CN113215005A - 一种体外无细胞蛋白合成体系（d2p体系）、其试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种体外无细胞蛋白合成体系、其试剂盒及其应用，属于蛋白合成技术领域。本发明通过添加外源L‑阿拉伯糖对基于乳酸克鲁维酵母来源的体外无细胞蛋白合成体系进行改进，显著提高了体系的蛋白合成能力；进而还提供一种更高效、更高通量的体外蛋白合成试剂盒及外源蛋白的合成方法。本发明提供的改进方式无需分子改造即可实现，操作简单便捷，节约成本。

Description

一种体外无细胞蛋白合成体系(D2P体系)、其试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及蛋白质合成技术领域，特别涉及体外无细胞蛋白合成技术领域，具体涉及一种L-阿拉伯糖优化的体外无细胞蛋白合成体系(DNA-to-Protein体系，D2P体系)、其试剂盒及其应用。

背景技术

蛋白质是细胞中的重要分子，几乎参与了细胞所有功能的执行。蛋白质合成主要包括传统的细胞内合成技术和新一代的体外合成技术。传统的蛋白表达系统是指通过模式生物如细菌、真菌、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞等表达外源基因的一种分子生物学技术。体外蛋白质合成系统，也称为无细胞表达体系，在1960年代应运而生，其以外源的mRNA或DNA为蛋白质合成模板，通过人为控制添加蛋白质合成所需的底物、能量、以及转录和翻译相关蛋白因子等物质，实现目标蛋白质的合成。体外蛋白合成系统一般是指在细菌、真菌、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞的裂解物/提取物中，加入核酸模板(mRNA模板或者DNA模板)、RNA聚合酶、氨基酸、ATP等组分，完成外源蛋白的快速高效翻译。体外蛋白合成系统无需进行质粒构建、转化、细胞培养、细胞收集和破碎步骤，是一种相对快速、省时、便捷的蛋白质表达方式，是蛋白质领域的重要工具(―Garcia RA,Riley MR.Appliedbiochemistry and biotechnology.Humana Press.1981,263-264”；―Fromm HJ,HargroveM.Essentials of Biochemistry.2012”；CN109988801A；―Assenberg R,Wan PT,GeisseS,Mayr LM.Advances in recombinant protein expression for use inpharmaceutical research.Current Opinion in Structural Biology.2013,23(3):393-402”；―Anne Zemella,Lena Thoring,Christian Hoffmeister,and StefanKubick.Cell-free protein synthesis:pros and cons of prokaryotic and eukaryoticsystems.Chembiochem.2015,16:2420-2431”)。利用体外合成体系生产的蛋白质产品，可广泛应用于医药、食品、营养品、膳食补充剂、化妆品等各领域，包括但不限于PROTEINN^TM、普罗敦^TM、普敦^TM等蛋白质产品。

蛋白合成能力是决定体外蛋白合成体系是否能实现产业化的关键指标之一，主要包括合成效率、蛋白合成产量。为了提高蛋白合成产量，较多地从细胞提取物、能量系统、遗传模板、反应器及操作形式等方面进行改造(张绪.无细胞体系高效合成复杂膜蛋白的关键技术及工业应用探索[D].浙江大学,2014)，还包括探索尝试各种添加剂。其中，对细胞内蛋白合成起到有益效果的组分往往成为研究首选。不过，由于细胞内合成生物体系和体外合成微环境的巨大差异，效果并非可以简单预期，而是需要借助大量的实验加以筛选和验证。制备细胞提取物的细胞来源于不同菌种时，菌种之间的差异有时也会导致技术效果难以预料，尤其是制备细胞提取物的细胞来源在原核系统、真核系统之间改变，而体外蛋白合成机理又分别强烈依赖于来源菌种的专有属性时，极可能会产生显著的不可预期性，这已被本领域技术人员所公知。

克鲁维酵母(Kluyveromyces)是一种子囊孢子酵母。其中，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)是工业上广泛使用的酵母。与其它酵母相比，乳酸克鲁维酵母具有许多优点，如超强的分泌能力，更好的大规模发酵特性、食品安全的级别、还具有蛋白翻译后修饰的能力等。

为合成大量蛋白质，能量的供应是影响系统效率和成本的关键问题之一。现有的能量供应系统包括糖类与磷酸盐能量体系、磷酸肌酸与磷酸肌酸酶体系、单糖或糖原及其酵解中间产物能量体系等类型。单糖、寡糖、多糖都有用于构建或优化体外无细胞蛋白合成体系的能量系统(Anderson M J,Stark J C,Hodgman C E and Jewett M C.Energizingeukaryotic cell-free protein synthesis with glucose metabolism[J].FEBSLetters,2015,589(15):1723-1727)。

综上所述，如何改进基于乳酸克鲁维酵母来源的体外无细胞蛋白合成体系，仍存在许多技术空白尚待解决。

发明内容

针对上述技术问题，本发明公开一种简单、便捷、更高效、更高通量的体外无细胞蛋白合成体系，该体系基于乳酸克鲁维酵母细胞提取物，通过添加L-阿拉伯糖进行优化，能够显著提高蛋白合成能力。

本发明第一方面提供一种体外无细胞蛋白合成体系，所述体外无细胞蛋白合成体系包括乳酸克鲁维酵母细胞提取物、外源L-阿拉伯糖；所述体外无细胞蛋白合成体系能够与编码外源蛋白的核酸模板进行反应，合成外源蛋白。

所述外源L-阿拉伯能够提高外源蛋白表达量。

优选地，所述外源L-阿拉伯糖的添加量，根据以C_L-ara为自变量、以Y_PRT为因变量、其它反应参数确定时的浓度曲线中的Y_PRT值确定浓度区间。

本发明中，

C_L-ara，指外源L-阿拉伯糖的浓度。

Y_PRT，指本发明的体外无细胞蛋白合成体系中外源蛋白的表达量。

本发明的“外源L-阿拉伯糖的浓度曲线”，如无特别说明，指本发明的体外无细胞蛋白合成体系中，以C_L-ara为自变量、以Y_PRT为因变量、其它反应参数确定时的浓度曲线，也记为“Y_PRT(C_L-ara)浓度曲线”，本发明中还记为Y_PRT～C_L-ara浓度曲线。

所述“其它反应参数”包括但不限于：除L-阿拉伯糖以外的其它体系组分(包括种类、浓度等)、反应原料的添加方式、反应温度程序、反应时间长度、反应容器的性质、反应体系体积，等等。

CFS(ara-)基础体系，本发明中，将“未添加L-阿拉伯糖的体外无细胞蛋白合成体系”称为CFS(ara-)基础体系。一个基础体系可对应多个Y_PRT～C_L-ara浓度曲线。一个基础体系可以在不同的反应温度程序下反应，还可以反应不同的时间长度，由此可以产生若干不同的Y_PRT～C_L-ara浓度曲线。

Y_max，指外源L-阿拉伯糖的浓度曲线中外源蛋白的最高表达量。

C_max，指外源L-阿拉伯糖的浓度曲线中Y_max所对应的外源L-阿拉伯糖的浓度。

Y_min，指Y_PRT(C_L-ara)浓度曲线中，Y_PRT>Y₀的区间范围内外源蛋白的最低表达量。

Y₀，指Y_PRT(C_L-ara)浓度曲线中，C_L-ara＝0时对应的外源蛋白表达量。

Y_Δ，为Y_max与Y₀的差值，数值上，Y_Δ＝Y_max-Y₀。

所述C_L-ara选自，外源L-阿拉伯糖的浓度曲线中，外源蛋白表达量大于Y₀时外源L-阿拉伯糖的浓度区间。本发明中，所述C_L-ara选自，Y_PRT(C_L-ara)浓度曲线中外源蛋白表达量(Y_PRT)大于Y₀时的浓度区间。上述可选的浓度区间可以为连续的，也可以为不连续的。

优选地，所述C_L-ara选自Y_PRT≥Y₀+50％Y_Δ时外源L-阿拉伯糖的浓度区间(即Y_min＝Y₀+50％Y_Δ)。

更优选地，所述C_L-ara选自Y_PRT≥Y₀+60％Y_Δ时外源L-阿拉伯糖的浓度区间(即Y_min＝Y₀+60％Y_Δ)。

更优选地，所述C_L-ara选自Y_PRT≥Y₀+70％Y_Δ时外源L-阿拉伯糖的浓度区间(即Y_min＝Y₀+70％Y_Δ)。

更优选地，所述C_L-ara选自Y_PRT≥Y₀+80％Y_Δ时外源L-阿拉伯糖的浓度区间(即Y_min＝Y₀+80％Y_Δ)。

更优选地，所述C_L-ara选自Y_PRT≥Y₀+90％Y_Δ时外源L-阿拉伯糖的浓度区间(即Y_min＝Y₀+90％Y_Δ)。

更优选地，所述C_L-ara选自Y_PRT≥Y₀+95％Y_Δ时外源L-阿拉伯糖的浓度区间(即Y_min＝Y₀+95％Y_Δ)。

最优选地，所述C_L-ara为外源蛋白最高表达量时对应的外源L-阿拉伯糖浓度值C_max。

优选方式之一，所述外源L-阿拉伯糖的浓度为2mM～400mM。

优选方式之一，所述外源L-阿拉伯糖的浓度为5mM～150mM。

优选方式之一，所述外源L-阿拉伯糖的浓度选自：6mM～110mM、5mM～50mM、4.8mM～36mM。

优选方式之一，所述外源L-阿拉伯糖的浓度选自：7.56mM、7.5mM、7.6mM、28.84mM、29mM或30mM。

优选地，所述体外无细胞蛋白合成体系含有能够识别核酸模板上的启动子元件的体系组分，使得所述体外无细胞蛋白合成体系能够识别编码外源蛋白的核酸模板的启动子元件；例如所述体外无细胞蛋白合成体系含有与启动子元件相应的RNA聚合酶。

所述能够识别核酸模板上的启动子元件的体系组分(例如相应的RNA聚合酶)，可以由所述乳酸克鲁维酵母细胞提取物提供，也可以通过其他外源组分提供，还可以通过两种或两种以上方式的组合方式提供。

优选地，所述体外无细胞蛋白合成体系还包括RNA聚合酶。所述RNA聚合酶的来源包括但不限于：含内源性表达的RNA聚合酶的细胞提取物、外源RNA聚合酶、编码RNA聚合酶的外源核酸模板的翻译产物、或者其组合。上述各技术方案，各自独立地优选所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶。所述编码RNA聚合酶的外源核酸模板，经体系的体外蛋白合成反应，可翻译为RNA聚合酶。

优选方式之一，所述体外无细胞蛋白合成体系还包括DNA聚合酶。所述DNA聚合酶的来源包括但不限于：含内源性表达的DNA聚合酶的细胞提取物、外源DNA聚合酶、编码DNA聚合酶的外源核酸模板的翻译产物、或者其组合。上述各技术方案，各自独立地优选所述DNA聚合酶为phi29 DNA聚合酶。所述编码DNA聚合酶的外源核酸模板，经体系的体外蛋白合成反应，可翻译为DNA聚合酶。

所述RNA聚合酶、DNA聚合酶各自独立地，可以通过外源方式直接添加，或者以反应产物或中间产物的方式提供(如添加编码RNA聚合酶或/和编码DNA聚合酶的外源核酸模板)。

优选方式之一，所述乳酸克鲁维酵母细胞提取物中含有内源性表达的RNA聚合酶。更优选地，所述乳酸克鲁维酵母细胞提取物中含有内源性表达的T7 RNA聚合酶。

优选方式之一，所述乳酸克鲁维酵母细胞提取物中含有内源性表达的RNA聚合酶。更优选地，通过对乳酸克鲁维酵母进行内源性菌株改造后制备细胞提取物实现，包括但不限于以下内源性菌株改造方式：将RNA聚合酶的编码序列插入到细胞内游离质粒、或者将RNA聚合酶的编码基因整合到细胞基因组、或者采用前述两种方式的组合方式。需要说明的是，在进行上述内源性菌株改造时，除整合入上述编码序列/编码基因外，还允许插入其它核苷酸序列，比如非编码序列、密码子序列、增强子序列、标签序列等等。通过上述内源性菌株改造，使改造菌株可以内源性表达RNA聚合酶。所述RNA聚合酶优选T7 RNA聚合酶。

优选方式之一，所述体外无细胞蛋白合成体系包括外源添加的T7 RNA聚合酶。

优选方式之一，所述体外无细胞蛋白合成体系包括以下至少一种组分：外源性RNA聚合酶、外源性DNA聚合酶。

优选方式之一，所述体外无细胞蛋白合成体系还包括能量系统；所述能量系统优选选自：糖(如，单糖、二糖、寡糖、多糖)与磷酸盐能量体系、糖与磷酸肌酸能量体系、磷酸肌酸与磷酸肌酸酶体系、磷酸肌酸与磷酸肌酸激酶体系、糖酵解途径及其中间产物能量体系(例如，单糖及其酵解中间产物能量体系、糖原及其酵解中间产物)、或者其组合。

优选方式之一，所述体外无细胞蛋白合成体系还包括合成蛋白的底物；所述合成蛋白的底物优选为氨基酸混合物，至少包括合成外源蛋白所需的氨基酸混合物。优选地，所述氨基酸混合物为天然氨基酸的混合物。

优选方式之一，所述含体外无细胞蛋白合成体系还包括合成RNA的底物；所述合成RNA的底物优选为核苷酸混合物，选自：核苷单磷酸、核苷三磷酸、或者其组合。

优选方式之一，所述体外无细胞蛋白合成体系中还包括以下至少一种组分：拥挤剂、镁离子、钾离子、抗氧化剂或还原剂、海藻糖、反应促进剂、缓冲剂、水性溶剂；

所述拥挤剂优选聚乙二醇、葡聚糖、Ficoll蔗糖聚合物(如

试剂，一种非离子型合成蔗糖聚合物)、或者其组合；

镁离子源优选选自：天门冬氨酸镁、醋酸镁、谷氨酸镁、氯化镁、磷酸镁、硫酸镁、柠檬酸镁、磷酸氢镁、碘化镁、乳酸镁、硝酸镁、草酸镁、或者其组合；

钾离子源优选选自：醋酸钾、谷氨酸钾、氯化钾、磷酸钾、硫酸钾、柠檬酸钾、磷酸氢钾、碘化钾、乳酸钾、硝酸钾、草酸钾、或者其组合；

所述抗氧化剂或还原剂优选为二硫苏糖醇(DTT)；

所述反应促进剂优选为氧化铝；

所述缓冲剂优选选自：Tris-HCl、Tris碱、HEPES、或者其组合；

所述水性溶剂优选为缓冲剂。

所述体外无细胞蛋白合成体系能够与编码外源蛋白的DNA模板或mRNA模板进行反应，合成外源蛋白。

上述各优选方式可以以任意合适的方式结合。

本发明第二方面提供一种体外蛋白合成试剂盒，所述试剂盒包括：

(i)第一方面所提供的体外无细胞蛋白合成体系；

(ii)可选地包括编码外源蛋白的核酸模板；

(iii)标签或说明书。

利用该试剂盒，可以进行体外蛋白合成反应，合成外源蛋白。

本发明第三方面提供一种外源蛋白的合成方法，所述合成方法包括以下步骤：

(i)提供本发明第一方面所提供的体外无细胞蛋白合成体系；

所述“提供”的方式包括但不限于：获取、制备；

(ii)向步骤(i)所述体外无细胞蛋白合成体系中添加编码外源蛋白的核酸模板，孵育反应，合成所述外源蛋白。

还可选地包括步骤(iii)分离或/和检测所述外源蛋白。

第二方面和第三方面中，所述编码外源蛋白的核酸模板为DNA模板、mRNA模板、或者其组合；各自独立地，所述编码外源蛋白的核酸模板优选为DNA模板。

为了进行体外蛋白合成反应，所述编码外源蛋白的核酸模板优选地含有能够被体系组分所识别的启动子元件。

优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板含有所述乳酸克鲁维酵母细胞提取物能够识别的启动子元件。例如，乳酸克鲁维酵母细胞提取物中含有内源性表达的、与核酸模板上启动子元件相对应的RNA聚合酶。

优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板中含有T7启动子，所述体外无细胞蛋白合成体系包括T7 RNA聚合酶。

优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板中含有T7启动子，所述乳酸克鲁维酵母细胞提取物包括内源性表达的T7 RNA聚合酶。

优选地，外源蛋白的基因转录过程由核酸模板上的T7启动子启动。

优选方式之一，外源蛋白的基因转录过程由核酸模板上的T7启动子启动，所述体外无细胞蛋白合成体系包括T7 RNA聚合酶。

优选方式之一，T7启动子位于核酸模板外源蛋白的编码序列的上游，启动外源蛋白的转录程序，体系组分之一的乳酸克鲁维酵母细胞提取物中含有内源性表达的T7 RNA聚合酶。

本发明第四方面提供第一方面所述体外无细胞蛋白合成体系的应用，用于蛋白合成方面。所述用于蛋白合成方面，包括但不限于应用于蛋白制造方面，或者应用于基于蛋白合成的检测等方面。

本发明第五方面提供L-阿拉伯糖在第一方面所述体外无细胞蛋白合成体系中的应用，或在第二方面所述体外蛋白合成试剂盒中的应用，或在第三方面所述外源蛋白的合成方法中的应用。

有益效果：

本发明采用的体外无细胞蛋白合成体系，采用乳酸克鲁维酵母来源的细胞提取物，添加L-阿拉伯糖进行优化，意外地能够显著提高体系的蛋白合成产量(普遍提高了15％以上，甚至提高了100％)。本发明提供的改进方式无需分子改造即可实现，操作简单，节约成本。

据文献报道，葡萄糖、甘露糖、半乳糖、乳糖等六碳糖和木糖、阿拉伯糖等五碳糖均可在马克斯克鲁维酵母体系中作为代谢底物(侯胜博,冯华良,高教琪等.马克斯克鲁维酵母的木糖和阿拉伯糖发酵[J].生物工程学报,2017,33(6):923-935)。不过，在同为克鲁维酵母的乳酸克鲁维酵母体系中，L-阿拉伯糖、柠檬酸盐、D-或L-岩藻糖等组分却并不能作为碳源用以提供能量(RC Dickson and JS Markin.Physiological studies ofβ-galactosidase induction in Kluyveromyces lactis[J].Journal of Bacteriology,1980,142(3):777-785)。

按照现有技术的教导，L-阿拉伯糖并不适于作为碳源改善乳酸克鲁维酵母体外无细胞蛋白合成体系。事实上，在现有报道中，也确实没有基于乳酸克鲁维酵母细胞提取物的体外蛋白合成体系采用L-阿拉伯糖作为添加剂。而在本发明中，我们偶然地意外发现，L-阿拉伯糖可以显著地改善基于乳酸克鲁维酵母细胞提取物的体外无细胞蛋白合成体系的外源蛋白合成能力，特别是提高了外源蛋白合成产量。推测L-阿拉伯糖可能起到稳定蛋白的作用。

附图说明

图1、编码外源蛋白mEGFP的质粒DNA模板的结构示意图，记为D2P质粒或pD2P。所述mEGFP为增强型绿色荧光蛋白的突变体。该质粒DNA模板包括以下元件：T7启动子(能够被T7RNA聚合酶识别)、5’非编码区、前导序列(可选元件)、纯化标签(可选元件)、外源蛋白mEGFP的编码序列、3’非编码区、复制起始位点、AmpR启动子、氨苄青霉素抗性基因、高拷贝数复制起始位点、控制质粒拷贝数的基因(rop基因，图中未标示)、Lac抑制子(lacI)的编码序列、LacI启动子。

图2、L-阿拉伯糖的添加浓度对体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成产量的影响(外源L-阿拉伯糖的浓度曲线)。对应实施例1。体外无细胞蛋白合成体系中，L-阿拉伯糖的浓度为变量，浓度范围6.05mM～110.01mM。其中，BC组为空白对照，不添加L-阿拉伯糖，添加质粒DNA；NC组为阴性对照，不添加L-阿拉伯糖，也不添加质粒DNA模板。

图3、L-阿拉伯糖的添加浓度对体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成产量的影响(外源L-阿拉伯糖的浓度曲线)。对应实施例2。体外无细胞蛋白合成体系中，L-阿拉伯糖的浓度为变量，浓度范围6.05mM～110.00mM。其中，BC组为空白对照，不添加L-阿拉伯糖，添加质粒DNA；NC组为阴性对照，不添加L-阿拉伯糖，也不添加质粒DNA模板。

图4、L-阿拉伯糖的添加浓度对体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成产量的影响(外源L-阿拉伯糖的浓度曲线)。对应实施例3。体外无细胞蛋白合成体系中，L-阿拉伯糖的浓度为变量，浓度范围4.84mM～45.06mM。其中，BC组为空白对照，不添加L-阿拉伯糖，添加质粒DNA；NC组为阴性对照，不添加L-阿拉伯糖，也不添加质粒DNA模板。

图5、不同体外无细胞蛋白合成体系的RFU值对比。“L-ara-29mM”对应添加29mM L-阿拉伯糖(且不添加葡萄糖)，“L-ara-15mM”对应添加15mM L-阿拉伯糖(且不添加葡萄糖)、“Glu-15mM”对应添加15mM葡萄糖(且不添加L-阿拉伯糖)，NC为阴性对照组(不添加L-阿拉伯糖，不添加葡萄糖，也不添加外源DNA模板)。

核苷酸和/或氨基酸序列表

SEQ ID No.:1，为外源蛋白mEGFP的基因序列，长度为717个碱基，其中含终止密码子TAA。

SEQ ID No.:2，为外源蛋白mEGFP的氨基酸序列，共238个氨基酸。

具体实施方式

本发明术语、名词、短语的含义。本部分的含义解释适用于本发明的全文，既适用于下文，也适用于上文。

D2P，DNA-to-Protein，从DNA模板到蛋白质产物。比如，D2P技术、D2P体系、D2P方法等等。

IVTT，in vitro transcription translation，体外转录翻译。

RFU，相对荧光单位值(Relative Fluorescence Unit)。

L-ara，L-arabinose，L-阿拉伯糖。

eGFP：增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein)。

mEGFP：eGFP的A206K突变体。

wt％或％(wt)：为质量浓度单位，均表示质量百分比。

(v/v)％或％(v/v)：均表示体积百分比。

％(w/v)：质量体积浓度单位，对应于g/100mL。

Ficoll蔗糖聚合物：如无特别说明，特指

试剂，一种非离子型合成蔗糖聚合物，是由蔗糖和环氧氯丙烷共聚而成的一种高度分支化的聚合物，可选自市售产品。举例如Ficoll-400(聚蔗糖400，CAS:26873-85-8)、Ficoll-70(聚蔗糖70，CAS：72146-89-5)。其中，

PM 400(Sigma Aldrich)是由蔗糖和环氧氯丙烷共聚而成的一种高度分支化的聚合物，平均分子量400kg/mol；

PM 70(Sigma Aldrich)的平均分子量为70kg/mol。

“本发明的表达系统”、“本发明的体外表达系统”、“体外无细胞表达系统”、“体外无细胞表达体系”可互换使用，指本发明的体外蛋白表达体系，也可采用其它，如：蛋白质体外合成系统、体外蛋白合成体系、无细胞系统、无细胞蛋白合成体系、无细胞体外蛋白合成体系、体外无细胞蛋白合成体系、体外无细胞合成体系、CFS体系(cell-free system)、CFPS体系(cell-free protein synthesis system)等描述方式。包括体外翻译体系、体外转录翻译体系(IVTT体系)等。本发明中，优选IVTT体系。我们还将体外蛋白合成系统称为“蛋白质合成工厂”(Protein Factory)。体外蛋白合成反应，是指在体外无细胞合成体系中合成蛋白的反应，至少包括翻译过程。包括但不限于IVTT反应(体外转录翻译反应)。本发明中，优选IVTT反应。IVTT反应，对应IVTT体系，是在体外将DNA转录翻译为蛋白质(Protein)的过程，因此，我们还将这类的体外蛋白合成体系称为D2P体系、D-to-P体系、D_to_P体系、DNA-to-Protein体系；相应的体外蛋白合成方法，还称为D2P方法、D-to-P方法、D_to_P方法、DNA-to-Protein方法。

翻译后修饰：也称翻译后加工，post-translational modification，PTM。PTM系统对于蛋白质的正常折叠、活性和稳定性具有重大作用。

本发明中，“翻译相关元件”，指从核酸模板到蛋白质产物合成过程中所需的相关功能元件，不限于翻译过程需要的功能元件；当核酸模板为DNA时，还广义地包括转录过程中需要的功能元件。所述翻译相关元件，可通过细胞提取物(各种内源性因子)、体外蛋白合成体系的其它外源组分(如外源RNA聚合酶、辅助因子等)、核酸模板上的功能元件(如控制外源蛋白转录/翻译的功能元件、抗性基因翻译系统、Lac抑制子翻译系统、控制质粒拷贝数的翻译系统等)等方式提供。所述控制外源蛋白转录/翻译的功能元件，举例如启动子、终止子、增强子、IRES元件、信号序列、前导序列、(如筛选标记标签、纯化标签、增强翻译水平的标签)等。

基因：包括编码区和非编码区。

核苷酸序列：由核苷酸单元构成的序列。

核酸序列：核酸物质的序列，包括DNA序列、RNA序列。

编码序列：coding sequence，缩写为CDS。与蛋白质的密码子完全对应的核苷酸序列，该序列中间不含其它非该蛋白质对应的序列(不考虑mRNA加工等过程中的序列变化)。

编码基因：编码蛋白质的有效基因片段，可以为连续的，也可以为不连续的。编码基因中必然包括编码序列。

核酸模板：指作为蛋白合成模板的核酸序列，包括DNA模板和mRNA模板。本发明的任一个实施方式中，所述核酸模板各自独立地可以为DNA模板、mRNA模板、或者其组合。本发明的任一个实施方式中，所述核酸模板可各自独立地优选为DNA模板。本发明中，如无特别说明，编码外源蛋白的核酸模板优选为DNA模板。

“编码X蛋白的核酸模板”指核酸模板中含有该X蛋白的编码序列，以该核酸模板为基础可以经翻译过程或者经转录翻译过程合成X蛋白，而且允许该核酸模板中含有非编码区，还允许含有除X蛋白以外的其它多肽或蛋白的编码序列。例如“编码RNA聚合酶的核酸模板”，至少包括RNA聚合酶的编码序列，此外还允许包括非编码区、融合标签等其它核酸序列；相应的表达产物至少含有RNA聚合酶结构，可以为RNA聚合酶分子或其融合蛋白，还可以为包括RNA聚合酶分子或/和其融合蛋白的混合组分。

内源/内源性：依赖于活性细胞代谢活动。内源性表达的蛋白由细胞培养时内源性分泌，可经处理后存在于本发明的细胞提取物中。

外源/外源性：不依赖活性细胞代谢活动。外源组分直接添加到体外蛋白合成体系中，而非通过加入细胞或细胞提取物的方式添加。如：外源性RNA聚合酶可通过加入前体(比如，无活性的前体，可经酶切或其他方式激活后生成RNA聚合酶)、核酸模板(可经体系翻译合成蛋白)、融合蛋白、、单质或混合物的外源方式添加到反应体系中。再如：外源性DNA聚合酶也可通过上述的外源方式添加到反应体系中。

外源蛋白：本发明的体外蛋白合成体系的目的表达产物，并非由宿主细胞分泌合成。可以为蛋白、融合蛋白、含蛋白或融合蛋白的混合物；还广义地包括多肽。基于编码外源蛋白的核酸模板进行体外蛋白合成反应后所得产物，可以为单一物质，也可以为混合物。

“编码RNA聚合酶的核酸模板(或编码DNA聚合酶的核酸模板)”，至少包括RNA聚合酶(或DNA聚合酶)的编码序列，此外还允许包括非编码区、融合标签等其它核酸序列；相应地表达产物至少含有RNA聚合酶结构(或DNA聚合酶结构)。以RNA聚合酶为例，可以为RNA聚合酶分子或其融合蛋白，还可以为包括RNA聚合酶分子或/和其融合蛋白的混合组分。

肽，是两个或两个以上氨基酸以肽键相连的化合物。本发明中，肽与肽段具有同等含义，可互换使用。

多肽，10～50个氨基酸组成的肽。

蛋白，50个以上的氨基酸组成的肽。融合蛋白也是一种蛋白。

外源RNA聚合酶：与外源性RNA聚合酶具有相同含义。

外源DNA聚合酶：与外源性DNA聚合酶具有相同含义。

本发明中，细胞提取物、细胞提取液、细胞裂解物、细胞破碎物、细胞溶解产物的含义相同，英文可采用cell extract、cell lysate等描述方式。

本发明中，能量体系、能量系统、能量供应体系具有同等含义，可互换使用。能量再生体系、能量再生系统具有同等含义，可互换使用。能量再生系统是能量系统的优选实施方式或者组成部分。

氨基酸混合物，指含有至少两种以上氨基酸的混合物。

本发明中，如无特别说明，所述氨基酸可以为天然氨基酸，也可以为非天然氨基酸，可以为_L-氨基酸、_D-氨基酸或者其组合，还可以为放射性同位素标记的氨基酸、经修饰的氨基酸等结构。所述经修饰的氨基酸，指连接有化学修饰基团的氨基酸，其结构没有特别限制，包括但不限于通过氨基酸侧基进行修饰。

拥挤剂，crowding agent，用于模拟细胞内拥挤的大分子环境的试剂。参考文献“XGe,D Luo and J Xu.Cell-free protein expression under macromolecular crowdingconditions[J].PLoS One,2011,6(12):e28707”及其引用文献等。

磷酸化合物，包括有机物和无机物。

磷酸盐，如无特别说明，指无机磷酸盐。

本发明中，“常温”优选室温至37℃，具体地，优选20℃～37℃，更优选25℃～37℃。

本发明中，“优选”、“较佳”、“更佳”、“最优选”等优选实施方式，并非用于限定本发明的实施方式，仅用于提供技术效果更好的实施方式的举例。

本发明的描述中，对于“优选方式之一”、“优选实施方式之一”、“优选例之一”、“优选例”、“在一优选的实施方式中”、“优选为”、“优选”、“优选地”、“更优选”、“更优地”、“进一步优选”、“最优选”等优选方式，以及“实施方式之一”、“方式之一”、“示例”、“具体示例”、“举例如”、“作为举例”、“例如”、“比如”、“如”等示意的列举方式，各方式所描述的具体特征包含于本发明的至少一个具体实施方式中。本发明中，各方式所描述的具体特征可以在任何的一个或者多个具体实施方式中以合适的方式结合。本发明中，各优选方式对应的技术方案也可以以任意合适的方式结合；举例如，可以同时加入外源RNA聚合酶、外源DNA聚合酶，参考专利类文献CN108642076A。

本发明中，“可选地”，表示可以有，也可以无。

本发明中，“一个或多个”、“一种或多种”等“一或多”的描述，与“至少一个”、“至少一种”等具有相同含义，表示数量上等于“1”或“大于1”。

本发明中，采用“或/和”、“和/或”表示“任选其一或者任选其组合”，也表示至少其一。举例如“包括合成RNA的底物和/或合成蛋白的底物”，表示可以仅包括合成RNA的底物，可以仅包括合成蛋白的底物，还可以同时包括合成RNA的底物和合成蛋白的底物。

在本发明提及的所有文献及这些文献直接引用或者间接引用的文献，都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(包括但不限于实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案，只要能够体外合成外源蛋白或者优选地高效合成外源蛋白即可。限于篇幅，在此不再一一累述。

本发明提供一种体外无细胞蛋白合成体系，所述体外无细胞蛋白合成体系基于乳酸克鲁维酵母细胞提取物，且体系中含有外源L-阿拉伯糖；该体系能够与编码外源蛋白的核酸模板进行反应，合成外源蛋白。

所述外源L-阿拉伯能够提高外源蛋白表达量。

通过能够实现“表达外源蛋白”的技术功能的限定，本发明仅涵盖那些能够实现上述功能的技术特征的组合方式，不能实现上述功能的技术特征的组合方式当然地排除在本发明范畴之外。也即，所述体外无细胞蛋白合成体系首先应当是一个可工作的体系，是一个能够表达外源蛋白的体系。

本发明的保护范围仅涵盖那些能够提高外源蛋白表达量的L-阿拉伯糖的浓度值所对应的技术方案。本发明中，对于所述的体外无细胞蛋白合成体系的任一个CFS(ara-)基础体系，仅要求存在至少一个L-阿拉伯糖的浓度值能够提高外源蛋白表达量，而不要求所有的L-阿拉伯糖的浓度值均起到提升作用。

所述体外无细胞蛋白合成体系能够提供合成外源蛋白所需的翻译相关元件。

优选地，所述体外无细胞蛋白合成体系含有能够识别核酸模板上的启动子元件的体系组分，例如与启动子元件相应的RNA聚合酶。

所述能够识别核酸模板上启动子元件的体系组分(例如相应的RNA聚合酶)，可以由所述乳酸克鲁维酵母细胞提取物提供，也可以通过外源添加方式提供，还可以通过前述两种方式的组合方式提供。

例如，乳酸克鲁维酵母细胞提取物中含有内源性表达的、与核酸模板上启动子元件相对应的RNA聚合酶。具体地例如，乳酸克鲁维酵母细胞提取物中含有内源性表达的T7RNA聚合酶，能够识别核酸模板上的T7启动子。

体外无细胞蛋白合成体系(L-阿拉伯糖优化)

本发明的体外蛋白合成反应，在基于乳酸克鲁维酵母细胞提取物的体外无细胞蛋白合成体系中进行。

所述体外无细胞蛋白合成体系的各组分的种类和含量，没有特别限制，只要所构成的体系能够与编码外源蛋白的核酸模板进行反应合成外源蛋白即可，并且优选那些能够高效表达外源蛋白的组合方式。而那些因为某些组分浓度过低或过高，而导致不能表达外源蛋白的组合方式，当然地排除在本发明范畴之外。

所述体外无细胞蛋白合成体系的各组分的加入顺序没有特别限制。

所述体外无细胞蛋白合成体系，至少包括细胞提取物。所述细胞提取物旨在提供用于蛋白转录翻译的结构或生物因子。所述细胞提取物的选取标准为：能够以编码外源蛋白的核酸模板为基础，经体外蛋白合成反应合成外源蛋白。本发明的细胞提取物来源于乳酸克鲁维酵母细胞，可以为野生型，也可以为非野生型。非野生型的乳酸克鲁维酵母包括但不限于基因改造型。

将DNA转化为mRNA的转录过程离不开RNA聚合酶。所述体外无细胞蛋白合成体系，优选地还包括RNA聚合酶。所述RNA聚合酶可以选自：内源性表达的RNA聚合酶(经由细胞提取物提供)、外源添加的RNA聚合酶、或者其组合。

所述内源性表达的RNA聚合酶不独立添加而是存在于细胞提取物中。

为了实现所述细胞提取物中含有内源性表达的RNA聚合酶，优选通过以下方式实现：将RNA聚合酶的编码序列插入到细胞内游离质粒、或者将RNA聚合酶的编码基因整合到酵母细胞基因组、或者采用前述两种方式的组合方式进行菌株改造，然后制备细胞提取物。所述将RNA聚合酶的编码基因整合到细胞基因组的方式包括但不限于：插入到细胞基因组、原位替换基因组的部分基因、或者其组合方式。

所述外源添加或内源性表达的RNA聚合酶各自独立地优选T7 RNA聚合酶。

所述体外无细胞蛋白合成体系，优选地还包括DNA聚合酶，所述DNA聚合酶可以选自：内源性表达的DNA聚合酶(经由细胞提取物提供)、外源添加的DNA聚合酶、或者其组合。

所述体外无细胞蛋白合成体系，可选地包括外源性RNA聚合酶或/和编码RNA聚合酶的核酸模板。

所述体外无细胞蛋白合成体系，可选地包括外源性DNA聚合酶或/和编码DNA聚合酶的核酸模板。

优选方式之一，所述体外无细胞蛋白合成体系，包括外源性RNA聚合酶、外源性DNA聚合酶。参考文献CN108642076A、WO2018171747A1(CN201710176691.4)。

优选方式之一，所述体外无细胞蛋白合成体系还包括能量系统。

优选方式之一，所述体外无细胞蛋白合成体系还包括合成RNA的底物。

优选方式之一，所述体外无细胞蛋白合成体系还包括合成蛋白的底物。

优选方式之一，所述体外无细胞蛋白合成体系，包括乳酸克鲁维酵母细胞提取物(含内源性表达的RNA聚合酶)、外源L-阿拉伯糖、能量系统、合成RNA的底物、合成蛋白的底物。

所述体外无细胞蛋白合成体系中可选地包括以下至少一种组分：拥挤剂、镁离子、钾离子、抗氧化剂或还原剂、海藻糖、反应促进剂、缓冲剂、水性溶剂。

外源L-阿拉伯糖

L-阿拉伯糖(L-Ara)是植物特异性单糖，其存在于拟南芥中10％～20％的非纤维素细胞壁多糖中。L-Ara存在于阿拉伯聚糖和I型阿拉伯半乳聚糖中，它们是果胶壁的主要成分。除了多糖，许多糖蛋白，例如伸展蛋白和富含亮氨酸的重复伸展蛋白，及一些分泌的CLE肽和普遍存在的阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGP)也是阿拉伯糖基化的(Marzol E,BorassiC,Bringas M,Sede A,Rosa Rodríguez Garcia D,Capece L,Estevez JM,GarciaRD.Filling the gaps to solve the extensin puzzle.Molecular Plant.2018,11:645-658)。L-阿拉伯糖的结构中含有多个羟基。

优选方式之一，所述外源L-阿拉伯糖的可选浓度区间，根据Y_PRT(C_L-ara)浓度曲线中的外源蛋白表达量确定。所述Y_PRT(C_L-ara)浓度曲线，本发明中还记为Y_PRT～C_L-ara浓度曲线，指，针对本发明的体外无细胞蛋白合成体系，以外源L-阿拉伯糖的浓度(C_L-ara)为自变量、以外源蛋白表达量(Y_PRT)为因变量、其它反应参数确定时的浓度曲线。

优选地，所述C_L-ara选自Y_PRT至少为Y₀+50％Y_Δ时外源L-阿拉伯糖的浓度区间。

更优选地，所述C_L-ara选自Y_PRT至少为Y₀+60％Y_Δ时外源L-阿拉伯糖的浓度区间。

更优选地，所述C_L-ara选自Y_PRT至少为Y₀+70％Y_Δ时外源L-阿拉伯糖的浓度区间。

更优选地，所述C_L-ara选自Y_PRT至少为Y₀+80％Y_Δ时外源L-阿拉伯糖的浓度区间。

更优选地，所述C_L-ara选自Y_PRT至少为Y₀+90％Y_Δ时外源L-阿拉伯糖的浓度区间。

更优选地，所述C_L-ara选自Y_PRT至少为Y₀+95％Y_Δ时外源L-阿拉伯糖的浓度区间。

优选方式之一，所述C_L-ara为Y_PRT(C_L-ara)浓度曲线中的Y_max对应的外源L-阿拉伯糖的浓度值。

优选方式之一，所述外源L-阿拉伯糖的浓度的确定方法为：其它组分的种类和含量均确定时，在较宽泛的浓度范围内调整L-阿拉伯糖的浓度，比如在0～200mM范围内调整，在指定的反应条件下(反应温度、反应时间等)，外源蛋白表达量最高时外源L-阿拉伯糖的浓度值C_max，即为该技术方案下L-阿拉伯糖的最适浓度(最优选的浓度)。

所述C_L-ara，Y_PRT，Y_max，C_max，Y₀，Y_Δ的定义与上述一致。

优选方式之一，所述外源L-阿拉伯糖的浓度为2mM～400mM。

优选方式之一，所述外源L-阿拉伯糖的浓度为5mM～150mM。

优选方式之一，所述外源L-阿拉伯糖的浓度为6mM～110mM。

优选方式之一，所述外源L-阿拉伯糖的浓度为5mM～50mM。

优选方式之一，所述外源L-阿拉伯糖的浓度为4.8mM～36mM。

优选方式之一，所述外源L-阿拉伯糖的浓度为7.56mM、7.5mM或7.6mM。

优选方式之一，所述外源L-阿拉伯糖的浓度为28.84mM、29mM或30mM。

细胞提取物(乳酸克鲁维酵母细胞提取物)

所述细胞提取物应当能够表达所述体外无细胞蛋白合成体系中编码外源蛋白的核酸模板，也即能够以该核酸模板为基础合成其编码的外源蛋白。

本发明所述细胞提取物的细胞来源为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis，K.lactis)。

所述细胞提取物旨在提供用于蛋白转录翻译的结构因子或/和生物因子。

细胞提取物可以提供合成外源蛋白所需的许多关键的翻译相关元件；这是内源性的提供方式。

所述细胞提取物典型地用于提供核糖体、转运RNA(tRNA)、氨酰tRNA合成酶、蛋白质合成所需的起始因子和延伸因子以及终止释放因子等物质，还可以经菌株改造后内源性地提供聚合酶(RNA聚合酶和/或DNA聚合酶)等其它酶物质。

所述细胞提取物优选地不含完整的细胞。

细胞提取物中还可以含有一些源自细胞的细胞质中的其它蛋白，尤其是可溶性蛋白。

优选地，所述细胞提取物含有蛋白合成所需的各种因子。

上述细胞提取物提供的各种蛋白类因子，相关的编码基因可以天然存在于细胞基因组中，也可以将相关编码基因整合到细胞的基因组中(整合到染色体)，还可以将相关的基因或基因片段或编码序列插入到细胞内游离质粒中。以RNA聚合酶、DNA聚合酶为例进行说明。优选方式之一，所述细胞提取物中含有内源性表达的RNA聚合酶和/或DNA聚合酶。

针对细胞提取物的来源细胞，将异源蛋白的编码序列或编码基因进行内源性整合，可以使其内源性表达异源蛋白，所述异源蛋白可以包括但不限于：RNA聚合酶、DNA聚合酶等。将异源蛋白的编码序列或编码基因进行内源性整合的方法可以参考包括但不限于专利申请文献CN109423496A、CN10697843A、CN2018116198190、“Molecular and CellularBiology,1990,10(1):353-360”等现有文献及其引用文献提供的方法，具体地，包括但不限于：将编码序列插入到游离型细胞质粒、将编码基因插入到细胞基因组、用编码基因替代细胞基因组的部分基因等方式、或者其组合方式。

本发明的乳酸克鲁维酵母的野生菌株的基因组中不含有T7 RNA聚合酶的编码基因。前期研究已经证明，采用野生型乳酸克鲁维酵母的细胞提取物构建体外无细胞蛋白合成体系，并采用T7启动子控制外源蛋白转录翻译时，如果不添加外源性T7 RNA聚合酶，进行体外蛋白合成反应时，就不能合成外源蛋白。

优选方式之一，所述细胞提取物的来源是乳酸克鲁维酵母，且其基因组中整合有RNA聚合酶的编码基因，包括但不限于插入到细胞基因组、原位替换基因组的部分基因(也即包括敲除原有部分基因的步骤)、敲除原有部分基因并插入RNA聚合酶的编码基因。实施例1-4中，将T7 RNA聚合酶的编码基因整合到了乳酸克鲁维酵母细胞的基因组中，该乳酸克鲁维酵母细胞内源性表达T7 RNA聚合酶，以此制备的细胞提取物含有内源性表达的T7 RNA聚合酶；因此能够在不添加外源性RNA聚合酶的情形下，进行体外无细胞蛋白合成。此外，还可以将RNA聚合酶的编码序列插入到细胞内游离质粒中，比如插入到乳酸克鲁维酵母的细胞内游离质粒中，进而制备细胞提取物。具体参照CN109423496A的制备方法。

优选方式之一，所述细胞提取物的来源是乳酸克鲁维酵母，且其基因组中整合有以下任一种基因序列或其组合：RNA聚合酶的编码基因、DNA聚合酶的编码基因。

还可以采用其他的基因改造方法对来源细胞进行改造，以促进细胞提取物促进体外蛋白合成的活力，如CN2018116083534、CN2019107298813、CN108949801A的基因敲除方法，如2018112862093的基因改造方法等。

所述细胞提取物的制备方法可以采用已报道的技术手段。简要概括而言，通常可包括以下步骤：用液氮将细胞速冻，将细胞打碎，离心收集上清液，即获得细胞提取物。参考CN106978349A、CN108535489A、CN108642076A、CN109593656A、CN109971783A等文献。可对种子细胞进行发酵培养，离心，去除培养液，收集到细胞，进而制备细胞提取物。

采用本发明提供的方法制备的细胞提取物可以使体外蛋白合成反应正常进行，含有具备氨基酸转运功能的tRNA、氨酰tRNA合成酶等蛋白合成所需的必要组分。

在一个实施例中，所述细胞提取物采用包括以下步骤的方法制备：(i)提供来源细胞，乳酸克鲁维酵母细胞；(ii)对乳酸克鲁维酵母细胞进行洗涤处理，获得经洗涤的乳酸克鲁维酵母细胞；(iii)对经洗涤的乳酸克鲁维酵母细胞进行破细胞处理，从而获得乳酸克鲁维酵母粗提物；和(iv)对所述乳酸克鲁维酵母粗提物进行固液分离，收集的上清液部分即为细胞提取物(乳酸克鲁维酵母细胞提取物)。

在本发明中，所述细胞提取物所含蛋白含量优选方式之一为20mg/mL～100mg/mL。另优选方式之一为20mg/mL～50mg/mL。另优选方式之一为50mg/mL～100mg/mL。另优选方式之一为25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL。所述的测定蛋白含量方法可以采用考马斯亮蓝测定方法。

所述细胞提取物在体外蛋白合成体系中的浓度没有特别限制。优选实施方式之一，细胞提取物的浓度为20％-80％(v/v)；另一优选实施方式，细胞提取物的浓度为20％-70％(v/v)；另一优选实施方式，细胞提取物的浓度为30％-60％(v/v)；另一优选实施方式，细胞提取物的浓度为40％-50％(v/v)；另一优选实施方式，细胞提取物的浓度为80％(v/v)；均以所述体外无细胞蛋白合成体系的总体积计。

外源RNA聚合酶、外源DNA聚合酶

当作为细胞提取物来源的细胞基因组中不含有RNA聚合酶的基因，也没有内源性整合RNA聚合酶的编码序列/编码基因的情况下，通常需要额外加入外源性RNA聚合酶以促进反应进行。

向体外蛋白合成体系中添加外源RNA聚合酶是传统的技术手段。现有技术中报道的添加外源RNA聚合酶的乳酸克鲁维酵母体外蛋白合成体系，均纳入到本发明中，作为本发明的CFS(ara-)基础体系的可选方式。例如，CN108535489A中添加外源RNA聚合酶(如T7 RNA聚合酶)的乳酸克鲁维酵母体外蛋白合成体系，均作为CFS(ara-)基础体系的可选方式纳入到本发明中。

所述体外无细胞蛋白合成体系中还可以包括以下至少一种组分，以优化反应体系：外源RNA聚合酶、编码外源RNA聚合酶的核酸模板、外源DNA聚合酶、编码外源DNA聚合酶的核酸模板。

可以直接添加外源性RNA聚合酶，也可以添加编码RNA聚合酶的外源核酸模板，或者添加其组合。RNA聚合酶的编码序列，可以一并构建于编码外源蛋白的核酸模板中，也可以另外构建在独立的外源核酸模板中。

同样地，DNA聚合酶也可以直接添加，或者添加含有其编码序列的外源核酸模板，或者添加其组合。可以是编码外源蛋白的核酸模板，也可以是独立的外源核酸模板。

所述编码外源蛋白的核酸模板为DNA模板时，可以包括DNA的扩增过程，也可以不包括DNA扩增过程；如果体外蛋白合成反应中还包括DNA扩增过程，则需要体系中含有内源表达的或/和外源添加的DNA聚合酶，例如CN108642076A中加入外源性phi29 DNA聚合酶。本发明的实施例1-4中，对编码外源蛋白mEGFP的DNA进行体外扩增后，将扩增产物加入反应体系中，作为外源DNA模板，体外蛋白合成反应再需要包括DNA扩增过程。

所述聚合酶(外源性RNA聚合酶、外源性DNA聚合酶)优选可进行常温扩增的聚合酶，所述常温优选室温至37℃，具体地，优选20℃～37℃，更优选25℃～37℃。所述可进行常温扩增的聚合酶可根据外源核酸模板进行选取，可用于体外无细胞体系的常温扩增聚合酶均作为参考纳入本发明的范围，包括但不限于phi29 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、exo-klenow DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、Pol III DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、T4 RNA聚合酶、T5 RNA聚合酶等，上述任一种聚合酶的片段，及上述聚合酶及其片段的任意组合。本发明还可采用Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Pol I DNA聚合酶、Pol IIDNA聚合酶等其它DNA聚合酶。

本发明可采用的扩增技术，特别是常温扩增方法没有特别限制，体外无细胞体系可采用的常温扩增技术均作为参考纳入本发明的范围。

能量系统/能量再生系统

能量系统/能量再生系统用于提供蛋白合成过程所需能量。

已报道的用于无细胞体外蛋白合成系统的能量系统/能量再生系统均可为本发明的体外蛋白合成体系提供能量。包括但不限于文献CN109988801A、CN2018116198186、CN2018116198190、US20130316397A、US20150376673A、“MJ Anderson,JC Stark,CEHodgman and MC Jewett.Energizing eukaryotic cell-free protein synthesis withglucose metabolism[J].FEBS Letters,2015,589(15):1723-1727”、“Y Lu.Advances inCell-Free Biosynthetic Technology[J].Current Developments in Biotechnologyand Bioengineering,2019,Chapter 2,23-45”、“P Shrestha,MT Smith and BCBundy.Cell-free unnatural amino acid incorporation with alternative energysystems and linear expression templates[J].New Biotechnology,2014,31(1):28-34”等文献及其直接引用或间接引用文献中报道的能量系统/能量再生系统，均作为参考纳入本发明。

优选实施方式之一，所述能量系统为糖(单糖、二糖、寡糖或多糖)与磷酸盐能量体系、糖与磷酸肌酸能量体系、磷酸肌酸与磷酸肌酸酶体系、磷酸肌酸与磷酸肌酸激酶体系、糖酵解途径及其中间产物能量体系(单糖及其酵解中间产物能量体系、糖原及其酵解中间产物能量体系)、或者其组合。具体地，所述磷酸盐，指无机磷酸盐，优选选自正磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐或者其组合。所述多糖可选自包括但不限于淀粉、麦芽糊精、玉米糊精等多糖。所述二糖，举例如蔗糖、麦芽糖等。所述糖酵解途径及其中间产物能量体系包括但不限于基于葡萄糖的能量体系。

能量系统中各组分的浓度没有特别限制，包括但不限于采用现有已报道的技术方案及其等同技术方案。实施例1-4采用的能量系统为多糖与磷酸盐能量体系，其中，多糖选用麦芽糊精，磷酸盐选用磷酸三钾(磷酸钾等同于磷酸三钾)。

合成RNA的底物

所述合成RNA的底物为核苷酸混合物，实施方式之一，选自：核苷单磷酸、核苷三磷酸、或者其组合。优选为核苷三磷酸混合物dNTP。所述核苷三磷酸混合物优选为腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸的混合物。在本发明中，各种单核苷酸的浓度没有特别限制，以合成蛋白所需核苷酸进行计量，通常的优选实施方式之一，每种单核苷酸的浓度为0.5mM～5mM，另一优选实施方式之一为1.0mM～2.0mM。

合成蛋白的底物

所述合成蛋白的底物为氨基酸混合物。以合成蛋白所需核苷酸进行计量。每种氨基酸的浓度通常的优选实施方式之一为0.01mM～5mM，另一优选实施方式之一为0.1mM～1mM。

所述氨基酸混合物至少包括合成外源蛋白过程所需的氨基酸混合物，选自包括但不限于：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。所述合成外源蛋白过程所需的氨基酸混合物，不仅包括组成外源蛋白一级序列的氨基酸，还可以包括合成过程中涉及的其它氨基酸。

所述氨基酸混合物可以包括天然氨基酸、非天然氨基酸。

所述氨基酸混合物可以包括_L-氨基酸、_D-氨基酸、或其组合。

除天然氨基酸外，所述氨基酸混合物还可以包括非天然氨基酸、_D-氨基酸、放射性同位素标记的氨基酸、经修饰的氨基酸等组分。所述非天然氨基酸没有特别限制，可以选自：包括但不限于“Y Lu.Cell-free synthetic biology:Engineering in an open world[J].Synthetic and Systems Biotechnology,2017,2,23-27”、“W Gao,E Cho,Y Liu andY Lu.Advances and challenges in cell-free incorporation of unnatural aminoacids into proteins[J].Frontiers in pharmacology,2019,10:611”等文献及其直接引用或间接引用文献中报道或引用的非天然氨基酸。所述放射性同位素标记的氨基酸没有特别限制，包括但不限于已报道的蛋白合成领域中采用的同位素标记。所述经修饰的氨基酸没有特别限制，包括但不限于通过氨基酸侧基进行修饰。

优选地，所述氨基酸混合物为天然氨基酸的混合物。

其它添加剂组分

所述体外无细胞蛋白质合成体系中还可以包括以下至少一种组分：聚乙二醇和/或其类似物、镁离子、钾离子、抗氧化剂或还原剂、海藻糖、反应促进剂、缓冲剂、水性溶剂。可以参考文献WO2016005982A1、US20060211083A1、“L Kai,V

R Kaldenhoff and FBernhard.Artificial environments for the co-translational stabilization ofcell-free expressed proteins[J].PloS one,2013,8(2):e56637”、US20030119091A1、US20180245087A1、US5665563、WO2019033095A1、US9410170B2、US9528137B2等文献及其直接或间接引用的文献。

所述体外无细胞蛋白质合成体系还可以含有聚乙二醇和/或其类似物，用于模拟细胞内的拥挤的大分子环境，用作crowding agents，其中如聚乙二醇，还可以调节体系粘度。聚乙二醇，具有CH₂CH₂O的重复单元，通常记为PEG(polyethylene glycol)、PEO(poly(ethylene oxide))、POE(polyoxyethylene)。聚乙二醇或其类似物的浓度没有特别限制，通常，聚乙二醇或其类似物的浓度为0.1％-10％，优选0.1％-8％，更优选0.5％-4％，更优选1％-2％，以所述蛋白合成体系的质量体积浓度计(％(w/v))或者以总重量计(wt％)；如无特别说明，本发明中均指质量体积浓度，单位为％(w/v)，如2％，指2％(w/v)，对应2g/100mL、20mg/mL。所述聚乙二醇优选分子量为200Da～10000Da，更优选分子量为3000Da～10000Da。另优选方式之一为200Da～8000Da。另优选方式之一为200Da～8000Da。本发明中，聚乙二醇或其类似物的分子量如无特别说明，均指重均分子量M_w。代表性的PEG选自下组：PEG3000、PEG8000、PEG6000、PEG3350、其组合；其中，3350等数字在数值上等于重均分子量。聚乙二醇的分子量还可以为，例如200Da、400Da、1500Da、2000Da、4000Da、6000Da、8000Da、10000Da等。通常，分子量规格优选为±10％或低于±10％。其它可起到crowding agents作用的大分子还包括，比如，聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)、葡聚糖(dextran)、

试剂(如Ficoll-400)等，还参考文献“X Ge,D Luo and J Xu.Cell-free proteinexpression under macromolecular crowding conditions[J].PLoS One,2011,6(12):e28707”及其引用文献所公开的拥挤剂。

所述镁离子来源于镁离子源，没有特别限制，所述镁离子源可以选自下组：醋酸镁、谷氨酸镁(优选L-谷氨酸镁)、天门冬氨酸镁(优选L-天门冬氨酸镁)、氯化镁、磷酸镁、硫酸镁、柠檬酸镁、磷酸氢镁、碘化镁、乳酸镁、硝酸镁、草酸镁、其组合。优选实施方式之一的浓度范围是0.1mM-50mM。另优选实施方式之一的浓度范围是0.5-20mM。另优选实施方式之一的浓度范围是1mM-10mM。

所述钾离子来源于钾离子源，没有特别限制，所述钾离子源可以选自下组：醋酸钾、谷氨酸钾(优选L-谷氨酸钾)、氯化钾、磷酸钾、硫酸钾、柠檬酸钾、磷酸氢钾、碘化钾、乳酸钾、硝酸钾、草酸钾、其组合。优选实施方式之一的浓度范围是0-500mM。另优选实施方式之一的浓度范围是1mM-250mM。另优选实施方式之一的浓度范围是5mM-200mM。另优选实施方式之一的浓度范围是10mM-100mM。

专利文献WO2016005982A1中报道的聚乙二醇、镁离子、钾离子的优化作用及优选方式，也可作为参考纳入本发明中。

所述抗氧化剂，也可称为还原剂。可选用包括但不限于二硫苏糖醇(DTT，dithiothreitol)、2-巯基乙磺酸、2-巯基乙醇等等。优选实施方式之一为二硫苏糖醇。DTT采用其常规使用浓度即可；具体实施方式之一如0.5mM～10mM；另一实施方式中采用浓度0～1.7mM。

所述反应促进剂，包括但不限于，如CN109971783A所提供的反应促进剂(如铝盐)。

所述缓冲剂，主要用于维持体系的pH环境。优选实施方式之一为，选自以下任一种或者其组合：Tris-HCl、Tris碱、HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸体系)。

所述水性溶剂，优选为缓冲剂。

体外蛋白合成体系的具体实施方式举例

优选实施方式之一为，所述体外蛋白合成体系含有乳酸克鲁维酵母细胞提取物、L-阿拉伯糖、内源性表达的RNA聚合酶(包含于前述乳酸克鲁维酵母细胞提取物中)或者外源添加的RNA聚合酶、能量系统、合成RNA的底物、合成蛋白的底物、拥挤剂、镁离子、钾离子、缓冲液，还可选地包括以下任一种组分：编码RNA聚合酶的外源核酸模板(独立地优选为DNA模板)、内源性表达的DNA聚合酶或者外源添加的DNA聚合酶、编码DNA聚合酶的外源核酸模板(独立地优选为DNA模板)、抗氧化剂或还原剂、海藻糖、反应促进剂、水性溶剂。

优选实施方式之一为，所述体外蛋白合成体系含有乳酸克鲁维酵母细胞提取物(把RNA聚合酶的编码基因整合到细胞基因组中或者插入到细胞内游离质粒中进行菌株改造)、L-阿拉伯糖，还含有选自以下组的一种或多种或全部组分：4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾(HEPES-K)或三羟甲基氨基甲烷(Tris)、醋酸钾、醋酸镁、谷氨酸镁、天门冬氨酸镁、核苷三磷酸混合物(dNTP)、氨基酸混合物、磷酸肌酸、磷酸肌酸酶、磷酸肌酸激酶、二硫苏糖醇(DTT)、RNA酶抑制剂、蔗糖、葡萄糖、淀粉、糊精、玉米糊精、麦芽糊精、磷酸盐(如磷酸钾)。

优选实施方式之一为，所述体外蛋白合成体系含有乳酸克鲁维酵母细胞提取物、L-阿拉伯糖，还含有选自以下组的一种或多种或全部组分：HEPES-K或Tris、醋酸钾、醋酸镁、谷氨酸镁、天门冬氨酸镁、dNTP、氨基酸混合物、磷酸肌酸、磷酸肌酸酶、磷酸肌酸激酶、DTT、RNA酶抑制剂、蔗糖、葡萄糖、淀粉、糊精、玉米糊精、麦芽糊精、磷酸盐(如磷酸钾)、外源性T7 RNA聚合酶、外源性phi29 DNA聚合酶。

优选实施方式之一为，所述体外蛋白合成体系含有乳酸克鲁维酵母细胞提取物(可选地，把RNA聚合酶的编码基因整合到细胞基因组中或者插入到细胞内游离质粒中进行菌株改造)、L-阿拉伯糖、还含有选自以下组的一种或多种或全部组分：HEPES-K或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris·HCl)、醋酸钾、醋酸镁、谷氨酸镁(优选L-谷氨酸镁)、天门冬氨酸镁(优选L-天门冬氨酸镁)、dNTP、氨基酸混合物、磷酸肌酸、磷酸肌酸酶、磷酸肌酸激酶、DTT、RNA酶抑制剂、蔗糖、葡萄糖、淀粉、糊精、玉米糊精、麦芽糊精、磷酸钾、聚乙二醇、氧化铝促进剂、外源性T7 RNA聚合酶、外源性phi29 DNA聚合酶、编码T7 RNA聚合酶的DNA模板、编码phi29 DNA聚合酶的DNA模板。

另一种优选实施方式为，所述体外蛋白合成的体系含有乳酸克鲁维酵母细胞提取物、L-阿拉伯糖，还含有选自以下组的一种或多种或全部成分：Tris-HCl(pH8.0)、醋酸钾、醋酸镁、谷氨酸镁、天门冬氨酸镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、葡萄糖、dNTP(四种核苷三磷酸混合物、单一核苷三磷酸浓度相同)、氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸；其中，单一氨基酸浓度相同)、磷酸钾、外源性T7 RNA聚合酶、外源性phi29 DNA聚合酶。

具体地，优选实施方式之一为，含有50％～80％(v/v)乳酸克鲁维酵母细胞提取物、5mM～110mM L-阿拉伯糖，还含有选自以下组的一种或多种或全部成分：9.78mM pH8.0的Tris-HCl、20mM～80mM醋酸钾、2mM～10mM醋酸镁、1.5mM～6mM L-天门冬氨酸镁、0.4mM～5mM二硫苏糖醇(如0.44mM)、0.5％～5％(w/v)聚乙二醇(如2％(w/v))、0.5mM～5mM四种核苷三磷酸(单一核苷三磷酸浓度均相同，如1.8mM)、0.1mM～1mM的氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，单一氨基酸浓度均相同，如0.5mM)、200mM～400mM麦芽糊精(以葡萄糖单体计量，如320mM，对应约52mg/mL)、10mM～40mM磷酸钾。

本发明的其它引用文献、其直接及间接引用文献中所记载的乳酸克鲁维酵母的体外无细胞蛋白合成体系，也均作为CFS(ara-)基础体系的实施方式纳入本发明，举例如，文献CN106978349A、CN108535489A、CN108690139A、CN108949801A、CN108642076A、CN109022478A、CN109423496A、CN109423497A、CN109837293A、CN109971783A、CN109988801A、CN110551700A、CN109971775A、CN110551745A、CN110551700A、CN2018116083534、CN2018116198186、CN2018116198190、CN2019102128619、CN2019102355148、CN2019107298813、CN2019112066163、CN2018108881848、CN2018109550734、CN2018111131300、CN2018111423277、CN2018112862093及其引用文献中记载的体外无细胞蛋白合成体系，均可作为CFS(ara-)基础体系的实施方式纳入本发明。

本发明第二方面提供一种体外蛋白合成试剂盒，所述试剂盒包括：

(i)第一方面所述体外无细胞蛋白合成体系；

(ii)可选地包括编码外源蛋白的核酸模板；

(iii)标签或说明书。

优选地，所述编码外源蛋白的核酸模板为DNA模板。

优选方式之一，各组分共同构成水性溶液。所述试剂盒包括一个盛放所述水性溶液的容器。

优选方式之一，所述试剂盒包括分别包括以下组分的分装容器：(a)细胞提取物；(b)能量系统；(c)可选地，核酸模板；(d)缓冲液；(e)可选地，pH调节组分；(f)可选地，若干个其它固态组分；(h)可选地，若干个其它液态组分。其中，组分(a)、(b)、(c)各自独立地为冻干粉或水性溶液。其中，组分(c)、(e)、(f)各自独立地有或无。此处的“若干个”表示1个、2个或更多个。

优选方式之一，各组分分装为冻干粉和液态试剂两个部分。所述试剂盒包括两个容器，一个盛放冻干粉组分，另一个盛放液态试剂组分。

优选方式之一，各组分分装为冻干粉、缓冲液、其它液态试剂，可选地包括溶剂水。

优选方式之一，以下各组分分别装在不同的容器中：乳酸克鲁维酵母细胞提取物(含有内源性表达RNA聚合酶，可选地含有内源性表达的DNA聚合酶)、L-阿拉伯糖、能量系统、合成RNA的底物、合成蛋白的底物、拥挤剂、外源镁离子、外源钾离子、缓冲液，还可选地包括以下任一种组分的分装容器：外源添加的RNA聚合酶、编码RNA聚合酶的外源DNA模板、外源添加的DNA聚合酶、编码RNA聚合酶的外源DNA模板、抗氧化剂或还原剂、海藻糖、反应促进剂、水性溶剂。所述RNA聚合酶独立地更优选为T7 RNA聚合酶。所述DNA聚合酶独立地更优选为phi29 DNA聚合酶。所述细胞提取物含转运RNA(tRNA)、核糖体(ribosome)。

优选方式之一，以下各组分分别装在不同的容器中：乳酸克鲁维酵母细胞提取物(来源细胞没有内源性整合RNA聚合酶的编码序列/编码基因、也没有内源性整合DNA聚合酶的编码序列/编码基因)、L-阿拉伯糖、外源添加的RNA聚合酶、能量系统、合成RNA的底物、合成蛋白的底物、拥挤剂、外源镁离子、外源钾离子、缓冲液，还可选地包括以下任一种组分的分装容器：编码RNA聚合酶的外源DNA模板、外源添加的DNA聚合酶、编码DNA聚合酶的外源DNA模板、抗氧化剂或还原剂、海藻糖、反应促进剂、水性溶剂。所述RNA聚合酶独立地更优选为T7 RNA聚合酶。所述DNA聚合酶独立地更优选为phi29DNA聚合酶。所述细胞提取物含转运RNA、核糖体。

本发明第三方面提供一种外源蛋白的合成方法，所述合成方法包括以下步骤：

(i)提供本发明第一方面所述体外无细胞蛋白合成体系；

(ii)向步骤(i)所述体外无细胞蛋白合成体系中添加编码外源蛋白的核酸模板，孵育反应，合成所述外源蛋白；

还可选地包括步骤(iii)分离或/和检测所述外源蛋白。

优选地，所述编码外源蛋白的核酸模板为DNA模板。

所述孵育反应，指进行体外蛋白合成反应，至少包括翻译过程(此时核酸模板可以仅包括mRNA模板)，可选地包括转录过程。

优选方式之一，采用编码外源蛋白的DNA模板，孵育反应包括转录和翻译过程。

所述分离或/和检测方法，采用常规技术方法即可实现。

本发明第四方面提供第一方面所述体外无细胞蛋白合成体系的应用，用于蛋白合成方面。所述用于蛋白合成方面，包括但不限于应用于蛋白制造、应用于基于合成蛋白的检测等方面。

本发明的任一实施方式中的编码外源蛋白的核酸模板各自独立地可以为DNA模板、mRNA模板、或者其组合。

本发明的任一实施方式中的编码外源蛋白的核酸模板可以各自独立地优选为DNA模板。

本发明的任一实施方式中，各自独立地优选，所述编码外源蛋白的核酸模板还含有所述乳酸克鲁维酵母细胞提取物能够识别的启动子元件。具体地例如，T7启动子位于核酸模板外源蛋白的编码序列的上游，启动外源蛋白的转录程序，体系组分之一的乳酸克鲁维酵母细胞提取物中含有内源性表达的T7 RNA聚合酶。

外源蛋白

适用于本发明的体外蛋白合成体系的外源蛋白，没有特别限制，只要能够基于乳酸克鲁维酵母细胞提取物进行体外合成即可。现有技术已公开的适用乳酸克鲁维酵母来源的体外蛋白合成体系的蛋白，均可以采用本发明的体系进行合成。已公开的适用于其他酵母来源的体外蛋白合成体系的外源蛋白，或者适用于细胞内合成的乳酸克鲁维酵母体系或者其他酵母体系的内源蛋白，也均可以采用本发明的体系进行合成，或者可尝试用本发明提供的体外蛋白合成体系进行合成。

例如，本发明的体外蛋白合成体系可合成的外源蛋白，可以选自包括但不限于以下任一种蛋白、任意组合方式的融合蛋白、任意组合方式的混合物：荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白(GFP)、增强绿色荧光蛋白(eGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、氨酰tRNA合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域、萤光素酶突变体、α-淀粉酶、肠道菌素A、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、胰岛素前体、干扰素αA、白细胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、单链抗体段(scFV)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶、大肠杆菌β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ)、人赖氨酸-tRNA合成酶(Lysine-tRNAsynthetase)、人亮氨酸-tRNA合成酶(Leucine-tRNA synthetase)、拟南芥甘油醛3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、鼠过氧化氢酶(Catalase)、或前述任一种的突变体(举例如萤光素酶突变体、eGFP的突变体)。还可参考专利文献CN109423496A。所述任意组合方式的混合物，可以包括前述任一种的蛋白，也可以包括前述任意组合方式的融合蛋白。

优选实施方式之一，采用GFP、eGFP、或其突变体作为外源蛋白对体外蛋白合成体系的蛋白合成能力进行评估。

外源核酸模板(包括编码外源蛋白的核酸模板)

本发明的外源核酸模板，如无特别说明，特指编码外源蛋白的核酸模板。此外，本发明的外源核酸模板，在指明的情况下，还可以包括编码体外蛋白合成过程所需蛋白因子或蛋白酶的核酸模板，举例如编码RNA聚合酶的外源核酸模板、编码DNA聚合酶的外源核酸模板。

离开编码外源蛋白的核酸模板，外源蛋白体外合成反应就无法进行。

所述编码外源蛋白的核酸模板为DNA模板、mRNA模板、或者其组合，优选地为DNA模板。

核酸模板作为合成外源蛋白的直接模板(mRNA)、间接模板(DNA)、或者其组合。

所述编码外源蛋白的核酸模板允许包括非编码区。所述表达产物可以为多肽或蛋白，也可以为融合蛋白。对一个核酸模板分子完成一次翻译(或转录翻译)过程，允许合成的多肽或蛋白分子数量可以为1个、2个或更多个。

转录翻译方式的蛋白合成过程以DNA模板为间接模板，仅翻译方式的蛋白合成过程可以采用mRNA模板作为直接模板。

优选地，本发明的体外蛋白合成体系为体外转录翻译体系，也即IVTT体系，采用DNA模板作为编码外源蛋白的核酸模板。

所述编码外源蛋白的核酸模板含有合成外源蛋白所需的翻译相关元件。

为了进行体外蛋白合成反应，所述编码外源蛋白的核酸模板优选地含有能够被体系组分所识别的启动子元件。

优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板含有所述乳酸克鲁维酵母细胞提取物能够识别的启动子元件。

优选方式之一，外源蛋白的基因转录过程由核酸模板上的T7启动子启动。

优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板包括外源蛋白翻译系统、抗性基因翻译系统、Lac抑制子翻译系统；上述翻译系统中分别包括相应的启动子。

优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板还含有控制质粒拷贝数的基因。

优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板还含有翻译增强元件，如增强子元件、IRES元件等。

外源DNA模板(包括编码外源蛋白的DNA模板)

本发明的外源DNA模板，如无特别说明，特指编码外源蛋白的DNA模板。

所述编码外源蛋白的DNA模板中含有外源蛋白的编码序列。

优选地，所述编码外源蛋白的DNA模板中含有外源蛋白的编码基因。

所述编码外源蛋白的DNA模板根据外源蛋白确定。

所述编码外源蛋白的DNA模板还可以含有选自启动子、终止子、增强子(举例如CN109423497A、CN109022478A、CN109837293A(CN201711194355.9)等文献中记载及其引用文献中记载的增强子元件，例如Ω序列及其同源序列、组合的增强子元件)、IRES元件(内部核糖体进入序列，参考CN109022478A、CN109423497A等文献及其引用文献)、多克隆位点(MCS)、控制质粒拷贝数的基因等的其它功能元件。还可以含有编码信号肽(对应signalsequence)、前导肽(对应leader sequence)、功能标签(如纯化标签)、连接肽等其它氨基酸链的编码序列。还可以含有5’非翻译序列、3’非翻译序列。

所述编码外源蛋白的DNA模板优选地含有启动子元件。所述启动子元件要求能够被所使用的细胞提取物或者体外蛋白合成体系的其它组分所识别；可以是野生型细胞提取物能识别的启动子，也可以将细胞提取物的来源细胞改造成能识别该启动子的细胞。所述编码外源蛋白的DNA模板中启动子可选自以下组：AOD1、MOX、AUG1、AOX1、GAP、FLD1、PEX8、YPT1、LAC4、PGK、ADH4、AMY1、GAM1、XYL1、XPR2、TEF、RPS7、T7、或其组合。参考包括但不限于以下文献及其引用文献：“Cereghino G.Applications of yeast in biotechnology:protein production and genetic analysis.Current Opinion in Biotechnology,1999,10(5),422-427”。

实施例1-4中，外源DNA模板采用T7启动子启动外源蛋白的转录过程；所述T7启动子是能够对T7 RNA聚合酶有特异性反应的强启动子。

优选地，由外源DNA模板上的T7启动子启动外源蛋白的基因转录过程。关于外源DNA模板的浓度选取，根据实验方案拟表达的外源蛋白量确定。优选实施方式之一为，外源DNA模板的浓度采用1ng/μL～400ng/μL。另优选实施方式之一为，外源DNA模板的浓度采用1ng/μL～80ng/μL。另优选实施方式之一为，外源DNA模板的浓度采用5ng/μL～50ng/μL。本发明中，如无特别说明，DNA模板的添加浓度为终浓度，也即体外蛋白合成反应的起始浓度。

所述外源DNA模板可以是环状DNA，也可以是线性DNA；可以是单链的，也可以是双链的。所述外源蛋白的编码基因可以选自包括但不限于：基因组序列、cDNA序列。所述外源DNA模板还可以含有启动子序列、5’非翻译序列、3’非翻译序列。

优选实施方式之一，所述外源DNA模板还包括选自下组的任一元件或其组合：启动子、终止子、poly(A)元件、转运元件、基因靶向元件、筛选标记基因、增强子、IRES元件、抗性基因、转座酶编码基因、信号序列(signal sequence)、前导序列(leading sequence，举例如CN109022478A中记载及其引用的前导序列)、控制质粒拷贝数的基因(rop基因)、增强翻译水平的标签(如CN2019112066163所记载的多肽标签)等。可参考文献US20060211083A1等。

所述外源DNA模板还可构建于表达载体之中。本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有外源蛋白的编码基因的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

例如，将“Z1-Z2”结构的核酸构建物插入到质粒载体的克隆位点，作为质粒DNA模板；其中，Z1为启动子，“-”为共价键或者核苷酸片段，Z2为外源蛋白的编码序列。其中，Z1的优选方式之一为T7启动子。

优选实施方式之一，所述外源DNA模板为环状DNA，进一步优选为质粒DNA。相应的DNA质粒没有特别限制，只要能够与体系的细胞提取物进行反应合成外源蛋白即可。通常地，质粒中含有启动子、终止子、非翻译区(UTR)等功能元件。所述质粒的优选方式之一为含有细胞提取物组分能够识别的启动子。举例如，含有T7启动子的质粒理论上都可以作为实施例1-4所使用的外源DNA模板的表达载体。例如大肠杆菌的pET系列质粒、pGEM系列质粒等均可以用之替代实施例1-4的乳酸克鲁维酵母提取物的质粒载体以实施本发明。所述质粒的另一优选方式为含有能够被外源添加组分所识别的启动子。

以外源DNA模板采用T7启动子启动外源蛋白的转录为例，所述T7启动子可以被乳酸克鲁维酵母细胞提取物中内源性表达的T7 RNA聚合酶所识别启动，也可以被外源添加的T7 RNA聚合酶所识别启动。

线性DNA可以通过扩增技术获得。可采用的扩增技术没有特别限制，包括但不限于PCR扩增技术、恒温扩增技术、常温扩增技术、室温扩增技术等。其中，恒温扩增技术优选常温扩增技术。

优选实施方式之一为，所述外源DNA模板为线性DNA，且为PCR线性片段。所述PCR线性片段可以通过已报道的PCR技术获得。

另一优选实施方式为，所述外源DNA模板为线性DNA，且为经扩增系统得到的双链线性DNA。所述扩增系统没有特别限制，可以从包括但不限于现有的商业化试剂盒、文献报道的扩增系统中选取，只要能够扩增本发明的编码外源蛋白的DNA模板即可。举例如，包括但不限于Biocompare、Neta Scientific Inc、ABM公司、Thermo Fisher Scientific公司、Expedeon公司、Vivantis公司等企业提供的商业化DNA扩增系统。

另一优选实施方式为，采用双链DNA作为外源DNA模板，且构建于环状质粒载体中。所采用的质粒载体，典型地，含有T7启动子、LAC4终止子(或T7终止子)和/或5’和3’UTR等功能元件。

作为优选实施方式之一，实施例1-4中，采用双链DNA作为外源DNA模板，构建于环状质粒载体；这些质粒含有T7启动子，作为启动外源蛋白转录翻译的启动子；在实施例1-4中，改造型乳酸克鲁维酵母可内源性表达T7 RNA聚合酶，由改造菌株制备细胞提取物，构建体外无细胞蛋白合成体系，该体系的T7启动子可适用于各种蛋白的体外无细胞表达。该质粒中还包含UTR等功能元件。

在一实施例中，质粒DNA中包括以下功能元件：启动子、5’非编码区、外源蛋白的编码序列、3’非编码区、终止子、复制起始位点(f1 ori)、AmpR启动子、氨苄青霉素抗性基因、高拷贝数复制起始位点(ori)、控制质粒拷贝数的基因(rop基因)、LacI启动子、lacI的编码序列。

另一实施例中，质粒结构至少包括实施例1中表1所列举的结构元件1-2、3-12。。

另一实施例中，除了至少包括图1标示的功能元件外，在5’UTR与mEGFP的编码序列之间还具有纯化标签，如多聚组氨酸标签(His-tag)。

另一实施例中，除了至少包括图1标示的功能元件外，在5’UTR与mEGFP的编码序列之间、5’UTR的下游还具有信号肽的编码序列(信号序列)。

另一实施例中，质粒DNA中包括以下功能元件：启动子、5’非编码区、信号肽的编码序列、外源蛋白的编码序列、3’非编码区、终止子、f1 ori、AmpR启动子、氨苄青霉素抗性基因、ori、rop基因、LacI启动子、lacI的编码序列。具体地举例如，质粒DNA中包括以下功能元件：T7启动子、5’非编码区、信号肽的编码序列、外源蛋白mEGFP的编码序列、3’非编码区、T7终止子、f1 ori、AmpR启动子、氨苄青霉素抗性基因、ori、rop基因、LacI启动子、lacI的编码序列。

另一实施例中，质粒DNA中包括以下功能元件：启动子、5’非编码区、信号肽的编码序列、纯化标签的编码序列、多克隆位点(MCS)、外源蛋白的编码序列、3’非编码区、终止子、复制起始位点(f1 ori)、AmpR启动子、氨苄青霉素抗性基因、高拷贝数复制起始位点(ori)、rop基因、LacI启动子、lacI的编码序列。具体地举例如，质粒DNA中包括以下功能元件：T7启动子、5’非编码区、信号肽的编码序列、纯化标签的编码序列、MCS、外源蛋白mEGFP的编码序列、3’非编码区、LAC4终止子或T7终止子、f1 ori、AmpR启动子、氨苄青霉素抗性基因、ori、rop基因、LacI启动子、lacI的编码序列。

质粒的基本结构以及将外源蛋白的编码基因插入到质粒载体的方法，可采用本领域常规技术手段，这里不再赘述。作为举例，可以参考CN108690139A、CN107574179A、CN108949801A等专利文献。作为举例，质粒基本结构还可参阅中国专利申请文献CN201910460987.8附图。

本发明中，编码非外源蛋白的DNA模板的浓度可以参考上述编码外源蛋白的DNA模板的用量，根据所需的该非外源蛋白的表达量确定。所述非外源蛋白，指并非目的表达蛋白，而是为了促进反应进行而合成的翻译产物。

外源mRNA模板

本发明还可以采用外源的mRNA模板代替外源DNA模板，或者采用外源mRNA模板与外源DNA模板的混合物，加入到上述体外无细胞蛋白合成体系中，进行体外蛋白合成反应，合成mRNA模板所编码的外源蛋白。

体外核酸扩增(体外核酸扩增技术、体外核酸扩增方法)

“体外核酸扩增”，是在体外对核酸进行复制的过程。

用于本发明的体外蛋白合成体系的核酸模板，包括编码外源蛋白的核酸模板，还可选地包括编码其他蛋白的核酸模板，均可采用体外核酸扩增技术用于制备模板原料。

可采用的体外核酸扩增技术没有特别限制，包括但不限于聚合酶链式反应技术(PCR扩增技术)、恒温扩增技术、常温扩增技术、室温扩增技术等。其中，恒温扩增技术优选常温扩增技术。

其中，恒温扩增技术可参考“J Kim et al.Isothermal DNA amplification inbioanalysis:strategies and applications[J].Bioanalysis,2011,3(2):227–239”、“Gill P et al.Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies—A Review[J].Nucleosides,Nucleotides,and Nucleic Acids,2008,27(3)224-243”、“Yong-JooJeong,Kkothanahreum Park and Dong-Eun Kim.Isothermal DNA amplification invitro:the helicase-dependent amplification system[J].Cell.Mol.Life Sci.,2009,66:3325–3336”、“吕蓓等.体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新[J].中国生物工程杂志,2011,31(3):91-96”、“汪琳等.核酸恒温扩增技术研究进展[J].生物技术通讯,2011,22(2):296-302”等文献及其引用文献中公开的恒温扩增技术。具体地，可用于本发明技术手段的的核酸恒温扩增方法包括但不限于：环介导恒温扩增法(LAMP)、链替代扩增法(SDA)、依赖核酸序列的扩增法(NASBA)、滚环扩增法(RCA)、切口酶核酸恒温扩增法、依赖解旋酶的恒温扩增法(HDA)、转录依赖的扩增法、杂交捕获法、转录介导的扩增法(TMA)、重组酶介导扩增法(RAA)、重组酶聚合酶扩增法(RPA)等，优选环介导恒温扩增法。

可用于本发明的体外核酸扩增方法，特别是常温扩增方法没有特别限制，体外无细胞体系可采用的常温扩增技术均作为参考纳入本发明的范围，包括但不限于滚环扩增技术(RCA)、组合酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)、链置换扩增技术(SDA)、解旋酶依赖性扩增技术(helicase dependent amplification，HDA)、3SR技术(self-sustained sequence replication)等等。参考文献，包括但不限于：“NicoleE.Gregorio,Max Z.Levine and Javin P.Oza.A User's Guide to Cell-Free ProteinSynthesis[J].Methods Protoc.2019,2,24”、“Y Lu.Advances in Cell-FreeBiosynthetic Technology[J].Current Developments in Biotechnology andBioengineering,2019,Chapter 2,23-45”、“Y Lu.Cell-free synthetic biology:Engineering in an open world[J].Synthetic and Systems Biotechnology,2017,2,23-27”等文献及其直接引用或间接引用文献，所公开的体外核酸扩增方法(特别是常温扩增方法)，均可用作本发明的技术手段，均作为参考纳入本发明。

孵育反应(体外蛋白合成反应)

将编码外源蛋白的核酸模板(优选为DNA模板)加入到所述体外无细胞蛋白合成体系中，孵育反应一段时间，表达合成所述外源蛋白。

进行体外蛋白合成反应的条件，根据具体的体外无细胞蛋白合成体系确定，可参考已报道的反应条件，包括但不限于CN106978349A、CN108535489A、CN108642076A等文献记载的反应条件。优选采用常温条件进行体外蛋白合成。所述常温条件优选室温至37℃，具体地，优选20℃～37℃。优选方式之一为25℃～37℃。另优选方式之一为20℃～30℃。已报道的适于常温条件的常温扩增方法或者等温扩增方法均可用于实施本发明的技术方案。

所述反应时间可根据原料使用量(如反应底物量、预期获得的蛋白含量等)、反应效率等因素综合确定。

实施方式之一，所述反应时间为1h～72h。

另实施方式之一，所述反应时间为3h～24h。

另实施方式之一，所述反应时间为3h～21h。

另实施方式之一，所述反应时间为6h～21h。

所述反应时间还可选自：3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、36h、48h。

下面结合具体实施例和附图1-5，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于阐述说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如“Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarbor LaboratoryPress,1989)”、《无细胞蛋白合成实验手册》“Edited by AlexanderS.Spirin and James R.Swartz.Cell-free protein synthesis:methods and protocols[M].2008”等文献中所述的实验条件，或者按照制造厂商所建议的条件，或者按照、参考上文所述的具体实施方式指引的条件。除非另外说明，否则本发明中提及的百分比和份数是重量百分比和重量份数。

如无特别说明，则本发明实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。

本发明以乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis，简写为K.lactis或kl)作为实施例1-4中的细胞提取物来源，制备的细胞提取物中蛋白浓度均为30mg/mL～50mg/mL。需要说明的是，本发明实施例中采用的质粒表达载体仅用于具体阐述本发明的实施方式，并非限定本发明的范围；其它可用于实施本发明的质粒载体包括但不限于现有商业途径可购买的常见质粒载体，举例如：pET系列质粒、pGEM系列质粒等。

实施例1L-阿拉伯糖的浓度对体外蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响

1.1制备核酸模板：构建表达mEGFP的质粒载体，进行体外DNA扩增，制备编码外源蛋白mEGFP的DNA模板(质粒DNA模板)

选取增强型绿色荧光蛋白(mEGFP)为外源蛋白，作为目的表达产物，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

选取质粒载体。采用针对乳酸克鲁维酵母细胞提取物设计的人工构建质粒载体，所述人工构建质粒载体含有T7启动子、5’UTR和3’UTR等功能元件。该质粒载体可以和含有内源性表达的T7 RNA聚合酶的乳酸克鲁维酵母细胞提取物构建成体外无细胞蛋白合成体系，在体外表达各种外源蛋白。

采用PCR扩增、同源片段重组方法，将含有mEGFP的编码基因的DNA片段插入到质粒载体中，构建表达mEGFP的质粒载体，记为D2P质粒或pD2P。质粒经基因测序确认正确。其中，编码mEGFP的基因序列如SEQ ID No.1所示。

所述D2P质粒的图谱如图1所示，其结构元件组成如下表1所示。

表1图1所示质粒的结构元件说明。

进行DNA扩增。扩增反应体系包括终浓度分别如下的各组分：1μM-5μM的随机引物(引物序列：NNNNNNN)，1.14ng/μL的上述质粒模板，0.5mM-1mM dNTP，0.1mg/ml BSA，0.05mg/mL-0.1mg/mL phi29 DNA聚合酶，1×phi29反应缓冲液(成分为200mM Tris-HCl,20mM MgCl₂,10mM(NH₄)₂SO₄,10mM KCl,pH7.5)。将上述的反应体系混匀后放置在30℃的环境中反应2h。获得质粒DNA模板(双链DNA结构)，紫外分光光度计测定其核酸浓度，反应液冷藏备用。

1.2制备细胞提取物：制备细胞提取物(乳酸克鲁维酵母细胞提取物)

细胞提取物的来源采用乳酸克鲁维酵母细胞提取物(Kluyveromyces lactis,K.lactis)。采用基于乳酸克鲁维酵母菌株ATCC8585的改造菌株，采用CN109423496A所记载的方法，将T7 RNA聚合酶的编码基因整合到乳酸克鲁维酵母的基因组中，获得改造菌株，使其可以内源性表达T7 RNA聚合酶，进而制备细胞提取物，编号为CM1122。根据对照实验比较，在不加入任何外源RNA聚合酶的情况下，没有内源性整合T7 RNA聚合酶的编码基因的乳酸克鲁维酵母几乎不能进行体外蛋白合成反应；经上述内源性整合改造后，在不加入任何外源RNA聚合酶的情况下可以实现外源蛋白的高效表达。

乳酸克鲁维酵母细胞提取物的制备过程采用常规技术手段，参考CN109593656A记载的方法制备。制备步骤概括而言，包括：提供经发酵培养的乳酸克鲁维酵母细胞原料，用液氮将细胞速冻，将细胞打碎，离心收集上清液，即为细胞提取物。

1.3体外无细胞蛋白合成体系(不添加外源RNA聚合酶)

每个体系体积均为200μL，在平底48孔板中进行反应。每个样品设置3个平行样，计算均值和标准偏差(error bar)。

实验组(L-阿拉伯糖的浓度曲线考察，记为L-ara组)各组分的终浓度分别为：9.78mM Tris-HCl(pH 8.0)，80mM醋酸钾，5.6mM L-天门冬氨酸镁，1.8mM核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的浓度均为1.5mM)，0.5mM的氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，各自浓度均为0.5mM)，6％(w/v)海藻糖，2％(w/v)的聚乙二醇8000，6.05mM～110mM L-阿拉伯糖(L-Arabinose，简写为L-ara)，5.3wt％麦芽糊精，18mM磷酸三钾，50％体积的乳酸克鲁维酵母细胞提取物。

空白对照组(BC组)：相对于上述实验组，不加入L-阿拉伯糖。

阴性对照组(NC组)：相对于上述实验组，不加入L-阿拉伯糖(浓度为0mM)，后续也不加入外源DNA模板。

1.4进行体外蛋白合成反应：NC组不添加外源DNA模板；向上述L-ara组、BC组的每个独立的体外无细胞蛋白合成体系中分别加入终浓度0.33μg/μL编码mEGFP的DNA模板(经上述步骤1.1进行体外RCA扩增获得)，混匀后，所有体系均放置在30℃的环境中，摇床反应过夜。分别在3h、20h时取样进行荧光蛋白活性测试。

1.5荧光蛋白活性测定：反应结束后，将各反应体系立即放置于Envision 2120多功能酶标仪(Perkin Elmer)，检测荧光信号强弱，以相对荧光单位值(RelativeFluorescence Unit,RFU)作为活性单位。RFU值的高低反映了mEGFP蛋白合成量的多少。

分别对各反应体系进行荧光测试。测试参数：4000转/分钟，离心1分钟后，将待测样品放置于Envision 2120多功能酶标仪，检测获得相对荧光单位值(RFU)。

1.6实验结果：如图2所示。L-ara组中(添加L-阿拉伯糖的实验组)，在添加L-阿拉伯糖7.56mM～110mM浓度范围内，相对于不添加L-阿拉伯糖的空白对照组(BC组)均具有积极效果，蛋白合成效果提高10.77％～73.96％。其中，添加L-阿拉伯糖的浓度为28.84mM、18.46mM时，蛋白质合成产量分别提高73.96％、64.74％，显著提高了体外蛋白合成体系的蛋白合成能力。

实施例2L-阿拉伯糖的浓度对体外蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响

2.1制备核酸模板：采用实施例1中1.1的方法，构建表达mEGFP的质粒载体并进行体外DNA扩增，制备编码外源蛋白mEGFP的质粒DNA模板。

2.2参考实施例1中1.2的方法，基于乳酸克鲁维酵母菌株ATCC8585，将T7 RNA聚合酶的编码基因整合到乳酸克鲁维酵母的基因组中，获得可内源性表达T7 RNA聚合酶的改造菌株。发酵培养该改造菌株后，制备乳酸克鲁维酵母细胞提取物，编号为YY09161。

2.3体外无细胞蛋白合成反应体系(不添加外源RNA聚合酶)

反应体系体积均为300μL，在平底48孔板中进行反应。每个样品设置3个平行样，计算均值和标准偏差。

实验组(L-阿拉伯糖的浓度曲线考察，记为L-ara组)各组分的终浓度分别为：9.78mM pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，80mM醋酸钾，5.6mM L-天门冬氨酸镁，1.8mM核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的浓度均为1.5mM)，0.6mM的氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，各自浓度均为0.7mM)，6％(w/v)海藻糖，2％(w/v)聚乙二醇8000，6.05mM～110mM L-阿拉伯糖，5.3wt％麦芽糊精，24mM磷酸三钾，50％体积的乳酸克鲁维酵母细胞提取物。

空白对照组(BC组)：相对于上述L-ara实验组，不加入L-阿拉伯糖。

阴性对照组(NC组)：相对于上述L-ara实验组，不加入L-阿拉伯糖(浓度为0mM)，后续不加入外源DNA模板。

2.4进行体外蛋白合成反应：NC组不添加外源DNA模板；向上述L-ara组、BC组的每个独立的体外无细胞蛋白合成体系中分别加入终浓度0.33μg/μL编码mEGFP的DNA模板(经上述步骤2.1进行DNA扩增获得)，混匀后，所有体系均放置在30℃的环境中，摇床反应20h。

2.5荧光蛋白活性测定：采用实施例1中1.5的方法，测定mEGFP荧光蛋白的RFU值。

2.6实验结果：如图3所示。L-ara组中(添加L-阿拉伯糖的实验组)，在添加L-阿拉伯糖6.05mM～110mM浓度范围内，相对于不添加L-阿拉伯糖的空白对照组(BC组)均具有积极效果，蛋白合成效果提高7.22％～32％。其中，添加L-阿拉伯糖的浓度为7.56mM时，蛋白质合成产量提高32.0％。

实施例3L-阿拉伯糖的浓度对体外蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响

3.1制备核酸模板：采用实施例1中1.1的方法，构建表达mEGFP的质粒载体并进行体外DNA扩增，制备编码外源蛋白mEGFP的质粒DNA模板。

3.2参考实施例1中1.2的方法，基于乳酸克鲁维酵母菌株ATCC8585，将T7 RNA聚合酶的编码基因整合到乳酸克鲁维酵母的基因组中，获得可内源性表达T7 RNA聚合酶的改造菌株。发酵培养该改造菌株后，制备乳酸克鲁维酵母细胞提取物，编号为YY102211。

3.3体外无细胞蛋白合成反应体系(不添加外源RNA聚合酶)。

反应体系体积为200μL，在平底48孔板中进行反应。每个样品设置3个平行样，计算均值和标准偏差。

实验组(L-阿拉伯糖的浓度曲线考察，记为L-ara组)各组分的终浓度分别为：9.78mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl，pH 8.0)，80mM醋酸钾，5.6mM L-天门冬氨酸镁，1.8mM核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的浓度均为1.5mM)，0.5mM的氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，各自浓度均为0.5mM)，6％(w/v)海藻糖，2％(w/v)的聚乙二醇8000，4.84mM～45.06mM L-阿拉伯糖，5.3wt％麦芽糊精，18mM磷酸三钾，50％体积的乳酸克鲁维酵母细胞提取物。

空白对照组(BC组)：相对于上述L-ara实验组，不加入L-阿拉伯糖。

阴性对照组(NC组)：相对于上述L-ara实验组，不加入L-阿拉伯糖(浓度为0mM)，后续也不加入外源DNA模板。

3.4进行体外蛋白合成反应：NC组不添加外源DNA模板；向上述L-ara组、BC组的每个独立的体外无细胞蛋白合成体系中，分别加入终浓度0.33μg/μL编码mEGFP的DNA模板(经上述步骤3.1进行DNA扩增获得)，混匀后，所有体系均放置在30℃的环境中，摇床反应20h。

3.5荧光蛋白活性测定：采用实施例1中1.5的方法，测定mEGFP荧光蛋白的RFU值。

3.6实验结果：如图4所示。L-ara组中(添加L-阿拉伯糖的实验组)，在添加L-阿拉伯糖4.84mM～45mM浓度范围内，相对于不添加L-阿拉伯糖的空白对照组(BC组)均具有积极效果，蛋白合成效果提高15.13％～100.20％。其中，添加L-阿拉伯糖的浓度为9.45mM、28.84mM、7.56mM时，蛋白质合成产量分别提高100.2％、86.25％、71.71％，显著提高了体外蛋白合成体系的蛋白合成能力。

上述实施例1～3的实验结果表明，向基于乳酸克鲁维酵母细胞提取物的体外无细胞蛋白合成体系中添加L-阿拉伯糖，可提高体外蛋白合成能力，蛋白合成量普遍提高15％以上；在浓度适当的情况下，甚至可实现提高100％(翻倍)。

实施例4L-阿拉伯糖、葡萄糖对体外蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响比较

4.1制备核酸模板：采用实施例1中1.1的方法，构建表达mEGFP的质粒载体并进行体外DNA扩增，制备编码外源蛋白mEGFP的质粒DNA模板。

4.2采用实施例2中2.2的方法，基于乳酸克鲁维酵母菌株ATCC8585，将T7 RNA聚合酶的编码基因整合到乳酸克鲁维酵母的基因组中，获得可内源性表达T7 RNA聚合酶的改造菌株。发酵培养该改造菌株后，制备乳酸克鲁维酵母细胞提取物，编号为YY09161。

4.3体外无细胞蛋白合成反应体系(不添加外源RNA聚合酶)

反应体系体积均为300μL，在平底48孔板中进行反应。每个样品设置3个平行样，计算均值和标准偏差。

实验组(添加L-阿拉伯糖或葡萄糖)各组分的终浓度分别为：9.78mM Tris-HCl(pH为8.0)，80mM醋酸钾，5.0mM醋酸镁，1.5mM核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的浓度均为1.5mM)，0.7mM的氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，各自浓度均为0.7mM)，1.7mM二硫苏糖醇，2％(w/v)的聚乙二醇8000，29mM L-阿拉伯糖(L-ara-29mM)或15mM L-阿拉伯糖(L-ara-15mM)或15mM葡萄糖(Glu-15mM)，5.3wt％麦芽糊精，24mM磷酸三钾，50％体积的酵母细胞提取物。添加L-阿拉伯糖的组记为L-ara组(不添加葡萄糖)，添加葡萄糖的组记为GC组(不添加L-阿拉伯糖)。

阴性对照组(NC组)：相对于实验组，不加入L-阿拉伯糖(浓度为0mM)，后续也不加入外源DNA模板。

4.4进行体外蛋白合成反应：NC组不添加外源DNA模板，向上述L-ara组、GC组的每个独立的体外无细胞蛋白合成体系中分别加入终浓度0.33μg/μL编码mEGFP的DNA模板(经上述步骤4.1进行DNA扩增获得)，混匀后，所有体系均放置在30℃的环境中，摇床反应20h。

4.5荧光蛋白活性测定：采用实施例1中1.5的方法，测定mEGFP荧光蛋白的RFU值。

4.6实验结果如图5所示：相比15mM葡萄糖时的蛋白产量(RFU均值为1288)，L-阿拉伯糖浓度为29mM、15mM时，外源蛋白合成产量(RFU均值分别为1897、1644)，分别提高47.3％、27.6％。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于上述实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内或指导、启示下，可以有各种变化和更改，所作的任何具有等同技术效果的变化和更改，均在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 康码（上海）生物科技有限公司

<120> 一种体外无细胞蛋白合成体系（D2P体系）、其试剂盒及其应用

<130> 2020

<141> 2020-01-21

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60

gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgcgc ggcgagggcg agggcgatgc caccaacggc 120

aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180

gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240

cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catctccttc 300

aaggacgacg gcacctacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360

aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420

ctggagtaca acttcaacag ccacaacgtc tatatcacgg ccgacaagca gaagaacggc 480

atcaaggcga acttcaagat ccgccacaac gtcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540

cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600

ctgagcaccc agtccaagct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660

ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaa 717

<210> 2

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys

35 40 45

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50 55 60

Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln

65 70 75 80

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

85 90 95

Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val

100 105 110

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile

115 120 125

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130 135 140

Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly

145 150 155 160

Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val

165 170 175

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro

180 185 190

Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser

195 200 205

Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val

210 215 220

Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

Claims (16)

1.一种体外无细胞蛋白合成体系，其特征在于：所述体外无细胞蛋白合成体系包括乳酸克鲁维酵母细胞提取物、外源L-阿拉伯糖；所述体外无细胞蛋白合成体系能够与编码外源蛋白的核酸模板进行反应，合成外源蛋白；所述外源L-阿拉伯能够提高外源蛋白表达量。

2.根据权利要求1所述体外无细胞蛋白合成体系，其特征在于：将所述外源L-阿拉伯糖的浓度记为C_L-ara，所述C_L-ara选自，外源L-阿拉伯糖的浓度曲线中，外源蛋白表达量大于Y₀时外源L-阿拉伯糖的浓度区间；其中，所述外源L-阿拉伯糖的浓度曲线，指以外源L-阿拉伯糖的浓度为自变量、以外源蛋白表达量为因变量、其它反应参数确定时的浓度曲线；其中，所述Y₀指所述C_L-ara为0时对应的外源蛋白表达量；

优选地，所述C_L-ara选自外源蛋白表达量至少为Y₀+50％Y_Δ时的浓度区间；

更优选地，所述C_L-ara选自外源蛋白表达量至少为Y₀+60％Y_Δ时的浓度区间；

更优选地，所述C_L-ara选自外源蛋白表达量至少为Y₀+70％Y_Δ时的浓度区间；

更优选地，所述C_L-ara选自外源蛋白表达量至少为Y₀+80％Y_Δ时的浓度区间；

更优选地，所述C_L-ara选自外源蛋白表达量至少为Y₀+90％Y_Δ时的浓度区间；

更优选地，所述C_L-ara选自外源蛋白表达量至少为Y₀+95％Y_Δ时的浓度区间；

更优选地，所述C_L-ara为外源蛋白最高表达量时的浓度值C_max；

其中，所述Y_Δ＝Y_max-Y₀；其中，所述Y_max指所述外源L-阿拉伯糖的浓度曲线中外源蛋白的最高表达量。

3.根据权利要求2所述体外无细胞蛋白合成体系，其特征在于：所述外源L-阿拉伯糖的浓度选自：2mM～400mM、5mM～150mM、6mM～110mM、5mM～50mM、4.8mM～36mM、7.56mM、7.5mM、7.6mM、28.84mM、29mM或30mM。

4.根据权利要求1-3中任一项所述体外无细胞蛋白合成体系，其特征在于：所述体外无细胞蛋白合成体系还包括RNA聚合酶；所述RNA聚合酶的来源选自以下任一种：含内源性表达的RNA聚合酶的细胞提取物、外源RNA聚合酶、编码RNA聚合酶的外源核酸模板的翻译产物、或者其组合；

优选地，所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶。

5.根据权利要求1-4中任一项所述体外无细胞蛋白合成体系，其特征在于：所述体外无细胞蛋白合成体系还包括DNA聚合酶；所述DNA聚合酶的来源选自以下任一种：含内源性表达的DNA聚合酶的细胞提取物、外源DNA聚合酶、编码DNA聚合酶的外源核酸模板的翻译产物、或者其组合；

优选地，所述DNA聚合酶为phi 29DNA聚合酶。

6.根据权利要求1-5中任一项所述体外无细胞蛋白合成体系，其特征在于：所述乳酸克鲁维酵母细胞提取物中含有内源性表达的RNA聚合酶；

优选之一，通过对乳酸克鲁维酵母进行内源性菌株改造后制备细胞提取物实现，改造方式选自：将RNA聚合酶的编码序列插入到细胞内游离质粒，或者将RNA聚合酶的编码基因整合到细胞基因组，或者采用前述两种方式的组合方式；

优选之一，所述内源性表达的RNA聚合酶为内源性表达的T7 RNA聚合酶。

7.根据权利要求1-6中任一项所述体外无细胞蛋白合成体系，其特征在于：所述体外无细胞蛋白合成体系包括以下至少一种组分：外源性RNA聚合酶、外源性DNA聚合酶。

8.根据权利要求1-7中任一项所述体外无细胞蛋白合成体系，其特征在于：所述体外无细胞蛋白合成体系还包括能量系统；

优选地，所述能量系统选自以下任一种：糖与磷酸盐能量体系、糖与磷酸肌酸能量体系、磷酸肌酸与磷酸肌酸酶体系、磷酸肌酸与磷酸肌酸激酶体系、单糖及其酵解中间产物、糖原及其酵解中间产物、或者其组合。

9.根据权利要求1-8中任一项所述体外无细胞蛋白合成体系，其特征在于：所述体外无细胞蛋白合成体系还包括合成RNA的底物和/或合成蛋白的底物；

优选地，所述合成RNA的底物为核苷酸混合物，更优选地选自：核苷单磷酸、核苷三磷酸、或者其组合；

优选地，所述合成蛋白的底物为氨基酸混合物，至少包括合成外源蛋白过程所需的氨基酸混合物；更优选地，所述氨基酸混合物为天然氨基酸的混合物。

10.根据权利要求1-9中任一项所述体外无细胞蛋白合成体系，其特征在于：所述体外无细胞蛋白合成体系还包括以下至少一种组分：拥挤剂、镁离子、钾离子、抗氧化剂或还原剂、海藻糖、反应促进剂、缓冲剂、水性溶剂；

所述拥挤剂优选聚乙二醇、葡聚糖、Ficoll蔗糖聚合物、或者其组合；

所述镁离子优选来自：天门冬氨酸镁、醋酸镁、谷氨酸镁、氯化镁、磷酸镁、硫酸镁、柠檬酸镁、磷酸氢镁、碘化镁、乳酸镁、硝酸镁、草酸镁、或者其组合；

所述钾离子优选来自：醋酸钾、谷氨酸钾、氯化钾、磷酸钾、硫酸钾、柠檬酸钾、磷酸氢钾、碘化钾、乳酸钾、硝酸钾、草酸钾、或者其组合；

所述抗氧化剂或还原剂优选为二硫苏糖醇；

所述缓冲剂优选选自以下任一种：Tris-HCl、Tris碱、HEPES、或者其组合；

所述水性溶剂优选为缓冲剂。

11.根据权利要求1-10中任一项所述体外无细胞蛋白合成体系，其特征在于，所述外源蛋白选自以下任一种蛋白、任意组合方式的融合蛋白、任意组合方式的混合物：荧光素酶、绿色荧光蛋白、增强绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰tRNA合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域、萤光素酶突变体、α-淀粉酶、肠道菌素A、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、胰岛素前体、干扰素αA、白细胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、单链抗体段、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶、大肠杆菌β-半乳糖苷酶、人赖氨酸-tRNA合成酶、人亮氨酸-tRNA合成酶、拟南芥甘油醛3-磷酸脱氢酶、鼠过氧化氢酶、前述任一种的突变体。

12.根据权利要求1-11中任一项所述体外无细胞蛋白合成体系，其特征在于：所述体外无细胞蛋白合成体系能够与编码外源蛋白的DNA模板或mRNA模板进行反应，合成外源蛋白。

13.一种体外蛋白合成试剂盒，其特征在于，所述体外蛋白合成试剂盒包括：

(i)权利要求1-12中任一项所述体外无细胞蛋白合成体系；

(ii)可选地包括编码外源蛋白的核酸模板，所述编码外源蛋白的核酸模板含有能够被(i)中的体系组分所识别的启动子元件；

(iii)标签或说明书；

优选地，所述编码外源蛋白的核酸模板中含有T7启动子，所述体外无细胞蛋白合成体系包括T7 RNA聚合酶；

更优选地，所述编码外源蛋白的核酸模板中含有T7启动子，所述乳酸克鲁维酵母细胞提取物包括内源性表达的T7 RNA聚合酶；

所述编码外源蛋白的核酸模板为DNA模板、mRNA模板、或者其组合；

优选地，所述编码外源蛋白的核酸模板还含有其它翻译相关元件；

优选地，所述编码外源蛋白的核酸模板包括外源蛋白翻译系统、抗性基因翻译系统、Lac抑制子翻译系统；上述翻译系统中分别包括相应的启动子；

优选地，所述编码外源蛋白的核酸模板还含有控制质粒拷贝数的基因；

优选地，所述编码外源蛋白的核酸模板还含有翻译增强元件。

14.一种外源蛋白的合成方法，其特征在于，所述外源蛋白的合成方法包括以下步骤：

(i)提供权利要求1-12中任一项所述体外无细胞蛋白合成体系；

(ii)向步骤(i)所述体外无细胞蛋白合成体系中添加编码外源蛋白的核酸模板，孵育反应，合成所述外源蛋白；所述编码外源蛋白的核酸模板含有能够被(i)中体系组分所识别的启动子元件；

还可选地包括步骤(iii)分离或/和检测所述外源蛋白；

优选地，外源蛋白的基因转录过程由核酸模板上的T7启动子启动，所述体外无细胞蛋白合成体系包括T7 RNA聚合酶；

更优选地，外源蛋白的基因转录过程由核酸模板上的T7启动子启动，所述乳酸克鲁维酵母细胞提取物包括内源性表达的T7 RNA聚合酶；

所述编码外源蛋白的核酸模板为DNA模板、mRNA模板、或者其组合；

优选地，所述编码外源蛋白的核酸模板还含有其它翻译相关元件；

优选地，所述编码外源蛋白的核酸模板包括外源蛋白翻译系统、抗性基因翻译系统、Lac抑制子翻译系统；上述翻译系统中分别包括相应的启动子；

优选地，所述编码外源蛋白的核酸模板还含有控制质粒拷贝数的基因；

优选地，所述编码外源蛋白的核酸模板还含有翻译增强元件。

15.权利要求1-12中任一项所述体外无细胞蛋白合成体系的应用，其特征在于，用于蛋白合成方面；

优选地，应用于蛋白制造，或者应用于基于蛋白合成的检测。

16.L-阿拉伯糖在权利要求1-12中任一项所述体外无细胞蛋白合成体系中的应用，或在权利要求13所述体外蛋白合成试剂盒中的应用，或在权利要求14所述外源蛋白的合成方法中的应用。

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