＡのＵＲＥの分析は、時期変 化遺伝子発現を与える要素が配列番号１のヌクレオチド１〜８５１および１６３ ９〜２３０３によって与えられることを示している。

本発明のもう一つの態様は、アプシジン酸（ＡＢＡ）応答性の遺伝子発現を与え るへりアンチコンのＵＲＥの領域に向けられている。ＡＢＡ応答性要素は、その 制御下に、遺伝子がＡＢＡに応答して発現されるようにしむける能力がある特別 のヌクレオチド配列を表している。ＡＢＡ応答性要素の調節下に、遺伝子の発現 は、ＡＢＡで処理することによって、またはＡＢＡ生合成の開始をもたらすもの として知られている外部刺激によって、誘発することができる０例えば、ＡＢ人 生合成は、水欠乏、水ストレスおよび塩ストレスを含む環境ストレスによっても たらされる膨満の低下の結果として開始される（ツエーファールトはか、（１９ ８９）　Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ　５ｉｏ１．３９，４３９参照） 、ＡＢＡのレベルはまた、損傷に応答しても増加する（ベニャーコルテスはか、 （１９１１９）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８６．９８ ５１）。ＡＢＡ応答性要素は、上記した他の調節要素の同定と同様にして同定さ れる０例えば、削除分析を用いることによって、ＡＢＡに応答してその制御下に 遺伝子の発現を誘発する任意のへりアンチコン遺伝子のヌクレオチド配列を同定 することができる。この配列は上記のように変型することができ、次いで分析し て、ＡＢＡ応答性発現をもたらす別の配列を同定することができる。好ましい一 実施例において、へりアンチコンＨａＧ３−Ａ遺伝子のＵＲＥの分析は、配列番 号１のヌクレオチド１〜２４０１が、種子にＡＢＡ応答性発現を与える要素を与 えていることを示している。別の好ましい実施例においては、配列番号１のヌク レオチド８５１〜１６３９または１６３９〜２３０３が、成長した植物の葉にお けるＡＢＡ応答性発現を与える要素を与えている。また別の好ましい実施例にお いて、へりアンチコンＨａＧ３”Ｄ遺伝子のＵＲＥの分析は、配列番号３のヌク レオチド１〜４０４が、植物の非晴芽組織におけるＡＢＡ応答性発現を与えてい ることを示している。

従って、ＡＢＡ応答性要素は、特定の環境的なきっかけがＡＢＡ生合成を開始し 得ることと、ざらにＡＢＡ応答性要素の制御下に遺伝子の発現を誘発するという 点で用途がある。へりアンチコンＵＲＥのＡＢＡ応答性要素によって駆動された 異種の遺伝子の発現は、種子に限定されるものではなく、成長植物の葉や実生の 組織内にも見いだされる。

へりアンチコン遺伝子の上流側調節要素の組合せを符号化する単離された核酸は 、以下のようにして与えることができる。へりアンチコン組替えゲノムのクロー ンが、へりアンチコンｍＲＮＡを表すｃＤＮＡ組替えによってヒマワリゲノムの ＤＮＡライブラリを選別することによって単離される（フオンデル　ハル、（１ ９８８）　Ｇ５ｎ５．？４，４３３１゜ヘリアンチコンゲノム組替えＤＮＡを得 るに有用と考えられる方法は、例えば、サンプルツクほか、１９８９．モレキュ ラークローニング：実験室指針（コールドスプリングハーバ−社、ニューヨーク ）、または組替えＤＮＡ技術に関する広範に入手し得る無数の実験室指導書に記 載されている。ヌクレオチド配列を測定するには、多数の技術が使用可能であり これらは当業者によく知られている。例えば、へりアンチコンＵＲＥを含む制約 断片は、ｐブルースクリプト（ストラタゲン）のような配列化ベクターの多連結 部位にサブクローン化することができる。これらｐブルースクリプトサブクロー ンは次にダブル−ストランドジデオキシ法（チェノおよびシーバーブ、　ｆ＋９ ８５１　ＤＮＡ、４，１６５）によって配列することができる。

へりアンチコン遺伝子クローンＨａＧ３ＡのＵＲＥを符号化するＤＮＡのための ヌクレオチド配列を図１に示し、配列番号１として表す。同様に、ヘリアンチコ ンクローンＨａＧ３ＤのＵＲＥの領域を符号化するＤＮＡのためのヌクレオチド 配列を図２に示し、配列番号２のヌクレオチド配列として表す、他のへりアンチ コン遺伝子のＵＲＥも同様の手法により得ることができる。また別に、へりアン チコン遺伝子ファミリーの他の成員を表すクローンは、このＨａＧ３ＡまたはＨ ａＧ３Ｄ符号または本発明のＵＲＥ配列を用いることによって、ヘリアンチコン ゲノムのライブラリーを選別しまた追加のへりアンチコン遺伝子を同定するため の交配プローブとして得ることができる。

時期、組織特異的かつＡＢＡ応答性の制御を指示するシス−制御配列の同定は、 異種の遺伝子の符号化配列で特定の配列の転写融合を行い、このキメラ遺伝子を 適当な宿主に移入し、次いでその異種の遺伝子の発現を検出することによって行 うことができる０発現を検出するに用いる分析法は、異型配列の性質に依存する 。

例えば、リポータ遺伝子なら、キメラ構成の転写および翻訳能力を評価するため に、通常、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼおよびβ−グルク ロニダーゼ（ＧＵＳ）を用いるなどである。遺伝子尋人生体におけるリポータ酵 素を鋭敏に検出するための標準的な分析法が提供されている。β−グルクロニダ ーゼ（ＧＵＳ）は、遺伝子導入したタバコ植物中のプロモータ活性のリポータと して有用である。それは、この酵素がタバコ細胞中で高度に安定であり、高等植 物においては固有のβ−グルクロニダーゼ活性が欠如しており、また定性的蛍光 分析法と組織化学的定位技術が適用可能だからである。ジェファーソンはか［＋ １９８７）　ＥＮＢＯＪ、６．３９０１］は、種物組織体中のＧＵＳ活性を生化 学的および組織化学的に検出する標準的方法を発表している。生化学的分析は、 種物組織溶解質を４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、ＧＵＳ 用の蛍光分析基質と混合し、３７℃で１時間培養し、次いで、得られた４−メチ ルウンベリフェロンの蛍光を測定することによって行われる。ＧＵＳ活性のため の組織化学的定位は、種物組繊試料を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル −グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｅ）中、３７℃で１８時間培養し、Ｘ−Ｇｌｕｅの 染色パターンを観察することにより測定される。上記のキメラ遺伝子の構成は、 発現の制御に要求される特有制御配列の定義を可能にし、またこの配列が分析の 条件下に異型遺伝子の発現を規定し得るものであることを示している。

本発明のもう一つの観点は、種子特異的遺伝子発現、接待異的遺伝子発現、ＡＢ Ａ応答性遺伝子発現または時期変化遺伝子発現を指示するへりアンチコン遺伝子 からの、この調節要素が異種の遺伝子によって符号化された生産物の発現を制御 できるように異種の遺伝子の符号化配列に連結した調節要素を含むキメラ種物遺 伝子に向けられている。ここで異種の遺伝子はへりアンチコン以外のいかなる遺 伝子であってもよい。必要なら、付加的なプロモータ要素またはｊ！種の遺伝子 によって符号化されたポリペプチドの有効量の生産をもたらす発現を生ずるに十 分なこれら要素の部分がキメラ構成の中に組み込まれる。

従って本発明は、本発明に従って種子特異的発現を与えるへりアンチコンＵＲＥ の領域をなす、デサチュラーゼのような脂質代謝酵素を符号化する配列に連結し たキメラ遺伝子を提供するものである。好ましい実施例においては、このＵＲＥ の領域は、配列番号１で示されるようにＨａＧ３−Ａのヌクレオチド８５１〜２ ４０１または１〜２４０１からなる０種子特異的発現を与えるこれら配列の任意 の変型が考慮される１種子はタンパク質と脂質とを蓄積し貯蔵する。このことは いずれも農業上きわめて重要である。へりアンチコンＵＲＥの要素は種子を発現 する際の高度な、制御された発現を規定することができるので、これらの要素は 種子の脂質および／またはタンパク質品質を改善する際に有用である。これらの 要素は、脂質代謝酵素を符号化する遺伝子の発現を制御するのに役立つ。例えば 、これらには脂肪酸の延長および不飽和化、および／またはタンパク質、特にリ ジンおよびメチオニン含量の高いものが含まれる。これらの要素を含むキメラ遺 伝子は、特定部属の脂質および／またはタンパク質の相当な量を蓄積し貯蔵する 遺伝子導入植物系統を提供するのに用いることができる。

本発明の他の態様は、種特異性が発現しているへりアンチコンのＵＲＥＩＩ域を 有しているキメラ遺伝子に向けられる。そしてこれは異種の遺伝子に融合してい る。この構造は、通常のへりアンチコンとは別の発現をしているものであり、異 種の遺伝子がもっばら植物の根の部分に表れているものである。言い替えれば、 種特異性が、全ＵＲＥの前後から移されたとき、組織特異性の規則性は変えられ る。具体例として、ＨａＧ３−＾、ＵＲＥの領域は配列倍号１の１〜１６３９、 あるいは８５１〜１６３９を含む。そして該領域はたとえいずれか一方の配向に おいてこれら要素が機能していてもプロモーターとは逆の分子配向で融合してい る。他の具体例としては、除草剤抵抗性が与えられた配列が少なくとも、ａｒｏ Ａ遺伝子の一部であることが好ましい。種特異性が発現したこれらの配列の何ら かの変型にか熟考される。

特に重要な点は、除草剤抵抗性が与えられたこれらのキメラ構造の使い方である 。はとんどの除草剤が、雑草と穀物との区別がつかないので、穀物の除草剤抵抗 性処理は、広範囲の除草剤の使用を認可している農学上重要な点である。したが って、本発明は、種特異性が発現したヘリアンチコンＵＲＥ要索を含むキメラ遺 伝子が少なくとも植物で機能するプロモーターの一部に融合し、さらに、少なく とも、ａｒｏＡ遺伝子の一部、あるいは除草剤抵抗性が付与され暗号化したポリ ペプチド配列に融合している。グリホセートに抵抗性が与えられ、５−エノール とロビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰ合成酵素）、スルホニル尿素 、イミダゾリノンの阻害に関係し、アセトラクターゼ合成酵素（ＡＬＳ）と７セ ロヒドロキシ酸合成酵素（ＡＩＩＳ）の阻害するところのペプチドの研究がなさ れている。具体例として、ＵＲＥ領域は配列番号１で示されるところのＨａＧ３ −Ａの１〜１６３９、あるいは８５１〜１６３９であり、プロモーターとは逆の 分子配向で融合されていることが好ましい、種特異性が発現するこれらの配列の 幾つかの変型が熟考される。

本発明の他の態様として、キメラ遺伝子は、時期変化が発現したへりアンチコン のＵＲＥ要素を含むもので、これは、少なくとも植物で機能するプロモーターの 一部の前あるいは逆に配向して融合しており、さらに異種の遺伝子のコード化さ れた領域に連結している。具体例として、ＵＲＥＩ！累は、配列番号１で示され るところのＨａＧ３−Ａの１〜８５１あるいは１６３９〜２３０３のヌクレオチ ドであることが好ましい０時期変化遺伝子発現が与えられたこれらの分子配列の 幾つかの変型が熟考される。

キメラ遺伝子は、ＡＢＡ応答性が発現したへりアンチコンのＵＲＥ含有要素を含 むもので、これは、少なくとも植物で機能するプロモーターの一部の前、あるい は逆の配向で任意に融合しており、さらに、異種の遺伝子にも融合している。

具体例として、ＵＲＥ要素は、配列番号１で示されるところのＨａＧ３−Ａの８ ５１〜１６３９、あるいは１６３９〜２３０３を含むものであり、あるいは配列 番号３で示されるところのＨａＧ３−Ｄの１〜４０４のヌクレオチドを含むもの であることが好ましい。特に重要な点は、水ストレス耐性が改善された植物を提 供するため、ＡＢＡ応答性発現が与えられた概念を使うことである。

本発明のキメラ遺伝子は、異種の遺伝子のコード配列にへりアンチコンのゲノム ＤＮＡの５′フランキング配列が融合することによって構成されている。これら の配列の並置はいろいろな方法で完成させることができる。具体例として、５゛ 〜３′までの配列順は、へりアンチコンで上流から、１１１１ｇ５領域、プロモ ーター領域、コード配列、そして、ポリアデニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔ ｉｏｎ）部位であることが好ましい。

このようなキメラ遺伝子の構造に関しての標準的な技法は、当業者において良く 知られており、Ｓａ園ｂｒｏｏｋら（１９８９）のものを参照することができる 。天然のＤＮＡフラグメントの末端によって選択されたＤＮＡのフラグメントを 結合させるなどさまざまな手法が利用できる０周知の技術の一つとして、発現さ せるべき異種の遺伝子によって、プロモーター要素として要求される構造と、転 写の能率的なポリアデニル化のためのシグナルが認識されている。従って、ＣＡ ＡＴ。

ＴＡＴＡボックスとして知られているプロモーター配列を含む５′へりアンチコ ンＵＲＥ領域は、プロモーターのない異種のコード配列に直接融合させることが できる。選択的にＣＡＡＴ、ＴＡＴＡボックスを含まないへりアンチコンＵＲＥ 領域は、植物内で作用するエンコード化プロモーターであるＤＮＡフラグメント に連結させることができる。植物のプロモーターは開業的に得ることもできるし 、公知の配列に基づいて化学的に合成することもできる。例えばこのようなフラ グメントには、ＣＡＡＴ、ＴＡＴＡボックスを有し、先端が切りとられたカリフ ラワーモザイクウィルス３５ｓプロモーターがある。他の代表的なプロモーター として、ツバリン合成酵素と、リブロース１．５−二リン酸カルボキシラーゼプ ロモーターを含むものがある。プロモーターフラグメントは異種のコード配列に さらに連結されている。コード配列の３　末端は、例で示したポリアデニル化部 位に融合されている。しかし、これに限定されず、ツバリン合成酵素のポリアデ ニル化であってもよい。さらに中間体植物の形質転換ベクターは有用であり、こ れは、植物の形質転換にとって必要とされる配列によって境界付けされたこれら ポリアデニル化部位を一つあるいはそれ以上含むものである０本発明のへりアン チコンＵＲＥ要索と異種のコード配列は、キメラ遺伝子が与えられた植物形質転 換ベクターの多結合部位においてサブクローンされることができる。

本発明の５′フランキング要素は、へりアンチコンのゲノムクローンを加水分解 する制限エンドヌクレアーゼ、あるいはエキソヌクレアーゼから誘導されること ができる。へりアンチコンのＣＡＡＴとＴＡＴＡボックスを含む制限フラグメン トは、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）のコード配列のような、プロモーターの ない異種の遺伝子の前方に配向し、結合している。当業者によれば、５′へりア ンチコンの調節配列が他の方法、例えば、化学的あるいは酵素による合成によっ て供給できるということを認識するであろう、異種の生産物は、同様の構成にお いて発現し得る幾つかの遺伝子のコード化配列とすることができる。このような 具体例は本発明によって熟考された。コード配列の３″末端は、例えていうなら 、通常ポリアデニル化部位に融合されている。しかし、これに限定されず、ツバ リン合成酵素のポリアデニル化部位、あるいはオクトピンＴ−ＤＮＡ遺伝子の７ ボリアデニル化部位であってもよい０選択的に、ポリアデニル化部位は異種の遺 伝子によって供給し得る。

ＴＡＴＡボックスを含まない５′へりアンチコン調節要素は、少なくとも植物プ ロモーター配列、すなわち、少なくともＣＡＡＴとＴＡＴＡ配列を含む植物プロ モーターの一部の前方あるいは逆方向の配向で連結させることができる。好まし い具体例として、このプロモーターは、先端をきりとったカリフラワーモザイク ウィルス（ＣａＭＶ）　３５　Ｓプロモーターがある。結果として、キメラ複合 体は異種コード配列とポリアデニル化配列とに結合されることができる。

異種の遺伝子の調節された発現を提供するために、ＭｖｌＪは、本発明のキメラ 遺伝子とともに形質転換される。遺伝子の転移は、トランスジェニック植物にお け異種の遺伝子を発現する方法のような技術分野において良く知られている。タ バコは宿主として最もよく使われている。これは、簡単に再生し、非常に多くの 発育した檜が得られるためである。そして、Ｔ１プラスミドベクターをＭｉｌｌ するアグロバクテリウムによって高開度で形質転換をさせることができる。（Ｈ ｅｅら、（１９８７）　Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ　５ｉｏ１．３１ １，４８７）　、ワタ、ナタネ、ダイズを含む双子葉植物はトランスジェニック 宿主として好ましい、しかしながら、当業者によれば、有効に形質転換し、再生 可能ないくつかの植物は、本発明において、トランスジェニック宿主として使用 可能であるといことが認識されるだろう。

形質転換の方法として、様々なものが知られている。キメラ遺伝子は、Ｈｏｒｓ ｃｈら（（１９８５）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２７．１２２９）によって述べられ たところの形質転換−再生処理によると、リーフディスク法によって植物中に導 入される。また、プロトプラスト培養（Ｈｏｒｓｃｂら（１９８４）　５ｃｉｅ ｎｃｅ　２２３，４９６ＨＤｅＢｌｏｃｋら（１９８４）　ＥＭＢＯＪ、２．２ １４３ＨＢａｒｔｏｎら（１９８３１Ｃａ１ｌ　３２．１０３３）や、艮式１四 での基部あるいは櫂の外題体の形質転換（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉら（＋９１１３） 　ＥＭＢＯＪ４，２１４３ＨＢａｒｔｏｎら（１９８３）釦１１３２．１０３３ ）のような形質転換の他の方法も使うことができ、これらは本発明の範囲に含ま れている。具体例として、植物はベクターを誘導するアグロバクテリウムで形質 転換されることが好ましい、しかしながら、他の方法も、植物細胞に本発明のキ メラ遺伝子を挿入するのに有効である。このような代替の方法は、生物的な方法 （Ｋｌｅｉｎら（＋９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　３２７．ＴＯ）　、電気的な方法 、化学的にＤＮＡを導入する方法、ベクターとしてウィルスや花粉を用いる方法 などを含むものである。

形質転換の方法にとって必要なときいつでも、本発明のキメラ遺伝子は、例えば Ｂｅｖａｎ　（１９８４）によって発表されたバイナリ−ベクターのような、植 物遺伝子転換ベクターに挿入されることができる。植物形質転換ベクターは、Ａ ｒＯｂａＣｔｅｒｉｕｍｔｕ＋５ｅｆａｃｉｅｎｓの転移システムである、修飾 された自然遺伝子によって訝尋されることができる。自然のシステムはＴ−ＤＮ Ａとして知られている大きなセグメントを含む大きなＴｉプラスミド（腫瘍誘導 物）を含んでいる。そしてこれは、形質転換した植物に転移されているものであ る。Ｔ１プラスミドのもう一つのセグメントであるｖｉｒ領域はＴ−ＤＮＡ転移 にとって、重要な役割を占めている。Ｔ−ＤＮＡ領域は末端反復によって境界づ けられている。修飾されたバイナリ−ベクターにおいて、腫瘍誘導物遺伝子は欠 失されており、ｖｉｒ領域の機能はＴ−ＤＮＡの境界配列によって隔てられた外 来ＤＮＡの転移に有効に働く、また、このＴ−領域は抗生物質抵抗性、転移によ って挿入された配列における多発性りａ−ン部位についての選択性のマーカーを 含んでいる。このように処理された株は、゛解除された（ｄｉｓａｒｍｅｄ）　 ”　４．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株として知られており、植物の核内ゲノム中の Ｔ−領域によって隔てられている配列の能率的な形質転換を許容している。

表面が殺菌された葉片は＾、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを含んだ゛解除された′外 来　ＤＮＡで接種され、２日間培養し、抗生物質が含まれた培地に転移した。形 質転換した出芽は、適切な抗生物質を含ませた培地に定着させた後、選別され、 土壌に移した。トランスジェニック植物は自己授粉し、これらの植物から種が取 れ、集められ、抗生物質を含んだ培地上で育てられる。

発芽した種、若い実生と成熟した植物の非相同あるいはレポーター遺伝子の発現 は、免疫的に、組織的に、あるいは活性検定によって監視されている。

ヘロインについて述べるとき、キメラ遺伝子の発現の検定の選択は、異種のコー ド領域の自然のままの状態によるものである０例えば、ノーザン分析は、適切な ヌクレオチドプローブが利用できるならば、転写を評価するのが定石であるとす ることができる。また、異種の遺伝子により、暗号化されたポリペプチドの抗体 が有効であるならば、ウェスタン分析と免疫組織学の局地は、ポリペプチドの生 産と局在を評価するのが定石であるとすることができる。非相同遺伝子により、 適切な生化学の評価が使われることができる０例えば、アセチルトランスフェラ ーゼは、標準基質のアセチル化を測定することによって検出される。除草剤抵抗 性遺伝子の発現は、トランスジェニック植物の除草剤抵抗性を定量すことによっ て検出される。

本発明の他の態様は、トランスジェニック植物、あるいは本発明のキメラ遺伝子 が含まれている植物の後代を提供することである。単子葉植物、双子葉植物の両 方について研究がなされている。植物細胞は、すでに述べられた植物の形質転換 法のいくつかによって、キメラ遺伝子で形質転換がなされている０通常、カルス 培養法かリーフディスク法で形質転換された植物細胞は、よく知られた方法（例 えばＨｏｒｓｃｈら（＋９８５）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２７．１１２９）によっ て完全にトランスジェニック植物に再生された。好ましい具体例として、トラン スジェニック植物として、ワタ、ナタネ、タバコ、ダイズなどがある。形質転換 した植物の子孫はキメラ遺伝子を遺伝しているので、形質転換した植物からの種 蒔、刈入れはトランスジェニック植物の系統で続けて用いられる。

本発明は、種子の脂質の質の改善された植物の製造方法も提供する。この方法は 、植物細胞の、デサチュラーゼのような脂質代謝酵素のコーディング連鎖に連結 した種子特異的調節要素を有するキメラ遺伝子を包含するベクターへの転換と、 植物の望みの特性への選択とを有する。好適な実施例として、配列番号１中に示 されているＨａＧ３ＡのＵＲＥのヌクレオチドの１〜２４０１又は８５１〜２４ ０１に調節要素がある。転換植物細胞は、改善された種子脂質の質を有する植物 に再生される。

本発明のもう１つの態様として、種子の蛋白質の質の向上された植物を製造する 方法がある。この方法は、植物細胞の、多量のリジン及び又はメチオニン残基を 有する蛋白質貯Ｍ種のコーディング連鎖に連結する種子特異的調節要素を有する キメラ遺伝子を包含するベクターへの転換と、植物の望みの特性への選択とを有 する。好適な実施例として、配列番号ｌ中に示されているＨａＧ３−ＡのＵＲＥ のヌクレオチドの１〜２４０１又は８５１〜２４０１＆：調節要素がある。転換 植物！！胞は、改善された種子の蛋白質の質を有する植物に再生される。

本発明のもう１つの態様は、除草剤抵抗性植物を製造する方法を提供するもので ある。植物細胞は、グリホサート抵抗遺伝子のような除草剤抵抗性遺伝子のコー ディング連鎖に連結する相持異的調節要素を有するキメラ遺伝子を包含するベク ターに転換され、そして望みの除草剤抵抗性を有する植物が選択される０選択さ れた植物は、同条件下にある転換されていない同種の植物を殺傷する除草剤処理 に耐える。好適な実施例として、配列番号１中に示されているＨａＧ３−ＡのＵ ＲＥのヌクレオチドの１〜１６３９又は８５１〜１６３９に調節要素があり、異 種構造の連鎖が、ＥＰＳＰシンターゼを符号化する遺伝子、アセトラクターゼ合 成１１票またはアセトヒドロキシ酸合成酵素により提供される。転換された植物 細胞は除草剤抵抗性植物に再生される。好適な実施例として、ＨａＧ３−Ａのヌ クレオチド８５１〜１６３９と、ａｒｏＡ除革剤抵抗性遺伝子を有する接待異的 ａｍ要素を包含するベクターｐＲＰＡ−ＭＬ−８０３により植物は転換される。

下記実施例は本発明をさらに示すものである。

Ｋ五最上 二杖互貞 下記実施例中で引用されているヌクレオチド順序は図１〜３に付されているも実 施例を通して使用されているＧＵＳレボ−タカセットの一般的な目的は、すでに （シェフ　７−　ソ＞他、（１９８７）ＥＭＢＯＪ、６．３９０１）＆：記載さ れている。要約すれば、ＧＵＳのコーディング範囲は、Ａ、誘導された１級役の ベクターｐＢＩＮ１９　（ベーパン（１９８４）！ＬＵＬＬ見ｌ工１又、８７１ １）のポリリンカー範囲のツバリンシンターゼポリアデニル化部位に連結された ５′であった。ベクターｐＢＩＮ１９は、植物転換に必要なＴ−ＤＮＡの左右境 界と、カナマイシン耐性遺伝子とを有する。結果としての構造、ｐＢＩＬＯｌ、 １は、図４中に描写されている。独特の限定は、プロモータＤＮＡ断片の挿入を 許すＧＵＳのＡＵＧ初期コドンの上流部分に位置させる。

ＣａＭＶ３５Ｓプロモータは、ｌ！！４に描写されているｐＢＩｌｏｌ、１から 創造ｐＢ１１２１．１のＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨｒ領域に連結された。ｐＢＩ １２０を創造するのに、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータは、−９０（ＣＡＡＴとＴＡ Ｔ八箱へら）のＥｃｏＲＶ範囲で切断され、ｐＢｌｌｏｌ、１のポリリンカー範 囲に複製された。

表１は親プラスミドと誘導構造を示している。ＨａＧ３−Ａ−ＦＬとｐＢＩ　１ ２１．１及びｐＢｌｌｏｌ、１のａｒｍ構造が図４に描写されている。親プラス ミドを構築するのに使用されたＨａＧ３−Ａ及びＨａＧ３−Ｄのゲノムクローン の限定断片をｒＩｌｉ５は示している。図６は、全長構成に関するＭ尋構造模式 図を示している。

ＨａＧ３−Ａ／ＧＵＳ構成は、全長に調整された範１！Ｉ（ｅ）ｉｌｌの−２３ ７７から＋２４）に広げる大きく重なり合う断片を発現する。各種の構成の３′ 終端は、ｐプルスクリプト（ストワタジェン）　（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｆＳ ｔｒａｔａｇｅｎｓｌ）　［ｐＨａＧ３−Ａ−２，８（ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ） 、表１］中の２．８ｋｂ　ＨａＧ３−Ａ断片のエキソヌクレアーゼＩＩＩ消化か ら誘導された。これらの欠失は図４の頭に示されている。最初の欠失、ｐＨａＧ ３−Ａ−２，４は、ＨａＧ３−ＡＣＡＡＴとＴＡＴＡボックスと−７５における その３′終端を有する。ＨａＧ３−Ａ　ＣＡＡＴとＴＡＴＡボックスの含有され た断片は、プロモータのないＧＵＳカセットｐＢｒｌｏ１．１への方向に連結さ れている。ＨａＧ３−Ａ　ＴＡＴＡボックスを含有しなかった断片は、ｐＢ１１ ２０の切断されたＣａＭＶ３５Ｓプロモータの上流方向にも連結されていた。こ れらの断片は、適当なＧＵＳカセットに副複製された。次の方向を示すＦと反対 方向を示すＲにより、次のそれらの終ｊｌｌｌｉｌ囲に基づいて構成は名付けら れている。ＧＵＳコーディング範！！１（Ｗ４）に関する断片の方向を矢印は示 している。ＨａＧ３−Ｄ／ＧＵＳ構成は、ノーマル（Ｎ）と反対（Ｉ）の両方で の４０４ｂｐ断片（多重色」２１一旦」λ」２１）を含有している。各構成の正 確さと方向は、ＧＵＳカセット（アドバンストＤＮＡテクノロジーＬａｂ、テキ サス　Ａ＆Ｍ大字）での範囲に対するプライマーを用いる二重螺旋ジデオキシ配 列（チェノとシーパルグ、１９８５）により確められた。

１簑旦肌ｉ暫遺 プラスミド構造に基づ＜ＢＩＮ−１９は、初期転換に５０μｇのカナマイシン／ ｍｌが選択され、そして１００μｇ／ｍｌのカナマイシンに変換されたこと以外 は標準手順（ホルシュ他、１９８５）に基づく変換タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ 　ｔａｂａｃ四ｃｖ、　Ｘａｎｔｈｉ）が使用された。植物は自家受粉され、撞 は、同一に転換されるように、カナマイシン（４００ｇ／＋＋１）で発芽された 。なぜならば、構成に基づくＢＩＮ−１９は、有害な抗生物質のカナマイシンに 耐性を授与するネオミシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＰＴＩＩ）を含 有しているからである。タバコゲノムに集積される各ＧＵＳ構成のコピ一番号は 、ＮＰＴＩ　Ｉ遺伝子の分ｌ１Ｍ度による各転換のため、判断される。転換の殆 どは構成のただ１つの分離座に包含された。子としての、ホモ接合体植物は示さ れているものが使用された。試験構成の全てを表現しているトランス生成植物は 、Ｈ−２の反対構成を除％Ｘて得られた。トランス生成植物はコンビロン（Ｃｏ ｎｖｉｒｏｎ）チャンノτ内で保持された。１６時間明、８時間暗、２４℃、相 対湿度７０〜８０％、全ての植物はテストするための乾燥前を防ぐために厳密な 計画で水がかけられた。

老」２ λ虱　Ｕ 蜆ノｊじＬ１エ ｐＢＩＩＱｌ、ｌ　Ｂ　ｉ　ｎ　１９−誘導非ブロモータＧＵＳレボータ遺伝子 カセット。

ｐａｒ＋ｚ＋、＋　ｐＢ　ｒ　１０１．　１中のＧＵＳカセットに融合したＣａ ＭＶ３５Ｓプロモータ ｐＢ＋＋２０　Ｅ　ｃ　ｏＲＶｉｉ囲’ｔ’切断さａたｃａＭＶ３５ｓプロモー タであッテ、ＣＡＡＴとＴＡＴＡボックスから、ＧＵＳコーディング範囲に融合 した。

ｐＨａＧ３−＾−２，８ｐブルースクリプト中のｌ（ａｇ３−Ａの２．８ｋｂＢ ａｍＩＨ−ＰｓｔＩ断片であって、ＨａＧ３−Ａコーディング範囲の上流部分の ２．＋ｋｂと、転写開始範囲の下流部分の０．３８ｋｂを包含し、エキソヌクレ アーゼＩＩＩ欠失の生成に使用された。

ｐＨａＧ３−＾−２，４ｐＨａＧ３Ａ−２，８の３′エキソヌクレアーゼＩＩＩ 消化から＋２４に生ずる２、１ｘｋｂ　ＨａＧ３−Ａ断片であって、ＨａＧ３− Ａ　ＣＡＡＴとＴＡＴＡ箱を包含する。

ｐＨａＧ３−Ａ−２，３ｐ　ＨａＧ　３　Ａ　−２、８の３′エキソヌクレアー ゼＩＩＩ消化から−７５に生ずる２−３ｋｂ　ＨａＧ３−Ａ断片であって、Ｈａ Ｇ３−Ａ　ＣＡＡＴボックスを包含する。

誘」１１区 ＨａＧ３−Ａ−ＦＬ　前方向でｐＢＩＬＯｌ、１に融合したｐＨａＧ３Ａ−２， ４の２、＋ｋｂ挿入 ＨａＧ３−ＡｍＨＳ／Ｆ　ｐＢ　Ｉ　１２０の切断されたＣａＭＶ３５Ｓプロモ ータに関して、−ＩＩＳ／Ｒ前後方向で複製されたｐＨａＧ３Ａ−２，３からの ０．８５ｋｂＢａｍＨ１−１１１１断片。

ＨＡＧ３−Ａ−Ｈ３／Ｒｐ　Ｂ　Ｉ　ｌ　２０の切断されたＣａＭＶ３５Ｓプロ モータに関して、後方向で複製されたＨ　ａ　Ｇ　３　Ａ　−ＨＳ　／　Ｆから のＳａｃ　Ｉとしての０．８５ｋｂの摘出。

ＨａＧ３−Ａ−ＨＢ／Ｆ　ｐ　Ｂ　Ｉ　Ｌ　２０の切断されたＣａＭＶ３５Ｓプ ロモータに関して、−ＨＢ／Ｒ前後方向で複製されたｐＨａＧ３Ａ−２，３から の１．６ｋｂＢａ工Ｈ１−Ｂａｌｌ断片。

ＨａＧ３−＾−３２／Ｆ　ｐＢ　Ｉ　１２０の切断されたＣａＭＶ３５Ｓプロモ ータに関して、−３２／Ｒ前後方向で複製されたＨａＧ３−Ａからの０　、６　 ｋ　ｂ　ＬＩＬＩ−Ｂａｌｌであって、各ＨａＧ３−Ａ−ＨＢ／ＦとＨａＧ３− Ａ−ＨＢ／ＲからＳａ上Ｉ−ＢａｍＨ１断片を欠失して構成された１（ａＧ３− ＾−Ｓ　２／Ｆ　ｐＢ　Ｉ　ｌ　２０の切断されたＣａＭＶ３５Ｓプロモータに 間して、−３２／Ｒ前後方向で複製されたｐＨａＧ３−Ａ−２，３からの１．４ ｋｂｂ ）１ａＧ３−Ａ−Ｂ　２／Ｆ　ｐ　Ｂ　Ｉ　１２０の切断されたＣａＭＶ３５Ｓ プロモータに関して、−Ｂ２／Ｒ前後方向で複製されたｐＨａＧ３−Ａ−２，３ からの０．６６ｋｂ　Ｂａ１Ｉ　５ａＬＩ断片。

ＨａＧ３−Ａ−Ｈ２ｐ　Ｂ　Ｉ　１２０の切断されたＣａＭＶ３５Ｓプロモータ に関して、前方向で複製されたｐＨａＧ３−Ａ−２，３からの２．３ｋｂ挿入。

ＨａＧ３−Ａ−３ｌ　ｐＢ　Ｉ　Ｉ　Ｏ１，１に関して、前方向で複製されたｐ ＨａＧ３−Ａ−２，４からの１．５ｋｂ　５ａｉｌ断片。

ＨａＧ３−Ｄ−４０４Ｎ　ｐ　Ｂ　Ｉ　１２０の切断されたＣａＭＶ３５Ｓプロ モータに関して、−４０４１ｇＪ後方向で複製されたＨａＧ３−Ｄを形成する０ 、４ｋｂ　Ｓａ東ｍ ＧＵＳ　の　− □ｔに 表１に示したそれぞれの構成を有する、遺伝子導入のタバコの胚芽および非胚芽 組織におけるＧＵＳ活性を決定した。ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）等 （１９８７）の標準的な操作にしたがった。

種物組織を抽出緩衝液（５０ｍＭＮａＰＯ＋、１０ｍＮ　ＥＤＴＡ、０．１％サ ルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ　）、０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１０ ０、および１■にβ−メルカプトエタノール）中ですりつぶした。溶解産物を遠 心分離した後、上澄み液をきれいな試験管に取り、１００μｌの分別量で分割し た。抽出緩衝液中の２ｓＭの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニ ドを等量加え、３７℃で１時間恒温状態に保った。０．８畷ｌのＮａ、２ＣＯ３ （０，２Ｍ）を用いて反応を終了させた。得られた４−メチルウンベリフェロン （４−ＨＤ）を記載（ジェファーソン（Ｊｅｆｆ６ｒｓｏｎ　）等、１９８７） に従い、ホフｙ　−（Ｈｏｅｆｆｓｒ）　ＴＫＯ−１００ミニフロロメータ（劃 ｎ１τｌｕｒｏｍｅｔｅｒ）を用いて決定した。ＧＵＳ活性は、分あたり単位質 量合計タンパク質試料あたりピコモル４．Ｍｌｌ、で表わされる。

ＧＵＳ発現を引き起こす、（図４に要約されている）　ＨａＧ３−＾の様々な連 続要素を含み、阻害後日数（ＤＰＩ）が１８日から２０日の範囲にある、遺伝子 導入実生より得られた子葉、胚軸、葉、および根の活性を分析した。結果を表２ に示す。

へりアンチコン遺伝子）１ａＧ３−人およびＨａＧ３−ロのＵ　Ｒ，Ｅの、ある 部分を含んでいる全ての構成は、遺伝子導入タバコ種子中でＧＵＳ活性を与えた 。全長の調節領域（ＦＬ）およびこの領域から得られるフラグメントは全て、Ｈ ａＧ３−ｄ／ＧＵＳ構成と河様に、完全なＣａＭＶ　３５Ｓプロモ一タ複合体（ ｐＨ１１２１）によって引き起こされるＧＵＳ発現と比べた場合、熟した種子に 著しいＧＵＳ活性を与えた。しかし、十分に定義された種子に特異的な発現は、 単に−７５と＋２４の間の近位の上流域を含む構成物を用いてのみ得られた（Ｆ ＬおよびＳ−１参照）、−２３７７から＋２４または−１５２７から＋２４のヌ クレオチドを含むこれら２つの構成は、遺伝子導入実生のどの組織においてもＧ ＵＳ活性が検知されない、組織に特異的なＧＵＳ発現を示した。しかし、熟した 種子中では、ＦＩＪＩ成物はＳ−１に比べて６倍高いレベルで発現した。長軸に 対して直角に切断されたＣｈＭＶ　３５Ｓプロモータ（ｐＨ１１２０）を含むか あるいはプロモータを含まない（ｐ＋ｕ＋ｏ＋）　、負の制御と同様に、完全な ＣａＭＶ　３５Ｓプロモ一タ複合体（ｐＨ１１２１）を含む実生の組織中のＧＵ Ｓ活性が比較のために含まれているｅｆＩ子中の発現と比較すると、同様の構成 を含む葉中の発現はほとんどない、一方、ＦＬおよびＳ−１以外のほとんどの構 成は、遺伝子導入の実生の相中に著しい発現を示した。

完全なＣａＭＶ　３５Ｓプロモ一タ複合体によって与えられる全体の活性は、相 中以外の体組織中において、ほかのすべての構成によって与えられる活性より高 かった。特に、ＨＢ／Ｒ（−２３７７から−７３９）およびＳＲ／Ｒ（−１５２ ７から−７３９）の構成を含む実生の根は、完全なＣａＭＶ　３５３プロモータ の制御下にあるＧＵＳを発現する根の活性の、７か６８倍のＯＵＳ活性レベルを 示した。

紅 ′伝　導入タバコの胚芽および非　組織におけるＧＵＳ　現の　約９）構成り〉 　発育　ＧＵＳ活性（ｐｍｏｌ　４ＭＵ　／　ａｇ　／　ｍ１ｎｉｅ〉　ＡＢ人 プロフィールＣ）　種子ｆ〉　葉９）　根９）　応答ｈ）１岨」 ＦＬ　Ｉ　１８．７±８．７　０　０ Ｓ−Ｉ　Ｉ　３．４±１．１　０　０　ＮＤＨ５Ｆ　ＩＩＩ　１７．］＋＋５　 ０．４５±０．０５　３６−６±２．２−ＲＮＤ”）　６．２±１．０　２．２ ３±０．０５　８．９±１，８−ＨＢ　Ｆ　ＩＩ　１４．８ｆ５．２　０．９５ ｆＯ，＋３　２９．９＋２．２　＋ＲＮＤ　１３．１±６．９　０．２５±０． ０５　７５゜４±３　＝ＳＢ　Ｆ　ＩＩ　１１．１±５．８　０　１３．９±６ ．８−ＲＮＤ　１２．１±５．８　０．３４±０．０５　９０．５±９．９＋Ｓ −２Ｆ　Ｈ３５，７±４．２　０　２０．６±＋０．２　ＮＤＲＮＤ　２１．０ ±１５　０．４５±０．０８　３８．８±１．２十Ｂ−２Ｆ　Ｉｌｌ　１１．２ ±３．９　２．０３±０．０８　！１．０±０．６２　＋１ｉ　ＮＤ　７゜２± ２．３　４．０５±０．１０　３．９±０．３　崎Ｈ−２Ｆ　Ｉｌｌ　１．８± １．ＯＮＤ　１．８±０．３　ＮＯ臘録」 ４０４　Ｎ　１１＋　９．２±２．９　０．０７±０．０１　６．８±０．５＋ Ｉ　ＮＤ　９．２±３．９　２．０３±０．０５　１２．９±２．８＋コントロ ール ｐＨ１０１８Ｄ　ＯＯＯ− ｐＢＩ　＋２０　ＮＤ　Ｏ００− ｐＢＩ　１２１　ＨＤ　４．３±１．０　２２．０±７．９　９．９±４．０− 五ヱ−ｍ ａ　図１の構成を含む遺伝子導入のタバコの、熟した種子および実生の組織のＧ ＵＳ活性を分析した。

ｂ　構成は図１に示された通りである。前進（Ｆ）および逆転（Ｒ）、通常（Ｎ ）および逆位（１）は、長軸に対して直角に切断された３５Ｓ　ＣａＭＶプロモ ータに関するそれぞれのへりアンチコンの配向について述べたものである。

Ｃ図１で前進構成を含む遺伝子導入タバコの発育中の種子は、８〜２４ＤＰＦか ら約２日の間隔でＧＵＳ活性を分析した。

ｄ　ＮＤとは、この一連の実験で決定されなかった意。

ｅ　すべての実験において、ＧＵＳ活性は、それぞれの構成に関して、４から１ ０の独立的に形質転換した植物の平均を表す、タイプ１．ＩＩ、およびＨｌのプ ロフィールは実施例３で定義される。

ｆ　Ｆ！１した（３０ＤＰＦ）遺伝子導入タバコの種子中のＧＵＳ活性。

ｇ　遺伝子導入のタバコの実生は、固体媒体上に無菌状態で成育された。実生（ １８〜２０ＤＰＩ）を集め、ＧＵＳ活性を分析した。

ｈ　１２〜１８ＤＰＦの発育中の種子中にのみ応答するＦＬ　ＡＢＡ、他のすべ てのものは、乾燥した葉のＧＵＳ発現と、指標植物の実生が外因性ＡＢＡに直接 応答するという二次的な証拠から予想されるＡＢＡ応答である。プラス記号は基 底値をこえるＧＵＳ活性の誘発を示す。マイナス記号はＧＵＳ活性の＃Ｓ発が検 知できないことを示す。

それぞれの前進構成によって与えられる時間的プロフィールを決定した。結果を 表２に示す。子の同型接合の植物を成育し、花を咲かせ、ついたさやから得られ た種子のＧＵＳ発現を実施例２の記載にしたがって分析した。発育胚芽において ＧＵＳが最初に発現する時間と、得られた発現パターンの定性的および定量的性 質に基づいて、発育プロフィールの３つのタイプを同定した；タイプＩのプロフ ィールは、１２ＰＤＦでＧＵＳの蓄積が始まる正しい時間調節を示した。タイプ ！■のプロフィールを示す植物においては、ＧＵＳ活性はやはり１２ＰＤＦ周辺 で蓄積を始めたが、１４ＰＤＦ付近で最大となり、その後はＧＵＳ活性は著しく 減少した。タイプＩＩＩの植物は１０ＤＰＦｌｉｌに活性を生じ、約１２ＰＤＦ で生じる活性は最大になることを示した。ヌクレオチド−２３７７から−１５２ ７または−７３９から−７５に起因するＨａＧ３−Ａ　Ｕ　ＲＥの領域を含む構 成は、この時間的に早いプロフィールを与えた。

東五鳳土 ａＵＳ　の組　化　な ＨａＧ３−Ａ−ＳＲ／ＲおよびＨａＧ３−Ｄ−４０４Ｎを含む実生中において、 ＧＵＳを組織化学的に位置ＦＩＩＩＩ！シた。試料を５０ｍＭのＮ　ａ　Ｐ　Ｏ ４で洗浄し、ｌｏＯμｌの反応緩衝液［５０ｍＭＮａＰＯａ、ｐＨ７，０，２ｍ Ｍ５−プロモー４−クロロ−３−インドリル−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｅ）　 、　０．１−Ｓフェリシアン化カリウム、および０．１ｓＭフェロシアン化カリ ウム］中で、３７℃で２４時間恒温状態に保った。８０％グリセロールを用いて 試料を顕微鏡のスライドに取り付けた。

１％のショ糖を含む基底媒体上に成育した、ＨａＧ３−Ｄ−４０４Ｎ　（図７Ａ ）およびＨａＧ３−Ａ−３Ｒ／Ｒ（ＱＵ　７　Ｂ　＞の実生は、わずかに異なっ た発現パターンを示した。ＨａＧ３−Ｄ−Ｈによって決まるＧＵＳ発現は子葉中 では低いレベルに表われ、胚軸中では活性が検知されずに末端の根の領域で著し く高いレベルに表われた。ＨａＧ３−Ａ−ＳＢ／Ｒの実生も胚軸または子葉では 活性が検知されずに末端の根において著しいＧＵＳ活性を示した。飽和以下のろ 紙上に、水の不足した環境で成育した１ＩａＧ３−Ｄ−４０４Ｎを含む実生中で 、１４ＤＰＩでＧＵＳ活性を組織化学的に位置確認した。ＧＵＳ活性は、始めは 、これらの実生の葉および根（図７Ｃ）に存在した。

ＨａＧ３−Ａ−３Ｂ／Ｒを含む実生のＧＵＳ発現パターンを決定した。　ＳＲ／ Ｒ中のＧＵＳ活性の大多数の部位は、発育中の根の先端（図７８．Ｃ）に存在し た。ＨａＧ３−＾−５Ｂ／Ｒを含む６ＤＰＩの実生中では、伸長している根の全 長でＧＵＳが発現し、根の先端（図７Ｄ）の分裂組織の領域では特に高いレベル であった。ｌ１ａＧ３−Ａ−５Ｂ／Ｒの実生（１４ＤＰＩ）の組繊化学的位置確 認により、主根（図７Ｂ）の分裂組織の領域で継続される活性と同様に、新しく 形成された側部の項中の活性も示された、１６ＤＰＩ以降の実生はこのパターン の発現を示し続けた（図７０）−根毛および根の末端部も高いレベルのＧＵＳ活 性を示した。

罠五班工 Ｂ　１ 図４に示される構造を含む変形遺伝子を有するタバコの全ての植物実験の中にお いて、ＨａＧ３−ＡとＨａＧ３−ＤとのＵＲＥｓのいくつかの領域が、植物の水 ポテンシャルの中で（表２）、変化に応答することが確認される。ＡＢＡは水欠 損の応答の媒介者として知られ、これらの要素により引き起こされるＧＵＳの発 現上にＡＢＡの効果が決定される。ＨａＧ３−Ａの中て、二つの領域（−１５２ ７から−７３９までと、−７３９から−７５まで）が、成熟した変形遺伝子を有 するタバコの葉の中と、実生の中とのＡＢＡの応答発現を比較することを表す。

別のＡＢＡの応答要素は、ＨａＧ３−Ｄ　（−７３９から−７５）のＵＲＥの中 で確認される。

ＨａＧ３−Ｄ−４０４Ｎ　（前方へ配向）を含む変形遺伝子を有するタバコの中 で、ＧＵＳの活性の導入は、進行する乾燥とその後の水の欠損からの回復との間 の水ポテンシャルに関連する。ＨａＧ３−Ａ　ＵＲＥの全ての長さは、種子の発 育期間を除き、どんな状態下でも発現しないので、このキメラのＧＵＳ構造を含 む植物は、負の制御に使用されていた。子として、各々の構造を含む同型接合体 植物は、土壌の中で育つ。植物には、常態（制御）で水にかけられるか、制御す る植物の１／３の量を持つ水をかけ又は少しも水をかけないことによる変更程度 に圧力を加えるかのいずれか一方が行われる。ＨａＧ３−Ｄ−４０４Ｎを含む十 分に圧縮させた植物は、約３６時間で、ＧＵＳ活性のピークを速やかに誘発させ 、それは水ポテンシャルの中の減少に関連する（図８）、たとえ植物が４バ一ル 程度の水ポテンシャルを持つ厳しい水欠損下であっても、２４時間後のＧＵＳの 決定は、ＧＵＳ活性の中で、再生可能な減少を現す、十分に圧縮させた植物は、 サンプリングを日に三度した後に、水をかけることにより、回復する。水ポテン シャルは水かけ後に圧縮されない水準に戻るように、植物は素早く回復し、ＧＵ Ｓの活性は、残存日にわたって減少し続ける。ＨａＧ３−Ｄ−４０４Ｎを含む１ ／３に圧縮された植物の中で、ＧＵＳの活性は、水ポテンシャルが減少するにつ れて（図８）、３．５日の間隔でずっと穏やかに増加する。十分に圧縮させた植 物を見ると、水欠損が回復する前に、ＧＵＳの活性が減少する。実例のない中で 、ＦＬ植物は、胚のない組織の中にＧＵＳを現す。

ＨａＧ３−Ｄから４０４ｂｐの破片かどうかを決定することが直接ＡＢＡに応答 し、ＨａＧ３−４０４Ｎを含む変形遺伝子を有するタバコの葉のディスクは、増 加時間の中でＡＢＡで処理され、その後、ＧＵＳ発現が検査される。約３．５時 間のタイムラグの後、１０ｍＭのＡＢＡを用いた処理は、ＧＵＳ発現中の急激な 増加を引き起こし１ＧＵｓは、蓄積速度が減少する８時間を通して、蓄積が続け られる（図９）。ＡＢＡを除いた理想的な状況下で維持される同様の植物から葉 のディスクの中でＧＵＳ活性は検出されない。同様に、ＨａＧ３−Ａの十分な長 さのＵＲＥを含む植物からの葉のディスクは、実験中活性を示さない。ＣａＭＶ ３５Ｓプロモータとβグルクロニターゼリポータとを含むキメラの遺伝子のため 、遺伝子は、葉（表１）の中で転写的な活性であり、ｐＢ１１２１を含む変形遺 伝子を有する植物は、重要な負の制御として役立っている。ｐＢ１１２１を含む 植物から葉のディスクは実験を通じ、外来のＡＢＡに応じてＧＵＳの活性中、増 加しないことが見られる（＋ＡＢＡ：　１２．６±３．３　ｐｍｏｌ　４−ＭＵ ／μｇ／分、−ＡＢＡ：　１３．５±３．６　ｐｍｏｌ　４−ＭＵ／Ｊｉｇ７分 ）。

実験の同様のシリーズは、ＨａＧ３−Ｄ−４０４ＮとＨａＧ３−Ａ−ＦＬとを含 む変形遺伝子を有するタバコの実生で行われる。１８本のＤＰＩの実生は、０− １０ｍＭのＡＢＡを含む媒体に変形し、ＧＵＳ活性は、１．２、そして３日の後 に決められる。ＨａＧ３−Ｄ−４０４Ｎを含む実生は、全部のＡＢＡの濃度で、 １日、ＡＢＡにより誘発され：平行実験の中でＨａＧ−Ａ−ＦＬの誘発は重要で ない、３１１発は、１度と時間に依存する。最大限の誘発は、異例の２００倍に 、１０ｍＭの一度のＡＢＡを、２．３日で生ずる（表３）。１９倍と７０倍との 重要な誘発は、それぞれ０．１ｍＭと１．０ｍＭとのＡＢＡに３８目に生ずる。

へりアンチコン（ｈｅｌｉａｎｔｈｉｎｉｎ）　ＨａＧ３−Ａ　ＵＲＥ　（−２ ３７７から＋２４）の全長（ＦＬ）は、発育する種の中で、ＡＢＡにより、その 誘発を試験させる。ＧＵＳ　（１！１４）の発現を引き起こす調節領域の全長（ ＦＬ）を含む種は、開花後の１１．１４．１８．２４日に行われ、ＡＢＡに応じ て、これらの能力に対する試験が行われる。ＡＢＡによる誘発は、ＧＵＳの活性 が基礎的な媒体で得られる水準を越える増加水準によって表され、；結果を表３ に要約する。ＡＢＡの反応は、発育のステージを変えた。ＩＬＤＰＦからの種は 、実験の進行中、ＡＢＡに応答しない、ところが、ずっと円熟した種が反応する 。１４ＤＰＥからの種は、１．５時間と同じくらい早く、基礎水準上に、誘発に より素早く応答する。

ＡＢＡで処理した１４ＤＰＥの種；３日間の処理による、を持つＧＵＳ活性中で は、単調に増加し、ＧＵＳ活性の水準は、ＡＢＡを用い、または用いずに処理し た１８と２４とのＤＰＦのそれより高い、１８ＤＰＦからの種は、Ｌ４ＤＰＦか らのそれよりＡＢＡに対して低い応答性であるが、１４ＤＰＦ　（＋ＡＢＡ）稲 に比べたＧＵＳ活性の水準は、ＡＢＡの処理を５０日することにより、１８ＤＰ Ｆ種内に観測される。２４ＤＰＦからの積は、ＡＢＡ処理を５日したものより、 ＡＢＡに対して応答性が低い、ＧＵＳ活性の水準もまた、基礎媒体たけで培養さ れた種によって変わる。基礎媒体上の１４ＤＰＦからの種は、４ｐｍｏｌ／４− ＭＵ／種／日に見積もられたＧＵＳ活性の中で、増加し続ける。

上記の結果は、ＨａＧ３　ＵＲＥｓを含むＡＢＡの応答性の要素が例えば成熟の ような適切な発達プログラムの脈絡の中だけで作用するへりアンチコン遺伝子の 発現を制御する階層を例示する。ＨａＧ３−Ａ　又はＨａＧ−Ｄ　ＵＲＥの脈絡 からＡＢＡの応答要素を取ることは、これらの要素が直接ＡＢＡに自由に応答し 、変形遺伝子を有するタバコの種苗と葉との中での培養に対して間接的に自由に 応答し、階層的な制御のロスを引き起こす。

１ユ ≦　伝　を　するタバコ糟の中で ＨａＧ３−Ａ−ＦＬの　のＡＢＡ ａ　ＨａＧ３−Ａ−ＦＬを含む変形遺伝子を有するタバコは、開花後（ＤＰＦ） １１ｆ示日に集められ、基礎媒体だけ、またはｌμＭのＡＢＡを含む基礎媒体〒 培養される。ＤＯＳの活性は、Ｏ１３，５日処理した俄に、決定される０発育す る種（Ｉｔ準）の中で、ＨａＧ３−Ａ−ＦＬで引き起こされるＧＵＳの生体外で の発現は、参考に表される。

東ＪＪＬ炙 タバコ中への除草剤の　留許容限　量の導入親のプラスミドｐＨａＧ３−Ａ−２ ，３（表１）から０．６６ｋｂのＢａ１Ｉ−３ａＩＩでは、その５′がＨｉｎｄ ｌｌｌの端部に連結され、その３′がｌ見立に１の位置に連結されている。その 結果として生じるカセットは、そのベクター中のＨｉｎｄ４１１とＬ１立ｌＬと サブクローニングカセットとで消化されたｐＲＰＡ−ＢＬ−４１０によるＲＰＡ −ＢＬ−４１０構造（フランス特許Ｎｏ、９１０２８７２号、１９９１年３月５ 日付）の中の二重のＣａＭＶプロモータ領域に置き代えられる。

その結果生じる構造は、ｐＲＰＡ−ＢＬ−４１０と呼ばれ、以下の要票：規定要 素であるへりアンチコンと、最適化された通過ペプチド（ＯＴＰ）と、ａｒｏＡ 遺伝子と、１１且終了暗号との転写フレームで構成される。

プラスミドｐＲＰＡ−ＭＬ−８０３は、３つの親をかけ合わすことにより、猛朋 畑旦国叶叩ｔｕｓａｆａｅｉｅｎｓ　５ｔｒａｉｎ　ＥＨＡＩＯＩＵｏｏｄ　ｅ ｔ　ａｌ、ｆ１９８６１Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１U８ ．１２９１）に変形され、その結果生じる＾ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、タバコ の葉のディスクの形質転換ために使用される。

再生されたタバコ植物は、約２０センチメーターの高さであり、ヘクタール当た り活性成分０．６ｋｇを１用量で、ラウンドアップ（ＲＯ［ＩＮＤＵＰ）として 規格化されたグリホセートを用いて温室中に噴霧した。転換しないコントロール の植物は、このグリホセートの用量で噴霧したときに殺される。転換した植物は 、健やかに生存でき、グリホセートの噴霧に対する高い残留許容限界量を示した 。

配列の表示 （１）一般情報。

（ｉ）出願人ニド−マス、テリー フレシネ、ジョルジュ （１、発明の名称・へりアンチコンの上流側調節要素に基づくキメラ植物遺伝子 （ｉｉｉ）配列の数＝３ （ｉＶ）住所 （Ａ）住所ニスカーリ−、スコツト、マーフィ　アンド　ブレフサ−ＣＢ＋スト リート： （Ｃ）シティ：ガーデン　シティ　プラグ（Ｄ）州・ニューヨーク （Ｅ）国、アメリカ合衆国 （ＦＩＺＩＰ：　１１５３０ （Ｖ）コンピューター読取可能形式 （Ａ）媒体方式　フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンピューター（Ｃ）オペレーティングシス テム：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア−Ｐａｔｅｎｔ［ｎ　 Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．０．　Ｖｅｒｓｉｏｎ　Ｈ，２５（ｖｉ）現在の出願デ ータ： （＾）８願番号。

ＦＢ）出願日。

（Ｃｌクラス番号 （ｖｉｉｉ）代理人の情報 （Ａ）名称、マクナルティ、ウィリアム　イー（Ｂ）ｆ録番号：　２２，６０６ （Ｃ）参照／事件整理番号　８０８】 （ｉｚ）通信情報 （Ａ）電話：　５１６−７４２−４３４３（Ｂｌテレファックス　：　５１６− ７４２−４３６６（２）配列番号１　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌ）の情報・（１ ）配列の特徴 （Ａ）長さくＬＥＮＧＴＨ）　：　２４０１塩基対（Ｂ）型（ＴＹＰＥ）　・核 酸 （ｃ）ｍの数（５ＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ＞　両形態（ｂｏｔｈ）（Ｄ）トポロ ジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）　：直頗状（ｘｉｌ　配列ノＲ示配Ｆｌａｔ　号１　 （ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１５ＧＴ（ＪＣＡＧＴｒ　ＴＩＴｒＴＧＴＧＴＧ　Ｇ ＣＣＡＴ入ＴＡＣ＾　八ＴＴＩＴｒＧＡＣＧ　ＴＩＧＣＧＴＴｋＧＴ　ＴＡＡＴ ＣＡＧＡsＸ　１６Ｂ□ （２）配列番号２　（ＳＥＱ　Ｉｎ　ＮＧ：２１の情報・（ｉ）配列の特徴 （Ａｌ長さくＬＥＮＧＴＨ）　１７３２塩基対（ｘｉ）配列の開示・配列番ｑ　 ２　（ＳＥＱ　１０　ＮＯ＋２１ＡＡＣＴＧＣＧＴＧＡ　ＡＣＴＧＡＴＣＴＣＡ 　ＧＣＣＣＴｒＧＡＴＴ　ＴＴＴ＾ＴＧＡＴｃＴ　ＴＧＡＧＡＴＴＡＡＡ　ＧＴ ＧＡＧＴＧＧbＡ　４８０ ＴＧＡＴＧＧＴＡＡＴ　ＴＡｍＧＧＴｒＡ　ＡｍＣＡｍＡＡＴＴＡＡ　ＡＴＡＣ ＡＡＡＡＡＧ　ＧＧＴＡＴＡＴＧＴＧ　５４ＱＧＣＴＴＩＴＧＡＴＣ入ＡＡＴＡ ＧＴＴＧＴ　へＡＡＴへＣＴへへ＾　ＡＴＡＣＡＣＣＡＡＧ　ＴＣＡＡＴＧＧＧ ＴＧ　ＡＡＡＧＴＴＡｃＴ`　１１８０ ＧｍＡＡＡＡＴＴ　ＡＡＡＧＣＴＡＴＡＡ　ＣＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＡＣＡＣＡ ＴｒＴｒ　ＴＡＡｍＡＡＡＡ　ＡＴ　１７］２（２）配列番Ｆ　３　（ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：３）　ノ情報（ｉｌ配列の特徴 （＾）長さくＬＥＮＧＴＨ）　：　４０４塩基月（ｘｉ）配列の開示　配列番号 ３　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）ＧＴＣＧＡＣＴＡＴＣＴｒＡＧＴｒＡＡＴＣＡ ＡＡＴＡＡＡｍ　ＡＴＴＴｒＧＡＴＩＴ　ＧＴｒＴｒＧＴＴＡＡ　ＴＧＴＡＴｒ ＴｒＣＴ　６O ＣＣＴＡＧＴｒＴ八Ａ　入ＧＴＣＧ＾ＴＧＴＧ　ＴへｍＡＴＡＴＪ、／、ＴＡＴ ｒｊ、ＧＴＡ；、τ；、：：、７）八　：、：２．７７品”F１．：　１２０ Ｔ八入＾Ｔ＾ａｃ八ＴＴｒ入Ｃ入入ＣＴ入λ　ＴＧＴＴ＾＾τＣＴｒ　ＴｒＧＴ Ｔ八Ｃ入Ａへ　ＴＧＴＩ’　４０４＋１０１２０１３０ ＋４０１５０１！；０ ＦＩＧ、ｌ　続き Ｃ丁ＣＧへ　−７２１ 八Ｃ＾八八τＣττ ＦＩＧ、６ ４０４Ｎ／ｌ　□ Ｆｔｇｕｒ＠　７ ＦＩＧ、　７Ａ　ＦＩＧ、　７Ｂ ＦＩＧ、　８Ａ 日数 ＦＩＧ、　８Ｂ ＦＩＧ、９ 補正書の翻訳文の提出書（特許法第１８４条の８）平成５年１０月８日 １、国際出願番号　ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０２８２２２、発明の名称　へりアン チコンの上流側調節要素に基づくキメラ植物遺伝子 ３、特許出願人 住　所　フランス国　６９２６３　リョン　リュ　ピエールベゼ　１４−２０ 名　称　ローン−ブーラン　アグロシミ代表者　追完 国　籍　フランス国 ４、代理人 住　所　東京都新宿区高田馬場３丁目２３番３号　ＯＲビル６、添付書類の目録 （１）補正書の翻訳文　１通 ７、前記以外の代理人 住　所　東京都新宿区高田馬場３丁目２３番３号　ＯＲビル電話　東京　５３３ ０−６０１１　（代表）臘ｍ里 １、　へりアンチコン遺伝子から分離された核酸であって、種子特異的遺伝子発 現、相持異的遺伝子発現、アブシジン１ｍ　（ＡＢＡ）応答性遺伝子発現及び時 期変化遺伝子発現の少なくとも１つを指示する少なくとも１つの調節要素を必須 としてなる核酸。

２、　相持異的遺伝子発現を指示する調節要素が、その制御が植物の根において 検出可能であるもとての遺伝子発現によって特徴付けされる請求の範囲第１項記 載の核酸。

３、ＡＢＡ応答性遺伝子発現を指示する調節要素が、その制御がＡＢＡで処理す る反応又はＡＢＡ生合成を導く状態において検出可能であるもとての遺伝子発現 によって特徴付けされる請求の範囲第１項記載の核酸。

４、　時期変化遺伝子発現を指示するｇＩＩｉ！５要素が、その制御が開花後４ 日程度の植物種子において検出可能であるもとての遺伝子発現により特徴付けさ れる請求のｉ！囲第１項記載の核酸。

５、　種子に特異的な遺伝子発現を指示する前記調節要素と、配列番号１の８５ １から２４０１のヌクレオチドを備えた請求の範囲第１項記載の核酸。

６、　根に特異的な遺伝子発現を指示する前記調節要素と、配列番号１の１から １６３９又は８５１から１６３９のヌクレオチドを備えた請求の範囲第１項又は 第２項１己載の核酸。

７、ＡＢＡ応答性遺伝子発現を指示する前記調節要素と、配列番号１の１から２ ４０１のヌクレオチド、配列番号１の８５１から１６３９のヌクレオチド、配列 番号１の１６３９から２３０３のヌクレオチド又は配列番号３の１から４０４の ヌクレオチドを備えた請求の範囲第１項又は第３項記載の核酸。

８、　時期変化遺伝子発現を指示する前記調節要素と、配列番号１の１から８５ １又は１６３９から２３０３のヌクレオチドを備えた請求の範囲第１項又は第４ 項記載の核酸。

９、　前記調節要素が、異種の遺伝子のコード化配列に調整可能に結合され、該 異積の遺伝子は該コード化配列からの生産物の遺伝子の前記発現を生じ、モして キメラ植物遺伝子を供給するものである請求の範囲第１項〜第８項の７ｓずれか １項の調節要素。

１０、　異種の遺伝子のフード化配列に操作可能に結合した５′フランキング領 域を備え、前記コード化配列が３″ポリアデニル化部位に操作可能に結合し、前 記５″フランキング領域が前記異種の遺伝子のコード化領域の種子特異的発現を 指示するへりアンチコン遺伝子からの調節要素を備えたキメラ植物遺伝子。

１１、　前記ｗＲｉ！５要素が配列番号１の８５１から２４０１のヌクレオチド よりなる請求の範囲第１０項記載のキメラ植物遺伝子。

１２、　植物内で作用するプロモーターをざらに鵞え、該プロモーターは前記コ ード化配列５′及び前記調節要素３″に操作可能に結合する請求の範囲第１０項 又は第１１項記載のキメラ植物遺伝子。

１３、ｎ記プロモーターが植物ウィルス又はカリフラワーモザイクウィルスプロ モーターである請求の範囲第１２項記載のキメラ植物遺伝子。

１４、　請求の範囲第９項〜第１３項のいずれか１項記載のキメラ植物遺伝子を 備えた接物形質転換ベクター。

１５、　請求の範囲第１０項又は第１１項記載のキメラ植物遺伝子を備えた植物 細胞。

１６、　請求の範囲第１５項記載の植物細胞から再生された植物又は該植物の後 代。

１７、　前記植物がワタ、タバコ、ナタネ、トウモロコシ又はダイズ植物である 請求の範囲第１６項記載の接物。

１８、　前記植物細胞がワタ、タバコ、ナタネ、トウモロコシ又はダイズ檀物細 胞である請求の範囲第１５項記載の植物細胞。

１９、＃Ｘ革剤に耐性を示す植物の生産のための方法であって、ａ）請求の範囲 第１４項の形質転換ベクターとともに植物細胞を形質転換し、及び ｂ）該形質転換した植物細胞から植物を再生することを備えた前記方法。

２０、　遺伝子導入種物を生産するための請求の範囲第１項〜第８項のいずれか １項記載の核酸の使用。

国際調査報告 一テーＪ・−二；’ＰＣＴ／ｌｌｓ９２１０２８２２フロントページの続き （７２）発明者　ホブ、　モリ− フランス国　６７０００　ストラスプール　リュ　デ　グラシュエール　２０ア

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．ヘリアンチニン遺伝子から分離された核酸であって、種子特異的遺伝子発現 、根特異的遺伝子発現、アブシジン酸（ＡＢＡ）応答性遺伝子発現及び時期変化 遺伝子発現の少なくとも１つを指示する少なくとも１つの調節要素を備えた核酸 。
2. ２．前記ヘリアンチニン遺伝子がＨａ２遺伝子、Ｈａ１０遺伝子、ＨａＧ３Ａ遺 伝子又はＨａＧ３Ｄ遺伝子から選択されたものである請求の範囲第１項記載の核 酸。
3. ３．前記調節要素がＨａ２遺伝子、Ｈａ１０遺伝子、ＨａＧ３Ａ遺伝子又はＨａ Ｇ３Ｄ遺伝子から選択されたものである請求の範囲第１項記載の核酸。
4. ４．種子特異的遺伝子発現を指示する調節要素が、その制御が種子において検出 可能であるもとでの遺伝子の発現によって特徴付けされる請求の範囲第１項、第 ２項又は第３項記載の核酸。
5. ５．根特異的遺伝子発現を指示する調節要素が、その制御が植物の根において検 出可能であるもとでの遺伝子の発現によって特徴付けされる請求の範囲第１項、 第２項又は第３項記載の核酸。
6. ６．ＡＢＡ応答性遺伝子発現を指示する調節要素が、その制御がＡＢＡで処理す る反応又はＡＢＡ生合成を導く状態において検出可能であるもとでの遺伝子の発 現によって特徴付けされる請求の範囲第１項、第２項又は第３項記載の核酸。
7. ７．時期変化遺伝子発現を指示する調節要素が、その制御が開花後４日程度の植 物種子において検出可能であるもとでの遺伝子の発現によって特徴付けされる請 求の範囲第１項、第２項又は第３項記載の核酸。
8. ８．種子特異的遺伝子発現を指示する前記調節要素と、配列番号１の１から２４ ０１又は８５１から２４０１のヌクレオチドを備えた請求の範囲第１項又は第４ 項記載の核酸。
9. ９．根特異的遺伝子発現を指示する前記調節要素と、配列番号１の１から１６３ ９又は８５１から１６３９のヌクレオチドを備えた請求の範囲第１項又は第５項 記載の核酸。
10. １０．ＡＢＡ応答性遺伝子発現を指示する前記調節要素と、配列番号１の１から ２４０１のヌクレオチド、配列番号１の８５１から１６３９のヌクレオチド、配 列番号１の１６３９から２３０３のヌクレオチド又は配列番号３の１から４０４ のヌクレオチドを備えた請求の範囲第１項又は第６項記載の核酸。
11. １１．時期変化遺伝子発現を指示する前記調節要素と、配列番号１の１から８５ １又は１６３９から２３０３のヌクレオチドを備えた請求の範囲第１項又は第７ 項記載の核酸。
12. １２．前記調節要素が、異種の遺伝子のコード化配列に調整可能に結合され、該 異種の遺伝子は該コード化配列からの生産物の遺伝子の前記発現を生じ、そして キメラ植物遺伝子を供給するものである請求の範囲第１項〜第１１項のいずれか １項記載の調節物。
13. １３．植物中で機能させることができるプロモーターの十分な部分と、前記コー ド化配列に操作可能に結合され、前記異種の遺伝子の発現に有効な前記調節要素 を備えた請求の範囲第１２項記載のキメラ植物遺伝子。
14. １４．前記プロモーターが種物ウィルスプロモーター又はカリフラワーモザイク ウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターである請求の範囲第２５項記載のキメ ラ植物遺伝子。
15. １５．前記プロモーターがＣＡＡＴとＴＡＴＡ配列を備えるＣａＭＶ３５Ｓプロ モータである請求の範囲第１４項記載のキメラ植物遺伝子。
16. １６．前記異種の遺伝子が、脂質代謝酵素をエンコードする遺伝子、デサチュラ ーゼ、除草剤耐性遺伝子、グリホサート耐性遺伝子又は５′エノールビルポイル シキミ酸−３−リン酸合成酵素をエンコードする遺伝子、アセトラクターゼ合成 酵素、又はアセトヒドロキシ酸合成酵素である請求の範囲第１２項記載のキメラ 植物遺伝子。
17. １７．前記グリフォセート耐性遺伝子がａｒｏＡである請求の範囲第１６項記載 のキメラ植物遺伝子。
18. １８．ｐＲＰＡ−ＭＬ−８０３のキメラ植物遺伝子を備えた請求の範囲第１７項 記載のキメラ植物遺伝子。
19. １９．請求の範囲第１２項〜第１８項のいずれか１項記載のキメラ植物遺伝子を 備えた植物形質転換ベクター。
20. ２０．請求の範囲第１９項記載の植物形質転換ベクターを備えた植物細胞。
21. ２１．請求の範囲第２０項の植物細胞から再生された植物又は該植物の後代。
22. ２２．前記植物がワタ、タバコ、ナタネ、トウモロコシ又はダイズ植物である請 求項２１記載の植物。
23. ２３．前記植物細胞がワタ、タバコ、ナタネ、トウモロコシ又はダイズ植物細胞 である請求項２０記載の植物細胞。
24. ２４．種子油脂の品質を改善する植物の生産のための方法であって、ａ）請求の 範囲第１９項の形質転換ベクターとともに植物細胞を形質転換し；及び ｂ）該形質転換した植物細胞から種子油脂の品質を改善する前記植物を再生する ことを備えた前記方法。
25. ２５．除草剤に耐性を示す植物の生産のための方法であって、ａ）請求の範囲第 １９項の形質転換ベクターとともに植物細胞を形質転換し；及び ｂ）該形質転換した植物細胞から植物を再生することを備えた前記方法。
26. ２６．遺伝子導入植物を生産するための請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか １項記載の調節要素の使用。
27. ２７．遺伝子導入植物を生産するための請求の範囲第１項〜第１１項のいずれか １項記載の核酸の使用。