JPH1080295A - 無細胞タンパク合成系によるタンパクの合成方法及び装置 - Google Patents
無細胞タンパク合成系によるタンパクの合成方法及び装置Info
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- JPH1080295A JPH1080295A JP9068597A JP9068597A JPH1080295A JP H1080295 A JPH1080295 A JP H1080295A JP 9068597 A JP9068597 A JP 9068597A JP 9068597 A JP9068597 A JP 9068597A JP H1080295 A JPH1080295 A JP H1080295A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 安定かつ簡便に十分な量のタンパクを合成さ
せることのできる、無細胞タンパク合成系を用いたタン
パクの合成方法、及びタンパクの合成装置を提供するこ
と。 【解決手段】 無細胞抽出液を含む無細胞タンパク合成
系を用いたタンパクの合成方法において、無細胞抽出液
及び低分子基質を含有する合成反応液と、低分子基質溶
液とを膜を介して接触させ、分子拡散によって低分子基
質溶液中の低分子基質を合成反応液中に移行させること
により、合成反応液中の低分子基質濃度をほぼ一定に維
持するとともに、合成反応液中の低分子副産物を低分子
基質溶液中に排出させることを特徴とするタンパクの合
成方法。
せることのできる、無細胞タンパク合成系を用いたタン
パクの合成方法、及びタンパクの合成装置を提供するこ
と。 【解決手段】 無細胞抽出液を含む無細胞タンパク合成
系を用いたタンパクの合成方法において、無細胞抽出液
及び低分子基質を含有する合成反応液と、低分子基質溶
液とを膜を介して接触させ、分子拡散によって低分子基
質溶液中の低分子基質を合成反応液中に移行させること
により、合成反応液中の低分子基質濃度をほぼ一定に維
持するとともに、合成反応液中の低分子副産物を低分子
基質溶液中に排出させることを特徴とするタンパクの合
成方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、無細胞タンパク合
成系を用いたタンパクの合成方法及びタンパクの合成装
置に関する。ここで無細胞タンパク合成系とは、ｍＲＮ
Ａの情報を読み取ってタンパクやポリペプチドを合成す
る無細胞翻訳系、並びにＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合
成する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者を含む系の何
れをも意味するものとする。
成系を用いたタンパクの合成方法及びタンパクの合成装
置に関する。ここで無細胞タンパク合成系とは、ｍＲＮ
Ａの情報を読み取ってタンパクやポリペプチドを合成す
る無細胞翻訳系、並びにＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合
成する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者を含む系の何
れをも意味するものとする。
【０００２】
【従来の技術】無細胞タンパク合成系を用いたタンパク
やポリペプチドの製造方法として、小麦胚芽、ウサギ網
状赤血球、大腸菌等の抽出液を用いる方法が知られてい
る。しかしながら、それらの抽出液を用いて量的に十分
なタンパクを合成することは難しく、タンパクの合成量
を増加させる為の種々の工夫がなされてきた。その一つ
として、特開平１−５０３１１号公報には、ｍＲＮＡ、
ＡＴＰ、ＧＴＰ及びアミノ酸を基質として含んでいるリ
ボソームの無細胞タンパク合成系において、最終副産物
であるＡＭＰ、ＧＤＰ、ピロりん酸塩、無機りん酸及び
合成された主生産物のポリペプチドを含んでいる翻訳生
成物を限外濾過膜を介して反応系から取り出し、それと
同時にアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰの形態の基質を、そ
れらの初期濃度を維持するために反応系へ供給するポリ
ペプチドの製造方法が記載されている。この方法によれ
ば、従来の方法では１時間程度でポリペプチドの合成が
停止してしまうものが、４０時間以上に渡って反応が継
続し、合成されるポリペプチドの収量も大きく増加する
ことが示されている。
やポリペプチドの製造方法として、小麦胚芽、ウサギ網
状赤血球、大腸菌等の抽出液を用いる方法が知られてい
る。しかしながら、それらの抽出液を用いて量的に十分
なタンパクを合成することは難しく、タンパクの合成量
を増加させる為の種々の工夫がなされてきた。その一つ
として、特開平１−５０３１１号公報には、ｍＲＮＡ、
ＡＴＰ、ＧＴＰ及びアミノ酸を基質として含んでいるリ
ボソームの無細胞タンパク合成系において、最終副産物
であるＡＭＰ、ＧＤＰ、ピロりん酸塩、無機りん酸及び
合成された主生産物のポリペプチドを含んでいる翻訳生
成物を限外濾過膜を介して反応系から取り出し、それと
同時にアミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰの形態の基質を、そ
れらの初期濃度を維持するために反応系へ供給するポリ
ペプチドの製造方法が記載されている。この方法によれ
ば、従来の方法では１時間程度でポリペプチドの合成が
停止してしまうものが、４０時間以上に渡って反応が継
続し、合成されるポリペプチドの収量も大きく増加する
ことが示されている。
【０００３】また、この改良法として、特開平４−２０
０３９０号公報には、基質の送液系や反応系中の気相の
介在を最小限に制御することにより、反応槽内の圧力の
変動を減らして基質の送液を安定化して、ポリペプチド
を合成する方法が記載されている。更に、反応系より反
応生成物を取り出す限外濾過膜を反応系の側面もしくは
上面に置くことにより、下面に置くのに比べて膜の目詰
りが軽減されることも合わせて記載されている。しかし
ながら、これらの方法は、高価な機器と厳密な送液条件
を必要とし、また、限外濾過膜の目詰りが避けられない
といった問題点があった。
０３９０号公報には、基質の送液系や反応系中の気相の
介在を最小限に制御することにより、反応槽内の圧力の
変動を減らして基質の送液を安定化して、ポリペプチド
を合成する方法が記載されている。更に、反応系より反
応生成物を取り出す限外濾過膜を反応系の側面もしくは
上面に置くことにより、下面に置くのに比べて膜の目詰
りが軽減されることも合わせて記載されている。しかし
ながら、これらの方法は、高価な機器と厳密な送液条件
を必要とし、また、限外濾過膜の目詰りが避けられない
といった問題点があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、上記の従来技術の問題点を解決し、安定かつ簡便に
十分な量のタンパクを合成させることのできる、無細胞
タンパク合成系を用いたタンパクの合成方法、及びタン
パクの合成装置を提供することにある。
は、上記の従来技術の問題点を解決し、安定かつ簡便に
十分な量のタンパクを合成させることのできる、無細胞
タンパク合成系を用いたタンパクの合成方法、及びタン
パクの合成装置を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】前記の目的を達成するた
めに、本発明者らは鋭意研究を重ね、無細胞タンパク合
成に必要な低分子基質、例えばタンパクの合成材料であ
るアミノ酸や合成反応に必要なエネルギー源であるＡＴ
Ｐ、ＧＴＰ等の濃度を、膜を通した分子拡散によって初
期濃度に維持することができることを見出し、本発明を
完成させるに至った。本発明は、無細胞抽出液を含む無
細胞タンパク合成系を用いたタンパクの製造方法におい
て、無細胞抽出液及び低分子基質を含有する合成反応液
と、低分子基質溶液とを膜を介して接触させ、分子拡散
によって低分子基質溶液中の低分子基質を合成反応液中
に移行させることにより、合成反応液中の低分子基質濃
度をほぼ一定に維持するとともに、合成反応液中の低分
子副産物を低分子基質溶液中に排出させることを特徴と
するタンパクの合成方法を提供するものである。
めに、本発明者らは鋭意研究を重ね、無細胞タンパク合
成に必要な低分子基質、例えばタンパクの合成材料であ
るアミノ酸や合成反応に必要なエネルギー源であるＡＴ
Ｐ、ＧＴＰ等の濃度を、膜を通した分子拡散によって初
期濃度に維持することができることを見出し、本発明を
完成させるに至った。本発明は、無細胞抽出液を含む無
細胞タンパク合成系を用いたタンパクの製造方法におい
て、無細胞抽出液及び低分子基質を含有する合成反応液
と、低分子基質溶液とを膜を介して接触させ、分子拡散
によって低分子基質溶液中の低分子基質を合成反応液中
に移行させることにより、合成反応液中の低分子基質濃
度をほぼ一定に維持するとともに、合成反応液中の低分
子副産物を低分子基質溶液中に排出させることを特徴と
するタンパクの合成方法を提供するものである。
【０００６】本発明はさらに、無細胞抽出液を含む無細
胞タンパク合成系を用いたタンパクの合成装置におい
て、無細胞抽出液及び低分子基質を含有する合成反応液
の収容室と、低分子基質溶液の収容室を、膜を介して接
触させ、分子拡散によって低分子基質溶液中の低分子基
質を合成反応液中に移行させ、且つ、合成反応液中の低
分子副産物を低分子基質溶液中に排出させるようにした
ことを特徴とするタンパクの合成装置を提供するもので
ある。
胞タンパク合成系を用いたタンパクの合成装置におい
て、無細胞抽出液及び低分子基質を含有する合成反応液
の収容室と、低分子基質溶液の収容室を、膜を介して接
触させ、分子拡散によって低分子基質溶液中の低分子基
質を合成反応液中に移行させ、且つ、合成反応液中の低
分子副産物を低分子基質溶液中に排出させるようにした
ことを特徴とするタンパクの合成装置を提供するもので
ある。
【０００７】本発明はまた、基質溶液を収容する密閉基
質容器と；キャピラリー膜を有し、入口部を上記密閉基
質容器に連通したバイオリアクターと；吸入側を上記バ
イオリアクターの出口部に連通し、排出側を上記密閉基
質容器に連通したペリスタルチックポンプとを有し；上
記バイオリアクターにおいて、上記キャピラリー膜の一
方の側に収容されたタンパク合成反応液と他方の側に収
容された上記基質溶液とを上記キャピラリー膜を介して
接触させることを特徴とするタンパク合成装置を提供す
るものである。本発明はさらに、バイオリアクターにキ
ャピラリー膜を介して接する二つの画室を形成し、一方
の画室にタンパク合成反応液を収容し、他方の画室に基
質溶液を収容し、タンパク合成反応液と基質溶液とを上
記キャピラリー膜を介して接触させることを特徴とする
タンパク合成装置を提供するものである。
質容器と；キャピラリー膜を有し、入口部を上記密閉基
質容器に連通したバイオリアクターと；吸入側を上記バ
イオリアクターの出口部に連通し、排出側を上記密閉基
質容器に連通したペリスタルチックポンプとを有し；上
記バイオリアクターにおいて、上記キャピラリー膜の一
方の側に収容されたタンパク合成反応液と他方の側に収
容された上記基質溶液とを上記キャピラリー膜を介して
接触させることを特徴とするタンパク合成装置を提供す
るものである。本発明はさらに、バイオリアクターにキ
ャピラリー膜を介して接する二つの画室を形成し、一方
の画室にタンパク合成反応液を収容し、他方の画室に基
質溶液を収容し、タンパク合成反応液と基質溶液とを上
記キャピラリー膜を介して接触させることを特徴とする
タンパク合成装置を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、本発明に使用する無細胞抽
出液の調製から無細胞タンパク合成系におけるタンパク
合成活性の測定までの各段階について詳細に説明する。
本発明に使用する無細胞抽出液としては、例えば、小麦
胚芽抽出液及び大腸菌細胞抽出液等があげられる。この
明細書において、タンパク合成活性は、合成された酵素
タンパクの酵素量（１unit：１分間に１μmol の基質を
変化させる酵素量) で表す。 ｉ無細胞抽出液の調製と抽出液の濃縮 無細胞抽出液の調製は、用いる材料に応じて異なるが、
通常のいかなる方法を用いても良い。また、抽出液の濃
縮は、特開平６−２２５７８３号公報に記載された方法
等、いかなる方法を用いても良い。 ii無細胞タンパク合成反応 反応液には、無細胞抽出液の他、目的とするタンパクを
コードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、タ
ンパクの構成アミノ酸、緩衝剤、ＡＴＰ、ＧＴＰ等のエ
ネルギー源、クレアチンホスフェート、クレアチンホス
フォキナーゼ、ホスフォエノールピルビン酸、ピルビン
酸キナーゼ等のＡＴＰ再生系、ジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）、スペルミン、スペルミジン等の安定化剤、RNas
e 阻害剤等を適量加える。反応は、用いる無細胞抽出液
及び目的とするタンパクの種類等により最適の温度で行
われ、一般に２０〜４０℃が適当である。
出液の調製から無細胞タンパク合成系におけるタンパク
合成活性の測定までの各段階について詳細に説明する。
本発明に使用する無細胞抽出液としては、例えば、小麦
胚芽抽出液及び大腸菌細胞抽出液等があげられる。この
明細書において、タンパク合成活性は、合成された酵素
タンパクの酵素量（１unit：１分間に１μmol の基質を
変化させる酵素量) で表す。 ｉ無細胞抽出液の調製と抽出液の濃縮 無細胞抽出液の調製は、用いる材料に応じて異なるが、
通常のいかなる方法を用いても良い。また、抽出液の濃
縮は、特開平６−２２５７８３号公報に記載された方法
等、いかなる方法を用いても良い。 ii無細胞タンパク合成反応 反応液には、無細胞抽出液の他、目的とするタンパクを
コードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、タ
ンパクの構成アミノ酸、緩衝剤、ＡＴＰ、ＧＴＰ等のエ
ネルギー源、クレアチンホスフェート、クレアチンホス
フォキナーゼ、ホスフォエノールピルビン酸、ピルビン
酸キナーゼ等のＡＴＰ再生系、ジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）、スペルミン、スペルミジン等の安定化剤、RNas
e 阻害剤等を適量加える。反応は、用いる無細胞抽出液
及び目的とするタンパクの種類等により最適の温度で行
われ、一般に２０〜４０℃が適当である。
【０００９】合成反応液中の各成分の濃度は特に制限さ
れないが、通常、以下の濃度範囲が適当である。 無細胞抽出液：１０〜９０重量％ 目的とするタンパクをコードするＤＮＡ：１〜２０ｎｇ
／μl 目的とするタンパクをコードするｍＲＮＡ：１０〜２０
０ｎｇ／μl タンパクの構成アミノ酸：５０〜３００μＭ ＡＴＰ：０．５〜５ｍＭ ＧＴＰ：０．０５〜０．５ｍＭ クレアチンホスフェート：１０〜１００ｍＭ クレアチンホスフォキナーゼ：０．０２〜５μｇ／μl ホスフォエノールピルビン酸：１〜２０ｍＭ ピルビン酸キナーゼ：０．０１〜１μg ／μl ジチオスレイトール（ＤＴＴ）：１〜１０ｍＭ スペルミジン：０．１〜５ｍＭ スペルミン：０．０１〜０．５ｍＭ
れないが、通常、以下の濃度範囲が適当である。 無細胞抽出液：１０〜９０重量％ 目的とするタンパクをコードするＤＮＡ：１〜２０ｎｇ
／μl 目的とするタンパクをコードするｍＲＮＡ：１０〜２０
０ｎｇ／μl タンパクの構成アミノ酸：５０〜３００μＭ ＡＴＰ：０．５〜５ｍＭ ＧＴＰ：０．０５〜０．５ｍＭ クレアチンホスフェート：１０〜１００ｍＭ クレアチンホスフォキナーゼ：０．０２〜５μｇ／μl ホスフォエノールピルビン酸：１〜２０ｍＭ ピルビン酸キナーゼ：０．０１〜１μg ／μl ジチオスレイトール（ＤＴＴ）：１〜１０ｍＭ スペルミジン：０．１〜５ｍＭ スペルミン：０．０１〜０．５ｍＭ
【００１０】本発明者らの研究により、タンパク合成反
応に必要なアミノ酸や基質エネルギー物質には至適濃度
があり、その濃度を一定に保つことが重要であること、
また最終副産物であるＡＭＰ、ＧＤＰ、ピロリン酸塩、
無機リン酸塩等が蓄積すると合成反応が阻害されること
が見出されている。これらを解決する方法として先に説
明したように特開平１−５０３１１号公報に示されたい
わゆる連続系が用いられている。しかし、この方法は高
価な装置と厳密な送液条件を必要とし、限外濾過膜の目
詰りが生じる等、必ずしも満足できる方法ではない。そ
こで、タンパク合成反応液中の種々の基質濃度を、簡便
かつ安定に維持する方法を確立するため研究を進めた。
その結果、合成反応液と、低分子基質溶液とを膜を介し
て接触させ、分子拡散させることによって、低分子基質
溶液中の低分子基質を合成反応液中に移行させ、合成反
応液中の低分子基質濃度をほぼ一定に維持するととも
に、合成反応液中で生産された反応阻害性の低分子副産
物（ＡＭＰ、ＧＤＰ、ピロリン酸塩、無機リン酸塩等）
を低分子基質溶液中に排出させることができ、その結
果、反応の至適条件が維持され、タンパク合成活性が高
まることが確認された。
応に必要なアミノ酸や基質エネルギー物質には至適濃度
があり、その濃度を一定に保つことが重要であること、
また最終副産物であるＡＭＰ、ＧＤＰ、ピロリン酸塩、
無機リン酸塩等が蓄積すると合成反応が阻害されること
が見出されている。これらを解決する方法として先に説
明したように特開平１−５０３１１号公報に示されたい
わゆる連続系が用いられている。しかし、この方法は高
価な装置と厳密な送液条件を必要とし、限外濾過膜の目
詰りが生じる等、必ずしも満足できる方法ではない。そ
こで、タンパク合成反応液中の種々の基質濃度を、簡便
かつ安定に維持する方法を確立するため研究を進めた。
その結果、合成反応液と、低分子基質溶液とを膜を介し
て接触させ、分子拡散させることによって、低分子基質
溶液中の低分子基質を合成反応液中に移行させ、合成反
応液中の低分子基質濃度をほぼ一定に維持するととも
に、合成反応液中で生産された反応阻害性の低分子副産
物（ＡＭＰ、ＧＤＰ、ピロリン酸塩、無機リン酸塩等）
を低分子基質溶液中に排出させることができ、その結
果、反応の至適条件が維持され、タンパク合成活性が高
まることが確認された。
【００１１】このように本発明においてタンパク合成活
性が高くなる主な理由は、合成反応液と低分子基質溶液
が膜を介して接触し、低分子物質が膜を介して分子拡散
するために、合成反応液中の基質濃度が低下すると膜を
介して低分子基質が合成反応液中に拡散してその至適濃
度が維持され、また合成反応液中で生成した反応阻害性
の低分子副産物が膜を介して効率良く反応系から排出除
去されるためであると考えられる。従って、合成反応液
の量と低分子基質溶液の容量比は、１：１〜１：１０
０、好ましくは１：１０〜１：２０程度とするのが適当
である。また、低分子基質溶液中の低分子基質は、合成
反応液中に移行し、同時に合成反応液からは副生した低
分子物質が低分子基質溶液中に排出されるため、低分子
基質溶液は新鮮なものを使用することが望ましい。この
ため、低分子基質溶液は一定時間後に新しいものと交換
するか、常に新しいものを循環させることが望ましい。
性が高くなる主な理由は、合成反応液と低分子基質溶液
が膜を介して接触し、低分子物質が膜を介して分子拡散
するために、合成反応液中の基質濃度が低下すると膜を
介して低分子基質が合成反応液中に拡散してその至適濃
度が維持され、また合成反応液中で生成した反応阻害性
の低分子副産物が膜を介して効率良く反応系から排出除
去されるためであると考えられる。従って、合成反応液
の量と低分子基質溶液の容量比は、１：１〜１：１０
０、好ましくは１：１０〜１：２０程度とするのが適当
である。また、低分子基質溶液中の低分子基質は、合成
反応液中に移行し、同時に合成反応液からは副生した低
分子物質が低分子基質溶液中に排出されるため、低分子
基質溶液は新鮮なものを使用することが望ましい。この
ため、低分子基質溶液は一定時間後に新しいものと交換
するか、常に新しいものを循環させることが望ましい。
【００１２】本発明に使用される膜の例としては、通
常、高分子物質と低分子物質の分離に使用されるいわゆ
る透析膜、限外濾過膜、セラミック膜、半透膜、中空子
膜等、いかなる材質の膜でも良い。しかし、タンパク合
成反応に必要な低分子基質及び反応により生成した反応
阻害性の低分子副産物を効率よく透過させ、かつ主生産
物であるタンパク、タンパク合成に必要なリボソーム、
ｍＲＮＡ等の高分子物質を透過させないために、分画分
子量が５００以上１０万以下である膜が望ましい。この
ような膜の具体例としては、中空糸膜（HC膜：旭化成工
業社製、H1P10-20：アミコン社製）、分画分子量１0,０
００の透析膜（Spectrum Por7 ：Spectrum社製、UC8-32
-25 ：三光純薬社製）等が挙げられる。
常、高分子物質と低分子物質の分離に使用されるいわゆ
る透析膜、限外濾過膜、セラミック膜、半透膜、中空子
膜等、いかなる材質の膜でも良い。しかし、タンパク合
成反応に必要な低分子基質及び反応により生成した反応
阻害性の低分子副産物を効率よく透過させ、かつ主生産
物であるタンパク、タンパク合成に必要なリボソーム、
ｍＲＮＡ等の高分子物質を透過させないために、分画分
子量が５００以上１０万以下である膜が望ましい。この
ような膜の具体例としては、中空糸膜（HC膜：旭化成工
業社製、H1P10-20：アミコン社製）、分画分子量１0,０
００の透析膜（Spectrum Por7 ：Spectrum社製、UC8-32
-25 ：三光純薬社製）等が挙げられる。
【００１３】本発明のタンパク合成装置の具体例を図１
に示す。この図では、膜として円筒形の中空子膜（キャ
ピラリー膜）を使用し、円筒形キャピラリー膜の内側を
基質溶液流路とし、円筒形キャピラリー膜の外側にタン
パク合成反応液を収容している。これとは逆に、円筒形
キャピラリー膜の外側を基質溶液流路とし、円筒形キャ
ピラリー膜の内側にタンパク合成反応液を収容してもよ
い。また、キャピラリー膜は平面状であっても差し支え
ない。
に示す。この図では、膜として円筒形の中空子膜（キャ
ピラリー膜）を使用し、円筒形キャピラリー膜の内側を
基質溶液流路とし、円筒形キャピラリー膜の外側にタン
パク合成反応液を収容している。これとは逆に、円筒形
キャピラリー膜の外側を基質溶液流路とし、円筒形キャ
ピラリー膜の内側にタンパク合成反応液を収容してもよ
い。また、キャピラリー膜は平面状であっても差し支え
ない。
【００１４】以下、比較例及び実施例によって本発明を
具体的に説明する。
具体的に説明する。
【実施例１及び比較例１】 小麦胚芽抽出液の調製と抽出液の濃縮 Andersonらの方法（Methods in Enzymology 101 巻、63
5-644 項、1983年）に従って小麦胚芽抽出液の調製をお
こなった。得られた抽出液６mlに５０％ポリエチレング
リコール６０００水溶液４mlを添加し、氷冷下１０分間
スターラーを用いて攪拌し、その後１5,０００×ｇで５
分間遠心分離し沈殿を得た。この沈殿に緩衝液１：２０
mM HEPES buffer(KOH にてpH 8.0に調整）、１２０ mM
酢酸カリウム、５ mM 酢酸マグネシウム、１mM DTT、７
２０μl に懸濁溶解し濃縮液を得た。
5-644 項、1983年）に従って小麦胚芽抽出液の調製をお
こなった。得られた抽出液６mlに５０％ポリエチレング
リコール６０００水溶液４mlを添加し、氷冷下１０分間
スターラーを用いて攪拌し、その後１5,０００×ｇで５
分間遠心分離し沈殿を得た。この沈殿に緩衝液１：２０
mM HEPES buffer(KOH にてpH 8.0に調整）、１２０ mM
酢酸カリウム、５ mM 酢酸マグネシウム、１mM DTT、７
２０μl に懸濁溶解し濃縮液を得た。
【００１５】無細胞タンパク合成反応 比較例１の反応液は、６０mM HEPES buffer(KOH にてpH
7.6に調整）、３mM ATP、１００μM GTP 、８mM DTT、
４５ mM クレアチンりん酸、１μｇ／μl クレアチンホ
スホキナーゼ、0.5 mMスペルミジン、0.02 mM スペルミ
ン、１６０μMアミノ酸、1.０U/μl RNase 阻害剤、0.5
μｇ／μｌ tRNA 、４５ng／μl DHFR（ジヒドロフォ
レートレダクターゼ）mRNA、2.5mM Mg++、小麦胚芽抽出
液５μlの組成からなり、全量を１５μl とした。反応
は２６℃で所定の時間行った。実施例１の反応液は、上
記比較例１と同組成の反応液２００μl を分画分子量１
3,０００の中空糸膜（HC膜、旭化成工業社製）の外側部
分に注入した。一方、中空糸膜の内側には、比較例１の
組成からｍＲＮＡ RNase 阻害剤、クレアチンホスキナ
ーゼを除き、小麦胚芽抽出液の代わりに緩衝液１を３５
％添加した組成の溶液１０mlをペリスタルチックポンプ
（ＡＴＴＯ社製）にて0.7ml/min の速度で循環させた。
反応システム全体の概略を図１に示す。反応液量に対す
る膜面積は３３cm2/mlであった。一定時間毎に反応液よ
り１０μl をとり、次の反応条件にてＤＨＦＲの活性を
測定した。５０mMりん酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0）、
５００μＭジヒドロフォレート、６０μＭ β−ＮＡＤ
ＰＨ、１８mM ２−メルカプトエタノール。３７℃にお
いて反応液中の３４０nm吸光度の減少を測定した。結果
を図２に示す。比較例１では２時間後には反応が飽和
し、ＤＨＦＲ活性が増大しないのに対して、実施例１で
は４時間後もＤＨＦＲ活性が増大していることがわか
る。
7.6に調整）、３mM ATP、１００μM GTP 、８mM DTT、
４５ mM クレアチンりん酸、１μｇ／μl クレアチンホ
スホキナーゼ、0.5 mMスペルミジン、0.02 mM スペルミ
ン、１６０μMアミノ酸、1.０U/μl RNase 阻害剤、0.5
μｇ／μｌ tRNA 、４５ng／μl DHFR（ジヒドロフォ
レートレダクターゼ）mRNA、2.5mM Mg++、小麦胚芽抽出
液５μlの組成からなり、全量を１５μl とした。反応
は２６℃で所定の時間行った。実施例１の反応液は、上
記比較例１と同組成の反応液２００μl を分画分子量１
3,０００の中空糸膜（HC膜、旭化成工業社製）の外側部
分に注入した。一方、中空糸膜の内側には、比較例１の
組成からｍＲＮＡ RNase 阻害剤、クレアチンホスキナ
ーゼを除き、小麦胚芽抽出液の代わりに緩衝液１を３５
％添加した組成の溶液１０mlをペリスタルチックポンプ
（ＡＴＴＯ社製）にて0.7ml/min の速度で循環させた。
反応システム全体の概略を図１に示す。反応液量に対す
る膜面積は３３cm2/mlであった。一定時間毎に反応液よ
り１０μl をとり、次の反応条件にてＤＨＦＲの活性を
測定した。５０mMりん酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0）、
５００μＭジヒドロフォレート、６０μＭ β−ＮＡＤ
ＰＨ、１８mM ２−メルカプトエタノール。３７℃にお
いて反応液中の３４０nm吸光度の減少を測定した。結果
を図２に示す。比較例１では２時間後には反応が飽和
し、ＤＨＦＲ活性が増大しないのに対して、実施例１で
は４時間後もＤＨＦＲ活性が増大していることがわか
る。
【００１６】
【試験例１】無細胞タンパク合成反応が、通常１〜２時
間で停止してしまう主要な原因は、反応液中のエネルギ
ー基質（ＡＴＰ、ＧＴＰ）濃度の急激な低下であること
が、Biosci.Biotech.Biochem.,58巻、1911頁、1994年に
明らかにされている。そこで実施例１の反応液中のＡＴ
Ｐ、ＧＴＰ濃度をJ.Apppl.Biochem., ５巻、330 頁、19
83年に従い、ＨＰＬＣ法で定量した。結果を図３に示
す。実施例１の反応液中のエネルギー基質（ＡＴＰ、Ｇ
ＴＰ）濃度は、反応開始時から４時間後までほぼ一定に
保持されていることがわかる。このことは、実施例１に
おいて長時間に渡ってＤＨＦＲ活性が増大しているの
は、反応液中にエネルギー基質が適切に供給されたため
であることを示している。
間で停止してしまう主要な原因は、反応液中のエネルギ
ー基質（ＡＴＰ、ＧＴＰ）濃度の急激な低下であること
が、Biosci.Biotech.Biochem.,58巻、1911頁、1994年に
明らかにされている。そこで実施例１の反応液中のＡＴ
Ｐ、ＧＴＰ濃度をJ.Apppl.Biochem., ５巻、330 頁、19
83年に従い、ＨＰＬＣ法で定量した。結果を図３に示
す。実施例１の反応液中のエネルギー基質（ＡＴＰ、Ｇ
ＴＰ）濃度は、反応開始時から４時間後までほぼ一定に
保持されていることがわかる。このことは、実施例１に
おいて長時間に渡ってＤＨＦＲ活性が増大しているの
は、反応液中にエネルギー基質が適切に供給されたため
であることを示している。
【００１７】
【実施例２及び比較例２】 小麦胚芽抽出液の調製 実施例１と同様の方法で小麦胚芽抽出液の調製を行っ
た。 無細胞タンパク合成反応 比較例２の反応液は、６０mM HEPES buffer(KOH にてpH
7.6に調整）、１mM ATP、１００μM GTP 、２mM DTT、
１２ mM クレアチンりん酸、４０μｇ／mlクレアチンホ
スホキナーゼ、0.1mM スペルミジン、0.01 mM スペルミ
ン、１６０μMアミノ酸、1.０U/μl RNase 阻害剤、１
１ng／μl DHFR（ジヒドロフォレートレダクターゼ）mR
NA、2.8mM Mg++、小麦胚芽抽出液５μl の組成からな
り、全量を１５μl とした。ただし、Ｋ+ 、Mg++濃度
は、小麦胚芽抽出液からの持ち込みも合わせた値で表し
た。反応は３０℃で２時間行った。実施例２の反応液
は、上記比較例２と同組成の反応液１３５μl を分画分
子量１0,０００の透析膜（Spectrum Por7 、Spectrum社
製）に封入し、比較例２の組成からｍＲＮＡ RNase 阻
害剤を除き、小麦胚芽抽出液の代わりに緩衝液１を添加
した組成の溶液３０ml中に沈め、溶液全体をスターラー
で攪拌しながら３０℃で２時間反応させた。反応終了後
の反応液より5.５μl をとり、次の反応条件にてＤＨＦ
Ｒの活性を測定した。５０mMりん酸ナトリウム緩衝液
（pH 7.0）、５００μＭジヒドロフォレート、６０μＭ
β−ＮＡＤＰＨ、１８mM ２−メルカプトエタノー
ル。３７℃において反応液中の３４０nm吸光度の減少を
測定した。結果を図４に示す。実施例２では比較例２よ
り反応生成物の収量が約４０％高いことがわかる。
た。 無細胞タンパク合成反応 比較例２の反応液は、６０mM HEPES buffer(KOH にてpH
7.6に調整）、１mM ATP、１００μM GTP 、２mM DTT、
１２ mM クレアチンりん酸、４０μｇ／mlクレアチンホ
スホキナーゼ、0.1mM スペルミジン、0.01 mM スペルミ
ン、１６０μMアミノ酸、1.０U/μl RNase 阻害剤、１
１ng／μl DHFR（ジヒドロフォレートレダクターゼ）mR
NA、2.8mM Mg++、小麦胚芽抽出液５μl の組成からな
り、全量を１５μl とした。ただし、Ｋ+ 、Mg++濃度
は、小麦胚芽抽出液からの持ち込みも合わせた値で表し
た。反応は３０℃で２時間行った。実施例２の反応液
は、上記比較例２と同組成の反応液１３５μl を分画分
子量１0,０００の透析膜（Spectrum Por7 、Spectrum社
製）に封入し、比較例２の組成からｍＲＮＡ RNase 阻
害剤を除き、小麦胚芽抽出液の代わりに緩衝液１を添加
した組成の溶液３０ml中に沈め、溶液全体をスターラー
で攪拌しながら３０℃で２時間反応させた。反応終了後
の反応液より5.５μl をとり、次の反応条件にてＤＨＦ
Ｒの活性を測定した。５０mMりん酸ナトリウム緩衝液
（pH 7.0）、５００μＭジヒドロフォレート、６０μＭ
β−ＮＡＤＰＨ、１８mM ２−メルカプトエタノー
ル。３７℃において反応液中の３４０nm吸光度の減少を
測定した。結果を図４に示す。実施例２では比較例２よ
り反応生成物の収量が約４０％高いことがわかる。
【００１８】
【発明の効果】本発明方法では、高価な機器と厳密な送
液条件を必要とせずに、合成反応液中のタンパク合成反
応に必要な低分子基質の濃度を一定に保つことができ、
同時に低分子の副産物が効率よく反応系外へ排出され
る。更に分子拡散であるため、濾過膜の目詰りといった
問題も生じない。これらのため、タンパク合成量を顕著
に高くすることができる。
液条件を必要とせずに、合成反応液中のタンパク合成反
応に必要な低分子基質の濃度を一定に保つことができ、
同時に低分子の副産物が効率よく反応系外へ排出され
る。更に分子拡散であるため、濾過膜の目詰りといった
問題も生じない。これらのため、タンパク合成量を顕著
に高くすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例に使用した反応システムの概略
を示す図面である。
を示す図面である。
【図２】実施例１及び比較例１のＤＨＦＲの生産量の経
時変化を示すグラフである。
時変化を示すグラフである。
【図３】実施例１における合成反応液中のＡＴＰ及びＧ
ＴＰの濃度の経時変化を示すグラフである。
ＴＰの濃度の経時変化を示すグラフである。
【図４】実施例２及び比較例２のＤＨＦＲの生産量の経
時変化を示すグラフである。
時変化を示すグラフである。
Claims (3)
- 【請求項１】 無細胞抽出液を含む無細胞タンパク合成
系を用いたタンパクの合成方法において、無細胞抽出液
及び低分子基質を含有する合成反応液と、低分子基質溶
液とを膜を介して接触させ、分子拡散によって低分子基
質溶液中の低分子基質を合成反応液中に移行させること
により、合成反応液中の低分子基質濃度をほぼ一定に維
持するとともに、合成反応液中の低分子副産物を低分子
基質溶液中に排出させることを特徴とするタンパクの合
成方法。 - 【請求項２】 無細胞抽出液が小麦胚芽抽出液である請
求項１記載の方法。 - 【請求項３】 無細胞抽出液を含む無細胞タンパク合成
系を用いたタンパクの合成装置において、無細胞抽出液
及び低分子基質を含有する合成反応液の収容室と、低分
子基質溶液の収容室を、膜を介して接触させ、分子拡散
によって低分子基質溶液中の低分子基質を合成反応液中
に移行させ、且つ、合成反応液中の低分子副産物を低分
子基質溶液中に排出させるようにしたことを特徴とする
タンパクの合成装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9068597A JPH1080295A (ja) | 1996-07-15 | 1997-04-09 | 無細胞タンパク合成系によるタンパクの合成方法及び装置 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18437296 | 1996-07-15 | ||
| JP8-184372 | 1996-07-15 | ||
| JP9068597A JPH1080295A (ja) | 1996-07-15 | 1997-04-09 | 無細胞タンパク合成系によるタンパクの合成方法及び装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1080295A true JPH1080295A (ja) | 1998-03-31 |
Family
ID=26432144
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9068597A Pending JPH1080295A (ja) | 1996-07-15 | 1997-04-09 | 無細胞タンパク合成系によるタンパクの合成方法及び装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1080295A (ja) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000036133A1 (fr) * | 1998-12-14 | 2000-06-22 | Riken | Procede de production d'un polypeptide dans un systeme de synthese proteique acellulaire |
| WO2000068412A1 (fr) * | 1999-05-11 | 2000-11-16 | Wakenyaku Co., Ltd. | Preparation contenant un extrait de cellules pour la synthese d'une proteine exempte de cellules, et moyen de synthese d'une proteine exempte de cellules |
| WO2002024939A1 (fr) * | 2000-08-29 | 2002-03-28 | Wakenyaku Co Ltd | Methode de synthese d'une proteine acellulaire |
| WO2003072796A1 (fr) * | 2002-02-28 | 2003-09-04 | Yaeta Endo | Solution de reaction pour la synthese de proteines sans cellule, procede de preparation de cette solution et procede de synthese de cette proteine utilisant cette solution |
| WO2004027077A1 (ja) * | 2002-09-20 | 2004-04-01 | Japan Science And Technology Agency | 無細胞タンパク質合成液およびその製造方法、並びにその利用 |
| US6783957B1 (en) | 1999-03-25 | 2004-08-31 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for synthesis of polypeptides in cell-free systems |
| WO2005003341A1 (ja) * | 2003-07-08 | 2005-01-13 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | 細胞内成分を利用した連続的なエネルギー供給系による無細胞タンパク質合成方法 |
| JP2006020632A (ja) * | 2004-06-30 | 2006-01-26 | Rina Netzwerk Rna-Technologien Gmbh | 体外蛋白質生合成の調整法 |
| JP2006109779A (ja) * | 2004-10-15 | 2006-04-27 | Shimadzu Corp | 昆虫細胞由来抽出液を用いた無細胞タンパク質合成方法 |
| WO2008020645A1 (fr) | 2006-08-14 | 2008-02-21 | Riken | Plante transformée à maturation précoce |
-
1997
- 1997-04-09 JP JP9068597A patent/JPH1080295A/ja active Pending
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000036133A1 (fr) * | 1998-12-14 | 2000-06-22 | Riken | Procede de production d'un polypeptide dans un systeme de synthese proteique acellulaire |
| US6783957B1 (en) | 1999-03-25 | 2004-08-31 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for synthesis of polypeptides in cell-free systems |
| US7235382B2 (en) | 1999-05-11 | 2007-06-26 | Cellfree Sciences Co., Ltd. | Preparation containing cell extracts for cell-free protein synthesis and means for synthesizing protein using the preparation |
| WO2000068412A1 (fr) * | 1999-05-11 | 2000-11-16 | Wakenyaku Co., Ltd. | Preparation contenant un extrait de cellules pour la synthese d'une proteine exempte de cellules, et moyen de synthese d'une proteine exempte de cellules |
| US6905843B1 (en) | 1999-05-11 | 2005-06-14 | Cellfree Sciences Co., Ltd. | Preparation containing cell extracts for synthesizing cell-free protein and means for synthesizing cell-free protein |
| WO2002024939A1 (fr) * | 2000-08-29 | 2002-03-28 | Wakenyaku Co Ltd | Methode de synthese d'une proteine acellulaire |
| US6869774B2 (en) | 2000-08-29 | 2005-03-22 | Yaeta Endo | Methods of synthesizing cell-free protein |
| WO2003072796A1 (fr) * | 2002-02-28 | 2003-09-04 | Yaeta Endo | Solution de reaction pour la synthese de proteines sans cellule, procede de preparation de cette solution et procede de synthese de cette proteine utilisant cette solution |
| US7273615B2 (en) | 2002-02-28 | 2007-09-25 | Cellfree Sciences Co., Ltd. | Reaction solution for cell-free protein synthesis, method of preparing the same, and protein synthesis method using the same |
| WO2004027077A1 (ja) * | 2002-09-20 | 2004-04-01 | Japan Science And Technology Agency | 無細胞タンパク質合成液およびその製造方法、並びにその利用 |
| WO2005003341A1 (ja) * | 2003-07-08 | 2005-01-13 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | 細胞内成分を利用した連続的なエネルギー供給系による無細胞タンパク質合成方法 |
| JP2006020632A (ja) * | 2004-06-30 | 2006-01-26 | Rina Netzwerk Rna-Technologien Gmbh | 体外蛋白質生合成の調整法 |
| JP2006109779A (ja) * | 2004-10-15 | 2006-04-27 | Shimadzu Corp | 昆虫細胞由来抽出液を用いた無細胞タンパク質合成方法 |
| JP4513495B2 (ja) * | 2004-10-15 | 2010-07-28 | 株式会社島津製作所 | 昆虫細胞由来抽出液を用いた無細胞タンパク質合成方法 |
| WO2008020645A1 (fr) | 2006-08-14 | 2008-02-21 | Riken | Plante transformée à maturation précoce |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040202 |