KR20200036925A - 이중-가닥 콘카테머 dna를 사용하는 무세포 단백질 발현 - Google Patents
이중-가닥 콘카테머 dna를 사용하는 무세포 단백질 발현 Download PDFInfo
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Abstract
진핵생물 무세포 발현 시스템에서 이중-가닥 콘카테머 DNA를 사용하는 시험관내 전사 및 번역을 위한 방법이 제공된다. 이러한 방법은 (a) 이중-가닥 콘카테머 DNA를 진핵생물 무세포 발현 시스템과 접촉시키는 단계, 및 (b) 진핵생물 무세포 발현 시스템에서 이중-가닥 콘카테머 DNA로부터 단백질을 시험관내 발현하는 단계를 포함한다. 이중-가닥 콘카테머 DNA는 복수의 탠덤 반복 서열을 포함한다. 복수의 탠덤 반복 서열은 프로모터, 캡-비의존적 번역 요소 (CITE), 및 오픈 리딩 프레임을 포함하는 발현 서열을 포함한다. 진핵생물 무세포 발현 시스템 내 이중-가닥 콘카테머 DNA의 최종 농도는 약 0.1 ng/μL 내지 약 35 ng/μL 범위이다. RCA 산물 DNA가 이러한 방법을 위한 이중 가닥 콘카테머 DNA로서 사용될 수 있다.
Description
서열 목록
본 출원은 서열 목록을 함유하며, 이는 ASCII 포맷으로 전자 제출되었고, 그에 의해 전문이 참조로 포함된다. 2017년 6월 16일에 생성된 상기 ASCII 카피는 파일명이 316478-1_SL.txt이고, 5,663 바이트 크기이다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 이중-가닥 콘카테머 DNA의 시험관내 전사 및 번역 (IVTT: in vitro transcription and translation)을 수반하는 개선된 무세포 단백질 발현 시스템에 관한 것이다.
무세포 단백질 발현은 세포 배양, 세포 조작 또는 세포 형질감염의 복잡함 없이 단백질을 생성시키는 간단하고 효율적인 방법을 제공한다. 재조합 단백질을 발현하기 위한 무세포 단백질 발현 시스템은 세포-기반 발현 시스템의 다양한 제한사항 예컨대 단백질 독성, 단백질 분해, 단백질 응집 및 미스폴딩, 제어되지 않은 번역후 변형, 또는 세포 기구의 격리로 인한 세포 성장에 대한 단백질 발현의 부정적인 효과를 해결한다. 무세포 단백질 발현 시스템을 사용하여 더 짧은 기간 내에 상당히 더 높은 양의 단백질이 발현될 수 있으며, 이는 하류의 고처리량 구조 및 기능 분석에 사용될 수 있다. 이같은 시험관내 단백질 발현은 또한 비용 절감, 합리화된 생산, 더 쉬운 규모 증대 및 단순화된 정제의 관점에서 상당한 이점이 있다. 무세포 단백질 발현 시스템에서, 관심 단백질의 유전자를 코딩하는 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)을 전사-번역-적격 세포 추출물에 첨가하고, 관심 유전자의 전사 및/또는 번역을 수행함으로써, 원하는 관심 단백질이 발현된다. 관심 유전자를 함유하는 DNA의 전사 및 번역은 단일 반응으로 커플링되어 새롭게 합성된 mRNA가 즉각적으로 단백질로 번역되게 할 수 있거나, 또는 연결될 수 있고, 이러한 경우에는 제1 반응에서 mRNA가 생성된 후, 생성된 mRNA가 제2 반응에서 단백질로 번역된다. 일반적으로, 커플링된 시험관내 전사 및 번역 (무세포 시스템에서의 커플링된 전사-번역)은 더 적은 시간 및 시험관내 조작으로 발현 단백질의 수율을 증가시킨다. mRNA의 즉각적인 번역은 mRNA 분해 또는 미스폴딩과 연관된 가능한 유해 효과를 또한 방지한다.
시험관내 전사-번역 시스템의 하나의 제한사항은 더 많은 양 (일반적으로 마이크로그램 양)의 DNA 주형을 필요로 한다는 것이다. 일반적으로, 충분한 양의 이같은 DNA 주형은 다중 워크플로우 단계 및 상당한 노력을 통해서만 수득될 수 있다. 예를 들어, 다중 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)으로부터 DNA 주형을 합성하고/거나 DNA 주형을 플라스미드 벡터 내로 클로닝하고, 플라스미드 벡터를 숙주 세포 예컨대 이. 콜라이(E. coli)에서 증폭시킴으로써 IVTT를 위한 적합한 DNA 주형이 생성될 수 있다. 그러나, 부분적으로는 PCR의 높은 돌연변이율로 인해, PCR은 종종 고품질 DNA의 대규모 생성에 적합하지 않다. 추가적으로, PCR 반응의 열 사이클링은 온도가 얼마나 빨리 대량으로 증가될 수 있는지에 대한 제한으로 인해 더 큰 반응으로 규모를 증대시키기가 어렵다. 또한, 선형 DNA 서열인 PCR 산물이 무세포 전사-번역 추출물 내에 존재하는 뉴클레아제에 의해 급속하게 분해된다. 추가로, 관심 유전자를 플라스미드 벡터 내로 서브클로닝한 후, 유전자 선별을 통해 이. 콜라이에서 대규모로 증식시키는 것은 시간 소모적이고, 노동 집약적이다.
일반적으로, 포유동물 무세포 추출물에서의 무세포 전사 및 번역은 원핵생물 세포 추출물을 사용하는 것만큼 효율적이지 않다. 포유동물 무세포 추출물을 사용하여 단백질 발현을 증진시키는 하나의 통상적인 방법은 과량의 시약 (예를 들어, 아미노산 및 에너지 공급원)을 공급하고, 투석 막을 사용하여 번역에 유해하게 영향을 미치는 폐기물을 제거하는 것이다. 그러나, 투석 공정에서, IVTT 반응의 부피가 상당히 증가한다. 추가로, 주형 DNA가 투석 챔버로부터 회수되지 않을 수 있다. 따라서, 투석이 사용되는 경우에 효율적인 IVTT를 위한 주형 DNA의 필요한 최종 농도를 유지하기 위해 주형 DNA가 실질적으로 더 많은 양으로 제공되어야 한다.
등온 DNA 증폭 기술 예컨대 롤링 서클 증폭 (RCA)을 더 적은 노력, 시간 및 비용으로 다량의 고품질 DNA를 생성시키는데 사용할 수 있다. 급속한 가열 및 냉각이 필요하지 않기 때문에, 등온 증폭 반응은 더 큰 반응 크기로 규모를 증대시키게 한다. 롤링 서클 증폭은 원형 DNA 주형을 사용하고, 주형 DNA의 탠덤 반복 단위 (콘카테머)인 RCA 산물을 생성시킨다. 플라스미드 DNA의 RCA에 이어지는 커플링된 시험관내 전사 및 번역으로 관심 단백질이 생성될 수 있다. 그러나, 일반적으로 이러한 플라스미드는 숙주 세포 예컨대 이. 콜라이 내부에서의 유전적 선별을 수반하는 표준 클로닝 방법을 통해 생성된다. 이같은 플라스미드는 복제 기원 (예를 들어, oriC), 항생제 선별 (예를 들어, 베타-락타마제의 경우의 amp), 및 숙주 세포에서 플라스미드를 선별 및/또는 스크리닝하는데 사용되는 부속 서열 (예를 들어, lacZ, 베타-갈락토시다제)을 위한 서열을 포함하는 다수의 추가적인 코딩 및 비-코딩 서열을 함유한다. 이러한 보조 서열의 전사 및/또는 발현은 원치 않고, 전체 워크플로우를 비효율적이게 만들 수 있다.
플라스미드 DNA에 비교하여 제한된 농도의 주형 DNA로부터 원하는 단백질을 용이하게 생성시키기 위한 개선된 진핵생물 시험관내 전사 및 번역 시스템이 요구되고, 따라서 PCR-기반 주형 DNA 합성을 필요로 하지 않는다. 또한, 간단하고, 비용-효과적이며, 시간을 덜 소모하는 방법을 사용하여 무세포 단백질 시스템을 가능하게 하는 것이 바람직하다.
일부 실시양태에서, 이중-가닥 콘카테머 DNA를 사용하는 시험관내 전사 및 번역을 위한 방법이 제공된다. 이러한 방법은 (a) 이중-가닥 콘카테머 DNA를 진핵생물 무세포 발현 시스템과 접촉시키는 단계, 및 (b) 진핵생물 무세포 발현 시스템에서 이중-가닥 콘카테머 DNA로부터 단백질을 시험관내 발현하는 단계를 포함한다. 이중-가닥 콘카테머 DNA는 복수의 탠덤 반복 서열을 포함하고, 여기서 복수의 탠덤 반복 서열 각각은 발현 서열을 포함한다. 발현 서열은 프로모터, 캡-비의존적 번역 요소 (CITE), 및 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함한다. 진핵생물 무세포 발현 시스템 내 이중-가닥 콘카테머 DNA의 최종 농도는 약 0.1 ng/μL 내지 약 35 ng/μL 범위이다.
일부 실시양태에서, DNA 미니-서클로부터 생성된 이중-가닥 콘카테머 (DNA)를 사용하는 시험관내 전사 및 번역을 위한 방법이 제공된다. 이러한 방법은 (a) DNA 미니-서클을 제공하는 단계, (b) DNA 미니-서클의 롤링 서클 증폭을 통해 이중-가닥 콘카테머 DNA를 생성시키는 단계, 및 (c) 생성된 이중-가닥 콘카테머 DNA를 시험관내에서 진핵생물 무세포 발현 시스템과 접촉시켜 전사 및 번역을 통해 이중-가닥 콘카테머 DNA로부터 단백질을 발현하는 단계를 포함한다. 진핵생물 무세포 발현 시스템 내 이중-가닥 콘카테머 DNA의 최종 농도는 약 0.1 ng/μL 내지 35 ng/μL 범위이다.
본 발명의 이러한 특색, 측면 및 이점 및 다른 특색, 측면 및 이점이 첨부된 도면을 참조로 하기의 상세한 설명을 읽을 때 더욱 잘 이해될 것이다.
도 1은 증폭되지 않은 플라스미드 DNA에 비교하여, 시험관내 전사 및 번역을 위한 주형으로서 플라스미드 DNA로부터 생성된 상이한 농도의 티오에이트화 또는 비-티오에이트화 RCA 산물 DNA를 사용하는 터보(Turbo) 녹색 형광 단백질 (터보GFP)의 무세포 발현을 예시한다.
도 2는 미니멀리즘적 발현 서열을 갖는 DNA 미니-서클을 예시한다.
도 3은 DNA 미니-서클로부터 유래된 상이한 농도의 RCA 산물 DNA가 시험관내 전사 및 번역 반응에 사용되었을 때의 증진된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 무세포 발현을 예시하는 SDS PAGE의 영상이다. pCFE-GFP 플라스미드의 IVTT에 의한 터보GFP 발현이 대조군으로서 사용되었다.
도 4는 도 3의 SDS-PAGE의 겔 밀도측정에 의해 생성된, DNA 미니-서클로부터 유래된 여러 농도의 RCA 산물 DNA를 사용하는 증진된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 대조군으로서의 플라스미드 DNA 주형의 것과의 비교 무세포 발현을 예시한다.
도 5는 DNA 미니-서클로부터 유래된 RCA 산물 DNA가 자기 비드에 접합되어 시험관내 전사 및 번역을 위한 주형으로서 사용되었을 때의 증진된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 무세포 발현을 대조군으로서의 터보GFP를 코딩하는 비-접합 플라스미드 DNA 주형과 함께 예시한다.
도 6a-c는 2개의 발현 서열을 포함하는 탠덤 반복 서열의 개략도이며, 여기서 발현 서열은 동일한 단백질을 코딩하거나 (도 6a), 발현 서열은 2개의 상이한 단백질을 코딩하거나 (도 6b), 또는 각각의 발현 서열은 2개의 상이한 단백질을 코딩하는 2개의 ORF를 포함한다 (도 6c).
도 1은 증폭되지 않은 플라스미드 DNA에 비교하여, 시험관내 전사 및 번역을 위한 주형으로서 플라스미드 DNA로부터 생성된 상이한 농도의 티오에이트화 또는 비-티오에이트화 RCA 산물 DNA를 사용하는 터보(Turbo) 녹색 형광 단백질 (터보GFP)의 무세포 발현을 예시한다.
도 2는 미니멀리즘적 발현 서열을 갖는 DNA 미니-서클을 예시한다.
도 3은 DNA 미니-서클로부터 유래된 상이한 농도의 RCA 산물 DNA가 시험관내 전사 및 번역 반응에 사용되었을 때의 증진된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 무세포 발현을 예시하는 SDS PAGE의 영상이다. pCFE-GFP 플라스미드의 IVTT에 의한 터보GFP 발현이 대조군으로서 사용되었다.
도 4는 도 3의 SDS-PAGE의 겔 밀도측정에 의해 생성된, DNA 미니-서클로부터 유래된 여러 농도의 RCA 산물 DNA를 사용하는 증진된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 대조군으로서의 플라스미드 DNA 주형의 것과의 비교 무세포 발현을 예시한다.
도 5는 DNA 미니-서클로부터 유래된 RCA 산물 DNA가 자기 비드에 접합되어 시험관내 전사 및 번역을 위한 주형으로서 사용되었을 때의 증진된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 무세포 발현을 대조군으로서의 터보GFP를 코딩하는 비-접합 플라스미드 DNA 주형과 함께 예시한다.
도 6a-c는 2개의 발현 서열을 포함하는 탠덤 반복 서열의 개략도이며, 여기서 발현 서열은 동일한 단백질을 코딩하거나 (도 6a), 발현 서열은 2개의 상이한 단백질을 코딩하거나 (도 6b), 또는 각각의 발현 서열은 2개의 상이한 단백질을 코딩하는 2개의 ORF를 포함한다 (도 6c).
하기의 상세한 설명은 예시적이고, 본 발명 또는 본 발명의 용도를 제한하도록 의도되지 않는다. 명세서 전반에 걸쳐, 특정 용어의 예시는 비제한적인 예로서 간주되어야 한다. 단수 형태는 문맥적으로 명확하게 달리 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 근사 언어는, 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 본원에 사용된 바와 같이, 자신이 관련된 기본 기능의 변화를 초래하지 않으면서 허용가능하게 변할 수 있는 임의의 정량적 표현을 수식하기 위해 적용될 수 있다. 따라서, "약"과 같은 용어가 수식하는 값은 명시된 정확한 값으로 한정되지 않아야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에서 사용된 성분, 성질 예컨대 분자량, 반응 조건 등의 양을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"으로 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 지시되지 않는 한, 하기 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 숫자 파라미터는 본 발명에 의해 수득하려고 추구하는 원하는 성질에 따라 변할 수 있는 근사값이다. 필요한 경우에, 범위가 제공되고, 이러한 범위는 그 사이의 모든 하위 범위를 포함한다. 청구된 발명의 주제를 더욱 명확하게, 그리고 간결하게 기술하고 지시하기 위해, 하기 설명 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 특정 용어에 대해 하기의 정의가 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오시드"는 핵산 염기 (핵염기)가 당 모이어티에 연결되어 있는 글리코실아민 화합물을 지칭한다. "뉴클레오티드"는 뉴클레오시드 포스페이트를 지칭한다. 뉴클레오티드는 표 1에 기술된 바와 같이 그의 뉴클레오시드에 상응하는 알파벳 문자 (문자 명칭)를 사용하여 표현될 수 있다. 예를 들어, A는 아데노신 (핵염기 아데닌을 함유하는 뉴클레오시드)을 가리키고, C는 시티딘을 가리키고, G는 구아노신을 가리키고, U는 우리딘을 가리키며, T는 티미딘 (5-메틸 우리딘)을 가리킨다. N은 랜덤 뉴클레오시드를 나타내고, dNTP는 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트를 지칭한다. N은 A, C, G, 또는 T/U 중 어느 하나일 수 있다.
표 1: 다양한 뉴클레오티드의 문자 명칭
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오티드 유사체"는 천연 발생 뉴클레오티드와 구조적으로 유사한 화합물을 지칭한다. 뉴클레오티드 유사체는 변경된 포스페이트 골격, 당 모이어티, 핵염기, 또는 그의 조합을 가질 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 천연 뉴클레오티드, 합성 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드, 또는 대용 교체 모이어티 (예를 들어, 이노신)일 수 있다. 일반적으로, 핵염기가 변경된 뉴클레오티드 유사체는, 특히, 상이한 염기 페어링 및 염기 스태킹 성질을 부여한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "LNA (잠금 핵산) 뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 당 모이어티가 리보핵산 (RNA)-모방 당 형상으로 잠겨진 비시클릭 푸라노스 단위를 함유하는 뉴클레오티드 유사체를 지칭한다. 데옥시리보뉴클레오티드 (또는 리보뉴클레오티드)로부터 LNA 뉴클레오티드로의 구조적 변화는 화학적 관점, 즉 2' 위치와 4' 위치의 탄소 원자 사이의 추가적인 연결 (예를 들어, 2'-C, 4'-C-옥시메틸렌 연결)의 도입에서 제한된다 (예를 들어, 문헌 [Singh, S. K., et al., Chem. Comm., 4, 455-456, 1998], 또는 [Koshkin, A. A., et al., Tetrahedron, 54, 3607-3630, 1998] 참조). LNA 뉴클레오티드 내 푸라노스 단위의 2' 및 4' 위치는 O-메틸렌 (예를 들어, 옥시-LNA: 2'-O, 4'-C-메틸렌-β-D-리보푸라노실 뉴클레오티드), S-메틸렌 (티오-LNA), 또는 NH-메틸렌 모이어티 (아미노-LNA) 등에 의해 연결될 수 있다. 이같은 연결은 푸라노스 고리의 형상 자유도를 제한한다. LNA 올리고뉴클레오티드는 상보적인 단일-가닥 RNA, 및 상보적인 단일- 또는 이중-가닥 DNA에 대한 증진된 혼성화 친화성을 나타낸다. LNA 올리고뉴클레오티드는 A형 (RNA-유사) 듀플렉스 형상을 유도할 수 있다. PNA의 백본은 펩티드 결합에 의해 연결된 반복되는 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로 구성된다. 다양한 퓨린 및 피리미딘 염기가 메틸렌 다리 (-CH2-) 및 카르보닐 기 (-(C=O)-)에 의해 백본에 연결된다. PNA는 N-말단이 첫번째 (왼쪽) 위치에 있고, C-말단이 마지막 (오른쪽) 위치에 있으면서 펩티드와 유사하게 도시된다. PNA 올리고머는 상보적 DNA에 결합하는 것에서 더 큰 특이성을 나타내고, 결합 효율 및 특이성이 PNA/RNA 듀플렉스에도 적용된다. PNA는 다른 뉴클레아제 또는 프로테아제에 의해 쉽게 인식되지 않아서, 이를 효소에 의한 분해에 대해 저항성이게 만든다. PNA는 또한 광범위한 pH 범위에 걸쳐 안정적이다. 포스페이트-당 백본이 변경된 뉴클레오티드 유사체 (예를 들어, PNA, LNA)는, 특히, 사슬 성질 예컨대 2차 구조 형성을 종종 변형시킨다. 문자 명칭에 선행하는 별표 (*) 기호는 이러한 문자가 지정하는 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드임을 나타낸다. 예를 들어, *N는 포스포로티오에이트 변형된 랜덤 뉴클레오티드를 나타내고, "atN"은 뉴클레오티드가 2-아미노 dA, 2-티오-dT, 정상 G 또는 정상 C 중 임의의 것일 수 있는 랜덤 뉴클레오티드를 나타내고, 문자 명칭에 선행하는 플러스 (+) 기호는 이러한 문자가 지정하는 뉴클레오티드가 LNA 뉴클레오티드임을 나타낸다. 예를 들어, +A는 아데노신 LNA 뉴클레오티드를 나타내고, +N는 랜덤 잠금 뉴클레오티드 (즉, 랜덤 LNA 뉴클레오티드)를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 추가적인 모이어티가 뉴클레오티드에 부착된, 변형이 있는 뉴클레오티드 (예를 들어, 비오티닐화 뉴클레오티드)를 지칭한다. 변형은 메이저 그루브 또는 마이너 그루브를 향할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 관심 핵산 타겟 내로 관능기를 효소에 의해 도입하기 위한 통상적인 도구이다. 핵염기의 메이저 그루브에 대한 변형은 피리미딘의 5-위치 및 퓨린의 7-위치와의 더 양호한 혼입 효율을 허용한다. 종종, 요구되는 변형이 링커를 통해 뉴클레오티드에 도입된다 (예를 들어, 비오틴 모이어티가 링커를 통해 뉴클레오티드에 부착됨). 변형 부위에 부착되는 링커 아암의 가요성이 뉴클레오티드 활용에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 경질 선형 링커는 핵산 증폭 동안 더 양호한 dNTP 혼입을 제공한다. 링커 아암 길이 또한 증폭 동안 변형된 dNTP의 혼입에서 역할을 한다. 예를 들어, 비오티닐화 뉴클레오티드를 제조하기 위한 비오틴-함유 링커와 5-아미노알릴-dCTP 및 5-아미노알릴-dUTP의 접합에 의해 비오티닐화 뉴클레오티드가 종종 제조된다. 링커 위치 및 길이 또한 4개의 dNTP 각각에 대한 관능기 도입에 영향을 미친다. 더 짧은 링커 아암이 있는 변형된 dNTP은 더 긴 링커 아암이 있는 뉴클레오티드보다 증폭 반응에 대한 더 양호한 기질이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 올리고머를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산"은 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "서열"은 올리고뉴클레오티드 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 명세서 전반에 걸쳐, 올리고뉴클레오티드 또는 핵산이 문자 서열에 의해 표현될 때마다, 뉴클레오티드는 왼쪽에서 오른쪽으로 5' → 3' 순서이다. 올리고뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA, RNA, 또는 이들의 유사체 (예를 들어, 포스포로티오에이트 유사체)일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 또는 핵산은 변형된 염기 및/또는 백본 (예를 들어, 변형된 포스페이트 연결 또는 변형된 당 모이어티)을 또한 포함할 수 있다. 핵산에 안정성 및/또는 다른 이점을 부여하는 합성 백본의 비제한적인 예는 포스포로티오에이트 연결, 펩티드 핵산, 잠금 핵산, 크실로스 핵산, 또는 그의 유사체를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프라이머"는 타겟 핵산 서열 (예를 들어, 증폭될 DNA 주형)에 혼성화하여 핵산 합성 반응을 프라이밍하는 짧은 선형 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 프라이머는 RNA 올리고뉴클레오티드, DNA 올리고뉴클레오티드, 또는 키메라 서열일 수 있다. 프라이머는 천연, 합성, 또는 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 프라이머 길이의 상한 및 하한 둘 다 경험적으로 결정된다. 프라이머 길이의 하한은 핵산 증폭 반응 조건 하에 타겟 핵산과의 혼성화 시 안정적인 듀플렉스를 형성하는데 요구되는 최소 길이이다. 매우 짧은 프라이머 (일반적으로 뉴클레오티드 3개 미만의 길이)는 이같은 혼성화 조건 하에 타겟 핵산과 열역학적으로 안정적인 듀플렉스를 형성하지 않는다. 상한은 타겟 핵산 내의 미리 결정된 핵산 서열 이외의 영역에서 듀플렉스 형성이 있을 가능성에 의해 종종 결정된다. 일반적으로, 적합한 프라이머 길이는 뉴클레오티드 약 3개 길이 내지 뉴클레오티드 약 40개 길이의 범위이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "랜덤 프라이머"는 소정의 위치가 가능한 뉴클레오티드 또는 그의 유사체 중 임의의 것으로 이루어질 수 있는 방식으로 올리고뉴클레오티드 서열 내의 임의의 소정의 위치의 뉴클레오티드를 랜덤화하는 것 (완전 랜덤화)에 의해 생성된, 프라이머 서열들의 혼합물을 지칭한다. 따라서, 랜덤 프라이머는 서열 내의 뉴클레오티드의 모든 가능한 조합으로 구성된, 올리고뉴클레오티드 서열의 랜덤 혼합물이다. 예를 들어, 육량체 랜덤 프라이머는 서열 NNNNNN 또는 (N)6으로 표현될 수 있다. 육량체 랜덤 DNA 프라이머는 4개의 DNA 뉴클레오티드, A, C, G 및 T의 모든 가능한 육량체 조합으로 이루어져서, 46 (4,096)개의 독특한 육량체 DNA 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 랜덤 혼합물을 초래한다. 랜덤 프라이머는 타겟 핵산의 서열이 미지인 경우에 또는 전체-게놈 증폭 반응을 수행하기 위해 핵산 합성 반응을 프라이밍하는데 효과적으로 사용될 수 있다. 랜덤 프라이머는, 프라이머의 농도에 따라, 단일-가닥 롤링 서클 증폭 (RCA) 산물보다 이중-가닥 RCA 산물을 프라이밍 및 생산하는데 또한 효과적일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "롤링 서클 증폭 (RCA)"은 롤링 서클 메카니즘을 통해 원형 핵산 주형 (예를 들어, 단일/이중 가닥 DNA 서클)을 증폭시키는 핵산 증폭 반응을 지칭한다. 롤링 서클 증폭 반응은 종종 단일 가닥인 원형 핵산 주형에 프라이머가 혼성화되는 것에 의해 개시된다. 그 후, 핵산 폴리머라제가 원형 핵산 주형을 돌아 계속 진행하는 것에 의해 원형 핵산 주형에 혼성화된 프라이머를 연장시켜, 핵산 주형의 서열을 반복해서 복제시킨다 (롤링 서클 메카니즘). 전형적으로 롤링 서클 증폭은 원형 핵산 주형 서열의 탠덤 반복 단위를 포함하는 콘카테머를 생산한다. 롤링 서클 증폭은 선형 증폭 동역학을 나타내는 선형 RCA (LRCA) (예를 들어, 단일, 특이적 프라이머를 사용하는 RCA)일 수 있거나, 또는 지수형 증폭 동역학을 나타내는 지수형 RCA (ERCA)일 수 있다. 롤링 서클 증폭은 과분지형 콘카테머에 이르는 다중 프라이머를 사용하여 수행될 수도 있다 (다중으로 프라이밍된 롤링 서클 증폭 또는 MPRCA). 예를 들어, 이중-프라이밍 RCA에서, 하나의 프라이머는 선형 RCA에서와 같이 원형 핵산 주형에 대해 상보적일 수 있는 반면, 다른 하나는 RCA 산물의 탠덤 반복 단위 핵산 서열에 대해 상보적일 수 있다. 결과적으로, 이중-프라이밍 RCA는 일련의 다중-혼성화, 프라이머-확장, 및 가닥-변위 이벤트 (양쪽 프라이머 및 양쪽 가닥을 수반함)의 캐스케이드를 특색으로 하는 지수형 증폭 동역학의 사슬 반응으로서 진행될 수 있다. 이는 콘카테머성 이중-가닥 핵산 증폭 산물의 개별적인 세트를 종종 생성시킨다. RCA는 등온 조건 하에 적합한 핵산 폴리머라제 예컨대 Phi29 DNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내에서 수행될 수 있다. 적합한 폴리머라제는 가닥 변위 DNA 합성 능력을 보유한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발현 서열"은 단백질 발현에 적격인 DNA 서열을 지칭한다. 달리 말하면, 발현 서열은 하나 이상의 오픈 리딩 프레임 (ORF)에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터를 포함하는 발현 적격 단위이다. 하나 이상의 ORF는 하나 이상의 동일하거나 상이한 단백질을 코딩할 수 있다. 일부 경우에, 발현 서열은 1개를 초과하는 ORF에 작동가능하게 연결된 하나의 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 발현 서열은 하나는 항체의 중쇄를 코딩하고 다른 하나는 경쇄를 코딩하는 2개의 상이한 ORF에 기능적으로 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 발현 서열은 효율적인 단백질 발현을 보조하기 위한 서열 예컨대 캡-비의존적 번역 요소 (CITE)를 추가로 포함할 수 있다.
하나 이상의 실시양태가 진핵생물 무세포 발현 시스템 (예를 들어, 시험관내 전사 및 번역 시스템 또는 IVTT)에서 단백질을 발현하기 위한 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 이중-가닥 콘카테머 DNA (예를 들어, 롤링 서클 증폭에 의해 생성된 RCA 산물 DNA)의 시험관내 전사 및 번역에 의해 단백질이 발현된다. 이러한 시험관내 전사 및 번역 반응으로 무손상 세포의 어떠한 오염도 없는 단백질 산물이 산출된다. 구조적 및 기능적 프로테오믹스를 포함하는 무수한 용도에서 이같은 단백질의 생성을 원할 수 있다. 이같은 단백질의 무세포 발현은 치료 용도에 특히 바람직하다.
무세포 발현은 일반적으로 2개의 모드를 포함한다: (1) mRNA 및 단백질이 단일 반응에서 제조됨 (예를 들어, 커플링된 IVTT) 및 (2) mRNA가 제1 반응에서 제조되고, 초래된 mRNA 산물이 제2의 별개의 번역 반응에 첨가됨 (예를 들어, 연결된 IVTT). 이중-가닥 콘카테머 DNA 예컨대 이중-가닥-RCA 산물 DNA이 (1) 또는 (2)의 어느 한쪽 모드에 이용될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, RCA 산물이 커플링된 시험관내 전사-번역 반응에 제공될 수 있으며, 여기서는 RCA 산물 DNA가 mRNA로 전환되고, 동시에 mRNA가 RNA 및 단백질을 생산할 수 있는 단일 반응 혼합물에서 단백질로 발현된다. 또 다른 실시양태에서, RCA 산물이 연결된 전사-번역 반응에 제공될 수 있으며, 여기서 RCA 산물 DNA가 먼저 전사 반응 혼합물에서 mRNA로 전환되고, 그 후, 생성된 mRNA가 단백질 발현을 위한 번역 반응 혼합물에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 커플링된 시험관내 전사-번역 반응 또는 연결된 전사-반역 반응에 제공되는 RCA 산물은 DNA 미니-서클로부터 유래된다.
한 실시양태에서, 시험관내 전사 및 번역을 위한 방법은 이중-가닥 콘카테머 DNA를 진핵생물 무세포 발현 시스템과 접촉시키는 단계 및 진핵생물 무세포 발현 시스템에서 이중-가닥 콘카테머 DNA로부터 단백질을 시험관내 발현하는 단계를 포함한다. 이중-가닥 콘카테머 DNA는 복수의 탠덤 반복 서열을 포함한다. 복수의 탠덤 반복 서열 각각은 프로모터, 캡-비의존적 번역 요소 (CITE), 및 ORF를 포함하는 발현 서열을 포함한다. 진핵생물 무세포 발현 시스템 내 이중-가닥 콘카테머 DNA의 최종 농도는 약 0.1 ng/μL 내지 약 35 ng/μL 범위이다. 도 1, 및 3-5는 시험관내 전사 및 번역 반응을 위한 주형으로서 여러 농도의 이중-가닥 콘카테머 DNA를 사용하는 상이한 단백질들의 무세포 발현을 예시한다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 콘카테머 DNA는 이중-가닥 롤링 서클 증폭 (RCA) 산물이다. 일부 실시양태에서, RCA 산물 DNA는 미니멀리즘적 발현 서열로부터 유래된다. 미니멀리즘적 발현 서열 (미니-서클)의 한 실시양태가 도 2에서 제시된다. 도 2는 폴리A 서열 p11A를 포함하는, 전사 종결인자를 포함하는 미니멀리즘적 발현 서열 (p11A + T7 종결인자)을 예시하며, 여기서 p11A는 11개의 아데닌 잔기를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 복수의 탠덤 반복 서열 각각은 적어도 하나의 발현 서열을 포함한다. 이같은 실시양태에서, 적어도 하나의 발현 서열은 적어도 하나의 프로모터, 적어도 하나의 CITE, 및 적어도 하나의 ORF를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 탠덤 반복 서열 각각의 2개 이상의 발현 서열을 포함한다. 2개 이상의 발현 서열은 동일한 단백질 또는 상이한 단백질을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 서열은 적어도 하나의 ORF에 기능적으로 연결된 적어도 하나의 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 한 측면에서, 도 6a 및 도 6b에 개략적으로 예시된 바와 같이, 발현 서열에서 하나의 프로모터가 하나의 ORF에 기능적으로 연결된다. 또 다른 측면에서, 도 6c에 개략적으로 예시된 바와 같이, 발현 서열에서, 하나의 프로모터가 2개의 상이한 ORF에 기능적으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 발현 서열은 2개 이상의 ORF에 기능적으로 연결된 2개 이상의 프로모터를 포함할 수 있다.
도 6a-c를 추가로 언급하면, 도 6a는 양쪽 발현 서열이 동일한 단백질을 코딩하는 2개의 발현 서열을 포함하는 탠덤 반복 서열을 예시한다. 또 다른 예에서, 도 6b는 제1 발현 서열은 제1 단백질을 코딩하고, 제2 발현 서열은 제2 단백질을 코딩하며, 제1 단백질이 제2 단백질과는 상이한, 2개의 발현 서열을 포함하는 탠덤 반복 서열을 예시한다. 도 6a 및 도 6b 둘 다에서, 예시된 발현 서열은 캡-비의존적 번역 요소 (예를 들어, IRES) 및 단일 ORF에 기능적으로 연결된 프로모터를 포함한다.
도 6c는 2개의 상이한 단백질을 코딩하는 2개의 ORF를 포함하는 발현 서열을 예시한다. 도 6c에서, 발현 서열은 서로 상이한 단백질을 각각 코딩하는 2개의 상이한 ORF에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 이러한 예에서, 단일 프로모터가 캡-비의존적 번역 요소를 통해 2개의 ORF에 기능적으로 연결된다. 각각의 ORF는 번역 개시 및 번역 정지 서열을 포함한다. 번역 종결 또는 정지 서열을 갖는 것이 요구되고, 그렇지 않으면 바람직하지 않은 무한한 폴리단백질이 합성될 수 있다. 그러나, 전사 정지 코돈이 제1 ORF에 대해 최적이어서 전사 시 폴리시스트론성 mRNA의 생성에 이를 수 있다. 이같은 경우에, IVTT 시, 단일 폴리시스트론성 mRNA가 생산되더라도, 이것이 2개의 상이한 단백질로 번역될 수 있도록, 제1 ORF와 제2 ORF 사이의 개재 서열이 선택될 수 있다.
도 6c에서, 하나의 프로모터가 IRES 및 2개의 ORF (예를 들어, 제1 ORF 및 제2 ORF)에 기능적으로 커플링된다. 제1 ORF는 제1 단백질을 코딩하고, 제2 ORF는 제1 단백질과는 상이한 제2 단백질을 코딩한다. 각각의 ORF는 번역 개시 및 번역 정지 서열을 포함한다. 도 6c에 예시된 발현 서열의 전사 시 폴리시스트론성 mRNA가 생성된다. 제1 ORF의 번역에 의한 제1 단백질의 합성에 제2 ORF의 제2 번역 개시 서열로의 리보솜 미끄러짐이 이어져서 제2 ORF로부터의 제2 단백질의 합성이 개시될 수 있다. 이는 제1 ORF와 제2 ORF 사이에 "자가-절단 서열"을 혼입시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 적합한 자가-절단 서열 예컨대 바이러스 P2A 모티프가 하나의 단일 mRNA로부터의 2개 이상의 단백질의 생성을 용이하게 한다.
상기 언급된 바와 같이, IRES 요소의 부재 하에, 번역 시 동일한 mRNA로부터 등몰 수준의 다중 유전자가 생산되도록 "자가-절단" 2A 펩티드가 멀티시스트론성 서열 내로 혼입될 수 있다. 전형적으로 이러한 2A 펩티드는 리보솜이 2A 요소의 C-말단에서의 펩티드 결합의 합성을 건너뛰도록 만들어서 2A 서열의 단부와 다음 하류 펩티드의 시작부 사이의 분리에 이르게 하는 것에 의해 기능한다. C-말단에서 확인되는 글리신과 프롤린 잔기 사이에서 "절단"이 발생하며, 이는 상류 시스트론은 단부에 부가된 소수의 추가적인 잔기가 있을 것인 한편, 하류 시스트론은 프롤린으로 시작할 것임을 의미한다. 4개의 상이한 2A 펩티드, 예컨대 서열식별번호(SEQ ID NO): 1-4가 진핵생물 세포에서 자가-절단 목적을 위해 통상적으로 사용된다 (표 2).
표 2: 대표적인 2A 펩티드 서열
하나 이상의 실시양태에서, 이중-가닥 콘카테머 DNA는 이중-가닥 RCA 산물 DNA이다. RCA 산물 DNA는 탠덤 반복 서열을 갖는 선형 또는 분지형 콘카테머일 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수 (예를 들어, 2개)의 별개의 이중 가닥 콘카테머 DNA가 사용될 수 있으며, 여기서 별개의 이중 가닥 콘카테머 DNA 각각이 상이한 단백질을 코딩하는 발현 서열을 포함한다. 예를 들어, 2개의 RCA 산물 DNA가 사용될 수 있으며, 여기서 제1 RCA 산물 DNA는 제1 단백질을 코딩하는 제1 발현 서열을 포함하고, 제2 RCA 산물 DNA는 제2 단백질을 코딩하는 제2 발현 서열을 포함하며, 제1 단백질은 제2 단백질과는 상이하다. 이중-가닥 콘카테머 DNA 예컨대 RCA 산물 DNA는 변형된 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 이중 가닥 콘카테머 DNA는 뉴클레오티드 유사체 (예를 들어, 포스포로티오에이트화 뉴클레오티드) 또는 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, 비오티닐화 뉴클레오티드)를 포함한다. 이중-가닥 콘카테머 DNA는 비오티닐화 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트화 뉴클레오티드, 이노신-함유 뉴클레오티드, LNA 뉴클레오티드, PNA 뉴클레오티드, 2-아미노-데옥시아데노신, 2-티오-데옥시티미딘, 다가양이온 뉴클레오티드 또는 그의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 콘카테머 DNA의 각각의 탠덤 반복 서열은 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중 가닥 콘카테머 DNA는 포스포로티오에이트화 뉴클레오티드를 포함한다. 포스포로티오에이트화 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트화 dNTP, 예컨대 α-S-dATP 또는 α-S-dTTP를 포함한다. 용어 "포스포로티오에이트화" 뉴클레오티드는 이하에서 "티오에이트화" 뉴클레오티드와 상호교환가능하게 사용된다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 콘카테머 DNA, 예컨대 RCA 산물 DNA는 내부적으로 티오에이트화될 수 있다 (알파-티오-dNTP를 가짐). 일부 실시양태에서, 내부적으로 티오에이트화된 이중-가닥 콘카테머 DNA를 생성시키기 위해, RCA 반응에 포스포로티오에이트화 뉴클레오티드가 보충된다. 증폭 동안 RCA 산물 DNA 내로 티오에이트화 염기가 랜덤로 혼입되게 하기 위해 포스포로티오에이트화 뉴클레오티드가 dNTP 혼합물 내로 혼입된다. 일부 다른 실시양태에서, RCA 반응에 티오에이트화 프라이머 서열을 사용함으로써 포스포로티오에이트화 뉴클레오티드를 포함하는 RCA 산물 DNA가 생성될 수 있다 (예를 들어, 티오에이트화되어, 알파-티오-dNTP를 가짐). 특정 실시양태에서, 이중-가닥 콘카테머 DNA는 비오티닐화 뉴클레오티드를 포함하며, 이는 이중-가닥 콘카테머 DNA를 기판 예컨대 스트렙타비딘-부착 비드에 접합시키는데 사용될 수 있다. 비오티닐화 이중-가닥 콘카테머 DNA는 비오티닐화 프라이머를 사용하여 RCA 반응을 수행함으로써 생성될 수 있다. 일반적으로 초래된 비오티닐화 RCA 산물 DNA를 정제하여 과량의 비오티닐화 프라이머를 제거한 후 스트렙타비딘-부착 비드에 접합시킨다. 정제된 비오티닐화 RCA 산물 DNA를 스트렙타비딘 비드와 혼합하여 RCA 산물 DNA를 스트렙타비딘 비드 상에 접합시킬 수 있다.
통상적으로, 원핵생물 무세포 발현 시스템을 사용하는 IVTT 반응, 예컨대 이. 콜라이 세포 용해물을 사용하는 것의 경우에, 마이크로리터의 IVTT 반응당 5-10 ng의 주형 DNA가 요구된다. 원생동물 세포 용해물을 사용하는 IVTT 반응의 경우에, 적어도 35 ng/μL의 플라스미드 DNA가 충분한 단백질 발현에 필요하다. 그러나, 진핵생물 또는 포유동물 세포 용해물, 예컨대 HeLa 또는 CHO 세포 용해물을 사용하는 IVTT 반응의 경우에, 40 ng/μL를 초과하는 플라스미드 DNA가 더 높은 무세포 단백질 발현 수율을 위해 통상적으로 사용되었다. 진핵생물 IVTT 반응을 위한 이같은 대량의 플라스미드 DNA의 생성은 종종 노동-집약적이고, 비용-효과적이지 않다. 대조적으로, 플라스미드 DNA의 것에 비교하여 유의하게 더 낮은 농도의 이중-가닥 콘카테머 DNA가 반응에 사용되었을 때에도 원하는 단백질의 진핵생물 무세포 발현의 효율이 유의하게 더 높았다. 일부 실시양태에서, 진핵생물 무세포 발현 시스템 내 이중-가닥 콘카테머 DNA의 최종 농도는 약 0.5 ng/μL 내지 약 20 ng/μL 범위이다. 특정 실시양태에서, 진핵생물 무세포 발현 시스템 내 이중-가닥 콘카테머 DNA의 최종 농도는 약 5 ng/μL 내지 약 20 ng/μL 범위이다. 일부 다른 실시양태에서, 진핵생물 무세포 발현 시스템 내 이중-가닥 콘카테머 DNA의 최종 농도는 약 2 ng/μL 내지 약 10 ng/μL 범위이다. 일부 실시양태에서, 진핵생물 무세포 발현 시스템 내 이중-가닥 콘카테머 DNA의 최종 농도는 약 3 ng/μL 내지 약 7 ng/μL 범위이다. 예시적인 실시양태에서, 진핵생물 무세포 발현 시스템 내 이중-가닥 콘카테머 DNA의 최종 농도는 약 5 ng/μL이다.
더 높은 농도 (예를 들어, 25 μL IVTT 반응에서의 1 μg 초과의 RCA 산물 DNA)를 주형으로서 사용하는 것에 비교하여 더 낮은 농도의 이중-가닥 콘카테머 DNA (예를 들어, 25 μL IVTT 반응에서의 0.125 μg의 RCA 산물 DNA)를 사용함으로써 진핵생물 용해물에서의 무세포 단백질 발현이 예상밖으로 개선되었다는 것이 관찰되었다. 예를 들어, IVT 키트가 제안하는 것보다 더 높은 농도 (예를 들어, 2 μg, 또는 3 μg)의 터보GFP 유전자를 포함하는 RCA DNA 주형을 적용하는 것이, 도 1에 제시된 바와 같이, 무세포 단백질 발현 시스템에서 더 낮은 수준의 터보GFP 단백질을 초래하였다. 그러나, IVT 키트 프로토콜에 따른 제안된 농도보다 더 낮은 농도 (예를 들어, 500 ng, 250 ng, 및 125 ng)로 RCA 산물 DNA를 사용했을 때, 무세포 터보GFP 단백질의 발현 상승이 관찰되었다 (도 1). 포스포로티오에이트화 및 비-포스포로티오에이트화 RCA 산물 DNA를 사용하여 결과가 유사하였고, 이때 포스포로티오에이트화 RCA 산물 DNA로부터의 단백질 발현이 근소하게 더 양호하였다. RCA 산물 DNA로부터 수득된 결과에 대조적으로, 동일한 IVTT 실험 조건 하에 플라스미드 DNA 주형의 농도에 비례하여 단백질 수율이 감소하였다. 예를 들어, 500 ng의 플라스미드 DNA (제조사의 IVT 프로토콜에 따라 2x 희석)로 1 μg의 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하는 것에 비교하여 더 적은 터보GFP 단백질이 산출되었다 (도 1). 따라서, IVTT 반응에서의 플라스미드 DNA 주형의 것에 비교하여 더 낮은 농도의 RCA 산물 DNA 주형에서 무세포 단백질 발현의 유의한 개선이 수득되었으며, 이는 예상밖이었다. RCA 산물 DNA 주형의 농도가 감소됨에 따라 무세포 단백질 발현이 증가되는 경향 (도 1)은 전형적인 IVTT 반응에서 주형 DNA의 농도에 무세포 단백질 발현이 직접적으로 비례하는 IVTT 반응 동역학의 일반적인 경향에 비교하여 또한 예상밖이었다.
일반적으로, IVTT의 반응 부피가 증가됨에 따라 더 높은 양의 DNA 주형이 요구된다. 예를 들어, 1-단계 인간 고-수율 맥시 IVT 키트가 2 mL의 반응 부피에 대해 제형된다. 키트 프로토콜에 따르면, 40 ng/μl 플라스미드 DNA 주형의 최종 농도 (즉, 2 mL 반응 부피당 80 μg의 플라스미드 DNA)가 IVTT 실험에서의 효율적인 단백질 발현을 위해 요구된다. 이같은 반응 부피를 추가로 규모 증대시키기 위해, 더 높은 총량의 플라스미드 DNA가 요구되며, 이는 비용, 제조 시간 및 노동을 추가로 증가시킨다. 예를 들어, 40 ng/μL 주형의 최종 농도를 충족시키기 위해 4 mL 반응 부피는 총 160 μg의 플라스미드 DNA를 요구할 것이다. 추가로, 반응 규모를 확장하는 경우에, IVTT 반응의 횟수가 병행하여 증가할 것이다. RCA DNA는 ~5 ng/μL에서 무세포 단백질 발현에 효과적이기 때문에, 80 μg의 총 플라스미드 DNA 대신 약 20 μg의 총 RCA DNA가 80x25 μL 개별 반응을 가능하게 하는데 요구되었다. 이와 같이, 무세포 단백질 발현을 위한 주형으로서 더 적은 양의 RCA 산물 DNA를 요구하는 것은 반응 부피 규모 증대, 반응 부피 규모 확장, 및 주형 비용-제어에 유리하다.
포유동물 무세포 추출물에서 시험관내 전사 및 번역 반응으로부터의 단백질 수율을 증진시키기 위해, 폐기물이 번역 기구에 유해하게 영향을 미치기 때문에 폐기물 제거가 종종 요구된다. 통상적으로 이는 투석 막을 사용하여 행해진다. 추가로, 투석 시스템 내 성분들의 농도를 최대화하도록 IVTT 반응 부피가 규모 증대된다. 따라서, 규모 증대 IVTT 반응 부피에서 주형 DNA의 요구되는 농도를 유지하도록 주형 DNA 또한 유의하게 규모 증대된다. 그러나, DNA 주형은 전통적으로 용액-기반 IVTT 반응으로 손실된다. 이같은 우려를 다루고 IVTT 단백질 수율을 증진시키기 위해, DNA 주형을 기판 상에 고정화시켜, DNA 주형을 용액-기반 IVTT 반응으로부터 회수할 수 있다. 일부 실시양태에서, 고정화된 DNA 주형이 연속 흐름 하에 무세포 발현 시스템에 노출되어, 고정화된 DNA 주형으로부터 연속 방식으로 단백질이 생산된다.
하나 이상의 실시양태에서, 방법은 이중-가닥 콘카테머 DNA를 기판 상에 고정화시키는 것을 추가로 포함한다. 이중-가닥 콘카테머 DNA 주형을 고정화시키는데 사용된 기판은 자기 입자, 세파로스 비드, 유리 기판, 중합체 기판 또는 금속 기판으로부터 선택될 수 있다. 자기 입자는 자기 비드 또는 자기 임펠러일 수 있다. 기판은 유리 시험관, 페트리 플레이트, 멀티웰 플레이트, 미세유체 장치/시스템, 분석 장치/시스템이거나 또는 그의 부분일 수 있으며, 여기서 이중-가닥 콘카테머 DNA가 기판 상에 고정화될 수 있다.
다양한 방법에 의해 이중-가닥 콘카테머 DNA가 기판 상에 고정화될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 이중-가닥 콘카테머 DNA는 비오티닐화 뉴클레오티드를 포함한다. 이같은 실시양태에서, 이중-가닥 콘카테머 DNA가 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 스트렙타비딘-코딩 기판 상에 고정화될 수 있다. 이중-가닥 콘카테머 DNA를 스트렙타비딘-코딩 기판 상에 고정화시키는 단계는 이중-가닥 콘카테머 DNA를 진핵생물 무세포 발현 시스템과 접촉시키기 전에 수행된다. 이중-가닥 콘카테머 DNA를 기판 상에 고정화시킨 후, 시험관내 무세포 단백질 발현을 위한 주형으로서 기능하는 고정화된 이중-가닥 콘카테머 DNA에 진핵생물 무세포 단백질 발현 시스템이 첨가된다. DNA 미니-서클 (도 2 참조)로부터 생성되고, 추가로 스트렙타비딘 비드 상에 고정화된 RCA 산물 DNA로부터의 무세포 발현이 실시예 4에서 명확하게 입증되며, 여기서 RCA 산물 DNA는 비오티닐화되었다. 이러한 실시예에서 RCA 산물은 스트렙타비딘 비드 상에 고정화된다.
일부 실시양태에서, 방법은 단백질을 시험관내 발현한 후 진핵생물 발현 시스템을 포함하는 반응 혼합물로부터 고정화된 이중-가닥 콘카테머 DNA를 회수하는 것을 추가로 포함한다. 이같은 실시양태에서, 단백질을 발현한 후, 발현된 원하는 단백질 및 나머지 진핵생물 무세포 발현 시스템을 함유하는 혼합물을 상이한 컨테이너로 옮길 수 있다. 고정화된 이중-가닥 콘카테머 DNA를 후속적 IVTT 반응에서 그의 후속적 사용 전에 (예를 들어, 세척 완충제를 사용하여) 세척할 수 있다.
하나 이상의 실시양태에서, 회수된 고정화된 이중-가닥 콘카테머 DNA를 하나 이상의 후속적 무세포 발현 시스템에서 재사용할 수 있다. 회수된 고정화된 이중-가닥 콘카테머 DNA를 이전의 무세포 발현 시스템으로부터 이어진 임의의 불순물을 제거하기 위한 1회 이상의 세척 단계와 함께 또는 세척 단계 없이 재사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 이중-가닥 콘카테머 DNA의 복수의 탠덤 반복 서열 각각이 프로모터, CITE, 및 ORF를 포함하는 발현 서열을 포함하며, 여기서 CITE는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 번역 증진 요소 (TEE), 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 콘카테머 DNA 주형으로서 사용된 RCA 산물 DNA는 IRES 서열을 CITE로서 포함한다. 바이러스로부터 유래된 것 또는 살아 있는 생물 내의 천연 서열을 포함하여 관련 기술분야에 공지된 적합한 IRES 또는 TEE 서열의 수많은 예가 CITE로서 사용될 수 있다. IRES 서열의 존재는 RCA 산물 DNA의 농도가 플라스미드 DNA의 것에 비교하여 유의하게 더 낮은 경우에도 진핵생물 무세포 발현 시스템에서 효율적인 번역을 구동시킨다 (도 1에 제시된 바와 같음). IRES 요소의 RNA 폴딩이 번역 효율의 조절에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 효율적인 번역을 위해, IRES 요소의 효과적인 RNA 폴딩을 보장하도록 무세포 단백질 발현 시스템 예컨대 HeLa 세포 용해물의 성분이 최적화된다.
발현 서열은 하나 이상의 ORF를 포함하며, 여기서 각각의 ORF는 번역 개시 서열 및 번역 종결 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, ORF는 코돈-최적화 서열, 정제 태그 서열, 리보솜 인식 증진을 위한 IRES로부터 유래된 아미노-말단 펩티드 융합 서열, 프로테아제 절단 부위, 신호 펩티드, 또는 그의 조합을 포함한다. 정제 태그 서열은 발현된 단백질의 정제에 이용될 수 있다. 하나 이상의 실시양태에서, 이중-가닥 콘카테머 DNA의 복수의 탠덤 반복 서열 각각 내의 발현 서열의 ORF는 번역을 증진시키기 위한 코돈-최적화 서열을 포함한다. 코돈 최적화 서열을 생성시키기 위해, 코돈 편향, 정황적인 코돈 선호도, 및/또는 개별적인 코돈 선호도가 일반적으로 고려되는 요인 중 일부이다.
ORF의 코돈-최적화 서열은 RCA 산물 DNA 내의 발현 서열의 번역의 속도 또는 품질을 증진시킨다. 일반적으로 코돈 최적화는 관심 유전자의 mRNA 안정성 또는 번역 효율을 증가시키는 것에 의해 단백질 발현을 개선한다. 맞춤 디자인 유전자 내의 코돈 용법을 최적화함으로써 유전자의 기능성이 또한 증가될 수 있다. 일부 코돈 최적화 실시양태에서, 종에서의 낮은 빈도의 코돈이 높은 빈도의 코돈에 의해 교체될 수 있다. 예를 들어, 류신에 대한 낮은 빈도의 코돈 UUA가 높은 빈도의 코돈 CUG에 의해 교체될 수 있다. 추가의 코돈 최적화 실시양태에서, 아미노산 고갈 동안 고도로 충전되는 tRNA를 나타내는 코돈이 사용될 수 있다. 코돈 최적화는 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있고, 따라서 단백질 번역 또는 단백질 폴딩의 속도를 변형시킬 수 있다. 추가로, 코돈 최적화는 전사 및 번역 제어를 맞춤 제작할 수 있거나, 리보솜 결합 부위를 변형시킬 수 있거나, 또는 mRNA 분해 부위를 안정화시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, ORF는 발현된 단백질의 정제를 위한 태그 서열을 포함할 수 있다. 태그 서열은 친화성 태그, 프로테아제 절단을 위한 인식 서열, 또는 그의 조합일 수 있다. 친화성 태그는 재조합 단백질의 신속한 정제 및 검출에 사용될 수 있다. 친화성 태그는 폴리히스티딘 태그 (his6) (서열식별번호: 8), 글루타티온 S-트랜스퍼라제 태그 (GST), 헤마글루티딘 (HA), myc (c-myc 유전자 산물로부터 유래됨), FLAG (엔테로키나제-절단 부위를 포함하는 8개의 아미노산 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (서열식별번호: 9)로 이루어짐) 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 융합 태그가 원하는 단백질의 신속한 정제 또는 검출을 돕지만, 이러한 태그는 재조합 단백질의 영구적인 고정물 또는 도메인으로서 간주되지 않을 수 있다. 따라서, 재조합 단백질 구조 및 기능의 고도로 분석적인 연구를 위해 융합 태그의 제거가 종종 요구된다. 또 다른 유형의 태그, 예컨대 프로테아제 절단 태그를 사용함으로써 정제용 태그를 단백질로부터 제거할 수 있다. 프로테아제 절단 태그는 특정 단백질 또는 펩티드 서열 내의 독특한 펩티드 결합을 절단하는데 사용될 수 있다. 프로테아제 절단 태그는, 예를 들어, 프리시전 프로테아제(PreScission Protease) 태그 (지이 헬스케어(GE Healthcare)) 또는 트롬빈 프로테아제 태그 (지이 헬스케어)를 포함할 수 있다.
하나 이상의 실시양태에서, 복수의 탠덤 반복 서열 각각은 폴리A 서열, 인트론 서열, 전사 종결 서열, 인슐레이터 서열, 또는 그의 조합을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 탠덤 반복 서열은 전사 종결 서열 및 폴리아데닐화 부위를 추가로 포함하며, 여기서 전사 종결 서열 및 폴리아데닐화 부위는 일반적으로 DNA 주형 내의 유전자의 3' 단부에 위치한다. 전사 종결 서열은 mRNA를 전사 복합체로부터 방출시키는 프로세스를 개시하도록 새롭게 합성된 mRNA 내에 신호를 제공하며, 이는 원하는 단백질 산물의 효과적인 번역을 또한 보조할 수 있다.
미니-서클로부터 유래된 RCA 산물에서의 비효율적인 전사 종결의 효과는 플라스미드 DNA로부터 유래된 RCA 산물에 비교하여 매우 사소하다. 일부 경우에, 유전자 직후의 이중-가닥 DNA 중단을 생성하도록 제한 효소를 사용하여 관심 유전자를 함유하는 플라스미드 DNA를 소화시켜서, RCA 산물이 플라스미드로부터 유래되는 경우에 이러한 지점 너머로 전사가 진행되는 것을 방지하여야 한다. 런-오프 전사가 발생한 경우에, 다수의 코딩 및 비-코딩 서열 (복제 기원, 항생제 선별, 및 숙주 세포에서의 플라스미드의 선별, 스크리닝 및/또는 증식에 사용되는 부속 서열을 포함함)을 함유하는 플라스미드의 다른 섹션이 전사될 것이다. 플라스미드 DNA로부터 유래된 RCA 산물은, 소화되지 않은 상태로 사용되는 경우에, 전사 번역-초과를 통해 원치 않는 mRNA 종을 생산할 수 있으며, 이는 관심 단백질과 함께 (또는 이보다 더 많은 양으로) 단백질 오염원의 생산을 위험하게 한다. 그러나, 미니-서클로부터 유래된 RCA 산물의 불량한 전사 종결은 여전히 온-타겟 mRNA를 생성시킬 수 있다. 결과적으로, 무세포 단백질의 효율이 플라스미드 또는 PCR-증폭 플라스미드 DNA로부터 유래된 RCA 산물에 비교하여 DNA 미니-서클로부터 유래된 RCA 산물로부터 더 양호하다. DNA 미니-서클로부터 유래된 RCA 산물에 전사 종결 서열이 완전히 결여된 경우에도 유사한 발현 이점이 관찰되며, 이는 예상밖의 결과이다. 이러한 RCA 산물은 시스트론성 mRNA 종의 탠덤 반복을 생성시킴으로써 무세포 단백질 발현을 개선하며, 여기서 mRNA의 모든 시스트론이 원하는 타겟 유전자를 포함한다. 시스트론의 탠덤 반복은, 특히 전사 종결 신호가 부재하는 경우에, 차례로 mRNA 안정성을 개선할 수 있고, 원하는 단백질 산물의 더 높은 번역 유동에 기여할 수 있다.
시험관내 전사 및 번역을 위한 방법의 하나 이상의 실시양태에서, 방법은 원형 DNA를 제공하는 단계, DNA 서클의 RCA를 통해 이중-가닥 콘카테머 DNA를 생성시키는 단계, 및 생성된 이중-가닥 콘카테머 DNA를 시험관내에서 진핵생물 무세포 발현 시스템과 접촉시켜 전사 및 번역을 통해 이중-가닥 콘카테머 DNA로부터 단백질을 발현하는 단계를 포함한다. 진핵생물 무세포 발현 시스템 내 이중-가닥 콘카테머 DNA의 최종 농도는 약 0.1 ng/μL 내지 35 ng/μL 범위이다. 일부 실시양태에서, 진핵생물 무세포 발현 시스템과 접촉시키기 전에 이중-가닥 콘카테머 DNA가 정제된다. 이중-가닥 DNA 주형의 분자내 라이게이션에 의해 DNA 미니서클이 생성될 수 있다. 하나 이상의 실시양태에서, DNA 미니-서클로부터 생성된 이중-가닥 RCA 산물 DNA는 선형 또는 분지형 콘카테머일 수 있다.
일부 실시양태에서, 원형 DNA로부터 생성된 이중-가닥 콘카테머 RCA 산물 DNA의 최종 농도는 약 0.5 내지 20 ng/μL 범위이다. 일부 다른 실시양태에서, 진핵생물 무세포 발현 시스템 내 원형 DNA로부터 생성된 이중-가닥 콘카테머 RCA 산물 DNA의 최종 농도는 약 3 ng/μL 내지 약 7 ng/μL 범위이다. 특정 실시양태에서, 진핵생물 무세포 발현 시스템 내 원형 DNA로부터 생성된 이중-가닥 콘카테머 RCA 산물 DNA의 최종 농도는 약 5 ng/μL 내지 약 7 ng/μL 범위이다. 예시적인 실시양태에서, 진핵생물 무세포 발현 시스템 내 DNA 서클로부터 생성된 이중-가닥 콘카테머 RCA 산물 DNA의 최종 농도는 약 5 ng/μL이다. 실시예 3, 도 2 및 3은 DNA 서클로부터 생성된 RCA 산물 DNA의 요구가 진핵생물 무세포 용해물에서의 원하는 단백질 발현을 위한 플라스미드 DNA보다 4 내지 8배 더 낮다는 것을 제시한다.
DNA 미니-서클로부터 생성된, IVTT 반응에 사용되는 이중-가닥 RCA 산물 DNA는 선형 또는 분지형 콘카테머일 수 있다. DNA 미니-서클은 프로모터, 캡-비의존적 번역 요소, 및 ORF로 본질적으로 이루어진 미니멀리즘적 발현 서열로 본질적으로 이루어진다. 따라서, DNA 미니-서클로부터 생성된 선형 또는 분지형 콘카테머 (이중-가닥 RCA 산물 DNA)는 미니멀리즘적 발현 서열의 탠덤 반복으로 본질적으로 이루어진다. 미니멀리즘적 발현 서열의 ORF는 특정한 관심 유전자를 함유하는 핵산 서열이다. 미니멀리즘적 발현 서열은 특정한 관심 유전자의 발현에 필요한 최소 유전자 요소 또는 서열 (예를 들어, 인핸서 서열)을 또한 함유할 수 있다.
하나 이상의 실시양태에서, 미니멀리즘적 발현 서열의 ORF는 코돈-최적화 서열, 정제 태그 서열, 프로테아제 절단 부위 또는 그의 조합을 포함한다. 코돈 최적화 서열을 생성시키기 위해, 코돈 편향, 정황적인 코돈 선호도, 및/또는 개별적인 코돈 선호도가 일반적으로 고려되는 요인 중 일부이다. 언급된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 미니멀리즘적 발현 서열은 추가로 전사 종결 서열로 본질적으로 이루어진다.
DNA 미니-서클의 캡-비의존적 번역 요소 (CITE)는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 번역 증진 요소 (TEE), 또는 그의 조합을 포함한다. 미니멀리즘적 발현 서열은 인슐레이터 서열, 폴리A 서열, 전사 종결 서열, 또는 그의 조합을 추가로 함유할 수 있다. 이는 이중-가닥 콘카테머 RCA 산물 DNA의 시험관내 전사 및/또는 번역에 상당히 영향을 미치지 않는 서열을 추가적으로 함유할 수 있다. 예를 들어, 이는 번역 인핸서 서열, 인슐레이터 서열, 인트론 서열, 또는 전사 종결 서열과 같은 서열을 추가로 포함할 수 있다. 그러나, 미니멀리즘적 발현 서열 및 초래된 이중 가닥 RCA 산물은 RCA 산물의 시험관내 전사 및 번역에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는 어떠한 추가 서열도 포함하지 않는다.
T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 예를 들어 포함하여, 관련 기술분야에 공지된 적합한 프로모터의 수많은 예가 사용될 수 있다. 유사하게, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 폴리A 트랙트, 종-비의존적 번역 리더 (SITS), 코작 컨센서스 서열, 및 샤인-달가노 서열을 예를 들어 포함하여, 적합한 리보솜 결합 부위의 수많은 예가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 인슐레이터 서열은 일반적으로 리보솜 결합 또는 번역 개시의 효율을 증진시킨다. 천연 IRES ORF의 번역된 N-말단, 또는 폴리-히스티딘 트랙트를 코딩하는 서열을 예를 들어 포함하여, 적합한 인슐레이터 서열의 수많은 예가 관련 기술분야에 존재한다. 미니멀리즘적 발현 서열은 프리-프로모터 서열, 프로테아제 절단 또는 뉴클레오티드 절단을 위한 서열, 단백질 정제를 위한 서열, 또는 그의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 미니멀리즘적 발현 서열은 원하는 단백질 산물의 전사 및/또는 번역을 방해 또는 억제하거나 또는 다르게는 단백질 생산을 더욱 성가시게 만드는 어떠한 서열도 함유하지 않도록 선택된다.
미니멀리즘적 발현 서열에는 숙주 세포에서의 플라스미드의 증식에 요구되는 어떠한 외인성 서열도 없다. 예를 들어, RCA 산물은 어떠한 외인성 서열, 예컨대 복제 기원, 항생제 선별 유전자, 또는 숙주 세포에서의 클로닝, 선별, 스크리닝 및/또는 복제에 요구되는 임의의 어떤 부속 서열도 배제한다. 이같은 외인성 서열이 RCA 산물에 존재하는 것은 무세포 단백질 발현에서의 전사 및/또는 번역에 상당히 영향을 미칠 것이다. "외인성 서열"은 원하는 단백질의 코딩 또는 발현에 필수적이지 않은 서열을 또한 포함한다. 외인성 서열은 숙주 세포에서의 플라스미드의 선별, 스크리닝 및/또는 증식에 사용되는 부속 서열, 예컨대 lacZ, 베타-갈락토시다제를 포함할 수 있다. 외인성 서열은 복제 기원을 위한 서열, 항생제 선별 유전자, 유전자 삽입을 위한 적합한 제한 부위, 예컨대 다중 클로닝 부위, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 외인성 서열은 숙주 세포 내로의 클로닝 또는 숙주 세포에서의 검출에 요구되는 임의의 다른 서열을 추가로 포함할 수 있다.
이중-가닥 콘카테머 RCA 산물 DNA 서열은 포스포로티오에이트화 뉴클레오티드, 비오티닐화 뉴클레오티드, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 미니멀리즘적 발현 서열의 탠덤 반복으로 본질적으로 구성되는 이중-가닥 콘카테머 RCA 산물 DNA는 비오티닐화 뉴클레오티드를 포함한다. 이같은 실시양태에서, 방법은 이중-가닥 콘카테머 DNA를 진핵생물 무세포 발현 시스템과 접촉시키기 전에 비오티닐화 뉴클레오티드를 포함하는 이중-가닥 콘카테머 DNA를 기판 상에 고정화시키는 것을 추가로 포함하며, 여기서 기판은 스트펩타비딘-코팅 기판이다. 방법은 이중 가닥 콘카테머 DNA로부터 단백질을 시험관내 발현한 후 진핵생물 무세포 발현 시스템으로부터 고정화된 이중-가닥 콘카테머 DNA를 회수하는 것을 추가로 포함한다. 방법은 미니멀리즘적 발현 서열의 탠덤 반복으로 본질적으로 이루어진 회수된 이중-가닥 콘카테머 DNA 주형을 후속적 IVTT 반응에 재사용하는 것을 추가로 포함한다.
무세포 전사 반응에서 사용된 RNA 폴리머라제 (예를 들어, T7 RNA 폴리머라제)는 일반적으로 DNA 코딩 서열에 효과적으로 결합하기 위해 이중-가닥 DNA 프로모터 서열을 요구한다. RNA 폴리머라제가 이중-가닥 DNA 프로모터 서열에 효과적으로 결합하는 것은 효율적인 전사를 개시시킨다. 따라서, 이중-가닥 RCA 산물의 생성을 촉진하는 RCA 반응 조건이 효과적인 시험관내 전사 및 번역에 바람직하다.
일부 실시양태에서, 생성된 이중-가닥 콘카테머 DNA는 진핵생물 무세포 발현 시스템과 접촉하기 전에 정화될 필요가 있다. 일부 실시양태에서, 진핵생물 세포-추출물을 사용하는 무세포 발현을 진행하기 전에 염 또는 임의의 다른 오염물, 예컨대 프라이머 또는 더 작은 단편화 DNA를 반응 배지로부터 제거하기 위해 RCA 산물 DNA가 (예를 들어, 침전에 의해) 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 RCA 산물 DNA는 어떠한 추가 프로세싱도 없이 무세포 발현 시스템에 제공된다. 예를 들어, RCA 산물 DNA는 어떠한 추가 제한 소화도 없이 증폭 후에 직접적으로 무세포 시스템에 첨가될 수 있다.
미니멀리즘적 발현 서열은 전사될 관심 유전자의 상류 (5')에 존재하는 프로모터 서열을 포함한다. DNA-의존적 RNA 폴리머라제가 이중-가닥 DNA 프로모터 영역에 결합하여 유전자 전사를 개시시킨다. 다양한 적합한 RNA 폴리머라제가 관련 기술분야에 공지되어 있고, 1개의 서브유닛만 있는 것 (예를 들어, 박테리오파지 예컨대 T3 및 T7, 및 미토콘드리아로부터의 것), 뿐만 아니라 박테리아 및 진핵생물로부터 유래된 멀티-도메인 RNA 폴리머라제를 포함한다. RNA 폴리머라제는 효율적인 전사를 위해 추가적인 단백질 보조-인자를 추가로 요구할 수 있다.
무세포 전사-번역 반응의 일부 실시양태에서, 생체분자 전사/번역 기구가 세포로부터 추출되고, 시험관내 번역에 활용된다. 전사 및 번역에 요구되는 조성, 효소 비율, 및 빌딩 블럭이 이러한 무세포 추출물에 의해 제공된다. 전사에 의해 합성된 mRNA가 번역 반응에서 발현되며, 이는 무세포 추출물에서 타겟 단백질을 생산한다. 시험관내 발현 반응에서, 단백질 합성은 배양된 세포 내에서보다는 무세포 추출물에서 발생한다 (세포로부터의 추출된 물질이 본원에서 어떠한 무손상 세포도 함유하지 않는 "무세포 추출물" 또는 "세포 추출물"로 지칭될 수 있음). 세포 추출물은 일반적으로 세포의 세포질 성분 및 소기관 성분을 함유한다. 무세포 추출물은 무세포 전사 및 번역에 요구되는 모든 또는 대부분의 분자, 예컨대 리보솜, 번역 인자, tRNA 및 아미노산, 효소 보조인자 및 에너지원, 및 단백질 폴딩에 필수적인 세포 성분을 공급할 수 있다. 시험관내 단백질 발현 반응에서, 단백질 합성은 배양된 무손상 세포 내에서보다는 무세포 추출물에서 발생한다.
언급된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 무세포 발현 시스템은 진핵생물 세포 추출물을 포함하며, 여기서 세포 추출물은 단세포 생물 (예를 들어, 원생동물, 효모 세포, 곤충 세포) 또는 다세포 생물 (예를 들어, 곤충 세포, 포유동물 세포 (인간 세포 포함))로부터 유래된다. 적합한 진핵생물 세포 추출물은 토끼 망상적혈구 용해물 (RRL), 밀 배아 추출물, 곤충 세포 용해물 (예컨대 SF9 또는 SF21), 포유동물 용해물 (예컨대 CHO), 인간 용해물 (예컨대 HeLa), 또는 원생동물 용해물 (예컨대 리슈마니아(Leishmania))을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
RCA 산물 DNA로부터 유래된 mRNA는 진핵생물 세포 추출물에 첨가될 수 있거나 또는 진핵생물 세포 추출물 내에서 생산될 수 있다. RCA 반응에 사용되는 DNA 주형은 합성 DNA 또는 천연 DNA일 수 있다. DNA 주형은 원형 DNA 주형일 수 있다. 한 예시적 실시양태에서, 선형 핵산 주형의 원형화가 효소 반응에 의해, 예를 들어, 라이게이션 효소 예컨대 DNA 리가제와의 인큐베이션에 의해 달성된다. 일부 실시양태에서, DNA 미니-서클 주형은 미니멀리즘적 발현 서열을 포함한다. 시험관내 전사-번역에 사용되는 RCA 산물은 분해되지 않은 무손상 상태일 수 있다.
롤링-서클 증폭 반응은 프라이머, 폴리머라제, 및 유리 뉴클레오티드 (dNTP)와 같은 시약을 종종 사용한다. 일부 실시양태에서, 이중-가닥 DNA 미니-서클을 랜덤 프라이머 혼합물을 포함하는 프라이머 용액과 접촉시켜 핵산 주형-프라이머 복합체를 형성시키고, 핵산 주형-프라이머 복합체를 DNA 폴리머라제 및 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트와 접촉시키고, 핵산 주형을 증폭시킴으로써 RCA가 수행될 수 있다. 증폭 반응에서 사용되는 핵산 폴리머라제는 프루프리딩 핵산 폴리머라제일 수 있다. Phi29 DNA 폴리머라제를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지되어 있는 DNA 가닥-변위 폴리머라제 중 임의의 것을 사용함으로써 RCA가 수행될 수 있다. 증폭 반응 혼합물은 추가적인 시약 예컨대 적합한 증폭 반응 완충제를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응에서 사용되는 각각의 시약은 임의의 오염 핵산을 제거하도록 예비-처리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시약의 예비-처리는 시약을 자외선의 존재 하에 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 다른 실시양태에서, 시약을 뉴클레아제 및 그의 보조-인자 (예를 들어, 금속 이온)의 존재 하에 인큐베이션함으로써 시약에서 오염이 제거된다. 적합한 뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 예컨대 엑소뉴클레아제 I 또는 엑소뉴클레아제 III을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, dNTP의 부재 하에 2가 금속 이온 (예를 들어, 마그네슘 또는 망간 이온)과 함께 인큐베이션함으로써 DNA 증폭 반응에 사용되는 프루프리딩 DNA 폴리머라제에서 오염이 제거될 수 있다.
랜덤 프라이머 혼합물을 사용하여 RCA 반응이 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특이적 프라이머가 RCA 반응에 사용된다. 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 프라이머 서열 또한 사용될 수 있다. 하나 이상의 실시양태에서, 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 랜덤 프라이머 혼합물을 사용하여 RCA가 수행된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 dNTP를 사용하여 RCA가 수행된다. 뉴클레오티드 유사체는 이노신, 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드, 펩티드 핵산 (PNA) 뉴클레오티드, 티오에이트화 뉴클레오티드, 2-아미노-데옥시아데노신, 2-티오-데옥시티미딘, 다가양이온 뉴클레오티드, 집 핵산 (ZNA: Zip Nucleic Acid), 다가양이온 변형된 뉴클레오티드, 또는 그의 조합일 수 있다. 하나 이상의 실시양태에서, 랜덤 프라이머 혼합물은 서열 +N+N(atN)(atN)(atN)*N (서열식별번호: 6) (AT 육량체 프라이머)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제-저항성 프라이머 (예를 들어, 적당한 위치에 포스포로티오에이트 기를 포함하는 프라이머 서열)가 증폭 반응에 사용된다 (예를 들어, NNNN*N*N). 일부 실시양태에서, DNA 미니-서클의 증폭은 랜덤 육량체 또는 육량체 프라이머, +N+N(at N)(at N)(at N)*N (서열식별번호: 6) (AT 육량체 프라이머)을 이용한다.
증폭 반응 동안, DNA 주형, 예를 들어, 미니멀리즘적 발현 서열로 본질적으로 이루어진 DNA 미니-서클이 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 (dNTP) 또는 그의 변형된 대응물의 존재 하에 폴리머라제에 의해 복제된다. 핵산 주형 증폭에서 사용되는 유리 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드 (예를 들어, dATP, dGTP, dCTP 또는 dTTP) 또는 그의 변형된 유사체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물에 티오에이트화 dNTP가 보충된다. 티오에이트화 dNTP는 α-S-dGTP, α-S-dCTP, α-S-dATP, 및 α-S-dTTP를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 티오에이트화 dNTP 예컨대 α-S-dATP 또는 α-S-dTTP가 티오에이트화 염기의 RCA 산물 내로의 랜덤 혼입을 위해 dNTP 혼합물 내로 첨가될 수 있다.
일부 실시양태에서, RCA는 약 10 μM 내지 약 10 mM 범위의 dNTP의 최종 농도를 사용하여 수행된다. RCA 반응의 하나 이상의 실시양태에서, dNTP 농도는 10 mM 미만이다. 이러한 실시양태에서, RCA 산물로부터의 히드로겔 형성을 방지하고, 반응 완충제 내에 존재하는 2가 양이온 (예를 들어, Mg2+)의 양 이하의 농도로 유지되도록 dNTP의 농도는 10 mM 미만으로 유지된다. 고농도의 dNTP의 존재 하에 증폭 후에 히드로겔 형성이 발생할 수 있으며, 이는 하류 조작 예컨대 피펫팅 및 RCA 산물의 프로세싱을 추가로 복잡하게 할 수 있다. 50 mM 이상의 dNTP 농도가 RCA 반응에 사용되는 경우에 히드로겔 형성이 관찰될 수 있다.
시판되는 RCA 증폭 키트 예컨대 일루스트라(illustra)™ 템플리파이(TempliPhi)™ 증폭 키트 (지이 헬스케어)를 사용하여 RCA를 수행할 수 있다. 템플리파이 롤링-서클 증폭은 변형된 랜덤 프라이머를 사용하며, 이는 더 높은 민감도 및 증폭 균형을 제공한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레아제-저항성 프라이머가 RCA 반응에 사용된다. 고농도의 주형 DNA가 본 발명의 시험관내 전사 및 번역 방법에 요구되기 때문에, 더 빠른 동역학 및 더 높은 수율의 더욱 균형잡힌 DNA 증폭이 RCA를 사용하여 달성될 수 있다.
다양한 방법을 사용하여 본 발명의 방법과 함께 사용하기 위한 DNA 미니-서클 주형을 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 미니-서클 주형이 생성되도록 선형 DNA 주형이 원형화될 수 있다. 한 예시적 실시양태에서, 효소 반응에 의해, 예를 들어, 라이게이션 효소 예컨대 DNA 리가제와의 인큐베이션에 의해 선형 DNA 주형의 원형화가 실행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 말단 단부가 근접하도록 선형 DNA 주형의 말단 단부가 핵산 서열에 혼성화된다. 그 후, 라이게이션 효소와 함께 인큐베이션하면 혼성화된 선형 DNA 주형의 원형화가 실행되어 DNA 미니-서클이 생성될 수 있다. 적합한 DNA 미니-서클 주형은 적당한 PCR 프라이머를 사용한 더 큰 DNA (예를 들어, 게놈 DNA, 또는 DNA 라이브러리로부터의 DNA)의 일부분의 PCR 증폭에 이어지는 PCR 산물의 원형화에 의해 또한 생성될 수 있다. DNA 미니-서클은 적합한 선형 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성에 이어지는 합성된 올리고뉴클레오티드의 원형화에 의해 또한 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성된 선형 올리고뉴클레오티드는 본질적으로 미니멀리즘적 발현 서열로 이루어질 수 있고, DNA 미니-서클이 생성되도록 DNA 리가제를 통해 원형화를 달성할 수 있다.
방법들 중 하나 이상은 DNA 미니-서클을 정제, 분석 및/또는 정량화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이중-가닥 DNA 미니-서클의 단리 또는 정제 및/또는 오염물, 예컨대 효소 또는 라이게이션되지 않은 형태의 DNA의 제거가 증폭 반응 전에 수행될 수 있다. 핵산의 정제, 분석 또는 정량화에 사용되는 임의의 적합한 기술을 사용할 수 있다. 비제한적인 예는 침전, 여과, 친화성 포획, 겔 전기영동, 시퀀싱 또는 HPLC 분석을 포함한다. 예를 들어, 친화성 포획에 의해 원형 핵산의 정제가 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 생성된 DNA 미니-서클의 프로세싱을 추가로 포함할 수 있다. 생성된 DNA 미니-서클의 후가공은 의도되는 용도에 따라 변할 수 있다.
실시예
달리 상술되지 않는 한, 실시예에 기술된 성분은 통상적인 화학 공급자로부터 상업적으로 입수가능하다. 실시예 섹션에서 사용된 일부 약어는 하기와 같이 확장된다: "mg": 밀리그램; "ng": 나노그램; "pg": 피코그램; "fg": 펨토그램; "mL": 밀리리터; "mg/mL": 밀리리터당 밀리그램; "mM": 밀리몰농도; "mmol": 밀리몰; "pM": 피코몰농도; "pmol": 피코몰; "μL": 마이크로리터; "min.": 분 및 "h.": 시간.
물질: 인간 및 CHO 용해물을 사용하는 1-단계 커플링 IVT 키트, pCFE-GFP 대조군 벡터, 및 퀀트-잇 피코그린(Quant-IT PicoGreen)® 이중-가닥 DNA 검정 키트는 써모피셔(ThermoFisher) (미국 매사추세츠주 월섬)으로부터 구입하였다. 마이크로콘(MICROCON)® 원심분리 필터 및 스트렙타비딘 자기 비드는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미국 미시간주 세인트 루이스)로부터 구입하였다. PstI 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) (미국 매사추세츠주 입스위치)로부터 구입하였다. 타이푼(Typhoon) 가변 모드 영상 장치는 지이 헬스케어 (미국 뉴저지주 피스카타웨이)로부터 수득하였다. 스펙트라맥스(SpectraMax) M5 마이크로플레이트 판독기는 몰레큘러 디바이시즈, 엘엘씨(Molecular Devices, LLC)로부터의 것이었다.
실시예 1: RCA 산물 DNA의 생성
원형 DNA 주형 (플라스미드 양성 대조군 예를 들어, pCFE-GFP, 또는 미니멀리즘적 발현 서열을 갖는 DNA 미니-서클)로부터 RCA 반응에 의해 RCA 산물 DNA이 생성되었다. 플라스미드 양성 대조군 pCFE-GFP는 1-단계 인간 커플링 IVT 키트의 일부로서 구입되었다. 이러한 정제된 플라스미드는 뇌심근염 바이러스 (EMCV)의 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 포함하고, 터보GFP 단백질을 코딩한다.
DNA 미니-서클의 생성:
EGFP를 위한 미니멀리즘적 발현 서열을 인-실리코로 디자인하고, 시험관내에서 합성하였다. 미니멀리즘적 발현 서열은 처음에는 T7 프로모터 및 +1 서열 (생성된 mRNA의 5'-비번역 영역의 제1 리보스 위치)을 함유하였고, IRES 서열이 EGFP 코딩 영역에 융합된 것이 이어졌다. T7 프리-프로모터 서열, T7 phi10 프로모터 줄기 루프, 번역 증진 요소 (TEE), 리보솜 결합 서열, 리보솜 결합을 증진시키기 위한 인슐레이터 서열, 리보솜 개시를 증진시키기 위한 인슐레이터 서열, T7 전사 종결 서열, 폴리아데닐화 서열, 펩티드 리더-서열, 또는 프로테아제 절단 부위를 포함하여, 다양한 추가적인 비-코딩 및 코딩 파라미터가 미니멀리즘적 발현 서열을 디자인하는 동안 포함되었다. 미니멀리즘적 발현 서열은 추가로 코돈 용법에 대해 최적화될 수 있다. 대표적인 미니멀리즘적 발현 서열이 서열식별번호: 5 (표 3)로서 열거된다. 서열식별번호: 5의 미니멀리즘적 발현 서열은 순차적으로 T7 프로모터, EMCV IRES, 번역 개시 코돈, EMCV 폴리단백질 ORF의 번역된 N-말단 (코돈 최적화된 EGFP에 융합됨), 번역 정지 코돈, 폴리A 트랙트 및 T7 전사 종결인자 서열을 포함한다.
표 3: DNA 서열 목록
5' 및 3' 단부 둘 다의 독특한 제한 부위 (각각 BamHI 및 BglII)로 DNA 합성기 (인터그레이티드 DNA 테크놀러지즈, 인크.(Integrated DNA Technologies, Inc.))를 사용하여 선형 이중-가닥 DNA를 합성하였다. DNA 미니-서클을 생성시키기 위해, 상보적인 점착성 오버행이 생산되도록 이중-가닥 DNA를 양쪽 엔도뉴클레아제로 소화시켰다. 이러한 소화된 DNA를 T4 DNA 리가제를 사용하여 라이게이션시켰다. 제한 소화 및 라이게이션 단계는 20 U BamH1, 10 U BglII, 400 U T4 리가제, 1 mM ATP, 100 μg/mL 소 혈청 알부민 (BSA), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 및 10 mM 디티오트레이톨 (DTT)을 포함하는 반응 혼합물을 사용하여 순차적으로 또는 동시에 (예를 들어, 동일한 튜브에서) 수행되었다. 후속적으로 모든 라이게이션 산물 (DNA 미니-서클)을 엑소뉴클레아제 I 및 엑소뉴클레아제 III으로 처리하여 임의의 잔여 선형 DNA 단편을 소화시켰다. 라이게이션 산물을 80℃에서 20분 동안 인큐베이션함으로써 엑소뉴클레아제를 열 불활성화시켰다. 엑소뉴클레아제의 열-불활성화 후, 10 μl (10 ng의 원형 DNA)의 완료된 라이게이션 반응을 변성시키고, Phi29 DNA 폴리머라제를 사용하는 등온 RCA 반응에 (중간 정제 없이) 직접적으로 사용하였다.
롤링-서클 증폭 (RCA):
원형 DNA 주형 (예를 들어, 플라스미드 또는 DNA 미니-서클)의 RCA는 유입 DNA 서열의 탠덤 반복을 갖는 고분자량의 과분지형 콘카테머를 산출한다. 오프-타겟 증폭을 최소화하기 위해, 물, 반응 완충제, 프라이머 및 DNA 폴리머라제 효소를 포함하는 RCA 시약을 원형 DNA 주형 (플라스미드 또는 미니-서클) 또는 dNTP의 첨가 전에 60분 동안 30℃에서 예비-정화하였다. 일부 실시양태에서, 프라이머-뉴클레오티드 믹스를 엑소뉴클레아제 I, 엑소뉴클레아제 III, 및 단일 가닥 DNA 결합 단백질 (SSB 단백질)의 조합물과 함께 인큐베이션함으로써 엑소뉴클레아제-저항성 프라이머 및 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머-뉴클레오티드 믹스에서 오염을 제거하였다. 일부 실시양태에서, 임의적으로 엑소뉴클레아제의 존재 하에 (사용된 DNA 폴리머라제가 비-프루프-리딩 DNA 폴리머라제를 포함한 경우), 2가 양이온 (예를 들어, Mg2+)와 함께 인큐베이션하는 것에 의해, 가닥-변위 DNA 폴리머라제를 함유하는 효소 믹스에서 오염이 제거된다. 후속적으로 오염이 제거된 효소 및 프라이머-뉴클레오티드 믹스를 사용하여 원형 DNA 주형의 증폭이 수행된다. 예를 들어, 200 ng의 Phi29 DNA 폴리머라제를 함유하는 폴리머라제 용액을 15 mM KCl, 20 mM MgCl2, 0.01% 트윈-20 및 1 mM TCEP를 함유하는 5 μL의 50 mM HEPES 완충제 (pH=8.0) 내의 0.1 단위의 엑소뉴클레아제 III과 함께 인큐베이션하였다. 30℃에서 약 60분 동안 또는 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션을 수행하였다. 오염이 제거된 Phi29 DNA 폴리머라제 용액을 빙냉조로 옮긴 후, 엑소뉴클레아제 III의 사전 불활성화 없이 타겟 RCA 검정에서 사용하였다.
원형 DNA (플라스미드 또는 DNA 미니-서클)의 증폭이 랜덤 육량체, 또는 서열 +N+N(at N)(at N)(at N)*N (AT 육량체, 서열식별번호: 6) (여기서 "N"은 랜덤 뉴클레오티드를 나타내고 (즉, N은 A, C, G, 또는 T/U 중 임의의 것일 수 있음), "at N"은 2-아미노 dA, 2-티오 dT, 정상 G 또는 정상 C 중 임의의 것을 나타내고, 문자 명칭에 선행하는 플러스 (+) 기호는 이러한 문자가 지정하는 뉴클레오티드가 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드임을 가리키며, 문자에 선행하는 별표 (*) 기호는 이러한 문자가 지정하는 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드임을 가리킴)을 갖는 육량체 프라이머를 사용하여 수행되었다. 일부 실시양태에서, 서열 비오틴-NNNN*N*N (서열식별번호: 7)을 갖는 비오티닐화 육량체 (여기서 "N"은 랜덤 뉴클레오티드를 나타내고 (즉, N은 A, C, G, 또는 T/U 중 임의의 것일 수 있음), 문자에 선행하는 별표 (*) 기호는 이러한 문자가 지정하는 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드임을 가리킴)를 사용하여 원형 DNA의 증폭이 수행되었다. 모든 RCA 반응에 대해, 증폭된 RCA 산물 DNA의 히드로겔 형성을 피하기 위해 dNTP 농도는 1 mM 미만 (전형적으로는 400-800 μM)으로 유지되었고, 히드로겔 형성은 잠재적으로 RCA 산물 DNA의 하류 유용성을 복잡하게 할 수 있다.
예비-정화된 RCA 시약을 30℃에서 약 16시간 동안 또는 960분 동안 원형 DNA 주형 및 뉴클레오티드 믹스와 함께 인큐베이션함으로써 DNA 증폭 반응이 수행되었다. 롤링-서클 증폭을 위해, 증폭 반응 혼합물은 40 μM 프라이머, 400 μM dNTP (400 μM의 각각의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP); ~1-30 ng의 원형 DNA 주형 (플라스미드 또는 DNA 미니-서클), 20 ng/μL의 phi29 DNA 폴리머라제, 50 mM HEPES (pH = 8.0), 30 mM KCl, 20 mM MgCl2, 2.5% (w/v) PEG-8000, 0.01% (v/v) 트윈-20, 및 1 mM TCEP를 포함하였다. 인큐베이션 종료 시, 반응 혼합물을 65℃에서 10분 동안 가열함으로써 반응 혼합물 내의 Phi29 DNA 폴리머라제를 불활성화시켰다. 일부 예에서, 티오에이트화 dATP가 dNTP 용액 내의 비-티오에이트화 dATP에 비교하여 1:40 비로 보충되었다 (예를 들어, 0.01 mM 알파-S-dATP).
서열식별번호: 5로부터 유래된 DNA 미니-서클로부터 RCA 산물 DNA가 생성되었다. DNA 미니-서클을 생성시키기 위해, 서열식별번호: 1의 DNA 주형을 BamHI 및 BglII로 소화시키고, 라이게이션에 의해 원형화시켰다. pCFE-GFP 플라스미드 및 DNA 미니-서클을 사용하는 RCA 반응을 3가지 상이한 테스트 조건을 사용하여 수행하였다: (i) 랜덤 육량체 및 dNTP를 사용함, (ii) AT-육량체 프라이머 및 dNTP를 사용함; 및 (iii) AT 육량체 및 티오에이트화 dATP와 혼합된 dNTP를 사용함. 일부 반응의 경우에 비-티오에이트화 dATP에 비교하여 1:40 비로 포스포로티오에이트화 dATP가 첨가된 것 (예를 들어, 0.01 mM 알파-S-dATP)을 제외하고는, 모든 RCA 반응은 0.4 mM dNTP (dNTP, 및 임의적인 티오에이트화 dATP의 최종 농도) 및 40 μM의 프라이머 (랜덤 육량체, AT 육량체, 또는 비오티닐화 육량체)를 포함하였다. 100 μL의 총 RCA 반응 부피로부터 퀀트-잇™ 피코그린® 이중-가닥 DNA 검정 키트 (써모피셔 인크.)를 사용하여 RCA 산물을 정량화하였다. 제한된 DNA 산물의 아가로스 겔 전기영동을 또한 수행하였고, 전기영동 밴드의 강도를 공지된 농도의 DNA를 갖는 표준물의 것에 비교하였다.
실시예 2: 진핵생물 무세포 추출물에서의 플라스미드 DNA로부터 생성된 RCA 산물 DNA의 발현
1-단계 인간 커플링 IVT 키트는 뇌심근염 바이러스 (EMCV)의 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 함유하고 터보GFP 단백질을 코딩하는 양성 대조군 벡터로서 pCFE-GFP를 포함한다. IRES 서열의 RNA 폴딩이 번역 효율의 조절에 유의하게 영향을 미치는 것으로 공지되어 있기 때문에, 1-단계 시험관내 전사 번역 (IVTT) 키트 내의 성분이 EMCV IRES 활성에 대해 최적화되었다.
실시예 1에 기술된 바와 같이, 티오에이트화 dATP의 존재 또는 부재 하에 AT 프라이머 (서열식별번호: 6)를 사용하여 RCA에 의해 pCFE-GFP 대조군 벡터가 증폭되었다. 1-단계 커플링 IVT를 사용하는 시험관내 전사-번역 검정을 제조사의 설명서에 따라 수행하였다. 1 마이크로그램의 RCA 산물 DNA를, 어떠한 중간 정제도 없이, Hela-세포 용해물 (25 μL 최종 부피)에 첨가하고, 30℃에서 6시간 동안 에펜도르프 써모믹서(Eppendorf ThermoMixer)®에서 인큐베이션하여 RCA 산물 DNA의 시험관내 전사 및 번역 (IVTT)을 수행하였다. 번역된 무세포 터보GFP 단백질을 형광 정량화 전에 4℃에서 철야로 인큐베이션하였다. IVTT에 의해 생성된 터보GFP 단백질을 함유하는 (PBS에서) 4배 희석된 샘플을 스펙트라맥스 M5 마이크로플레이트 리더를 사용하는 형광 측정에 적용하였다. 활성 무세포 터보GFP 단백질의 형광을 482 nm에서 측정하고, 기준물로서의 정제된 녹색 형광 단백질 (GFP) (바이오비전, 인크(BioVision, Inc))에 비교하였다. μg/mL의 단위로 총 무세포 터보GFP 단백질 수율을 계산하였다. 도 1은 어떠한 중간 정화 또는 정제도 없이 Hela 용해물 내로 직접적으로 적용된 경우에 RCA 산물로부터 형광 터보GFP가 거의 생산되지 않았음을 제시한다.
RCA 반응 성분이 IVTT의 IRES-매개 번역을 억제하였을 수 있기 때문에, RCA 반응 성분을 제거하기 위해, 0.04 부피의 500 mM EDTA 및 0.1 부피의 7.5 M 아세트산암모늄을 첨가하고 와동에 의해 혼합함으로써 RCA 산물 DNA를 침전시켰다. 혼합물에, 3.5 부피의 95% 에탄올 (실온, 25℃)을 첨가하고, 다시 혼합한 후, RCA 산물 DNA를 실온에서 20,000g로 20분 동안 미세원심분리기에서 펠릿화하였다. DNA 펠릿을 건드리지 않으면서 피펫을 사용하여 상청액을 튜브로부터 조심스럽게 제거하였다. 그 후, 약 200 μL의 70% 에탄올 (실온)을 펠릿에 첨가하고, 와동에 적용하여 혼합하고, 20,000g에서 5분 동안 다시 원심분리하였다. 펠릿을 건드리지 않으면서 상청액을 조심스럽게 제거하였다. DNA 펠릿을 미세원심분리기에서 20,000g의 속도로 3분 동안 다시 스피닝시킨 후, 마지막 미량의 에탄올을 제거하였다 (RCA DNA를 불용성이 되게 할 수 있는 과다-건조를 피하도록 주의함). 그 후, DNA 펠릿을 0.1 M TE 완충제 (10 mM 트리스, pH 7.5, 0.1 mM EDTA)에 다시 현탁시키고, 무세포 발현 반응에서 사용하기 전에 4℃에서 보관하였다.
후속적으로, 정제된 RCA DNA를 사용한 무세포 단백질 발현을 Hela 세포 용해물을 사용하여 결정하였다. 1 마이크로그램의 정제된 RCA DNA를 Hela 세포 용해물에 첨가하고, 제조사의 프로토콜에 따라 1-단계 인간 커플링 IVT 키트를 사용하여 IVTT 검정을 수행하였다. 도 1은 1 μg의 RCA DNA가 IVTT 반응에 사용되었을 때 RCA 산물 DNA로부터의 터보GFP 단백질 수율이 플라스미드 DNA보다 비교적 더 적었음을 제시한다. RCA 산물 DNA를 IVTT 반응에서 2x 또는 3x 더 높은 농도로 적용하면 (2 μg 및 3 μg), (도 1에 제시된 바와 같음) 터보GFP 단백질의 더욱 더 낮은 수율이 초래되었다. RCA DNA가 1-단계 인간 커플링 IVT 키트가 제안하는 농도에 비해 2x, 4x, 및 8x만큼 희석되어 (500-125 ng), IVTT에 사용되었을 때, 증가된 무세포 터보GFP 단백질 수율이 관찰되었으며, 이는 도 1에서 제시된다. 총 IVTT 반응 부피가 25 μL였기 때문에, RCA 주형 DNA의 최종 농도는 5-20 ng/μL 범위였다. 무세포 발현 결과는 티오에이트화 및 비-티오에이트화 RCA 산물 DNA 사이에서 유사하였다. 대조적으로, 플라스미드 DNA가 주형으로서 사용되었을 때, 플라스미드 DNA의 희석 시, 무세포 단백질 발현 수율이 IVTT에서 감소되었다. 예를 들어, 도 1에 제시된 바와 같이, 0.5 μg의 플라스미드 DNA 주형 (2x 희석)으로 1 μg의 플라스미드 DNA에 비교하여 더 적은 터보GFP 단백질이 산출되었다.
실시예 3: DNA 미니-서클로부터 생성된 RCA 산물 DNA를 사용하는 무세포 단백질 발현
실시예 2로부터의 데이터 (도 1)는 RCA 산물 DNA가 HeLa 세포 용해물을 사용하는 IVTT 검정을 위한 주형으로서 사용되었을 때, 플라스미드 DNA에 비교하여 4 내지 8배 더 낮은 농도의 RCA 산물 DNA가 최적의 단백질 발현에 요구된다는 것을 제시하였다. IVTT 반응을 위해 DNA 미니-서클로부터 생성된 RCA 산물 DNA을 사용함으로써 이러한 관찰이 추가로 확립되었다. DNA 미니-서클 주형으로부터 생성된 RCA 산물 DNA가 제조되었고, IVTT에 의해 단백질 발현을 비교하는데 이용되었다. 실시예 1에 기술된 바와 같이, EGFP 단백질을 코딩하는 DNA 서열 (서열식별번호: 5)을 라이게이션시켜 미니-서클을 형성시키고, 티오에이트화 dATP의 존재 하에 AT 프라이머를 사용하여 RCA에 의해 증폭시켰다. RCA 산물 DNA를 단계적으로 희석하여 상이한 농도의 RCA 산물 DNA의 샘플들을 생성시켰다. 상이한 농도의 RCA 산물 DNA를 25 μL의 1-단계 인간 커플링 IVT 반응 혼합물에 첨가하고, 300 rpm에서 가볍게 진탕시키면서 에펜도르프 써모믹서에서 30℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 IVTT 산물인 무세포 EGFP 단백질을 형광 분석 전에 4℃에서 철야로 폴딩되게 하였다. 약 4 μL의 IVTT 산물을 SDS-PAGE로 분리하고 (도 3), 488 nm 타이푼 가변-모드 영상 장치 (지이 헬스케어)를 사용하여 겔에서 천연 형광 단백질을 검출하였다. 도 4는 약 125 ng의 RCA 산물 DNA이 HeLa 세포 용해물에서 EGFP의 최대 무세포 발현을 일으켰다는 것을 입증하며, 이는 플라스미드 DNA 주형으로부터 생성된 RCA 산물 DNA을 사용한 실시예 2의 결과와 일관된다. 도 4에 제시된 바와 같이 RCA 산물 DNA 발현 수율 사이에서 가우스 분포가 관찰되었다. 결과적으로, 도 4는 0.5-1 마이크로그램의 유입 RCA DNA로부터, 그리고 8-16 나노그램의 유입 RCA DNA으로부터 거의 등가의 양의 단백질이 생성되었음을 예시한다. 도 4는 유입 RCA DNA의 양 (예컨대 0.5 마이크로그램 및 16 나노그램의 유입) 사이의 차이가 96%를 초과하는 경우에도 무세포 단백질 발현이 거의 동일하였음을 추가로 제시한다. 대조군 목적으로, 터보GFP 단백질을 1 마이크로그램의 pCFE-GFP 플라스미드 DNA로부터 (제조사의 설명서에 따라) 합성하여, 상대적 형광 출력을 비교하였다. 요약하면, 도 3 및 4는 원형 주형 (도 2의 DNA 미니-서클 구축물)으로부터 생성된 RCA 산물 DNA의 요구가 진핵생물 무세포 용해물에서의 원하는 단백질 발현을 위한 플라스미드 DNA의 것보다 4 내지 8배 더 낮다는 것을 제시한다.
실시예 4: DNA 미니-서클로부터 생성된 자기-비드 접합 RCA 산물 DNA로부터의 무세포 발현
실시예 3으로부터 DNA 미니-서클 서열 (서열식별번호: 5)로부터 생성된 비오티닐화 RCA 산물 DNA를 스트렙타비딘 비드 상에 접합시키고, HeLa 세포 추출물에서의 시험관내 전사 및 번역에 사용하였다. DNA 미니-서클 (서열식별번호: 5)을 비오티닐화 육량체 프라이머 (서열식별번호: 7) 또는 비-비오티닐화 AT 육량체 (서열식별번호: 6) 프라이머를 사용하여 RCA에 의해 증폭시키고, 생성된 증폭 산물을 피코그린 검정에 의해 정량화하였다. 일부 실시양태에서, 비드 접합 전에 과량의 비오티닐화 육량체 프라이머를 제거하기 위해 생성된 미정제 RCA 산물을 마이크로콘 원심분리 필터를 사용하여 예비-정제하였다. 미정제 또는 정제 RCA 산물 DNA를 스트렙타비딘 비드와 혼합하여, 마이크로리터의 비드당 포획된 약 24 ng 또는 50 ng의 RCA 산물 DNA에 대한 잠재력을 달성하였다. 스트렙타비딘 비드를 PstI로 소화시키고 방출된 DNA의 양을 피코그린 검정에 의해 정량화함으로써, 스트렙타비딘 비드 상에 접합된 RCA 산물 DNA의 상대적인 양을 확인하였다. 대표적인 비드-제조 프로토콜로부터의 정량적 결과가 표 3에서 제시된다. 수집하는데 자석을 사용하여 PBS에서 비드를 광범위하게 세척한 후, 최종 부피 (2.8 μL)의 비드를 1-단계 인간 커플링 IVT 반응 (25 μL)으로 옮기고, SDS-PAGE 겔에서 천연 형광에 의해 무세포 EGFP 번역을 비교하였다 (도 5). 488 nm 타이푼 가변-모드 영상 장치를 사용하여 EGFP 형광을 영상화하였다 (겔 내). 도 5는 IVTT 반응 혼합물의 마이크로리터당 5 ng의 추정 주형 농도로 비오틴-스트렙타비딘 커플링에 의해 스트렙타비딘 비드 상에 포획되었을 때 DNA 미니-서클로부터 생성된 RCA 산물 DNA로부터 형광 EGFP가 효과적으로 생산되었음을 입증한다. 비오티닐화 RCA 산물 DNA가 어떠한 중간 정제도 요구하지 않으면서 스트렙타비딘 비드 상에 효과적으로 커플링되었다. 예상대로, 비-비오티닐화 AT 프라이머와 함께 인큐베이션된 비드를 사용하여 무세포 EGFP 발현이 거의 관찰되지 않거나 관찰되지 않았다. 마이크로콘 필터를 사용하여 과량의 육량체 프라이머를 제거하는 것이 미정제 제조 공정 (도 5의 레인 2 참조)에 비교하여 더 높은 비-특이적 발현에 기여하였다 (도 5의 레인 3 참조). 대조군 목적으로, 터보GFP를 1 마이크로그램의 pCFE-GFP 플라스미드 DNA로부터 (제조사의 설명서에 따라) 합성하여, 상대적 형광 출력을 비교하였다.
표 3: 무세포 발현 전의 RCA 산물 DNA 비드 제조의 정량적 추정
상기 실시예는 본 발명의 일부 특색을 예시하고, 다양한 모든 가능한 실시양태오부터의 선택된 실시양태이다. 본 발명은 그의 취지 또는 본질적인 특성을 벗어나지 않으면서 다른 특정한 형태로 구현될 수 있다. 본 발명의 특정 특색만이 본원에 예시 및 기술되었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 본 개시내용의 이점을 고려하여, 파라미터를 최적화하기 위해 변형/변화를 만들 수 있을 것이다. 따라서, 상기 실시양태는 모든 면에서 본원에 기술된 발명을 제한하기보다는 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 필요한 경우에, 범위가 제공되었고, 이러한 범위는 그 사이의 모든 하위 범위를 포함한다.
SEQUENCE LISTING
<110> KVAM, ERIK LEEMING
NELSON, JOHN RICHARD
GAO, WEI
<120> CELL-FREE PROTEIN EXPRESSION USING DOUBLE-STRANDED CONCATAMERIC
DNA
<130> 316478-1
<140>
<141>
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> May or may not be present
<400> 1
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 2
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> May or may not be present
<400> 2
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> May or may not be present
<400> 3
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(3)
<223> May or may not be present
<400> 4
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 5
<211> 1395
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 5
ccgggatccc agtgaattgt aatacgactc actatagggc gaattaattc cggttatttt 60
ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga 120
cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg 180
tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt 240
gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat 300
aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg 360
aaagagtcaa atggctcacc tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg 420
taccccattg tatgggatct gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt 480
cgaggttaaa aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac 540
acgatgataa tatggccaca accgtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc 600
ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg 660
gtgaaggcga cgctacttac ggaaagctga cactgaagtt catttgcacc acaggcaaac 720
tgcctgtgcc ctggccaacc ctcgtgacta ccctcacata cggcgtgcag tgctttagca 780
gatatcctga tcatatgaaa cagcacgact tctttaagtc tgctatgcct gaaggatacg 840
tgcaggagag aaccatcttc ttcaaggacg acggaaacta taagactaga gccgaggtga 900
agtttgaggg agacacactg gtgaatagga tcgagctgaa gggcattgac ttcaaggagg 960
acggaaacat cctgggccac aagctggagt acaactacaa tagccacaac gtctatatta 1020
tggctgataa gcagaagaac ggaatcaagg tgaacttcaa gatcagacac aacatcgagg 1080
acggcagcgt gcagctggcc gaccactacc agcagaatac ccctatcgga gacggccccg 1140
tgctcctgcc agacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg 1200
agaagcgcga tcatatggtt ctgctggagt tcgtgaccgc cgccggcatc actcttggta 1260
tggacgagct gtacaagtaa taagatctga ctgaaaaaaa aaaagtttaa acactagtcc 1320
gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg 1380
ctgcagagat ctccg 1395
<210> 6
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule:
Synthetic oligonucleotide
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> A, C, G, or T/U
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(2)
<223> Locked nucleic acid
<220>
<221> modified_base
<222> (3)..(5)
<223> 2-amino dA, 2-thio dT, normal G or normal C
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> Phosphorothioate linkage between nucleotides
<220>
<221> modified_base
<222> (6)..(6)
<223> A, C, G, or T/U
<400> 6
nnnnnn 6
<210> 7
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<220>
<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule:
Synthetic oligonucleotide
<220>
<223> 5'-biotin
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(6)
<223> A, C, G, or T/U
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> Phosphorothioate linkage between nucleotides
<400> 7
nnnnnn 6
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
6xHis tag
<400> 8
His His His His His His
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 9
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
Claims (27)
- 이중-가닥 콘카테머 DNA를 진핵생물 무세포 발현 시스템과 접촉시키며, 여기서 이중-가닥 콘카테머 DNA는 복수의 탠덤 반복 서열을 포함하고, 여기서 복수의 탠덤 반복 서열 각각은 프로모터, 캡-비의존적 번역 요소 (CITE), 및 오픈 리딩 프레임을 포함하는 발현 서열을 포함하는 것인 단계; 및
진핵생물 무세포 발현 시스템에서 이중-가닥 콘카테머 DNA로부터 단백질을 시험관내 발현하는 단계
를 포함하는, 시험관내 전사 및 번역을 위한 방법으로서,
여기서 진핵생물 무세포 발현 시스템 내 이중-가닥 콘카테머 DNA의 최종 농도는 약 0.1 ng/μL 내지 약 35 ng/μL 범위인
방법. - 제1항에 있어서, 진핵생물 무세포 발현 시스템 내 이중-가닥 콘카테머 DNA의 최종 농도가 약 0.5 ng/μL 내지 약 20 ng/μL 범위인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 진핵생물 무세포 발현 시스템 내 이중-가닥 콘카테머 DNA의 최종 농도가 약 2 ng/μL 내지 약 10 ng/μL 범위인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵생물 무세포 발현 시스템 내 이중-가닥 콘카테머 DNA의 최종 농도가 약 3 ng/μL 내지 약 7 ng/μL 범위인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 캡-비의존적 번역 요소 (CITE)가 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 번역 증진 요소 (TEE), 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 오픈 리딩 프레임이 번역을 증진시키기 위한 코돈-최적화 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 오픈 리딩 프레임이 발현된 단백질의 정제를 위한 태그 서열, 리보솜 인식 증진을 위한 IRES로부터 유래된 아미노-말단 펩티드 융합 서열, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 서열이 폴리A 서열, 전사 종결 서열, 인슐레이터 서열, 또는 그의 조합을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 이중-가닥 콘카테머 DNA를 진핵생물 무세포 발현 시스템과 접촉시키기 전에 이중-가닥 콘카테머 DNA를 기판 상에 고정화시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제9항에 있어서, 단백질을 시험관내 발현한 후 기판-고정화된 이중-가닥 콘카테머 DNA를 진핵생물 무세포 발현 시스템으로부터 회수하고, 회수된 기판-고정화된 이중-가닥 콘카테머 DNA를 후속적 시험관내 전사 및 번역 반응에 재사용하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 이중-가닥 콘카테머 DNA가 롤링 서클 증폭 (RCA) 산물 DNA인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 이중-가닥 콘카테머 DNA가 비오티닐화 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트화 뉴클레오티드, 이노신-함유 뉴클레오티드, 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드, 펩티드 핵산 (PNA) 뉴클레오티드, 2-아미노-데옥시아데노신, 2-티오-데옥시티미딘, 다가양이온 뉴클레오티드 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
- DNA 미니-서클을 제공하는 단계,
DNA 미니-서클의 롤링 서클 증폭을 통해 이중-가닥 콘카테머 DNA를 생성시키는 단계; 및
생성된 이중-가닥 콘카테머 DNA를 시험관내에서 진핵생물 무세포 발현 시스템과 접촉시켜 전사 및 번역을 통해 이중-가닥 콘카테머 DNA로부터 단백질을 발현하는 단계
를 포함하는, 시험관내 전사 및 번역을 위한 방법으로서,
여기서 진핵생물 무세포 발현 시스템 내 이중-가닥 콘카테머 DNA의 최종 농도는 약 0.1 ng/μL 내지 35 ng/μL 범위인
방법. - 제13항에 있어서, DNA 미니-서클이 프로모터, 캡-비의존적 번역 요소, 및 오픈 리딩 프레임으로 본질적으로 이루어진 미니멀리즘적 발현 서열로 본질적으로 이루어진 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 미니멀리즘적 발현 서열에는 숙주 세포에서의 플라스미드의 증식에 요구되는 어떠한 외인성 서열도 없는 것인 방법.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 캡-비의존적 번역 요소 (CITE)가 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 번역 증진 요소 (TEE), 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
- 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 미니멀리즘적 발현 서열이 추가로 인슐레이터 서열, 폴리A 서열, 전사 종결 서열, 또는 그의 조합으로 본질적으로 이루어진 것인 방법.
- 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 오픈 리딩 프레임이 번역을 증진시키기 위한 코돈-최적화 서열, 발현된 단백질의 정제를 위한 태그 서열, 리보솜 인식 증진을 위한 IRES로부터 유래된 아미노-말단 펩티드 융합 서열, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
- 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵생물 무세포 발현 시스템 내 이중-가닥 콘카테머 DNA의 최종 농도가 약 0.5 내지 20 ng/μL 범위인 방법.
- 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵생물 무세포 발현 시스템 내 이중-가닥 콘카테머 DNA의 최종 농도가 약 3 ng/μL 내지 약 7 ng/μL 범위인 방법.
- 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 이중-가닥 콘카테머 DNA가 변형된 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
- 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 이중-가닥 콘카테머 DNA가 포스포로티오에이트화 뉴클레오티드, 비오티닐화 뉴클레오티드, 이노신-함유 뉴클레오티드, 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드, 펩티드 핵산 (PNA) 뉴클레오티드, 2-아미노-데옥시아데노신, 2-티오-데옥시티미딘, 다가양이온 뉴클레오티드 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
- 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 이중-가닥 콘카테머 DNA를 진핵생물 무세포 발현 시스템과 접촉시키기 전에 이중-가닥 콘카테머 DNA를 기판 상에 고정화시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제23항에 있어서, 단백질을 시험관내 발현한 후 기판-고정화된 이중-가닥 콘카테머 DNA를 진핵생물 무세포 발현 시스템으로부터 회수하고, 회수된 기판-고정화된 이중-가닥 콘카테머 DNA를 후속적 시험관내 전사 및 번역 반응에 재사용하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제13항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 롤링 서클 증폭이 약 10 μM 내지 약 10 mM 범위의 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP) 및 임의적인 알파-티오 dNTP의 최종 농도를 사용하여 수행되는 것인 방법.
- 제13항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 롤링 서클 증폭이 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 랜덤 프라이머 혼합물을 사용하여 수행되는 것인 방법.
- 제26항에 있어서, 랜덤 프라이머 혼합물이 +N+N(atN)(atN)(atN)*N (서열식별번호: 6) 또는 5'-비오틴-NNNN*N*N (서열식별번호: 7)의 서열을 갖는 것인 방법.
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