JP6150349B2 - タンパク質の合成方法、およびタンパク質の合成キット - Google Patents
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Description
本発明は、タンパク質の合成方法、およびタンパク質の合成キットに関し、詳細には、無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の合成方法、およびこのタンパク質の合成方法に利用できるタンパク質の合成キットに関する。
タンパク質合成に必要な因子を含む細胞抽出液に、基質となるアミノ酸、ＡＴＰなどのエネルギー源、および目的タンパク質の遺伝子を加え、試験管内でタンパク質を合成する、いわゆる無細胞タンパク質合成方法が従来知られている。無細胞タンパク質合成系には、大腸菌、昆虫細胞、小麦胚芽および動物細胞等から調製した抽出液を用いた系が知られており、キット化されたものが数社から市販されている。
細胞を用いた合成系である細胞発現系と比較すると、無細胞タンパク質合成系では、（ｉ）反応条件を自由に設定できる、（ｉｉ）発現ベクターに目的遺伝子をクローニングした環状ＤＮＡに限らず、ＰＣＲ産物等の直鎖状ＤＮＡも利用できる、および（ｉｉｉ）様々な標識タンパク質を容易に合成できる、といった強みがある。その反面、一部に高価な試薬類を用いるため、無細胞タンパク質合成系は、細胞発現系よりも高コストであることが弱みとされている。この点が、気軽に使用できるツールとしての広がりを妨げるひとつの要因となっている。
無細胞タンパク質合成系における反応液の構成成分のうち、高価な試薬類の一つとして、ヌクレオシド３リン酸（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰ。以下、この４つを総称してＮＴＰと呼ぶ。）が挙げられる（非特許文献１）。反応液にＤＮＡを鋳型として添加し、転写および翻訳をひとつの反応液中で同時に行う共役系の場合では、４種類のＮＴＰを加えることが一般的である。また、ＡＴＰおよびＧＴＰについては、ｍＲＮＡの転写反応における基質として働くだけではなく、翻訳反応のエネルギー源としても必須である。そのため、予め調製したｍＲＮＡを鋳型として反応液に加えて翻訳のみを行う合成系であっても、４種類のＮＴＰのうち、通常ＡＴＰおよびＧＴＰを添加する必要がある。すなわち、転写および翻訳の両方が含まれる合成系ならびに翻訳のみを行う合成系いずれにおいても、市販の高価なＮＴＰを用いることによるコスト高という共通の課題が存在する。
ところで細胞抽出液には、転写および翻訳に必要な因子以外にも様々な酵素が含まれている。これらの酵素を積極的に利用することによって、前駆体から有用な基質等を系内合成することが可能である。
例えば、非特許文献２には、無細胞タンパク質合成系において細胞抽出液中の酵素を用いてアミノ酸前駆体からアミノ酸を合成し、これを無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質合成に利用した技術が開示されている。ＮＭＲ解析用のタンパク質試料の調製には、２０種類の安定同位体標識アミノ酸を加えるか、もしくは藻類由来のアミノ酸混合物に対して、それには含まれないＴｒｐ、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＣｙｓの４種類のアミノ酸を加えてタンパク質合成を行うことが一般的である。２０種類の安定同位体標識アミノ酸を用いる方法よりも、藻類由来のアミノ酸混合物に４種類のアミノ酸を加える方法がより安価であるものの、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＣｙｓは他の１６種類のアミノ酸に比べて非常に高価であることが問題となっていた。この問題を解決するために、非特許文献２では、安定同位体標識された安価な数種類の原料から、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＣｙｓを抽出液中の酵素によって系内合成して、無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質合成に供する技術を報告している。
また例えば、非特許文献３には、ＮＴＰの代わりにヌクレオシド一リン酸（ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰおよびＵＭＰ。以下、この４つを総称してＮＭＰと呼ぶ。）を添加するとともに、エネルギー源としてホスホエノールピルビン酸の代わりにグルコースを反応液に加えて、代謝酵素を利用することによってＮＴＰを系内合成して、これを無細胞タンパク質合成系に利用したタンパク質合成方法が報告されている。
また、酵素によってＡＭＰからＡＴＰを、ＧＭＰからＧＴＰを合成することが非特許文献４に記載されており、酵素によってＣＭＰからＣＴＰを合成することが非特許文献５に記載されている。また、非特許文献６には、無細胞タンパク質合成系において、ピルビン酸塩を用いてＡＤＰからＡＴＰを合成することが記載されている。非特許文献７には、高価なＮＡＤおよびＣｏＡが含まれているＳ１２ ｅｘｔｒａｃｔを用いて無細胞タンパク質合成を行うことが記載されている。
Noguchi T and ShibaT, Biosci. Biotechnol. Biochem., 1998, 62(8), 1594-1596.
Yokoyama J, Matsuda T, Koshiba S, and Kigawa T, J Biomol NMR., 2010, 48(4), 193-201.
Calhoun KA and Swartz JR, Biotechnol. Prog., 2005, 21, 1146-1153.
Kameda A, ShibaT, Kawazoe Y, Satoh Y, Ihara Y, Munekata M, Ishige K and Noguchi T, J. Biosci. Bioeng., 2001, 91, 557-563.
Ishige K, Hamamoto T, ShibaT and Noguchi T, Biosci. Biotechnol. Biochem., 2001, 65(8), 1736-1740.
Kim D-M and Swartz J R, Biotechnol. Bioeng., 2001, 74, 309-316.
Kim T-W, Kim H-C, Oh I-S and Kim D-M, Biotechnol. BioprocessEng., 2008, 13, 464-469.
ＮＭＰはＮＴＰと比較して安価であるものの、構造解析など大量のタンパク質を合成する必要がある場合には、より多くの基質が必要であるため、合成系のさらなる低コスト化が望まれている。
そこで、本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、無細胞タンパク質合成系において、より安価にタンパク質合成を行うことができる方法を提供することにある。
本願発明者らが鋭意検討した結果、細胞抽出液を含む反応液により安価なリボヌクレオシドを添加した合成系であっても、さらには、１種類のリボヌクレオシドのみを添加した場合であっても、ＮＴＰを添加した合成系と同程度のタンパク質合成量を得ることができることを見出し、本願発明を完成させるにいたった。
本発明に係るタンパク質の合成方法は、上記課題を解決するために、無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の合成方法であって、タンパク質をコードする鋳型ＤＮＡと、アデノシン、グアノシン、ウリジンおよびシチジンのうちの少なくとも何れか１種のリボヌクレオシドとを、タンパク質合成用の細胞抽出液を含む反応液に添加することを特徴とする。
本発明に係るタンパク質の合成キットは、上記課題を解決するために、上述のタンパク質の合成方法に使用されるタンパク質の合成キットであって、アデノシン、グアノシン、ウリジンおよびシチジンのうちの少なくとも何れか１種のリボヌクレオシドと、細胞抽出液とを含むことを特徴とする。
本発明に係るタンパク質の合成方法によれば、無細胞タンパク質合成系において、転写反応の基質としてのＮＴＰ、およびその前駆体のＮＭＰを添加することなく、タンパク質を合成することができる。
本発明に係るタンパク質の合成方法の一実施形態について、以下説明する。
本発明に係るタンパク質の合成方法は、無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の合成方法であって、タンパク質をコードする鋳型ＤＮＡと、アデノシン、グアノシン、ウリジンおよびシチジンのうちの少なくとも何れか１種のリボヌクレオシドとを、タンパク質合成用の細胞抽出液を含む反応液に添加するものであればよく、その他の具体的な工程、ならびに使用する器具および装置は特に限定されるものではない。
（無細胞タンパク質合成系）
本明細書において「無細胞タンパク質合成系」とは、細胞抽出液を用いて、試験管等の人工容器内で転写および翻訳の反応系を再構成してタンパク質を合成させる系である。細胞抽出液は、細胞内に含まれる、ＤＮＡを鋳型としたＲＮＡの転写に必要な因子、およびタンパク質の翻訳に必要な因子を、細胞を破砕して抽出液として取り出したものである。すなわち、本明細書において「タンパク質合成用」とは、ＲＮＡにコードされた情報に基づくタンパク質の合成のみならず、ＤＮＡを鋳型とした、タンパク質の合成に用いられるＲＮＡの合成をも含むことを意図している。
本明細書において「無細胞タンパク質合成系」とは、細胞抽出液を用いて、試験管等の人工容器内で転写および翻訳の反応系を再構成してタンパク質を合成させる系である。細胞抽出液は、細胞内に含まれる、ＤＮＡを鋳型としたＲＮＡの転写に必要な因子、およびタンパク質の翻訳に必要な因子を、細胞を破砕して抽出液として取り出したものである。すなわち、本明細書において「タンパク質合成用」とは、ＲＮＡにコードされた情報に基づくタンパク質の合成のみならず、ＤＮＡを鋳型とした、タンパク質の合成に用いられるＲＮＡの合成をも含むことを意図している。
無細胞タンパク質合成系を構築する細胞抽出液としては、さまざまな生物種に由来する細胞抽出液を利用することができ、例えば、大腸菌および好熱性細菌等の細菌細胞の抽出液、ならびに小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞および出芽酵母等の真核細胞の抽出液を用いることができる。なかでも、細菌細胞の細胞抽出液を好適に用いることができ、大腸菌の細胞抽出液がより好ましい。
大腸菌の抽出液としては、Ｚｕｂａｙ（非特許文献：Zubay G., Ann Rev Genet, (1973) 7, 267-287）またはＰｒａｔｔら（非特許文献：Pratt, J.M. et al., Transcription and Translation-A Practical Approach, (1984), pp.179-209, Henes, B.D. et al. eds., IRL Press, Oxford）に記載された方法により調製されたＳ３０抽出液を用いることができる。大腸菌Ｓ３０抽出液は、転写および翻訳に必要な大腸菌の全ての酵素と因子を含んでいる。具体的な調製方法としては、まず最初に大腸菌を培養し、菌体を遠心分離等により回収する。回収された菌体は、洗浄後、緩衝液に再懸濁し、フレンチプレス、ガラスビーズ、およびワーリングブレンダー等を用いて破砕する。破砕された大腸菌の不溶物質を遠心分離で除去し、プレインキュベーション混合液と混合してインキュベーションする。この操作によって内在性のＤＮＡおよびＲＮＡが分解されるが、さらに、カルシウム塩およびマイクロコッカスのヌクレアーゼ等を添加して内在性の核酸を分解してもよい。続いて、透析により内在性のアミノ酸、核酸およびヌクレオシド等を除き、適量ずつ分注して液体窒素又は−８０℃にて保存する。
真核細胞抽出液としては、ウサギ網状赤血球溶解物および小麦胚芽抽出液が好ましい。ウサギ網状赤血球溶解物は、ＰｅｌｈａｍおよびＪａｃｈｓｏｎ（非特許文献：Pelham, H.R.B. and Jachson, R.J. Eur. J. Biochem., 67, 247-256, 1976）によって記載された方法を用いることができる。小麦胚芽抽出液の作製方法としては、例えばＲｏｂｅｒｔｓおよびＰａｔｅｒｓｏｎ（非特許文献：Roberts, B.E. and Paterson, B.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 2330-2334, 1973）によって記載された方法を用いることができる。
反応液における細胞抽出液の量は、１０〜５０％であることが好ましく、２０〜３０％がより好ましい。
なお、いずれの細胞抽出液においても、市販の細胞抽出液を使用することも可能である。また、いずれの細胞抽出液も転写および翻訳に必要な全ての酵素と因子を含んでいるが、タンパク質合成の反応液として用いる際に、さらに補充的な成分および緩衝液を添加することができる。
（リボヌクレオシド）
本発明に係るタンパク質の合成方法では、アデノシン、グアノシン、ウリジンおよびシチジンのうちの少なくとも何れか１種のリボヌクレオシドが、タンパク質合成用の細胞抽出液を含む反応液に添加される。
本発明に係るタンパク質の合成方法では、アデノシン、グアノシン、ウリジンおよびシチジンのうちの少なくとも何れか１種のリボヌクレオシドが、タンパク質合成用の細胞抽出液を含む反応液に添加される。
細胞抽出液を含む反応液には、アデノシン、グアノシン、ウリジンおよびシチジンのうちの少なくとも何れか１種のリボヌクレオシドが添加されればよく、より好ましくは、少なくとも何れか２種のリボヌクレオシドが添加され、さらに好ましくは、少なくとも何れか３種のリボヌクレオシドが添加される。
下記反応式（１）〜（３）は、それぞれ大腸菌のＡＴＰの生合成経路、ＧＴＰの生合成経路ならびにＣＴＰおよびＵＴＰの生合成経路を示している。大腸菌は、下記式（１）〜（３）中に示されているような、リボヌクレオシドから、ＮＭＰ、ＮＤＰ（ヌクレオシド二リン酸）およびＮＴＰを順次合成する酵素群を有している。これらの酵素群は菌を破砕した調製した細胞抽出液にも含まれている。そのため、ＮＴＰの代わりにアデノシン等のリボヌクレオシドを細胞抽出液に添加することによって、これらの酵素群を利用してＮＴＰを生合成して、転写反応および翻訳反応に供することが可能になる。
（反応式１）
（反応式１）
（反応式２）
（反応式３）
なお、上記反応式（１）〜（３）は、大腸菌における生合成経路を示したものであるが、他の生物種においても同様の代謝経路が存在する。そのため、上述の通り、細胞抽出液は大腸菌由来の細胞抽出液に限らず、他の生物種由来の細胞抽出液も、本発明に係る無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の合成方法に用いることができる。
添加するリボヌクレオシドの種類としては、少なくともグアノシンが含まれていることが好ましく、グアノシンおよびシチジンが含まれていることがより好ましい。グアノシンのみを添加した場合であっても、一定の添加量以上であれば、ＮＴＰを添加した場合と同程度のタンパク質合成量を得ることができる。また、グアノシンおよびシチジンを添加した場合には、より少ない添加量で、４種類すべてのリボヌクレオシドを添加した場合と同程度の合成量であって、ＮＴＰを添加した場合よりも高い合成量を得ることができる。
添加するリボヌクレオシドの量は、それぞれ、０．１〜８ｍＭであることが好ましく、０．２〜１．６ｍＭであることがより好ましい。
なお、市販品のＮＴＰは、酵素法によって生産された高純度品であるため非常に高価である。一方、ＮＴＰの前駆体であるリボヌクレオシドはＮＴＰに比べて非常に安価である。例えば、それぞれ１ｇあたりの価格を比較すると、リボヌクレオシドは、対応するＮＴＰのおよそ１／２０〜１／３４０の価格である。さらに、一般的な無細胞タンパク質合成に添加されるＮＴＰのモル量（０．８〜１．２ｍＭ）は、本発明において添加されるリボヌクレオシドの好適なモル量（０．４ｍＭ）よりも多い。その結果、１ｍＬの無細胞タンパク質合成系反応液に要するＮＴＰおよびリボヌクレオシドの価格を比較すると、リボヌクレオシドを用いる場合には、ＮＴＰを用いる場合と比較して、およそ１／４７０となる。
また、ＮＴＰの代わりに、ＮＴＰよりも安価であるＮＭＰを用いる無細胞タンパク質合成系が従来知られているが（上記非特許文献３参照）、市販品のＮＭＰも、前駆体であるリボヌクレオシドと比較すると高価である。また、ＮＭＰを用いる合成系において、無細胞タンパク質合成に添加されるＮＭＰのモル量（０．８〜１．２ｍＭ）は、本発明において添加されるリボヌクレオシドの好適なモル量よりも多い。そのため、１ｍＬの無細胞タンパク質合成系反応液に要するＮＭＰおよびリボヌクレオシドの価格を比較すると、リボヌクレオシドを用いる場合には、安価な形態（ナトリウム塩、水和物、またはナトリウム塩の水和物）のＮＭＰを用いる場合と比較しても、およそ１／１２となる。
また、ＮＭＰを用いた場合には、タンパク質の合成量がＮＴＰを用いた場合よりも低くなることが示されている（上記非特許文献３および７参照）。このことは後述する実施例（実施例６）においても示されている。これらの結果からすると、リボヌクレオシドを使用した場合には、さらに合成量が低くなることが予想される。しかしながら驚くべきことに、リボヌクレオシドを使用した場合には、ＮＴＰを添加した場合よりも高い合成量を得ることができる。
さらに、ＮＭＰをＮＴＰにするには２分子のＡＴＰが必要であるのに対し、リボヌクレオシドをＮＴＰにするには３分子のＡＴＰが必要である。すなわち、リボヌクレオシドを使用した場合には、１分子のＡＴＰ分だけ余計にエネルギーを消費することになる。このことから、リボヌクレオシドを用いることは、タンパク質合成に不利に働くと想定される。また、リボヌクレオシドを使用した場合には、最終的にタンパク質が合成されるまでに関与する酵素数が増加するため、系の不安定化が想定される。これらのことからしても、リボヌクレオシドを使用した場合には、ＮＴＰを添加した場合よりも高い合成量を得ることができることは驚くべきことである。
（鋳型ＤＮＡ）
鋳型ＤＮＡとしては、発現させたい所望のタンパク質をコードする遺伝子配列と、適当な発現制御領域とが含まれている二本鎖ＤＮＡであればよく、直鎖状および環状の何れの形態であってもよい。
鋳型ＤＮＡとしては、発現させたい所望のタンパク質をコードする遺伝子配列と、適当な発現制御領域とが含まれている二本鎖ＤＮＡであればよく、直鎖状および環状の何れの形態であってもよい。
発現制御領域としては、プロモーター配列、ターミネーター配列、エンハンサー配列、ポリＡ付加シグナルおよびリボソーム結合配列などを含み得る。
また、合成されたタンパク質を迅速に精製、または検出するために、アフィニティー標識（タグ）配列を組み込んだ融合タンパク質が合成できるように鋳型ＤＮＡを設計することもできる。
添加する鋳型ＤＮＡの量は、０．１〜５０μｇ／ｍＬであることが好ましく、１〜１０μｇ／ｍＬであることがより好ましい。
（エネルギー再生系）
本発明の方法において、細胞抽出液を含む反応液には、さらにエネルギー再生系の成分を添加することが好ましい。エネルギー再生系の成分に制限はなく、例えば、クレアチンキナーゼとクレアチンリン酸との組合せ、およびホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとの組合せ等によるＡＴＰ再生系が使用可能である。クレアチンキナーゼおよびピルビン酸キナーゼは何れもＡＤＰをＡＴＰに再生する酵素であり、それぞれクレアチンリン酸およびホスホエノールピルビン酸を基質として必要とする。ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとの組合せ等の系を効率的に動かすにはＮＡＤおよびＣｏＡの２つの補酵素を加える必要がある。一方、クレアチンキナーゼとクレアチンリン酸との組合せの系では、これらの補酵素は不要である。そのため、クレアチンキナーゼとクレアチンリン酸との組合せを用いることが特に好ましい。
本発明の方法において、細胞抽出液を含む反応液には、さらにエネルギー再生系の成分を添加することが好ましい。エネルギー再生系の成分に制限はなく、例えば、クレアチンキナーゼとクレアチンリン酸との組合せ、およびホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとの組合せ等によるＡＴＰ再生系が使用可能である。クレアチンキナーゼおよびピルビン酸キナーゼは何れもＡＤＰをＡＴＰに再生する酵素であり、それぞれクレアチンリン酸およびホスホエノールピルビン酸を基質として必要とする。ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとの組合せ等の系を効率的に動かすにはＮＡＤおよびＣｏＡの２つの補酵素を加える必要がある。一方、クレアチンキナーゼとクレアチンリン酸との組合せの系では、これらの補酵素は不要である。そのため、クレアチンキナーゼとクレアチンリン酸との組合せを用いることが特に好ましい。
クレアチンキナーゼは０．０２〜５ｍｇ／ｍＬで使用されることが好ましく、クレアチンリン酸は１０〜１００ｍＭで使用されることが好ましい。
また、Ｊｅｗｅｔｔら（非特許文献：Jewett MC and Swartz JR, Biotechnol. Bioeng., 2004, 86(1), 19-26.）に記載のＰＡＮＯｘＳＰと呼ばれる、ホスホエノールピルビン酸およびＮＡＤ等を用いたＡＴＰ再生系、あるいは上記非特許文献３に記載のホスホエノールピルビン酸の代わりにグルコースを用いているＰＡＮＯｘＳＰの改良系では、大気中の酸素を必要とするため、反応液が空気に接触するように工夫した容器で反応を行う必要がある。一方、クレアチンキナーゼとクレアチンリン酸との組合せを用いたＡＴＰ再生系では、タンパク質の生産性に関し、酸素供給の有無による影響はない。したがって、ＡＴＰ再生系として、クレアチンキナーゼとクレアチンリン酸との組合せを用いた合成系の場合には、反応に際して特殊な容器を用いる必要はなく、そのため、大量調製のためのスケールアップが容易となる。
（補充的な成分および緩衝液）
反応液には、細胞抽出液、鋳型ＤＮＡおよびリボヌクレオシド、ならびにクレアチンキナーゼおよびホスホエノールピルビン酸等のエネルギー再生系のほかに、緩衝液、塩類、基質となるアミノ酸、核酸分解酵素阻害剤、抗菌剤、還元剤、ポリエチレングリコール、ｃＡＭＰ、葉酸類、ＲＮＡポリメラーゼおよびｔＲＮＡ等を含むことができる。
反応液には、細胞抽出液、鋳型ＤＮＡおよびリボヌクレオシド、ならびにクレアチンキナーゼおよびホスホエノールピルビン酸等のエネルギー再生系のほかに、緩衝液、塩類、基質となるアミノ酸、核酸分解酵素阻害剤、抗菌剤、還元剤、ポリエチレングリコール、ｃＡＭＰ、葉酸類、ＲＮＡポリメラーゼおよびｔＲＮＡ等を含むことができる。
緩衝液としては、例えば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、およびＴｒｉｓ−ＯＡｃ等の緩衝剤を使用できる。塩類としては、酢酸カリウム、酢酸マグネシウムおよび酢酸アンモニウム等の酢酸塩、ならびにグルタミン酸カリウム等のグルタミン酸塩等を使用できる。基質となるアミノ酸は、タンパク質を構成する天然の２０種類のアミノ酸およびこれらの誘導体である。抗菌剤としては、例えば、アジ化ナトリウムおよびアンピシリン等を使用できる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ等の市販の酵素を使用でき、鋳型ＤＮＡのプロモーター配列に適合するように適宜選択すればよい。
（タンパク質の合成キット）
細胞抽出液およびリボヌクレオシド、ならびに必要に応じて、緩衝液および塩類等のその他の成分は、使用しやすいように一定量ごと分注して製品として配送することができる。これらの製品は凍結または乾燥状態で保存することができ、保存および輸送に適した容器に収容してキットとして販売することができる。キットには取扱説明書および陽性コントロールＤＮＡ等を添付することができる。すなわち、本発明に係るタンパク質の合成キットは、上述のタンパク質の合成方法に使用されるキットであって、アデノシン、グアノシン、ウリジンおよびシチジンのうちの少なくとも何れか１種のリボヌクレオシドと、細胞抽出液とを含むものである。
細胞抽出液およびリボヌクレオシド、ならびに必要に応じて、緩衝液および塩類等のその他の成分は、使用しやすいように一定量ごと分注して製品として配送することができる。これらの製品は凍結または乾燥状態で保存することができ、保存および輸送に適した容器に収容してキットとして販売することができる。キットには取扱説明書および陽性コントロールＤＮＡ等を添付することができる。すなわち、本発明に係るタンパク質の合成キットは、上述のタンパク質の合成方法に使用されるキットであって、アデノシン、グアノシン、ウリジンおよびシチジンのうちの少なくとも何れか１種のリボヌクレオシドと、細胞抽出液とを含むものである。
（タンパク質の合成）
本発明に係るタンパク質の合成方法としては、透析法およびバッチ法を適用することができる。
本発明に係るタンパク質の合成方法としては、透析法およびバッチ法を適用することができる。
透析法は、反応液である内液と反応基質を含む外液とを透析膜（限外濾過膜）によって隔離して含む、振とうまたは攪拌可能な閉鎖系による合成法である。透析法では、透析膜を介して、合成に必要な基質が外液から反応液に供給されるとともに、反応液中の余計な副産物を外液中に拡散させることで、より長時間、反応を持続させることができる。そのため、より高いタンパク質合成量を得ることができ、大量（ミリグラム単位）のタンパク質を調製することができる。
透析法によってタンパク質を合成する場合には、４種類すべてのリボヌクレオシドを添加することが好ましい。
一方、バッチ法は、必要な成分すべてを反応溶液中に均一に混合して含ませて、反応を行う合成法である。透析法と比較するとタンパク質合成量は少ないものの、反応時間がより短く、結果がすぐに得られること、および一般的な９６穴プレート中で合成反応を行えることから、バッチ法は、ハイスループットスクリーニングに適した合成系といえる。
バッチ法においては、ＮＴＰを用いた合成系よりも、より長時間、タンパク質合成反応が持続する。そのため、本発明に係るタンパク質の合成方法をバッチ法にて実現した場合には、ＮＴＰを用いた合成系と比較して、より安価にタンパク質合成を実現できるばかりでなく、より高いタンパク質合成量を得ることができる。なお、ＮＭＰを用いた合成系では、このような効果はみられない。
バッチ法によってタンパク質を合成する場合には、４種類すべてのリボヌクレオシドを添加する方法に限らず、グアノシン１種類のみを添加する方法、またはグアノシンおよびシチジンのみを添加する方法であってもよい。バッチ法によれば、グアノシンのみを添加した場合であっても、添加量によっては、ＮＴＰを用いた合成系と同程度のタンパク質合成量を実現することができる。また、グアノシンおよびシチジンのみを添加した場合には、添加量によっては、ＮＴＰを用いた合成系を超える量のタンパク質合成量を実現することができ、４種類すべてのリボヌクレオシドを添加した場合と同程度のタンパク質合成量を実現することができる。グアノシンのみを添加する場合には、グアノシンの量は０．１〜８ｍＭが好ましく、１〜４ｍＭがより好ましい。また、グアノシンおよびシチジンのみを添加する場合には、グアノシンおよびシチジンの量はそれぞれ、０．１〜８ｍＭが好ましく、０．２〜１．６ｍＭがより好ましい。
合成されたタンパク質の精製は、生細胞を用いる場合と異なり破砕する必要がないことに加えて、生細胞からの分離と比べて混在する物質の量および種類が格段に少ないため、比較的容易に行うことができる。精製法は、タンパク質の性質に応じて従来公知のものを単独にまたは適宜組み合わせて使用できる。例えば硫酸アンモニウムもしくはアセトン沈殿、酸抽出、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動、およびクロマトフォーカシングなどの慣用の技術を挙げることができる。
また、合成されたタンパク質の同定および定量は、活性測定、免疫学的測定、分光学的測定、およびアミノ酸分析などによって、必要に応じて標準サンプルと比較しながら行うことができる。
（まとめ）
以上のように、本発明に係るタンパク質の合成方法は、無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の合成方法であって、タンパク質をコードする鋳型ＤＮＡと、アデノシン、グアノシン、ウリジンおよびシチジンのうちの少なくとも何れか１種のリボヌクレオシドとを、タンパク質合成用の細胞抽出液を含む反応液に添加することを特徴とする。
以上のように、本発明に係るタンパク質の合成方法は、無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の合成方法であって、タンパク質をコードする鋳型ＤＮＡと、アデノシン、グアノシン、ウリジンおよびシチジンのうちの少なくとも何れか１種のリボヌクレオシドとを、タンパク質合成用の細胞抽出液を含む反応液に添加することを特徴とする。
本発明に係るタンパク質の合成方法においては、少なくともグアノシンを添加することが好ましい。
本発明に係るタンパク質の合成方法においては、アデノシン、グアノシン、ウリジンおよびシチジンのうちの少なくとも何れか２種のリボヌクレオシドを添加することが好ましい。
本発明に係るタンパク質の合成方法においては、少なくともグアノシンおよびシチジンを添加することが好ましい。
本発明に係るタンパク質の合成方法において、上記細胞抽出液は細菌細胞から調製した抽出液であることが好ましい。
本発明に係るタンパク質の合成方法において、上記細胞抽出液は大腸菌から調製した抽出液であることが好ましい。
本発明に係るタンパク質の合成方法においては、ＡＴＰ再生系の成分を上記反応液に添加することが好ましい。
本発明に係るタンパク質の合成方法においては、上記ＡＴＰ再生系の成分として、クレアチンキナーゼおよびクレアチンリン酸を上記反応液に添加することが好ましい。
本発明に係るタンパク質の合成方法は、透析法による合成方法であり得る。
本発明に係るタンパク質の合成方法は、バッチ法による合成方法であり得る。
本発明に係るタンパク質の合成キットは、上述のタンパク質の合成方法に使用されるタンパク質の合成キットであって、アデノシン、グアノシン、ウリジンおよびシチジンのうちの少なくとも何れか１種のリボヌクレオシドと、細胞抽出液とを含むことを特徴とする。
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
〔実施例１：バッチ法によるＣＡＴタンパク質の合成〕
（合成反応条件）
バッチ法による無細胞合成系の反応液組成は、次の通りである：６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、２３０ｍＭ Ｄ−グルタミン酸カリウム、２％ ＰＥＧ８０００、３ｍＭ ＤＴＴ、０．４ｍＭ アデノシン、０．４ｍＭ グアノシン、０．４ｍＭ シチジン、０．４ｍＭ ウリジン、３６μｇ／ｍＬ フォリン酸、８０ｍＭ クレアチンリン酸、１５０μｇ／ｍＬ Ｅ.ｃｏｌｉ ｔＲＮＡ、１３ｍＭ 酢酸マグネシウム、各１．５ｍＭ タンパク質構成アミノ酸（ただしＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、およびＧｌｎについては４．５ｍＭ）、５０μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ、１００μｇ／ｍＬ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、４μｇ／ｍＬ 鋳型ＤＮＡ、および２４％ 大腸菌Ｓ３０抽出液。
（合成反応条件）
バッチ法による無細胞合成系の反応液組成は、次の通りである：６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、２３０ｍＭ Ｄ−グルタミン酸カリウム、２％ ＰＥＧ８０００、３ｍＭ ＤＴＴ、０．４ｍＭ アデノシン、０．４ｍＭ グアノシン、０．４ｍＭ シチジン、０．４ｍＭ ウリジン、３６μｇ／ｍＬ フォリン酸、８０ｍＭ クレアチンリン酸、１５０μｇ／ｍＬ Ｅ.ｃｏｌｉ ｔＲＮＡ、１３ｍＭ 酢酸マグネシウム、各１．５ｍＭ タンパク質構成アミノ酸（ただしＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、およびＧｌｎについては４．５ｍＭ）、５０μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ、１００μｇ／ｍＬ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、４μｇ／ｍＬ 鋳型ＤＮＡ、および２４％ 大腸菌Ｓ３０抽出液。
鋳型ＤＮＡには、ｐＫ７−ＣＡＴを用いた（非特許文献：Kim DM, Kigawa T, Choi CY, Yokoyama S (1996) EurJ Biochem 239:881-886）。このプラスミドはＴ７プロモーター、リボソーム結合配列、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、およびＴ７ターミネーターから構成されている。
大腸菌Ｓ３０抽出液は、Ｚｕｂａｙの方法（非特許文献：Zubay G., Ann Rev Genet, (1973) 7, 267-287）、およびＫｉｇａｗａらの方法（非特許文献：Kigawa T, Yabuki T, Matsuda N, Matsuda T, Nakajima R, Tanaka A, Yokoyama S. (2004) J Struct Funct Genomics 5, 63-68）に従って、大腸菌ＢＬ２１ ｃｏｄｏｎ−ｐｌｕｓ ＲＩＬ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）から調製した。
シチジン（Ｓｉｇｍａ社）、およびウリジン（Ｓｉｇｍａ社）はミリＱ水に溶解して、１００ｍＭの溶液として調製した。アデノシン（ナカライテスク社）、およびグアノシン（和光純薬社）は水への溶解度が低い（約０．２ｍＭ）ため、ミリＱ水を加えて、１００ｍＭの懸濁液を調製して実験に用いた。
なお、ＮＴＰを用いた対照としては、アデノシン、グアノシン、シチジン、およびウリジンの代わりに、１．３ｍＭ ＡＴＰ、０．９ｍＭ ＧＴＰ、０．９ｍＭ ＣＴＰ、および０．９ｍＭ ＵＴＰが添加されている。
反応は、３０℃で行った。
（ＣＡＴタンパク質の定量）
ＣＡＴタンパク質の合成量は、Ｋｉｇａｗａらの方法（非特許文献：Kigawa T, YabukiT, Matsuda N, Matsuda T, Nakajima R, Tanaka A, Yokoyama S. (2004) J Struct Funct Genomics 5, 63-68）に従って、比活性の値から求めた。結果を図１に示す。
ＣＡＴタンパク質の合成量は、Ｋｉｇａｗａらの方法（非特許文献：Kigawa T, YabukiT, Matsuda N, Matsuda T, Nakajima R, Tanaka A, Yokoyama S. (2004) J Struct Funct Genomics 5, 63-68）に従って、比活性の値から求めた。結果を図１に示す。
図１は、反応時間と合成量との関係を示す図である。図１に示されるように、ＮＴＰを添加した合成系の場合には、タンパク質合成反応は１時間程度で停止していた。一方、リボヌクレオシドを添加した合成系の場合には、タンパク質合成反応は２時間持続していた。その結果、リボヌクレオシドを添加した合成系では、ＮＴＰを添加した合成系と比較して、約１．４倍量のＣＡＴタンパク質が合成された。以上から、ＮＴＰの代わりにリボヌクレオシドを用いることによって、無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質合成が可能であるばかりでなく、ＮＴＰを用いた場合よりも合成量を増加させることができることが示された。
〔実施例２：ＥＧＦＰタンパク質、ＵＢＡタンパク質、Ｒａｓタンパク質、およびβガラクトシダーゼタンパク質の合成〕
実施例１と同様にして、Ｎ末端にＨｉｓタグを融合させたＥＧＦＰタンパク質（分子量３４ｋＤａ）、ＵＢＡタンパク質（分子量１０ｋＤａ）、Ｒａｓタンパク質（分子量２４ｋＤａ）およびβガラクトシダーゼタンパク質（分子量１１９ｋＤａ）の合成について比較を行った。
実施例１と同様にして、Ｎ末端にＨｉｓタグを融合させたＥＧＦＰタンパク質（分子量３４ｋＤａ）、ＵＢＡタンパク質（分子量１０ｋＤａ）、Ｒａｓタンパク質（分子量２４ｋＤａ）およびβガラクトシダーゼタンパク質（分子量１１９ｋＤａ）の合成について比較を行った。
（合成反応条件）
ＥＧＦＰタンパク質、ＵＢＡタンパク質、Ｒａｓタンパク質およびβガラクトシダーゼタンパク質の鋳型ＤＮＡとして、それぞれｐＣＲ２．１ ＮＨｉｓ−ＥＧＦＰ、ｐＣＲ２．１ Ｎ１１−ＵＢＡ、ｐＫ７ｂ２ ＮＨｉｓ−ＲａｓおよびｐＵＣ１９ Ｎ１１−β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅを用いた以外は、実施例１と同じである。これらのプラスミドは、構造遺伝子の上流に、Ｔ７プロモーターおよびリボソーム結合配列を有しており、下流に、Ｔ７ターミネーターを有している（非特許文献：Matsuda T, Kigawa T, KoshibaS, Inoue M, Aoki M, Yamasaki K, Seki M, Shinozaki K, Yokoyama S. (2006) J Struct Funct Genomics. 7(2), 93-100.参照）。
ＥＧＦＰタンパク質、ＵＢＡタンパク質、Ｒａｓタンパク質およびβガラクトシダーゼタンパク質の鋳型ＤＮＡとして、それぞれｐＣＲ２．１ ＮＨｉｓ−ＥＧＦＰ、ｐＣＲ２．１ Ｎ１１−ＵＢＡ、ｐＫ７ｂ２ ＮＨｉｓ−ＲａｓおよびｐＵＣ１９ Ｎ１１−β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅを用いた以外は、実施例１と同じである。これらのプラスミドは、構造遺伝子の上流に、Ｔ７プロモーターおよびリボソーム結合配列を有しており、下流に、Ｔ７ターミネーターを有している（非特許文献：Matsuda T, Kigawa T, KoshibaS, Inoue M, Aoki M, Yamasaki K, Seki M, Shinozaki K, Yokoyama S. (2006) J Struct Funct Genomics. 7(2), 93-100.参照）。
反応は、３０℃で４時間行った。
（ＥＧＦＰタンパク質、ＵＢＡタンパク質、Ｒａｓタンパク質、およびβガラクトシダーゼタンパク質のＨｉｓタグアフィニティ精製）
合成反応後の反応液を、１２，０００ｒｐｍで５分間、室温で遠心した。その上清８０μＬを、９６穴フィルタープレート（ミリポア社）に加え、そこに６０μＬのＡバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ）、および予めＡバッファーで平衡化した６０μＬの５０％ ＴＡＬＯＮ（登録商標）樹脂（ＴＡＫＡＲＡＢＩＯ社）を加えて、１０分間振とうした。フィルタープレートを１５００ｒｐｍで１分間遠心し、抽出液由来の夾雑タンパク質を除いた。ここで、目的のタンパク質はＴＡＬＯＮ樹脂に結合している。次に、１５０μＬのＡバッファーを加えて１５００ｒｐｍで１分間遠心する洗浄工程を、３回行った。最後に、５０μＬのＢバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭ イミダゾール）を加えて３分間振とう撹拌した後に１５００ｒｐｍで１分間遠心して粗精製タンパク質を得る溶出工程を２回行った。
合成反応後の反応液を、１２，０００ｒｐｍで５分間、室温で遠心した。その上清８０μＬを、９６穴フィルタープレート（ミリポア社）に加え、そこに６０μＬのＡバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ）、および予めＡバッファーで平衡化した６０μＬの５０％ ＴＡＬＯＮ（登録商標）樹脂（ＴＡＫＡＲＡＢＩＯ社）を加えて、１０分間振とうした。フィルタープレートを１５００ｒｐｍで１分間遠心し、抽出液由来の夾雑タンパク質を除いた。ここで、目的のタンパク質はＴＡＬＯＮ樹脂に結合している。次に、１５０μＬのＡバッファーを加えて１５００ｒｐｍで１分間遠心する洗浄工程を、３回行った。最後に、５０μＬのＢバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭ イミダゾール）を加えて３分間振とう撹拌した後に１５００ｒｐｍで１分間遠心して粗精製タンパク質を得る溶出工程を２回行った。
（ＥＧＦＰタンパク質、ＵＢＡタンパク質、Ｒａｓタンパク質、およびβガラクトシダーゼタンパク質の定量）
ＥＧＦＰタンパク質、ＵＢＡタンパク質、Ｒａｓタンパク質およびβガラクトシダーゼタンパク質の各粗精製タンパク質の定量は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準物質として、Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、ブラッドフォード法で行った。また、粗精製タンパク質についてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、分子量の確認を行った。結果を図２および３に示す。
ＥＧＦＰタンパク質、ＵＢＡタンパク質、Ｒａｓタンパク質およびβガラクトシダーゼタンパク質の各粗精製タンパク質の定量は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準物質として、Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、ブラッドフォード法で行った。また、粗精製タンパク質についてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、分子量の確認を行った。結果を図２および３に示す。
図２は、ブラッドフォード法により定量した各タンパク質の収量を示す図である。図３は、電気泳動の結果を示す図であり、レーンＡ〜Ｄは、鋳型ＤＮＡとしてそれぞれｐＣＲ２．１ ＮＨｉｓ−ＥＧＦＰ、ｐＣＲ２．１ Ｎ１１−ＵＢＡ、ｐＫ７ｂ２ ＮＨｉｓ−ＲａｓおよびｐＵＣ１９ Ｎ１１−β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅを用いた合成系由来の粗精製物であり、レーンＥは合成系に鋳型ＤＮＡを含まないコントロールの合成系由来の粗精製物である。図２に示されるように、リボヌクレオシドを添加した合成系の場合には、ＮＴＰを添加した合成系の場合と比較して、タンパク質の収量が約１．２倍〜１．４倍となり、より高い収量で得られた。また、図３に示されるように、リボヌクレオシドを添加した合成系において合成されたタンパク質は、ＮＴＰを添加した合成系の場合と同じく、目的のタンパク質の分子量を有するタンパク質であった。以上から、ごく小さなタンパク質から１００ｋＤａを超える高分子量タンパク質まで様々なタンパク質においても、ＮＴＰの代わりにリボヌクレオシドを用いることによって正しく合成が可能であるばかりでなく、ＮＴＰを用いた場合よりも収量を増加させることができることが示された。
〔実施例３：添加するリボヌクレオシドの種類による評価〕
添加するリボヌクレオシドの種類および量を変化させた場合のタンパク質の合成量について比較を行った。
添加するリボヌクレオシドの種類および量を変化させた場合のタンパク質の合成量について比較を行った。
（合成反応条件）
鋳型ＤＮＡとしてｐＣＲ２．１ ＮＨｉｓ ＧＦＰ−Ｓ１を用い、４種類のリボヌクレオシドのうち、いずれか１種類、２種類または３種類を、各０．１〜１．６ｍＭ添加した以外は、実施例１と同じである。プラスミドｐＣＲ２．１ ＮＨｉｓ ＧＦＰ−Ｓ１は、ＧＦＰ−Ｓ１タンパク質をコードする配列を有しており、この配列の上流にＴ７プロモーターおよびリボソーム結合配列を有しており、下流に、Ｔ７ターミネーターを有している（非特許文献：Seki E, Matsuda N, Yokoyama S, Kigawa T.（2008）Anal Biochem. 377(2):156-161.参照）。
鋳型ＤＮＡとしてｐＣＲ２．１ ＮＨｉｓ ＧＦＰ−Ｓ１を用い、４種類のリボヌクレオシドのうち、いずれか１種類、２種類または３種類を、各０．１〜１．６ｍＭ添加した以外は、実施例１と同じである。プラスミドｐＣＲ２．１ ＮＨｉｓ ＧＦＰ−Ｓ１は、ＧＦＰ−Ｓ１タンパク質をコードする配列を有しており、この配列の上流にＴ７プロモーターおよびリボソーム結合配列を有しており、下流に、Ｔ７ターミネーターを有している（非特許文献：Seki E, Matsuda N, Yokoyama S, Kigawa T.（2008）Anal Biochem. 377(2):156-161.参照）。
反応は、３０℃で３時間行った。
（ＧＦＰ−Ｓ１タンパク質の合成量の評価）
反応終了後、１０μＬの反応液に９０μＬのＰＢＳを加えて、４８５ｎｍ（励起光）／５３５ｎｍ（発光）の蛍光強度を測定することにより、ＧＦＰ−Ｓ１タンパク質の合成量を評価した。結果を図４に示す。
反応終了後、１０μＬの反応液に９０μＬのＰＢＳを加えて、４８５ｎｍ（励起光）／５３５ｎｍ（発光）の蛍光強度を測定することにより、ＧＦＰ−Ｓ１タンパク質の合成量を評価した。結果を図４に示す。
図４は各合成系におけるＧＦＰ−Ｓ１タンパク質由来の蛍光強度を示す図であり、（ａ）は、リボヌクレオシドとして少なくともアデノシンおよびグアノシンが添加されている合成系における結果を示しており、（ｂ）は、リボヌクレオシドとして少なくともアデノシンが添加されている合成系における結果を示しており、（ｃ）は、リボヌクレオシドとして少なくともグアノシンが添加されている合成系における結果を示しており、（ｄ）は、リボヌクレオシドとしてアデノシンおよびグアノシンのいずれもが添加されていない合成系における結果を示している。
図４（ａ）に示されるように、４種類のリボヌクレオシドを添加した場合には、０．１〜１．６ｍＭの範囲で安定した蛍光値が得られた。このことから、仮に、リボヌクレオシドの濃度が多少ずれたとしても、タンパク質合成は安定していることが示された。また、リボヌクレオシドは必ずしも４種類加える必要はなく、例えば、グアノシンおよびシチジンの２種類のみを添加した場合にも蛍光値の上昇が検出され、０．４ｍＭ以上のグアノシンおよびシチジンのみを添加した場合には、４種類すべてのリボヌクレオシドを添加した場合と同程度の蛍光値が得られた（図４（ｃ）参照）。これは、グアノシンまたはシチジンから、ＡＴＰおよびＵＴＰが合成されたものと推定される。
さらに、グアノシンのみを添加した場合にも蛍光値の上昇が検出され、１．２ｍＭ以上のグアノシンを添加した場合には、ＮＴＰを添加した場合と同程度の蛍光値が得られた（図４（ｃ）参照）。このことから、リボヌクレオシドを添加して合成を行う系において、グアノシンを添加することにより、合成量をより向上させることができることが示された。
〔実施例４：透析法によるＣＡＴタンパク質の合成〕
上述の実施例１では、バッチ法によりＣＡＴタンパク質の合成を行ったが、透析法によってもＣＡＴタンパク質の合成を試みた。
上述の実施例１では、バッチ法によりＣＡＴタンパク質の合成を行ったが、透析法によってもＣＡＴタンパク質の合成を試みた。
（合成反応条件）
透析法による無細胞合成系の内液組成は、次の通りである：６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、２３０ｍＭ Ｄ−グルタミン酸カリウム、４％ ＰＥＧ８０００、３ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％ ＮａＮ３、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、３６μｇ／ｍＬ フォリン酸、８０ｍＭ クレアチンリン酸、１７５μｇ／ｍＬ Ｅ.ｃｏｌｉ ｔＲＮＡ、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、各１．５ｍＭ タンパク質構成アミノ酸、１００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ、６０μｇ／ｍＬ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、１μｇ／ｍＬ 鋳型ＤＮＡ、および３０％ 大腸菌Ｓ３０抽出液。また、外液組成は、次の通りである：６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、２３０ｍＭ Ｄ−グルタミン酸カリウム、４％ ＰＥＧ８０００、３ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％ ＮａＮ３、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、３６μｇ／ｍＬ フォリン酸、８０ｍＭ クレアチンリン酸、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、各１．５ｍＭ タンパク質構成アミノ酸、３０％ 大腸菌Ｓ３０バッファー。
透析法による無細胞合成系の内液組成は、次の通りである：６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、２３０ｍＭ Ｄ−グルタミン酸カリウム、４％ ＰＥＧ８０００、３ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％ ＮａＮ３、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、３６μｇ／ｍＬ フォリン酸、８０ｍＭ クレアチンリン酸、１７５μｇ／ｍＬ Ｅ.ｃｏｌｉ ｔＲＮＡ、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、各１．５ｍＭ タンパク質構成アミノ酸、１００μｇ／ｍＬ クレアチンキナーゼ、６０μｇ／ｍＬ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、１μｇ／ｍＬ 鋳型ＤＮＡ、および３０％ 大腸菌Ｓ３０抽出液。また、外液組成は、次の通りである：６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、２３０ｍＭ Ｄ−グルタミン酸カリウム、４％ ＰＥＧ８０００、３ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％ ＮａＮ３、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、３６μｇ／ｍＬ フォリン酸、８０ｍＭ クレアチンリン酸、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、各１．５ｍＭ タンパク質構成アミノ酸、３０％ 大腸菌Ｓ３０バッファー。
アデノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジンの濃度は、内液および外液ともに、０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．８ｍＭ、１．２ｍＭまたは１．６ｍＭである。なお、ＮＴＰを用いた対照としては、内液および外液ともに、アデノシン、グアノシン、シチジン、およびウリジンの代わりに、１．３ｍＭ ＡＴＰ、０．９ｍＭ ＧＴＰ、０．９ｍＭ ＣＴＰ、および０．９ｍＭ ＵＴＰが添加されている。
鋳型ＤＮＡには、ｐＫ７−ＣＡＴを用いた。大腸菌Ｓ３０抽出液ならびにシチジン、ウリジン、アデノシンおよびグアノシンは実施例１と同様にして調製した。
反応は、３０℃で１４時間行った。
（ＣＡＴタンパク質の定量）
ＣＡＴタンパク質の定量方法は、実施例１と同様である。結果を図５に示す。
ＣＡＴタンパク質の定量方法は、実施例１と同様である。結果を図５に示す。
図５は、ＣＡＴタンパク質の合成量を比較した図である。図５に示されるように、０．８〜１．６ｍＭのリボヌクレオシドを添加した場合には、ＮＴＰを添加した場合の８０〜１０３％のＣＡＴタンパク質が合成されていた。すなわち、ミリグラム単位の大量調製に用いられる透析法においても、リボヌクレオシドを用いて、従来と同程度のタンパク質を合成できることが示された。
透析法を行う場合、通常、内液および外液の両方にＮＴＰを加える必要があり、外液には内液の１０倍の量を用いることが一般的である。すなわち、透析法ではより多くのＮＴＰが必要となるため、ＮＴＰを安価なリボヌクレオシドに入れ替えることによるコストの削減効果は、透析法において顕著である（図６参照）。
〔実施例５：ＮＴＰ合成の確認〕
上記実施例１の反応において、鋳型ＤＮＡおよびＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの何れをも添加していない反応液を調製し、反応開始前のサンプル、および反応開始から３０分後のサンプルを各３０μｌ回収し、５％ＴＣＡを等量加えて氷冷した。これを１２，０００ｒｐｍで５分間遠心を行い、得られた上清３９μＬに内部標準として２ｍＭ ＮＡＤを１μＬ加えた。この溶液２０μＬに含まれる各ヌクレオシドおよび各ＮＴＰの検出を、Ｃ１８カラムをつないだ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行った。結果を図７に示す。
上記実施例１の反応において、鋳型ＤＮＡおよびＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの何れをも添加していない反応液を調製し、反応開始前のサンプル、および反応開始から３０分後のサンプルを各３０μｌ回収し、５％ＴＣＡを等量加えて氷冷した。これを１２，０００ｒｐｍで５分間遠心を行い、得られた上清３９μＬに内部標準として２ｍＭ ＮＡＤを１μＬ加えた。この溶液２０μＬに含まれる各ヌクレオシドおよび各ＮＴＰの検出を、Ｃ１８カラムをつないだ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行った。結果を図７に示す。
図７（ａ）は、反応開始前のサンプルにおける結果を示しており、図７（ｂ）は、反応開始から３０分後のサンプルにおける結果を示している。図７に示されるように、反応開始直後に検出されていたアデノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジンのピークは、反応開始から３０分後には大幅に低減しており、一方で、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰのピークが増大していた。このことから、合成系内において、アデノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジンから、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰが合成されていることが確認できた。
〔実施例６：ＥＧＦＰタンパク質の合成〕
エネルギー再生系の成分として、（ｉ）クレアチンリン酸（ＣＰ）およびクレアチンキナーゼ（ＣＫ）、（ｉｉ）３０ｍＭ ＰＥＰ、０．３３ｍＭ ＮＡＤ、０．２６ｍＭ ＣｏＡおよび２．７ｍＭ シュウ酸ナトリウム、または（ｉｉｉ）３０ｍＭ グルコース、０．３３ｍＭ ＮＡＤ、０．２６ｍＭ ＣｏＡおよび１０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４を用い、かつ、ｐＫ７−ＣＡＴの代わりに、ｐＣＲ２．１ ＮＨｉｓ−ＥＧＦＰを用いたこと以外は、実施例１と同様にしてタンパク質の合成を行った。なお、ピルビン酸キナーゼは大腸菌Ｓ３０抽出液中に含まれているため、ピルビン酸キナーゼのさらなる添加は行っていない。反応は、３０℃で３時間行った。何れの場合にもさらなる対照として、リボヌクレオシドの代わりに、１．３ｍＭ ＡＭＰ、０．９ｍＭ ＧＭＰ、０．９ｍＭ ＣＭＰ、および０．９ｍＭ ＵＭＰを添加して、あるいはリボヌクレオシドおよびその代替物を添加せずに、タンパク質の合成を行った。反応終了後、実施例３と同様にして、４８５ｎｍ（励起光）／５３５ｎｍ（発光）の蛍光強度を測定することにより、ＥＧＦＰタンパク質の合成量を評価した。結果を図８に示す。
エネルギー再生系の成分として、（ｉ）クレアチンリン酸（ＣＰ）およびクレアチンキナーゼ（ＣＫ）、（ｉｉ）３０ｍＭ ＰＥＰ、０．３３ｍＭ ＮＡＤ、０．２６ｍＭ ＣｏＡおよび２．７ｍＭ シュウ酸ナトリウム、または（ｉｉｉ）３０ｍＭ グルコース、０．３３ｍＭ ＮＡＤ、０．２６ｍＭ ＣｏＡおよび１０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４を用い、かつ、ｐＫ７−ＣＡＴの代わりに、ｐＣＲ２．１ ＮＨｉｓ−ＥＧＦＰを用いたこと以外は、実施例１と同様にしてタンパク質の合成を行った。なお、ピルビン酸キナーゼは大腸菌Ｓ３０抽出液中に含まれているため、ピルビン酸キナーゼのさらなる添加は行っていない。反応は、３０℃で３時間行った。何れの場合にもさらなる対照として、リボヌクレオシドの代わりに、１．３ｍＭ ＡＭＰ、０．９ｍＭ ＧＭＰ、０．９ｍＭ ＣＭＰ、および０．９ｍＭ ＵＭＰを添加して、あるいはリボヌクレオシドおよびその代替物を添加せずに、タンパク質の合成を行った。反応終了後、実施例３と同様にして、４８５ｎｍ（励起光）／５３５ｎｍ（発光）の蛍光強度を測定することにより、ＥＧＦＰタンパク質の合成量を評価した。結果を図８に示す。
図８に示されるように、ＰＥＰを用いた場合であっても、リボヌクレオシドを添加することにより、添加しない場合と比較し、タンパク質の合成量が増加した。
また、ＣＰおよびＣＫを含む系においてＮＭＰを用いた場合、得られた蛍光値はＣＰおよびＣＫを含む系においてＮＴＰを用いた場合の約９割程度であったのに対し、ＣＰおよびＣＫを含む系においてリボヌクレオシドを用いた場合、得られた蛍光値はＣＰおよびＣＫを含む系においてＮＴＰを用い場合の約１.２倍であった。
本発明は、タンパク質の合成、機能の解析、および構造の解析を必要とする、製薬分野および保健医学分野をはじめ、生命科学分野の産業に広く利用することができる。
Claims (11)
- 無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の合成方法であって、
タンパク質をコードする鋳型ＤＮＡと、アデノシン、グアノシン、ウリジンおよびシチジンのうちの少なくとも何れか１種のリボヌクレオシドとを、タンパク質合成用の細胞抽出液を含む反応液に添加することを特徴とするタンパク質の合成方法。 - 少なくともグアノシンを添加することを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の合成方法。
- アデノシン、グアノシン、ウリジンおよびシチジンのうちの少なくとも何れか２種のリボヌクレオシドを添加することを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の合成方法。
- 少なくともグアノシンおよびシチジンを添加することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質の合成方法。
- 上記細胞抽出液は細菌細胞から調製した抽出液であることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載のタンパク質の合成方法。
- 上記細胞抽出液は大腸菌から調製した抽出液であることを特徴とする請求項５に記載のタンパク質の合成方法。
- ＡＴＰ再生系の成分を上記反応液に添加することを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載のタンパク質の合成方法。
- 上記ＡＴＰ再生系の成分として、クレアチンキナーゼおよびクレアチンリン酸を上記反応液に添加することを特徴とする請求項７に記載のタンパク質の合成方法。
- 透析法による合成方法であることを特徴とする請求項１〜８の何れか１項に記載のタンパク質の合成方法。
- バッチ法による合成方法であることを特徴とする請求項１〜８の何れか１項に記載のタンパク質の合成方法。
- 請求項１〜１０の何れか１項に記載のタンパク質の合成方法に使用されるタンパク質の合成キットであって、アデノシン、グアノシン、ウリジンおよびシチジンのうちの少なくとも何れか１種のリボヌクレオシドと、細胞抽出液とを含むことを特徴とするタンパク質の合成キット。
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