JP7028986B2 - タンパク質合成効率を高めることができるタンデムdnaエレメント - Google Patents
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Description
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5(I)
式中、Z1~Z5は、それぞれ、構築物の一部としてのエレメントであり、
各「-」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Z1は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントは、IRESエレメントを含み、
Z2は、タバコモザイクウイルスの5’リーダー配列(leading sequence)であり、つまりΩ配列であり、
Z3は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖であり、[オリゴ(A)]nで表され、
Z4は、翻訳開始コドンであり、
Z5は、セリンコドンであり、
Z3、Z4およびZ5は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は、酵母に由来する。
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6(II)
式中、Z1~Z6は、それぞれ核酸構築物の一部としてのエレメントであり、
各「-」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Z1はエンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントはIRESエレメントを含み、
Z2は、タバコモザイクウイルスの5’リーダー配列(leading sequence)であり、つまりΩ配列であり、
Z3は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖であり、[オリゴ(A)]nで表され、
Z4は、翻訳開始コドンであり、
Z5は、セリンコドンであり、
Z6は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Z3、Z4およびZ5は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は、酵母に由来する。
Z0-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6(III)
式中、Z0~Z6は、それぞれ、核酸構築物の一部としてのエレメントであり、
各「-」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Z0は、プロモーターエレメントであり、プロモーターエレメントは、T7プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーターおよびこれらの組合せからなる群から選択され、
Z1は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントはIRESエレメントを含み、
Z2は、タバコモザイクウイルスの5’リーダー配列(leading sequence)であり、つまりΩ配列であり、
Z3は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖であり、[オリゴ(A)]nで表され、
Z4は、翻訳開始コドンであり、
Z5は、セリンコドンであり、
Z6は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Z3、Z4およびZ5は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は、酵母に由来する。
Z0’-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6(IV)
式中、Z0’~Z6は、それぞれ、構築物の一部としてのエレメントであり、
各「-」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Z0’は、GAAであり、
Z1は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントは、IRESエレメントを含み、
Z2は、タバコモザイクウイルスの5’リーダー配列(leading sequence)であり、つまりΩ配列であり、
Z3は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖であり、[オリゴ(A)]nで表され、
Z4は、翻訳開始コドンであり、
Z5は、セリンコドンであり、
Z6は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Z3、Z4およびZ5は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は、酵母に由来する。
(a)本発明の第1の態様から第4の態様に記載の核酸構築物、
(b)本発明の第5の態様に記載のベクター又はベクターの組合せ、および
(c)本発明の第6の態様による遺伝子組み換え細胞。
(i)真核生物系のインビトロ生合成系の存在下で、本発明の第1の態様から第4の態様による核酸構築物を提供する工程、
(ii)適切な条件下で、工程(i)の真核生物系のインビトロ生合成系をT1の期間インキュベートして、外来性タンパク質を合成する工程。
(a)真核細胞抽出物と、
(b)ポリエチレングリコールと、
(c)選択可能にある外来性スクロースと、
(d)水または水性溶媒であり、選択可能にある溶媒と、を含む。
(i)真核細胞を提供する工程と、
(ii)洗浄された真核細胞を得るために、真核細胞を洗浄する工程と、
(iii)洗浄された真核細胞を細胞溶解処理で処理し、粗真核細胞抽出物を得る工程と、
(iv)粗真核生物抽出物を固液分離により処理して、液相(すなわち、真核生物細胞抽出物)を得る工程と、を含む。
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5 (I)
各「-」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Z1は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントはIRESエレメントを含み、
Z2は、タバコモザイクウイルスの5’リーダー配列(leading sequence)であり、つまりΩ配列であり、
Z3は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖[oligo(A)]nであり、
Z4は、翻訳開始コドンであり、
Z5は、セリンコドンであり、
Z3、Z4およびZ5は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は酵母に由来する。
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6 (II)
各「-」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Z1は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントはIRESエレメントを含み、
Z2は、タバコモザイクウイルスの5’リーダー配列(leading sequence)であり、つまりΩ配列であり、
Z3は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖[oligo(A)]nであり、
Z4は、翻訳開始コドンであり、
Z5は、セリンコドンであり、
Z6は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Z3、Z4およびZ5は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は酵母に由来する。
Z0-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6 (III)
各「-」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Z0は、プロモーターエレメントであり、プロモーターエレメントは、T7プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーター、およびこれらの組合せからなる群から選択され、
Z1は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントはIRESエレメントを含み、
Z2は、タバコモザイクウイルスの5’リーダー配列(leading sequence)であり、つまりΩ配列であり、
Z3は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖[oligo(A)]nであり、
Z4は、翻訳開始コドンであり、
Z5は、セリンコドンであり、
Z6は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Z3、Z4およびZ5は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は酵母に由来する。
Z0’-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6(IV)
各「-」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Z0’はGAAであり、
Z1は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントはIRESエレメントを含み、
Z2は、タバコモザイクウイルスの5’リーダー配列(leading sequence)であり、つまりΩ配列であり、
Z3は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖[oligo(A)]nであり、
Z4は、翻訳開始コドンであり、
Z5は、セリンコドンであり、
Z6は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Z3、Z4およびZ5は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は酵母に由来する。
(i)真核生物系のインビトロ生合成系の存在下で、本発明の第1~第4の態様から選択される核酸構築物を提供する工程と、
(ii)適切な条件下で、工程(i)の真核生物系のインビトロ生合成系をT1の期間インキュベートして、外来性タンパク質を合成する工程と、を含む。
クルイベロマイセス・ラクティスの4つ内因性IRESおよびサッカロマイセス・セレビシエにおけるそれらと相同性を持つタンパク質に対応するIRES(表1に示す)は、インビトロタンパク質合成を開始することができる。Flucの合成を開始するIRESの中で、6つのIRES(KlFLO8、KlMSN1、KlNCE102、ScFLO8、ScMSN1およびScNCE102)は、従来のΩ配列よりも高い相対発光量(RLU)値を示した。他の2つIRES(KlBOI1およびScBOI1)は、Ω配列よりも低いRLU値を示した(図2に示す)。これらの8つのIRESは、Ω配列およびKozak配列とタンデムに連結されることが決定された。
8つの内因性IRESをΩ配列およびクルイベロマイセス・ラクティスに特異的Kozak配列とタンデムに連結し、Ω配列に対してIRESの上流または下流の位置を変化させる。その結果、合計16のタンデムDNAエレメントを設計した(KlFLO8、KlMSN1、KlNCE102、KlBOI1、ScFLO8、ScMSN1、ScMSN1、ScNCE102およびScBOI1-Ω-10A、ならびに、Ω-KlFLO8、KlMSN1、KlNCE102、KlBOI1、ScFLO8、ScMSN1、ScNCE102およびScBOI1-10A)。配列番号2~17に示されるタンデムエレメントの配列は、上記のタンデムDNAエレメント(KlFLO8、KlMSN1、KlNCE102、KlBOI1、ScFLO8、ScMSN1、ScNCE102およびScBOI1-Ω-10A、ならびに、Ω-KlFLO8、KlMSN1、KlNCE102、KlBOI1、ScFLO8、ScMSN1、ScNCE102およびScBOI1-10A)の配列にそれぞれ対応する。
上記に設計されたような16のタンデムエレメントは、Ω-10Aに置換するために、既存のΩ-10A-Flucプラスミド(カンマ-ヘルスケアコード(シャンハイ)バイオテックカンパニーリミテッドから入手、Ω-10A配列は配列番号1に示される)に挿入された。そして、16の新しいプラスミドは、形成された。得られた16の新しいプラスミドは、それぞれ、KlFLO8-Ω-10A-Fluc、KlMSN1-Ω-10A-Fluc、KlNCE102-Ω-10A-Fluc、KlBOI1-Ω-10A-Fluc、ScFLO8-Ω-10A-Fluc、ScMSN1-Ω-10A-Fluc、ScNCE102-Ω-10A-Fluc、ScBOI1-Ω-10A-Fluc、Ω-KlFLO8-10A-Fluc、Ω-KlMSN1-10A-Fluc、Ω-KlNCE102-10A-Fluc、Ω-KlBOI1-10A-Fluc、Ω-ScFLO8-10A-Fluc、Ω-ScMSN1-10A-Fluc、Ω-ScNCE102-10A-FlucおよびΩ-ScBOI1-10A-Flucだった。その中で、KlNCE102-Ω-10A-Fluc、ScFLO8-Ω-10A-Fluc、KlMSN1-Ω-10A-Fluc配列をそれぞれ配列番号85~87に示した。
Ω配列の上流または下流にそれぞれ位置することによって、Ω-10A-Flucプラスミドに、それぞれ8個の内因性IRESを挿入する。具体的に使用したプライマーを表2に示す。
Claims (14)
- 下記式Iの核酸配列を含むことを特徴とする核酸構築物。
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5(I)
(式中、Z1~Z5は、それぞれ前記酸構築物の一部としてのエレメントであり、
各「-」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Z1は、KlNCE102であるIRESエレメントを含むエンハンサーエレメントであり、
Z2は、タバコモザイクウイルスの5’リーダー配列(leading sequence)、つまりΩ配列であり、
Z3は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖[オリゴ(A)]nであり、
Z4は、翻訳開始コドンであり、
Z5は、セリンコドンであり、
Z3、Z4およびZ5は、酵母に由来するKozak配列を構成する。) - 前記核酸構築物の核酸配列は、配列番号4である請求項1に記載の核酸構築物。
- 5’から3’に下記式IIの構造を含むことを特徴とする核酸構築物。
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6 (II)
(式中、Z1~Z6は、それぞれ前記核酸構築物の一部としてのエレメントであり、
各「-」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Z1は、KlNCE102であるIRESエレメントを含むエンハンサーエレメントであり、
Z2は、タバコモザイクウイルスの5’リーダー配列(leading sequence)、つまりΩ配列であり、
Z3は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖[オリゴ(A)]nであり、
Z4は、翻訳開始コドンであり、
Z5は、セリンコドンであり、
Z6は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Z3、Z4およびZ5は、酵母に由来するKozak配列を構成する。) - 前記外来性タンパク質のコード配列は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル-tRNAシンセターゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α-アミラーゼ、エンテロシンA、C型肝炎ウイルスE2糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαA、インターロイキン-1β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択される外来性タンパク質をコードする、好ましくは、前記外来性タンパク質のコード配列は、ホタルルシフェラーゼをコードする請求項3に記載の核酸構築物。
- 前記外来性タンパク質は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル-tRNAシンセターゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α-アミラーゼ、エンテロシンA、C型肝炎ウイルスE2糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαA、インターロイキン-1β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、前記外来性タンパク質は、ホタルルシフェラーゼである請求項3に記載の核酸構築物。
- 5’から3’に下記式IIIの構造を含むことを特徴とする核酸構築物。
Z0-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6 (III)
(式中、Z0~Z6は、それぞれ前記核酸構築物の一部としてのエレメントであり、
各「-」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Z0は、T7プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーター、およびこれらの組合せからなる群から選択されるプロモーターエレメントであり、
Z1は、KlNCE102であるIRESエレメントを含むエンハンサーエレメントであり、
Z2は、タバコモザイクウイルスの5’リーダー配列(leading sequence)、つまりΩ配列であり、
Z3は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖[オリゴ(A)]nであり、
Z4は、翻訳開始コドンであり、
Z5は、セリンコドンであり、
Z6は、外来性タンパク質のコード配列であり、好ましくは、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル-tRNAシンセターゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α-アミラーゼ、エンテロシンA、C型肝炎ウイルスE2糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαA、インターロイキン-1β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択される外来性タンパク質のコード配列であり、より好ましくは、ホタルルシフェラーゼのコード配列であり、
Z3、Z4およびZ5は、酵母に由来するKozak配列を構成する。) - 5’から3’に下記式IVの構造を含むことを特徴とする核酸構築物。
Z0’-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6(IV)
(式中、Z0’~Z6は、それぞれ前記核酸構築物の一部としてのエレメントであり、
各「-」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Z0’は、GAAであり、
Z1は、KlNCE102であるIRESエレメントを含むエンハンサーエレメントであり、
Z2は、タバコモザイクウイルスの5’リーダー配列(leading sequence)、つまりΩ配列であり、
Z3は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖[オリゴ(A)]nであり、
Z4は、翻訳開始コドンであり、
Z5は、セリンコドンであり、
Z6は、外来性タンパク質のコード配列であり、好ましくは、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル-tRNAシンセターゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α-アミラーゼ、エンテロシンA、C型肝炎ウイルスE2糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαA、インターロイキン-1β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択される外来性タンパク質のコード配列であり、より好ましくは、ホタルルシフェラーゼのコード配列であり、
Z3、Z4およびZ5は、酵母に由来するKozak配列を構成する。) - 請求項1~7のいずれか一項に記載の前記核酸構築物を含むことを特徴とするベクターまたはベクターの組合せ。
- 遺伝子組み換え細胞のゲノムが1つ以上の部位で請求項1~7のいずれか一項に記載の前記核酸構築物と一体化される、または、遺伝子組み換え細胞が請求項8に記載の前記ベクターまたは前記ベクターの組み合わせを含むことを特徴とする遺伝子組み換え細胞。
- 試薬を含むキットであって、前記試薬は、
グループ(a)請求項1~7のいずれか一項に記載の前記核酸構築物と、
グループ(b)請求項8に記載の前記ベクターまたは前記ベクターの組合せと、
グループ(c)請求項9に記載の前記遺伝子組み換え細胞と、のうちの1つまたは複数から選択されることを特徴とするキット。 - ハイスループットのインビトロタンパク質合成のための、請求項1~7のいずれか一項に記載の核酸構築物、請求項8に記載のベクターまたはベクターの組合せ、請求項9に記載の遺伝子組み換え細胞、または、請求項10に記載のキットの使用。
- 外来性タンパク質のためのインビトロハイスループット合成方法であって、前記方法は、
ステップ(i)真核生物系のインビトロ生合成系の存在下で、請求項1~7のいずれか一項に記載の前記核酸構築物を提供する工程と、
ステップ(ii)適切な条件下で、前記工程(i)の前記真核生物系のインビトロ生合成系を2~6時間インキュベートして、外来性タンパク質を合成する工程と、を含むことを特徴とする外来性タンパク質のためのインビトロハイスループット合成方法。 - (iii)前記真核生物系のインビトロ生合成系から前記外来性タンパク質を単離する工程、
前記真核生物系のインビトロ生合成系から前記外来性タンパク質を検出する工程、または、
それらの組み合わせをさらに含む請求項12に記載のインビトロハイスループット合成方法。 - 前記真核生物系のインビトロ生合成系は、酵母系のインビトロ生合成系である請求項12に記載のインビトロハイスループット合成方法。
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