UA44217C2 - Виділена молекула нуклеїнової кислоти (варіанти), химерний рослинний ген (варіанти), трансформуючий рослину вектор (варіанти), рослинна клітина (варіанти), спосіб одержання рослини, що проявляє стійкість до гербіциду (варіанти) - Google Patents
Виділена молекула нуклеїнової кислоти (варіанти), химерний рослинний ген (варіанти), трансформуючий рослину вектор (варіанти), рослинна клітина (варіанти), спосіб одержання рослини, що проявляє стійкість до гербіциду (варіанти) Download PDFInfo
- Publication number
- UA44217C2 UA44217C2 UA93003973A UA93003973A UA44217C2 UA 44217 C2 UA44217 C2 UA 44217C2 UA 93003973 A UA93003973 A UA 93003973A UA 93003973 A UA93003973 A UA 93003973A UA 44217 C2 UA44217 C2 UA 44217C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- gene
- plant
- specified
- fact
- promoter
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 171
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 17
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 title claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 4
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 title 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 160
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 121
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 75
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 43
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 30
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 claims description 25
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 16
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 9
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 8
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 7
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims description 6
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 claims description 6
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 6
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 5
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 5
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 claims 4
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 claims 4
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 claims 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims 4
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 claims 1
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N (+)-Abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 abstract description 118
- FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N desoxyabscisic acid Natural products OC(=O)C=C(C)C=CC1C(C)=CC(=O)CC1(C)C FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 59
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 40
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 abstract description 9
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 6
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 abstract description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 abstract description 3
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 abstract 1
- 101000736922 Prunus dulcis Prunin 1 Pru du 6 Proteins 0.000 abstract 1
- 101000736893 Prunus dulcis Prunin 1 Pru du 6.0101 Proteins 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 67
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 37
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 26
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 10
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 10
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 9
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 7
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 7
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 7
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 7
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 4
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 4
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 4
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 4
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000008117 seed development Effects 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 3
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 3
- 244000004005 Nypa fruticans Species 0.000 description 3
- 235000005305 Nypa fruticans Nutrition 0.000 description 3
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 208000032763 autosomal recessive 11 intellectual disability Diseases 0.000 description 2
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 108010083391 glycinin Proteins 0.000 description 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 2
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 235000020238 sunflower seed Nutrition 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- JLIDBLDQVAYHNE-LXGGSRJLSA-N 2-cis-abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\C1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-LXGGSRJLSA-N 0.000 description 1
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical class O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHJFFLKPAYHPHU-BYNIDDHOSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glucuronide Chemical compound O1[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 DHJFFLKPAYHPHU-BYNIDDHOSA-N 0.000 description 1
- 108091005721 ABA receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 101100025824 Caenorhabditis elegans nas-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 1
- 101710190853 Cruciferin Proteins 0.000 description 1
- 244000182691 Echinochloa frumentacea Species 0.000 description 1
- 235000008247 Echinochloa frumentacea Nutrition 0.000 description 1
- 240000001624 Espostoa lanata Species 0.000 description 1
- 235000009161 Espostoa lanata Nutrition 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010073032 Grain Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108700005084 Multigene Family Proteins 0.000 description 1
- 101100372509 Mus musculus Vat1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710202365 Napin Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100165358 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) BIO5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010016634 Seed Storage Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 201000003740 cowpox Diseases 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000010254 physiological adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000025508 response to water Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- STZCRXQWRGQSJD-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzenesulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 STZCRXQWRGQSJD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- -1 storage proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
- C12N15/8227—Root-specific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
- C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8237—Externally regulated expression systems
- C12N15/8238—Externally regulated expression systems chemically inducible, e.g. tetracycline
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Botany (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Регуляторні елементи, що походять від генів геліантиніну, здатні регулювати експресію специфічних генів у трансгенних рослинах. На основі таких елементів була одержана молекула нуклеїнової кислоти. Були одержані також химерні гени рослин з 5'-регуляторними зонами гена геліантиніну, а також вектори трансформації рослин, які містять регуляторні гени згідно з винаходом, що пропонується, і рослинні клітини, трансформовані згаданими векторами. Запропоновано способи одержання рослин, що відзначаються стійкістю до дії гербіциду.
Description
Гелиантини представляет собой запасной белок семян подсолнечника. Настоящее изобретение относится к
Б!-регуляторньм областям генов гелиантинина. Болеє конкретно, настоящеє изобретениє относится к специфическим цис-регуляторньм злементам указанной регуляторной области, которье управляют тканеспецифическои, регулируемой во времени, или восприийимчивой к воздействию абсцизовой кислоть зкспрессией генов. Настоящее изобретение относится к химерньім генам, включающим в себя цис-регуляторнье злементьі, сцепленнье с кодирующей последовательностью гетерологичного гена для регуляции зкспрессий зтих генов. Химернье геньї настоящего изобретения могут бьть использованьї для сообщения трансгенньім растениям резистентности к гербицидам и улучшения качества липидов семян.
Развитие семян, специфическое для вьісших растений, включаеєт в себя змбриональное развитие и процессь физиологической адаптации, которье опроисходят в семенах, обеспечивая тем самьм вьживаемость развивающихся саженцев после их прорастания. После оплодотворения наблюдаются бьстрьй рост и дифференциация зародьша и зндосперма, после чего во время периода созревания в процессе развития семян начинают откладьваться запасьі питательньїх веществ. Зти запасьь сохраняются в течение периода блока развития для более позднего их использования развивающимися проростками. Зтот период блока развития продолжаеєтся до фазь! десикации развития семян.
В течение змбриогенеза аккумулируются белки зерна нескольких классов, включая запасньсе белки, лектинь и ингибиторь! трипсина. Основная функция запасньїх белков семян заключаєтся в их аккумуляции во время змбриогенеза и сохранениє запасов углерода и азота для развивающихся саженцев после их прорастания. Зтим белкам, а также генам, кодирующим зти белки, били посвящень!ї многочисленнье исследования (см., например,
Зпоїмеї! и др. (1989) в Те Віоспетівігу ої Ріапів, 15, Асадетіс Ргевв, МУ, 297.
Геньї, коюдирующие запасньсе белки семян, являются в вьісокой степени регулируемьми и дифференциально зкспрессируемьми в процессе развития семян. Зта зкспрессия является регулируемой во времени мРНК, бьістро аккумулирующейся во время фазьі созревания змбриогенеза. Указанная зкспрессия также является тканеспецифической и происходит, главньм образом, в семядоле или зндосперме развивающихся семян.
Образующиеся запаснье белки процессируются и направляются в белковье тельца, в которьїх зти запаснье остаются в течениеє периода десикации и покоя зародьша. После прорастания проростки используют зти запасньсе белки, как источник углерода и азота (Ніддіп5 (1984) Апп. Неу. Ріапі. Рпузіої, 35, 191).
Белки семян, включая, запасньюе белки, лектиньї и ингибиторь! трипсина, кодируются негомологичньїми мультигенньми семействами, которне не амплифицируются или структурно изменяются в процессе развития (см., Соідрега и др., (1989) Сеї! 56, 149). Зти геньї являются регулируемьми пространственно и во времени, но они необязательно являются связанньми. Хотя посттранскрипционнье механизмь! направлень на регуляцию аккумулирования некоторьїх из озтих белков, однако регуляция происходит, главньм образом, на транскрипционном уровне. В соответствии с зтим, геньї белков семян представляют собой прекрасную систему для "поставки" генетических регуляторних злементов, особенно тех озлементов, которье сообщают тканеспецифичность, временную регуляцию и восприимчивость к воздействию окружающей средь и химических соединений.
Наблюдения временной и пространственной регуляции генов белков семян позволяют предположить, что зти геньї регулируются отчасти общими клеточньмми факторами, известньіми как трансактивирующие факторнь!.
Однако, поскольку характер зкспрессии генов белка семян имеет качественное и количественное отличие для каждого отдельного гена, то для обеспечения способов осуществления дифференциальной зкспрессии для каждой конкретной группь! белков семян, очевидно, должнь! также существовать более специфические факторь!.
Типьї дифференциальной зкспрессии наблюдались для мажорньх запасньїх белков семян рапса, круциферина и напина (см. Стоисі и др., (1981) Ріапіа 153, 64; РіпКеївієїп и др., (1985) Ріапі РНузіо!. 78, 630) и для отдельньмх членов генного семейства соевого ингибитора трипсина Кипії: (ТоїШКіє и др., (1989) Ріапі СеїЇ, 1, 1079).
Сравнениеє генов мажорного запасного белка семян сои вьявило различие в тайминге и клеточной типоспецифичности зкспрессии В-конглицина (75) и глицинина (115). мРНК субьединиць! 75 появлялась за несколько дней до мРНК 115. Кроме того, членьі генного семейства глицинина все активировались одновременно (Мієївеп и др. (1989) Ріапі СеїЇ, І, 313), тогда как членьі генного семейства р-конглицина регулировались дифференциально (Ваїкег и др., (1988) Ргос. Маїе. Асай. Зевї. ОБА 85, 458; Спеп и др., (1989) ЮОєу.
С»епеї. 10, 112). Каждьй из зтих генов содержит ряд цис-регуляторньїх злементов, которне сообщают типь! дифференциальной зкспрессии различньїм генньім семействам или генам внутри данного семейства.
Гелиантинин является мажорньм запасньм белком семян (глобулином 115) подсолнечника (Неїїапіпизаппив). Аналогично другим запасньм белкам семян, зкспрессия гелиантинина является тканеспецифической и находится под зволюционньім контролем. Однако регуляторнье злементь! гелиантинина, которне сообщают такую специфичность, до настоящего времени не бьли идентифицированьі. Сначала бьла обнаружена мРНК гелиантинина в зародьшах через семь дней после цветения (ДПЦ) , причем максимальньй уровень мРНК достигался на стадии 12-15 ДПЦ, после чего зтот уровень транскриптов гелиантинина начинал падать. В зрельхх семенах или в проростках, транскрипть! гелиантинина отсутствовали. От 7 до 19 ДПЦ, накопление полипептида гелиантинина происходило бистро, но затем замедлялось, как только семена достигали стадии созревания (Аїеп и др., (1985) Ріапі Мої. Віо!. 5, 165).
Как и большинство запасньїх белков, гелиантинин кодируется небольшим генньім семейством. Известнь, по крайней мере, два различньїх подсемейства, которне обозначаются Наг и На10. Бьіли вьіделеньі и частично охарактеризовань!ї два клона Насі3-А и Найіз-І, представляющих неаллельньсе члень! подсемейства На?2 (Мопаег
Нааг и др., (1988), Сепе, 74, 433). Однако детального анализа регуляторних злементов зтих или любьх других генов гелиантинина до сих пор не бьіло проведено.
В соответствии с настоящим изобретением бьло обнаружено, что регуляторнье злементь, происходящие от генов гелиантинина, могут управлять семя-специфической зкспрессией гена, корнеспецифической зкспрессией гена, зкспрессией гена, восприимчивой к воздействию абсцизовой кислотьї, и/или меняющейся во времени зкспрессией гена. Зти регуляторнье злементь! способньії регулировать зкспрессию специфических генньх продуктов в трансгенньїх растениях. Таким образом, настоящее изобретение позволяєт осуществлять более вьісокую степень регулирования зкспрессии генов в трансгенньїх растениях и тем самьм даєт возможность получать семена более вьісокого качества и с более вьісокой устойчивостью к условиям окружающей средь,, например, таким, как засуха, а также осуществлять более вьісокий контроль генов устойчивости к гербицидам.
Настоящее изобретение относится к 5'-регуляторной области гена гелиантинина. В настоящем описаний, зта область будет иметь название "5 -концевой регуляторньй ансамбль" (ШАЕ) и будет использована для регулирования зкспрессии гетерологических белков. ШАЕ включает в себя несколько регуляторних злементов, которне сообщают различнье типьї регулируемой зкспрессии гетерологичньм генам, зкспрессируемьм в трансгенньх растениях, при связьіваний зтих злементов с кодирующими областями зтих генов.
Более конкретно, настоящеє изобретение относится к вьіделенньм ДНК, содержащим регуляторнье злементьі гелиантияина, которье способньі регулировать семя-специфическую зкспрессию гена, корне- специфическую зкспрессию гена, зкспрессию гена; восприимчивую к воздействию абцизовой кислоть! (АВА); и/или меняющуюся во времени зкспрессию гена.
В другом своем варианте настоящееє изобретение относится к химерньм генам растений, содержащих указаннье регуляторнье злементь. Зти регуляторнье злементьіь являются соответствующим образом связанньми с кодирующей последовательностью гетерологичного гена таким образом, что указанньій злемент способен регулировать зкспрессию продукта, кодированного гетерологичньм геном. Если необходимо, в конструкции химерньїх генов могут бьїть включень! дополнительнье промоторнье злементь или части зтих злементов. В обьем настоящего изобретения также входят векторьї трансформации растений, включающие в себя химернье геньі настоящего изобретения; растительнье клетки, трансформированнье зтими векторами; и растения и их потомство, содержащие указаннье химерньє гень!.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу продуцирования растения, обладающего более вьсоким качеством семенньх липидов. В соответствии с настоящим изобретением, сконструированнье химерньсе геньї, содержащие регуляторньйй злемент, которьій способен регулировать семя- специфическую зкспрессию, связан с кодирующей областью гена, которая кодирует фермент липидного метаболизма. Если растительнье клетки трансформировать зтим химерньм геном, то могут бьть регенерировань! растения с улучшенньїм качеством липидов семян.
В еще одном своем варианте, настоящее изобретение относится к способу продуцирования растений, обладающих резистентностью Кк сгербицидам. Например, в соответствии с настоящим изобретением, конструируются химерньсе геньї, в которьїх корне-специфический регуляторний злемент управляет зкспрессией гербицид-резистентного гена. Позтому с помощью растительньх клеток, трансформированньїх указанньм химерньм геном, могут бьіть регенерировань! растения, обладающие устойчивостью к гербицидам.
На рис. | изображена нуклеотидная последовательность ОНВЕ гена Насй3-А гелиантинина. Номера нуклеотидов от -2377 до -24 на рис. | соответствуют номерам нуклеотидов 1 -2401 последовательности, показанной в 5ЕО ІЮ Ме І.
На рис. 2 изображена нуклеотидная последовательность части ШАЕ гена Нас3-О гелиантинина. Номера нуклеотидов -2457 до -726 на рис. 2 соответствуют номерам нуклеотидов последовательности, показанной в ЗЕО
Мо 2.
На рис. З представлена нуклеотидная последовательность части ОАЕ гена Насй3-О гелиантинина. Номера нуклеотидов от -725 до -322 на рис. З соответствуют номерам нуклеотидов от Ї до 404 последовательности, показанной в 5ЕО 10 Мо 3. В гене Нас3-О нуклеотидная последовательность, изображенная на рис. 3, находится непосредственно ниже ("вниз по течению") последовательности, изображенной на рис. 2.
На рис. 4 показань РІ /5И05-конструкция НасйіЗ3-А и контрольньсе конструкции рВІгІ.І и рРВІО.1.
На рис. 5 представлень рестрикционная. карта геномньхх клонов Нас3З-А и На(с3-О0) гелиантинина и рестрикционнье фрагменть, используемьсе для конструирования родительских плазмид.
На рис. 6 изображень конструкции НасйіЗ-А и Нас3-О), которне являются дериватизированньми по отношению к конструкции с полной длиной.
На рис. 7 проиллюстрирована гистохимическая локализация йИ5-активности в трансгенньїх проростках, содержащих конструкции Насі3-0О-М и Насі-А-58/А А: Нас3і-0-404М, 8 дней после набухания (ДПН); В: Нас3-А-
ЗВ/А, 8 ДПН; С: Насзі-0-404 М, 14 ОРІ; 0: НасіЗ-А-58/А, 14 ДПН; Е: Насі-А-58-Н; 8 ДПН; Е: НасіЗз-А-58/НА, 6 ДПН.
На рис. 8 графически проиллюстрировано индуцирование СИ5-активности в листьях трансгенного табака, содержащих конструкцию Насі3-0-404М, в течение прогрессирующей десикации, с последующей компенсацией недостатка водь.
На рис. 9 графически проиллюстрировано АВА-индуцирование (3И5-зкспрессии в листьях табака, содержащих Насі-0-404М.
В настоящем описаний раскрьваются цис-регуляторнье злементь! 5'-концевого регуляторного "ансамбля" (ОАЕ) генов гелиантинина подсолнечника. Зти цис-регуляторнье злементь! являются дискретньми областями
ОАЕ, под контролем которьїх происходит регулируемая зкспрессия гена. В частности, настоящее изобретение относится к вьіделенной нуклеиновой кислоте, содержащей, по крайней мере, один регуляторньій злемент, происходящий от гена гелиантинина, и регулирующий, по крайней мере, одну из следующих зкспрессии гена: семя-специфическую зкспрессию, корне-специфическую зкспрессию, АВА-восприимчивую зкспрессию, или изменяющуюся со временем зкспрессию гена. Указаннье регуляторнье злементь! могут происходить от любого гена гелиантинина, например, от генов Наг2 и На1ї0, которье являются представителями двух разнькх подсемейств генов гелиантинина. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения такими генами гелиантинина являются Насі3-А и Насі3-О-геньї, которне являются членами подсемейства Наг.
Один из рассматриваємьхх регуляторних злементов контролирует семя-специфическую зкспрессию. Семя- специфический регуляторньй злемент представляет собой конкретную нуклеотидную последовательность, способную вьізьявать зкспрессию гена под своим контролем, которая имеет место в зерне, то есть, зкспрессию гена, обнаруживаемую в зерне. Семя-специфическая зкспрессия может происходить в любой части зерна, например, в семядолях и змбрионньїх стволах зародьша и в зндосперме. Однако зта зкспрессия гена не наблюдается в проростках или соматических тканях зрелого растения для генов под семя-специфическим контролем.
Для идентификации регуляторних злементов, управляющих семя-специфической зкспрессией, может бьіть осуществлен делеционньй анализ полного ОАЕ гена гелиантинина. В делеционном анализе нуклеотядь последовательно удаляют из полного ШВАВЕ, и полученнье фрагментьь лигируют с кодирующей последовательностью гена- "репортера" или другого гетерологичного гена. Затем конструкции анализируют на их способность к регулированию семя-специфической зкспрессии путем обнаружения присутствия продукта репортерного гена в тканях семян, но не в других тканях. Семя-специфичнье злементь!, которье бьли идентифицировань, могут бьіть также модифицировань, например, с помощью сайт-направленного мутагенеза.
Зти модифицированнье регуляторнье злементь! могут бьіть затем проанализированьі на их способность к регулированию семя-специфической зкспрессии, что позволяет идентифицировать альтернативнье последовательности, несущие семя-специфичность. Описанная техника идентификации регуляторних злементов может бьіть применена ко всем генам гелиантинина. Например, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, анализ ШОАЕ гена Насйх3і-А гелиантинина показал, что семя-специфические регуляторнье злементь! определяются нуклеотидами 851 - 2401 и нуклеотидами І - 2401 в последовательности
ЗЕОІЮ Ме 1.
Другие регуляторнье злементьі настоящего изобретения управляют корне-специфической зкспрессией.
Корне-специфическая зкспрессия представляет особьй интерес и важность. Обьчно ген гелиантинина подсолнечника зкспрессируется только в семенах. При вьіделений конкретньїх областей ОВЕ гелиантинина из полного ШАЕ в соответствии с настоящим изобретением, зкспрессия локализуется исключительно в корнях растений. Корне-пецифический регуляторний злемент представляет собой конкретную нуклеотидную последовательность, обладающую способностью вьізьшвать зкспрессию гена под своим контролем, которая имеет место лишь в корнях растения, но не в других тканях растения. Регуляторнье злементьі), управляющие корне-специфической зкспрессией, могут бьть идентифицированьй путем анализа фрагментов ШВЕ гелиантинина на их способность сообщать корне-специфическую зкспрессию, которьй осуществляют способом,аналогичньмм описанному вьіше для идентификации семя-специфических регуляторньїх злементов за исключением того, что указанная зкспрессия обнаруживаєтся в тканях корней растений. Модификации нуклеотидньїх последовательностей, которье стимулируют корне-специфическую зкспрессию могут бьіть также идентифицировань,как описано вьіше. С помощью указанной техники могут бьіть идентифицировань! корне- слецифические регуляторнье злементьі, происходящие от любого гена сгелиантинина. Например, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, анализ ОВЕ гена Насі3-А гелиантинина показьшаєт, что корне-специфическиє регуляторяве злементьї представлень нуклеотидами ! - 1639 и нуклеотидами 831 - 1639 в 5ЕО ІО Мо1.
Зкспрессия гелиантинина происходит под строгим временньм контролем с участием мРНК, впервье обнаруживаемой на 12 ДПЦ. В соответствии с отим, бьіло обнаружено, что существуют цис-регуляторнье злементьі, сособщающие изменяющуюся во времени зкспрессию гена, обнаруживаеємую уже примерно на 4 день после цветения (ДПЦ).
Для идентификации регуляторних злементов, сообщающих временную зкспрессию гена, может бьть осуществлен делеционньй анализ всегоШАЕ гена гелиантинина. Фрагменть ОАЕ связьшают с кодирующей последовательностью гетерологичного гена, и полученную химерную конструкцию используют для трансформации растений. Семена от трансформированньїх растений вьіращивают до определенньїх стадий после цветения (дни после цветения, ДПЦ), после чего зти семена анализируют на обнаружение зкспрессий гетерологичного гена. Злементьі, регулирующие зкспрессию гетерологичного гена примерно до 10 ДПЦ, бьіли идентифицировань как злементь, вьзьвающие меняющуюся ово времени зкспрессию. Модификации нуклеотидньїх последовательностей таких злементов, сообщающих нужньй фенотип, могут бьть идентифицированьі, как описано вьіше. Указанная техника идентификации регуляторньїх злементов, которье сообщают изменяющуюся во времени зкспрессию гена, может бьіть применена ко всем генам гелиантинина. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, анализ ОАЕ гена Насі3-А гелиантинина показьівает, что злементьі, регулирующие временную зкспрессию гена, представлень! нуклеотидами І! - 851 и 1639 - 2303 в БЕО ІЮ Ме 1.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к областям ШАЕ гелиантинина, которье стимулируют зкспрессию гена, восприимчивую к воздействию абсцизовой кислоть! (АВА). АВА-восприимчивьй злемент представляєт собой конкретную нуклеотидную последовательность, которая способна вьзьвать зкспрессию гена под своим контролем в ответ на воздействие АВА. Зкспрессия гена под контролем АВА- восприимчивого злемента может бьть индуцирована путем обработки абсцизовой кислотой (АВА), или внешними раздражителями, которье известньі как стимуляторьї АВА-биосинтеза. Например, АВА-биосинтез инициируєется в результате спада тургора, вьізванного стрессами, обусловленньми состоянием окружающей средьі, например, недостатком водь, водньіми стрессами, и стрессами, вьізванньіми засолением субстрата (см., 7еемаїї и др., (1988) Аппи. ВНем.Ріапі Рпизвіоі!. 39, 439). Уровни АВА также возрастают в ответ на скарификацию (Репа, Сопез и др., (1989) Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 86, 9851). АВА - восприимчивье злементь! идентифицируют, как описано вьіше, для идентификации других регуляторних злементов. Например, для идентификации нуклеотидньїх последовательностей любого гена гелиантинина, которне индуцируют зкспрессию гена под своим контролем в ответ на воздействие АВА, может бьіть использован делеционньй анализ. Зти последовательности могут бьть модифицировань, как описано вьше, а затем проанализировань для идентификации альтернативньхх последовательностей, индуцирующих АВА - восприимчивую зкспрессию. В одном из предпочтительньїх вариантов осуществления настоящего изобретения, анализ ОВЕ гена Нас3-А гелиантинина показал, что злемент, ответственньй за АВА - восприимчивую зкспрессию в семенах, представлен нуклеотидами
І- 2401 в 5ЕО ІЮО Мо 1. В другом из предпочтительньїх вариантов осуществления настоящего изобретения бьіло установлено, что злемент, индуцирующий АВА - восприимчикую зкспрессию в листьях зрелого растения, соответствует нуклеотидам 851 -1639 или 1639 - 2303 в 5ЕО ІО Мо 1. В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения анализ ОНЕ гена Нас3-О гелиантинина показал, что нуклеотидь 1-404 последовательности 5ЕО ІЮ Ме З, соответствуют области, индуцирующей АВА - восприимчивую зкспрессию в незмбрионньх тканях растений.
В соответствии с вьішеуказанньм, ценность АВА - восприийимчивьїх злементов заключается в том, что специфические условия окружающей средь могут инициировать АВА-биосинтез, и тем самьм индуцировать зкспрессию генов под контролем АВА-восприимчивьїх злементов. Зкспрессия гетерологичньїх генов под кон- тролем АВА - восприимчивьїх злементов ОАЕ гелиантинина не ограничивается лишь семенами, но также наблюдаєется в листьях зрельїх растений и в тканях проростков.
Вьіделенная нуклеиновая кислота, кодирующая 5'-концевой регуляторньй ансамбль гена гелиантинина, может бьть получена следующим образом. Рекомбинантнье геномнье клонь! гелиантинина вьіделяют путем скрининга сгеномной ДНК-библиотеки подсолнечника с рекомбинантной кДНК, представлящей мРНК гелиантинина (Мопдег Нааз (1988) Сепе 74, 433). Для получения геномньїх рекомбинантньїх ДНК гелиантинина могут бьіть использовань! методьі, описаннье Затрбгоок и др. (1989) в "МоІесшаг Сіопіпд: А І арогаїогу Мапаиаї,
Соїіа бріїпд Наїбог, МУ, либо в любом из многочисленньїх руководств по технике рекомбинантньїх ДНК, которье имеются в настоящееє время. Для определения нуклеотидньїх последовательностей существует множество способов, хорошо известньх каждому специалисту в зтой области. Например, рестрикционнье фрагментьї, содержащие ШНЕ гелиантинина, могут бьіть субклонировань! в сайт полилинкера секвенирущего вектора, такого, как рВіпезсгірі (Бігаїадепе). Зти рВійезсіірі -субклонь! могут бьіть затем секвенированьї с помощью двухнитевого дидезокси метода (Спеп ибеерига (1985) ОМА, 4, 165).
Нуклеотидная последовательность для ДНК, кодирующей ОНЕ клона гена Насі3-А гелиантинина, показана на рис. І. и представлена как 5ЕО ІЮ Мо 1 (см. ниже). Аналогично, нуклеотидная последовательность для ДНК, кодирующей область ОНЕ клона НасзЗі гелиантинина, показана на рис. 2, и представлена ниже как нуклеотидная последовательность 5ЕО ІЮО Ме 2. ОАЕ других генов гелиантинина могут бьіть полученьі! аналогичньім образом.
Альтернативно, клоньї, представляющие другие члень! семейства генов гелиантинина,могут бьіть получень с использованием кодирующих НасйзЗА - или Найшз3зО - последовательностей или ОАЕ - последовательностей настоящего изобретения в качестве гибридизационньх зондов для скрининга геномной библиотеки гелиантинина и идентификации дополнительньх генов гелиантинина.
Идентификация цис-регуляторньїх последовательностей, которьне осуществляют временную, тканеспецифическую и АВА-чувствительную регуляцию, может бьіть осуществлена путем транскрипционного лигирования специфических последовательностей с кодирующей последовательностью гетерологичного гена, последующего переноса химерного гена в подходящего хозяина, и обнаружения зкспрессии гетерологичного гена. Вьібор анализа для обнаружения зкспрессии зависит от природьі гетерологичной последовательности.
Например, для оценки транскрипционной и трансляционной компетенции химерньх конструкций обьічно используют репортернье геньі, идентифицированнье с помощью хлорамфениколацетилтрансферазь и вД- глюкуронидазь! (405). Имеются также стандартнье анализь! для чувствительного обнаружения репортерного фермента в трансгенном организме. Ген рВ-глюкуронидазьї может бьїть использован в качестве "поставщика" (репортера) промоторной активности в трансгенньїх растениях табака вследствие вьісокой стабильности зтого фермента в клетках табака, недостатка ВД-глюкуронидазной активности в вьісших растениях и доступности качественного флуориметрического анализа и гистохимической техники локализации. ТепПегзоп и др., (1987),
ЕМВО ТТ, 6, 3901)) разработали стандартнье процедурь! для биохимического и гистологического обнаружения
С2О5 -активности в тканях растений. Биохимический анализ осуществляют путем смешивания лизатов растительной ткани с 4-метилумбел-лиферил- В-О-глюкуронидом, флуориметрическим субстратом для (05, инкубирования при 37" С в течение одного часа, и последущего измерения флуоресценции полученного 4 - метилумбеллиферона. Гистохимическую локализацию для (505-активности определяют путем инкубации образцов ткани растений в 5-бромо-4-хлоро-З-индолил-глюкурониде (Х-Сі0с) в течение 18 часов при 37 С с последующим наблюдением характера окрашивания Х-Сійс. Конструирование таких химерньїх генов позволяет определить специфические регуляторньіе последовательности, необходимье для регулирования зкспрессии, и дает возможность проиллюстрировать тот факт, что зти последовательности могут регулировать зкспрессию гетерологических генов анализируемьм способом.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к химерному гену растения, содержащему регуляторний злемент от гена гелиантинина, индуцирующий семя-специфическую зкспрессию гена, корне- специфическую зкспрессию гена, АВА-восприимчивую зкспрессию гена или временную зкспрессию гена; причем, указанньійй химерньй ген лигируют с кодирующей последовательностью гетерологичного гена так, чтобь регуляторньїйй злемент бьіл способен регулировать зкспрессию продукта, кодированного гетерологичньїм геном.
Таким гетерологичньїм геном может бьіть любой ген, не являющийся геном гелиантинина. Если необходимо, то в химернье конструкции могут бьїть включень! дополнительнье промоторньсе злементь или части зтих злементов, достаточнье для индуцирования зкспрессии, которая приводит к продуцированию зффективного количества полипептида, кодированного гетерологичньїм геном.
В соответствии с вьішеуказанньм, настоящее изобретение относится к химерньм генам, содержащим области ОАЕ гелиан-тинина, которьій индуцирует семя-слецифическую зкспрессию в соответствии с настоящим изобретением, и которьій связан с последовательностью, кодирующей фермент липидного метаболизма, такой, как десатураза. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, области ВЕ соответствуют нуклеотидам 851 - 2401 или І - 2401 Нас3, как показано в 5ЗЕО ІО Ме 1. В настоящеєе изобретение может бьть включена любая модификация, стимулирующая семя-специфическую зкспрессию, семена аккумулируют и хранят белки и липидьї, которне имеют важное агрономическое значение. Поскольку злементь!
ОАЕ гелиантинина могут индуцировать в вьісокой степени регулируемую зкспрессию в развивающихся семенах, то зти злементь! могут бить использованьі для повьішения качества липида и/или белка зерна. Зти злементь! могут бьіть использовань! для регулирования зкспрессии генов, кодирующих ферменть! липидного метаболизма, такие, которне участвуют в злонгации и десатурации жирньх кислот, и/или белков, особенно белков с вьісоким содержанием лизина и метионина. Химерньсєе геньі, содержащие указаннье злементь, могут бьіть использовань! для получения линий трансгенньїх растений, которне аккумулируют и хранят значительнье количества липидов и/или белков определенньх классов.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к химерньім генам, содержащим область ОВЕ гелиантинина, которая индуцирует корне-специфическую зкспрессию, и которая присоединена к гетерологичному гену. Зта конструкция индуцирует зкспрессию, которая пространственно отличается от "нормальной" зкспрессии гелиантинина тем, что указанньй гетерологичньй ген зкспрессируется исключительно в корнях растений.
Другими словами, если специфическую последовательность удалить из полного регуляторного ансамбля ВЕ, то в ткане-специфической регуляции произойдет изменение. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ОВЕ-область Насі3-А соответствуеєет нуклеотидам І - 1639 или 851 -1639 в ЗЕОІЮО Ме1, и присоединена к промотору в обратной ориентации, хотя зти злементьї функционируют в любой ориентации. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, последовательность, ссобщающая растению резистентность к гербицидам, представляет, по крайней мере, часть гена агоА. В обьем настоящего изобретения входит любая модификация зтих последовательностей, которая индуцирует корне-специфическую зкспрессию.
Особьй интерес представляют химернье конструкции, сособщающие растению резистентность к гербицидам.
Поскольку большинство гербицидов оказьвают свое токсическое воздействие не только на сорняки, но и на культурнье растения, то получение устойчивьїх к гербицидам растений имеет особо важное значение в агротехнике, поскольку оно позволяет использовать гербицидьії широкого спектра. В соответствии с зтим, настоящее изобретение относится к химерньм генам, содержащим злементьй ОАЕ гелиантинина, которье индуцируют корне-специфическую зкспрессию и которье соединеньі, по крайней мере, с частью промотора, функционирующего в растениях, а также соединень, по крайней мере, с частью гена агоА или последовательностью, кодирующей полипептид, несущий резистентность к гербицидам. В настоящем изобретений рассматриваются полипептидь), которье сообщают растению устойчивость к глифосату и родственньмм ингибиторам 5-знолпировилшикимат-3-фосфатсинтазьї (ЕР5Р-синтазь)), сульфонилмочевинам, имидазолинонам, и ингибиторам а це толактазосинтазь (АЇ5 ) и ацетооксикислой синтазьй (АН5). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ОВЕ-области соответствуют нуклеотидам - 1639 или 851 - 1639 НасйіЗ3-А в 5ЕС ІЮ Мо 1 и являются сцепленньіми в обратной ориентации с промотором. В настоящем изобретениий рассматриваеєтся любая модификация, которая индуцируєт корне-специфическую зкспрессию.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к химерньїм генам, содержащим злементьї ОВЕ гелиантинина, которне индуцируют изменяющуюся во времени зкспрессию и которне соединень! в прямой или обратной ориентации, по крайней мере, с частью промотора, функционирующего в растениях, а также с кодирующей областью гетерологичного гена. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения зти злементьї ШАЕ соответствуют нуклеотидам 1 - 851 или 1639 -2303 Нас3-А в 5ЕО. 10 Ме І. В обьем настоящего изобретения входит любая модификация зтих последовательностей, индуцирующая временную зкспрессию гена.
Настоящее изобретение также относится к химерньим генам, содержащим злементьї ОАЕ гелиантинина, которне индуцируют АВА - зкспрессию и которье являются необязательно присоединеннььмми в прямой или обратной ориентации, по крайней мере, с частью промотора, функционирующего в растениях, а также с гетерологичньм геном. В предпочтительном варианте настоящего изобретения зти злементь ШВЕ соответствуют нуклеотидам 852 - 1639 или 1639 - 2303 Нас3-А в 5ЕО ІЮ Ме І, или нуклеотидам І - 404 Нас3-О в
ЗЕО ІО Мо 3. Особьйй интерес представляют конструкции, индуцирующие АВА - восприимчивую зкспрессию (и тем самьм сособщающие растениям повьішенную устойчивость к водньіїм стрессам.
Химерньюе сгеньі настоящего изобретения конструируют путем лигирования 5'-рланкирующей последовательности геномной ДНК гелиантинина с кодирующей последовательностью гетерологичного гена.
Присоединение зтих последовательностей может бьть осуществлено различньми способами, в предпочтительном варианте настоящего изобретения, указаннье последовательности расположень в следующем порядке: (от 5 Кк 3) вверху регуляторная область гелиантинина, затем промоторная область, кодирующая последовательность и сайт полиаденилирования.
Способьї конструирования таких химерньх генов хорошо известньі каждому специалисту и могут бить легко найденьії в специальной литературе, например, бЗатргоок и др., (1989). Для лигирования фрагментов ДНК существует несколько стратегий, вьібор которьїх зависит от природьії концов ДНК - фрагментов. Каждому специалисту известно, что для зкспрессии гетерологичного гена необходимо, чтобь! конструкция содержала промоторньсе злементь и сигналь! для зффективного полиаденилирования транскрипта. В соответствии с зтим, -области ОАЕ гелиантинина, которне содержат промоторньюе последовательности, известнье как СААТ- и
ТАТА-блоки, могут бьіть непосредственно присоединень! к гетерологической последовательности, не имеющей промотора. Альтернативно,ю ШАЕ-области гелиантинина, которье не содержат СААТ- и ТАТА-блоки, могут бьть присоединеньї к ДНК-фрагменту, кодирующему промотор, которьій функционирует в растениях. В зтих целях могут бьть использованьь коммерческие растительнье промоторь, либо они могут бьть химически синтезированьі, исходя из их известньїх последовательностей. Примером вьішеуказанного фрагмента может служить усеченньійй промотор 355 вируса мозаийки цветной капустьі, которьій содержат СААТ- и ТАТА-блоки.
Другими типичньіми промоторами являются промотор нопалинсинтазь! и рибуло-з0о-1, 5-бифосфаткарбоксилазь!.
Промоторньйй фрагмент, кроме того, сшивают с гетерологической кодирующей последовательностью. 3 - конец кодирующей последовательности сшивают с сайтом полиаденилирования, примером которого является, но не ограничивается им, сайт полиаденилирования нопалинсинтазь. Кроме того, существуют векторнь, трансформирующие растения, которне содержат один или несколько указанньїх сайтов полиаденилирования, граничащих с последовательностями, необходимьми для трансформации растений. Злементь ШВЕ гелиантинина и гетерологичнье кодирующие последовательности настоящего изобретения могут бьть субклонировань! в сайт полилинкера растение - трансформирующего вектора для получения химерньх генов.
Б-фланкирукщиє злементь! настоящего изобретения могут бьїть полученьї в результате переваривания геномного клона гелиантинина рестриктирующей зндонуклеазой или зкзонуклеазой. Зти рестрикционнье фрагментьї, содержащие СААТ- и ТАТА-блоки гелиантинина, лигируют в прямой ориентации с гетерологичньім геном, не содержащим промотора, например, геном, кодирующим р-глюкуронидазу (505). Каждому специалисту ясно, что 5- регуляторнье последовательности гелиантинина могут бьіть полученьї и другими способами, например, путем химического или ферментного синтеза. Указанньм гетерологичньм геном может бьть кодирующая последовательность любого гена, которьій может бьть зкспрессирован в данной конструкции.
Описанньсе способь! также входят в. обьем настоящего изобретения. 3- конец кодирующей последовательности может бьїть, но необязательно, лигирован с сайтом полиаденилирования, примером которого является, но не ограничиваетсл им, сайт полиаденилирования нопалинсинтазьі, или сайт полиаденилирования гена 7 Т-ДНК октопина. Альтернативно, сайт полиаденилирования может обеспечиваться гетерологичньїм геном. 5- регуляторнье злементь! гелиантинина, которье не содержат ТАТА-блок, могут бьіть лигированьї в прямой или обратной ориентации, по крайней мере, с частью последовательности растительного промотора, т.е., промоторной последовательности, содержащей, по крайней мере, СААТ- и ТАТА-последовательности. В предпочтительном варианте настоящего изобретения, указанньім промотором является усеченньій промотор 355 вируса мозайики цветной капусть! (Самм). Полученньй в результате химерньйй комплекс может бьіть лигирован с гетерологичной кодирующей последовательностью или последовательностью полиаденилирования.
Для индуцирования регулируемой зкспрессии гетерологич-явіх генов растения трансформируют химерной генной конструкцией настоящего изобретения. Перенос генов являєтся хорошо известньм способом, применяемьм для зкспрессии гетерологичньїх генов в трансгенньїх растениях. В качестве хозяина чаще всего используют растение табака, поскольку оно легко регенерируется, дает большое количество жизнеспособньх семян на одно растениє, и может бьть трансформировано с вьісокой степенью частотьь с помощью Ті - плазмидного вектора, происходящего от агробактерии (Кіїє и др., (1987) -Аппи. Нем. Ріапі Рпузіо!І. 38, 467). В качестве трансгенньїх хозяев предпочтительньми являются двудольньюе растения, такие, как хлопчатник, масличньйй рапс и соя. Однако каждому специалисту ясно, что в качестве трансгенного растения в настоящем изобретении может бьіть использовано любое растениеє, которое может бьіть зффективно трансформировано и регенерировано.
Известно несколько способов трансформации. Химерньсе гень!ї могут бьіть введень! в растения с помощью процедурьї трансформации-регенерации дисков листьев, описанной Ногзсіп и др.(1985) бсієпсе 227, 1229). В целях настоящего изобретения могут бьть использованьй и другие способьї трансформации, которье также входят в обьем настоящего изобретения, например, такие, как культивирование протопластов (Ногзсі и др., (1984) бсієпсе 223,496; ЮОе ВіоскК и др., (1984) ЕМВО Т., 2, 2143; Вапоп и др., (1983) СеїІ 32, 1033) или трансформация зксплантатов стебля или корня іп міо (7атрьгузк и др., (1983) ЕМВО Т, 2, 2143; Вапоп и др., (1983), Сеїї, 32, 1033). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, растения трансформируют векторами, происходящими от Адгобасіегійт. Однако, для вставки химерньїх генов настоящего изобретения в растительнье клетки могут бьть использованьй и другие методь. Такими альтернативньми методами являются злектропорация (Кієїп и др. (1987) 327, 70), химически индуцированноеє внедрениеє ДНК и использование вирусов или пьІльць в качестве векторов.
Если необходимо, то химернье геньі настоящего изобретения могут бьіть введень! в вектор трансформации растения, например, бинарньій вектор, описанньій Вемап (1984). Векторьї для трансформации растений могут бить полученьї путем модификации натуральной системь! для переноса гена, происходящей от Адгорасцепйит
Штеїасієпез. Зта натуральная система представляет собой большую ТІ (опухоль-индуцирующую) - плазмиду, содержащую большой сегмент, известньій как Т-ДНК, которьійй переносится в трансформированное растение.
Другой сегмент Ті -плазмидьї, а именно, міг -область, является ответственньїм за перенос Т-ДНК. Т-ДНК - область имеет на своих границах концевье повторьі, в модифицированньх бинарньїх векторах, опухоль-индуцирующие геньі били делетировань, и функции міг - -области бьіли использовань! для переноса чужеродной ДНК, имеющей на своих границах пограничнье Т-ДНК-последовательности. Т-область также содержит селектируемьй маркер на резистентность ок антибиотику и сайт множественного клонирования для инсерции переносимьх последовательностей. Сконструированньюе таким образом, штаммь! известньі как "обезвреженнье" штаммь! А. їШштегїасієп5, которье позволяют осуществлять зффективную трансформацию последовательностей, окаймленньх Т-областями, в нуклеарньсе геномь! растений.
Диски листьев со стерилизованной поверхностью инокулировали "обезвреженной" А. Шнптпеїасієпв, содержащей чужеродную ДНК и культивированной в течение двух дней, а затем переносили на среду, содержащую антибиотик. После укоренения в среде, содержащей антибиотик, трансформированнье побеги отбирали и переносили в почву. Трансгенньіе растения подвергали самоопьілению, а семена от зтих растений собирали и культивировали на среде, содержащей соответствующий антибиотик.
Зкспрессия гетерологичного или репортерного гена в развивающихся семенах, молодьх проростках и зрельїх растениях может бить проконтролирована с помощью иммунологического и гистиохимического анализа или анализа на активность.
Как указьівалось вьіше, вьібор анализа на зкспрессию химерного гена зависит от природь! гетерологичной кодирующей области. Например, для оценки транскрипции может бьть использован Нозерн-анализ, если имеются подходящие нуклеотиднье зондь. Если имеются оантитела к полипептиду, кодированному гетерологичньім геном, то для оценки продуцирования и локализации полипептида могут бьіть использовань
Вестерн-анализ и иммуногистохимический анализ на локализацию, в зависимости от гетерологичного гена, может бьіть использован соответствующий биохимический анализ. Например, а це тилтрансферази могут бьіть обнаружень! путем оценки ацетилирования стандартного субстрата. Зкспрессия гена резистентности к гербициду может бьіть обнаружена путем оценки трансгенного растения на резистентность к гербициду.
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к трансгенньм растениям или их потомству, содержащим химернье геньії настоящего изобретения. В целях настоящего изобретения могут бьть использованьї как однодольньсе, так и двудольнье растения, растительнье клетки трансформируют химерньми генами с использованием любого из имеющихся методов трансформации растений, описанньїх вьше.
Трансформированньюе клетки растений, обьічно в каллюсной культуре или дисках листьев, регенерируют в полное трансгенное растение хорошо известньмми способами (см., например, Ноїзспі и др. (1985) 5сієпсе 227, 1129). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, трансгенньми растениями являются хлопчатник, масличньій рапс, кукуруза, табак, или соя. Поскольку потомство трансформированньх растений наследует химерньєе геньї, то для сохранения линии трансгенного растения используются семена или черенки от трансформированньмх растений.
Настоящее изобретениеє также относится к способу продуцирования растения с улучшенньім качеством липида семян. Зтот способ заключаєтся в том, что клетку растения трансформируют с помощью вектора, содержащего химерньй ген, включающий в себя семя-специфический регуляторньйй злемент, присоединенньй к кодирующей последовательности фермента липидного метаболизма, такого, как десатураза; а затем производят отбор растения с нужньми характеристиками. В предпочтительном варианте, осуществления настоящего изобретения регуляторньй злемент соответствует нуклеотидам І - 2401 или 851 - 2401 ОВЕ Найі3-А, показанньім в ЗЕО ІЮ Ме 1. Трансформированньсєе клетки растений регенерируют в растения с улучшенньїм качеством липида семян.
В другом варианте настоящее изобретение относится к способу продуцирования растения с улучшенньм качеством белка семян. Зтот способ заключаєтся в том, что растительную клетку трансформируют вектором, содержащим химерньй ген, которьй овключаєт в себя семя-специфический регуляторньій злемент, присоединенньій к кодирующей последовательности запасного белка семян с вниісоким содержанием лизиновьх и/или метиониновьїх остатков; а затем производят отбор растений с онужньми характеристиками. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, регуляторньйй злемент соответствует нуклеотидам І - 2401 или 851 - 2401 ОВЕ Нас3-А, как показано в 5ЕО ІЮ Мо 1. Трансформированнье клетки растений регенерируют в растения с улучшенньїм качеством белка семян.
В еще одном своем варианте настоящее изобретение относится к способу продуцирования растений, обладающих резистентностью к гербицидам. Клетки растений трансформируют вектором, содержащим химерньй ген, которьій включает в себя корне-специфический регуляторньй злемент, лигированньй с кодирующей последовательностью гена резистентности к гербицидам, такого, как ген резистентности к глифосату, после чего отбирают растения, обладающие резистентностью к нужному гербициду. Отбор производят по принципу вьживаємости растения после его обработки гербицидом, которьй уничтожает нетрансформированньсе растения того же вида и в тех же условиях. В предпочтительном варианте настоящего изобретения, регуляторний злемент соответствует нуклеотидам І - 1639 или 851 - 1639 ОАЕ Нас3-А, как показано в 5ЕО ІЮ Ме І, а гетерологичная последовательность поставляется геном, кодирующим ЕРБ5Р -синтезу, ацетолактазосинтазу, ацетооксисинтазу. После зтого трансформированньюе клетки растений регенерируют в растения, обладающие резистентностью к гербицидам. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, растения трансформируют с помощью вектора рРАРА-М -803, которьій содержит корне- специфический регуляторний злемент, соответствующий нуклеотидам 851 - 1639 НОЗ-А и агоА-ген устойчивости к гербициду.
В целях иллюстрации настоящего изобретения, ниже приводятся следующие примерь!:
Пример
Общие методь!
Нуклеотиднье последовательности, указаннье в приведенньх ниже опримерах, пронумеровань! в соответствии с рис. 1-3.
Конструирование гена-репортера С
Используемье в настоящих примерах кассеть! репортерньїх генов СИ общего назначения бьли описань ранее ТебПеггоп и др., (1987) ЕМВО Т. 6, 3901). Короче говоря, кодирующую область с лигировали с 5'і-кКонцом сайта полиадеямлирования нопалинсинтазьй в области полилинкера вектора рВвіМІ9У, происходящего от
АЛДитеї?асієпе (Вемап (1984) Мисіїйс Асійє Нев. І2, 8711). Вектор рВІМ19 содержит слева и справа от Т-ДНК пограничнье последовательности, необходимье для трансформации растений, а также ген резистентности к канамицину. Полученная конструкция рВІТО1ї зображена на рис. 4. Уникальнье сайть рестрикции, расположенньсе вьіше кодона инициации (АОС) 05 , позволяют инсертировать ДНК-фрагменть! промотора.
Промотор 355 СамМ лигировали в Ніпй 111 и Ват НІ - сайтьї рВ1І101.1 для создания рВв1121.1, изображенной на рис. 4. Для построения рВ1120, промотор 355 Саму усекали у ЕсоВУ -сайта у нуклеотида - 90 (оставляя СААТ и ТАТА-блоки) и клонировали в полилинкерньй сайт рВ1101.1
В Таблице | описаньї родительские плазмидьй и производнье конструкции. На С3-А-РЇ и контрольнье конструкции рВ1121.1 и рВ1101.1 изображень на рис. 4. На рис. 5 показаньї рестрикционнье фрагменть геномньїх клонов Нас3-А и Насз-О, использованнье для конструирования родительских плазмид. На рис.б показань! схематически производнье конструкции по отношению к полной конструкции.
Таблица
Конструирование Описание
Родительские плазмидь! рвіІТтО1.1 Кассета репортерньїх генов (СИО5, не содержащая промотор и полученная на основе ВІМ-19. рвіт211 Промотор 355 Саму, сшитьй с 4И5-кассетой в рВІ1О01.1. рвіт201 Промотор 355 СамуУ, усеченньй у ЕсоНВМ-сайте с сохранением
СААТ- и ТАТА-блоков и сшитьй с 2И5-кодирующей областью/
рНа-с3-А-2.8 2,8кв - Вам ІН-Рвї І-фрагмент Насзі в ррійезсгірі, содержит 2,4кв вьше от кодирующей области На-253-А и 0,38 кв ниже от сайта инициации транскрипции; бьіл использован для создания зкзонуклеазньх
ПІ делеций. рНа-а3-А-2.4 2,4кв -На-с43-фрагмент, полученньій в результате 3'-переваривания зкзонуклеазой Ії рНа-сЗА-2,8 - 424; содержит СААТ и ТАТА-блоки Насз-
А. рНа-с3-А-2,3 2,3Кв -Насз3-А-фрагмент, генерированньй в результате переваривания зкзонуклеазой Ш рНасзА-2,8 - (-75); содержит СААТ-блок
НасЗ3-А.
Производнье конструкции
Насз3-А-РІ. 2,4кв-вставка рНасзА-2,4, лигированная с рВіІТ01.1 в прямой ориентации.
На-а3-А-НБЗ/Р-НЗ/А 0.85-кв-Ват НІ-ЗаП-фрагмент от рНасзЗА-2,3, клонированньй в прямой и обратной ориентации по отношению к усеченному промотору 355 Самм рві1120.
НасйіЗ-А-НБ/ВА 0О,85кв-фрагмент, вьірезанньй как Засі-фрагмент из НасзА-Н5/Е, и клонированньй в обратной ориентации по отношению к усеченному промотору 355 Самм рві120
На-а3-А-НВ /г-НВ/А 1,6кв-Ват НІ - ВаїІ-фрагмент из рНасзЗА-2.3, клонированньй в прямой и обратной ориентациях по отношению к усеченному Саму- промотору 355 рвіІ120.
На-а3-А-52 /г-52/8 0,6 кв-ЗаїІ-Ва!-фрагмент из На-(023-А, клонированньй в прямой и обратной ориентации по отношению к усеченному Самм -промотору 355 в рВІ120 и сконструированньйй путем делеции ЗаіІІ-Ват НІ-фрагмента из
Набс3-А-НВ/Е и Нас3-А-НВ/НВ, соответственно.
На-53-А-52/Е-52/38 1,4кв ЗаїІ- фрагмент из рНа-23-А-2,3, клонированньй в прямой и обратной ориентации по отношению к усеченному СаМмМ-промотору 355 в рВІ120.
На-о3-А-В2/Е-В2/8 О,ббкв - Ва- ЗаїІ- фрагмент из рНас3-А-2,3, клонированньй в прямой и обратной ориентациийи по отношению к усеченному Самум- промотору 355 в РВІІ2О.
Насз-А-Н2 2,3кв - вставка из рНнасз3-А-2.3, клонированная в прямой ориентации по отношению к усеченному Саму - 355 рВІІ20.
Нас3-А-51 1,5кв За - фрагмент из рНас3-А-2,4, клонированньй в прямой ориентации по отношению к рВІОІ.!.
Насіт-0-40414-4041 О,4кв ЗаІ-Нра! - фрагмент из Нас3-3О0, клонированньій в прямой и обратной ориентации по отношению к усеченному СаМмМ-промотору 355 в РВІІ2О.
На а3-А/505 -конструкции представляют большие перекривающиеся фрагменть, которне расположень! по всей длине регуляторной области (-2377- ж 24, рис. І). 3" -концьї нескольких конструкций бьли получень в результате переваривания 2,8кв - На 23-А-фрагмента в рріпйезспрі (5ігаїадепе) |рНасз3-А-2.8 (Ват НІ - Реї)
Табл. 1| зндонуклеазой 111. Зти делеции показаньй в верхней части рис. 4. Первая делеция, рНасіЗ-А-2,4, содержит СААТ- и ТАТА-блоки Насі3-А, где ее 3-конец находится у -75. Фрагментьі, содержащие -Нас3-СААТ2 и
ТАТА-блоки, лигировали в прямой ориентации в бИ5-кассету, не содержащую промотора рВ1101.1. Фрагменть, которне не содержали На-23-А-ТАТА-блок, лигировали в обеих ориентациях вьіше усеченного промотора 355
САММ рВ1120. Зти фрагментьї субклонировали в соответствующую (305-кассету. Полученньюе конструкции обозначали в соответствии с их концевьми сайтами, причем, последующая бувка Е означаєт прямую ориентацию, а буква В- обратную ориентацию.
Стрелками показана ориентация фрагмента по отношению к кодирующей области БИО5 (рис. 4). Насі3- р/аи5-конструкции содержат 404 п.о. - фрагмент (заї! - Нраї) в обеих ориентациях: нормальной (М) и обратной (). Точность и ориентация каждой конструкции бьла подтверждена с помощью двух нитевого дидезоксисеквенирования (Спеп и беериго, 1985) и с использованием праймеров к областям в бИ5-кассетах (Адуапсеа ОМА ТесНпоіодієз І ар, Техаз АБМ Опімегейу).
Трансформация растений
Плазмиднье конструкции на основе ВІМ-19 использовали для трансформации табака (Місойапа їарбасит су.
Хапійі) в соответствии со стандартньіми процедурами (Ногзгсі и и др. 1985) за исключением того, что исходнье трансформанть! подвергали селекции на 50мкг канамицина/мл, а затем переносили на 100мкг/мл канамицина.
Растения подвергали самоопьлению, семена проращивали на канамицине (400г/мл) для идентификации трансформантов, поскольку конструкции на основе ВІМ-І9У содержат ген неомицинфосотрансферазь! (МРТ11), которьій сообщаеєт резистентность к токсичному антибиотику канамицину. Число копий каждой И5-конструкции, интегрированной в геном табака, оценивали для каждого трансформанта путем определения частоть! сегрегации гена МРТ11. Большинство трансформантов содержали лишь один локус сегрегации конструкции. Дочерние гомозиготнье растения использовались там, где зто указано. Трансгеннье растения, представляющие все испьітуемье конструкции, бьіли полученьї для всех случаєв, за исключением обратной конструкции Н- 2.
Трансгеннье растения вьідерживали в камерах Конвирона: с циклом день: ночь - 16ч : 8ч, температурой 247С, относительной влажностью 70 - 8095. Для предупреждения десикации до проведения испьітаний придерживались строгого режима орошения растений.
Пример2
Биохимическая оценка 5И5-активноети: семя-специфическая и корне-специфическая зкспрессия сО5-активность определяли в змбриональньїх и незмбриональньїх тканях трансгенньїх растений табака, содержащих каждую из конструкций, описанньх в Таблице І. При зтом бьли использованьі стандартнье процедурь Тепйегзоп и др. (1987).
Растительную ткань измельчали в зкстрационном буфере (50мМ, МаРОол, 10мМ ЗДТК, 0.195 Богковуї, 0,195.
Тритон Х-ІОО и 10мМ В-меркаптозтанола). После центрифугирования лизата супернатант удаляли в свежую пробирку, и распределяли на 100мкл, аликвотьї. Затем в зкстракционньій буфер добавляли равньй обьем 24М 4-метилумбеллиферил-В-Ю-глюкуронида и инкубировали в течение | часа при 37С. После зтого реакцию прекращали путем добавления 0,8мл МагСОз (0,2 М). Флуоресценцию полученного 4-метилумбеллиферона (4-
МУ) определяли с помощью минифлуориметра Ноеєїйег ТКО-І0О, как описано (ТеПегзоп и др., 1987). (405 - активность вьіражали в пикомолях 4-МУ на единицу массь всего образца белка в минуту.
На (05 -активность оценивали семядоли, гипокотили, листья и корни от трансгенньїх проростков от 18 до 20 дней после набухания(ДПН), содержащих различнье злементь! последовательности Насз-А (систематизированньє на рис. 4), которне индуцируют 1И5 -зкспрессию. Результать! представлень в Таблице 2.
Все конструкции, содержащие некоторую часть ОАЕ от генов Нас3-А и Нас3-О гелиантинина, продуцировали свИ5-активность в семенах трансгенного табака. Полная регуляторная область (ЕІ) и фрагментьі, происходящие от зтой области, а также На 53-00 (505 -конструкции, все индуцировали значительную 1И5 -активность в зрельїх семенах по сравнению С2И5 -зкспрессией, индуцированной интактним Самм-355 -промоторньм комплексом (рВІ21). Однако хорошо вьураженная семя-пецифическая зкспрессия бьла получена лишь с использованием конструкций, содержащих 5 -проксимальнье области между -75 и 24 (см.РІ и 5-Ї). Зти две конструкции, содержащие нуклеотидь -2377 -424 или -1527 - 424, демонстрировали тканеспецифическую 1И5 -зкспрессию с не обнаруживаеємой 505 -активностью во всех тканях трансгенньїх проростков. Однако, уровень зкспрессии РІ - конструкции в зрельїх зернах в шесть раз превьішаєт уровень зкспрессии 5-І. Для сравнения, -240И5-активность в тканях проростков, содержащих интактньй Самм-355-промоторньйй комплекс (рВ112І), используется так же, как негативньій контроль: содержащие усеченньй Самм -355 -промотор (рВ1120) или не содержащие промотор (рРВІОЇ). По сравнению с зкспрессией в семенах, в листьях, содержащих ту же самую конструкцию, наблюдалась незначительная зкспрессия; но, с другой стороньі, большинство конструкций (кроме Рі и 5-І) обнаруживали значительную зкспрессию в трансгенньїх проростках
В соматических тканях, за исключением корней, полная активность, индуцированная интактньм Самму-355- промоторньім комплексом, превьішаеєт активность, индуцированную другими конструкциями. В частности, уровни сИ5-активности в корнях проростков, содержащих конструкции НВ/В (-2377- -739 ) и 5В/А (-1527- -739), в 7-8 раз превьішают уровни (И5-зкспрессии в корнях под контролем интактного промотора 355 Саму.
Таблица 2
Суммарная оценка СИ5-зкспреесии в змбриональньїх и не змбриональньх тканях трансгенньїх растений табака
Конструкция Профиль сИ5-активность (пмоль 4Му/мкг/мин) АВА- развития зерна листья корни воспри- имчивость
Насі3-А
Р. | 18.7 5 8.7 (9) (9) ни 5-1 | 34 ж11 (9) (9) МТВ)
Е Ш 17.1 з 15 0.455005 36.6 :2.2 - не в МО 6.2 1.0 0.23 ж 0.05 8.9 5 1.8 -
Е ІІ 14.8 55.2 0.955013 29922 щ
Нв в МО 13.1 7 6.9 0.25 з 0.05 75.43 -
Е ІІ 11.1 з 5.8 0 13.9 з 6.8 -
ЗВ в МО 12.1 з 5.8 0.3450.05 90.5 :9.9 щ
Е ІІ 35.7 14.2 (9) 20.6 10.2 МО 5-2 в МО 21.0 515 0.455008 38.8 51.2 щ
Е Ш 11.2 753.9 2.03 0.08 8.0 5 0.62 щ в-2 в МО 72и23 4.05 50.10 3.9 50.3 щ н-2 Е Ш 1.8 51.0 МО 1.8 50.3 МО
Насз3з-0
М Ш 9.2 52.9 0.07 з 0.01 6.8 5 0.5 щ 404
МО 9.2 53.9 2.03 ж 0.05 12.9 52.8 щ 0) Контрольньсе сопігоїїв
РВІ 101 МТВ) (0) (0) (0) -
РВІ 120 МТВ) (0) (0) (0) -
РВІ 121 МО 4.3 51.0 22.0 7.7.9 9.9 54.0 - а) Зрельсе семена и ткани саженцев трансгенньх растений табака, содержащих конструкции, изображеннньєве на рис. І, анализировали на бИ5-активность. р) Конструкции показань! на рис. І. Прямая (Р) и обратная (Р), нормальная (М) и обращенная (І) ориентация каждого фрагмента гелиантинина дана по отношению к усеченному промотору 355
Саму. с) Развивающиеся зерна трансгенного табака, содержащего прямье конструкции, изображеннье на рис. І, анализировали на 24И5-активность от 8 до 24 ДПЦ с интервалами приблизительно в два дня. Профили типа І, ЇЇ и І определень в Примере 3. а) МО - не определяли в зтой серии зкспериментов. е) Во всех зкспериментах Б4О5-активности представляют собой средниеє значения по 4 - 10 независимо трансформированньїм растениям для каждой конструкции. Бьіли внесеньі поправки на ср. кв. погрешности.
У сИ5-активность в зрельїх (30 ДПЦ) семенах трансгенного табака. 9) Трансгенньсе проростки табака аксенически культивировали на твердой среде. Ткани от проростков (18 - 2ОДПН) собирали и анализировали на -5О05-активность.
Р) Для РІ. АВА-восприимчивость наблюдалась только в развивающихся семенах 12 - 198ДПЦ (см. текст и Таблицу 3). Для всех других конструкций АВА-ответ предварительно определяли по сИ5-зкспрессийи вьісушенньх листьев с последующей иллюстрацией того, что проростки указанньїх растений реагируют непосредственно на зкзогенную АВА. Знак " ж" означает индуцирование СИ5-активности сверх базального уровня. Знак " - " означаєт отсутствие С0Ш5- активности.
Пример З
Биохимическое обнаружение (4О5-активности: зкспрессия, регулируемая в процессе развития
Определяли временной профиль, сообщаємьй каждой прямой конструкцией, и результать! зтого определения представлень в Таблице 2. Дочерние гомозиготнье растения культивировали, доводили до цветения, и семена из стручков на соответствующих стадиях анализировали на СИ5-зкспрессию, как описано в
Примере 2. Исходя из времени начального вьіявления (505-активности в развивающихся змбрионах и количественньіїх и качественньїх характеристик полученньїх картин зкспрессии, біли идентифицировань! три типа профилей развития. Профили Типа | обнаруживают правильную временную регуляцию, где аккгумуляция сИ5-начинаєтся через 12 дней после цветения (ДПЦ). В растениях, обнаруживающих профили Типа ІІ, 20И5- активность также начинает акксумулироваться примерно через 12 ДПЦ, но достигаєт пика примерно через 14
ДПЦ, а затем уровни бИ5-активности значительно снижаются. Растения Типа ШІ обнаруживают бИ5-активность ранеє, чем через 10 дней после цветения ДПЦ, при зтом пик активности достигается приблизительно через 12
ДПЦ. Отот более ранний временной профиль сообщают конструкции, содержащие области ОАЕ НасЗ3-А, соответствующие нуклеотидам -2377- -1527 или -739- -75.
Пример 4
Гистохимическая локализация й4О5-активности
Гистохимическое определение локализациийи 5И5-активности осуществляли для проростков, содержащих
Насз-А- 5В/А и Насі3-0-404М. Образцьі промьівали в 50 мМ МарРо»х, и инкубировали 24 часа при 37"С в 100мкл реакционного буфера (5ОмМ МаРОл, рн 7,0, 2мМ 5-бромо-4-хлоро-З-индолил-глюкуродида (Х- Сіис), 0,1ММ железосинеродистого калия, и 0,1мМ железосинеродис-того калия, и 0,1мМ железосинеродистого калия)| . Затем образцьї наносили на предметньсе стекла микроскопа с 8095 глицерина.
Проростки с Нас3-0-404М (рис. 7А) и Нас3-А-5В/А (рис. 7В), культивированнье на базальньїхх средах, содержащих Ід95 сахарозьї, обнаруживали различньійй характер зкспрессии. На-с23-Д-М-индуцированная. СИ5- зкспрессия обнаруживалась на низких уровнях в семядолях, и на значительно более вьсоких уровнях в дистальних областях корней; при зтом, активность вообще отсутствовала в гипокотилях. На (С3-А- 58 /В- проростки также обнаруживали значительную С1ШИб5-активность в дистальньїх отделах корней и не обнаруживали активности в гипокотиле или семядолях. 5И5-активность гистохимически обнаруживалась на 14 день после цветения в саженцах, содержащих Насз3-0-404М, которье бьіли культивировань!ї в условиях водного дефицита окружающей средьй на фильтровальной бумаге с неполньм насьщением; при зтом -5И5-активность наблюдалась, главнь/м образом, в листьях и корнях указанньїх саженцев (рис. 7С).
Определяли характер -4О5-зкспрессии саженцев, содержащих На-23-А-5В/А. Главная область щИ5- активности в 5В/А-саженцах наблюдалась в кончиках развивающихся корней (рис. 78, С). В 6 ДПЦ-саженцах, содержащих На(сйо5-А- 58 /А, (СИ5 оокспрессировалась по всей длине удлиняющегося корня, причем максимальнье уровни наблюдались в меристематической области верхушек корней (рис. 71). Гистохимическая оценка СИ5-активности в НасіЗ3-А-58/А-саженцах (14 ДПЦ) показала наличие активности во вновь образованньх боковьїх корнях, а таюке сохраненную активность в меристематической области главного корня (рис. 7В).
Проростки от 16 ДПЦ показьшали ту же картину зкспрессии (рис. 7С); также вьсокая сСИб5-активность наблюдалась в корневьїх волосках и дистальньх областях корней.
Пример 5
АВА - восприимчивая зкспрессия
В серии зкспериментов, проведенньхх на трансгенньх растениях табака, содержащих конструкции, показанньсє на рис. 4, било идентифицировано несколько ОВЕ-областей На-23-А и На-(23-О, которне оказались восприимчивьмми к изменению в растениях водного потенциала (Таблица 2). Поскольку АВА, как известно, является медиатором ответа на водньй дефицит, то определяли действие АВА на -5И5-зкспрессию, индуцированную указанньмми злементами. В Нас3-А бьіли обнаружень! две области (нуклеотидь! от -1527 до - 739 и от -739 до -75), которне индуцируют АВА-восприимчивую зкспрессию в листьях зрелого трансгенного табака и в саженцах. Другой АВА-чувствительньйй злемент бьіл идентифицирован в ОВЕ Насз-О (от -739 до - 322).
Корреляция СИ5-активности в трансгенном табаке, содержащем Нас3-0-404М (прямая ориентация) с водньім потенциалом, наблюдалась в течениеє прогрессирующей дисикациий и при последующем вьіводе из водного стресса. Поскольку Насй3З-ОНЕ с полной длиной не зкспрессируются ни при каких условиях за исключением периода развития семени, то растения, содержащие зти химернье (14О5-конструкции, использовали в качестве негативного контроля. Дочерние гомозиготнье растения, содержащие каждую конструкцию, вьтуращивали в почве. Зти растения либо нормально поливали (контроль), либо содержали в условиях водного стресса, варьируя степень орошения от 1/3 количества водь, используемого для контрольного растения, вплоть до полного отказа от полива. Растения, содержащие Нас3-0-404М и находящиеся в полном водном стрессе, бьістро, за примерно 36 часов, индуцировали пик й4О5-активности, которьій коррелировал со снижением водного потенциала (рис. 8). Последующее определение (3О05-активности через 24 часа вьявило воспроизводимое снижение активности, даже, если растения продолжали находиться в условиях жесткого водного стресса с водньім потенциалом, близким 4 бар. Растения в условиях полного водного стресса восстанавливали путем орошения на 3-й день после завершения взятия проб. После орошения растения бьістро восстанавливали водньій потенциал, которьй возвращался до своего дострессового уровня, а йИ5-активность продолжала снижаться в течение всех последующих дней. В растениях, находящихся в 1/3 стрессовьїх условиях (см. вьіше) и содержащих Нас3-0-М, бИ5-активность медленно увеличивалась в течение 3,5 дней по мере уменьшения водного потенциала (рис. 8). Как и в случаеє растений в условиях полного стресса, бО5-активность начинала снижаться до восстановления водного дефицита. При зтом не наблюдалось ни одного случая, когда РІ -растения зкспрессировали БШ5 в незмбриональньх тканях.
Для того, чтобьі определить является ли 404 п.о. - фрагмент из Насй3З-О чувствительньм к непосредственному воздействию АВА, диски листьев трансгенного табака, содержащего Насзі-0-404М, обрабатьшвали АВА в течение увеличивающихся периодов времени, после чего зти диски анализировали на сИ5-зкспрессию. После лаг-периода, составляющего приблизительно 3,5 часа, обработка 10 мМ АВА давала бьістрое увеличение (14И5-зкспрессии; аккумуляция 105 продолжалась на протяжении 8 часов, а после зтого скорость аккумуляции (405 значительно снижалась (рис. 9). При зтом бИ5-активность не наблюдалась в дисках листьев тех же растений, содержащихся в идентичньїх условиях, за исключением обработки АВА. Аналогичньїм образом, диски листьев от растений, содержащих ОАЕ Насі3-А с полной длиной, не обнаруживали никакой активности на протяженийи всего зксперимента. Поскольку химерньй ген, содержащий Самм -355 -промотор и репортерши ген В-глюкуронидазь, является транскрипционально активнь!м в листьях (Таблица І), то трансгеннье растения, содержащие рВвіІ21, использовали в качестве важного негативного контроля. Диски листьев от растений, содержащих рВіІ21, не показьвали увеличения (О5-активности в ответ на воздействиє зкзогенной
АВА на протяжениий всего зксперимента (АВА: 12,6 жї- 3,3 пмоль 4-МУ/мкг/мин; -АВА: 13,5 ж 3,6 пмоль 4-
МУ/мкг/мин).
Аналогичная серия зкспериментов бьіла проведена с трансгенньіми саженцами табака, содержащими Насі3-
Ор-404М и На-С23-А-РІ. (рис. 4). 18 ДПН-саженць! переносили на средьі, содержащие 0-10 мМ АВА, и определяли сИ5-активность на 1-й, 2-ой и 3-ий день (Таблица 3). Саженцьії, содержащие Нас3-0-404М , бьіли восприимчивь! к воздействию АВА на 1-й день при всех концентрациях АВА; тогда, как в параллельньїх зкспериментах, Насз3-А-
Р. -саженць не показали значительной индукции. Индукция зависит от времени и концентрации. Максимальная индукция, 200-кратная, имела место на 2 и З дни при концентрации АВА 10 мМ (Таблица 3). Значительная индукция, 19-кратяая и 70-кратная, наблюдалась на 3-й день при 0,1 мМ и 1,0 мм АВА, соответственно.
ОАЕ Нас3-А гелиантинина с полной длиной (РІ) (от -2377 до 24) испьітьівали на их АВА-индуцибельноеть в развивающихся семенах. Семена, содержащие регуляторную область с полной длиной (Б), индуцирующую
СИиБ-зкспрессию (рис. 4), доводили до стадии 11, 14, 18 и 24 дня после цветения (ДПЦ) и анализировали на их способность к ответу на воздействие АВА. АВА-индукция обнаруживалась посредством увеличения уровней сО5-активности по отношению к уровням, полученньм на базальной среде. Полученнье результать систематизированьй в Таблице 3. АВА-восприимчивость варьировалась в зависимости от стадии развития.
Семена от 11 ДПЦ не реагировали на АВА на протяжений всего зксперимента, тогда, как более зрелье семена обнаруживали чувствительность к воздействию АВА. Семена от 14 ДПЦ показьівали бьістрьй ответ, начиная уже с 1,5 часов, с уровнем индукции, превьішающем базальнье уровни. Для 14 ДПЦ-семян, обработанньх АВА, зти уровни СбИ5-активности монотонно увеличивались, и на 3-й день после обработки они бьіли вьіше, чем уровни для 18 ДПЦ- и 24 ДПЦ-семян, обработанньїх или необработанньїх АВА. 18 ДПЦ-семена давали более медленньй ответ на АВА, чем 14 ДПЦ-семена, однако, их уровни йО5-активности достигали значений, сравнимьмх с уровнями для 14 ДПЦ- (їАВА)-семян, лишь на 5-й день после АВА-обработки. 24 ДПЦ-семена бьіли менеєе восприимчивьї к АВА через 5 дней после АВА-обработки. Уровни СйИб-активности также варьировались в зависимости от того бьіли ли семена инкубированьь лишь на одной базальной среде. 14 ДПЦ-семена на базальной среде обнаруживали постепенное увеличение СИ5-активности, оцененной в 4 пМ 4-МУ/семя/день.
Полученнье результатьь проиллюстрировали йиерархический принцип регулирования зкспрессии гена гелиантинина, такой, что АВА-чувствительнье злементь!, содержащиеся в НасЗ-АЕ, функционируют только в условиях соответствующей программь развития. Если АВА-чувствительнье злементььй удалить из их соответствующего окружения в Нас3-А- или Нас3-0- ОАЕ, то зто приведет к потере иерархического контроля таким образом, что зти злементьї будут свободно реагировать на прямое воздействие АВА и косвенно на дисикацию в листьях и проростках трансгенного табака.
Таблица З
АВА-индукция іп міїго Насі3-А-РЇ. в трансгенньїх семенах табака сИБ-активность (ПМ 4-МУ/мкг/мин) дпц Нормальнье 11 ДПЦ 14 ДПЦ 18 ДПЦ 24 ДПЦ
АВА
11 ОРЕ 14 ОРЕ 18 ОРЕ 24 ОРЕ
ОРЕ Могтаї ротор
ВВ ПИВ ПОСЛИ ПО ПО ПО а) Трансгеннье семена табака, содержащие Нас3-А-РЇ бьли собраньі в указаннье дни после цветения (ДПУ), и инкубировань на лишь одной базальной среде или на базальной всреде, содержащей 1 мкМ АВА. (305- активность определяли через О, З и 5 дней после обработки. Для сравнения приводятся данньюе іп мімо- зкспрессии 205, индуцированной Насі3.-А-РІ,, в развивающихся семенах (Нормальнньєв).
Пример 6
Введение признака резистентности к гербициду в растение табака 0,66 кв-Ваї! - ЗаіІ-фрагмент из родительской плазмидьі! рНас3-А-2,3 (Таблица 1) сшивали его 5 -концом с
Ніпа І-сайтом, а его З -концом с ЕсоКІ-сайтом. Полученную кассету использовали для замень! области двойного
СамМм-промотора в реЕРА-ВІ-410-конструкции (описанной во французской патентной заявке Ме 91 02872, поданной 5 марта 1991 ) путем переваривания указанной конструкции Ніпа І и ЕсоВ І и субклонирования зтой кассеть! в вектор. Полученная конструкция, обозначенная рАРА-МІ --803, содержала в транскрипционной рамке следующие злементь!: регуляторний злемент гелиантинина; оптимизированньй транзитньій пептид (ОТП), агоА- ген, поз-терминатор.
Плазмиду рАРА-МІ-805 переносили в штамм ЕНАЇІ гобасіепййт Ште Гасієпе5 (Носа и др. (1986) 5. Васіетпіої,
І68, 1291) посредством тройного скрещивания, и полученную Адгобраїегійт использовали для трансформации дисков листьев табака.
Регенерированньсе растения табака, вьісотой примерно 20 сантиметров, опрьіскивали в условиях теплиць! глифооатом в виде препарата АВОШМОШР в дозе 0,6 кг активного ингредиента на гектар. При обработке указанной дозой глифосата нетрансформированнье контрольнье растения погибали. В противоположность зтому трансформированнье растения оставались невредимьми и жизнеспособньми, что свидетельствовало об их толерантности к глифооату.
(хі) БЕООЕМСЕ РЕЗСВІРТІОМ: 5ЕО І МО:1:
ССАТССТСТА ССТАТАТАТА ТАТАТАТАТА ТОЛАТТТТТТ АЛААЛАААТСС СОТАССССсТС Бо
СААААААСоО СССТТАТОоСО СААСТССТСС ТСОСАСАССТ АААбБАсССОоС ССАТОСТТТТ 120
ТААТСАААТА САТОТОСАТО АТОТАСТОАТ АСТТІТТТАСТ ЛАААТССАТТ АСТТТАТАДА 180
ТАТТІТТААдтТ СТІТТТТТТТ СТІТАТАТАА АААААОЛАлА ТТАХААААСА АААТСТССАХ 7Ао
ААТАСТОСТОо ТАТСААСТАТ ОСАКМАЛАСАС АААААЛАССС ТІТТОСТТАА САААСТСТІТ 300
ААТТТААСТА АСТТІТСТСАТ ТТСААОСААА ТТІСАЛАСААА ААСбААсотТо сопсосСосооо 36 остТооооТотТ ТТССТТАСАА АДААСТІТТАА ТТІТТАСАТТА ААОТАТААДАА АТІВСССАДА 420
ССТСАСОСАСА АТІТТУТАСАТ ТТАТААСТСА ТТОТСТАААТ АСТААЛААТАС АССЛАСТСАА 48о
ТООСТОАААс ТТАСТАТСТТ ТІТТАТТОСА АТТТСАСАТТ АССТТАТІТА СТІТТСАбБАА 540
АСАССАСАТА АСААТТААоб АСТТАТАСТО ТОАТооОоТІТ ОСОСТАТТТТ ТСАТАСТТАХ 6оо
ОСТССАбОСТІ ТОААТСТТТТ АААСАТІТТТ ТТТТААСТТО АТСАТААСАА ТАТААСААТТ 66о
ДАССАСТТАТ ОАТСТОАТОоС ТТТОССТТАТ СТІТТТІССТАС ТААТТААооТ СССОСТТТоА 720
АТСТСТСААА СААТАТАТТА ТІТІТІСТТА ААЛАСОААТО АСАСАТОСТС АСААТООСАА 8
ТІОААССОАС АССТАТРТООТ ТІААААТТАА АОСТАТААСА ААСТОСАССТА САСАТІТТІА 8490
АТІТАААААТ СТСБАСТАТС ТТАСТТААТС АЛАТАААТТТ АТТІТТОАТІТ ОТТІТОТТАА 900
ТОТАТТГТСТ ССТААТТКАА АСТССАТОТО ТАТІТАТАТА АТАТТАСТАА ТАТІТТАТТА збо
АСАТСААТАС АТОСТТСАСОо ТІТТОТОТТА ОТСТТСОТІТ ТІТАТАТОСТ ТТТАТСАотТОо 1020 бтТотТоотТОотТА ССАТОАСОАТ ТАТІТАААТА АТОАСОААСТ ТСТТОСТЕСТ ТАСТТАТТОА 1080
ТОТАСБААОС ТОАСАТСТАА СОАДАСССААС АСАТАЖТАААТ ААСАТТТТОС АТААСАТТАС 1140
ОАСТТІТАТТТ АТСОСТТОСС АТОАААТТГТА СААОАТТТОо СТТААПСАСАС ДАССАСАТАТ 1200
ААТОТОАТОС ТАААТАССАТ ТТАСААСТАА ТОТТААТСТТ ТІОТТАСААА ТОТТОТТААС 1260
ТАСОСТТОАТ АТОТААЛААТТ ТІТАЛАСАСТ АТСАССОТОТТ СТТАСОСТІТТ ТАСАТСТАСТ 13220
МЛАСАСАТТАА АЛАЛАЛАААА ОСААССАААО ТААСТІСОТААА ОАСАСТАЛАб АСААТОТАСС 1380
САТОСАТАТОС СТОАТТОТТС АТСАССАТОС САТТТАТАСТ ТАТСАТСТТО АТОАТОСАТА 1440
ТАСАСАТОАТ ОТОоТОСТАСО ТАСССААТТТ ТААСАбСТІС ССООСОСААС АСАСОСТОТАТ 1500
МААТАССАТА ОАТТАТАААС САЛАТАСОСТ АСОТАТАООТ ООТТАТАТОА ТАССТАТОАТ 1550
САСТТОАССТ ТТССТТАСАС ТТОАОСТОАА АААААТААЛА АААТОТОССТ АТАСОСОСАТ 1620 ссТсАСсАСТТІ ТІТТТОТОТОо СССАТАТАСА АТТТТТОАСОо ТАОСОТТАСТ ТААТСАбАТА 1680
ААТТТАТІТТТ САТТІСТТТТІ СОТТААТОТАТ ТІТСТССТАА ТІТСААСТАб АСОоТОоТАТТТ 1740
АТАТААТАТТІ АСТААТАТТТ ТАТТААСАТС ААТАСАТОСТ ТСАТОТТІТОо ссТТАсТотТт 1800
ССТІТТІТАТ АТООТІТТАТ САСТООСРОТА ССАТСАСОАТ ТАТІТАЛАТА АТСАСОСАСТ 186у
ТСТтТООоТтТотТ ТАСТТАТТОА ТОТАСОААОС ТСАСАТОТАА СОААССОААС АСАТАТАдАтТ 1920
ААСАТТТТОс АТААСАТТАС САСТТІТАТТТ АТСООТТОСС АТОАААТТТО СААСАСсттТео 1980
СТТААСАСАС ААССАСАТАТ ДАТОоТОАТОоС ТАААТАССАТ ТТАСААСТАА ТОТТААТСсТТ 27940
ТТСТТАСААА ТОТТОТТААС ТАбОСТТОАТ АТОТААААТТ ТТТАААбАСТ АТАТОСТОТТ 2190
СТТАСОСТТІТ ТАСАТСТАСТ ААБАСАТТАА ААЛАДАААЛА АААДОСААОО ДААСсТАдотТОе 2160
ТАААБАСАСТ АААСАСААТО ТАБССАТОАТ АТООСТОАТТ ОТТСАТСАСС АТосССсАТТТА 2220
ТАСТТАТСАТ СТТІСАТСАТО САТАТАСАСА ААСАСАСТАС ТТАТАСАСАТ СТАСсАтТотТо 2280
ТСАБСТССАА АТООТОАТСТ ТСТоСтТОоОСА ТААССТСТТА САТОТСАСТТ ССТССТТоСАТ 2340
СТТІСТТССАС ТАТААААССА ОСТАСТТСАС ААСАССТАТТ САССАСАТСА САТСССАТТС 2400 (2) Даннье последовательности 5ЕО ІЮО Мо 2: (1) Характеристики последовательности (А) Длина: 732 пар оснований (В) Тип: нуклейиновокислотньй (С) Цепочечность: двухцепочечная и одноцепочечная (С) Топология: линейная (ХІ) Описание послеловательности 5ЕО ІЮ Мо 2:
СОАРТССТОТА АСААСТОССС ЛАААТОТОАО ААОТОТАТТА ТААСАСТАТА ТАТААТАСТА бі
ТАТААСАССА ТАТАААТАСС СТАТААСАСТ АТОТААСАСС АТАТААСАСА АТАТААСОоСТ 120
АТСТААСАСТ АТАТААСАТТ АТАТААСЬАТ АТАТААСАСТ АТАСАТСТАТ САБАОАСАТИ 180
СТАТСАПАСА АССТАТАОТОо ТТАТАТТТСТ ТАТАТААТОТ ТАТАТАСТОТ ТАСАТАССосСТ 249
ТАТАТООТАТ ТАТАТОСОТОТ ТАСАТАТТОТ ТАТАСОТОТТ ТАТАТОСОТОТ ТАТАТАСТАТ 300
ТАТАТАТАСТ СТТАТААТАС АСТІСТСАСА СТТІТОбОСАС ТТІТТТАСАСО АТСАТСстТАСсС з6о
ТАТАТАТАТА ТАТАТАТАТА ТАААОСАТТА ССТІСААСО ТОААСАВАТТ СССАдсдостО 420
ААСТОССТОА АСТОАТСТСА ССССТТСАТТ ТІТАТОСАТСТ ТСАСАТТААА СтТОодстТоссА 4во
ТСАТОСТААТ ТАТТТОСТТА АТТТТТТІТС АТТТААТТІАА АТАСАДАААС ССТАТАТСТО 5аС
ТААТІТСААТ СТТАААТТОА ТТОСАТАААТ СТОТСАСАЛА ТСАДОТААТС ААТТАТСстТтТОе ОО
ТТАААСТОАТ ТАСАТАААТС ТСТСАСАААТ САААТСААСо АТТАСОАААС АТОТААСТТА 6Бо
АТЕСТААТТА СТААААТААС ТАТТІСТІТА ААТОСОАТОТ АСАСАТатТостТ АТІСТОАтТТтТ 720
ТОСССТСТтТТ ТТААТСТОАТ СТАСАСАТСТ СТАТАТССТО ТОТІТТТАТС АСАТСТСАСА 780
АТІТТТТТТО ТАТТОААТОТ ТОАТОТАСАС СТОТОААТТА СТОТАСАСАТ АТОТАсССАТО 840
СТОАТОСТОА СТАСАСАТОТ ОТАСТОТТСТ АТІТАТАТСС ААСТАСАСАТ СТОТАДССТЕ 900 бАААТАТОАА АСТТАСотТосС АТСТТААААА ТСААААТТІТО ААТТСТОСТО АТОАААТСто БО
АААТАААЛАТ ТААААТТСАА АТСТОСТОАТ ТІОТТОТТТОо ТТТІТОАТААТ ТАТСТТАТТА 1020
АТАААТАААС АТААТОТОСА ТААТОААТІТ АААТТАССАА АБАТОТААСТ ТААТТСААТТ 1080
АТТААААТАА ТОАТТТАААТ СТААТІТТТТ АТАТААТТАС ААТССТАССС ТТААСААСТА 1140
АХМААСОАААТ СААСООТТСА ТАТСТОТТСА СОСАСТТСАС ТтотТтосодоа ТІОТТСАсоСс 1200
ТООААСССТА СССТАТАТАТ АТАТАТАТАТ АТАТАТСАЛА ТТТТІТТААЛА АЛАТСССОТА 1260
ССССТСОАДА АЛАСОобОССТ ТАТоСОБАлО ТОСТОСТСОС АСАССТАААС АСССОсСССАТ 1320
ССТІТТОАТС АААТАСТТОТ АААТАСТААА АТАСАССАЛО ТСААТСООТО АААСТТАСТА 1380
ТСТТТТТТАТ ТОСААТТІТСА САТТАССТТА ТІТАСТІТТО АСАААСАССА САТААСААТТ 1440
ААССАСОТТАТ АСТСТОСАТСО ТІТОСОСТАТ ТІТТСАТАСТ ТААОоСТоСАС СТТІТОААТАТ 1500
ТІТАААСАТТ ТІТТІТІДЛАСТ ТОАТСАТААС ААТАТААСАА ТТААОСАСТТ АТООТСТОСАТ 1560 ооТІТОсстТТ АТСТТТТІССТ АСТААТТААС СТОССОСТІТ СААТСТОСТСА ААСААТАТАТ 15725
ТАТІТТТАСС ТАААЛАСОЛА ТОЛООСАТОС ТСАСААТОбО ААТТОЛАССО АСАССТАТТО 1680
СТІТААААТТ АЛАССТАТАА САААСТОАСС ТАСАСАТТТТІ ТААТІТАААА АТ й 1732 (1) Характеристики последовательности: (2) Даннье "последовательности 5ЕО ІО Мо 3: (А) Длина: 404 пар оснований (В)Тип: нуклеиновокислотньш (С) Цепочечность: двухцепочечная и олноцепочечная (С) Топология: линейная (Хі)Описание последовательности 5ЕО 10 Мо 3:
СТССАСТАТС ТТАСТТААТС АААТАААТІТ АТТІТТОАТТІТ СТТІТОТТАА ТОТАТТТТСТ
ССТАСТТТАА АСТССАТОТО ТАТТТАТАТА КТАТТАСТАА ТАТТТТАТТА АСАТСААТАС 120
АТОСТТСАбо ТІТТОТОТТА ОТСТТССТТТ ТІТАТАТОСТ ТТТАтТсАссо стотостТоТА 180
ССАТСАССАТ ТАТТТАААТА АТСАСОСАСТ ТСТТОСТТСТ ТАСТТАТТОА ТОСТАСбААСС 240
ТОАСАТОТАА СОААССОААС АСАТАТАААТ ААСАТТТТОб АТААСАТТАС сАСстТттТАТТТ зова
АТССОоТТОоСС АТОСАААТТТО бААСАСТтТОО ОТТААСАСАС ААССАСАТАТ ААТсТОАтТоо 360
ТАААТАССАТ ТТАСААСТАА ТОТТААТСТТ ТТОТТАСААА ТоТТ 404
-60 || -50 |! -40 І -2371 сслтСст -2340 ТІТАЛАЛАЛА ТСССОТАССС СТООЛАЛАЛА -2280 ССТАААСлАСС СОСССАТОСТ ТТТТЛАТСЛА -2220 АСТЛАЛАТСС АТТАСТТТАТ ЛААТАТТтТтТА -2160 АААТТАЛААА АСААЛАТОТО СЛАЛАТАСТС -9100 СССТТІТІССТ ТАЛСАЛАСТО ТТТЛАТТТАХл -2010 АЛАлЛАСсААС стос боб -1980 ТТАЛАСТАТА ЛАААІТТОССС ЛАлЛСсСстТелос -19290 АЛАТАСТАДАА ТАСАССЛАСТ СААТОССТСА -1860 АТТАССТТАТ ТТАСТТТТОА САЛЛСАСвАС -1800 ТІТССССТАТ ТТІТТСАТАСТ ТЛАостсСсСАС -1740 ТІСАТСАТАА СААТАТлЛАСА ЛТТлЛАСОАСТ -1680 ТАСТЛАТтТЛА СссТССсСсосСтТТ ТСлАТСТСсТо --1620 АТСлЛОлЛСАТО СІСАСААТоС СЛАТТслЛАСС -1560 АСАЛААСТСАС СТАСАСАТТТ ТІЛАТТТАлЛА -ї500 ТІТАТІТТОоА ТІТОТТТТОТ ТАЛІСТАТІТ -1440 АТААТАТТАС ТЛАТАТТТТА ТТАЛСАТОСЛА -1350 ТТТТТТАТАТ ССТТТТАтТСлА стТоототТостТ -1320 АСТТСТТСОТ ТСОТТАСТТАТ ТОАТСТЛСбА -17250 ААТААСАТТТ ТОбАТААСАТ ТАССАСтТТТА -1200 ТСОСІТААСА САСАЛССАСА ТАТАЛІСТоА - 140 сСтТтТТТСТТАС АЛАТОоТтТОТтТ лАСтТАбостТт -1080 СтТТСТТАССссС ТІТТАСлЛІСТ ЛОТЛАСАСАТ -1020 ААЛАСАСАСТА ЛАСАСЛАТСТ ЛоССАТОАТА -9960 АСТТІАТСАТС ТІСАТОАТОС АТАТЛСАСАТ -900 ТІССССбСОС ЛАСАСАССТО ТАТАААТАСсС -840 ССТОСТТАТА ТСАТАССТАТ САТСАСТТСА -Т80 ЛААлЛААТоТо бСТАТАСоСО САТОБТСАСА -717120 АСОТАСССТТ ЛОТТААТСАС АТАЛАТТТАТ -ББ50 ТЛАТТТСЛАС ТАСАСОТСОТА ТТТАТАТААТ -600 ССТТСАТСТТ ТІССОТТАСТ СТТССстТтТтТтТТ -540 САТТАТТТЛА АТААІСАСОоС лАосттІСстТтТест -490 ТЛАССЛАССС ААСЛАСАТАТА ЛАТААСлтТТтТ -420 БССАТСАААТ ТТОСААСАСТ ТООСТІТААСА -360 САТІТАСААС ТЛАТОТІЛАТ СтТІТТаТТАС -З300 АТТТТТААлЛО АСТАТАТОобТ СТІСТТАСсоС -42440 АЛАЛАЛААССА АССААДОТлЛА СТОТЛААСАС -180 АТІСТТСАТС АССАТСССАТ ТТАТАСТТАТ -120 ТАСТТАТАСА САТОТлосАтТ БтСстТСслостТо -560 ТТАСАтОтТСсА СстТІСсСсСтТоеСстТТ ОлЛІСТТСТТо 1 АТТСАССАСА ТСАСАТСССЛ ТтТоС
І 10 І 20 І 30
СР, т.
-0 І -20 І -19 І
СТАССТАТАТ АТАТАТАТАТ АТАТОЛАТТТ -234Х
СсССоССстТтТАТ бСоСлЛАСТСС ТОоСТСОСАСА -2251
АТАСЛТСТОС АТСАТСТАСТ БАТАОТТІТТ -2221
АЛІСТТТІТТ ТІТСТТТАТА ТАЛАЛАЛАСА -2161
СТОСТАТСААС ТАТОСАЛАЛА САСАЛАЛАЛА -2101
СТЛАСТІТОТ САТТІСЛАСо АЛЛАТТСАЛАС -2041
ТСТІТООТТА СЛАЛАЛОТТТ ТЛАТТІТТАСА -1981
АСАЛТТТТТА САТТТАТААС ТСАТТОТСТА -1921
ААСТТАСТАТ СТІТТТТАТТ ОСЛАТІТСАС -1861
АТААСАЛТТА АоблЛОТТАТА отстТоАтосоо -1801
СТІТСААЛТСТ ТІТАЛАСАТТ ТТТІТІТЛАС -1741
ТАТОАТСтТоА ТОоСІтТТОСОТ ТАТотТІТтТСо -1681
ЛАЛСАЛТАТА ТТАТТТТТТС ТТАЛлЛАлАСОА -1621
САСАССТАТТ ОСТТТААААТ ТААЛоСТАТА -1561
ЛАТОТСбАСТ АТСТТАСТТА АТСАЛАТАЛА -1501
ТСТССТААТТ ТАЛАСІССАТ СТОоТЛІТтТАТ -1441
ТАСАТтТОСстТІС ЛОоСстТтТтТІСтТо ТТАСТСтТтІСо -1381
СТАСОАТОАС САТТАТТТЛА АТААТОлАСоА -1321
ТОСТОАБАТо ТАлАСлЛАССО ААСАСАТАТА -1251
ТТТЛІСОоСТТ СССАТСАЛАТ ТТІЛСАЛОАТТ -1201
ТОСТАЛАТАС САТТТАСЛАС ТААТСТТААТ -1141
САТАТОТАЛА АТТТТТААЛАб АСТАТСлОСТ -1081
ТАЛАЛААДАЛА АлЛАССАлЛОСА ЛАСТЛАСТоТ -1021
ТООСТСАТТС ТТІСАТСАССА ТСССАТТТАТ -961
САТСТоТОСТ лЛеССТАСССАА ТІТТААСАСС -901
АЛІАСАТТАТА ЛАССАЛАТАС ССТАССТАТА -841
ССТІТССТТА САСТТОЛОСТ СБААЛААЛАТА -781
СТТІТТТІТОТ СТСбССАТАТ АСААтТІТІТо -721
ТІТСЛТТІТСТ ТІТСТІЛАТО ТАТТтТТСТоС -661
АТТАСТААТА ТТТТАТТАЛС ЛТСЛАТАСАТ -601
ТАТАТООТІТТ ТАТСлЛОТОСТ стТАСолЛІСАС -541
ТСТІАСТТАТ ТОАТОТАССА лЛостТоАсАтТо -4851
ТОБАТЛАСАТ ТАССАСТТТА ТТТАТоССІТ -421
САСЛЛССАСА ТАТАЛТІСТОА ТОСТААЛТАС -3б1
АЛЛІСТІСОТТ ААСТАСОСТТІ САТАТСТАлЛА -301
ТІТІАСАТСТ АСТАЛОЛОАТ ТАЛАЛАДАЛА -241
ЛОТЛАЛОАСА АТСТАОССАТ САТАтТосстТо -181
СЛІСТТОАТО АТОСАТАТАС АСЛЛАСЛСАС -121
САЛАТОСтТоА ТСТІСТССТС БСАТААССтТо -61
САСТАТЛАЛА ССАССТЛОТТ САСлЛАСАССТ -1 24
І 40 І 5о |! о
Ор. ЇЇ продолж.
-60 | -50 | 0-40 -2457 ССАТССТ СТАЛОЛАСТС СССЛАЛАТСТ -2400 СТАТАТАЛСА ССАТАТАЛАТ лЛОССтТАТЛАС -7340 ССТАТСТААС АСТАТАТЛАС АТТАТАТлЛАС 0 -2280 АТССТАТСЛС АСЛАССТАТА СТСТТАТАТТ -2220 ССТТАТАТСС ТАТТАТАТСо ТОТТЛСАТАТ -2160 ТАТТАТАТАТ АСТСТІЛТЛА ТАСАСТТСТС о -9100 АССТАТАТАТ АТАТАТАТАТ АТАТАЛАССА - -2040 СТСЛАСТОСС ТСлЛАСТСАТо тТолоСссстТтс -1950 ССАТОАТОоСТ ААТТАТТТОоС ТІЛАТтТтТТтТТ -1920 СТСТЛАТТТС АЛТСТІТЛАЛТ тТолЛтТтТосСАТА -1і860 ттстТтТллЛАСТ САТТАСАТЛА АТСТСТСАСА -1800 ТТЛАТІСТАА ТТАСТААЛАТ ЛАСТАТТТСоТ -1740 ТТТІССССТС ТІТТТАЛТСТ САТСТАСАСА -1680 АСЛАТТТІТТ ТТСТЛТТСЛА ТСТТСАТСТА -1620 АТОСТСАТСС ТСАСТАСЛСЛ ТСсТСТАСТСТ -1560 СТТСАЛАТАТ САЛАСТТАСС ТОоСАТСТТАА -1500 СТСАЛАТАЛА ЛАТТАЛАЛТТ бАЛАТСТоСТ -1440 ТТААТАЛАТА ЛАСАТААТСТ ССАТЛАТСЛА -1380 лЛТТАТТАЛАЛ ТЛАТСАТІТА ЛАТСІЛАТІТ -1320 СТААЛАЛАССА ЛАТСАЛСОСТ ТСАТАТСТОТ -1260 СССТОСАЛСС СТАСССТАТА ТАТАТАТЛТА -1200 СТАССССтТСС ЛАЛЛАлЛССсос ССтТтТАтТоСсо -1140 САТССТТТТб АТСЛААТАСТ ТСТАЛАТАСТ -1080 СТАТСТТТТТ ТАТТОСАЛАТТ ТСАСАТТАСС -1020 АТТАЛССАСТ ТАТАСтТСТОЛ тТостІтТоСос -960 ТАТТТТАЛАС АТТТТТТТТА АСТТСАТСЛТ -900 САТОССТТТСС СТТАТСТТТТ ССТАСТЛАТТ -840 ТАТТАТІТТТ ЛОСТАЛАЛАС СААтТолоссА -180 ТТОСТТТАЛА АТТАЛАССТА ТААСАЛАСТо
РА с. 2
-30 І -20 | -10 І
САСАЛОТСТА ТТАТААСАСТ АТАТАТЛАТА -2401
АСТАТСТАЛАС АССАТАТАЛС АСААТАТАлАС -2341
АЛАТАТАТААС АСТАТАСАТС ТАТСАСлЛОолЛС -2281
ТСТТАТАТАА ТОТТАТАТАС ТСТТАСАТАб -2221
ТОТТАТАССТ СТІТАТАТОоС ТСТТАТАТАС -2151
АСАСТТТОбо САСТТТТТАС ЛОоБАТСАТСТ -2101
ТІАССТІТСАА АСОТОААСАА АТІСССЛАСА -2041
АТІТТІТАТОА ТСТТОлЛОоАтТтІ ЛАлЛотТОЛоТо -1981
ТТСАТІТААТ ТАЛАТАСАЛА ЛАсОСТАТАТ -1921
АЛІСТСТСЛС АЛАТСААСТА АТСЛАТТЛТС -1861
ЛАТСАЛАТСА АССАТТЛоСА ЛАСАТоТлЛАС -1801
ТТАЛАТОСОА ТСТАСАСАТОо ТОТАТІСТОЛ -1741
ТОТСТАТАТС СТСТОТТІТТ АТОлЛСАТСТо -1681
САССТОТОАЛ ТтТАСТОТАСА САТАТОТАСо -1621
ТСТАТТТАТА ТОСЛАСТАСА САТОТОТААС -1551
АЛАТСЛАЛАТ ТТОЛАТІСТОо СТСАТОлЛЛАТ -1501
САТІТСТІСТ ТТСТІТТСАТ АЛАТТАТСТТА -1441
ТІТАЛАТТАС БАЛАСАТОТА АСТТААТТСА -1381І
ТІТАТАТААТ ТАСААТССТА СССТІТААСЛА -1221
ТсАСССлЛОаТТ САСІСТтТОобОо ЛОоСІТОТТСА -1261
ТАТАТАТАТС АЛАТІТТТТТ ААЛАААТССС -1201
АЛОТССТОСТ СОСАСАССТА лАСБАоСссосс -1141
ААЛАТАСлЛОС ЛАСТСААТОоС СТСАлЛАСТТА -1081
ТТАТТТАСТТ ТІСАСАААСА СОЛСАТАЛСА -1021
ТАТІТТТСАТ АСТІЛАСОТо СлЛОСТТТОАл -961
ДЛАСААТАТАА СЛАТІЛАССА БІТАтсСсСТСстТ -901
АлЛООТСССоб ТТТОААТСТС ТСАЛАСЛАТА -841
ТОоСТСАСЛАТ обОлЛАТтІсЛА СССлЛСАССтТА -781
ЛОСТАСАСАТ ТТТТААТТТА ААЛАТ
ЯРиас. ра продаж -720 СТАТСТІАСТ ТААТСЛААТА ААТТТАТТТТ -ББО ТТІТАААСІСС АТСТОТАТТТ АТАТААТАТТ -565ОО ТСАСОТТТТС ТОТТАСТІСТТ СОТТТТТТАТ -540 АССАТІАТТТ АААТААТСАС ССАСстТтСстТто -40 ТСТААССААС ССААСАСАТА ТАААТААсСАТ -й20 ТТОССАТОАА АТТІТОСААСА СТТООСТТАА -360 ДОСАТТТАСА АСТААТОТТА АТСТТІТСТТ
Фаг. З стосА -121
САТТТСТТІТ СТТААТОТАТ ТТТСТоСтТАо -661
АСТААТАТТТ ТАТТААСАТС ААТАСАТОоСТ -601
АТОСТТТТАТ САбСобТосТо СТСТАССАТес -541
СТІСТІТАСТТ АТТСАТОТАС СААССТОАСА -481
ТТІТООАТААСС АТТАСОАСТІ ТАТІТАТССо -421
БАСАСААССА САТАТААТСТ САТОСТАААТ -361
АСАААТСТТ
Фитго, З продолж.
Сг ,, 4 2376 424 Неаб3-А /60и5
Ноб3-А в- ГлЛукОРО МИ ДА А дп-т» ва! Ва! - - 5500 Есойві
Нтіпд п! -Кх -
Ба! 1 -88 07-24 ніраза? вич
ХвВа | ьо
Ват ПІ ССАДАТ /ТАТАДдА рВІ 12 Саму 355 В- /лукоРОна А АБА - ль
Ніпа ПІ Ба 58 Есопі!
Ват 1 та рВІ ОС в-глУКрРонНИй А ра 55 Есоп!і
Ніпа пі ба!
ХБа
Вага ПІ
Зта
Сан, 5
Есопі- Хбаї й. Вапі-вапь ! Ватні-Ваї и ! вх Нн Е 1 ЕРВІ І 5 Р Р5 В хн 5 шо її поло 1177000 ноб3-А лк, ! 5 РОРЗ В Е 5 І Н ІЕ 5
Наб3-0 КБ- - Є 15 Ж »5х'л' -4: 2:25 ( : А -Я 552-235 - - Ж« 2.5 - ф - 2: - - - 5
Фиг , б -88-75 -24:2453
САЛАТІ ТАТАДА АТО
"те аг ми 26 -2248-920 -1527 -950-738 - .. ТеВя / «-/ь «ь те
На03-Дд ий 000 ПОП 7/7 пен» .
Ватні Ба Ва.
НО -я- 5 5 « ль
НВ ---- - - - - - - А юю рі
ЗВ яр - юр ді ! 9д-де. -- - - 25353533 1
В-а2 -----!
Н-вд2д 0 ------------ 5 5 5 5 5 53535355 5 - - І ді 5З-в1 - 5 - ТИ ННОШНО- Я
ЕС. на жа аааалалалшТа попи вн -2457 -1246-НІВ -725 -2841 «в
Наш3-0 ГП БАННІ Е
Ватні ба! апа Ми ----
КВ вка ШЕ
У
. ,
КЯ-,
ТАГ,, аж ,' ков Й "М фам ря М дні
НЕ ій Ну,
Н
І ї
Є г. ллАВТВ стінові тестя ої - й гос . - 11 люта и. о о Код
Жаиого що | ши, ь и Г. т і В ке: БА ик о ва БО
Ж з Ж жо «Ж о НИ: сн. щей в т Ат. сот . ще і шецїї - "
Рис Ї С . а
ШТЕЛЯИИНЕЧЕНМ ЖК «Лов ев в нн нн о й Ж посуд нен: рН пен ЧОН, р не ИНА
Рис, То
Н ї інн пе и мВт важ пет
Во НІ нок ти с с З ШИЯ З т я у: з НК, нет» а й її й з ДИ з ; КО, ж ля І
У я у я 54 я т. се В г ІК Я
ШИ Бяю о дкрюи В ко. ма се
Й І "З ! щи Й п ! ї .
І т і; я , і З ; Ще з Й Му Щ "
Заочні Бик, - - Що: - Фа
Св г, ВЗА
З о е - -о--Водногй потеницм ВА -4 (чист) -е- МДЦ ИРОВлЛНИЕ -6
От -8 о є 4 б в ІО
День
Сг . вв
З о -е 2 С --0-- Воддьйй дозепьцд а (тзисг) -- Дно улигова ниє і -6
О--« -8 о 2 4 6 8 ІО
День
Стат й 9 гЗ х 6 о 1 5о-
У тл
Гой З о АВА ет (7 а -- ВА5АЇ. «г й о їм ко а
О па
І о а 8 і2 ІЄ го
І Час
Claims (36)
1. Вьіделенная молекула нуклейновой кислотьі, содержащая регуляторньй злемент гена гелиантинина, где указанньійй регуляторньійй злемент управляєт семя-специфичной генной зкспрессией в растений и включает нукдеотидьі! 2304-2401 5ЕО ІЮ МО: 1: ССТОБСА ТААССТСТТА САТОТСАСТТ ССТОСТТІвАТ СТТСТТССАС ТАТАЛААССА ОСТАСТТСАС ААСАССТАТТ САССАСАТСА САТСССАТТС (о
2. Вьіделенная молекула нуклейиновой кислотьі, содержащая регуляторньй злемент гена гелиантинина, где указанньій регуляторньйй злемент управляет корень-специфичной генной зкспрессией в растений и включаєет нуклеотидьї 851-1639 или 1-1639 5ЕО ІЮ МО: 1: ССАТССТСТА ССТАТАТАТА ТАТАТАТАТА ТОЛАТТІТТТ ААЛААААТоС СОоТАССоСтТо САДААААСОоС ОССТТАТОСО САДСТОСТСС ТСССАСАССТ ДААСАбССоС ССАТОоСТТТТ ТААТСАДАТА САТСТОСАТС АТСТАСТОАТ АСТТТТІТАСТ ААААТССАТТ АСТІТАТААА ТАТТТТАААТ СТТТІТТТІТ СТІТАТАТАА АЛАЛАСАДАА ТТААДАЛАСА АААТОТССАА ААТАСТОСТОо ТАТСААСТАТ ОСАААААСАС АААААААСоС ТІТТОСТТАА САААОТСТТТ ААТТТААСТА АСТТТСОТСАТ ТТСААССААА ТТСАААСАДЛА ААСОААСотТо собососСобо ссТОобОоСстТотТ ТТОСТТАСАА АААСТТІТТАА ТІТТАСАТТА ААСТАТАААА АТТОСССАДА ССТСЛОБАСА АТТІТІТАСАТ ТТАТААСТСА ТТОТСТАААТ АСТААААТАС АССААСТСАА ТОООТОАААС ТТАСТАТСТІ ТІТТАТТОСА АТТТСАСАТТ АССТТАТТТА СТІТТОАбАА АБАСОАСАТА АСААТТААСО АСТТАТАСТС ТОАТоООТТТ ОСОСТАТІТТТ ТСАТАСТТАХ ССТССАОСТТ ТОААТСТІТТ АААСАТТІТТТ ТТТТААСТТО АТСАТААСАА ТАТААСААТТ. МАСОАСТТАТ САТСТОАТОос ТТТОСОТТАТ СТТТТСОТАС ТААТТАдДОоСТ СССОоСсТТтТоА АТСТСТСААА СААТАТАТТА ТТТТІТТСТТА ААААСОААТО АбАСАТОСТС АСААТОоООАА ТТОААССОАС АССТАТТОСТ ТТААААТТАА АОСТАТААСА ААСТОДОСТА САСАТТТТТА АТІТАААААТ СТСОАСТАТС ТТАСТТААТС АААТАЛАТТІТ АТІТТСАТТТ СсТТТТСТТАА ТОТАТТТІТСТ ССТААТТТАА АСТССАТОТОо ТАТТТАТАТА АТАТТАСТАА ТАТТІТАТТА АСАТСААТАС АТОСТТСАСо ТІТТОТОТТА СТСТТССТТТ ТТТАТАТОСТ ТІТАТСАСсТОо СТОТОСТОТА ССАТСАССАТ ТАТІТАААТА АТОСАССААСТ ТСТТОСсТТСТ ТАСТТАТТСА
ТОТАСОААОС ТОАСАТОТАА СОААССОДАС АСАТАТАААТ ААСАТТТТОО АТААСАТТАС САСТІТАТІТ АТСОСТТОСС АТОАААТІТА СААСАТТТОО СТТААСАСАС ААССАСАТАТ ААТСТОАТОС ТАААТАССАТ ТТАСААСТАА ТОТТААТСТТ ТІСТТАСАЛА ТОТТОТТААС ТАСОСТТОАТ АТОТААЛАТТ ТІТАААСАСТ АТСАбОТОТТ СТТАСООТТТ ТАСАТСТАСТ МАСАСАТТАА ААААААЛАЛА ОСАДОСАААС ТААСТОТААА САСАСТАААС АСААТОТАОС САТОАТАТОС СТОАТТСТТС АТСАССАТСС САТТТАТАСТ ТАТСАТСТТО АТОСАТОСАТА ТАСАСАТОАТ СТОТОСТАСОо ТАССОААТТТ ТААСАОСТТо ССБОСОСААС АСАСОСТОТАТ МААТАССАТА САТТАТААДАС САААТАСОСТ АСОТАТАООТ ООТТАТАТОА ТАССТАТОАТ САСТТОАССТ ТТСОТТАСАС ТТСАССТОАА АААДАТАААА АААТОТООСТ АТАСОоСОсСАТ соТсАсАет 77777:
3. Вьделенная молекула нуклейновой кислотьі, содержащая регуляторньй злемент гена гелиантинина отличающаяся тем, что указанньй регуляторньй злемент управляєт генной зкспрессией в ответ на АВА в растений и включаєет нуклеотидную последовательность, вбиібранную из 1-2401 5ЕО ІО МО: 1, 851-1639 5ЕО ІЮ МО: 1, 1639-2303 5ЕО ІЮ МО: 1 или 1-404 5БЕО ІЮО МО: 3: 5ЕОСЕМСЕ РЕЗСКІРТІОМ: 5ЕО 10 МО:1: ССАТССТСТА ССТАТАТАТА ТАТАТАТАТА ТОЛАТТТТТТ АААААААтТоСс сотТАСсссСсТо САДААААСООо СССТТАТОСО СААСТОСТОСС ТСОСАСАССТ АААСАоССОоС ССАТОоСТТТТ ТААТСАААТА САТОТОСАТС АТОТАСТОАТ АСТТТТТАСТ ААААТССАТТ АОТТТАТААДА ТАТТТТАААТ ОТТТТТТТТТ СТТІТАТАТАА ДАДАДСАААА ТТАДАДААСА АДАТОТССАд ААТАСТОСТО ТАТСААСТАТ ССААЛАААСАС ААААДААССС ТТТТОСТТАА САААСТоТТТ ААТТТААСТА АСТТТОТСАТ ТТОААСОААА ТТСАААСАДА ДАСОААсСотТо обоососооо оСТОоООбоТОоТ ТТОСТТАСАА ДААСТТІТТАА ТІТТАСАТТА ААСТАТАААА АТТОСССААДА ССТСАбБОАСА АТТТТТАСАТ ТТАТААСТСА ТТІОТСТАААТ АСТААААТАС АССААСТСАА ТОООТОАААС ТТАСТАТСТТ ТІТТАТТОСА АТТТСАСАТТ АССТТАТТТА СТТТТСАСАА АСАССАСАТА АСААТТААОО АСТТАТАСТС ТСАТСОСТІТ ССОСТАТТТТ ТСАТАСТТАА ССТССАСОТТ ТОААТСТТТТ АЛАСАТТТТТ ТІТТААСТТО АТСАТААСАА ТАТААСААТТ. ААСОАСТТАТ САТСТОАТОос ТТТОССТТАТ СТІТТССТАС ТААТТАЛОоСТ СССОоСТтТТоА АТСТСТСААА СААТАТАТТА ТТТТТТСТТА ААААСОААТО АСАСАТОСТС АСААТоСсААд ТТВБААССОАС АССТАТТОСТ ТТААААТТАА АССТАТААСА ААСТОАОСТА САСАТТТТТА
АТТІТАААААТ СТССАСТАТС ТТАСТТААТОС АДАТАААТТІТ АТТТТОАТТтТ СТІТТОТТАА ТСТАТТТТСТ ССТААТТТАЛ АСТССАТСТО ТАТТТАТАТА АТАТТАСТАА ТАТТТТАТТА АСАТСААТАС АТОСТТСАСС ТТТТСТОТТА СТСТТССТТТ ТТТАТАТОСТ ТТТАТСАСТО СТОТОСТОТА ССАТСАССАТ ТАТТТАААТА АТСАССААСТ ТСТТОСТТСТ ТАСТТАТТоА ТОСТАСОАдДОС ТОАСАТОТАА СОААССОДАС АСАТАТАЛАТ ААСАТТТТОО АТААСАТТАС САСТТТАТТТ АТСОСТТІССС АТОАААТТТА СААСАТТТОС СТТААСАСАС ААССАСАТАТ ААТОТОАтТОос ТАДАТАОСАТ ТТАСААСТАА ТОТТААТСТТ ТІСТТАСААА ТОТТСТТААС ТАСОСТТСАТ АТОТААААТТ ТІТААЛАСАСТ АТСАООТОТТ СТТАСОСТТТ ТАСАТСТАСТ ДАСАСАТТАА ААДАААДЛААА ОСАДОСААЛАО ТААСТОТААА бАБАСТААЛО ДОААТОТАОС САТОАТАТОО СТОАТТОТТС АТСАССАТСС САТТТАТАСТ ТАТСАТСТТО АТОАТОСАТА ТАСАСАТСАТ СТСТОСТАСО ТАССОААТТТ ТААСАССТТС ССОССОСААС АСАСОТСТАТ АААТАССАТА САТТАТАЛАС САЛАТАСОСТ АССТАТАССТ ССТТАТАТСА ТАССТАТОАТ САСТТОАССТ ТТССТТАСАС ТТОАССТОАА ААЛААТААЛАА АААТОТСОСТ АТАСОСОСАТ ОСТСАСАСТТ ТТТТТСТСТО СССАТАТАСА АТТТТТОАСО ТАСССТТАСТ ТААТСАСАТА ААТТТАТТТТ САТТТСТТТТ СТТААТОТАТ ТТТСТОСТАА ТТТСААСТАО АССТОТАТТТ АТАТААТАТТ АСТААТАТТТ ТАТТААСАТС ААТАСАТОСТ ТСАТСТТТТо ССТТАСТСТТ ССТТТТТТАТ АТОСТТТТАТ САСТОСТОТА ССАТСАССАТ ТАТТТАААТА АТСАСОСАСТ ТСТТОСТТСТ ТАСТТАТТОА ТОТАССАДОС ТОАСАТОТАА ССААССОЛАС АСАТАТАЛАТ ДАСАТТТТОС АТААСАТТАС САСТТТАТТТ АТСООТТОСС АТОАЛАТТТО СААСАСТТоо СТТАДСАСАС ААССАСАТАТ ААТСТОАТОС ТАААТАССАТ ТТАСААСТАА ТСТТААТСТТ ТТСТТАСААА ТОТТОТТААС ТАСОСТТСАТ АТСТААААТТ ТТТАААСАСТ АТАТОСТСТТ СТТАСОСТТТ ТАСАТСТАСТ ААСАСАТТАА ААААЛАААЛА ААААОСААСО АААСТААСТо ТАЛАСАСАСТ АААСАСААТО ТАСССАТСАТ АТООСТСАТТ СТТСАТСАСС АТСССАТТТА ТАСТТАТСАТ СТТОАТОАТО САТАТАСАСА ААСАСАСТАС ТТАТАСАСАТ СТАОСсАтТоТС ТСАБСТССАА АТОСТОАТСТ ТСТоСТОбСА ТААССТСТТА САТОТСАСТТ ССТОСТТОАТ СТТІСТТССАС ТАТААААССА ОСТАСТТСАС ВАСАССТАТТ САССАСАТСА САТСССАТТС (о последовательность 5859 1 ХХ З: СТСОАСТАТС ТТАСТТААТС АЛАТАААТТТ АТТІТТСАТТТ СТТТТОТТАА ТСТАТТТТСТ
ССТАСТТТАА АСсТССАтТСтТо ТАТТТАТАТА АтТАТТ АСТАХ ТАТТТТАТТА АТАТІААТАТ АТОСТТСАбо ТТІТТСТСоТТА сукомишмої си ши "ИТТТАТА русісни ТТІТАТеІАосо ОТСТОСТотТА -е - СОАТСАССАТ ТАТТТАААТА АТСАСОоСАСТ ТСтт сісишкеим ТАСТТАТТОА ТотТА УОТАСОАДдОоС ТОАСАТОТАА СОААССбАдАс АСАТАТААДАТ ААСАТтТтТтТоб АТААбАтТтТАсС САсСТТтТАТТТ АТСОСТТОСС АТОДААтТТТо СААСАСТТОб СТТАДСАсСАсС ААССАСАТАТ дАТСТо АТСС ТАААТАбСАТ ТТАСААСТАА ТСТТААТсТтТ ТТСТТАСАДА ТСсТттТ
4. Вьіделенная молекула нуклейновой кислотьі, содержащая регуляторньй злемент гена гелиантинина, отличающаяся тем, что указанньйй регуляторньійй злемент управляет временно измененной генной зкспрессией в растений и включаєт нукдеотидь 1-851 или 1639-2303 5ЕО ІЮ МО: 1.
5. Химерньй растительньй ген, включающий 5'-фланкирующую область, оперативно соединенную с кодирующей последовательностью гетерологичного гена, отличающийся тем, что указанная кодирующая последовательность гетерологичного гена оперативно связана с сайтом 3'-полиаденилирования, и где указанная 5-фланкирующая область включаєт молекулу нуклейиновой кислоть, охарактеризованную в п. 1.
6. Химерньй растительньй ген по п. 5, отличающийся тем, что дополнительно содержит промотор, которьй функционирует в растениях, где указанньій промотор оперативно связан по 5'-концу с указанной кодирующей последовательностью, а по 3-концу - с указанной молекулой нуклеийновой кислоть!.
7. Химерньій растительньйй ген по п. 6, отличающийся тем, что указанньйй промотор представляет собой промотор вируса растения.
8. Химерньй растительньй ген по п. 7, отличающийся тем, что указанньйй промотор представляєт собой промотор вируса мозайики цветной капусть!.
9. Химерньй растительньй ген, включающий 5'-рланкирующую область оперативно соединенную с кодирующей последовательностью гетерологичного гена, отличающийся тем, что указанная кодирующая последовательность гетерологичного гена оперативно связана с сайтом 3'-полиаденилирования и где указанная 5-фланкирующая область включаєт молекулу нуклейиновой кислоть, охарактеризованную в п. 2.
10. Химерньй растительньїй ген по п. 9, отличающийся тем, что содержит промотор, которьій функционирует в растениях, где указанньй промотор оперативно связан опо 5-концу с указанной кодирующей последовательностью, а по 3-концу - с указанной молекулой нуклеийновой кислоть.
11. Химерньй растительньій ген по п. 10, отличающийся тем, что указанньій промотор представляет собой промотор вируса растения.
12. Химерньй растительньїй ген по п. 11, отличающийся тем, что указанньій промотор представляет собой промотор вируса мозайики цветной капусть!.
13. Химерньй растительньй ген, включающий 5'-фланкирующую область, оперативно соединенную с кодирующей последовательностью гетерологичного гена, отличающийся тем, что указанная кодирующая последовательность гетерологичного гена оперативно связана с сайтом 3'-полиаденилирования и где указанная 5-фланкирующая область включаєт молекулу нуклейиновой кислоть, охарактеризованную в п. 3.
14. Химерньй растительньй ген по п. 13, отличающийся тем, что содержит промотор, которьій функционируеєт в растениях, где указанньй промотор оперативно связан опо 5-концу с указанной кодирующей последовательностью, а по 3-концу - с указанной молекулой нуклеийновой кислоть.
15. Химерньй растительньїй ген по п. 14, отличающийся тем, что указанньій промотор представляет собой промотор вируса растения.
16. Химерньй растительньїй ген по п. 15, отличающийся тем, что указанньій промотор представляет собой промотор вируса мозайики цветной капусть!.
17. Химерньй растительньй ген, включающий 5'-фланкирующую область, оперативно соединенную с кодирующей последовательностью гетерологичного гена, отличающийся тем, что указанная кодирующая последовательность гетерологичного гена оперативно связана с сайтом 3'-полиаденилирования и где указанная 5-фланкирующая область включаєт молекулу нуклейиновой кислоть, охарактеризованную в п. 4.
18. Химерньй растительньй ген по п. 17, отличающийся тем, что дополнительно содержит промотор, которьй функционирует в растениях, где указанньій промотор оперативно связан по 5'-концу с указанной кодирующей последовательностью, а по 3-концу с указанной молекулой нуклеиновой кислоть!.
19. Химерньй растительньїй ген по п. 183, отличающийся тем, что указанньій промотор представляет собой промотор вируса растения.
20. Химерньй растительньїй ген по п. 19, отличающийся тем, что указанньй промотор представляет собой промотор вируса мозайики цветной капусть!.
21. Трансформирующий растение вектор, отличающийся тем, что содержит химерньій растительньй ген, охарактеризованньй в п. 5.
22. Трансформирующий растение вектор, отличающийся тем, что содержит химерньій растительньй ген, охарактеризованньй в п. 9.
23. Трансформирующий растение вектор, отличающийся тем, что содержит химерньій растительньй ген, охарактеризованньй в п. 13.
24. Трансформирующий растение вектор, отличающийся тем, что содержит химерньій растительньй ген,
охарактеризованньй в п. 17.
25. Растительная клетка, отличающаяся тем, что содержит химерньй растительньй ген, охарактеризованньй в п. 5.
26. Растительная клетка по п. 25, отличающаяся тем, что представляєт собой клетку хлопка, табака, масличного рапса, кукурузь! или сои.
27. Растительная клетка, отличающаяся тем, что содержит химерньй растительньй ген, охарактеризованньй в п. 9.
28. Растительная клетка по п. 27, отличающаяся тем, что представляєт собой клетку хлопка, табака, масличного рапса, кукурузь! или сои.
29. Растительная клетка, отличающаяся тем, что содержит химерньй растительньй ген, охарактеризованньй в п. 13.
30. Растительная клетка по п. 29, отличающаяся тем, что представляет собой клетку хлопка, табака, масличного рапса, кукурузь! или сои.
31. Растительная клетка, отличающаяся тем, что содержит химерньй растительньй ген, охарактеризованньй в п. 17.
32. Растительная клетка по п. 31, отличающаяся тем, что указанная растительная клетка представляет собой клетку хлопка, табака, масличного рапса, кукурузь! или сои.
33. Способ получения растения, которое проявляеєт устойчивость к гербициду, которьій предусматриваєт трансформацию растительной клетки трансформирующим вектором, охарактеризованньм в п. 21, и регенерацию указанного растения из указанной трансформированной растительной клетки.
34. Способ получения растения, которое проявляет устойчивость к гербициду, которьій предусматривает трансформацию растительной клетки трансформирующим вектором, охарактеризованньм в п. 22, и регенерацию указанного растения из указанной трансформированной растительной клетки.
35. Способ получения растения, которое проявляет устойчивость к гербициду, которьій предусматривает трансформацию растительной клетки трансформирующим вектором, охарактеризованньм в п. 23, и регенерацию указанного растения из указанной трансформированной растительной клетки.
36. Способ получения растения, которое проявляет устойчивость к гербициду, которьій предусматриваєт трансформацию растительной клетки трансформирующим вектором, охарактеризованньм в п. 24, и регенерацию указанного растения из указанной трансформированной растительной клетки.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US68235491A | 1991-04-08 | 1991-04-08 | |
| PCT/US1992/002822 WO1992017580A1 (en) | 1991-04-08 | 1992-04-07 | Chimeric plant genes based on upstream regulatory elements of helianthinin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA44217C2 true UA44217C2 (uk) | 2002-02-15 |
Family
ID=24739323
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA93003973A UA44217C2 (uk) | 1991-04-08 | 1992-07-04 | Виділена молекула нуклеїнової кислоти (варіанти), химерний рослинний ген (варіанти), трансформуючий рослину вектор (варіанти), рослинна клітина (варіанти), спосіб одержання рослини, що проявляє стійкість до гербіциду (варіанти) |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5859325A (uk) |
| EP (1) | EP0579726A4 (uk) |
| JP (1) | JPH06509939A (uk) |
| KR (1) | KR100228918B1 (uk) |
| AU (1) | AU672949B2 (uk) |
| BR (1) | BR9205873A (uk) |
| CA (1) | CA2107583A1 (uk) |
| IE (1) | IE921108A1 (uk) |
| IL (1) | IL101508A0 (uk) |
| MX (1) | MX9201592A (uk) |
| UA (1) | UA44217C2 (uk) |
| WO (1) | WO1992017580A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA922542B (uk) |
Families Citing this family (58)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5780709A (en) * | 1993-08-25 | 1998-07-14 | Dekalb Genetics Corporation | Transgenic maize with increased mannitol content |
| US6118047A (en) | 1993-08-25 | 2000-09-12 | Dekalb Genetic Corporation | Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction |
| EP0907728B1 (en) * | 1996-05-17 | 2004-10-20 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Promoter elements conferring root-preferred gene expression |
| US5981841A (en) * | 1996-08-30 | 1999-11-09 | Monsanto Company | Early seed 5' regulatory sequence |
| US5959175A (en) * | 1997-04-09 | 1999-09-28 | Thomas; Terry L. | Sunflower albumin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition |
| EP1007683A1 (en) * | 1997-07-12 | 2000-06-14 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Coffee storage proteins |
| US7897843B2 (en) | 1999-03-23 | 2011-03-01 | Mendel Biotechnology, Inc. | Transcriptional regulation of plant biomass and abiotic stress tolerance |
| US20050086718A1 (en) | 1999-03-23 | 2005-04-21 | Mendel Biotechnology, Inc. | Plant transcriptional regulators of abiotic stress |
| US6677503B1 (en) | 1999-06-23 | 2004-01-13 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Sunflower anti-pathogene proteins and genes and their uses |
| GB9923306D0 (en) | 1999-10-01 | 1999-12-08 | Isis Innovation | Diagnostic and therapeutic epitope, and transgenic plant |
| US6667427B1 (en) * | 1999-10-14 | 2003-12-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Sclerotinia-inducible promoters and their uses |
| EP1950306A1 (en) | 1999-11-17 | 2008-07-30 | Mendel Biotechnology, Inc. | Environmental stress tolerance genes |
| WO2001036597A1 (en) | 1999-11-17 | 2001-05-25 | Mendel Biotechnology, Inc. | Plant biochemistry-related genes |
| WO2002015675A1 (en) | 2000-08-22 | 2002-02-28 | Mendel Biotechnology, Inc. | Genes for modifying plant traits iv |
| FR2815969B1 (fr) | 2000-10-30 | 2004-12-10 | Aventis Cropscience Sa | Plantes tolerantes aux herbicides par contournement de voie metabolique |
| EP1401849A4 (en) * | 2001-05-30 | 2005-05-18 | Chromos Molecular Systems Inc | ARTIFICIAL PLANT CHROMOSOMES, THEIR USE AND METHOD FOR THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL PLANT CHROMOSOMES |
| GB0212885D0 (en) | 2002-06-05 | 2002-07-17 | Isis Innovation | Therapeutic epitopes and uses thereof |
| AU2003245772A1 (en) | 2002-06-28 | 2004-01-19 | University Of Guelph | Harvest-inducible genes form alfalfa (medicago sativa) and methods of use thereof |
| US7329798B2 (en) * | 2002-06-28 | 2008-02-12 | University Of Guelph | Harvest-inducible regulatory elements and methods of using same |
| FR2844142B1 (fr) | 2002-09-11 | 2007-08-17 | Bayer Cropscience Sa | Plantes transformees a biosynthese de prenylquinones amelioree |
| ATE539158T1 (de) | 2002-09-18 | 2012-01-15 | Mendel Biotechnology Inc | Polynukleotide und polypeptide in pflanzen |
| FR2848570B1 (fr) | 2002-12-12 | 2005-04-01 | Bayer Cropscience Sa | Cassette d'expression codant pour une 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps) et plantes tolerantes aux herbicides la contenant |
| US10105437B2 (en) | 2004-04-28 | 2018-10-23 | Btg International Limited | Epitopes related to coeliac disease |
| NZ550600A (en) | 2004-04-28 | 2010-03-26 | Btg Int Ltd | Epitopes related to coeliac disease |
| EP2716654A1 (en) | 2005-10-24 | 2014-04-09 | Evogene Ltd. | Isolated polypeptides, polynucleotides encoding same, transgenic plants expressing same and methods of using same |
| EP3196310B1 (en) | 2007-04-27 | 2020-07-08 | The Regents of The University of California | Plant co2 sensors, nucleic acids encoding them, and methods for making and using them |
| UY33139A (es) | 2009-12-23 | 2011-07-29 | Bayer Cropscience Ag | Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd |
| ES2659085T3 (es) | 2009-12-23 | 2018-03-13 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de HPPD |
| ES2659086T3 (es) | 2009-12-23 | 2018-03-13 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de HPPD |
| AR079883A1 (es) | 2009-12-23 | 2012-02-29 | Bayer Cropscience Ag | Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd |
| EP2516631B1 (en) | 2009-12-23 | 2018-02-14 | Bayer Intellectual Property GmbH | Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides |
| CA2788052C (en) | 2010-02-02 | 2020-02-04 | Bayer Cropscience Ag | Soybean transformation using hppd inhibitors as selection agents |
| ES2588802T3 (es) | 2010-11-10 | 2016-11-04 | Bayer Cropscience Ag | Variantes de HPPD y procedimientos de uso |
| US9157091B2 (en) | 2011-02-24 | 2015-10-13 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Materials and method for modifying a biochemical component in a plant |
| WO2012130684A1 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Bayer Cropscience Ag | Use of n-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)benzamides for controlling unwanted plants in areas of transgenic crop plants being tolerant to hppd inhibitor herbicides |
| EP2688406B1 (en) | 2011-03-25 | 2015-04-22 | Bayer Intellectual Property GmbH | Use of n-(tetrazol-4-yl)- or n-(triazol-3-yl)arylcarboxamides or their salts for controlling unwanted plants in areas of transgenic crop plants being tolerant to hppd inhibitor herbicides |
| PL2764101T3 (pl) | 2011-10-04 | 2017-09-29 | Bayer Intellectual Property Gmbh | RNAi do kontroli grzybów i lęgniowców poprzez hamowanie genu dehydrogenazy sacharopinowej |
| US10689660B2 (en) | 2012-06-22 | 2020-06-23 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for mediating plant stomatal development in response to carbon dioxide and applications for engineering drought tolerance in plants |
| WO2014043435A1 (en) | 2012-09-14 | 2014-03-20 | Bayer Cropscience Lp | Hppd variants and methods of use |
| CN104955947A (zh) | 2013-01-29 | 2015-09-30 | 格拉斯哥大学董事会 | 用于增加植物中胁迫耐受性和生物量的方法和工具 |
| WO2015000914A1 (en) | 2013-07-01 | 2015-01-08 | Bayer Cropscience Nv | Methods and means for modulating flowering time in monocot plants |
| EP3049517B1 (en) | 2013-09-24 | 2018-04-11 | Bayer CropScience NV | Hetero-transglycosylase and uses thereof |
| EP3117003B1 (en) | 2014-03-11 | 2019-10-30 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Hppd variants and methods of use |
| WO2016050512A1 (en) | 2014-10-03 | 2016-04-07 | Bayer Cropscience Nv | Methods and means for increasing stress tolerance and biomass in plants |
| BR112017017798A2 (pt) | 2015-02-18 | 2018-04-10 | Univ Iowa State Res Found Inc | método para aumentar o teor de proteína numa célula eucariótica, célula, coleta de células, tecido, órgão, organismo, híbrido, semente e planta |
| US10597674B2 (en) | 2015-09-11 | 2020-03-24 | Basf Agricultural Solutions Seed, Us Llc | HPPD variants and methods of use |
| WO2017184727A1 (en) | 2016-04-21 | 2017-10-26 | Bayer Cropscience Lp | Tal-effector mediated herbicide tolerance |
| KR102374017B1 (ko) * | 2016-05-24 | 2022-03-14 | 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 | 식물 조절 요소 및 이들의 용도 |
| EP3269816A1 (en) | 2016-07-11 | 2018-01-17 | Kws Saat Se | Development of fungal resistant crops by higs (host-induced gene silencing) mediated inhibition of gpi-anchored cell wall protein synthesis |
| US20190225974A1 (en) | 2016-09-23 | 2019-07-25 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Targeted genome optimization in plants |
| US11091772B2 (en) | 2016-11-23 | 2021-08-17 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | AXMI669 and AXMI991 toxin genes and methods for their use |
| KR20190095411A (ko) | 2016-12-22 | 2019-08-14 | 바스프 아그리컬쳐럴 솔루션즈 시드 유에스 엘엘씨 | 선충 해충의 방제를 위한 ｃｒｙ１４의 용도 |
| UY37571A (es) | 2017-01-18 | 2018-08-31 | Bayer Cropscience Lp | Gen de toxina bp005 y procedimientos para su uso |
| US11286498B2 (en) | 2017-01-18 | 2022-03-29 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Use of BP005 for the control of plant pathogens |
| WO2018165091A1 (en) | 2017-03-07 | 2018-09-13 | Bayer Cropscience Lp | Hppd variants and methods of use |
| WO2019083808A1 (en) | 2017-10-24 | 2019-05-02 | Basf Se | IMPROVING HERBICIDE TOLERANCE AGAINST HPPD INHIBITORS BY REGULATION OF PUTATIVE REDUCED 4-HYDROXYPHENYLPYRUVATE REDUCES IN SOYBEANS |
| WO2019083810A1 (en) | 2017-10-24 | 2019-05-02 | Basf Se | IMPROVING HERBICIDE TOLERANCE FOR 4-HYDROXYPHENYLPYRUVATE DIOXYGENASE (HPPD) INHIBITORS BY NEGATIVE REGULATION OF HPPD EXPRESSION IN SOYBEANS |
| CN108103156A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-06-01 | 苏州百源基因技术有限公司 | 用于检测葵花dna的特异性引物和探针及实时荧光定量pcr试剂盒 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4394443A (en) * | 1980-12-18 | 1983-07-19 | Yale University | Method for cloning genes |
| DE3687682T2 (de) * | 1985-08-07 | 1993-08-19 | Monsanto Co | Glyphosat resistente pflanzen. |
| NZ221258A (en) * | 1986-07-31 | 1990-05-28 | Calgene Inc | Acyl carrier protein - dna sequence and synthesis |
| NZ228320A (en) * | 1988-03-29 | 1991-06-25 | Du Pont | Nucleic acid promoter fragments of the promoter region homologous to the em gene of wheat, dna constructs therefrom and plants thereof |
| ATE241007T1 (de) * | 1990-03-16 | 2003-06-15 | Calgene Llc | Dnas, die für pflanzliche desaturasen kodieren und deren anwendungen |
-
1992
- 1992-04-06 IL IL101508A patent/IL101508A0/xx unknown
- 1992-04-07 KR KR1019930703055A patent/KR100228918B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-04-07 MX MX9201592A patent/MX9201592A/es unknown
- 1992-04-07 JP JP4509101A patent/JPH06509939A/ja active Pending
- 1992-04-07 BR BR9205873A patent/BR9205873A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-04-07 EP EP92909899A patent/EP0579726A4/en not_active Withdrawn
- 1992-04-07 CA CA002107583A patent/CA2107583A1/en not_active Abandoned
- 1992-04-07 AU AU16819/92A patent/AU672949B2/en not_active Ceased
- 1992-04-07 IE IE110892A patent/IE921108A1/en unknown
- 1992-04-07 WO PCT/US1992/002822 patent/WO1992017580A1/en not_active Application Discontinuation
- 1992-04-08 ZA ZA922542A patent/ZA922542B/xx unknown
- 1992-07-04 UA UA93003973A patent/UA44217C2/uk unknown
-
1994
- 1994-05-16 US US08/243,541 patent/US5859325A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-07 US US08/480,344 patent/US5905186A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100228918B1 (ko) | 1999-12-01 |
| CA2107583A1 (en) | 1992-10-09 |
| MX9201592A (es) | 1992-10-01 |
| AU672949B2 (en) | 1996-10-24 |
| ZA922542B (en) | 1992-12-30 |
| JPH06509939A (ja) | 1994-11-10 |
| BR9205873A (pt) | 1994-08-23 |
| WO1992017580A1 (en) | 1992-10-15 |
| AU1681992A (en) | 1992-11-02 |
| IL101508A0 (en) | 1992-12-30 |
| US5859325A (en) | 1999-01-12 |
| US5905186A (en) | 1999-05-18 |
| EP0579726A4 (en) | 1995-04-19 |
| IE921108A1 (en) | 1992-10-21 |
| EP0579726A1 (en) | 1994-01-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA44217C2 (uk) | Виділена молекула нуклеїнової кислоти (варіанти), химерний рослинний ген (варіанти), трансформуючий рослину вектор (варіанти), рослинна клітина (варіанти), спосіб одержання рослини, що проявляє стійкість до гербіциду (варіанти) | |
| RU2130491C1 (ru) | Фрагмент днк (варианты), слитый фрагмент днк для экспрессии в растениях и способ получения трансгенного растения и его потомков | |
| US7674952B2 (en) | Stress-inducible plant promoters | |
| Crane et al. | Transgenic Medicago truncatula plants obtained from Agrobacterium tumefaciens-transformed roots and Agrobacterium rhizogenes-transformed hairy roots | |
| An et al. | Organ-specific and developmental regulation of the nopaline synthase promoter in transgenic tobacco plants | |
| US8053639B2 (en) | Hydroxyproline-rich glycoprotein promoter | |
| US20040123347A1 (en) | Water-deficit-inducible plant promoters | |
| Anuradha et al. | Genetic transformation of peanut (Arachis hypogaea L.) using cotyledonary node as explant and a promoterless gus:: npt II fusion gene based vector | |
| CN110904071B (zh) | Raf49蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用 | |
| CA2640686A1 (en) | Novel plant expression constructs | |
| PL204789B1 (pl) | Promotor, rekombinowana konstrukcja DNA, transgeniczna komórka roślinna, transgeniczna roślina i sposób wytwarzania transgenicznej rośliny | |
| CN101516180A (zh) | 早熟的转基因植物 | |
| CN112062823B (zh) | Glk7蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用 | |
| CN107058317B (zh) | 一种花粉特异性启动子及其应用 | |
| CA2555332A1 (en) | Regulation of gene expression in plant cells | |
| CN104395467A (zh) | 甘蔗成花控制技术 | |
| WO1998051806A2 (en) | Recovery of transformed plants without selectable markers by nodal culture and enrichment of transgenic sectors | |
| CN101831429B (zh) | 水稻胚乳特异表达基因的启动子及表达模式鉴定 | |
| Ahmadi et al. | The promoter of a metallothionein-like gene from the tropical tree Casuarina glauca is active in both annual dicotyledonous and monocotyledonous plants | |
| US5824865A (en) | Chimeric plant genes based on upstream regulatory elements of helianthinin | |
| US20230340518A1 (en) | Abiotic stress inducible promotors from cotton | |
| CN102586247A (zh) | 一个逆境诱导型启动子在控制基因在干旱诱导表达中的应用 | |
| US6613960B1 (en) | Phloem-loading-specific promoter | |
| US20020056153A1 (en) | Epidermal specific regulatory sequence | |
| WO1995016047A1 (en) | Ethylene resistant selection system |