ES2277832T3 - Metodo de sintesis de polipeptidos en sistemas libres de celulas. - Google Patents
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Abstract
Un método para obtener polipéptidos en un sistema libre de células en el que la mezcla de reacción se prepara a partir de un lisado o extracto celular; se seleccionan los parámetros del sistema libre de células y el modo de síntesis; se determinan el tipo y los parámetros de al menos una barrera porosa; la mezcla de reacción y la solución de alimentación se colocan en el módulo de reacción; y la síntesis se lleva a cabo, en la que una vez que se han seleccionado los parámetros del proceso, los tipos de los componentes seleccionados que determinan la productividad de la síntesis son seleccionados, los límites superior e inferior del intervalo en el que las concentraciones de los componentes seleccionados cambian durante la síntesis están definidos; la mezcla adicional que contiene los componentes seleccionados está formada; la mezcla adicional se introduce a la mezcla de reacción o a la solución de alimentación; la síntesis se lleva a cabo con concentraciones cambiantes de los componentes seleccionados dentro de los intervalos definidos mientras que las concentraciones del resto de los componentes se mantienen constantes.
Description
Método de síntesis de polipéptidos en sistemas
libres de células.
La invención pertenece al campo de la biología
molecular, en concreto a la síntesis de proteínas y polipéptidos en
sistemas libres de células preparados a partir de células
procariotas y eucariotas.
La síntesis de polipéptidos y proteínas en
sistemas de traducción libres de células de primera generación
(Patente estadounidense núm. 4668624, Roberts, 1979) se realizó en
un modo estacionario (de lote), en el que la mezcla de reacción se
encuentra en condiciones estacionarias con concentraciones de
Mg^{2+}, K^{+} y NTP (abreviación de nucleósido trifosfato)
constantes y pH y temperatura constantes. Para este fin, se
prepararon extractos y lisados de células procariotas (Zubay, 1973)
y eucariotas (Roberts y Paterson, 1973; Pelham y Jackson, 1976), y
se utilizó mRNA natural y sintético (Patente estadounidense núm.
4937190, Palmberg, 1990).
El rápido desarrollo de la biotecnología ha
exigido la búsqueda de métodos alternativos que puedan incrementar
el rendimiento en los procesos de síntesis de proteínas. El diseño
de sistemas de traducción más productivos en los que la
concentración de componentes básicos se mantiene constante durante
la síntesis es una de las direcciones hacia la que se dedican los
esfuerzos para mejorar los métodos existentes. En los sistemas de
segunda generación (Spirin et al., 1988), un flujo continuo
de sustratos de bajo peso incluidos en la solución de alimentación
(modo CFCF) dentro del volumen del reactor y la eliminación de los
polipéptidos diana y productos de peso molecular bajo que inhiben
el sistema libre de células, aumenta su tiempo de funcionamiento e
incrementa el rendimiento de la proteína deseada en comparación con
el sistema clásico de síntesis en condiciones estacionarias (de
lote). Numerosos estudios se han centrado en la optimización de las
condiciones para la síntesis proteica en modo CFCF (Baranov, 1989;
Ryabova et al., 1989; Takanori et al., 1991; Spirin,
1992, Baranov y Spirin, 1993; Volyanik et al., 1993; Erdman
et al., 1994; Kim y Choi, 1996; Yamamoto, 1996; Ryabova
et al., 1998, Patente europea EP 0312617; Alakhov et
al., 1993 Patente europea EP 0401369; Baranov et al.,
1995, patente estadounidense núm. US 5434079; Mozayeni, 1995;
patente japonesa núm. JP 7075592, Shimizu, 1995; patente japonesa
núm. JP 7031494, Sakurai, 1995; patente japonesa núm. JP 5076381,
Sato, 1995; patente europea EP 0593757, Baranov et al., 1997;
patente estadounidense núm. US 5593856, Choi et al.,
1997).
La patente estadounidense núm. US 5478730
(Alakhov et al., 1995) describe un método en el que la
síntesis en los sistemas de traducción libres de células está
basado en el intercambio continuo (modo CECF) de los componentes de
la solución de alimentación con el componente de la mezcla de
reacción mediante un proceso de difusión a través de una barrera
semipermeable. Los resultados obtenidos por muchos autores (Davis
et al., 1996; Kim y Choi, 1996; patente estadounidense núm.
US 5593856, Choi, 1997; patente japonesa núm. JP 10080295, Yamane.
1998) demuestran un aumento significativo en el rendimiento de
polipéptido diana con el intercambio continuo, en comparación con
el modo de funcionamiento estacionario(de lote).
Además de la mejora de los componentes del
sistema de traducción, se hizo el esfuerzo de mejorar los métodos
para la preparación de mRNA en los sistemas de transcripción que
utilizan RNA polimerasa y DNA. En estos sistemas, la preparación
del mRNA depende de la concentración de RNA polimerasa y de DNA, así
como de la concentración de Mg^{2+}, K^{+} y NTP y de otras
condiciones iónicas (Kern y Davis, 1997). El coste de los
componentes de la transcripción in vitro, que incluyen RNA
polimerasa, DNA y NTP, es muy elevado. Por lo tanto, es necesario
analizar las condiciones de transcripción y optimizar el proceso de
preparación del mRNA (Gurevich et al., 1991).
Existen métodos para la síntesis de polipéptidos
en un modo CFCF en sistemas libres de células procariotas y en
condiciones de transcripción-traducción acopladas
(Baranov et al., 1989; patente europea EP 0401369, Baranov
et al., 1995; Ryabova et al., 1998) y el procedimiento
se patentó para los casos en que se da transcripción y traducción
en sistemas libres de células eucariotas en el mismo volumen de
reacción (Spirin, 1992; Baranov y Spirin, 1993; patente europea EP
0593757, Baranov et al., 1997).
Está descrito (Craig et al., 1993) que
las condiciones de traducción y transcripción en los sistemas
eucariotas libres de células pueden ser muy diferentes y están
determinados en gran medida por las concentraciones de Mg^{2+} y
K^{+}. Por lo tanto, la síntesis en dos etapas (Patente
estadounidense US 5665563, Beckler, 1997; Operating Guide, Single
Tube Protein™, Novagen Inc., 1998) o en tres etapas (Roberts y
Paterson, 1973) se usan frecuentemente en un modo estacionario (de
lote). En la primera etapa se consiguen las condiciones óptimas
para la transcripción del mRNA; a continuación, se purifica el mRNA,
o bien se le añade inmediatamente a una nueva mezcla de reacción en
unas condiciones adecuadas para la traducción. Se conoce un
procedimiento para la síntesis de polipéptidos en una única etapa
en sistemas de transcripción-traducción eucariotas
libres de células (patente estadounidense US 534637, Thompson et
al., 1994; Operation Guide, Linked in vitro SP6/T7
Transcription/Translation Kit, Roche Diagnostics GmbH, 1998). Los
autores de la patente estadounidense (US 5324637, Thompson et
al., 1994) utilizaron un principio conocido de optimización de
la concentración de Mg^{2+} de la mezcla de reacción. Con la
adición de Mg^{2+} a la mezcla de reacción antes de la síntesis
consiguieron una concentración de Mg^{2+} en el sistema de
reacción que se encuentra a medio camino entre la concentración
óptima para la transcripción y la concentración óptima para la
traducción. Estudios posteriores mostraron que esta optimización no
representaba ninguna ventaja respecto a los procedimientos en dos o
tres etapas. El estudio de Laios et al. (1998) demuestra que
la optimización de la transcripción y la traducción en etapas
separadas es de 2 a 6 veces más eficiente que la realizada en un
proceso acoplado. Por otra parte, la optimización de la selección
de concentraciones de Mg^{2+} está basada en una medición
preliminar de la concentración de magnesio en el lisado o en el
volumen de reacción, lo cual devalúa el principio del procedimiento
en una sola etapa.
La patente europea EP 0593 757 (Baranov et
al., 1997) describe la posibilidad de realizar síntesis CFCF
continua de polipéptidos en sistemas de
transcripción-traducción eucariotas libres de
células durante 20 horas. Durante el proceso de síntesis, se
mantiene la concentración del Mg^{2+} de la mezcla de reacción al
nivel requerido gracias a la concentración constante de Mg^{2+}
en la solución de alimentación. Dado que la actividad ribonucleasa
del volumen de reacción es baja y que los moldes de mRNA mantienen
su actividad durante un periodo de tiempo elevado, el sistema de
reacción funciona tanto con moldes de mRNA de síntesis previa como
reciente, y sintetiza un producto diana gracias a la concentración
constante de Mg^{2+}. Para obtener una síntesis más productiva,
el sistema de transcripción debe sintetizar una cantidad suficiente
de mRNA. Por esta razón es necesaria una gran cantidad de
polimerasa SP6 o T7 (30.000 unidades), que son muy costosas. En el
texto de la patente se menciona que en cada caso en particular se
deben escoger las condiciones óptimas de síntesis. Para tomar una
decisión adecuada, es necesario realizar una serie de procesos de
síntesis en un volumen de mezcla a diferentes concentraciones de
Mg^{2+} y determinar su valor óptimo para el polipéptido en
cuestión. La optimización del proceso lleva mucho tiempo y además
es considerablemente costosa.
Existen muchos dispositivos en los que se puede
mantener el modo de intercambio discontinuo (CECF) gracias a un
proceso de difusión. El dispositivo, en la forma de un recipiente de
diálisis para la síntesis de polipéptidos en un sistema libre de
células, fue descrito por primera vez en la patente estadounidense
US 5478730 (Alakhov et al., 1995). Fue Promega Corp. (Davies
et al., 1996) quien hizo un análisis comparativo de la
síntesis (en un modo estático (de lote) y en un modo de intercambio
continuo) durante los procesos acoplados de transcripción y
traducción en un sistema procariota de E. coli libre de
células. Con este propósito los autores utilizaron instrumentos
"DispoDialyser" fabricados por Spectrum Medical Industr.
(patente estadounidense US 5324428, Flaherty, 1994) y dializadores
"Slidealyzer" fabricados por Pierce Chemical Comp. (patente
estadounidense US 5503741, Clark, 1996). Para la síntesis de
polipéptidos durante los procesos acoplados de
transcripción-traducción en un sistema procariota
de E. coli libre de células concentrado de forma preliminar,
Kim y Choi (1996) emplearon una membrana de diálisis fijada en el
extremo inferior de un cilindro.
Yamamoto (1996) construyó un dializador cuya
membrana está hecha de fibras huecas. La solución de alimentación
atraviesa las fibras huecas. Por un proceso de difusión los
componentes de la mezcla de reacción se intercambian con los de la
solución de alimentación. En el dispositivo diseñado por Yamane
(patente japonesa JP 100809295, Yamane, 1998), la membrana se
utiliza para mantener unas condiciones de síntesis constantes
gracias a la difusión de sustratos de bajo peso molecular de la
solución de alimentación que circula a lo largo de la membrana de
diálisis. La patente estadounidense US 5478730 (Alakhov et
al., 1995) se aproxima más al dializador que funciona en modo
de intercambio continuo. Los autores de la patente ofrecen una
descripción detallada de los requisitos de la barrera porosa, hecha
de una membrana de diálisis, una membrana plana o de fibras huecas,
que puede estar dispuesta en una estructura con múltiples capas. Se
han desarrollado muchos dispositivos cuyo funcionamiento se basa en
un modo de flujo continuo (CFCF). Difieren entre sí en cuanto a la
formación de los flujos de la solución de alimentación y los modos
de eliminación de los productos de síntesis y metabolismo que
inhiben el funcionamiento del sistema. La utilización de una
membrana de ultrafiltración en un reactor de flujo está descrita en
numerosos artículos (Spirin et al., 1988, 1992; Takanori
et al., 1991; Spirin, 1992; Volyanik et al., 1993;
Kim y Choi, 1996; Ryabova et al., 1998). Una desventaja de
este método reside en que el flujo de entrada de la solución de
alimentación es igual al volumen del flujo de salida de los
componentes de elevado y bajo peso molecular, lo cual provoca un
cierre rápido de los poros de la membrana de ultrafiltración. En
1990, Fischer et al. (patente alemana DE 3914956) propusieron
un método que utiliza un aporte de la solución de alimentación al
volumen de reacción en forma de múltiples pulsos. Con esta finalidad
se forman N ciclos para proporcionar una presión positiva y
negativa en el volumen de reacción. Con la formación de la presión
positiva, los productos inhibidores se eliminan del volumen de
reacción a través de la barrera porosa y se mezclan con la solución
de alimentación. Cuando la presión es negativa, parte de los
productos inhibidores son devueltos al volumen de reacción a través
de la barrera porosa junto con otra porción de la solución de
alimentación. Además, los componentes de elevado peso molecular del
sistema libre de células que son necesarios para una síntesis
prolongada son eluidos de forma intensiva de la mezcla de reacción.
En 1995 Mozayeny (patente estadounidense US 5434079) propuso un
dispositivo que supone una mejora en la eliminación de los
productos de elevado peso molecular gracias a una membrana de
ultrafiltración área más grande . Durante el proceso de síntesis,
los componentes del sistema libre de células son eliminados a la vez
que el producto diana a través de la extensa área constituida por
dos membranas paralelas con tamaños de poro de entre 70 y 100 kD,
que limita el tiempo de síntesis. Los dispositivos aquí propuestos
se aproximan más al dispositivo descrito en la patente
estadounidense US 5478730 (Alakhov et al., 1995) con una o
dos barreras porosas. Las barreras pueden estar compuestas por
membranas planas o fibras huecas. En general, la técnica anterior
describe métodos y dispositivos desarrollados para el mantenimiento
de unas condiciones constantes durante el proceso de síntesis. Las
condiciones constantes las proporcionan tanto la eliminación de los
productos de bajo peso molecular del volumen de reacción que
inhiben el funcionamiento del sistema libre de células, como la
adición al volumen de reacción de algunos componentes que mantienen
el proceso de síntesis. La síntesis se mantiene gracias a las
mismas concentraciones de Mg^{2+}, K^{+} y NTP y de otros
componentes, tanto en la mezcla de reacción como en la solución de
alimentación. Los autores de la técnica descrita en la patente
anterior emplean un principio de optimización ampliamente conocido.
La optimización del proceso lleva mucho tiempo y además es
considerablemente costosa.
La finalidad de la presente invención es
proporcionar un método que permita la síntesis de un polipéptido
diana en sistemas procariotas y eucariotas libres de células. La
invención está basada en la modificación de métodos de síntesis en
un modo de flujo continuo (CFCF) o un modo de intercambio continuo
(CECF). En estos modos, durante el proceso de síntesis y de forma
paralela a la entrada en la mezcla de reacción de componentes que
mantienen la síntesis y la salida de la mezcla de reacción de los
componentes de bajo peso molecular que inhiben la síntesis, las
concentraciones de al menos uno de los componentes seleccionados que
sirven para determinar la productividad del proceso (Mg^{2+},
K^{+}, NTP, poliaminas o sus combinaciones) cambian continuamente
entre los límites superior e inferior del margen determinado.
Las siguientes figuras ilustran la
invención.
La Figura 1 muestra diagramas de los cambios en
las concentraciones de Mg^{2+} durante la síntesis de mRNA y la
síntesis de polipéptidos en un sistema libre de células que funciona
en un modo de intercambio continuo (CECF). La Figura 2 muestra un
diagrama de los cambios en las concentraciones de Mg^{2+} durante
la síntesis en un modo de flujo continuo (CFCF) cuando las
condiciones de síntesis cambian de predominantemente
transcripcionales a predominantemente traduccionales.
La Figura 3 muestra un diagrama de los cambios
en las concentraciones de Mg^{2+} con pulsos repetidos de entrada
de mezcla adicional a la mezcla de reacción.
La Figura 4 muestra un diagrama de los cambios
repetidos en las concentraciones de Mg^{2+} respecto a la forma
en gradiente lineal. La figura 5 muestra el esquema de un reactor
con una barrera porosa. La figura 6 muestra un esquema del módulo y
de las direcciones de los flujos de un reactor formados en el modo
de salida ramificada de fracciones de elevado peso molecular y bajo
peso molecular (CFCF-BF).La figura 7 representa un
esquema de flujos ramificados cuando el producto diana es eliminado
de la zona de síntesis (CFCF-RP). La figura 8
muestra un esquema del módulo y la ramificación del flujo de un
reactor cuando la primera barrera porosa desempeña el papel de
distribuidor de los flujos de la solución de alimentación y de la
mezcla adicional quedándose el producto diana en la zona de
síntesis (CFCF-RP). La figura 9 representa un
esquema del módulo y de la ramificación de un reactor cuando las
direcciones de la entrada la solución de alimentación son cambiadas
de forma repetida de la primera barrera porosa a la segunda
(CFCF-RF). La figura 10 muestra la cinética de la
síntesis de cloranfenicol acetil transferasa (CAT). El diagrama P
hace referencia a la síntesis en un modo estacionario (de lote). El
diagrama R muestra la cinética de la síntesis de CAT durante la
traducción en el modo CECF.
La figura 11 muestra la cinética de la síntesis
de CAT en el sistema combinado de
transcripción-traducción. El diagrama S representa
la síntesis en el modo estacionario (de lote). El diagrama T
representa la cinética de la síntesis de CAT durante la
transcripción-traducción en el modo CECF.
La figura 12 muestra la cinética de la síntesis
de CAT en el sistema combinado de
transcripción-traducción con concentraciones
cambiantes de Mg^{2+} y NTP en la mezcla de reacción durante el
proceso de síntesis. El diagrama U representa la síntesis en el
modo estacionario (de lote). El diagrama V representa la cinética
de la síntesis de CAT durante la
transcripción-traducción en el modo CECF.
La figura 13 muestra un diagrama que compara los
resultados de cuatro experimentos sobre la síntesis del polipéptido
CAT diana.
F10, F11, F12 son los flujos de solución de
alimentación.
F20, F21, F22 son los flujos de mezcla
adicional.
F30, F31, F32 son los flujos de los productos de
bajo peso molecular de la mezcla de reacción.
F40 es el flujo de los productos de elevado peso
molecular de la mezcla de reacción.
F50, F51, RF52 son los flujos de los componentes
de elevado peso molecular que mantienen la síntesis.
Las posiciones de la 1 a la 9 designan entradas
y salidas del reactor.
Las posiciones de la 10 a la 19 designan los
elementos del reactor.
\newpage
Mg^{2+}, iones de magnesio añadidos en forma
de sal de magnesio;
K^{+}, iones de potasio añadidos en forma de
sal de potasio;
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis consta de las siguientes etapas.
1. La mezcla de reacción se prepara utilizando
un lisado o un extracto celular.
2. Se prepara la solución de alimentación y la
mezcla adicional, que incluye al menos uno de los componentes
seleccionados que determinan la productividad de la síntesis.
3. Se determina el modo de funcionamiento del
reactor y se selecciona el tipo de módulo del reactor con un número
y unos tipos determinados de barreras porosas. Se determina la
proporción de volumen de la mezcla de reacción y de la solución de
alimentación o la velocidad del flujo de la solución de alimentación
a través del volumen de reacción.
4. Se monta el dispositivo para la síntesis que
incluye al menos un módulo de reactor.
5. La mezcla de reacción y la solución de
alimentación se introducen en las zonas correspondientes del módulo
de reactor separadas por una barrera porosa como mínimo.
6. La mezcla adicional se añade a la mezcla de
reacción, o a parte de la solución de alimentación, durante la
síntesis o antes de esta.
7. Durante el transcurso del proceso de
síntesis, la mezcla adicional se introduce una vez, de forma
repetida o continua, dependiendo del modo de funcionamiento.
8. En el modo de la síntesis preparativa, los
componentes de elevado peso molecular requeridos se suministran a
la mezcla de reacción de una sola vez, de forma repetida o de forma
continua.
9. El producto sintetizado se recoge de la
mezcla de reacción, o bien al final de la síntesis, o bien durante
la misma.
10. Cuando el producto se recoge durante la
síntesis, éste se analiza y se corrigen las condiciones que
determinan la productividad del sistema.
Los sistemas libres de células se preparan
utilizando lisados o extractos celulares. Estos incluyen todos los
componentes necesarios para la síntesis proteica además de un
sistema de regeneración, NTP, un tampón, sales y aminoácidos.
Se conoce una gran diversidad de tipos de
sistemas libres de células que sirven para la síntesis de
polipéptidos (patente estadounidense US 5807717, Joyce, 1998).
Estos se preparan a partir de arqueobacterias (Halobacterium,
Thermoproteus, Methanococcus, Sulfolobus, etc.), eubacterias
(Pseudonomas, Agrobacterium, etc.) y células eucariotas
(reticulocitos de conejo, germen de trigo, HeLa, hígado de ratón,
etc). Las condiciones que aquí se describen se aproximan más a las
de los sistemas de traducción y sistemas de
transcripción-traducción preparados a partir de
extractos procariotas de E. coli (Zubay, 1973), extractos
eucariotas de germen de trigo (Roberts y Paterson, 1973) y
extractos preparados de reticulocitos de conejo (Pelham y Jackson,
1976).
Uno de los componentes del sistema de
transcripción-traducción libre de células debe ser
una RNA polimerasa dependiente de DNA que sintetice mRNA. Se
selecciona de RNA polimerasas de E. coli o RNA polimerasas de
bacteriófagos. En esta invención analizamos el uso de las
polimerasas T1, T3, T5, T7, SP6, A16, PHL1 y PHL11 en estos
sistemas, pero sin restringirlo a las mismas. Las más adecuadas con
las polimerasas T7 y SP6.
Está descrito que las condiciones para la
síntesis difieren entre los sistemas libres de células eucariotas y
procariotas. La productividad de la síntesis depende de si las
concentraciones de los componentes de un sistema libre de células
como son el Mg^{2+}, el K^{+} y el NTP se encuentran dentro del
margen óptimo y en qué proporción cambian durante el proceso de
síntesis. El intervalo de concentraciones en el que la síntesis es
óptima es considerablemente estrecho. Cualquier cambio en la
temperatura, pH o concentración inicial de los componentes durante
la síntesis obliga al sistema libre de células a abandonar el modo
de síntesis óptima, lo cual provoca un menor rendimiento en la
síntesis del producto. Para todos los sistemas libres de células,
el concepto de optimización significa que a priori se
determina el valor de NTP y se seleccionan los intervalos de
concentraciones de Mg^{2+} y K^{+} que corresponden a la
síntesis con productividad máxima.
Esto conduce a una gran dispersión en las
concentraciones de magnesio "óptimas" dadas en diferentes
patentes. Por ejemplo, como se menciona en la patente de Promega
(patente estadounidense US 5324637, Thompson et al., 1994),
en el caso de la síntesis de polipéptidos en un sistema de
transcripción-traducción con un lisado de
reticulocitos, la concentración de magnesio óptima en la mezcla de
reacción oscila entre 2,5 y 3,5 mM. Sin embargo, en la otra patente
(patente estadounidense US 5807717, Joyce, 1998) los valores de este
rango son de entre 6,0 y 10,0 mM de Mg^{2+} para la síntesis de
polipéptidos en el mismo sistema con el lisado de reticulocitos
producido por Promega.
Está descrito que (Pokrovskaya, 1994) que con la
utilización de las polimerasas SP6, T7 y T3, la transcripción
óptima ocurre cuando la concentración de Mg^{2+} oscila entre 16 y
36 mM. Las concentraciones de NTP determinan en gran parte el
inicio de la transcripción (Guajardo et al., 1998) y la
concentración de Mg^{2+} debe ser mayor que la concentración
total de NTP (Gurevich et al., 1991; Kem y Davis, 1997) para
que la polimerasa T7 actúe de forma eficiente. Asimismo, para que
la traducción de mRNA sea óptima en sistemas libres de células con
un lisado de reticulocitos preparados mediante una técnica estándar
(Pelham y Jackson, 1976; Suzuki, 1977; Merrick,1983), las
concentraciones de magnesio pueden oscilar entre 1,0 y 3,0 mM de
Mg^{2+} añadidos a la mezcla de reacción.
En la presente invención, las contradicciones
que aparecen respecto a la determinación de la concentración de
Mg^{2+} y K^{+}, que proporcionan el nivel necesario tanto para
la transcripción como para la traducción, se resuelven de forma
diferente al método conocido cuando la concentración óptima de
Mg^{2+} y K^{+} es determinada por los resultados de
experimentos intermedios. En este documento esto se hace de la forma
siguiente. Durante el proceso de síntesis y de forma paralela a la
entrada en la mezcla de reacción de componentes que mantienen la
síntesis y a la salida de la mezcla de reacción de los componentes
de bajo peso molecular que inhiben la síntesis, las concentraciones
de al menos uno de los componentes seleccionados que sirven para
determinar la productividad del proceso (Mg^{2+}, K^{+}, NTP,
poliaminas o sus combinaciones) cambian continuamente entre los
límites superior e inferior del intervalo determinado.
La elección de los límites superior e inferior
de este intervalo depende del modo síntesis, de los parámetros del
extracto libre de células y de las condiciones tanto de la mezcla de
reacción como de la solución de alimentación. Si se toma el
Mg^{2+} como uno de los componentes seleccionados, la
concentración de Mg^{2+} (en diversos modos que incluyen
transcripción, transcripción-traducción y
traducción) oscila entre 0,25 y 50 mM de Mg^{2+} añadido. Cuando
uno de los componentes de un sistema libre de células es una RNA
polimerasa dependiente de DNA, en el modo de transcripción de RNA
los límites superior e inferior de un intervalo dado de cambios en
la concentración de Mg^{2+} debería oscilar entre 2 y 50 mM de
Mg^{2+} añadido. Si la síntesis proteica tiene lugar en
condiciones de transcripción-traducción, estos
límites deberían estar entre 2 y 25 mM de Mg^{2+} añadido. De la
misma manera, si la síntesis proteica tiene lugar en condiciones de
traducción, los límites superior e inferior de un intervalo
determinado de cambios en la concentración de Mg^{2+} deberían
estar entre 0,25 y 25 mM de Mg^{2+} añadido. Es posible que estos
límites se escojan de forma que, durante la síntesis, las
condiciones de síntesis cambien junto con el modo de síntesis (es
decir, la transcripción predominante cambia a
transcripción-traducción o a traducción
predominante). El ejemplo anterior implica intervalos de
concentración de solamente uno de los componentes seleccionados
(Mg^{2+}) necesarios para la síntesis. La amplitud de los
intervalos seleccionados y sus límites superiores e inferiores son
de proteínas y polipéptidos en sistemas procariotas o eucariotas
libres de células.
La otra finalidad de la presente invención es
disminuir el coste de la síntesis de una cantidad determinada de un
polipéptido en sistemas eucariotas libres de células. En los métodos
conocidos, la síntesis se lleva a cabo con una concentración
elevada de polimerasa T7, que es muy costosa, en un flujo continuo a
través del volumen de reacción de componentes (caros también) de la
solución de alimentación, como NTP o aminoácidos (patente europea
EP 0593757, Baranov et al., 1997). En la presente invención,
la productividad de la síntesis en sistemas de
transcripción-traducción aumenta, dado que la
introducción de concentraciones elevadas de Mg^{2+} y NTP en la
mezcla de reacción al principio del proceso de síntesis disminuye la
cantidad de mRNA defectuoso, lo que a su vez reduce el gasto de
ATP, GTP y aminoácidos durante la traducción.
Algunos de los ejemplos incluidos en esta
invención que tienen que ver con el principio de un flujo continuo
de la solución de alimentación a través del volumen de reacción
(CFCF) están pensados para disminuir el coste de la síntesis
preparativa de polipéptidos diana. El flujo de la solución de
alimentación y las concentraciones de los componentes seleccionados
se pueden controlar fácilmente cambiando la velocidad y la dirección
del flujo mediante una bomba. Otros ejemplos muestran el uso del
intercambio continuo (CECF) y la posibilidad de incrementar la
productividad de la síntesis gracias a cambios continuos de la
concentración de al menos uno de los componentes seleccionados.
Como está descrito, la velocidad de intercambio a través de la
membrana de diálisis de componentes de bajo peso molecular
incluidos en la mezcla de reacción y en la solución de alimentación
depende de muchos factores (área de la membrana, tamaño del poro,
etc). Este hecho restringe la elección de los modos de síntesis y
la elección de los límites superior e inferior del intervalo para
cambiar las concentración de los compuestos seleccionados. Por
ejemplo, en un modo CECF, es más preferible realizar la síntesis en
modos separados (transcripción, traducción,
transcripción-traducción), en una combinación de dos
modos (p. ej., transcripción y
transcripción-traducción o
transcripción-traducción y traducción) o en una
combinación de tres modos (p. ej., transcripción,
transcripción-traducción y traducción). Esto está
provocado por el hecho de que debido a una velocidad
considerablemente baja, el intercambio necesita mucho tiempo y no
puede alcanzar la velocidad requerida para la entrada de
componentes de bajo peso molecular necesarios para la síntesis y la
eliminación de productos de bajo peso molecular que inhiben el
funcionamiento del sistema.
La Figura 1 muestra dos ejemplos de cambios en
las concentraciones de Mg^{2+} en la mezcla de reacción para
diferentes modos de síntesis. Un ejemplo muestra el caso en el que
es necesario llevar a cabo la síntesis de una gran cantidad de
mRNA. Tal como se observa en el diagrama (K), los cambios de las
concentraciones de componentes seleccionados desde el nivel
superior (A) al nivel (C) están dentro del margen en el que en la
mezcla de reacción se constituyen las condiciones adecuadas para que
tenga lugar de forma predominante la transcripción y la síntesis de
mRNA gracias a una concentración elevada de Mg^{2+} y NTP. En este
caso la concentración inicial de Mg^{2+} no debe ser superior a
la de NTP en más de 10 mM. El posterior descenso de la
concentración de Mg^{2+} y NTP está causado por el hecho de que el
sistema ajusta las concentraciones de Mg^{2+} y NTP a los valores
correspondientes al límite superior de la zona de
transcripción-traducción (zona
C-D). El otro ejemplo (diagrama L) muestra el caso
en el que el límite superior de las concentraciones de Mg^{2+} y
NTP corresponde al límite superior de la zona de
transcripción-traducción (zona C-D)
y el límite inferior coincide con el límite inferior de la zona de
traducción (zona D-B). En este caso, las condiciones
de la mezcla de reacción pasan de ser predominantemente
transcripcionales a predominantemente traduccionales durante la
síntesis. Los parámetros de la barrera porosa (tamaño del poro, área
de la membrana, tipo de membrana) y la velocidad del flujo de la
solución de alimentación sobre la superficie de la barrera porosa
deben escogerse teniendo en cuenta la tasa de difusión y el
intercambio de componentes de bajo peso molecular de la solución de
alimentación y de la mezcla de reacción, de forma que estos
proporcionen la tasa de intercambio y el cambio de las
concentraciones de Mg^{2+} y NTP necesarios durante la síntesis.
La elección de los límites superior o inferior de la concentración
depende de las propiedades del extracto libre de células que puede
prepararse de diferentes formas. Las propiedades de la mezcla de
reacción dependen del porcentaje del extracto y de la solución de
alimentación que contenga la mezcla. La determinación de los límites
superior e inferior, entre los que durante la síntesis cambian las
concentraciones de los componentes seleccionados, permite el control
de la productividad del sistema libre de células de modos
diferentes.
El modo de flujo continuo (CFCF) permite un
cambio rápido de la velocidad y la dirección del flujo de la
solución de alimentación a través de la mezcla de reacción. Esto
permite el control de la tasa de cambio de las concentraciones de
los componentes seleccionados en varios estadios de la síntesis.
Durante un ciclo es posible escoger diferentes velocidades del
flujo de solución de alimentación a través de la mezcla de reacción.
Por lo tanto, durante la síntesis de polipéptidos en un sistema de
transcripción-traducción libre de células, es
posible ajustar la duración de estadios individuales en los que los
parámetros de la mezcla de reacción y las concentraciones de los
componentes seleccionados corresponden a los de sistemas con
predominancia de transcripción,
transcripción-traducción o traducción. La elección
de parámetros definidos, entre los que se pueden cambiar las
concentraciones de los componentes seleccionados, depende del
objetivo de la síntesis (síntesis de mRNA, síntesis de un
polipéptido diana en el modo traduccional o síntesis de un
polipéptido diana en el modo
transcripcional-traduccional), de las condiciones
de síntesis seleccionadas y, en especial, de las propiedades del
extracto celular, los parámetros de las barreras porosas (tamaño
del poro, área de membrana y tipo de membrana) y la posibilidad de
añadir componentes de elevado peso molecular prescindibles. El
límite superior del intervalo permitido de concentraciones de
Mg^{2+} (a partir del cual se determina un intervalo de trabajo)
no puede ser superior a 50 mM en sistemas CFCF de
transcripción-traducción con RNA polimerasa
dependiente de DNA. El límite inferior de la concentración de
Mg^{2+} no puede ser inferior a 0,25 mM.
La Figura 2 muestra la dependencia (M) de los
cambios en las concentraciones de Mg^{2+} en función del tiempo
en sistemas de transcripción-traducción. Si se
ajusta la velocidad de flujo de la solución de alimentación en el
primer estadio de la síntesis (periodo
t_{1}-t_{2}) es posible corregir la cantidad de
mRNA sintetizado y evitar su superproducción. La elevada
concentración de Mg^{2+} y NTP al inicio del primer periodo
(t_{1}-t_{2}) disminuye la cantidad necesaria
de la costosa RNA polimerasa porque la síntesis de mRNA prosigue con
una menor producción de mRNA defectuoso. La proporción entre las
concentraciones de Mg^{2+} y NTP se selecciona de forma que en el
primer estadio la concentración de Mg^{2+} supere a la
concentración de NTP en un valor de entre 5 y 10 mM, mientras que
en el tercer estadio este exceso de Mg^{2+} sobre NTP no debe ser
menor a 0,5 M.
Cuando se trata de una síntesis prolongada en un
modo CFCF, la concentración de los compuestos seleccionados se hace
oscilar entre los límites superior e inferior una vez o de forma
repetida. La Figura 3 muestra un diagrama (N) de los cambios en las
concentraciones de Mg^{2+} y NTP dado un pulso constante de
entrada de la mezcla adicional a la mezcla de reacción. La síntesis
se divide en pasos N con una duración de cada paso entre t_{4} y
t_{6}. La mezcla adicional se introduce durante el tiempo
t_{4}-t_{5}. Las concentraciones de Mg^{2+} y
NTP aumentan, superan el nivel C, y las condiciones de síntesis en
el sistema de reacción alcanzan la zona A-C en la
que tiene lugar la transcripción predominante de mRNA. Un descenso
en las concentraciones de Mg^{2+} y NTP cambia las condiciones de
síntesis de transcripción-traducción (zona
C-D) a traducción predominante (zona
D-B).
Durante la síntesis preparativa de polipéptidos
diana no se necesitan solamente componentes de bajo peso molecular
de la solución de alimentación para que sea una síntesis prolongada.
En este modo, además de los componentes de bajo peso molecular, en
la mezcla de reacción también se introducen componentes de elevado
peso molecular. Estos componentes son (I) una fracción ribosómica,
(ii) un extracto libre de células (S30, S100 y sus modificaciones),
(iii) polimerasas, (iv) plásmidos y (v) tRNA. Por lo que respecta a
las condiciones de síntesis, los componentes de elevado peso
molecular se introducen de una vez, de forma repetida o de forma
continua. Es preferible introducir estos componentes en forma de
polimerasas y plásmidos en la mezcla de reacción junto con la
entrada de la concentración máxima de Mg^{2+} y NTP en la fase de
transcripción. La fracción ribosómica puede introducirse durante la
traducción.
La Figura 4 muestra el diagrama (s) de los
cambios en las concentraciones de Mg^{2+} y NTP durante la
formación de un gradiente lineal de estos componentes. El proceso
de formación de un gradiente lineal es ampliamente conocido y
empleado, p. ej. en la cromatografía líquida. Es aconsejable
utilizar este modo para una síntesis preparativa del polipéptido
diana en el sistema de traducción de mRNA. En este modo, las
concentraciones de Mg^{2+} y NTP, que se encuentran en el dentro
del intervalo de cambios (zona E-F), deberían
corresponder al intervalo en el que las concentraciones de
Mg^{2+} y NTP se encuentran más próximas a la traducción óptima
de mRNA. El intervalo de concentraciones de Mg^{2+} y NTP
permitidas debe determinarse a partir de los tipos de extracto
conocidos aportados por la literatura científica o a partir de las
descripciones técnicas de los fabricantes. Se compensa el descenso
en la eficiencia de la traducción en las zonas cercanas a los
límites del margen E-F gracias a múltiples
repeticiones de las condiciones de síntesis dentro de la zona óptima
con cambios repetidos de las concentraciones de Mg^{2+} y NTP
proporcionales al gradiente lineal. Igual que en el caso anterior,
la totalidad de la síntesis se divide en N pasos, con una duración
de cada paso que varía entre t_{7} y t_{9}. En el primer paso,
de t_{7} a t_{8}, la mezcla adicional que contiene una elevada
concentración de Mg^{2+} y NTP se mezcla con la solución de
alimentación, de forma que aumenta la concentración de Mg^{2+} y
NTP en la mezcla total. La mezcla total se introduce en la mezcla de
reacción y las condiciones de la síntesis cambian. En ese momento,
se mantiene la síntesis y se eliminan del volumen de reacción los
componentes de bajo peso molecular que inhiben la síntesis. Con un
cambio en la proporción de los volúmenes mezclados y un descenso en
la cantidad de entrada de la mezcla adicional en relación con la
solución de alimentación, las concentraciones de Mg^{2+} y NTP de
la mezcla total descienden. Las concentraciones disminuidas de
Mg^{2+} y NTP pasan la región de la zona E-F en
la que la síntesis es máxima. En función de las condiciones de
síntesis, se añaden en exceso componentes de elevado peso molecular
que mantienen la síntesis al volumen de reacción de forma repetida o
continua.
Un modo similar también puede emplearse para
controlar la transcripción preparativa con el fin de obtener una
cantidad suficiente de mRNA. La diferencia entre los métodos
conocidos de síntesis de mRNA en un modo en lote y los métodos en
los que se alimenta en lote los sistemas de transcripción sin
eliminar los productos de bajo peso molecular (Kern y Davies, 1997)
es la siguiente: (a) debido a la eliminación de los componentes de
bajo peso molecular que inhiben la síntesis de mRNA, el proceso de
síntesis se prolonga y la producción de mRNA aumenta; (b) debido a
la elección del límite inferior del margen de las concentraciones de
Mg^{2+} y NTP, es posible obtener mRNA en condiciones que
promueven el próximo estadio de traducción del mRNA sintetizado sin
purificación adicional; (c) la utilización de concentraciones
elevadas de Mg^{2+} (hasta 50 mM) da lugar a una menor producción
de moléculas de mRNA incompletas o defectuosas y disminuye el
consumo de la costosa RNA polimerasa.
Los modos de funcionamiento descritos pueden
llevarse a cabo mediante la elección adecuada de un diseño del
módulo de reacción. Al utilizar barreras porosas situadas dentro del
módulo de reacción, se forma un volumen de reacción además de zonas
para la entrada de la solución de alimentación, de los componentes
de la mezcla adicional y de los componentes de elevado peso
molecular prescindibles que mantienen la síntesis, y para la salida
del módulo de reacción de los componentes de bajo peso molecular que
inhiben la síntesis y, en algunos modos, la salida de componentes
de elevado peso molecular, incluyendo los polipéptidos diana.
En el sistema más sencillo el volumen de
reacción está dividido en dos zonas. (a) en un modo CECF, una
barrera porosa divide el volumen en la zona con la mezcla de
reacción y la zona con la solución de alimentación; (b) en un modo
CFCF, la barrera porosa divide el volumen en la zona con la mezcla
de reacción a la que se añade la solución de alimentación, y la
zona para la eliminación de los productos sintetizados (patente
estadounidense US 5478730, Alakhov et al., 1995).
Existen reactores en los que se forman tres
zonas (patente estadounidense US 5135853, Dzewulski et al.,
1992; patente estadounidense US 5478730, Alakhov et al.,
1995; solicitud de patente alemana DE 19832160.0 A1, Bauer et
al., 1999): una zona para la entrada de la solución de
alimentación, una zona con la mezcla de reacción y una zona para la
salida de los productos sintetizados. Para mantener unas condiciones
de síntesis constantes es necesaria una división de este tipo. En
la presente invención, la productividad de la síntesis debería
estar respaldada, por un lado, una composición constante de
aminoácidos y otros componentes de la mezcla de reacción y, por
otro lado, una regulación activa (en el modo CFCF) o pasiva (modo
CECF) de las concentraciones de los compuestos seleccionados. Estas
condiciones determinan la elección de una construcción de reactores
diseñados para su funcionamiento en diferentes modos. La
construcción de un reactor con dos barreras porosas que forman tres
zonas en el volumen de reacción es la que se emplea de forma más
común para funcionar en modos diferentes. La cantidad de zonas
puede aumentarse en función de las peculiaridades del módulo
reactor.
El volumen de la mezcla de reacción depende de
las condiciones y la finalidad de la síntesis. Como es sabido
(patente estadounidense US 5324637. Thompson et al., 1994),
con fines de investigación la síntesis se realiza en
microvolúmenes. La síntesis en una escala preparativa (patente
estadounidense US 0593757, Baranov et al., 1997) se lleva a
cabo en reactores cuyo volumen varia entre 500 \mul y 1,0 ml. Con
finalidad investigadora, el volumen de reacción mínimo debe estar
entre 50 y 500 \mul. Para la síntesis preparativa, se utilizan uno
o varios módulos de reacción con un volumen entre 500 \mul y 10
ml. La cantidad de volúmenes de reacción en el reactor puede variar
de 1 a 10 en función de los tipos de módulo reactor.
En cada punto del volumen de reacción debe haber
tres procesos funcionando de forma simultánea. (a) entrada de la
solución de alimentación, (2) salida de los productos de bajo peso
molecular que inhiben la síntesis y (3) un cambio temporal en la
concentración de los componentes seleccionados que determinan la
productividad del proceso de síntesis. El módulo reactor más
preferible es aquel en el que se forman diversas capas finas de la
mezcla de reacción. El grosor de la capa se escoge de manera que el
intercambio continuo de la mezcla de reacción y los componentes de
la solución de alimentación o el flujo de la solución de
alimentación a través de la mezcla de reacción, así como la
eliminación de los productos de bajo peso molecular que inhiben la
síntesis, tengan lugar durante el periodo en que la síntesis no
disminuye por debajo del nivel permitido. La mezcla de reacción
puede disponerse en el volumen de cualquier forma delimitada por la
superficie de las barreras porosas. Si se utilizan fibras huecas,
membranas planas o combinaciones de ambas, el volumen de reacción
puede adoptar la forma de un cilindro o de una lámina fina y plana
de 0,1 a 5,0 mm de grosor. Los volúmenes internos del sistema de
reacción y la solución de alimentación pueden entremezclarse gracias
a una circulación en bucle cerrado de la mezcla de reacción por la
acción de una bomba (patente estadounidense US 54343079, Mozayeni,
1995), a la agitación del reactor (patente estadounidense US
5593856. Choi, 1997) o al empleo de un agitador magnético (Kim y
Choi, 1996). El volumen de reacción puede llenarse previamente con
diferentes separadores o extendedores de naturaleza orgánica o
inorgánica. Pueden estar compuestas por materiales porosos, en
capas o capilares escogidos de entre los siguientes: (a) filtros de
polímeros sintéticos o materiales inorgánicos, (b) metales porosos
o composiciones de estos y (c) estructuras con naturaleza de gel.
Los materiales porosos con tamaño de poro entre 10 \mum y 0,1 mm
situados en la mezcla de reacción sirven para incrementar el área
sobre la que las moléculas chocan entre sí y de esta forma
incrementar la velocidad de las reacciones de síntesis (Alberts
et al.,1983). Además de los polímeros, óxidos inorgánicos y
ceolitos (patente estadounidense US 5593856, Choi, 1997), estos
materiales pueden contener sustancias absorbentes utilizadas en las
técnicas de cromatografía, incluidas las sustancias absorbentes por
afinidad (Maier et al., 1998), para aislar el polipéptido
diana del sistema de reacción. El empleo de cualquier material
poroso con este objetivo está restringido solamente por su
actividad química y por la posibilidad de que inhiba la
síntesis.
Las barreras porosas, como las membranas, las
fibras huecas u otras estructuras porosas, aseguran el intercambio
de los componentes de la solución de alimentación y la mezcla de
reacción y desempeñan el papel de distribuidores de los flujos de
la solución de alimentación a través del volumen de reacción. No hay
restricciones por lo que respecta a la utilización en un reactor de
barreras porosas de tipos diferentes (membranas, fibras huecas) o
de materiales diferentes (sólidos o sólidos combinados con gel). Las
barreras porosas puede emplearse en construcciones tanto de capa
única como de varias capas, incluidas aquellas compuestas por
materiales diversos.
Las variantes aquí propuestas de posiciones
comunes de barreras porosas pueden modificarse según las técnicas
conocidas en el campo.
A continuación se exponen ejemplos de formación
de flujos (la solución de alimentación, la mezcla adicional o la
combinación de ambas) en módulos reactores para una síntesis
eficiente en los modos de intercambio continuo (CECF) o flujo
continuo (CFCF) (ejemplos 1 a 5), y de síntesis de cloranfenicol
acetil transferasa (CAT) en modo de intercambio continuo (ejemplo
6).
La fig. 5 muestra un esquema del reactor (10)
con una barrera porosa (11) que divide el volumen del reactor en
dos partes. En una parte (14), restringida por la superficie de la
barrera porosa (11), se sitúa la mezcla de reacción introducida por
la entrada 1. En la otra parte (15), se introduce la solución de
alimentación por la entrada 2 entrando en contacto con la
superficie de la barrera porosa (11). La barrera porosa puede tener
forma de cilindro o de lámina plana. En el primer caso, se emplean
membranas de diálisis o de ultrafiltración en forma de un disco, un
cuadrado o un rectángulo; en el segundo caso, se utilizan fibras
huecas o recipientes para diálisis. La mezcla de reacción se incuba
a una temperatura entre 20 y 40ºC. El intervalo de temperaturas
preferible para el extracto de germen de trigo es de 20 a 26ºC, para
el lisado de reticulocitos es de 24 a 38ºC y para el extracto de
E. coli es de 20 a 38ºC. Se forman flujos tangenciales que se
mueven a lo largo de la superficie interna y externa de la membrana
para intensificar el intercambio de la solución de alimentación y
la mezcla de reacción. En el caso del modo CECF, se eligen las
barreras porosas que permitan la eliminación exclusiva de los
componentes de bajo peso molecular del volumen de reacción (cuando
los tamaños del poro no superan los 30 kD) o la eliminación
simultánea de componentes de bajo y elevado peso molecular (cuando
los tamaños del poro varían entre 30 y 100 kD). Las entradas 1 y 2
del módulo reactor pueden estar cerradas de forma hermética o
abiertas durante la síntesis manteniendo la misma presión en ambas
partes del volumen de reacción . Esto permite la adición de
sustratos a la mezcla de reacción o a la solución de alimentación
que mantienen la síntesis, y también el cambio de la concentración
de los componentes seleccionados de forma independiente a la
difusión. Antes de iniciar la síntesis, se elige la proporción del
volumen de la mezcla de reacción y de la solución de alimentación
entre 1/5 y 1/100 y se seleccionan los tipos de módulo de reacción
que correspondan con esta proporción, tamaño de poro y área de
membrana de diálisis.
La descripción de la utilización del método
propuesto para la síntesis en el modo de intercambio continuo
(CFCF) se muestra a continuación.
Con fines analíticos, la síntesis de
polipéptidos se realiza en microrreactores con un volumen de
reacción de 50 \mul como mínimo. La síntesis de cantidades
preparativas de polipéptidos exige al modo de síntesis y al diseño
del reactor unos requisitos especiales. A continuación se exponen
variantes que se pueden realizar con reactores de un canal o
reactores multicanal, que incluyen aquellos con flujos ramificados
dentro del volumen del reactor. Las variantes de barreras porosas,
sus parámetros y el grosor de la capa de mezcla de reacción son en
su mayor parte análogos a los anteriormente descritos. Los reactores
utilizados en un modo de flujo deben asegurar (1) la entrada de la
solución de alimentación que contiene componentes de bajo peso
molecular en el volumen de reacción y (2) la entrada de componentes
de elevado peso molecular directamente en el volumen de reacción o
a través de una barrera porosa. La barrera porosa desempeña el papel
de distribuidor de flujos con tamaños de poro no superiores a 5000
kD que aseguran la penetración libre de la mayor parte de los
componentes del extracto de S30, excluyendo los ribosomas y
complejos formados a su alrededor. El número de posibles
construcciones de reactores que se pueden diseñar utilizando los
conocimientos de que se dispone es considerablemente alto, y la
técnica anteriormente descrita no restringe el alcance de otras
variantes.
El proceso de síntesis en el modo de entrada
continua de solución de alimentación con flujos ramificados de
fracciones de salida de componentes de elevado y bajo peso molecular
(CFCF-BF) proporciona la oportunidad de concentrar
el polipéptido sintetizado dentro de la mezcla de reacción debido a
la regulación independiente de los flujos de salida. La Figura 6
muestra un esquema del reactor y de las direcciones de los flujos
formados en una salida ramificada de la fracción de elevado peso
molecular F40 y de bajo peso molecular F30. El reactor tiene una
carcasa (10), dos barreras porosas (11 y 12) que forman el volumen
de reacción (14) localizado entre las superficies internas de las
barreras porosas, y dos zonas (15 y 16) para entrada/salida de
circuitos líquidos que contacten con la superficie externa de las
barreras porosas. La mezcla de reacción se introduce a la mezcla de
reacción a través de entrada 1. A través de la misma entrada se
introduce (a) la mezcla de alimentación F10, (b) la mezcla
adicional F20 y (c) la fracción de componentes de elevado peso
molecular F50. La mezcla de alimentación se introduce a través de
la entrada 1 de forma continua o recurrente. En función de las
condiciones de síntesis, la mezcla adicional F20 y la fracción de
componentes de elevado peso molecular F50 se suministran a la
mezcla de reacción de una sola vez, de forma repetida o de forma
continua. La fracción de componentes de elevado peso molecular F50
se introduce al volumen de reacción independientemente a la solución
de alimentación F10, o se mezcla previamente con la solución de
alimentación. El proceso de síntesis puede llevarse a cabo sin la
introducción de la fracción F50. Antes del inicio, se determinan las
proporciones de los volúmenes de las fracciones de la solución de
alimentación, la mezcla adicional y la fracción de elevado peso
molecular respecto a la mezcla de reacción y a la velocidad del
flujo de dichas fracciones a través del volumen de reacción. El
tamaño de poro de la primera barrera porosa (11) se selecciona
teniendo en cuenta el peso molecular y las dimensiones del
polipéptido diana, en el intervalo que oscila entre 30 y 100 kD; el
tamaño de poro de la segunda barrera porosa (12) no debe sobrepasar
los 30 kD. En referencia al modo seleccionado de síntesis, la
proporción de los volúmenes que pasan a través de la primera y
segunda barrera debe estar entre 1/10 y 1/100.
La Figura 7 muestra un esquema de los flujos del
reactor en el que la primera y la segunda barrera tienen UN tamaño
de poro igual o diferente que no sobrepasa los 30 kD. En este caso,
la síntesis se lleva a cabo sin eliminar de la zona de síntesis
(CFCF-RP) la fracción F40 de elevado peso molecular
ni el producto diana, y los flujos F31 y F32 contienen únicamente
componentes de bajo peso molecular. Este modelo se utiliza cuando
el producto sintetizado sobrepasa los 80-100 kD o
cuando la acumulación del polipéptido sintetizado en el volumen de
reacción no inhibe la síntesis. Los modos de entrada de la solución
de alimentación, la mezcla adicional y la fracción con los
componentes de elevado peso molecular son similares al modelo
CFCF-BF.
Las barreras porosas se pueden utilizar como
distribuidores de la solución de alimentación y de los flujos de la
mezcla adicional cuando el volumen, al que se le introduce la mezcla
de reacción, se rellena con materiales porosos y cuando la mezcla
del volumen de reacción presenta dificultades o es imposible.
La Figura 8 muestra un esquema del módulo del
reactor y de la dirección del flujo en el modo
CFCF-RP cuando la primera barrera porosa desempeña
la función de distribuidor de flujos de la solución de alimentación
F10 y de la mezcla adicional F20. El tamaño de poro de la primera
barrera porosa (11) no debe sobrepasar los 5000 kD. Esto permite la
entrada de parte de la fracción F51 de elevado peso molecular a
través de la primera barrera porosa, si las dimensiones de los
componentes incluidas en esta fracción son más pequeñas que el
tamaño de poro de la primera barrera. Dichos componentes son tRNA,
enzimas y otros elementos. Cuando sea necesario, la fracción
ribosómica F52 se introduce en el volumen de reacción (14)
directamente a través de la entrada líquida 1. El tamaño de poro de
la segunda barrera porosa no debe sobrepasar los 30 kD. El flujo de
los componentes F30 de bajo peso molecular, que inhiben el
funcionamiento del sistema, se eliminan a través de la salida 5.
La Figura 9 representa un esquema de los flujos
del modo CFCF-RF cuando la dirección del aporte de
la solución de alimentación a través de la primera y segunda
barrera porosa está alterada recurrentemente. En este modo diseñado
para la síntesis prolongada de polipéptido, alterar la dirección del
aporte de la solución de alimentación provoca el aclaramiento de
los poros de la primera barrera porosa (11) y de la segunda barrera
porosa (12). La síntesis se lleva a cabo sin la eliminación de los
productos de elevado peso molecular del reactor (el tamaño de poro
de la primera y segunda barrera porosa debe ser igual y no
sobrepasar los 30 kD), o con la eliminación de parte del producto
sintetizado del volumen de reacción (el tamaño del poro de la
primera barrera porosa no debe sobrepasar los 100 kD y el de la
segunda los 30 kD). El flujo de los componentes de elevado peso
molecular F50 se suministra al volumen de reacción a través de la
entrada 1. Se forman n etapas de entrada de la solución de
alimentación y de la mezcla adicional durante la síntesis. Cada
etapa se divide en dos periodos. Durante el primer periodo, los
contenedores con la solución de alimentación y al mezcla adicional
se conectan a la entrada 2 mediante válvulas líquidas. Los flujos
de la solución de alimentación F11 y de la mezcla adicional F21
entran en la zona (16) formada por la superficie de la primera
barrera porosa (11). A través de los poros de la primera barrera
porosa, la solución de alimentación y las mezclas adicionales se
introducen en la zona de síntesis (14) del reactor. A través de los
poros de la segunda barrera porosa (12) se eliminan los componentes
de bajo peso molecular de la zona de síntesis a la zona 15 y,
entonces se forma el flujo 32 que es eliminado del reactor a través
de la salida 5.
Tras la finalización del primer periodo, se
cambia la configuración de las válvulas y los contenedores con la
solución de alimentación y la mezcla adicional se conectan a la
entrada 3 que está unida a la zona 15 formada por la segunda
barrera porosa (12).
Los flujos F12 y F22 penetran a través de la
segunda barrera porosa a la mezcla de reacción y al mismo tiempo
limpian los poros de la segunda barrera que se habían cerrado
durante la primera etapa de síntesis. Los componentes de bajo peso
molecular abandonan el volumen de reacción a través de la primera
barrera porosa. Esos componentes forman el flujo F31 que se elimina
del reactor a través de la salida 4. Al ajustar la duración del
primer y segundo periodo de la entrada de la solución de
alimentación y al fluir la mezcla adicional al volumen de reacción
a través de la primera y segunda barrera porosa, la tasa del volumen
de los flujos F31 y F32 cambia.
Síntesis de la cloranfenicol acetil transferasa
(CAT) en el modo de intercambio continuo (CECF) en el sistema de
traducción y en dos variantes de los sistemas combinados de
transcripción-traducción.
Está descrito que la transcripción de formas
lineales o circulares de DNA por parte de polimerasas de fagos
tiene lugar en condiciones diferentes, en particular, a diferentes
concentraciones de Mg^{2+}. Entre los moldes de DNA lineal se
pueden encontrar plásmidos linealizados mediante enzimas de
restricción y productos de PCR. La utilización de productos de PCR
excluye el uso de células vivas para la preparación de constructos
genéticos [p. ej., tras la expresión de genes que codifican
productos tóxicos estables o inestables (Martemyanov et al.
, 1997)]. Además, la utilización de PCR para preparar moldes
permite una modificación más conveniente y sencilla de sus
constructos a escala genética, incluyendo (a) la introducción de
elementos estabilizadores de la estructura del RNA (p. ej.,
regiones altamente estructuradas, elementos RQ de RNA, terminadores
de la transcripción, etc.), (b) la introducción de elementos que
favorecen la expresión génica (p. ej., secuencias estimuladoras,
secuencias líder no traducibles, etc.), (c) la introducción de
secuencias marcadoras codificantes (p. ej., epítopos, marcadores
para la purificación por afinidad, etc.).
El método permite introducir alteraciones en la
intensidad de la transcripción de plásmidos circulares que pueden
encontrarse, por algunas razones, en su formas superenrollada o de
anillo abierto. Para las distintas polimerasas, dichas formas son
inherentes a los moldes cuya eficiencia depende del Mg^{2+}. A
continuación se ofrecen ejemplos de aplicaciones de este método
cuando se utilizan plásmidos circulares tras la síntesis de CAT en
los sistemas de transcripción-traducción.
Para comparar la productividad de la síntesis en
modos distintos, se utilizaron varias mezclas de reacción. La
primera mezcla de reacción se utilizó para preparar la mezcla de
traducción, y se sintetizó CAT utilizando el mRNA preparado
inicialmente. En el segundo modo, los componentes para la
transcripción del mRNA se añadieron a la mezcla de reacción y se
crearon las condiciones para la
transcripción-traducción combinadas. En la tercera
variante, una mezcla adicional que consta de los componentes
seleccionados, como Mg^{2+} y NTP, se añadió a la mezcla de
reacción preparada para la síntesis de un sistema combinado
transcripción-traducción. Antes de la síntesis se
introdujeron componentes adicionales a la mezcla de reacción.
La mezcla de reacción para la traducción de mRNA
se preparó teniendo en cuenta los datos de la Tabla 1. La mezcla
incluía un extracto de germen de trigo.
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La solución de alimentación se preparó según los
datos de la Tabla 2.
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\newpage
En este ejemplo se utilizó un dializador
preparado a partir de un recipiente de diálisis de 8 mm de diámetro
(Union Carbide Corp.) y con un volumen de funcionamiento de 100 ml.
El volumen de la solución de alimentación fue de 1 ml. Para
comparar la productividad del proceso de síntesis, la mezcla de
reacción total se dividió en dos volúmenes. Se colocaron 30 ml de
la mezcla de reacción en un vial de microcentrífuga y 100 ml de la
mezcla en el dializador. El dializador y el microvial se colocaron
en un volumen con control de temperatura y se realizó la síntesis a
25ºC. Durante el proceso de síntesis, se tomaron alícuotas de 5 ml
del microtubo y del recipiente de diálisis para determinar la
cinética de síntesis en el modo estacionario de lote y en el modo
de intercambio continuo (CECF). La cantidad de polipéptido
sintetizado se determinó mediante precipitación del polipéptido
sintetizado en un filtro de fibra de vidrio con ácido
trifluoroacético seguido por el recuento de radiactividad en un
contador de líquido de centelleo. En la Figura 10 se muestra la
cinética de la reacción de síntesis. El diagrama P hace referencia
a la síntesis en un modo estacionario (de lote). El diagrama R
muestra la cinética de la síntesis de CAT durante la traducción en
el modo CECF.
La mezcla de reacción se preparó según los datos
mostrados en la Tabla 3. El sistema combinado
transcripción-traducción contiene el plásmido
estimulador pCAT con el gen de la cloranfenicol acetil transferasa
(CAT) bajo el control del promotor de la polimerasa SP6.
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
La solución de alimentación se preparó teniendo
en cuenta los datos mostrados en la Tabla 4. Para mantener el
proceso de transcripción, se añadieron CTP y UTP a la solución de
alimentación.
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de síntesis (temperatura,
volumen de la mezcla de reacción, volumen de la solución de
alimentación, tipo de dializador) fueron las mismos que en el
ejemplo 6a (síntesis de CAT en el sistema de traducción). Los
resultados del proceso de síntesis se analizaron como en el Ejemplo
6a.
La figura 11 muestra la cinética de la síntesis
de CAT en el sistema combinado de
transcripción-traducción. El diagrama S representa
la síntesis en el modo de lote. El diagrama T representa la cinética
de la síntesis de CAT durante la
transcripción-traducción en el modo CECF.
La mezcla de reacción se preparó teniendo en
cuenta los datos mostrados en la Tabla 5.
La solución de alimentación se prepara teniendo
en cuenta los datos mostrados en la Tabla 6.
La concentración de Mg(OAc)_{2}
en la solución de alimentación fue reducida a 3,8 mM, dado que
durante el proceso de síntesis cuando las concentraciones de la
mezcla de reacción y de la solución de alimentación son iguales, la
concentración de Mg(OAc)_{2} alcanza 5,1 mM que es
la apropiada para permitir la
transcripción-traducción.
Las condiciones de síntesis (temperatura,
volumen de la mezcla de reacción y de la solución de alimentación,
tipo de dializador) se seleccionaron de forma análoga a los
mostrados en el Ejemplo 6a (síntesis de CAT tras la traducción).
Los resultados del proceso de síntesis se analizaron como en el
Ejemplo 6a.
La figura 12 muestra la cinética de la síntesis
de CAT en el sistema combinado de
transcripción-traducción. El diagrama U representa
la síntesis en el modo de lote. El diagrama V muestra la cinética de
la síntesis de CAT tras la transcripción-traducción
en el modo CECF con concentraciones cambiantes de Mg^{2+} y NTP
en la mezcla de reacción durante el proceso de síntesis.
La figura 13 muestra un diagrama que compara los
resultados de los experimentos de síntesis del polipéptido CAT
diana. Los datos se han tomado de los Ejemplos 6a-c
y demuestran el rendimiento de CAT (mg/ml) en diferentes modos: (a)
modo estacionario (de lote) del sistema combinado de
transcripción-traducción (Ejemplo 6b, columna W);
(b) traducción (Ejemplo 6a, columna X); (c)
transcripción-traducción combinadas (Ejemplo 6b,
columna Y); (d) transcripción-traducción combinadas
con concentraciones cambiantes de Mg^{2+} y NTP en la mezcla
(Ejemplo 6c, columna Z). La comparación de los resultados muestra
que se obtiene el mayor rendimiento de polipéptido CAT (32 mg/ml)
en el modo de transcripción-traducción combinadas
cuando las concentraciones de Mg^{2+} y NTP oscilan entre sus
valores máximo y mínimo.
La invención puede utilizarse para sintetizar
polipéptidos en sistemas libres de células utilizando células
eucariotas y procariotas. El método descrito en el presente
documento permite al usuario optimizar todo el proceso de síntesis
y estudiar la contribución de cada componente individual a la
síntesis en modos independientes de transcripción,
transcripción-traducción y traducción.
Alakhov J. B. et al. Method of
preparing polypeptides in a cell-free translation
system. US Patent 5478730, US Cl. 435/68.1 (26.12.1995).
Alakhov J.B. et al. Method of
obtaining polypeptides in cell-free translation
system. EP Patent 0312617, Int. Cl. C12P 21/00
(03.03.1993).
Alberts B. et al. Molecular
biology of the cell. New York, London, p. 133 (1983).
Baranov V.I. et al. Gene
expression in a cell-free system on the preparative
scale. Gene 84: 463-466 (1989).
Baranov V.I. et al. Method for
obtaining polypeptides in a cell-free system. EP
Patent 0593757, Int. Cl. C12P 21/00 (15.01.1997).
Baranov V.I. et al. Method for
preparative expression of genes in a cell-free
system of conjugated transcription/translation. EP Patent 0401369,
Int. Cl. C12P 21/00 (31.05.1995).
Baranov V.I., Spirin A.S. Gene expression
in cell-free system on preparative scale. From:
"Methods in Enzym." Vol. 217 "Recombinant DNA", Part H,
Edit. R. Wu, Academic Press p.p. 123-142
(1993).
Bauer H. et al. Verfahren und
Vorrichtung zur Durchführung biochemischer Reaktionen.
DE-A1-19832160. Int. Cl. C12M 1/12
(04.02.1999).
Beckler G.S. Coupled transcription and
translationin eukaryotic cell-free extract. US
Patent 5324637, US Cl.435/
68.1 (09.09.1997).
68.1 (09.09.1997).
Choi C. et al. Method producing
protein in a cell-free system. US Patent 5593856 US
Cl. 435/68.1 (14.01.1997).
Clark C. Dialysis device with
hermetically sealed vacant chamber. US Patent 5503741, US Cl.
210/232
(02.04.1996).
(02.04.1996).
Craig D. et al. Plasmid
cDNA-directed protein synthesis in a coupled
eukaryotic in vitro transcription-translation
system, Nucl. Acids Res. V. 20, No. 19:
4987-4995 (1993).
Davis J. et al. Large scale
dialysis reactions using E. coli S30 extract systems Promega
Notes N 56: 14-20 (1996).
Dziewulski D. et al. Three
compartment bioreactor and method of use. US Patent 5135853, US Cl.
435/04 (04.04.1992).
Erdmann V.A. et al. , The Protein
-Bioreactor: Its Potentials for the Synthesis of Proteins in
Biotechnology, Medicine and Molecular Biology. First
German-Russian Summer school on in vitro
Systems, 64-70, Berlin (1994).
Fischer K., Bauer H. Verfahren zur
Beschleunigung des Stoffaustauschs eines kontinuierlichen
Bioreaktors und Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens, DE
Patent Appl. 3914956 A1, IPC Cl. C12M 1/12 (22.11.1990).
Flaherty J.E. Disposable dialysis
apparatus. US Patent 5324428, US Cl. 210/232 (28.06.
1994).
Guajardo R. et al. NTP
Concentration Effects on Initial Transcription by T7 RNAP Indicate
that Translocation Occurs through Passive Sliding and Reveal that
Divergent Promoters have Distinct NTP Concentration Requirements for
Productive Initiation. J. Mol. Biol. 281,
777-792 (1998).
Gurevich V. et al. Preparative
in-Vitro mRNA Synthesis Using SP6 and T7 RNA
Polymerases. Analyt. Biochem. 195: 207-213
(1991).
Joice G.F. Coupled isothermal
polynucleotide amplification and translation system. US Patent
5807717, US Cl. 435/091.1 (15.09.1998).
Kem J.A., Davis R.H. Application
of solution equilibrium analysis to in-vitro RNA
transcription. Biotechnol. Prog., 13: 747-756
(1997).
Kim D.M., Choi C.Y. A
semicontinuous prokaryotic coupled transcription/translation system
using a dialysis membrane. Biotechnol. Prog., Sep., 12:
645-649 (1996).
Laios E. et al. Novel
hybridization assay configurations based on in vitro
expression of DNA reporter molecules. Clin. Biochem, Apr, 31:
3, 151-158 (1998).
Maier T. et al.
Strep-tag II affinity purification: an approach to
study intermediates of metalloenzyme biosynthesis. Anal.
Biochem. 259:1, 68-73 (1998).
Martemyanov K. A. et al. Direct
expression of PCR products in a cell-free
transcription/transiation system: synthesis of antibacterial peptide
cecropin. FEBS Letters 414: 268-270
(1997).
Merrick W. C. Translation of Exogenous
mRNAs in Reticulocyte Lysates. From: Methods in Enzymology'' Vol.
101: "Monitoring cloned gene expression" Academic Press, Inc.
p.p.606-615 (1983).
Mozayeni B.R. Apparatus and process for
continuous in vitro synthesis of proteins. US Patent 5434079,
US Cl. 435/311 (07.18.1995).
Operating Guide, Linked in vitro SP6/T7
Transcription/Translation Kit. Roche Diagnostics GmbH
(1998).
Operating Guide, Single Tube Protein™ System 3.
Novagen Inc. (1998).
Ovodov S.J. et al. Method for
obtaining polypeptides in a cell-free translation
system. EP Patent 0485608, Int. Cl. C12P 21/00
(22.11.1995).
Palmenberg A.C. et al. Translation
enhancer. US Patent 4937190, US Cl. 435/69.1
(26.06.1990).
Pelham H.R.B., Jackson R.J. An
efficient mRNA-dependent translation system from
reticulocyte lysates. Eur. J. Biochem. V. 67:
247-256 (1976).
Pokrovskaya I., Gurevich V.
In-vitro Transcription: Preparative RNA
Yields in Analytical Scale Reactions. Analyt. Biochem. 220:
420-423 (1994).
Roberts B. E. Protein translation method.
US Patent 4668624, US Cl. 435/68 (28.03.1979).
Roberts B.E., Paterson B.M.
Efficient translation of tobacco mosaic virus RNA and rabbit globin
8S RNA in a cell-free system from commercial wheat
germ. Proc. Natl. Acan. Sci. U.S.A. 70:
2330-2334 (1973).
Ryabova L. A. et al.
Continuous-flow cell-free
translation, transcription-translation, and
replication-translation systems. From: "Methods in
Molecular Biology" Vol.77 "Protein Synthesis: Methods and
Protocols", Edit. R. Martin, Humana Press Inc. Totowa, NJ p.p.
179-193 (1998).
Ryabova L. A. et al. Preparative
synthesis of globin in a continuous cell-free
translation system from rabbit reticulocytes. Nucleic Acids
Res. 17, 11: 4412 (1989).
Sakurai T. Method for production protein
in cell-free system and device therefore. JP Patent
7031494, IPC Cl. C12P 21/00 (03.02.1995).
Sato T. Method for synthesizing
polypeptide. JP Patent 5076381, IPC Cl. C12P 21/00
(30.03.1995).
Shimizu N. Metod for synthesizing protein
by extracted solution of cell and device therefore. JP Patent
7075592, IPC Cl. C12P 21/00 (20.03.1995).
Spirin A.S. Cell-Free
Protein Synthesis Bioreactor. From: "Frontiers in Bioprocessing
II", Edit. Todd P. et al, Amer. Chemic. Soc. p.p.
31-43 (1992).
Spirin A.S. et al. A Continuous
Cell-Free Translation System Capable of Producing
Polypeptides in High Yield. Science, 242:
1162-1164 (1988).
Suzuki H. Effect of Concentration of KCL,
Magnesium Acetate and Spermine on the Ratio of \alpha to \beta
Globin Chains Synthesized. J. Biochem, 82:1,
251-260 (1977).
Takanori K. et al. A Continuous
Cell-Free Protein Synthesis System for Coupled
Transcription-Translation. J. Biochem. 110:
166-168 (1991).
Thompson D.V. et al. Coupled
transcription and translation in eukaryotic
cell-free extract. US Patent 5324637, US Cl.
435/68.1 (28.06.1994).
Volyanik E.V. et al. Synthesis of
Preparative Amounts of Biologically Active Interleukin 6 Using a
Continuous-Flow Cell-Free
Translation System. Analyt. Biochem. 214:
289-294 (1993).
Wimmer E, et al. De novo
cell-free synthesis of picornavirus. US Patent
5674729, US Cl. 435/235.1 (07.10.1997).
Yamamoto Y., et al. Hollow fiber
reactor for continuous flow cell-free protein
production. J. Chem. Eng. Japan, 6: 1047-1050
(1996).
Yamane T. et al. Synthesis of
protein by cell-free protein synthetic system and
apparatus therefore. JP Patent 10080295, IPC Cl. C12P 21/00
(31.03.1998).
Zubay G. In vitro synthesis of
protein in microbial systems. Annu. Rev. Genet. 7:
267-287 (1973).
Claims (9)
1. Un método para obtener polipéptidos en un
sistema libre de células en el que la mezcla de reacción se prepara
a partir de un lisado o extracto celular; se seleccionan los
parámetros del sistema libre de células y el modo de síntesis; se
determinan el tipo y los parámetros de al menos una barrera porosa;
la mezcla de reacción y la solución de alimentación se colocan en el
módulo de reacción; y la síntesis se lleva a cabo, en la que una vez
que se han seleccionado los parámetros del proceso, los tipos de los
componentes seleccionados que determinan la productividad de la
síntesis son seleccionados, los límites superior e inferior del
intervalo en el que las concentraciones de los componentes
seleccionados cambian durante la síntesis están definidos; la mezcla
adicional que contiene los componentes seleccionados está formada;
la mezcla adicional se introduce a la mezcla de reacción o a la
solución de alimentación; la síntesis se lleva a cabo con
concentraciones cambiantes de los componentes seleccionados dentro
de los intervalos definidos mientras que las concentraciones del
resto de los componentes se mantienen constantes.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1
en el que al menos uno de los componentes seleccionados se escoge
entre Mg^{2+}, K^{+}, NTP, poliamina o una combinación de los
mismos.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2
en el que una combinación de los componentes seleccionados incluye
Mg^{2+} y NTP.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1
en el que el modo de síntesis se escoge al menos uno de entre los
siguientes: traducción, transcripción-traducción,
transcripción o combinaciones de dichos modos.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4
en el que dependiendo del modo de síntesis, los NTP contenidos en la
mezcla adicional comprenden el grupo ATP, GTP, UTP y CTP o el grupo
de ATP y GTP.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1
en el que la mezcla adicional se introduce en la mezcla de reacción
antes de la síntesis o durante la síntesis, o la mezcla adicional se
introduce a una parte de la solución de alimentación antes de la
síntesis o durante la síntesis.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6
en el que la mezcla adicional se introduce de una vez, de forma
recurrente o continua durante el proceso de síntesis.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 1
en el que el modo de entrada de componentes de bajo peso molecular
de la solución de alimentación a la mezcla de reacción se selecciona
del grupo formado por modos de intercambio, un grupo de modos de
flujo continuo, o una combinación de dichos modos.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 1
en el que la mezcla de reacción se prepara utilizando un lisado o
extracto celular obtenido de células procariotas o eucariotas.
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10011209A1 (de) * | 2000-03-08 | 2001-09-13 | Roche Diagnostics Gmbh | Matrix-Reaktor und Verfahren zur Herstellung von Produkten in diesem Reaktor |
| DE10137792A1 (de) * | 2001-08-06 | 2003-02-27 | Erdmann Volker | Verfahren zur Genexpression |
| EP1295894B1 (en) | 2001-09-25 | 2011-09-14 | F. Hoffmann-La Roche AG | Method for an in vitro sequence specific biotinylation of polypeptides |
| CA2463719A1 (en) | 2003-04-05 | 2004-10-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nucleotide analogs with six membered rings |
| US7341852B2 (en) * | 2003-07-18 | 2008-03-11 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods of decoupling reaction scale and protein synthesis yield in batch mode |
| WO2005123936A1 (ja) * | 2004-06-15 | 2005-12-29 | Zoegene Corporation | ポリペプチド合成方法 |
| JP4513495B2 (ja) | 2004-10-15 | 2010-07-28 | 株式会社島津製作所 | 昆虫細胞由来抽出液を用いた無細胞タンパク質合成方法 |
| US20070117179A1 (en) * | 2005-09-27 | 2007-05-24 | Invitrogen Corporation | In vitro protein synthesis systems for membrane proteins that include adolipoproteins and phospholipid-adolipoprotein particles |
| EP2118129A4 (en) * | 2007-03-01 | 2010-04-28 | Life Technologies Corp | ISOLATED PHOSPHOLIPID PROTEIN PARTICLES |
| JP5684734B2 (ja) | 2009-02-20 | 2015-03-18 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 免疫グロブリンをコードする核酸を得る方法 |
| EP2758428A1 (en) | 2011-09-21 | 2014-07-30 | F.Hoffmann-La Roche Ag | METHOD FOR OBTAINING FAB FRAGMENTS FROM SINGLE ANTIBODY PRODUCING CELLS BY MULTIPLEXED PCR IN COMBINATION WITH TaqMan PROBES |
| WO2014144583A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Northwestern University | Methods for cell- free protein synthesis |
| MY193444A (en) | 2015-03-30 | 2022-10-13 | Greenlight Biosciences Inc | Cell-free production of ribonucleic acid |
| US11530432B2 (en) | 2018-03-19 | 2022-12-20 | Northwestern University | Compositions and methods for rapid in vitro synthesis of bioconjugate vaccines in vitro via production and N-glycosylation of protein carriers in detoxified prokaryotic cell lysates |
| US11725224B2 (en) | 2018-04-16 | 2023-08-15 | Northwestern University | Methods for co-activating in vitro non-standard amino acid (nsAA) incorporation and glycosylation in crude cell lysates |
| US11814621B2 (en) | 2018-06-01 | 2023-11-14 | Northwestern University | Expanding the chemical substrates for genetic code reprogramming |
| US12421537B2 (en) | 2018-07-06 | 2025-09-23 | Northwestern University | Ribosome variants for sequence defined polymer synthesis |
| WO2020072127A2 (en) | 2018-08-03 | 2020-04-09 | Northwestern University | On demand, portable, cell-free molecular sensing platform |
| US12325884B2 (en) | 2019-03-04 | 2025-06-10 | Northwestern University | Riboswitch-based fluoride sensing in cell-free extract |
| RU199182U1 (ru) * | 2019-12-10 | 2020-08-19 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка Российской академии наук (ИБ РАН) | Устройство для синтеза белков в бесклеточной системе |
| GB202406294D0 (en) | 2024-05-06 | 2024-06-19 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | Methods and compositions for producing capped mRNA |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4668624A (en) | 1979-02-28 | 1987-05-26 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Protein translation method |
| US5135853A (en) | 1983-07-22 | 1992-08-04 | Rensselaer Polytechnic Institute | Three compartment bioreactor and method of use |
| SU1618761A1 (ru) * | 1987-04-29 | 1991-01-07 | Институт Белка Ан Ссср | Способ получени пептидов и белков в бесклеточной системе трансл ции |
| US4937190A (en) | 1987-10-15 | 1990-06-26 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Translation enhancer |
| US5478730A (en) * | 1988-12-21 | 1995-12-26 | Institute Of Protein Research | Method of preparing polypeptides in cell-free translation system |
| SU1705302A1 (ru) | 1988-12-22 | 1992-01-15 | Институт Белка Ан Ссср | Способ препаративной экспрессии генов в бесклеточной системе сопр женной транскрипции/трансл ции |
| DE3914956A1 (de) | 1989-05-06 | 1990-11-22 | Fischer Karl Heinz | Verfahren zur beschleunigung des stoffaustauschs eines kontinuierlichen bioreaktors und vorrichtung zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| JP2891540B2 (ja) | 1989-07-31 | 1999-05-17 | インスティテュト、ベルカ、ロシイスコイ、アカデミイ、ナウク | 無細胞翻訳系におけるポリペプチドの製造方法 |
| DK0593757T3 (da) * | 1989-07-31 | 1997-07-07 | Inst Of Protein Research Russi | Fremgangsmåde til opnåelse af polypeptider i et cellefrit system |
| CA2115991A1 (en) | 1991-06-24 | 1993-01-07 | Eckard Wimmer | De novo cell-free synthesis of picornavirus |
| JPH0576381A (ja) | 1991-09-19 | 1993-03-30 | Hitachi Ltd | ポリペプチド合成方法 |
| ES2097363T3 (es) | 1991-10-11 | 1997-04-01 | Promega Corp | Transcripcion y traduccion acopladas en un extracto exento de celulas eucariotas. |
| WO1994005812A1 (en) | 1992-09-02 | 1994-03-17 | The Scripps Research Institute | Coupled isothermal polynucleotide amplification and translation system |
| BR9300343A (pt) * | 1993-02-09 | 1994-09-27 | Semer S A | Secadora multifunções |
| US5434079A (en) | 1993-02-12 | 1995-07-18 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Apparatus and process for continuous in vitro synthesis of proteins |
| JPH0731494A (ja) | 1993-07-14 | 1995-02-03 | Hitachi Ltd | 無細胞系におけるタンパク質の生産方法及び装置 |
| US5324428A (en) | 1993-07-19 | 1994-06-28 | Spectrum Medical Industries, Inc. | Disposable dialysis apparatus |
| JPH0775592A (ja) | 1993-09-07 | 1995-03-20 | Hitachi Ltd | 細胞抽出液による蛋白質合成方法及び装置 |
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