CN101516180A - 早熟的转基因植物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了早熟的转基因植物，它含有可表达的、编码具有导致植物早熟活性的蛋白的核酸。

Description

早熟的转基因植物

技术领域

本发明涉及早熟的(early-maturing)转基因植物、产生该植物的方法、以及使植物早熟的方法。

背景技术

通常将激活标签法用作分析基因功能的方法。这种方法涉及使用整合到T-DNA中的转录增强子序列来产生植物基因转录被激活的突变体、然后克隆转录激活的基因(非专利文献1)。使用这种方法发现了抑制侧根形成的基因(专利文献1)。

不过，激活标签方法在用于基因功能详尽分析(存在于基因组中的多个基因的功能的集体分析)时是有问题的。例如，在诸如拟南芥之类的模式生物中，10Kb的基因组区域平均含有2个或更多个基因。然而，在激活标签方法中，在标签中用作激活子的增强子序列以及转录激活的基因组区域在插入位点每个末端均可延伸5Kb长。因此，用增强子序列来激活基因的效果不仅仅局限于单个基因，而是多个基因的转录均被激活，这样产生了复合表型(非专利文献2)。

为了避免这个问题，本发明人开发了一种称为“Fox搜寻系统(全长cDNA过表达基因搜寻系统)”的技术(专利文献2)。Fox搜寻系统是一种涉及将作为强表达基因来源的全长cDNA文库直接以混合物的形式通过具有强表达T-DNA载体的土壤杆菌的介导引入到植株中、播种所获得的T₁种子、然后对表型进行筛选的方法。当出现所需表型时，通过PCR检验插入到相关谱系中的全长cDNA并测序，从而对造成这种效果的基因进行鉴定。

关于Fox搜寻系统优点的实例如下所述。

(i)全长cDNA文库含有基因发挥功能所需的所有氨基酸信息，因此导入的基因能表现出其全部固有功能。这样，这种全长cDNA文库比普通cDNA文库在表达功能方面具有高得多的效率。此外，所有的cDNA片段均有起始密码子和终止密码子信息，从而在表达中不需要蛋白融合，并且蛋白表达效率也高。

(ii)即使将一个有数亿个克隆的文库用于感染，也仅有1到2个克隆被引入到植株中。不同的克隆被引入到转基因植株中，从而对于cDNA分离及表型性状只需确认较少的实例(一般来说是2个)。

(iii)使用传统cDNA文库时，所有的mRNA分子原封不动地按照数量比率替换成cDNA分子。因此，在这种cDNA文库中，cDNAs的比例(譬如，高水平表达的结构蛋白组与通常在低水平表达的信号转导相关基因组)根据表达水平彼此之间有显著不同。然而，可用于Fox搜寻系统的文库是一种“规范化”文库，它以相同比例含有所有的克隆，而不管基因表达水平如何。能够比基因组标签法更为高效地检验不同物种的基因的功能(不过，对于拟南芥和水稻之类的植物，由于已经建立了规范化的全长cDNAs，所以这些cDNAs也可以使用。此外，当分析诸如结构蛋白之类的高表达水平蛋白的功能时，也可以使用普通的未规范化的全长cDNA文库)。(iv)无需产生分离谱系便可检索文库中全部基因的功能，从而制备含有全长cDNAs的全部植物居群。因此，可轻易获得目标突变株，并且仅需最少量的工作便可筛选导到赋予特定性状的基因(不管其功能是否就是这些基因的固有功能)。

植物的早熟，在下述例如非专利文献3和4中已经报道过。

至少在模式植物拟南芥的例子中，当称为FT的基因在叶片中被激活时，其mRNA通过韧皮部迁移到芽尖，在那诱导花芽。因此，通过该基因的异位强表达，可在早期诱导出花芽。然而，花芽的诱导需要在通过转化进行转基因之后再进行细胞内基因表达，因此也需要制备重组体。此外，难以控制相关基因表达的时期，诱导花形成的时期。

专利文献1：JP Patent Publication(Kokai)No.2002-010786 A

专利文献2：JP Patent Republication(Saikohyo)No.2003/018808

非专利文献1：Walden，R et al.，Plant Mol Biol，1994，26(5)：pp.1521-8

非专利文献2：Ichikawa et al.，Plant J，2003，36：pp.421-429

非专利文献3：Heang et al.，Science 2005，309，pp.1694-1696

非专利文献4：Hanzawa et al.，PNAS 2005，102，pp.7748-7753

发明内容

本发明的一个目标是发现植物早熟基因，然后提供用该基因转化的植株。

本发明人已经使用上述Fox搜寻系统生成了大约15000个拟南芥转化谱系，然后观察具有突变表型的谱系。因而，本发明人已经发现了显示早熟的形态学突变体，并成功分离了导致这种突变的基因，从而完成了本发明。

具体地，本发明如下所述。

[1]早熟的转基因植物，其含有可被表达的核酸，所述的核酸编码：

(a)含有SEQ ID NO：2、33、35或37所示氨基酸序列的蛋白；

(b)含有在SEQ ID NO：2、33、35或37所示氨基酸序列中具有一个或几个氨基酸缺失、替代、或者增加的氨基酸序列的蛋白；或者

(c)含有与SEQ ID NO：2、33、35或37所示氨基酸序列具有90％或者更高同一性的氨基酸序列并且具有导致植物早熟活性的蛋白。

[2][1]中的转基因植物，其中所述的核酸含有：

(d)含有SEQ ID NO：1、32、34或36中所示核苷酸序列的DNA；

(e)含有在SEQ ID NO：1、32、34或36中所示核苷酸序列中具有一个或几个核苷酸缺失、替代或者增加所得的核苷酸序列、并且编码具有导致植物早熟活性的蛋白的DNA；

(f)含有与SEQ ID NO：1、32、34或36所示核苷酸序列具有90％或者更高同一性的核苷酸序列、并且编码具有导致植物早熟活性的蛋白的DNA；或者

(g)在严格条件下可与同含有SEQ ID NO：1、32、34或36所示核苷酸序列的DNA相互补的DNA进行杂交、并且编码具有导致植物早熟活性的蛋白的DNA。

[3][1]中的转基因植物，其中所述的植物是双子叶植物或者单子叶植物。

[4][1]中的转基因植物，其中所述的核酸整合到植物基因组中。

[5][1]中的转基因植物，其中该蛋白进一步具有增加植株大小使其大于其野生型植株的活性。

[6]来自[1]到[5]任一项的转基因植物的组织、细胞或者种子。

[7]用来产生[1]到[5]任一项早熟的转基因植物的方法，包括将[1]或[2]的核酸导入到植物组织或细胞中并再生植物体。

[8][7]中的方法，其中所述的核酸的导入是通过使用含有该核酸的重组载体来进行的。

[9]导致植物早熟的方法，包括在[1]到[5]任一项的转基因植物中过表达[1]或[2]的核酸，从而诱导早熟。

[10]增加植株大小的方法，包括在[1]到[5]任一项的转基因植物中过表达[1]或[2]的核酸，从而诱导出比其野生型植株更大的植株。

[11]导致植物早熟的方法，包括将[1]的蛋白应用到土壤或植株中从而诱导早熟。

[12]增加植株大小的方法，包括将[1]的蛋白应用到土壤或植株中从而诱导出比其野生型植株更大的植株。

本描述中所用术语“核酸”是指DNA或RNA，这种核酸的实例包括基因、cDNAs、mRNAs及其化学修饰产物。

本说明书包括作为本申请优先权基础的日本专利申请No.2006-221061中说明书和/或附图中的部分或者全部内容。

附图说明

图1(a)所示的是其中引入了全长cDNA的双元载体(binary vector)构建体。图1(b)所示的是所扩增cDNA的电泳图像。图1(c)所示的是RAFL cDNA的大小分布。

图2所示的是使用拟南芥观察到的具有致癌基因过表达的表型与具有野生型表型的植株。图2(a)所示的是在经历相同的生长时期后iaaM过表达的植株与野生型(WT)植株之间的比较。图2(b)是iaaM过表达植株的照片。图2(c)是tmsl过表达植株的照片。

图3(a)到(d)所示的是F03024谱系的表型。图3(e)到(f)所示的是F01907谱系的表型。图3(g)所示的是每个谱系的叶绿素含量。图3(h)所示的是每个谱系的光合作用活性。

图4所示的是通过RT-PCR扩增的基因的电泳图像。在图4(a)中，“19”和“21”表示AtPDH1的特异性PCR片段；“微管蛋白”表示用作内标基因的β-微管蛋白的PCR片段；“泳道1”和“泳道2”表示野生型的Columbia植株；“泳道3”和“泳道4”表示在T₂代中表现出浅绿色表型的F03024植株。在图4(b)中，上部的带表示At3g55240的特异性PCR片段，下部的带表示用作上样修正的AHA1(AHA1：拟南芥质膜H+-ATP酶)PCR片段。在图4(c)中，上部的带表示通过RT-PCR(循环数：40)扩增的At3g55240的特异性PCR片段(p01907)，下部的带表示通过RT-PCR(循环数：28)扩增的用作上样修正的AHA1(AHA1：拟南芥质膜H+-ATP酶)PCR片段。

图5(a)所示的是F01907谱系的相对表达水平。图5(b)所示的是F01907谱系的相对叶绿素含量。图5(c)所示的是F01907谱系的莲座叶数目。图5(d)所示的是F01907谱系的表型。

图6所示的是AT3G55240蛋白与相关蛋白的比对。AT3G55240、AT3G28990和AT5G02580是拟南芥蛋白，OS01G0837600(旧称：P0031D11.2)是水稻EST蛋白。

图7所示的是AT3G55240蛋白及其相关蛋白的系统发育树。AT3G55240、AT3G28990和AT5G02580是拟南芥蛋白，OS01G0837600(旧称：P0031D11.2)是水稻EST蛋白。

图8所示的是F01907谱系等的叶肉细胞的电子显微图片。画面(panel)1和2所示的是野生型植株，画面3和4所示的是At1g70070转基因植株的，画面5和6所示的是At3g55240转基因植株的叶肉细胞的电子显微图片。

图9(a)是表达GFP的拟南芥培养细胞的荧光显微图片。图9(b)是表达N98-GFP嵌和蛋白的拟南芥培养细胞的荧光显微图片。

本发明的最佳实施方案

1.植物早熟基因的分离

例如，可使用拟南芥通过Fox搜寻系统来获得植物早熟基因。不过，下述技术不仅可用于拟南芥，也可用于其它植物(尤其是被子植物)。

具体地，可通过下述流程来进行这种植物早熟基因的分离。

(1)制备含全长cDNA及内标基因的cDNA混合物。

术语“全长cDNA”是指与从某个基因转录的mRNA具有相同序列(不过，其中U→T)的DNA；即，mRNA的完整拷贝。即使存在比这样获得的cDNA更长的cDNA，它也是本文所用全长cDNA的实例。

本领域中的技术人员可通过已知方法从靶mRNA来制备这种全长cDNA。例如，可通过诸如Cap-trapper法(Carninci，P.，et al.，Genomics，1996.37(3)：pp.327-36)或者Cap-finder法(Zhao，Z.，et al.，J.Biotechnol.，1999.73(1)：pp.35-41)之类的技术从来源于拟南芥的mRNA制备全长cDNA。此外，也可使用拟南芥全长cDNA收集物(RIKEN(Wako，Japan))，其中整个基因组的cDNA均已测序。

优选地，本文所用用于克隆全长cDNA的载体的实例是在cDNA插入位点两端具有诸如Sfi I之类的能够识别8个或更多核苷酸、并且可限定单向插入DNA的限制性内切酶位点的载体。

本领域的技术人员可使用已知技术来构建包括上述全长cDNAs在内的全长cDNA文库。用于构建这种文库的载体的实例包括LambdaZap II、Lambda FLC-1-B、pTAS和pBIG。

此外，来自细菌的致癌基因(譬如，tmsl、iaaM、rolB和tmr)也可在后续的表型筛选中用作内标。tmsl和iaaM基因分别编码来自丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的色氨酸2-单加氧酶。过表达这些基因可导致大量产生植物生长素。rolB基因来源于Agrobacterium rhyzogenesis，与植物生长素敏感性相关。tmr基因来源于根癌土壤杆菌，其功能是细胞分裂素的生物合成。已知这些致癌基因可强烈地影响很多植物的形态(Casanova et al.，Biotechnol Adv，23，2005，3-39；Romano et al.，PlantMol Biol，27，1995，1071-83；Smart et al.，Plant Cell，3，1991，647-656)。这类致癌基因可用作文库cDNA均一性的指示物。然而，在转化到拟南芥中后，这些致癌基因会从第二代的突变系中被清除。这些致癌基因可通过PCR来扩增。

(2)全长cDNA文库的规范化

如背景技术中所述，在传统的cDNA文库中，cDNA克隆的比例根据彼此间的基因表达水平会有显著不同。因此，优选地，要进行“规范化”，由此构建的文库不管基因表达水平如何，均可以相同比例含有所有克隆。

可通过混合等量的全长cDNA克隆来获得规范化的全长cDNA混合物。为了获得这种规范化的全长cDNA混合物，要确定所合成的全长cDNA的5’末端序列和3’末端序列(单向测序(single pathsequencing))，然后选择非冗余(末端部分区域的序列是不一致的)全长cDNA克隆，接下来构建这些克隆的数据库。

通过选择彼此不同的cDNAs、然后以等量将其混合来构建这种规范化的全长cDNA文库。所以，这种规范化的全长cDNA文库不象传统cDNA文库那样含有不均匀的分子种类，它是完全均一的。因此，考虑到还存在基因组基因的多拷贝基因群，不同种类基因的功能可在更为等量的程度上被检测；也就是说，比基因组标签法更为高效。

在拟南芥的例子中，目前占全基因组50％或者更多的规范化全长cDNAs已被确定并且可用。在本发明中，可以使用这些可用的并且规范化了的全长cDNAs。

(3)将全长cDNA克隆到表达载体中

所获得的全长cDNA或者规范化的全长cDNA可以克隆到通过根癌土壤杆菌进行植物转化的T-DNA表达载体中。T-DNA是在土壤杆菌病原菌株中发现的Ti质粒上的一段特异区域。(土壤杆菌是导致双子叶植物肿瘤的冠瘿病的病原菌)当菌感染植株后，T-DNA转入植物细胞中，然后整合到基因组DNA上。

T-DNA含有一段调节全长cDNA表达的序列。优选地，整合了作为表达调控序列的表达盒，在其中连接了能够在植物细胞中引起恒定或者条件表达的启动子以及终止子序列。优选的恒定表达启动子序列的实例是花椰菜花叶病毒(Cauliflower Mosaic virus)的35S启动子序列(Sanders，P.R.et al.，Nucleic Acids Res，1987.15(4)：pp.1543-58)。诱导型启动子的实例包括糖皮质激素诱导型启动子序列(Aoyama，T.et al.，Plant J，1997.11(3)：pp.605-12)及雌激素诱导型启动子(Zuo，J etal.，Plant J，2000.24(2)：pp.265-273)。在本发明中，这些启动子可以以其任意组合(通过连接)来使用。这种启动子的组合可以由恒定表达启动子或者诱导型启动子组成。此外，两种类型也可以联合使用。

此外，例如，对于后续的植株选择，也可插入潮霉素抗性基因。

例如，使用T4连接酶通过酶反应将上述全长cDNA或者规范化的全长cDNA以正向或者反向插入到启动子序列的下游。因此，此处可鉴定的变化是：当正义链表达时编码相关cDNA的基因的过表达所导致表型性状的改变；或者当反义链表达时编码相关cDNA的基因的欠表达所导致表型性状的改变。

(4)全长cDNA文库导入到植物中

接下来，通过常规方法将上述全长cDNA或规范化的全长cDNA或者其中插入了致癌基因的T-DNA群(全长cDNA过表达文库；FOX文库)导入到土壤杆菌中。构建好文库后，将文库中的cDNAs通过土壤杆菌感染导入(转化)到植物(譬如，拟南芥)中。

对于用土壤杆菌感染植物，可以使用浸渍法(dipping method)、浸花转化法(floral dipping method)等。在浸渍法的例子中，将一束植株浸在含有土壤杆菌的液体中30到60秒。在浸花转化法的例子中，将植物宿主的花蕾直接浸没，将罐转移到托盘上，然后将罐覆盖过夜以保持湿润。第二天移去盖子，原样培养植株，然后采集种子。

(5)基于表型性状的筛选

从使用土壤杆菌FOX文库转化拟南芥植株等所产生的转基因植株(T₀代)中收获种子。然后将种子播种在例如含有潮霉素的培养基上。可在发芽后大约一周内选择转基因植株，这样无需后续的培养来选择潮霉素抗性秧苗。将所选择的植株(T₁代)转移到土壤中，然后收获种子。

(6)表型性状的再确认以及导致突变性状的基因的鉴定

从感兴趣的转基因植株(譬如，具有被认为与早熟相关的性状的植株，例如与其它转基因植株相比生长更早的植株以及开花更早的植株)中提取基因组DNA。基于T-DNA中所含的启动子序列与终止子序列附近的核苷酸序列信息设计引物，使用该引物，由上述基因组DNA进行聚合酶链反应(PCR)，然后分离位于转录调控区间之间的cDNA。再将该cDNA插入到与上述T-DNA具有相似启动子序列与终止子序列的T-DNA中，将T-DNA再次导入到正常植株中，然后再次确认表型性状。通过随后的cDNA测序，可鉴定导致突变性状的基因。

2.分离并鉴定早熟基因

通过上述技术分离并鉴定的植物早熟基因是拟南芥At3g55240(谱系名：F01907)。此外，在本发明中早熟基因的实例包括拟南芥基因At3g28990、At5g02580和水稻EST Os01g0837600(旧称：P0031D11.2)，每个均编码具有导致植物早熟活性的蛋白，与At3g55240的活性相当。此外，这些基因编码的蛋白具有增加植株大小使其大于其野生型植株的活性。

此处，本发明中术语“导致植物早熟的活性”是指同其野生型植株相比，可加速表达了早熟基因的植株的生长的活性。此外，短语“具有导致植物早熟的活性”是指活性同具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白的活性基本相当。具有这种早熟活性(或早熟能力)的植株在本说明书中被称为早熟植株。

此外，本发明中术语“增加植株大小使其大于其野生型植株的活性”是指同其相应的野生型植株相比，增加植株大小——譬如高度的活性。此外，短语“具有增加植株大小使其大于其野生型植株的活性”是指活性同具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白的活性基本相当。

At3g55240的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。At3g28990的核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示。At5g02580的核苷酸序列如SEQID NO：34所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示。Os01g0837600(旧称：P0031D11.2)的核苷酸序列如SEQ ID NO：36所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示。

上述早熟基因可以是编码蛋白的基因，该蛋白含有如SEQ ID NO：2、33、35或37所示的氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、替代或增加所得的氨基酸序列，并且具有可导致植物早熟的活性。这里的术语“几个”是指约为10、9、8、7、6、5、4、3或2的整数。例如，如SEQ ID NO：2、33、35或37所示的氨基酸序列中有1到10个、1到8个、优选地为1到5个氨基酸可以被缺失、增加或者替代。

此外，上述氨基酸序列可以包含保守的氨基酸替代。这种替代发生在结构与电荷性状彼此相似的氨基酸之间。这种氨基酸组的实例包括(1)酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)、(2)碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、(3)非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)、(4)不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)以及(5)芳香族氨基酸(苯丙氨酸和酪氨酸)。

作为选择，上述早熟基因也可以是编码含有与SEQ ID NO：2、33、35或37中所示的氨基酸序列具有70％或者更高同一性的氨基酸序列、并且具有可导致植物早熟活性的蛋白质的基因。这种同一性为70％或以上，优选地为80％或以上、85％或以上、更优选地为90％或以上，最优选地为95％或以上。在这里，术语“％同一性”是指在两个相比对的氨基酸序列中相同氨基酸的数目相对于氨基酸总数的百分比。这种％同一性可使用诸如BLAST或FASTA之类的同源性检索程序来确定。比对可以通过引入或者不引入缺口(gap)的同源性检索来进行。此外，例如GenBank、EMBL等可用作序列数据库。

上述早熟基因可以是含如SEQ ID NO：1、32、34或36所示的核苷酸序列的DNA。

此外，上述早熟基因可以是包含在SEQ ID NO：1、32、34或36所示的核苷酸序列中有一个或几个核苷酸缺失、替代或增加所得的核苷酸序列、并编码具有导致植物早熟活性蛋白质的DNA。在这里，术语“几个”是指约为10、9、8、7、6、5、4、3、或2的整数。

作为选择，上述早熟基因可以是同SEQ ID NO：1、32、34或36所示的核苷酸序列具有70％或以上、优选地为80％或以上、85％或以上、更优选地为90％或以上、最优选地为95％或以上同一性、并且编码具有导致植物早熟活性蛋白的DNA。在这里，术语“％同一性”是指在两个相比对的核苷酸序列中相同核苷酸的数目相对于核苷酸总数的百分比。这种％同一性可使用诸如BLAST或FASTA之类的同源性检索程序来确定。比对可以通过引入或者不引入缺口的同源性检索来进行。此外，例如GenBank、EMBL等可用作序列数据库。

此外，上述早熟基因可以是能够在严格条件下与同含如SEQ IDNO：1、32、34或36所示的核苷酸序列的DNA相互补的DNA杂交、并且编码具有导致植物早熟活性蛋白的DNA。在这里，术语“严格条件”是指可形成所谓的特异性杂交而不形成非特异性杂交的条件。例如，这种条件包括在约45℃使用5～6×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)杂交，然后在约50℃到约65℃使用0.1到1×SSC及0.1％SDS洗涤。或者，例如，这种条件也包括在约65℃到约70℃使用1×SSC杂交，然后在约65℃到约70℃使用0.3×SSC洗涤。

可通过本领域已知技术制备(改变)的基因或DNA是编码包含在上述SEQ ID NO：2、33、35或37所示的氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、替代或增加所得的氨基酸序列的蛋白的基因、编码具有同上述SEQ ID NO：2、33、35或37所示的氨基酸序列有90％或更高同一性的氨基酸序列的蛋白的基因、包含在上述SEQ ID NO：1、32、34或36所示的核苷酸序列中有一个或几个核苷酸缺失、替代或增加所得的核苷酸序列的DNA、含同上述SEQ ID NO：1、32、34或36所示的核苷酸序列具有90％或以上同一性的核苷酸序列的DNA、或者在严格条件下可与同上述SEQ ID NO：1、32、34或36所示的核苷酸序列的DNA相互补的DNA杂交的DNA。可通过诸如Kunkel法或缺口双链法或者与其相关的方法之类的已知技术将突变引入到基因中。例如，可使用利用位点特异性突变来引入突变的试剂盒(譬如，Mutant-K(由TaKaRa，Kyoto，Japan生产))或者TaKaRa LA PCR体外突变系列试剂盒来引入突变。此外，可以通过在PCR中使用其中引入了突变的引物来进行位点特异性突变(F.M.Ausubel et al.，ShortProtocols In Molecular Biology，1995，third edition，John Wiliey & Sons，Inc.)。

一旦确定了上述早熟基因的核苷酸序列，就可以通过化学合成、以克隆的cDNA为模板进行的PCR、或使用具有该核苷酸序列的DNA片段作为探针的杂交来获得早熟基因。

与上述早熟基因具有高同源性的基因的实例包括具有下述NCBI(国立生物技术信息中心)序列号的基因。这些基因及其修饰产物也可用于产生本发明的早熟转基因植物。

水稻：XM_475377.1

玉米：AY106962.1GI：21210040

3.构建重组载体的并产生转基因植物

(1)构建重组载体

可通过将上述早熟基因插入到适当的载体来构建本发明中所用的重组载体。例如，pBI、pUC和pTRA载体是优选的用作向植物细胞中导入早熟基因并随后表达该基因的载体。可使用pBI和pTRA载体通过土壤杆菌将目的基因导入到植物中。优选地，使用这种pBI双元载体或者中间载体，其实例包括pBI121、pBI101、pBI101.2和pBI101.3。通过使用pUC载体，可将基因直接导入到植物中，其实例包括pUC18、pUC19和pUC9。也可以使用诸如花椰菜花叶病毒(CaMV)、菜豆金花叶病毒(BGMV)及烟草花叶病毒(TMV)载体之类的植物病毒载体。

例如，本文所用的将早熟基因插入到载体中的方法包括首先用适当的限制性内切酶酶切纯化的DNA、将产物插入到合适载体DNA的限制性内切酶位点或者多克隆位点上、连接产物与载体。

需要将早熟基因整合到载体中，以便基因发挥功能。因此，如果需要，除了启动子及早熟基因外，可将终止子、增强子、选择标记、剪切信号、polyA附加信号、5’-UTR序列等连接到载体上。

本文所用的“启动子”可以不是来源于植物的DNA，只要该DNA可以在植物细胞中发挥功能并且可在特定植物组织中或在特定生长时期诱导表达即可。其具体实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、胭脂氨酸合成酶基因启动子(Pnos)、玉米泛素启动子、水稻肌动蛋白启动子以及烟草PR蛋白启动子。

可使用任何“终止子”，只要它含有能够终止由上述启动子所转录的基因转录的终止子序列即可。其具体实例包括胭脂氨酸合成酶基因终止子(Tnos)及花椰菜花叶病毒polyA终止子。

“增强子”的优选实例包括用于提高目的基因表达效率的增强子区域并含有CaMV 35S启动子的上游序列。

“选择标记”的实例包括二氢叶酸还原酶基因、氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因以及双丙氨磷(bialaphos)抗性基因。

(2)产生早熟转基因植物

可通过将上述早熟基因或含该基因的重组载体导入到可以表达目的基因的宿主中的方式来获得本发明的早熟转基因植物。

在本发明中，术语“转基因植物”是指通过基因操作产生的转基因植物及其后代植物。此外，后代植物的实例包括保持早熟能力的杂交植物。

转基因植物可通过如下方式来获得。

本发明中转化的靶标是植物组织(譬如，表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部及维管束，以及植物器官(譬如，叶片、花瓣、茎、根及种子))或植物细胞。

可用于转化的植物的实例包括，但并不局限于，双子叶植物和单子叶植物，譬如属于十字花科、禾本科、茄科或豆科的植物(参见下述实例)。

十字花科：拟南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜籽、甘蓝、大白菜(Brassica)等。

茄科：烟草(Nicotiana tabacum)、茄子、土豆(Solaneum)、番茄(Lycopersicon)、胡椒(Capsicum)等。

蔷薇科：玫瑰(Rosa)、草莓(Fragaria)、樱桃(Prunus)、苹果(Malus)等。

菊科：菊(Chrysanthemum)、向日葵(Helianthus)等。

石竹科：麝香石竹(Dianthus caryophyllus)等。

禾本科：玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)、大麦(Hordeum)、小麦(Triticum)等。

兰科：洋兰(Cattleya)、蝴蝶兰(Phalaenopsis)等。

百合科：郁金香(Tulipa)等。

豆科：大豆(Glycine max)、豌豆(Pisum)、蚕豆(Vicia)、紫藤(Wisteria)等。

将早熟基因或重组载体导入到植物中的方法的实例包括土壤杆菌法、PEG-磷酸钙法、电转化法、脂质体法、基因枪法及显微注射法。土壤杆菌法可以使用原生质体或者组织切片。例如，当使用原生质体时，可通过将原生质体与含Ti质粒的土壤杆菌一起培养的方法或者将原生质体与原生质体化的土壤杆菌相融合的方法(原生质体法)来进行转化。例如，当使用组织切片时，可通过让土壤杆菌感染无菌培养的目的植物的叶片切片(叶碟(leaf disc))的方法(叶碟法)或感染胼胝体(未分化的培养细胞)来进行转化。此外，可通过土壤杆菌法将乙酰丁香酮用于单子叶植物转化，以增加转化率。

可通过PCR、Southern杂交、Northern杂交或其它方法来确认基因是否整合到植物中。例如，制备转基因植物的DNA，设计DNA特异的引物，然后进行PCR。PCR后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳等，然后用溴化乙锭、SYBR Green溶液等染色，从而鉴定扩增产物条带。这样，可以确认转化。或者，也可以通过使用预先标记了荧光染料等的引物的PCR来检测扩增产物。此外，本文也可使用将扩增产物结合到诸如微量培养板之类的固相上从而通过荧光反应、酶反应等确认扩增产物的方法。

作为转化产物而获得的肿瘤组织、芽、须根等可以直接用于细胞培养、组织培养或器官培养。而且，这些转化产物可以通过给予适当浓度的植物激素(譬如，植物生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯或芸苔素)这种已知的传统植物组织培养法再生成植物。通常通过在混合有合适类型植物生长素及细胞分裂素的培养基上分化出根、将产物移植到含高含量细胞分裂素的培养基上以分化出芽，然后将产物移植到不含激素的土壤中来再生植株。

所获得的其中已导入了上述诸如At3g55240之类的早熟基因的转基因植物表现出早熟性状。此外，这种转基因植物表现出了同其野生型植株相比具有更大植株大小的表型。而且，其中引入了At3g55240基因的拟南芥还具有浅绿色的表型。

本说明书中术语“早熟化”或“早熟”是指植物在播种、开花、成熟、结实过程中经历了较短的生长期。

本说明书中术语“表型”与“表型性状”可通用。这些术语指容易观察或测定的植物形态学特征。

具有这种早熟表型性状的植物可以在早期收获，这样这种性状具有降低遭受诸如台风之类的来自自然环境灾害的机会的优势。此外，对于具有早熟表型性状的观赏性植物，可大大缩短从培养到交付过程中的培养周期，这样可显著降低这些植物的种植费用。而且，比其野生型植株具有更大植株大小的表型性状可增加生物量。因此，这种表型性状对于譬如用作工业原料的植物是有益的。

本发明进一步包括按如上所述方式来产生的、来自本发明中早熟植物的组织、细胞或种子。这些组织、细胞或种子也含有本发明中的核酸或早熟基因。特别地，这些种子可以将基因型及其性状传递到子代。

4.产生由早熟基因编码的蛋白

如被称为TargetP V1.0的算法分析所示，上述几种类型的早熟基因在N末端位点具有与膜结构相结合的元件。在如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中，预测到可以被转运然后被切除的序列位于距N末端的第34个氨基酸残基处。此外，在如SEQ ID NO：33、35或37所示的氨基酸序列中，存在类似的氨基酸残基(参见图6)。具有这种部分氨基酸序列的蛋白，也被认为具有导致植物早熟的活性和/或比其野生型植株具有更大植株大小的活性。

因此，在如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中，可通过下述计算公式来找出被认为构成活性蛋白的氨基酸：

95(SEQ ID NO：2中的所有氨基酸)-33(在距N末端的34个氨基酸处剪切)＝62个氨基酸即，这种活性蛋白其范围位从34位氨基酸残基到95位氨基酸残基。因此，合成的至少含有该序列的肽也会具有相应的活性。类似地，在如SEQ ID NO：33、35或37所示的氨基酸序列中，合成的至少含有与SEQ ID NO：2中34到95位氨基酸序列相对应的氨基酸序列的肽也会具有相应的活性。

可通过将上述1.中分离到的早熟基因连接(插入)到可在宿主中复制的重组载体(譬如，质粒DNA或噬菌体DNA)上、将载体导入到诸如优选地为大肠杆菌之类的除植物宿主外的宿主中以获取转化子、培养转化子、然后从培养产物中收集蛋白的方式来获得由早熟基因编码的蛋白。术语“培养产物”是指培养基上清液、所培养的细胞或微生物、或者所培养的细胞或微生物的裂解产物。

上述质粒DNA的实例包括来源于大肠杆菌的质粒(譬如，pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18，pUC19及pBluescript)、来源于枯草芽孢杆菌的质粒(譬如，pUB110及pTP5)以及来源于酵母的质粒(譬如，YEp13及YCp50)。噬菌体DNA的实例包括λ噬菌体(譬如，Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11及λZAP)。此外，也可使用诸如逆转录病毒及牛痘病毒之类的动物病毒载体以及诸如杆状病毒之类的昆虫病毒载体。

可使用的除植物宿主外的宿主的实例包括：诸如大肠杆菌之类的属于埃希氏菌属(Escherichia)的、诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)之类的属于芽孢杆菌属的、诸如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)之类的属于假单胞菌属的及诸如苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)之类的属于根瘤菌属的细菌；诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomces pombe)之类的酵母；诸如COS细胞及CHO细胞之类的动物细胞；以及诸如Sf9细胞之类的昆虫细胞。

当诸如大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌之类的细菌用作宿主时，此处大肠杆菌的实例包括，但并不局限于，DH5α、HB101和DH10B，枯草芽孢杆菌的实例包括但并不局限于枯草芽孢杆菌。在这样的例子中，启动子并没有特别的限制，只要它能够在诸如大肠杆菌之类的宿主中表达本发明中的基因即可。例如，可使用大肠杆菌来源的或者噬菌体来源的启动子，譬如trp启动子、lac启动子、PL启动子及PR启动子。优选地，上述重组载体能够在细菌中自主复制，同时由上述启动子、核糖体结合序列、上述早熟基因及转录终止序列组成。此外，这种重组载体也可含有控制启动子的基因。向细菌中导入重组载体的方法没有特别的限制，只要是将DNA引入到细菌中的方法即可。例如，可使用利用钙离子的方法(Cohen，S.N.et al.，Ploc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，69：2110，1972)及电转化法。

例如，当酵母用作宿主时，可使用酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母(Pichea pastris)。在这样的例子中，启动子并没有特别的限制，只要它能够在酵母中表达本发明中的基因即可。例如，可使用gal1启动子、gal10启动子、热休克蛋白启动子、MFα1启动子、PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子或AOX1启动子。向酵母中导入重组载体的方法没有特别的限制，只要是能将DNA引入到酵母中即可，这些方法的实例包括电转化法、原生质体法及醋酸锂法。

当动物细胞用作宿主时，可使用猴COS-7细胞、Vero、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、小鼠L细胞等。在这样的例子中，例如，可使用SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV启动子等，也可使用人细胞肥大病毒的早期基因启动子。向动物细胞中导入重组载体的方法的实例包括电转化法、磷酸钙法及脂质体转染法。

当昆虫细胞用作宿主时，可使用Sf9细胞等。在这样的例子中，此处所用的启动子有多角体启动子、P10启动子、苜蓿银纹夜蛾多角体病碱性蛋白启动子、杆状病毒早初期基因1启动子或杆状病毒39K晚初期基因启动子。向昆虫细胞中导入重组载体的方法的实例包括磷酸钙法、脂质体转染法及电转化法。

上述培养转化子的方法可按照通常培养宿主的技术来进行。

作为用来培养使用诸如大肠杆菌或酵母之类的微生物宿主所获得的转化子的培养基，无论是天然的还是合成的培养基均可使用，只要它含有可被微生物吸收的碳源、氮源及无机盐并且可有效培养转化子即可。碳源的实例包括：诸如葡萄糖、果糖、蔗糖及淀粉之类的碳水化合物；诸如醋酸及丙酸之类的有机酸；以及诸如乙醇及丙醇之类的醇。氮源的实例包括氨；诸如氯化铵、硫酸铵、醋酸铵及磷酸铵之类的无机或有机酸的铵盐；其它含氮化合物；蛋白胨；肉类提取物及玉米浸泡液。无机物的实例包括：磷酸一钾、磷酸二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁(I)、硫酸锰、硫酸铜及碳酸钙。通常在诸如37℃的振荡培养或者通风振荡培养之类的有氧条件下进行培养。用无机或有机酸、碱溶液等来调节pH。在培养期间，如果需要，可向培养基中添加诸如氨苄青霉素或四环素之类的抗生素。

当对用含有诱导型启动子的表达载体转化的微生物进行培养时，如果需要可向培养基中加入诱导物。例如，当对用含有可被异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子的表达载体所转化的微生物进行培养时，可向培养基中加入IPTG或其类似物。当对用含有可被吲哚乙酸(IAA)诱导的trp启动子的表达载体所转化的微生物进行培养时，可向培养基中加入IAA或其类似物。

用来培养使用动物宿主细胞获得的转化子的培养基的实例包括常用的RPMI 1640培养基、DMEM培养基以及添加了胎牛血清等的这些培养基。一般而言，于37℃在5％CO₂中培养1到30天。在培养中，如果需要，可向培养基中加入诸如卡那霉素或青霉素之类的抗生素。

如果培养后在相关微生物或细胞内产生了上述蛋白，通过用超声破碎、反复冻融循环、匀浆机处理等破碎所培养的微生物或细胞来收集蛋白。如果产生了蛋白并分泌到微生物或细胞外，可以以这种状态直接利用培养液，或者通过离心或其它过程以除去微生物或细胞。之后，可单独使用或适当组合诸如硫酸铵沉淀、凝胶层析、离子交换层析或亲和层析这样的通用分离/纯化蛋白的生化技术来从上述培养产物中分离并纯化蛋白。

除了使用上述基因重组技术外，本发明所用的蛋白或具有其活性的肽也可通过在例如麦胚提取物、大肠杆菌提取物或兔网织红细胞提取物中的无细胞蛋白合成方式来合成(日本专利公开(Kokai)No.10-80295A(1998))。

5.导致植物早熟和/或增加植株大小的方法

将如上述4所述而制备的前述蛋白或具有其活性的肽应用到植株或土壤(撒粉、喷洒等)中，从而可导致植物早熟和/或相对于其野生型植株而言增加植株大小。在肽中，剪切序列后面的含SEQ ID NO：2的氨基酸序列中62个氨基酸的肽被认为具有活性组分。这是仅含62个氨基酸的亲水肽，因此认为它易溶于水。相同情形也可发生在SEQID NO：33、35或37氨基酸序列中的对应氨基酸上。因此，通过将蛋白或肽与水混合然后将溶液喷洒在苗端上、或者将蛋白或肽溶于水中然后将溶液加入土壤中或用于培养的水溶液中，可使根有效吸收这些蛋白或肽。

此外，上述蛋白及上述肽的另一个优势在于它们是不妨害生态环境的生物活性物质。这是因为与化学物质不同，肽活性物质在自然界中很容易降解，并可进行地区性地喷洒。

所生产的含有上述蛋白或上述肽作为活性组分的植物早熟诱导物或者增加植株大小的诱导物，可以是含有上述蛋白或上述肽以及诸如通常用于农作物田间的载体及添加剂之类的用于植物生长的其它组分的组合物。

上述诱导物的药剂形式可以是固体制品(譬如，丸剂、粒状物形式、粒剂、粉末材料、水分散性粉末或粒状水分散性粉末)或者液体制品(譬如，液体药物或乳剂)。不过，其实例并不仅限于此。

上述蛋白或上述肽的含量并没有特别限制，只要可有效导致目的植物早熟和/或增加其大小即可。例如，在固体制品的例子中，所含活性组分的含量在2重量％至60重量％之间，在液体制品的例子中，其喷洒浓度在约0.1ppm到10ppm之间。

在固体制品中，载体的实例包括诸如高岭土粘土、硅藻土、班脱土沸石、硅酸钙、酸性粘土、活性粘土及Attapulgus粘土之类的矿物质载体、诸如硫酸铵及氯化铵之类的铵盐、诸如磷酸二钾盐之类的磷酸盐、诸如碳酸钠、碳酸氢钠及碳酸钙之类的碳酸盐、诸如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖及糊精之类的糖类、以及诸如尿素、氯化钠、硫酸钠、聚乙二醇之类的在常温以固体形式存在的水溶性载体。在液体制品中，载体的实例包括水、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液及柠檬酸盐缓冲液。这些载体其含量范围为，但并不局限于，例如，在固体制品中从5重量％到40重量％，在液体制品中为80％到99％。

此外，作为添加剂也可加入分散剂、膨胀剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、稀释液等。

可通过已知方法来生产上述诱导物。例如，可通过喷雾干燥含有上述蛋白或上述肽、水、如果需要还有分散剂、载体等的悬浮液来生产粉末材料。此外，例如，可通过将上述蛋白或上述肽溶于水或缓冲液中然后加入适量添加剂等来生产液体药物。

根据本发明还提供了导致植物早熟和/或增加植株大小的方法，包括在上述转基因植物中过表达植物早熟基因，从而诱导植物早熟和/或同其野生型植株相比增加了植株的大小。

导致早熟基因过表达的方法可通过对生长中的植株给予某种物质、赋予环境胁迫等方式来实现。

实施例

实施例1

以下将参考下述实施例来对本发明进行更为详尽的描述，但本发明并不局限于这些实施例。

1.方法

(1)制备由规范化全长cDNAs及标记基因所组成的cDNA混合物

使用下述两个载体构建拟南芥(Arabidopsis thaliana Columbia株)全长cDNA文库。载体Lambda Zap II(Stratagene，La Jolla，U.S.A.)用于文库RAFL2到RAFL6(RAFL：RIKEN拟南芥全长cDNA克隆)。载体Lambda FLC-1-B(Stratagene，La Jolla，U.S.A.)用于文库RAFL7到RAFL11。

对来自这些文库的克隆进行单向测序(Seki et al.，2002，Plant J，31，279-92)以选择非冗余克隆，并制备含有约15000个cDNA克隆的全长cDNA混合物，每个克隆的平均终浓度为14ng/ml。

从RAFL克隆测序计划(Yamada et al.，2003，Science 31 October2003：Vol.302.no.5646，pp.842-846)已知这些克隆的大约三分之一含有冗余cDNA。因此，该克隆混合物含有约10000种非冗余的全长cDNA。

在RAFL2和RAFL3文库(相应于总共1623个克隆)中全长cDNA相对于sfi I克隆位点的方向与其它RAFL克隆中的方向相反。为了有可以进行形态学筛选的内标，通过PCR扩增了4个与植物生长素合成(tmsl、iaaM))(Comai et al.，1982，J Bacteriol，149，40-6；Klee et al.，1984，Proc Natl Acad Sci U.S.A.，81，1728-32)、植物生长素敏感(rolB)(Furner et al.，1986，Nature，319，422-427)及细胞分裂素合成(tmr)(Lichtenstein et al.，1984，J Nol Appl Genet，2，354-62)相关的细菌基因，然后克隆到pBluescript来源载体的Sfi I位点。每种内标质粒分别以30ng/ml的浓度加入到全长cDNA混合物中。用于扩增内标基因的DNA模板及PCR引物如下所示：

pT281(tmsl)：

5’-AGAGGCCAAATCGGCCATGTCAGCTTCACCTCTCCTT-3’(SEQ ID NO：3)

5’-AGAGGCCCTTATGGCCCTAATTTCTAGTGCGGTAGTTAT-3’(SEQ ID NO：4)

pCP3(iaaM)：

5’-AGAGGCCAAATCGGCCATGTATGACCATTTTAATTCACCC-3’(SEQ ID NO：5)

5’-AGAGGCCCTTATGGCCCTAATAGCGATAGGAGGCGTTG-3’(SEQ ID NO：6)

pLJ-1(rolB)：

5’-TCCTCTAGAGGCCAAATCGGCCATGGATCCCAAATTGCTATTCCT-3’(SEQ ID NO：7)

5’-TGATCTAGAGGCCCTTATGGCCTTAGGCTTCTTTCTTCAGGTTTA-3’(SEQ ID NO：8)

pT281(tmr)：

5’-AGAGGCCAAATCGGCCATGGACCTGCATCTAATTTTCG-3’(SEQ ID NO：9)

5’-AGAGGCCCTTATGGCCCCTAATACATTCCGAACGGATGA-3’(SEQ ID NO：10)

(2)构建规范化全长cDNAs的土壤杆菌文库

将上述(1)中制备的cDNA混合物用Sfi I(Takara Bio)消化，然后用T4连接酶(New England BioLabs，Beverly，U.S.A.)克隆到土壤杆菌双元载体pBIG2113SF的Sfi I位点上。本文所用的pBIG2113SF来源于pBIG2113N(Taji et al.，2002，Plant J，29，417-26)，在pBIG2113N的XbaI位点插入了两个Sfi I位点，从而使得全长cDNA可以以相对于35S启动子的正义方向插入。

图1(a)所示的是双元载体的示例。“El”表示CaMV 35S启动子的5’上游序列(-419到-90)，“P35S”表示CaMV 35S启动子(-90到-1)，“Ω”表示TMV的5’上游序列，“NOS-T”表示Ti质粒上胭脂氨酸合成酶基因的多聚腺苷化信号，“Hyg”表示潮霉素抗性基因。箭头分别表示用于收集cDNA所使用的GS4和GS6引物的位置。

用相对于双元载体6倍摩尔过量的pBluescript来进行连接。通过电转化用连接产物来转化大肠杆菌DH10B(Invitrogen)。然后混合克隆以分离质粒文库。

通过电转化用质粒文库转化土壤杆菌GV3101。混合所获得的细菌克隆，以构建土壤杆菌文库。

(3)转化并栽培植物

在先前的报告中描述了植物的转化及栽培(Ichikawa et al.，2003，Plant J，36，421-429)。

于22℃、长白昼条件(16小时光照、8小时黑暗的周期)下在培养箱系统(Arasystem，Gent，Belgium)中栽培矮野生型拟南芥(Col-0)及转化系。使用土壤杆菌文库通过浸花转化法来转化野生型植株(Clough et al.，1998，Plant J，16，735-43)。

在含50mg/l潮霉素的基础琼脂培养基(BAM)上对潮霉素抗性的T₁秧苗进行7天的选择，然后移植到土壤(Nakazawa et al.，2003，Biotechniques，34，28-30)中。对可见的表型(譬如，生长率、植株颜色、花期及育性改变)进行记分，将所有表现出表型(FTIP)的植株移植到新的Arasystem碟中，然后对其进行观察。

从所有的FTIP植株中采集莲座叶或花，用于DNA分析。

(4)DNA凝胶印迹分析及潮霉素抗性检测

Southern印迹如先前的报告所述进行(Meyer et al.，1995，Mol GenGenet，249，265-73)。随机选择二十(20)个谱系，在与如上(3)转化及栽培植株中所述相似的条件下，于土壤中栽培T₂植株3星期。从每个谱系的3个植株中采集叶片，然后在液氮中匀质化。

根据使用手册使用DNeasy plant mini试剂盒(Qiagen，Tokyo，Japan)分离基因组DNA。从pBIG2113SF扩增的含有部分潮霉素抗性基因的0.5kb的PCR片段，用DIG DNA Labeling Mix(F.Hoffmann-La Roche，Basel，Switzerland)进行标记。

本文所用的用于DNA模板的PCR引物如下所示：

HN：5’-ATGAAAAAGCCTGAACTCACCG-3’(SEQ ID NO：11)

HC：5’-TCGAGAGCCTGCGCGACG-3’(SEQ ID NO：12)

除了于44℃、在溶液(5×SSC，50％甲酰胺，0.1％N-月桂酰肌氨酸、0.02％SDS、2％封闭试剂(F.Hoffmann-La Roche，Basel，Switzerland))中用5ng/ml浓度的探针进行杂交，并用0.1×SSC及0.1％SDS溶液进行第二次清洗之外，根据使用手册所述进行杂交。

用DIG Nucleic Acid Detection Kit(F.Hoffmann-La Roche，Basel，Switzerland)处理杂交膜后，可通过LumiVisionPRO(Aisin)来检测化学发光。

(5)从FTIP植株中扩增并克隆全长cDNA

采集约200mg(鲜重)莲座叶或花。

将五个(5)陶瓷颗粒(CERAMICS YTZ ball，D：2.3mm，Nikkato，Japan)和300μl裂解缓冲液加入到植物材料中，然后用Shake Master(Shake Master ver.1.0，Bio Medical Science，Tokyo，Japan)对产物进行匀质化。使用Wizard Magnetic 96DNA Plant System(Promega，Tokyo，Japan)提取基因组DNA。采用工作站系统(Tecan genesis workstation150，Tecan，Tokyo，Japan)运行提取试剂盒中所述的提取流程。

使用下述引物将cDNA PCR克隆到Gateway载体中。

B1GS7：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCTAGAGGCCCTTATGGCCG-3’(SEQ ID NO：13)

B2GS8：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCGAGTTAATTAAATTAATCCCCC-3’(SEQ ID NO：14)

使用下述引物对克隆到pBIG2113SF载体中。

GS4：5’-ACATTCTACAACTACATCTAGAGG-3’(SEQ ID NO：15)

GS6：5’-CGGCCGCCCCGGGGATC-3’(SEQ ID NO：16)

短片段的PCR条件为：94℃变性30秒、62℃退火30秒、及72℃延伸120秒。长片段的PCR条件为：94℃变性30秒、58℃退火30秒、及68℃延伸180秒。在两种情况下，在反应前将DNA于95℃处理8分钟进行变性。

(6)将PCR片段克隆到表达载体中并测序

首先通过BP克隆酶根据指导手册(Invitrogen，Carlsbad，U.S.A.)将Gateway载体PCR片段克隆到pDONR-207载体中。使用下述attL1和attL2引物对所插入的全长cDNA片段进行测序。

attL1：5’-TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC-3’(SEQ ID NO：17)

attL2：5’-GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC-3’(SEQ ID NO：18)

为了克隆到pBIG2113SF中，将来自T₁植株的PCR片段用Sfi I消化，然后克隆到载体的Sfi I位点上。例如，所获得的构建体根据F01907谱系命名为pF01907。使用GS6引物对插入的全长cDNA片段进行测序。

(7)RT-PCR

将来自F03024谱系的T₁植株(T₁-F03024)、来自F01907谱系的T₁植株(T₁-F01907)、6个独立的T₁-R01907谱系及野生型植株的种子播种到土壤中。将F03024植株栽培约6周，将F01097和R01907植株栽培4周。

采集来自每个谱系至少3个不同植株的莲座叶，然后使用Dynabeads mRNA DIRECT Kit(Dynal，Oslo，Norway)根据使用手册提取mRNA。为了进行组织特异性检验，采集萌发后生长5周的5周龄野生型Columbia植株，然后从相应组织中利用相同方法来分离mRNA。于37℃用RQ1Dnase(Promega，Tokyo，Japan)处理mRNA一小时。使用用于RT-PCR的Superscript第一链合成体系(InVitrogen，Carlsbad，U.S.A.)根据厂商说明书来合成cDNA。

首先使用下述β-微管蛋白特异性引物(Takahashi et al.，2001，Plant Physiol，126，731-41)或拟南芥质膜H+-ATP酶(AHA1)特异性引物(Kinoshita et al.，2001，Nature，414，656-60)进行RT-PCR来调节野生型与各个谱系之间的cDNA比例。

TU1：5’-TTCATATCCAAGGCGGTCAATGTG-3’(SEQ ID NO：19)

TU2：5’-CCATGCCTTCTCCTGTGTACCAA-3’(SEQ ID NO：20)

AHA1：5’-TTCTTCTGGGTGAAGATGTCAGG-3’(SEQ ID NO：21)

AHA3：5’-TGGTTTTAGGAGCAAGACCAGC-3’(SEQ ID NO：22)

在F03204中的基因特异性引物是3024-N和3024-C：

5’-TCAAAGTCTTGCCACTACTAGTCG-3’(SEQ ID NO：31)。

在F01907中的基因特异性引物是1907N：

5’-TGATAGAGAAATGTTTGATCTTCCAT-3’，(SEQ ID NO：23)和1907C：

5’-TCTTGCTTGTTGGACCGATGCTAAG-3’(SEQ ID NO：24)

可始终在下述条件下进行PCR：94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸120秒。

(8)通过定量实时PCR来分析基因表达

使用NucleoSpin RNA Plant试剂盒(MACHEREY-NAGEL GmbH，Duren，Germany)从来自同一个T₁R01907谱系的T₂ R01907植株的1月龄莲座叶中分离RNA。使用Superscript第一链合成体系(InVitrogenCorp.，Carlsbad，U.S.A.)根据使用手册合成cDNA。

使用MX3000P Multiplex QuantitiVe PCR System(Promega Corp.，Madison，U.S.A.)进行实时PCR分析。

使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO Co.Ltd，Japan)来检测扩增片段。

用于扩增参照DNA的引物是ACT2：

5’-CTGGATCGGTGGTTCCATTC-3’(SEQ ID NO：25)和

5’-CCTGGACCTGCCTCATCATAC-3’(SEQ ID NO：26)。

用于实时PCR的基因特异性引物是RP-1907-2：

5’-CATGCGTCAGGGATAAATCGT-3’(SEQ ID NO：27)和LP-1907-2：

5’-ACTGTGTGGAAGGAGCTGGA-3’(SEQ ID NO：28)。

(9)构建GFP融合蛋白及荧光显微观察

使用下述引物，用于pF03024S克隆扩增对应于下述AtPDH1(从F03024系统回收的cDNA(拟南芥原核DEVH盒解螺旋酶1))N末端98个氨基酸序列的DNA片段。

attB1-3024N：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGAACACTCTTCCCGTCGTCT-3’(SEQ IDNO：29)

attB2-3024C2：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTCATCGCTATTCCGAATTTCA-3’(SEQ ID NO：30)。

通过pDONR-207载体的介导根据Gateway使用手册(Invitrogen，Carlsbad，CA U.S.A.)将扩增的DNA片段克隆到pGWB5(Saito et al.，1999，Plant Cell Physiol，40，77-87)中。

所获得的构建体pGWB3024N98可在CaMV 35S转录启动子的控制下过表达与合成绿色荧光蛋白(GFP)基因(Chiu et al.，1996，CurrBiol，6，325-30)的N末端融合的、98个氨基酸构成N末端的区域(嵌和的N98-GFP蛋白)。

将pSA701(由Dr.T.Nakagawa，Shimane University，Japan提供)用作阴性对照构建体，其中的GFP基因由35S启动子单独表达。

使用Helios Gene-Gun系统(Bio-Rad，Tokyo，Japan)根据标准流程将这些质粒用于拟南芥Col-0叶片的基因枪法转化。

分别使用U-MNIBA和U-MWIG滤片在荧光显微镜(BX 60，Olympus，Tokyo，Japan)下观察单个叶片的GFP荧光和叶绿素荧光。

(10)电子显微镜观察

将四周龄植株(F03024、F01907及野生型植株)的莲座叶于4℃用在20mM pH7.0的二甲胂酸钠缓冲液中配制的4％戊二醛固定20小时，然后用相同的缓冲液于4℃清洗4小时。接下来，将其于4℃用在20mM pH7.0的二甲胂酸钠缓冲液中配制的2％四氧化锇再固定20小时。所固定的样品用醇系进行脱水，然后嵌入Spurr树脂(Taab，Berkshire，UK)中。于LTRACUT UCT超薄切片机(Leica，Wien，Austria)上用金刚石刀片切取超薄切片，然后转移到包被Formvar的栅格上。于室温用4％的乙酸铀酰和柠檬酸铅溶液进行双染色，时间分别为15分钟和10分钟。通过蒸馏水清洗后，使用JEM-1200EX电子显微镜(Jeol，Tokyo，Japan)在80kV下观察样品。

(11)测定叶绿素含量

通过两种方式来测定叶绿素的含量

一种方法(图3(g))是按先前报告(Porra et al.，1989，Biochimicaet Biophysica Acta，975，384-394)所述通过直接测定色素的方式来进行。在80％丙酮中将短叶片材料匀质化。利用分光光度计(Ultrospec3000，Pharmacia Biotech，UK)在663nm、645nm和720nm的波长处测量丙酮溶液。

第二种方法(图5(b))是通过使用双波长类型的可携式叶绿素仪(SPAD-520；Minolta，Tokyo，Japan)测定每单位叶片面积上叶绿素的相对含量来进行的。

测定叶绿素后，将相同的材料用于定量实时PCR分析。

(12)测定叶绿素荧光

可通过下述公式计算PSII的量子产量：

[Pm’＝(Fm’-Fs)/Fm’](Genty-参数)

(Fm’和Fs＝在光照适合的叶片中叶绿素荧光的最大值和稳态值)。因此，可使用脉冲幅度调制(PAM)荧光仪(MINI-PAM，Walz，Effeltrich，Germany)在室温下测定3周龄植株叶片中的叶绿素荧光。其结果是至少4个不同叶片测量值的平均值。

(13)通过计算机进行分析

使用NCBI Blast程序进行BLAST检索。

使用TargetP V1.0(Emanuelsson et al.，2000，J Mol Biol，300，1005-16)和ChloroP 1.1(Emanuelsson et al.，1999，Protein Sci，8，978-84)预测细胞内定位。

利用clustalX(Thompson et al.，1997，Nucleic Acids Res，25，4876-82)和GeneDoc(Nicholas et al.，1997，EMBNEW.NEWS，4，14)进行多重比对。

使用CLUSTALX和TREEVIEW(Page，1996，Comput Appl BioSci，12，357-8)来构建邻接法(Neighbour-Joining)系统发育树。

2.结果

(1)含有约10000个规范化拟南芥全长cDNAs的土壤杆菌表达文库的构建

按相同摩尔比混合约10000个独立的拟南芥全长cDNAs，用于构建拟南芥全长cDNA文库。这些cDNAs来源于RIKEN拟南芥全长cDNA收集物，每个cDNA均已测序(Seki et al.，2002，Plant J.，31，279-92)。而且，也混合了4个已知可诱导形态学表型及不育的细菌的致癌基因，将其用作内标。这些内标可用作文库中cDNA表达量的指示物，但在转化到拟南芥中后，这些致癌基因可以从其第二代突变系中清除掉。使用了：tmsl(Klee et al.，1984，Proc Natl Acad Sci U.S.A.，81，1728-32)；iaaM(Comai et al.，1982，J Bacteriol，149，40-6)；rolB(Furner et al.，1986，Nature，319，422-427)；及tmr(Lichtenstein et al.，1984，J Mol Appl Genet，2，354-62)。已知这些致癌基因可强烈影响许多植物的形态。这4个致癌基因以约每种全长cDNA的双倍摩尔比加入到cDNA混合物中。可预期在每约7500个cDNA克隆中即可遇到一个致癌基因。

在构建土壤杆菌文库(FOX土壤杆菌文库)后，设计T-DNA特异性引物对从随机选取的土壤杆菌克隆分离到的DNAs进行PCR。当扩增了来自34个土壤杆菌克隆的PCR片段然后进行电泳时，发现20个克隆含有单链cDNA构建体，发现11个克隆含有2个不同的cDNA构建体，发现1个克隆含有3个不同的cDNA构建体，还发现2个克隆含有空载体(图1(b))。图1(b)中的泳道1、2、5、6、7、9、10、13、15、17、19和22所示的是所扩增的多个条带(泳道M表示Lambda/HindIII标记)。

此外，这45个扩增的cDNA片段平均大小为1.4Kb，其范围在0.3Kb到3.0Kb之间。当对45个cDNA片段测序时，发现所有的cDNAs彼此无关(数据未显示)。

(2)生成拟南芥FOX谱系

为了生成拟南芥FOX谱系，使用FOX土壤杆菌文库转化拟南芥Columbia-0(Col-0)生态型。浸花转化后，采集来自T₀植株的种子然后在含潮霉素的BAM平板上进行选择(Nakazawa et al.，2003，Biotechniques，34，28-30)。通过使用这些平板进行萌发后，在1周内对转基因植株进行选择，从而无需进行进一步培养以选择潮霉素抗性秧苗。将潮霉素抗性T₁秧苗移植到土壤中，生成了超过15000个拟南芥可育FOX谱系。为了确认存在转基因，通过Southern法分析了24个随机选取的植株，使用潮霉素基因作为探针检查是否存在标记基因。发现所有的谱系均含有潮霉素抗性基因。此外，发现在这些拟南芥FOX谱系中平均存在2.6个T-DNA插入(数据未显示)。

(3)在拟南芥FOX谱系中全长cDNAs的大小分布及序列差异

将全长cDNAs整合到表达载体中，其大小分布范围为0.3Kb到3Kb，平均为1.4Kb。检验了是否大小分布可反映拟南芥FOX谱系。

为了估算整合在这些FOX谱系中的cDNAs的大小分布以及变化，使用T-DNA特异性引物对从随机选取的FOX植株中分离的基因组DNA进行PCR。在106个谱系中大小分布平均为1.4Kb，其范围在0.3Kb到4.2Kb之间。图1(c)所示的是从拟南芥FOX植株中扩增的106个RAFL cDNA片段的大小分布，它是通过与277个随机选自Lamdba载体上的RAFL cDNAs(白色线条)相比较而获得的。为了强调分布模式的相似性，在绘图前将从Lambda载体获取的数值除以2，然后将结果绘制在图中。

从这些谱系扩增的PCR片段的平均数为每植株1.2个。进行了DNA凝胶印迹分析。从而，发现平均每个谱系有2.6个插入。然而，从FOX植株中仅收集了平均1.2个PCR片段。这种低PCR片段回收率部分程度上可用在群体中存在空载体来解释，但主要是通过诸如T-DNA串联或反向重复(De Buck et al.，1999，Plant J，20，295-304；DeNeve et al.，1997，Plant J，11，15-29；Krizkova et al.，1998，Plant J，16，673-80)这样的复制的T-DNA整合事件来解释。

cDNA分布的平均大小和范围与FOX土壤杆菌文库中所观测的那些非常相似，也与在277个随机选择的拟南芥全长cDNAs中所观测的那些很相似(图1(c))。

对四十个(40)PCR片段进行测序，表明它们来自不同的全长cDNAs，并且这些cDNAs中没有一个与加入到cDNA混合物中作为内标的细菌致癌基因是相同的(表1)。

表1：40个插入到FOX植株中的RAFL cDNAs的基因注释

谱系	RAFL代号	p值	MIPS代号	注释
					F04822	06-69-P16	3.00E-25	At1g29390	未知蛋白
F04838	09-19-I24	2.50E-27	At5g02040	sa_e_20未知蛋白
					F04841	05-07-L21	1.30E-84	At2g13360	f14o4丙氨酸-乙醛酸转氨酶
F05137	ND	2.80E-32	At1g26800	T24P13未知蛋白
					F05139	09-89-F04	6.60E-102	At1g12900	F13K23甘油醛3-磷酸脱氢酶A，叶绿体前体，推定的
F05140	04-17-E22	4.90E-65	At5g40370	mpo 12谷氧还原蛋白样蛋白
					F05209	06-86-D10	1.70E-68	At4g25950	EN_D_24液泡型H+-ATP酶亚基G3(VHA-G3)
F05212	ND	6.90E-67	At1g03020	F1003推定的谷氧还蛋白
					F05509	21-13-L10	5.70E-74	At1g29395	F15D2未知蛋白
F05535	09-23-L13	1.00E-72	At3g52990	mg_c_20丙酮酸激酶样蛋白
					F05625	06-76-K22	9.00E-97	At5g51610	F9L11质体核糖体蛋白(PRPL11)
F05632	04-12-J05	1.30E-42	At1g32990	K17S15类L1150s核糖体蛋白
					F05701	09-07-M11	2.70E-103	At4g40070	MY_D_45未知蛋白
F05706	06-11-C05	2.80E-99	At4g00895	T18A10未知蛋白
					F05735	05-14-011	1.00E-24	At3g50260	po-c-22推定的蛋白
F06540	08-12-G17	6.60E-116	At5g60360	muf9AALP蛋白
					F06549	09-13-A13	1.40E-81	At2g44100	f6e13GDP解离抑制剂
F06603	17-39-M11	1.10E-64	At5g12310	my_e_31类RING指蛋白
					F06603	09-34-021	1.80E-103	At3g09440	F3L24热休克蛋白(At-hsc70-3)
F06603	ND	4.50E-10	At5g10380	wt_e_21推定的蛋白
					F06619	09-81-K15	8.40E-82	At1g29410	磷酸核糖基邻氨基苯甲酸异构酶
F06636	06-10-F19	4.00E-98	At2g41430	脱水诱导的蛋白(ERD15)
					F06650	09-36-H22	4.20E-70	At4g35860	EN_D_23GTP结合蛋白GB2
F06827	ND	9.00E-25	At5g67190	K21H1 TINY样蛋白
					F06903	06-71-N13	3.30E-55	At4g39090	MY_D_43干旱诱导的半胱氨酸蛋白酶RD19A前体
F06909	ND	6.10E-20	At1g03901	F21M11未知蛋白
					F06909	ND	7.50E-14	At4g28660	SR-D-25光系统II蛋白酶RD19A前体
F06913	09-67-P06	3.70E-123	At4g24430	WT_D_35类LG27/30基因
					F07008	09-47-K07	2.60E-68	At1g29850	F1N18与TF-1细胞凋亡相关蛋白19相似
F07049	04-14-I04	9.00E-76	At5g38430	MXI10二磷酸核酮糖羧化酶小链b前体
					F07108	ND	1.20E-29	At5g67500	K9I9porin样蛋白
F07703	ND	2.00E-37	At1g70830	F15H11未知蛋白
					F07801	04-09-024	2.10E-76	At4g30270	WU_D_22木糖葡萄糖-endo-1，4-β-D-葡聚糖酶前体
F07805	ND	1.40E-15	At1g59740	F23H11硝酸盐转运子NTL1，推定的

F07818	11-02-I02	6.10E-61	At4g25570	PO_D_20未知蛋白
					F08101	09-19-E06	6.40E-60	At2g16070	f7h1未知蛋白
F08134	06-09-G16	1.20E-74	At3g15780	MSJ11未知蛋白
					F08151	06-11-K21	1.20E-80	At2g20880	f5h14 AP2域转录因子
F08326	09-19-L12	3.90E-114	At5g18770	ch_e_41推定的蛋白
					F08509	04-20-L08	8.20E-77	At5g66040	K2A18衰老相关蛋白sen1样蛋白类酮康唑抗性蛋白

谱系：谱系名字；RAFL代号：对应于全长cDNA的RAFL数；ND：未确定；“P值”、“MIPS代号”和“注释”是使用MIPS Arabidopsisthalina基因组数据库进行BLAST检索的结果(http://mips.gsf.de/proj/thal/db/index.html)。

(4)监测拟南芥FOX谱系的表型

在生成15547个T₁FOX谱系期间，对表型(譬如，生长率、植株颜色、花期及育性)进行监测。这样，收集了1487个表型上有变动的谱系。

将这些有明显形态学突变的谱系与拟南芥激活标签谱系中出现的形态学突变体进行比较。不同种类突变体出现的频率几乎与激活标签突变体中的出现频率相同，但是在Fox谱系中突变体通常以更高效率出现(数据未显示)。这表明Fox谱系的效率主要是由于强CaMV启动子及胭脂氨酸合成酶(NOS)终止子控制下的全长cDNAs正确表达所致。

为了确认T₂代中突变表型的遗传力，栽培了117个在T₁代中表现出浅绿色的突变系(表2)，然后调查T₂代中的突变表型。

表2

	谱系名称	观测植株的数目(0)	表现出表型的植株的数目(P)	T2表型比率(P/O X 100)
					1	F03430	17	17	100
2	F05420	17	17	100
					3	F05833	5	4	80
4	F06017	12	12	100
					5	F06026	8	0	0
6	F06121	15	0	0
					7	F06405	11	11	100
8	F06644	10	10	100
					9	F07103	17	17	100
10	F07146	7	0	0
					11	F08004	9	0	0
12	F08007	16	16	100
					13	F08211	17	12	70
14	F08650	17	0	0
					15	F08919	13	0	0
16	F09751	1	0	0
					17	F09807	4	0	0
18	F10002	17	0	0
					19	F10116	13	13	100
20	F10129	17	17	100
					21	F10216	12	10	83
22	F10223	2	0	0
					23	F10244	16	0	0
24	F10422	4	4	100
					25	F10428	15	6	40
26	F10439	17	0	0
					27	F10731	17	17	100
28	F11005	6	5	83
					29	F11726	9	9	100
30	F12809	11	0	0
					31	F12929	41	41	100
32	F13219	12	6	50
					33	F13222	4	3	75
34	F13602	13	6	46
					35	F13627	17	17	100
36	F14207	5	3	60
					37	F14344	5	5	100
38	F14403	3	3	100
					39	F14442	5	0	0
40	F14634	40	40	100
					41	F14701	6	5	83
42	F14702	7	4	57
					43	F14905	15	9	60
44	F15031	26	18	69

45	F15113	17	0	0
					46	F15117	16	0	0
47	F15445	14	14	100
					48	F15649	13	0	0
49	F15707	17	17	100
					50	F15716	12	0	0
51	F15836	32	21	65
					52	F15903	9	5	55
53	F16031	3	0	0
					54	F16128	15	0	0
55	F16232	13	4	30
					56	F16302	11	11	100
57	F17212	12	0	0
					58	F17222	12	12	100
59	F17341	8	7	87
					60	F17620	13	0	0
61	F17850	17	5	29
					62	F17908	17	0	0
63	F17918	17	0	0
					64	F17938	17	0	0
65	F18419	17	17	100
					66	F18625	14	0	0
67	F18704	14	6	42
					68	F18817	9	9	100
69	F19419	17	17	100
					70	F19832	17	0	0
71	F19903	17	0	0
					72	F19934	9	9	100
73	F20117	1	1	100
					74	F20350	17	17	100
75	F20610	17	0	0
					76	F20804	1	1	100
77	F21014	33	18	54
					78	F21129	17	15	88
79	F21139	43	37	86
					80	F21350	1	1	100
81	F21617	11	5	45
					82	F21705	17	1	5
83	F22320	16	8	50
					84	F22723	14	12	85
85	F22814	17	0	0
					86	F22835	13	0	0
87	F23218	17	7	41
					88	F23404	57	42	73
89	F23404	16	1	6
					90	F23607	8	3	37
91	F23817	17	0	0
					92	F24240	17	10	58

93	F24737	17	0	0
					94	F25132	17	17	100
95	F25145	26	26	100
					96	F25344	17	4	23
97	F26427	17	0	0
					98	F26516	17	10	58
99	F26615	17	0	0
					100	F26746	17	0	0
101	F26918	17	15	88
					102	F27141	17	5	29
103	F27225	17	7	41
					104	F27718	32	17	53
105	F27904	17	0	0
					106	F28030	16	8	50
107	F28407	1	0	0
					108	F28409	17	6	35
109	F28503	17	0	0
					110	F28621	15	5	33
111	F28909	29	28	96
					112	F29309	17	0	0
113	F29340	7	7	100
					114	F29739	39	39	100
115	F29743	17	3	17
					116	F30406	9	2	22
117	F30503	8	8	100

为了监测这些表型，栽培每个谱系的20个秧苗。尽管确定20个秧苗的确切显性有些困难，仍有60个谱系表现出浅绿色表型(具体地，如表2所示，T₂表型比例为50％或者更高的谱系数目为60)。此外，检测了40个形态学突变体，发现7个谱系表现出原始的突变表型。这可能是由于抑制了T₂代的转基因或在T₁ FOX植株中错误鉴定了突变体所致。特别地，矮小及叶片形状突变体可能是由于从选择平板上移植后的环境胁迫造成的。

(5)由致癌基因导致的形态

将作为内标的四(4)个致癌基因——tms1、iaaM、rolB和tmr与全长DNA文库混合。iaaM和tmsl分别编码来源于丁香假单胞菌(P.syringae)的色氨酸2-加氧酶及来源于根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)的色氨酸2-加氧酶，并且过表达以增强植物生长素应答(Comai et al.，1982，J Bacteriol，149，40-6)。rolB来源于Agrobacterium rhyzogenesis，并参与对植物生长素的敏感性。致癌基因tmr来源于根癌土壤杆菌，其功能是细胞分裂素的生物合成。将这些致癌基因中的每一种均以相当于其它全长cDNA两倍的摩尔比与全长cDNA混合。

为了监测全长cDNA的表达水平与分布，检查拟南芥FOX谱系中是否出现了这些致癌基因。首先，对于由这些致癌基因导致的突变体，监测了转基因植株的形态。发现只有下述两种基因确实具有形态学表型。由于tmsl和iaaM增强了植物生长素的应答，发现含有这些基因的植株具有加速的顶端优势及矮性(compact)表型(图2)。可以轻而易举地将这些形态学特征与其它形态学突变体非常清晰地区分开来。图2(a)所示的是在相同生长周期栽培的iaaM过表达植株与野生型(WT)植株的比较。图2(b)所示的是iaaM过表达植株的照片。图2(c)所示的是tmsl过表达植株的照片。

过表达tmr会导致植株秧苗死亡，但过表达rolB不会导致明显的表型。发现在15547个拟南芥FOX谱系中存在十三(13)个过表达tmrl和iaaM的突变体。这些突变体的表观数目高于理论值(15000中有4个)。这可能是由于所转化的土壤杆菌在细菌培养过程中的生长差异所致。除rolB之外的这些致癌基因的一个优势在于它们不会传递到下一代，因为其突变体是不育的。

(6)由于植物早熟基因导致的突变体的表征

在上述59个在T₂代中表现出浅绿色表型的谱系中，选取两个谱系作为代表(F03024谱系(该谱系表现出延迟生长)，F01907谱系(表现出过表达早熟基因的早熟谱系))。F03024植株表现出浅绿色及延迟生长的表型(图3(a)，T₁代中F03024谱系的表型)。自花授粉后在T₂代中浅绿色表型是半显性的(图3(b)：来自T₂代的F03024植株表现出部分浅绿色表型，图3(c)左：在T₂代中F03024植株表现出浅绿色的茎，右：在T₂代中F03024谱系的野生型分离株)。F01907也是作为浅绿色突变体分离的，其表型在T₂代中是显性的(图3(e)，在T₁代中F01907的表型)。图3(g)所示的是这些谱系叶绿素含量的比较(在图3(g)中，X轴1：野生型植株，2：F01907谱系的T₁植株，3：F03024谱系的T₁植株，Y轴：相对叶绿素含量)。

通过使用T-DNA引物组的基因组PCR来回收所导入的全长cDNAs。从F03024和F01907植株中分别重新获得了3.0Kb的cDNA片段和0.8Kb的cDNA片段。引物设计为可扩增插入的全长cDNA片段。将这样重新获得的cDNA片段克隆回土壤杆菌Ti质粒载体中，然后用重构建的质粒转化拟南芥(Col-0)植株。

在土壤中栽培后，用从F03024中重新获得的cDNA生成的48个转基因植株中有32个表现出在原始F03024植株中观察到的浅绿色及延缓生长的表型(图3(d)，左：未转化的野生型植株，右：在相同时期栽培的用AtPDH1基因(描述见下文)转化的野生型植株表现出浅绿色表型)。对从F03024回收的cDNAs进行测序。使用NCBI(国立生物技术信息中心)数据库检查从F03024重新获得的cDNA，发现其为At1g70070(RIKEN，Japan)拟南芥全长cDNA No.AF387007)，编码DEVH盒解螺旋酶。在F03024中At1g70070被过表达(图4(a))。DEVH盒解螺旋酶是包括DEAD及DEAH盒RNA解螺旋酶在内的基因家族成员。从F03024重新获得的cDNA命名为AtPDH1(拟南芥原核DEVH盒解螺旋酶1)。已有烟草DEAD盒解螺旋酶(VDL)作用于叶绿体并调节叶绿体发芽的报道(Wang et al.，2000)。AtPDH1在其N末端区有一个推定的叶绿体靶信号，属于构成原核DEAD盒解螺旋酶的一个小分支。通过将N末端的98个氨基酸与绿色荧光蛋白(GFP)融合来检验该蛋白的细胞内定位。因此，发现该蛋白定位于叶绿体中(图9(a)和(b))。当检验过表达AtPDH1植株的浅绿色叶片中光合作用活性及叶绿体结构时，光合作用活性显著降低了(图3(h))。这是由于叶绿体内膜结构发育不足所致(图8)。

在51个含有从F01907中回收的cDNA的转基因植株中有四十七(47)个再次表现出原始的F01907表型，并在长日照条件下表现出浅绿色及早期开花的表型(图3(f)左：未转化的野生型植株，右：栽培于相同时期在T₂代中表现出浅绿色及较高高度表型的At3g55240转基因植株)。将cDNA进行测序，然后使用NCBI数据库进行检查，从而发现At3g55240具有未知功能。

F01907植株不仅表现出浅绿色表型，而且比野生型植株生长得更快更高(图3(e)和图3(f))。由于这种植物发育是对生长在弱光照条件下的野生型植株发育的“回放”，因此这种表型被称为“PEL(光线照射的假黄化)”。PEL表型是由于过表达具有未知功能的At3g55240基因所致(图4(b)，上部的条带表示At3g55240的特异性PCR片段，下部的条带表示用于上样修正的AHA1PCR片段(AHA1：拟南芥质膜H+-ATP酶)，泳道1：野生型Columbia植株，泳道2-7：表现出浅绿色表型的T₂-R01907植株，泳道8：表现出浅绿色表型的T₂-F01907)。于F03024植株相反，这些PEL植株具有正常的光合作用活性以及正常的叶绿体结构(图3(h)，泳道1-4：4个独立的At1g70070转基因植株，泳道5-7：3个独立的At3g55240转基因植株，Y轴：以相对于野生型来表示的相对光合作用活性，X轴：个体植株。图8，对野生型(1和2)，At1g70070转基因植株(3和4)及At3g55240转基因植株(5和6)的叶肉细胞的电子显微镜观察。箭头表示plastgrobule的聚集。线条1、3和5表示1μm。线条2、4和6表示200nm)。At3g55240基因编码一个小蛋白(95个氨基酸)，并具有相对较长的3’UTR(330bp)。发现来源于拟南芥的两个基因、来源于水稻和豆子的基因与这个小蛋白具有同源性，但是在哺乳动物中则没有该同源性基因。因此，发现这些基因是植物特异性的。图6所示的是AT3G55240蛋白与相关蛋白的比对。AT3G55240、AT3G28990和AT5G02580是拟南芥蛋白。OS01G0837600(旧称：P0031D11.2)是水稻EST蛋白。图6中的数字表示每种蛋白的氨基酸位置。图7所示的是AT3G55240蛋白和相关蛋白的系统发育树。AT3G55240、AT3G28990和AT5G02580是拟南芥蛋白，OS01G0837600(旧称：P0031D11.2)是水稻EST蛋白。当用细胞内定位预测程序TargetP V1.0对这些基因进行分析时，它们都表现出分泌蛋白的典型特征，即，具有N末端跨膜结构域及邻近的剪切位点。然而，未报道过此蛋白功能。由于在公开的资源中心未发现敲除At3g55240的谱系，制备了对应于该基因的RNAi构建体并转入野生型拟南芥植株中。绝大多数转基因植株在非常早的发育阶段就已经死亡。此外，在所有残存下来的转基因植株中均未观察到目标基因转录水平的降低。因此，At3g55240基因组的敲除表型可能是致死的。

(7)转基因的表达水平及突变表型

通过异位表达单个拟南芥全长cDNA来产生FOX谱系。从而，检查了转基因表达水平与突变表型之间的相关性。

检查了几个再次转基因植株中At3g55240的表达水平。同野生型植株相比较，表达水平在1.0E+3倍到1.0E+8倍或更高之间变化(图5(a)所示的是通过实时PCR估算的At3g55240的相对表达水平)。检查了这些突变体的叶绿体含量及抽苔时间(抽苔前叶片的数目)(图5(b)所示的是叶片的相对叶绿体含量，图5(c)所示的是抽苔前莲座叶的数目)。在At3g55240的表达水平与叶绿体含量及抽苔时间之间观察到了负相关(图5(a)到(c))。在图5(a)到(c)中，每幅图中X轴上的每个数字表示T₂代中At3g55240再次转基因植株的No.。谱系No.19、21或22的植株为表现出潮霉素敏感性的野生型分离株。图5(d)为每个谱系No.T₂植株的照片。

这些结果表明突变表型是转基因的结果，表型变化依赖于转基因的表达水平。有趣的是，转录物优先在野生型植株的莲座叶中表达(图4(c)，上部条带表示At3g55240特异性的PCR片段(p01907)，它通过RT-PCR来扩增(循环数为40)，下部条带表示AHA1的PCR片段(拟南芥质膜H+-ATP酶)，通过RT-PCR来扩增(循环数为28)，用于上样修正。泳道1：叶片，泳道2：茎，泳道3：根，泳道4：花瓣，泳道5：种子)。

本文所引用的所有出版物、专利及专利申请均以参考的形式完整地整合在本文中。

工业应用的可能性

根据本发明可以提供的有益之处在于：通过用植物早熟基因转化多种植物使植物的早熟成为可能，从而能够加速收获作物的时限等；或者可通过肽合成等来人工合成全部或部分这种早熟基因的基因产物、然后将产物同水一起加入到土壤或植株中，从而加速花的形成。此外，使用上述基因获得的转基因植物其特征在于比其野生型植株具有更大的植株大小，从而该转基因植物可用作，例如工业原料。

本发明的早熟转基因植物可用于，例如农艺及园艺领域。

序列表

<110>RIKEN

<120>早熟的转基因植物

<130>PH-3274-PCT

<150>JP 2006-221061

<151>2006-08-14

<160>37

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>670

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

aaagaagact ctcttttaag tttgggtgtt aattctaggg tttccattaa caatggcaga  60

ttcttcttct gcttcttaca ttcacatggt gcagcacatg atagagaaat gtttgatctt 120

ccatatgagc aaagaagagt gtgtggaagc tctctctaag catgcaaaca tcactcctgt 180

catcacctct actgtgtgga aggagctgga gaaagagaac aaggaattct tcaaggcgta 240

tgaggagagg caaagcaaac aagagcaaat gtcggaggaa gagacaaacc agatgatcca 300

gaagattatc tcggattcat ctaaagaatc cgacgactga tcgcgatgtt cgatcgttag 360

atttcgaaaa ccttatagtt tatatatatg aatctcatga aaacgattta tccctgacgc 420

atgcatgttt ataagtaaat cgttttttca tcttagcatc ggtccaacaa gcaagacagc 480

aaaaaaagga gtgatgacac tctttttggt acgttatacg tacgtggtcc acataatatt 540

gcctctgttt aattatatat aatgaaacgg acgctagctc atacatggat cgatggtgtg 600

gtgttttaat tgaatgtatc gtgtgtatat attttcaaat aaactattta tttcgggttt 660

tggtcacctt                                                        670

<210>2

<211>95

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>2

Met Ala Asp Ser Ser Ser Ala Ser Tyr Ile His Met Val Gln His Met

1               5                   10                  15

Ile Glu Lys Cys Leu Ile Phe His Met Ser Lys Glu Glu Cys Val Glu

            20                  25                  30

Ala Leu Ser Lys His Ala Asn Ile Thr Pro Val Ile Thr Ser Thr Val

        35                  40                  45

Trp Lys Glu Leu Glu Lys Glu Asn Lys Glu Phe Phe Lys Ala Tyr Glu

    50                  55                  60

Glu Arg Gln Ser Lys Gln Glu Gln Met Ser Glu Glu Glu Thr Asn Gln

65                  70                  75                  80

Met Ile Gln Lys Ile Ile Ser Asp Ser Ser Lys Glu Ser Asp Asp

                85                  90                  95

<210>3

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>3

agaggccaaa tcggccatgt cagcttcacc tctcctt                   37

<210>4

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>4

agaggccctt atggccctaa tttctagtgc ggtagttat              39

<210>5

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>5

agaggccaaa tcggccatgt atgaccattt taattcaccc             40

<210>6

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>6

agaggccctt atggccctaa tagcgatagg aggcgttg               38

<210>7

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>7

tcctctagag gccaaatcgg ccatggatcc caaattgcta ttcct       45

<210>8

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>8

tgatctagag gcccttatgg ccttaggctt ctttcttcag gttta            45

<210>9

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>9

agaggccaaa tcggccatgg acctgcatct aattttcg                    38

<210>10

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>10

agaggccctt atggccccta atacattccg aacggatga                   39

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>11

atgaaaaagc ctgaactcac cg                                         22

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>12

tcgagagcct gcgcgacg                                             18

<210>13

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>13

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc tagaggccct tatggccg            48

<210>14

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>14

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cgagttaatt aaattaatcc ccc      53

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>15

acattctaca actacatcta gagg                       24

<210>16

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>16

cggccgcccc ggggatc                               17

<210>17

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>17

tcgcgttaac gctagcatgg atctc                      25

<210>18

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>18

gtaacatcag agattttgag acac                       24

<210>19

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>19

ttcatatcca aggcggtcaa tgtg                       24

<210>20

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>20

ccatgccttc tcctgtgtac caa                        23

<210>21

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>21

ttcttctggg tgaagatgtc agg                        23

<210>22

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>22

tggttttagg agcaagacca gc            22

<210>23

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>23

tgatagagaa atgtttgatc ttccat        26

<210>24

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>24

tcttgcttgt tggaccgatg ctaag         25

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>25

ctggatcggt ggttccattc                       20

<210>26

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>26

cctggacctg cctcatcaa c                      21

<210>27

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>27

catgcgtcag ggataaatcg t                     21

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>28

actgtgtgga aggagctgga                       20

<210>29

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>29

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tgaacactct tcccgtcgtc t      51

<210>30

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>30

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc gtcatcgcta ttccgaattt ca     52

<210>31

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>31

tcaaagtctt gccactacta gtcg                                    24

<210>32

<211>293

<212>DNA

<213>Arabidopsis thaliana

<400>32

tggttgtagc aaaatatata atagaaatga gacactcttc tcccgctgta tacattcatc     60

tggtgcaaca catgatagag acatgtttga cctttaacat gagcaaagag gaatgcatgg    120

aagctctctc agagaatgca aacatcaatc ccatcatcac gtccactgtt tggaaggagc    180

tggttaaaga gaacaaggac ttctttgaga cgtacgagca gaagcttatg aaaaaggaat    240

caatgtcgga ggaggagaca aaccaattaa ttcagaacat catctctttg tga           293

<210>33

<211>88

<212>PRT

<213>Arabidopsis thaliana

<400>33

Met Arg His Ser Ser Pro Ala Val Tyr Ile His Leu Val Gln His Met

1           5                       10                  15

Ile Glu Thr Cys Leu Thr Phe Asn Met Ser Lys Glu Glu Cys Met Glu

            20                  25                  30

Ala Leu Ser Glu Asn Ala Asn Ile Asn Pro Ile Ile Thr Ser Thr Val

        35                  40                  45

Trp Lys Glu Leu Val Lys Glu Asn Lys Asp Phe Phe Glu Thr Tyr Glu

    50                  55                  60

Gln Lys Leu Met Lys Lys Glu Ser Met Ser Glu Glu Glu Thr Asn Gln

65                  70                  75                  80

Leu Ile Gln Asn Ile Ile Ser Leu

                85

<210>34

<211>722

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>34

cgggtcttgt agcgttttat atatattttc acctgccttt cttctcccat ccatcatcat   60

atctctctct aatttctctc cgtataacac aaactactct ttaataagta tttatgggtg  120

atcataatag ctcgcaagct tcttacatcc atttggtgca tcatttgata gaagaatgta  180

tagtattcaa catgggcaaa gaagagtgta tggatgctct gttcaagcat gctaatatta  240

agcctatcat cacttccaca gtgtggaaag agctagcgaa agagaacaaa gagttcttcg  300

aggcatacga gagaagacga gaagaaatac cgaccgagaa agagacagct cgaagaatcc  360

gtgatttgct ttcacgaact acaatctaag atcatgacac ctacttttac ttacatatac  420

atacactcat ctatattacc ataggcatgt gtgtgtatat gtatgatccg acgattctat  480

atatactctt tagacaattt gtattataat cttcattagg aaatgaataa ttcacctttg  540

gggaaatctc tttttcagct tagtttaaaa tcgttatgat ttatttgctc tttttcacgt  600

tatgatttat ttgcgtatta cttttcttta cgttatgatt tatttgtaag ttaccaattg  660

gatcttaacc attttcaatg tctaaacaat gttattggag cataatatac ctgtctttgt  720

gt                                                                 722

<210>35

<211>91

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>35

Met Gly Asp His Asn Ser Ser Gln Ala Ser Tyr Ile His Leu Val His

1               5                   10                  15

His Leu Ile Glu Glu Cys Ile Val Phe Asn Met Gly Lys Glu Glu Cys

            20                  25                  30

Met Asp Ala Leu Phe Lys His Ala Asn Ile Lys Pro Ile Ile Thr Ser

        35                  40                  45

Thr Val Trp Lys Glu Leu Ala Lys Glu Asn Lys Glu Phe Phe Glu Ala

    50                  55                  60

Tyr Glu Arg Arg Arg Glu Glu Ile Pro Thr Glu Lys Glu Thr Ala Arg

65                  70                  75                  80

Arg Ile Arg Asp Leu Leu Ser Arg Thr Thr Ile

                85                  90

<210>36

<211>680

<212>DNA

<213>稻(Oryza sativa)

<400>36

gttggtcgat cactccatcg atccatcgat cgatcgctag ctactcgccg tcgtcgaccg     60

gtcgatccgc cattagcgag ctgcaaggct ctctcgctta taaatcttcc gagtaggcaa    120

gcctcaatcg atccgagagt ttggtcgttg atcgagctga tcgatcgacc ggtgagtggt    180

gcgtggtgtg cggccatgga cgacggcggc ggcggcggcg gcggcgactc gtcgccggct    240

tcgtacatca gattggtgca gcatctgatc gagaagtgca tctgctacaa catgaacaag    300

gaggaatgca tggagacgct ggagaagcac gccaacatca agcccgtcat cacctccacc    360

gtgtggaagg agcttgagaa ggagaacagc gagttcttcg ccacgtacaa gaagggccaa    420

ggagaggaac cagcggagag caagagcagt agttcttcac aggaagctgc tggttccaag    480

agatcaggcg gagacgacga ctaggtgcat gcatggcacc cacgagagag ggggctactt    540

gtacagtagg atatccatca agtcgtagta cctcgtactg tcttacatct agctgttcat    600

agtacatagc gtatagtagt aatgtagccg ttattatgta cgttttgccc cgaaaataat    660

taagattcgg attcgcagct                                                680

<210>37

<211>102

<212>PRT

<213>稻

<400>37

Met Asp Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Ser Ser Pro Ala Ser

1               5                   10                  15

Tyr Ile Arg Leu Val Gln His Leu Ile Glu Lys Cys Ile Cys Tyr Asn

            20                  25                  30

Met Asn Lys Glu Glu Cys Met Glu Thr Leu Glu Lys His Ala Asn Ile

        35                  40                  45

Lys Pro Val Ile Thr Ser Thr Val Trp Lys Glu Leu Glu Lys Glu Asn

    50                  55                  60

Ser Glu Phe Phe Ala Thr Tyr Lys Lys Gly Gln Gly Glu Glu Pro Ala

65                  70                  75                  80

Glu Ser Lys Ser Ser Ser Ser Ser Gln Glu Ala Ala Gly Ser Lys Arg

                85                  90                  95

Ser Gly Gly Asp Asp Asp

            100

Claims (12)

1.早熟的转基因植物，其含有可被表达的核酸，所述的核酸编码：

(a)含有SEQ ID NO：2、33、35或37所示氨基酸序列的蛋白；

(b)含有在SEQ ID NO：2、33、35或37所示氨基酸序列中有一个或几个氨基酸缺失、替代、或者增加所得的氨基酸序列、并且具有导致植物早熟活性的蛋白；或者

(c)含与SEQ ID NO：2、33、35或37所示氨基酸序列具有90％或者更高同一性的氨基酸序列、并且具有导致植物早熟活性的蛋白。

2.权利要求1中的转基因植物，其中所述的核酸含有：

(d)含有SEQ ID NO：1、32、34或36中所示核苷酸序列的DNA；

(e)含有在SEQ ID NO：1、32、34或36中所示核苷酸序列中有一个或几个核苷酸缺失、替代或者增加所得的核苷酸序列、并且编码具有导致植物早熟活性的蛋白的DNA；

(f)含有与SEQ ID NO：1、32、34或36所示核苷酸序列具有90％或者更高同一性的核苷酸序列、并且编码具有导致植物早熟活性的蛋白的DNA；或者

(g)在严格条件下可与同含有SEQ ID NO：1、32、34或36所示核苷酸序列的DNA相互补的DNA进行杂交、并且编码具有导致植物早熟活性的蛋白的DNA。

3.权利要求1中的转基因植物，其中所述的植物是双子叶植物或单子叶植物。

4.权利要求1中的转基因植物，其中所述的核酸整合到植物基因组中。

5.权利要求1中的转基因植物，其中该蛋白进一步具有增加植株大小使其大于其野生型植株的活性。

6.来源于权利要求1到5任一项的转基因植物的组织、细胞或者种子。

7.用来产生权利要求1到5任一项的早熟的转基因植物的方法，包括将权利要求1或2的核酸导入到植物组织或细胞中并再生植物。

8.权利要求7的方法，其中所述的核酸的导入是通过使用含有该核酸的重组载体来进行的。

9.导致植物早熟的方法，包括在权利要求1到5任一项的转基因植物中过表达权利要求1或2的核酸，从而诱导早熟。

10.增加植株大小的方法，包括在权利要求1到5任一项的转基因植物中过表达权利要求1或2的核酸，从而诱导出比其野生型植株更大的植株。

11.导致植物早熟的方法，包括将权利要求1的蛋白应用到土壤或植株中从而诱导早熟。

12.增加植株大小的方法，包括将权利要求1的蛋白应用到土壤或植株中从而诱导出比其野生型植株更大的植株。

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