KR20070093992A - 고품질 핵산의 무세포 생합성 및 그것의 사용 - Google Patents

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사이토제닉, 인크.
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Abstract

본 발명은 대량의 치료적-품질 핵산을 생성할 수 있는 개선된 무세포 증폭 방법 및 연구, 치료 및 다른 용도에서 합성된 핵산을 사용하는 방법을 제공한다. 이 방법은 치료적 목적상 핵산을 알맞게 생성하기 위하여 몇몇 최첨단 과정을 결합시키고 그것들의 용도를 조정한다. 특정 용도를 위하여 특이적으로 설계된 시험관내 롤링 서클 증폭, 고충실도 폴리머라제, 고친화성 프라이머, 및 능률적인 주형을 결합시킨다. 발현 목적을 위하여, 주형은 진핵세포의 프로모터, 관심있는 유전자의 코딩 서열, 및 진핵세포의 종결 서열을 포함한 발현 카세트를 함유한다. 증폭 후, 직렬연쇄체는 그것들의 의도하는 용도에 따라서 연속적으로 가공되며, 짧은 발현 카세트(SEC)의 생성을 위한 제한효소 분해; SEC(CNA)를 환형화하는 리게이션 단계; 및/또는 sCNA를 생성하는 수퍼코일링 단계을 포함할 수 있다. 최종 생성물은 거의 검출되지 않는 수준의 박테리아의 내독소를 함유한다.
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고품질 핵산, 무세포 증폭, 발현카세트, 환형.

Description

고품질 핵산의 무세포 생합성 및 그것의 사용{CELL FREE BIOSYNTHESIS OF HIGH-QUALITY NUCLEIC ACID AND USES THEREOF}
본 발명은 고품질 핵산을 제조하는 과정 및 그것의 사용에 관한 것이다.
유전자 전달, 유전자 치료 및 DNA 예방접종에서의 DNA-기반 치료의 출현은 순도, 유효성, 효능 및 안정성 면에서 엄격한 품질 기준을 충족하는 DNA의 대규모 생성의 요구를 증가시켰다. 표적 조직에서의 유전자 발현의 효능 및 기간이 상대적으로 낮기 때문에, 대량의 DNA는 전형적으로 이러한 용도를 위하여 필요하다.
당업계의 현재 상태는 치료적 품질 핵산의 생산을 위하여 박테리아 배양에서의 플라스미드의 성장 및 고가의 정제 기술에 의존한다. 박테리아 및 다른 세포 공급원으로부터의 전형적인 플라스미드 정제 과정은 페놀, 브롬화에티디움과 염화세슘, 및 리소자임, 프로테이나제 K, 및 RN아제 A와 같은 효소를 포함한 유기, 돌연변이유발 및 독성 화합물을 사용하는 방법을 포함한다. 이들 모두는 DNA-기재 치료에서 오염물질로 주사되는 경우 잠재적인 건강 유험요소를 구성할 수 있다. 이러한 과정은 또한 의도하지 않은 오염 트랜스포존 및 다른 외래 에피솜 DNA를 플라스미드에 혼입하는 잠재적 위험성을 가진다(Haapa, S., Nuc. Ac. Res., 27(13): 2777-84, 1999). 또한 잔여 숙주세포 핵산, 다른 세포 단백질 및 내독소에 의한 오염 가 능성이 있다. 이러한 불순물은 DNA 흡수의 효율성을 최소화할 뿐만 아니라, 투여량-관련된 독성을 야기할 수 있다. 이들 불순물을 제거하기 위하여, 수용되는 정제 방법은 종종 음이온 교환, 친화성, 및 크기-배제와 같은 다중 크로마토그래프 단계를 사용한다. 이들 정제 과정은 비용이 많이 든다.
미국 특허 제5,561,064('064)호는 박테리아 배양물로부터 약학적 등급 플라스미드 DNA를 얻는 것과 관련된 노력을 설명한다. 이 특허는 박테리아 세포를 용해하기 위하여 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 방법과 이어서 유전자 치료 사용을 위한 더 순수한 DNA를 생산하기 위하여 추가 독성 화학물질을 사용하지 않고 일련의 크로마토그래피 분리를 설명한다. 이 방법은 추가 성분이 정제에 첨가되지 않더라도 잠재적 독성 세포 환경에서 플라스미드를 생산하는 것에 여전히 의존한다.
반대로, 무세포 핵산 증폭은 능률적인 생산 및 단순화된 정제 때문에 현저한 비용 절감을 제공할 수 있으며, 또한 전형적으로 박테리아에 의하여 생산된 플라스미드와 연관된 불순물을 제거한다. 시험관내 증폭, 예를 들면 폴리머라제 연쇄반응(PCR)은 1980년대 중반 이래, 실험실에서 성공적으로 사용되어 왔다. 그러나, PCR은 빠른 열 순환에 의존하며, 이는 대량 사용시에 비실용적이다.
시험관내 등온 증폭 기술이 알려져 있지만, 핵산 복제의 메커니즘을 연구하는 데 주로 사용되었다. 1984년에, Blanco와 Salas는 고 진행반응성, 가닥 치환 폴리머라제인 파지 Phi29 DNA 폴리머라제를 분리하였다. Phi29 DNA 폴리머라제는 신뢰성 높게 70 킬로 염기 길이(Phi29 유전체의 전체 길이) 이상의 DNA 가닥을 재생산할 수 있다(Blanco, L. and Salas, M., PNAS 81 (17): 5325-5329, 1984). Phi29 폴리머라제는 시험관내에서 DNA의 효율적인 등온 증폭을 위하여 말단 단백질, 이중가닥 DNA 결합 단백질 및 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB)을 필요로 한다(Blanco, L. et al., PNAS 91: 12198-202, 1994).
미국 특허 제5,001,050('05O)호는 DNA 시퀀싱에서 Phi29 DNA 폴리머라제의 사용, DNA 증폭, 및 10 kb 길이 이상의 DNA의 합성을 주장한다. 관련 미국 특허 제5,198,543 ('543)호 및 제5,576,204 ('204)호는 개선된 시퀀싱 반응을 위한 Phi29 폴리머라제의 엑소뉴클레아제-결핍 형태를 포함한, 효소의 변형된 형태를 주장한다. 그러나, 이들 변형된 폴리머라제는 더 낮은 신뢰성을 가지며, 시퀀싱 반응에서만 유용하다.
자연상태에서, 플라스미드 및 일부 바이러스 DNA를 포함한 환형 DNA 분자의 복제는 롤링 환형 증폭(RCA)에 의하여 자주 발생하며, 환형 DNA 주형은 연쇄 반복의 긴 직렬연쇄체로 복제된다. 이어서 직렬연쇄체는 절단되고 단백질 외피에 패키지된다(Dean, F.B. et al., Genome Res. 11: 1095-99, 2001). RCA를 사용하여, 일부 실험실은 DNA 시퀀싱, 클로닝, 라이브러리 구성, 및 스크리닝을 포함한 다양한 목적을 위하여DNA를 증폭하는 방법을 개발하였다(Inoue-Nagata, et al., J. Virological Methods 116: 209-211, 2003).
미국 특허 제5,654,033호, 제6,210,884호, 제6,316,229호, 제6,344,329호, 및 제6,797,474호(각각 '033, '884, '229, '329, 및 '474)는 주어진 샘플에서 표적 메시지의 사본 수를 결정하는 것과 같은 연구적 용도만을 위한 RCA 기술에 관한 것이다. 이 방법은 먼저 DNA 샘플을 환형 DNA로 변환시킨 후 조절된 순환 증폭을 사 용하여 본래 메시지의 상대적 양을 결정한다. 다른 용도는 이러한 정량적 증폭을 표적 유전자의 돌연변이체 대립유전자를 검출하는 능력과 결합시킨다.
미국 특허 제6,280,949호 및 제6,124,120호는 무작위 프라이머를 사용하여 전체 유전체의 증폭에서 RCA의 사용을 교시한다. 일부 구체예는 무작위 프라이머를 유전체의 특정 영역을 증폭하는 특정 프라이머와 결합시킨다.
미국 특허 제6,329,150호는 이미 증폭된 생성물의 2차 합성을 개시하기 위하여 새롭게 합성된 DNA에 네스트하도록 지정된 프라이머를 사용하여 변형된 RCA 기술을 교시한다. 이 방식으로, 증폭은 급격하게 발생하며 동시에 다중 표적의 검출을 위하여 PCR에 대한 등온 대안을 제공할 수 있다. 미국 특허 제6,255,082호는 이들 네스트 증폭을 촉진하는 긴 말단 반복의 사용을 교시한다. 이들 특허는 샘플에서 특정 서열의 존재를 빠르게 확인하기 위하여 RCA를 변형한다.
미국 특허 제6,642,034호는 다중 프라이머 및 가닥 치환 DNA 폴리머라제를 사용하는 증폭의 일반적 방법을 교시한다. 이 방법은 표적서열, 전체 유전체의 증폭, 표적 서열 또는 돌연변이의 검출, 주소 태그의 합성과 검출, 및 올리고뉴클레오티드의 합성을 확인하는 데 사용된다.
RCA의 다른 용도는 시퀀싱, 클로닝, 맵핑, 유전자형확인, 프로브 생성 및 진단용 스크리닝을 포함한다. 발행된 미국 특허출원 제2003/0207267호는 증폭의 속도를 향상시키는 다중 프라이머를 사용하여 표적 서클을 동시에 증폭하는 3',5'-엑소뉴클레아제 활성을 가진 다른 DNA 폴리머라제의 사용을 교시한다.
현재까지 대부분의 RCA 기술은 다른 폴리머라제의 사용이 가끔 제기되었지 만, Phi29 DNA 폴리머라제의 사용에 초점을 맞추고 있다. 이는 Phi29 폴리머라제가 신속하게 핵산의 긴 직렬연쇄체를 합성하는 고 진행반응성이 있고, 만날 수 있는 어떤 2차 프라이머를 치환하는 동안 새로운 핵산 서열을 계속적으로 합성하는 가닥 치환 활성을 가진다. 게다가, 그것은 열 순환없이 상대적으로 짧은 시간에 대량의 고 충실도 핵산을 생산할 수 있다. Phi29 폴리머라제는 4 x 10-6의 극히 낮은 평균 오류율을 가진다(Esteban, J.A., et al., J. Biol. Chem., 268(4): 2719-2726, 1993).
대부분의 RCA 기술이 Phi29 DNA 폴리머라제를 사용하지만, 미국 특허 제6,576,448호 및 제6,235,502호는 RCA에서 박테리아 DNA 폴리머라제 III (Pol III)의 사용을 개시한다. 보고에 의하면 Pol III는 증가된 속도의 DNA 합성을 제공하는 클램프 유사 활성을 가지고(초당 약 700-800 뉴클레오티드), 헬리카제를 첨가하거나 단백질을 안정화시킴으로써 최적화될 수 있다. 박테리아 DNA 폴리머라제 I(Pol I)은 또한 100 bp보다 더 작은 주형을 증폭하는 RCA에 사용되었다(Fire and Xu, PNAS 92: 4641-45, 1995). Pol I은 작은 환형 주형이 종종 극히 작은 이중-가닥 주형과 연관된 입체적 방해없이 용이하게 형성될 수 있도록 우세하게 단일 가닥 주형을 사용한다. 미국 특허 제5,614,365호는 효율성을 500 배까지 증가시키는 T7 DNA 폴리머라제의 서열을 포함하는 변형된 PolI을 개시한다. 이 폴리머라제는 감소된 디옥시-와 디디옥시뉴클레오티드 간의 구별 능력을 가지며, 시퀀싱 반응에 좋다.
전형적으로, RCA 반응은 단일 또는 이중 가닥 핵산 주형을 이용할 수 있다. Phi29 DNA 폴리머라제는 단일 가닥 또는 이중 가닥 주형을 사용할 수 있는 반면, PolI은 단일 가닥 주형만을 사용할 수 있다. 게다가, Phi29 폴리머라제는 RNA 또는 DNA 주형을 사용할 수 있다. 따라서, Phi29 폴리머라제는 RCA 및 다른 증폭에서 더 편재하는(ubiquitous) 용도를 가진다.
미국 특허 제6,368,802호, 제6,096,880호 및 제5,714,320호는 적합한 폴리머라제 및 작은 단일 가닥 환형 DNA 주형을 사용하여, RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드(28-74 뉴클레오티드 길이)를 생산하는 RCA의 사용을 교시한다. 따라서, 생산된 DNA 올리고뉴클레오티드는 세포 내 발현에 필요한 유전정보가 결핍된다.
Moreno S, et al.은 DNA 백신을 생산하기 위한 축소형, 면역학적으로 정의된 유전자 발현 벡터(MIDGE)를 개발하였다(Vaccine, 22: 1709-1716, 2004). 이들 벡터는 진핵세포 유전자 발현 및 면역반응의 유도를 위한 최소 서열만을 함유한다. 게다가, 선형 발현 카세트의 말단은 그것들의 수명 및 발현 효율성을 증가시키는 헤어핀 루프를 가지도록 변형될 수 있다. 이 접근법은 큰 진전을 나타내지만, 박테리아의 배양물로부터 플라스미드의 정제 후 불필요한 박테리아 서열의 제거가 발생하기 때문에 노동 집약적 과정을 포함한다. MIDGE 과정은 여전히 전구체로서 박테리아 플라스미드에 의존한다.
유사한 방식으로, Chen, Z.Y. et al.은 벡터에서 박테리아 서열을 제거하는 미니서클을 개발하였다. 그들은 cis-결합된 박테리아 서열이 진핵세포 발현을 침묵시킬 수 있다는 것을 보여주었다(Human Gene Ther. 16: 126-131, 2005). 그들은 또한 어떤 결합된 박테리아의 유전물질이 결핍된 선형 발현 카세트가 박테리아의 플 라스미드 백본에 결합된 발현 카세트를 가진 공유결합된 환형 플라스미드보다 10 - 100 배 더 효율적으로 발현한다는 것을 보여주었다. 무박테리아 발현 카세트의 발현은 트랜스팩션 후 90일까지 지속된다.
이 그룹은 환형 발현 카세트, 그것들로부터 만들어진 치료적 조성물, 및 환형 발현 카세트를 표적 세포에 도입하는 방법을 교시하는, 발행된 미국 특허출원 제2004-0214329호에 이 과정을 설명한다. 게다가, 이 출원은 재조합에 의하여 박테리아 서열의 제거를 촉진하기 위하여 발현 카세트의 양쪽에 인접해 있는 attB 및 attP 서열을 사용한다. 정상 조건 하에서 박테리아 배양 후, 재조합효소를 코딩하는 유도성 카세트를 또한 운반하는 박테리아는 충분한 플라스미드가 생성된 후에 attB 및 attP 부위에 재조합을 유도하는 재조합효소를 생성하도록 유도될 수 있다. 세포내 재조합은 두 개의 분리된 미니서클을 발생시킨다: 하나는 발현 카세트가 있는 것과 다른 하나는 박테리아의 유전물질이 있는 것. 박테리아 유전자 오염을 최소화하기 위하여 능률화되었다 하더라도, 이 방법은 여전히 박테리아 배양물에서의 플라스미드의 생산에 의존한다.
DNA를 사용한 치료적 사용은 안정성 및 효율성 기준에 대한 엄격한 지지를 요구한다(Prazeres, D.M., et al., Trends Biotechnol 17(4): 169-173, 1999). 대용량 설비에서 생산된 플라스미드 DNA는 오염 유전체 DNA(<10 ng/투여량), 숙주 단백질(<10 ng/투여량), RNA(0.8% 아가로스겔에서 검출불가), 및 내독소(<1 유닛/체중 kg, 또는 <0.1 EU/μg 플라스미드)가 없어야 한다. 게다가, 플라스미드는 멸균되어야하며 바람직하게는 더 효율적으로 발현될 수 있는 수퍼코일 형태이어야 한 다. 최종 제제로부터 제거될 필요가 있는 다른 오염물질은 정제 시약, 예를 들면 브롬화에티디움, 클로로포름, 페놀, 리소자임, 프로테이나제 K, RN아제 A, 및 정제 칼럼으로부터 걸러낼 수 있는 어떤 잠재적 오염물질, 예를 들면 음이온 교환기의 4차 아민을 포함한다.
이들의 순도 기준은 주로 박테리아에서 생산된 플라스미드에 대한 광범위하고 종종 고비용의 정제 기술을 사용하면서 제기되었다. 전술한 바와 같이, 인정되는 정제 방법은 주로 다중 크로마토그래피 과정을 사용하며, 음이온 교환, 친화성, 및 크기-배제 크로마토그래피 정제 단계의 조합을 포함할 수 있다. 박테리아로부터 치료적 품질 플라스미드의 생산에 필요한 정제 방법은 특수한 장치, 비싼 수지, 비싼 주택시설 및 시간이 필요하다는 것이 중요하다. 비-GMP(연구 품질) 플라스미드 DNA의 현재 비용은 최종 생성물의 g당 $30,000 - 150,000 범위이며, GMP 품질 DNA의 비용은 약 2-3배 더 높다. 간단히 말해서, 박테리아에서 생산한 플라스미드 DNA를 사용한 치료 DNA의 생-제조는 과중하게 비쌀 수 있다.
무세포 증폭을 이용하는 것에 초점을 맞춘 방법은 다수의 박테리아 오염물질에 대한 노출을 피하는 능력 때문에 현저한 비용 및 시간 절감을 제공한다. 무세포 시스템에서의 모든 것은 명백하게 확인된다. 높은 품질의 시약 및 효소만이 사용된다면, 흔적 오염물질만이 시스템에 있을 것이다. 따라서, 최종 정제는 투석, 초미세여과 및/또는 겔 여과와 같은 단순한 과정을 사용할 수 있으며, 적은 부피의 반응 혼합물만이 정제될 필요가 있다.
현재까지, RCA 시스템은 유전자 치료, DNA 백신 또는 다른 치료적 용도에 사 용하기 위한 핵산의 무세포 생산을 채용하지 않았다. 반대로, 대부분의 문헌은 시퀀싱, 유전체 증폭, 유전체 분석, 태깅, 클로닝, PCR형 용도, 라이브러리 구성 및 다른 분석적 용도를 포함한 엄격한 진단 및 연구 목적을 위한 것임을 시사한다.
발명의 개요
본 발명의 한 양태는 능률적인 발현 카세트 주형, 고 특이적 또는 무작위 프라이머, 고 충실도 폴리머라제, 및 축소형 완충 시스템을 사용하여 대용량(예를 들면, > 1mg) 핵산 생산을 위한 무세포 시스템을 생산하는 시험관내 RCA 시스템의 최적화에 관한 것이다. 이 시스템은 오로지 최소 및 비싸지 않은 정제 과정의 필요성에서 짧은 시간 동안 적은 부피로 대량의 핵산을 생산하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 이 시스템은 어떤 기본적 분석 또는 연구 목적을 위해서지만, 더 중요하게는 치료적 사용을 위하여 고품질 치료 등급 핵산을 생산할 수 있다.
본 발명은 치료, 진단 및 연구 용도를 위하여 많은 양의 고품질 핵산을 알맞게 생산하기 위하여 일부 기술을 결합시킨다. 본 발명의 방법은 대응되는 박테리아 배양물의 부피에서 생산된 것보다 250-300 배 더 많은 핵산을 생산할 수 있다. 본 발명에서, 사용된 시약에 최소한으로 함유된 것 이외의 어떤 내독소의 오염 공급원도 없다. 추가적 이점은 작은 실험실 플라스크에서 생성물의 대 발효-유사 양을 생산할 수 있는 능력; 최소한의 수의 시약만의 필요;및 능률적인 정제 과정을 포함한다. 종합하면, 이들 이점은 치료적 사용을 위하여 대량의 고품질 핵산을 생산하는 알맞은 방법으로 해석된다.
본 발명의 한 구체예에서, 박테리아에서 플라스미드 선택 및 복제에 필요한 전형적인 유전 서열이 결핍된 변형된가 주형으로 사용된다. 본 발명의 구체예에 따라서, 주형은 숙주 세포에서 발현 및 발현된 생성물의 가공에 필요한 유전 요소의 양쪽에 인접에 있는 관심있는 유전자를 함유한 환형 발현 카세트일 수 있다.
보통의 플라스미드는 본 발명의 방법을 사용하여 복제될 수 있지만, 여분의 유전 서열을 가지지않는 능률적인 주형은 많은 이점을 제공한다: 그것은 관심있는 서열의 발현을 침묵시킬 수 있는 외래 서열을 제거한다; 더 작은 구성체는 더 컴팩트하고 표적 세포에 의하여 더 효율적으로 흡수될 수 있어서, 더 높은 트랜스팩션 효율성을 야기한다;그리고 적은 물질을 가진 발현 카세트의 더 많은 양의 생산, 최종 생성물의 충실도의 통계학적 증가 및 광범위한 정제의 불필요 때문에 보다 비용 효율적이다.
무작위 프라이머 또는 서열-특이적 프라이머가 사용될 수 있지만, 서열 특이적 프라이머가 대규모 증폭에 더 효율적이고 경제적이다. 프라이머 크기는 4 내지 20 뉴클레오티드 이상일 수 있으며, 증가된 친화성, 안정성 및 장기 보관을 위하여 변형된 염기 및/또는 백본을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 포스포로티오에이트 말단-변형을 가진 특이적 프라이머는 대량(1 ml에 약 1.5 mg)의 핵산을 생산하는 데 사용될 수 있다.
증폭 단계는 완충액을 제공하는 어떤 특이적 폴리머라제를 사용할 수 있으며 온도 조건은 그 폴리머라제의 특정 요건을 수용하도록 조절된다. 예는 고온 taq-유사 폴리머라제를 사용할 때 필요한 변성 및 어닐링 단계를 포함한다. 그러나, 본 발명의 바람직한 구체예는 열순환없이 주형을 효율적으로 증폭하기 위하여 Phi29-유사 폴리머라제와 같은 진행반응성, 가닥-치환 폴리머라제를 사용한다. 바람직한 구체예는 Phi29 또는 Phi29-유사 폴리머라제를 사용하지만, Pol I 및 Pol III, T7 DNA 폴리머라제, 및 그것들의 유사체와 같은 다른 폴리머라제가 또한 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 효율성 및/또는 충실도를 향상시키도록 설계된 다른 변형된 또는 키메라 폴리머라제를 사용할 수 있다.
증폭 후, 핵산 생성물은 그것이 의도한 사용을 촉진하는 방식으로 더 가공될 수 있다. 검출, 동정 또는 시퀀싱을 포함한 연구 목적은 전형적으로 오로지 제한효소 분해 또는 특정, 광화학적 뉴클레오티드에서의 절단 또는 유도된 분열과 같은 물리적 또는 화학적 방법에 의하여 얻을 수 있는 직렬연쇄체의 더 짧은 선형 단위체(전달 단위체)를 요구한다. 세포의 트랜스팩션은 다양한 형태로 수행될 수 있지만, 더 높은 효율성의 흡수는 전형적으로 환형 또는 수퍼코일 핵산으로 얻어진다. 한 구체예는 환형 핵산(CNA)을 만들기 위하여 DNA 리가제를 사용하는 연속적 리게이션 단계를 포함한다. 다른 구체예는 전달 단위체를 CNA 내에 환형으로 만드는 재조합효소 또는 유사한 효소를 사용한다. 다른 구체예는 수퍼코일 CNA(sCNA)를 생성하기 위하여 환형 생성물을 수퍼코일로 만드는 DNA 자이라제를 사용한 추가 단계를 포함한다.
생성물이 진핵세포 중의 발현을 의도하는 경우, 배양물에서든지 치료적 사용에서든지 세포에 의한 흡수가 결정적이다. 트랜스팩션은 환형, 수퍼코일 CNA 또는 내부 염기 및/또는 선형 단위체의 말단에서의 변형으로 안정화될 수 있는 특별히 설계된 선형 형태를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 변형은 클레노우 단편-유사 효소로 채움으로써 말단을 평활성으로 만드는 단계; 적합하게 변형된 염기로 선형 가닥의 말단을 포스포티오에이트하는 단계; 증폭 과정이나 그 다음 생체내 선형을 안정화 또는 분해를 최소화하는 직렬연쇄체의 분해 과정 동안 다른 변형된 염기를 혼입하는 단계; 및 세포 내에 카세트의 빠른 흡수 및/또는 발현의 장기 수명을 촉진하는 안정화 서열을 포함하도록 발현 카세트를 설계하는 단계를 포함한다(Kay, M.A. et al., Molec. Ther. 3(3): 403-410, Mar. 2001).
무세포 증식 단계 후 변형 또는 가공의 정도는 생성물의 의도된 사용에 따른다. 그 다음, 최종 가공된 생성물은 시약, 오염물질, 및/또는 생성물의 다른 형태를 제거하기 위하여 정제된다. 생성물의 다른 형태는 수퍼코일 서클뿐만 아니라 선형 단편, 오픈 서클, 모노머, 다이머, 트리머 등을 포함한 공유결합으로 닫혀진 서클 등을 포함할 수 있다. 의도하는 형태는 특정 사용에 따르며 앞서 언급한 형태 중 어떤 것 사이에서 바꿀 수 있다. 사용되는 시약의 수 및 필요한 순도의 정도에 따라서, 생성물은 크로마토그래피, 초미세여과, 투석, 핵산 침전, 또는 당업계에 공지된 어떤 다른 적합한 방법을 사용할 수 있다. 겔 여과 및/또는 투석을 포함하는 구체예들은 치료적 사용에 대한 고품질 생성물을 제공할 수 있다.
도 1은 유용한 주형을 생성하기 위한 다중 메커니즘을 도시한다. 예를 들면, 주형은 플라스미드 변형, PCR 증폭, 화학합성, 또는 cDNA 합성에 의하여 생성될 수 있다.
도 2는 본 발명의 한 구체예에 따라서 RCA-기재 증폭 과정을 도시한다. 그 과정은 환형 주형으로부터 직력연쇄체를 합성하는 폴리머라제를 사용한다. 직렬연쇄체는 더 작은 단편으로 가공될 수 있으며, 이는 적어도 하나의 무결 발현 카세트를 포함할 수 있다. 합성된 생성물은 짧은 선형 단위체, 환형화된 핵산(CNA), 또는 수퍼코일 환형 핵산(sCNA)으로 사용될 수 있다.
도 3은 본 발명의 다른 구체예에 따른 방법을 도시한다. 이 방법은 이중가닥 주형의 순방향(A)과 역방향(B) 가닥을 개별적으로 증폭하는 단계를 포함한다. 두 개의 개별 반응 용기에, 각각의 가닥을 증폭하고 단일-가닥 서클로 환형화한다. 각각의 용기에, 한 가닥만을 가닥-특이적 프라이머를 사용하여 증폭한다. 그 다음, 제한효소부위(OR1 또는 OR2)의 서열을 포함한 두 번째 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 직렬연쇄체에 있는 사전 설계된 부위에 어닐링되고, 이중-가닥 주형의 짧은 조각은 제한효소에 의한 분해가 가능하도록 생성된다. 분해 후 변성 전, 이중-가닥 말단을 DNA 리가제를 사용하여 환형으로 만든다. 리게이션 후, 올리고뉴클레오티드를 단일-가닥 서클로부터 변성한 후, 상보적 단일-가닥 서클과 결합하여 모노모만을 포함한 이중-가닥 서클을 형성한다. 이 방법은 다이머, 트리머 및 다른 멀티머 부산물의 형성을 최소화한다.
도 4는 본 발명의 한 구체예에 따른 RCA 과정의 정률증가를 도시한다. 이 과정은 지정된 시간에 주형, 프라이머, 완충액 성분의 연속적 첨가 및 지정된 온도로의 이동을 포함한다. 이것은 짧은 시간에 대량의 생성물을 생산하기 위한 효율적인 방법을 제공한다. 리게이션 전에 반응 부피를 희석하는 것은 모노머 환형 생성물의 형성을 도와준다.
도 5는 자동화된 증폭 장치의 구조를 도시한다. (A)는 1 ml 미만의 부피를 포함한 많은 수의 각 반응이 많은 각각의 주형을 동시에 증폭하는 데 사용될 수 있는 모델을 나타낸다. (B)는 대량의 단일 DNA 생성물의 합성을 가능하게 하는 단일 용기의 사용을 도시한다. (1) 반응 매개변수를 제어하는 프로그램가능한 컴퓨터; (2) 반응 매개변수를 평가하고 조절하기 위한 모니터; (3) 효소, 완충액, 및 다른 성분을 포함한 원액의 온도 조절 챔버; (4) 반응 용기에 시약을 첨가하기 위한 분배구; (5) 온도 조절된 반응 용기; (6) 다중-웰 분배기; (7) 다중 웰 반응 용기 플레이트; (8) 다중-웰 플레이트의 온도 조절된 챔버.
도 6은 점성 반응 혼합물의 다양한 혼합 전략을 도식적으로 요약한다: (A) 프로펠러-유사 혼합 용기; (B) 구멍난 원판 혼합 용기; (C) 액체이송 펌프를 사용한 재순환 혼합 용기. (C)에서, (1)은 (2)에 있는 시약의 보정된 첨가를 위하여 조절가능한 자동화 제어기 및 출입구이다. 조절가능한 제어기(1)는 시약과 작은 유출의 반응 혼합물의 조절된 혼합을 가능하게 하며, 출구 반대 위치에 있는 챔버에 시약 변형된 반응 혼합물을 되돌려놓음으로써 반응 혼합물의 전반적 혼합을 지지한다. 시약없이 계속된 펌핑은 치밀한 혼합을 촉진한다.
도 7은 분자내 리게이션의 과정을 도시한다. 용기(B)에서 DNA의 증폭 및 분해 후, 반응 혼합물을 리게이션 칵테일을 함유한 두 번째 용기(A)에 천천히 첨가한다. DNA를 용기(A)에 천천히 첨가하는 것은 모노머 CNA 형성을 촉진하기 위하여 DNA의 충분한 희석을 제공한다.
도 8은 플라스미드, 본 발명의 한 구체예에 따라서 생성된 짧은 발현 카세트(합성 DNA, synDNA), 및 조절 용액으로 면역화한 후, Balb/c 마우스에서 생성된 gp160에 대한 IgG 항체역가의 결과를 나타낸다. 이들 결과는 합성 DNA가 마우스에서 면역반응을 유도하는 데 효과적임을 명백하게 나타낸다.
도 9는 B형 간염 바이러스 소표면 항원(HBs(S))의 서열을 함유한, 본 발명의 한 구체예에 따라서 준비된, 플라스미드 또는 합성 DNA(발현 카세트)를 사용한 토끼의 면역화의 결과를 나타낸다. 이들 결과는 본 발명의 합성 발현 카세트가 토끼에서 면역반응을 유도하는 데 효과적임을 명백하게 나타낸다.
도 10은 인플루엔자 H1N1 바이러스에 대한 BALBc 마우스의 주사 후 면역화 결과를 나타낸다. 그림은 바이러스 복제가 다양한 유전적 면역화 실험으로 억제된, 최종 희석으로 기록된 바이러스-중화 역가를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 구체예는 대량의 고품질 핵산을 생산하는 방법 및 장치에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 치료적으로 유용한, 최소로 오염된 핵산 생성물을 생산하는 롤링 서클 증폭(RCA)-기재 무세포 시스템을 사용한다(도 2).
본 발명의 문맥에 사용된 "핵산", "올리고", 또는 "올리고뉴클레오티드"는 DNA 또는 RNA, 또는 그것의 유사체(예를 들면, 포스포로티오에이트 유사체)일 수 있다. 핵산 또는 올리고뉴클레오티드는 또한 변형된 염기, 백본, 및/또는 말단을 포함할 수 있다. 합성 백본은 포스포로티오에이트(Pt), 펩티드 핵산(PNA), 잠겨진 핵산(LNA), 자일로스 핵산(XNA), 또는 핵산에 안정성 및/또는 다른 이점을 부여하 는 그것의 유사체를 포함할 수 있다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 한 구체예에 따른 방법은 RCA에 기초한다. 이 과정은 환형 주형으로부터 직렬연쇄체를 합성하는 폴리머라제를 사용한다. 직렬연쇄체는 더 작은 단편으로 가공될 수 있으며, 이는 적어도 하나의 무결 발현 카세트를 포함할 수 있다. 합성된 생성물은 짧은 선형 단위체로 사용될 수 있거나 환형화된 핵산(CNA) 또는 수퍼코일 환형 핵산(sCNA)을 생성하도록 더 가공될 수 있다.
본 발명의 방법은 DNA 또는 RNA 주형으로 시작할 수 있다. RNA 주형으로 시작하는 것들은 cDNA 주형을 만드는 조류 미엘로블라스토시스 바이러스 역전사효소와 같은 역전사효소를 포함한다. 당업계에 공지된 어떤 방법은 도 2에 도시된 바와 같이 본 발명의 방법에 사용하기 위한 환형 주형을 제조하는 데 사용될 수 있다. 이들 방법 중 일부는 도 1과 관련하여 이후에 상세하게 설명될 것이다.
단일-가닥 결합 단백질은 주형을 안정화하고 일부 폴리머라제의 증폭의 효율성을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 또한, 추가 효소는 착오를 회복하기 위하여 증폭 반응에 포함될 수 있다. 또한, 단백질 매개된 오류 교정 효소, 예를 들면 돌연변이 스플라이싱 단백질(MutS)은 폴리머라제의 전반적인 충실도를 효과적으로 향상시킬 수 있으며 증폭 반응 동안 또는 그 후에 사용될 수 있다(Carr, P., et al., Nuc Ac Res 32(20): e162, 2004).
의도하는 용도에 따라서, 본 발명의 방법에 사용되는 DNA 폴리머라제는 어떤 공지된 원핵세포, 진균, 바이러스, 박테리오파지, 식물 또는 진핵세포 DNA 폴리머 라제일 수 있으며, 전효소 및 전효소의 어떤 기능적 부분 또는 핵산 분자의 합성을 실행할 수 있는 어떤 변형된 폴리머라제를 포함할 수 있다. 유용한 DNA 폴리머라제는 박테리오파지 phi29 DNA 폴리머라제, 다른 phi29-유사 폴리머라제(예를 들면, 파지 M2 DNA 폴리머라제, 파지 B103 DNA 폴리머라제, 또는 파지 GA-I DNA 폴리머라제), 파지 phi-PRD1 폴리머라제, VENT DNA 폴리머라제, DEEP VENT DNA 폴리머라제, KlenTaq DNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제 I, DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편, DNA 폴리머라제 III 전효소, T5 DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제 전효소, T7 DNA 폴리머라제, Bst 폴리머라제, rBST DNA 폴리머라제, N29 DNA 폴리머라제, TopoTaq DNA 폴리머라제, 및 ThermoPhiTM DNA 폴리머라제를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예는 Phi29 폴리머라제, Phi29-유사 폴리머라제, 또는 다른 고 충실도 폴리머라제(예를 들면, 하이브리드 융합 폴리머라제)를 사용한다.
본 발명의 바람직한 구체예는 고 충실도 염기 혼입을 위한 조건 하에서 DNA를 증폭하는 진행반응성, 가닥-치환 폴리머라제를 사용한다. 본 발명의 문맥에서, 고 충실도 "DNA 폴리머라제"란 추천하는 조건 하에서 통상적으로 사용되는 열안정 PCR 폴리머라제, 예를 들면 Vent DNA 폴리머라제, KlenTaq DNA 폴리머라제, 또는 T7 DNA 폴리머라제와 연관된 것들(1.5 x 10-5 - 5.7 x 10-5)과 동일하거나 그보다 낮은 오류 혼입률을 가진 것이다. 추가 효소는 단백질 매개 오류 교정 효소, 예를 들면 MutS를 포함하여 잘못된 혼입 상황을 최소화하는 반응에 포함될 수 있으며, 이것은 폴리머라제 반응 동안이나 그 후에 폴리머라제 충실도를 효과적으로 향상시킨 다(Carr, P. et al, Nuc Ac Res 32(20):e162, 2004).
유사하게, 고 충실도 "RNA 폴리머라제"는 보통의 RNA 폴리머라제(Promega Technical Information)의 것들과 동일한 또는 그보다 더 낮은 오류 혼입율을 가진다. 본 발명에 유용한 RNA 폴리머라제는 T7 RNA 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제, T3 RNA 폴리머라제, 및 그것들의 변형된 또는 키메라 버젼을 포함한다.
증폭 반응 동안, 환형 주형은 디옥시리보뉴클레오시드 트로포스페이트(dNTP)의 존재 하의 폴리머라제, 리보뉴클레오시드 트리포스페이트(NTP), 또는 주형의 연쇄반복을 포함한 긴 직렬연쇄체를 형성하는 변형된 사본에 의하여 복제된다. 직렬연쇄체는 예를 들면 제한효소 분열 또는 물리적 절단에 의하여 "짧은 발현 카세트"(SEC)로 언급된 더 작은 단편으로 연속적으로 분열된다. SEC는 관심대상의 서열을 함유하며 진핵세포의 발현 서열(또는 카세트)을 선택적으로 함유할 수 있다. 바람직한 구체예는 적어도 하나의 진핵세포 발현 카세트를 포함하는 SEC를 사용한다. 종래의 박테리아에 의하여 생성되는 플라스미드와 달리, 본 발명의 SEC는 박테리아의 유전물질이 아닌, 의도하는 진핵세포 서열의 양쪽에 인접해 있는 관심대상의 서열 단독으로 구성된다.
"짧은 발현 카세트"는 표적 세포에 의하여 인식되는 진핵세포 프로모터; 무결 유전자, 유전자 단편, 또는 관심대상의 특정 서열(SOI)일 수 있는 관심대상의 서열; 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 짧은 발현 카세트는 리게이션을 촉진하거나(예를 들면, CAN 제조) 선형 단편을 안정화하는 추가 서열 양쪽에 인접해 있을 수 있다. 원하는 양쪽인접 서열을 가진 발현 카세트는 "전달 유닛"(DU)를 포함 하고, 박테리아의 배양물에 생성된 플라스미드의 선택 및 복제에 단독으로 사용되는 불필요한 유전물질을 함유하지 않는다. 진핵세포 내에서 어떤 가치도 없는 박테리아의 유전물질을 최소화함으로써, 고농도의 고품질, 생활성 DNA 분자를 생성하는 것이 가능하다. 생성된 핵산은 전형적인 플라스미드보다 작고, 세포에 더 효율적으로 트랜스팩션되며, 트랜스팩션시 세포내에서 더 효율적으로 발현된다.
효소 또는 화학적 방법은 중합화의 오류에서 야기된 불일치된 뉴클레오티드를 가진 DU을 제거함으로써 최종 생성물의 동질성을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 돌연변이 검출에 사용되는 효소(예를 들면, 레솔바제, T4 엔도클레아제 VII, 또는 T7 엔도뉴클레아제) 또는 유전자 돌연변이 및 다형성을 검출하는 데 그리고 점 돌연변이의 고정밀 스크리닝(예를 들면, TILLING)에 사용되는 다른 효소들이 이 목적을 달성하는 데 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 환형 주형을 제조하기 위하여 어떤 방법도 사용될 수 있다. 도 1은 적어도 하나의 관심대상 서열(SEC 또는 DU)을 포함하는 유용한 환형 주형을 생성하는 세 가지 통상적으로 사용되는 방법을 도시한다. 한 방법은 존재하는 플라스미드의 효소적 변형을 포함하고, 진핵세포 발현 카세트를 포함한 DU는 제한효소 분해에 의하여 플라스미드로부터 선택적으로 절단된다. DU는 복제기점 또는 선택가능 마커, 예를 들면 생체내에서 SOI의 발현을 침묵시킬 수 있는 항생제 내성 매개자가 없다.
본 발명의 바람직한 구체예는 CNA 내에 선형 SEC의 환형화를 가능하게 하는 카세트의 어떤 측면에 인접한 서열을 가진 무결 진핵세포 발현 카세트를 포함한 주 형을 사용한다(도 1). 주형은 환형 주형으로 변환되고 미니서클 DNA 뿐만 아니라 플라스미드를 포함하는 어떤 단일- 또는 이중-가닥 핵산(DNA 또는 RNA)일 수 있다. 사전-리게이션 반응은 자물쇠 프로브를 사용하는 경우에서와 같이 사용될 수 있다(Baner, J., et al., Nuc Ac Res 26(22): 5073-78, 1998).
이중-가닥 주형은 사용되는 폴리머라제에 따라서 폴리머라제 반응을 최적화하기 위하여 초기에 변성될 필요가 있을 수 있다. 이러한 반응에서, 순방향 및 역방향 가닥은 모두 동일한 반응에서 동시에 증폭될 수 있다. 그 다음, 연속적인 가공은 제한효소, 리가제, 및/또는 자이라제의 첨가를 필요로 할 수 있다. 그 다음, 생성물은 치료적 사용을 위하여 DU를 산출하도록 정제될 수 있다.
주형을 만드는 두 번째 방법은 환형화를 위하여 상대적으로 짧은 DU를 생성하는 특이적 발현 카세트의 양쪽에 인접한 특정 올리고뉴클레오티드를 사용하여 더 큰 DNA 주형으로부터 PCR 증폭하는 것을 포함한다.
도 1에 도시된 세 번째 방법은 이후에 DU 또는 발현 카세트를 함유하는 주형을 생성하도록 환형화되는 단일 핵산 가닥 또는 상보적 가닥을 만드는 올리고뉴클레오티드(올리고)의 화학 합성을 포함한다.
증폭하는 동안, 주형은 용액에 자유롭게 현탁되거나, 염색체 또는 단백질(미국 특허 제5,854,033호)과 같은 지지체, 또는 유리 또는 폴리스티렌 비드와 같은 고체 지지체에 결합될 수 있다.
본 발명의 구체예에 따른 대안적 방법은 도 3에 도시된다. 도시된 바와 같이, 이중-가닥 주형 중 한 가닥은 DU의 단일 가닥 직력연쇄체를 생성하는 적합하게 설계된 프라이머를 사용하여 개별적으로 증폭될 수 있다. 개별적으로 증폭된 직렬연쇄체는 특정 제한효소 부위를 함유한 올리고와 각각 혼합되고 제한효소로 분열된다. 이들 단편의 일시적 이중-가닥 말단은 리게이션되어 환형 단일-가닥 생성물을 형성한다(Dahl, F., et al., PNAS 101(13): 4548-53, 2004). 이 방법의 이점은 각 반응의 단일 가닥 서클이 이중-가닥 모노머 서클의 단일 부류를 형성하도록 결합됨으로서, 반응의 다른 멀티머 형태로부터 모노머를 정제할 필요를 피할 수 있다는 점이다. 그 다음, 모노머 서클은 발현 카세트의 흡수 및 발현의 효율성을 향상시키는 DNA-자이라제 또는 유사한 효소로 수퍼코일될 수 있다.
많은 구체예들이 환형, 이중-가닥 DNA 주형을 직렬연쇄체 합성을 개시하는 지정된 부위에 특이적으로 결합하는 프라이머와 함께 사용한다. 프라이머는 안정성을 향상시키는 "핵산"의 다양한 변이 중 어떤 것을 포함할 수 있으며, 길이가 사용되는 DNA 폴리머라제의 어닐링 온도에 의하여 결정되는 다양한 길이를 가질 수 있다. 프라이머 서열은 무작위 또는 특정 서열을 포함할 수 있으며, 특정 서열 변경을 가지도록 설계될 수 있고, 또는 증폭된 서열의 조작 또는 분석을 촉진하기 위하여 주형에 비-상보적인 태그 또는 검출 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, 무작위 헥사머는 가공 및 세포내로 트랜스팩션 시 원하는 효과를 생성하는 DU를 효과적으로 증폭하는 데 사용된다. 다른 구체예는 개시 부위를 제거함으로써 그리고 증폭반응 조건을 최적화하기 위하여 조절된 친화성의 프라이머를 사용함으로써 RCA 반응이 조절될 수 있게 하는 특이적 설계된 프라이머를 사용한다. 테트라머만큼 짧은 서열-특이적 프라이머는 특정 DU를 효과적으로 증폭하는 데 사용될 수 있다.
대부분의 사용에서, 본 발명에 사용되는 폴리머라제, 제한효소, 리가제, 및 다른 효소는 가용성 형태의 효소로 구성된다. 그러나, 제한효소 분해, 리게이션 및 수퍼코일링 반응을 포함한 고체상 증폭 반응 또는 고체상 가공 반응은 또한 증폭 과정을 능률적으로 하기 위하여 도입될 수 있다. 게다가, 충실도, 효율성, 및 가공 또는 최종 생성물을 향상시키도록 설계된 다른 효소(특히 폴리머라제)의 최적의 영역을 포함한 융합 단백질이 사용될 수 있다. 또한, 박테리아, 식물, 곤충, 또는 동물 세포에서 발현되는 하나 이상의 태그(예를 들면, 6XHis, S-Tag, 칼모듈린-결합 펩티드, 단백질 A 등)을 함유한 효소의 재조합 형태가 사용될 수 있다. 태깅된 효소를 사용하는 이점은 그것들이 친화성 크로마토그래피를 사용하여 최종 생성물로부터 용이하게 제거될 수 있다는 점이다. 정제 후, 태그 부분을 통하여 고체 매트릭스에 고정된, 회수된 효소는 연속적인 효소 반응에 사용될 수 있다.
증폭 후, 직렬연쇄체는 적어도 하나의 DU를 포함한 짧은 발현 카세트(SEC)로 분열되고, 단일 SEC는 DU의 다중 사본을 포함할 수 있으며 전달 및 발현을 최적화하기 위하여 그와 같이 설계될 수 있다. 선형 SEC는 표적 세포에 의한 흡수를 촉진하기 위하여 선형 단편, 환형화된 단편(CNA), 또는 수퍼코일 환형화된 단편(sCNA)으로 직접 투여될 수 있다. 이와 같이, 증폭 후 가공은 의도하는 용도에 따라서 다양하다.
SEC의 가공은 다음 중 어떤 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다: 물리적 또는 효소적 방법을 통한 SEC의 추가 절단 단계; 클레노우와 같은 효소적 분열에 의 하거나 화학적 방법에 의하여 SEC의 말단을 채우거나 가공하는 단계; 환형화된 CNA를 생성하는 SEC의 두 말단을 내부에서 리게이션하는 단계; 토포이소머라제 II형을 포함한 자이라제형 효소로 CNA를 수퍼코일로 만드는 단계; 변형된 내부 염기 또는 변형된 말단을 가진 형태 중 어떤 것을 효소 또는 화학적으로 처리하는 단계; 두 개 이상의 SEC를 함께 리게이션하는 단계; 또는 기능적 콘쥬게이트를 생성하기 위하여 SEC를 특정 리간드에 리게이션하는 단계. 본 발명의 문맥에 정의된 용어 리간드는 DNA, RNA, PNA, LNA 또는 그것들의 변형을 포함한 핵산; 표적화 및 세포의 흡수를 촉진하거나 치료적 효능을 증가시키는 펩티드; 효소적으로 활성 및/또는 물리적으로 기능적일 수 있는 폴리펩티드; 앱타머, 단백질의 기능을 인식, 결합 및 변형하는 핵산; 뿐만 아니라 핵산의 안정화 또는 의도하는 세포 또는 조직에 생성물의 표적화를 촉진하는 폴리머를 포함한다.
본 발명에 의하여 생성된 DNA를 사용하여 성공적으로 투여될 수 있는 치료적 용도는 항체 생산 및 유전자 침묵을 포함한 DNA 치료법에 대한 몇 가지 접근법을 포함한다. 예를 들면, 항체는 인플루엔자 및 HIV 바이러스와 같은 병원균에 의하여 야기되는 질환을 예방하거나 치료하도록 설계된 적합한 발현 카세트의 성공적인 투여 후에 생체내에서 생성될 수 있다. 예를 들면, 진핵세포 프로모터의 조절 하에 적혈구응집소 단백질을 코딩하는 서열은 인플루엔자 A 바이러스에 의하여 표적화되는 동물에서 체액성 및 세포성 면역 반응을 일으키는 데 사용될 수 있다. 유사하게, 절단된 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 외피 단백질을 코딩하는 서열의 발현은 마우스에서 HIV에 대한 효과적인 면역성 반응을 성공적으로 유도할 수 있다.
본 발명의 증폭된 핵산은 또한 생체내에서 표적화된 유전자 침묵을 매개하는 것으로 나타날 수 있다. 몸의 다양한 부분에 고통스러운 수포 및 통증을 야기하는 단순포진바이러스(HSV)와 수두(초기 감염) 및 대상포진(재발시)을 야기하는 대상포진은 바이러스 감염을 유효하게 하는 ICP4와 ICP47 모두의 발현을 필요로 하는 바이러스의 동일한 패밀리의 구성원이다. 세포 배양물에 트랜스팩션시, ICP4 또는 ICP47에 특이적인 안티센스 올리고를 발현하는 증폭된 SEC는 생체내에서 이들 단백질 발현을 조절하는 데 사용될 수 있으며 바이러스의 추가 증식을 최소화할 수 있다. 생체내에서 항-ICP4 전사체의 발현은 ICP4 유전자를 성공적으로 침묵시키고 세포에서 ICP4 단백질의 생산을 차단한다. 유사한 효과를 이 방법에 의하여 생성되는 ICP47 발현 카세트의 발현 후에 확인할 수 있다.
ICP47은 숙주 면역성 공격으로부터 바이러스를 방어하는 데 결정적인 주조직적합성복합체(MHC) 제시 경로를 억제하는 기능을 한다. ICP47의 유전자 생성물은 감염된 세포의 외부에 항원의 제시와 관련된 운반자 단백질에 결합하여, 주조직적합성복합체(MHC) I형 항원제시경로를 차단한다. 결과적으로, HSV-감염된 세포는 세포독성 T-림프구에 의하여 면역 인식으로부터 가려진다. 따라서, ICP47은 HSV-감염에 필수적 기능을 한다.
폐암 세포주, A549를 본 발명에 따라서 증폭된 ICP47 SEC으로 트랜스팩션하는 것은 안티센스 서열을 효과적으로 발현하고 웨스턴 블롯 분석에 의하여 평가된 바와 같이 ICP47 단백질의 생산을 차단할 수 있다. 유사하게 침묵할 수 있는 단순포진 유전체에 추가 감염된 세포 단백질(ICP)이 있다.
다른 유전자 침묵 표적은 리노바이러스, 코로나바이러스, 아데노바이러스, 인플루엔자 및 파라-인플루엔자 바이러스와 같은 호흡성 바이러스를 포함하는데, 이는 흔히 일반적인 감기, 폐렴, 건선, 및 만성폐쇄성폐질환(COPD)을 포함한 상부 및 하부 호흡기 감염과 연관된다. 사람 리노바이러스(HRV)는 캡시드 외피 단백질, RNA 폴리머라제 및 두 바이러스성 프로테아제를 코딩하는 단일-오픈-리딩 프레임을 가진 크기가 약 7.2kb인 단일-가닥 RNA 유전체를 가진다. 감염시, 바이러스성 단백질은 숙주 기계가 세포가 용해할 때 결국 방출되는 수천 개의 바이러스 입자를 제조하도록 효과적으로 재유도한다.
대부분의 리노바이러스는 세포를 감염시키는 수용체로서 세포내 부착 분자 I(ICAM-1)을 이용한다. ICAM-1 메시지에 대한 안티센스를 코딩하는 증폭된 SEC의 발현은 생체내에서 ICAM-1 단백질의 발현을 효과적으로 차단할 수 있고 바이러스의 감염을 최소화하는 데 유용한 것으로 증명될 수 있다. 호흡성 질환과 싸우기 위한 다른 유용한 전략은 감염을 매개하는 필수 단백질의 활성을 차단하는 안티센스-유사 분자(안티센스, 앱타머, 트리플렉스 형성 분자, 및 유사한 분자), 예를 들면 바이러스 입자를 가공하는 데 필요한 바이러스 프로테아제의 생체내 발현을 포함한다. 다른 접근법은 병원균-유도된 조직 반응의 매개자(예를 들면, 브라디키닌, 프로스타글란딘, 타치키닌, 히스타민, 및 다양한 사이토카인)를 차단하거나, 이들 매개자에 의하여 야기된 생리학적 효과를 유효하게 하는 세포의 수용체를 차단하기 위하여 SEC를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 치료적 용도의 다른 표적은 초기에 양성, 비-종양성 사마귀로 감 염을 나타내지만, 어떤 경우에는 악성 성장으로 발전할 수 있는 사람 파필로마 바이러스(HPV)에 의하여 야기되는 감염을 조절하는 것을 포함한다. 예를 들면, 생식기 HPV는 오럴 또는 항문 섹스를 통해서뿐만 아니라 성교를 통하여 한 사람에게서 다른 사람에게로 전달될 수 있다. 바이러스 감염된 경부 세포는 초기 양성 사마귀로부터 전(前)암성 세포로 전환될 수 있으며, 결국 암종으로 발전할 수 있다. 경부암은 아마 바이러스 감염이 어떻게 암을 유도할 수 있는지에 대하여 가장 잘 알려진 예 중 하나이다. 사람과 동물에서, 세포분열은 주로 Rb 및 p53에 의하여 조절된다. HPV의 E6 및 E7 단백질은 단백질의 종양 억제자 효과를 억제하는 Rb 및/또는 p53에 직접 부착할 수 있으며 감염된 세포가 통제되지 않고 재생산하도록 야기할 수 있다(Didelot, C. et al., Intl J Oncology 23:81-87, 2003). 바이러스는 개시하는 사건으로만 작용하지만, 시간이 지나면 거칠게 성장하는 세포들 중 일부는 회복될 수 없는 그것들의 유전적 구조에 영구적인 변화를 발생시킨다. E6 및 E7을 차단하도록 설계된 안티센스-유사 구성체를 발현시킴으로써, 바이러스 감염은 비효율적이게 된다.
다른 유형의 HPV 감염은 남성과 여성 모두의 성기 및 항문에 또는 그 주변에 사마귀로 나타날 수 있으며, 또한 본 발명에 의하여 생성된 핵산을 사용하는 치료적 안티센스-유사 발현을 위한 유효한 후보이다. 여성의 경우, 가시적인 사마귀가 자궁경부에 나타날 수 있다. 이 유형의 성기 사마귀는 기술적으로 음부사마귀로 알려져 있으며, 일반적으로 두 HPV 유형, 6번과 11번과 연관된다. 이들 사마귀는 좀처럼 암으로 발전하지 않으며, "저-위험성" 바이러스인 것으로 간주된다. 성적으로 전달되는 다른 HPV는 남성과 여성 모두에서 성기 또는 항문암과 연관되어 있다. 이들은 "고 위험성" HPV 유형이라 불리며, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-45뿐만 아니라 일부 다른 것들을 포함한다. 고 위험성 HPV 유형은 대개 가시적인 사마귀에 함유되지 않지만, 고-위험성 및 저-위험성 HPV는 모두 자궁경부에서 비정상적인 세포의 성장을 야기할 수 있다. 두 유형의 HPV 감염은 효과적인 생체내 안티센스-유사 발현 치료제로 효과적으로 조절될 수 있다.
본 발명의 증폭 반응은 박테리아 서열을 포함한 무결 플라스미드 또는 이들 서열을 포함하지 않는 변형된 버전의 플라스미드를 증폭하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 1) 절단되었지만 완전한 활성 RT를 코딩하는 마우스 몰로니 백혈병 바이러스 역전사효소((MoMuLV RT) 유전자; 2) MoMuLV RT에 의한 역전사 개시에 필수적인 측면인접 영역을 가진 프라이머 결합 부위(PBS); 3) 안티센스, 앱타머, DNA 효소, 또는 트리플렉스 형성을 유도하는 서열의 생산을 위한 표적 유전자 코딩 서열; 및 4) 무결 발현 카세트로서 역전사 반응의 종결을 위하여 설계된 스템-루프 구조를 포함하는 단일-가닥의 DNA 발현 벡터, pssXE는 본 발명에 따라서 효과적으로 증폭될 수 있다. 증폭된 생성물은 트랜스팩션될 수 있으며 포유동물, 바이러스, 및 박테리아 유전자를 효과적으로 침묵시키는 데 사용될 수 있다. 세포 내에 발현시, 트랜스팩션된 RT는 이어서 RNA 전사체의 3' 말단에서 프라이머 결합 부위(PBS)에 결합하여 ssDNA 합성을 개시하는 프라이머로서 내생 숙주 tRNA(예를 들면, tRNAPro 또는 tRNAVal)를 사용한다. 역전사 후, ssDNA는 mRNA 주형이 RN아제 H 또는 RT의 RN아제 H 활성에 의하여 분해될 때 방출될 수 있다.
핵산(SEC)의 전달은 표적 수용체에 안정화 완충액 중의 네이키드 핵산의 단순 주사에 의하여 달성될 수 있다. 본 발명의 구체예는 또한 세포내로의 핵산의 표적화와 전달을 돕는 전달 벡터를 사용할 수 있다(Dias, N. Molec Cancer Ther 1: 347-355, 2002). 일부 구체예는 약화된 바이러스 시스템, 약간 또는 어떤 면역성 단백질도 포함하지 않는 바이러스의 패키징 시스템일 수 있는 바이러스 벡터 시스템을 사용한다(Srivastava, LK. and Liu, M.A. Ann Intern Med. 138: 550-559, 2003). 다른 구체예는 핵산을 캡슐에 넣거나 정전기적 상호작용에 의하여 핵산에 결합하는 중성 또는 양이온성 리포솜의 사용을 포함한다. 이들 구체예는 또한 전달된 핵산을 엔도좀 부위에 격리하는 것을 막는 보조 분자(예를 들면, 클로로퀸 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민)를 사용할 수 있다. 상업적으로 구입할 수 있는 리포좀 벡터 중 일부는 리포펙틴, 유펙틴, 사이토펙틴 및 리포펙타민을 포함한다.
다른 전달 방법은 핵산을 양이온 펩티드에 공유결합시키는 것을 포함하며, 이것은 물리적 상호작용, 수용체- 또는 운반자-매개 메커니즘에 의하여 원형질막의 투과성을 조절할 수 있다. 이러한 결합은 세포질에 직접 전달되고 발현을 위하여 핵에 용이하게 운반되는 전달된 핵산의 효율성을 증가시킨다(Luo, D. and Saltzman, W.M. Nature Biotech 18: 33-37, 2000). 또 다른 구체예는 핵산을 세포에 전달하기 위하여 치료적 핵산과 정전기적으로 상호작용하는 양이온성 폴리머를 사용한다. 예를 들면, 양이온성 폴리머는 폴리-L-리신 (PLL), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), PEG-블록-PLL-덴드리머, 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머, 폴리알킬시아노 -아크릴레이트 나노입자, 및 폴리에틸-에네이민 (PEI) 및 그것의 콘쥬게이트 (예를 들면, 만노스-PEI, 트랜스페린-PEI, 선형 PEI)를 포함한다.
에어로졸 전달은 기도 상피 및 폐 표면으로의 비침습적 전달방식이다. 예를 들면, PEI 및 핵산을 포함한 제형은 분무에 의한 전달시 고수준 기도 또는 폐의 트랜스팩션을 유효하게 할 수 있다. 이 용도의 PEI-핵산 복합체는 많은 양이온성 지질 제형보다 더 높은 수준의 유전자 발현을 유효하게 할 수 있으며, 기도 상피 및 폐 유조직의 세포로의 현저히 높은 효율(거의 100%)의 트랜스팩션을 나타낸다. 게다가, PEI-기재 제형의 반복된 에어로졸 투여는 매우 낮은 독성과 연관된다. 이 전달 방법은 PEI-핵산의 정맥내 주사 또는 양이온성 리포좀-핵산 복합체의 에어로졸 전달과 비교할 때 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 및 인터루킨 1 베타(IL-1β)의 발현을 단지 최소한으로 유도한다.
박테리아에 의하여 생성된 플라스미드 DNA의 빈번한 문제는 박테리아에서 가공된 DNA에 내재된 메틸화되지 않은 모티브에 숙주가 노출되는 것으로부터 기인한다. 메틸화되지 않은 DNA는 폐 독성 및 치료적 용도의 감소된 효율성과 연관된 심각한 문제인 CpG-매개된 사이토카인 반응 및 염증촉진성 사이토카인의 유도를 유도할 수 있다. 결과적으로, 박테리아에 의하여 생성된 DNA의 사용은 현재까지 사용되는 많은 최신 유전자 치료 접근법을 심각하게 방해하고 있다. PEI에 의한 CpG 반응의 방해는 PEI-유전자 에어로졸을 통하여 전달되는 유전자의 지속적 발현을 촉진할 수 있으며, 따라서 지속적 치료 반응이 달성될 수 있다. 본 발명의 무세포 증폭 방법에 의하여 생성된 핵산과 조합하여 사용할 때, PEI-기재 에어로졸은 폐 및 기도 상피에 대한 DNA 치료를 위하여 극히 효과적인 전달 시스템이 될 수 있다.
또한 일부 구체예는 장기 방출 시스템을 사용한다. 생체친화적 통제된-방출 폴리머, 예를 들면 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)(PLGA) 미소구체 및 폴리(에틸렌-co-비닐 아세테이트(EVAc) 매트릭스는 수 개월 동안 생활성 핵산의 통제된, 조절가능한 그리고 예측가능한 방출을 유효하게 할 수 있으며, 두 성분은 미국 식품의약국에 의하여 치료적 용도로 승인받았다.
물리적 전달 시스템이 또한 사용될 수 있다. 일렉트로포레이션은 피부 세포, 각막 내피 및 근육을 포함한 다른 조직에 치료제를 전달하는 데 효율적일 수 있다. 압력-매개 또는 유압 주사는 포유동물 시스템에서 50% 효율성까지 유효하게 할 수 있다. 다른 방법은 식물을 포함한 많은 다른 유형의 세포에서 DNA-지질 복합체의 전달을 위하여 초음파분사를 포함하며 입자 발사 또한 식물에 유용하다.
무세포 증식 과정의 정률증가는 반- 또는 완전-자동화된 플랫폼을 사용하여 수행될 수 있는데, 온도 및 인큐베이션 시간과 함께 염, 효소 및 핵산의 연속적 첨가는 최적의 효율성을 위하여 엄격하게 조절될 수 있다(도 4). 한 구체예에서, 정률증가는 각 반응 부피를 상대적으로 작게(< 1 ml)로 유지하면서 반응 수를 증가시킴으로써 달성될 수 있으며, 주형(들)은 표준 또는 주문제작 플랫폼에서의 다중-웰 플레이트를 사용하여 동시에 증폭될 수 있다(도 5A). 대안적으로, 정률증가는 환경적 통제하에 발효기-유사 용기를 사용하여 단일 러닝에 대량(kg 양)의 단일 핵산 생성물을 생성하는 큰 부피(예를 들면, 10 리터)를 포함할 수 있다(도 5B). 큰 부피는 생성물의 큰 수득량을 생산하는 데 사용될 수 있다. 혼합된 용량의 다중 플랫 폼은 갇힌 공간 내에 평행하게 배열될 수 있으며 대등한 방식으로 다양한 증폭 규모 요건을 만족시킬 수 있는 큰 생-제조 설비의 부분으로서 기능할 수 있다.
적은 부피에서 대량의 핵산의 생성은 시약이 고 점성 반응 혼합물 내에 혼합되는 문제를 제기한다. 본 발명은 경화성 사전-형성된 용기 또는 자기 함유 비닐봉지와 같은 유연성 용기일 수 있는 반응 용기를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 반응 용기 및 반응 혼합물과 접촉하여 유입되는 모든 성분은 순수하고, 멸균되어 있으며, 어떤 오염 핵산 서열도 없다. 경화성 사전-형성된 용기 내용물은 바람직하게는 반응 용기 내에 함유된 장치에 의하여 혼합되지만, 재순환 장치를 포함할 수 있다. 유연성 용기는 바람직하게는 연동-유사 펌프의 사용을 포함할 수 있는 재순환 메커니즘에 의하여 혼합되거나, 자동화된 압출 기구 또는 핵산 생성물의 절단을 피하는 저에너지 진동 장치와 같은 외부 기계장치를 포함할 수 있다.
내부 장치는 전기적으로 제어되는 속도 및 자동화된 타이밍을 가진 프로펠러-유사 교반 장치를 포함한 몇 가지 다른 메커니즘(도 6A), 또는 반응 용기의 내부 직경 내에 상부에서 바닥까지 샤프트 러닝에 고정된 구멍난 원판을 사용하는 제어된 액체 치환 과정(도 6B)을 사용할 수 있다. 원판은 반응 혼합물의 적합한 혼합을 제공하는 액체 내에서 다양한 속도로 높아지거나 낮춰진다. 이들 두 혼합 챔버는 혼합 용기 외부에 별개로 챔버가 있으며, 다양한 원액 성분을 다양한 시약의 정밀하고 연속적인 전달을 조절하기 위하여 액체이송 펌프를 사용하여 반응 혼합물에 전달하는 각 혼합기의 축에 부착된 작은 튜브를 포함할 수 있는 분배 장치를 갖출 수 있다.
다른 구체예는 반응 혼합물의 안정적인 정상류가 챔버로부터 펌프된 후 되돌아가 가는 시스템을 실시한다. 예를 들면, 챔버의 바닥에 위치한 출구는 적은 유량의 유체가 첨가된 시약과 조합되게 한 후 혼합을 실행하기 위하여 동일한 반응 챔버의 상부에 위치한 입구를 통하여 뒤로 채널이 열리게 한다(도 6C). 액체이송 펌프 및 흡수 밸브는 재순환 과정 동안 다양한 용질 및 효소의 분배를 조절 및 모니터한다(도 6C).
또 다른 구체예는 혼합물이 원통형으로 연장된 형태로 형성되는 DNA 혼합물의 요변성 성질을 이용한다. 요변성 화합물은 화합물에 가해지는 전단력의 정도에 따라서 점성을 변화시킬 수 있다. 전형적으로, 전단력의 증가는 요변성 화합물의 점성을 감소시킬 수 있다. 전단력이 제거되면, 이러한 화합물은 그것의 원래 점성으로 복귀하기 시작할 것이다. 이 구체예에서, 점성 반응 혼합물을 보유한 용기는 평탄한 공간의 구멍을 가지는 데, 이를 통하여 필요한 화학물질이 가공하는 동안 주입된다. 따라서, 작은 직경의 원통을 통한 점성 반응 혼합물의 연장은 점성을 충분히 변화시켜 혼합을 실행하는 충분히 긴 기간 동안 작은 직경 원통 내에 그리고 점성이 덜한 반응 혼합물에 천천히 주입되는 시약과의 국소 혼합을 촉진한다.
이 장치는 바람직하게는 제품 안정성을 증명하고 품질 조절 및 품질 보증을 유지하는 모든 관련 물리적 및 생화학적 매개변수의 하나 이상의 인라인 실시간 모니터링을 포함하며, 이것은 치료적 용도로 허용가능한 제품에 요구되는 공인의약품제조관리기준(cGMP)을 유지하는 데 필요하다. 이것은 점성, 핵산 농도, 용액 탁도; 전도성; pH; 온도; 단백질양; 내독소, 미생물존재량, 및/또는 시스템의 분해가능한 성분으로부터 발생한 화학적 오염물질을 모니터하기 위한 컴퓨터 또는 유사한 수단을 포함할 수 있다.
선형 SEC를 환형으로 가공하는 것은 리게이션 단계가 분자간 반응 동안 분자내(자기-고정) 반응을 돕는 것을 필요로 한다. 전통적인 최종 증폭 생성물의 희석은 분자내 리게이션을 돕기 위하여 몰비율을 조작하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 바람직한 구체예는 효소 및 완충액 성분을 함유한 리게이션 칵테일에 적은 양의 반응 혼합물을 혼합함으로써 전체 반응 부피를 최소화한다. 한 구체예에서, 증폭된 생성물은 매우 낮은 또는 맥동하는 펌프 속도를 이용하여, 도 6C에 도시된 바와 같이 적은 유량의 반응 혼합물에 첨가된다. 다른 구체예는 증폭된 반응 혼합물을 리게인션 칵테일을 함유한 두 번째 용기에 한 방울씩 떨어뜨리는 방식으로 분배하여 큰 부피의 리게이션된 반응 혼합물을 생성하지 않고 희석시킨다. 충분한 시간이 각 분취액 첨가 사이에 허용되어 분배된 각각의 새로운 분취액을 위한 분자간 리게이션 과정을 최적화한다. 분취액의 리게인션이 완료되면, 환형 DNA는 더 이상 효소의 기질이 아니라 희석 혼합물의 부분이 된다. 그 다음, 두 번째 분취액을 분배하고, 모든 증폭된 DNA를 분배하고 리게이션할 때까지 순환을 반복한다. 이 과정은 초기 증폭 반응을 크게 희석시키지 않고 분자내 리게이션이 발생하도록 하며 리게이션되는 동시의 분취액을 고려하고 가공 시간을 최소화하기 위하여 다중 분배 챔버를 포함할 수 있다.
생성물의 최종 정제는 반응 과정 동안 투과가능한 멤브레인-기재 방법을 사용함으로써 능률적일 수 있다. 이들 멤브레인은 생성물을 유지하는 동안 확산시키 기 위하여 증폭된 DNA 반응 혼합물에 저 분자량 분자(염, 혼입되지 않은 프라이머, dNTP, NTP 및 다른 소분자)를 허용한다. 혈액투석 과정의 변형은 다른 반응 성분들 대신에 증폭된 DNA의 선택적 유지를 허용하는 데 사용될 수 있다. 반응이 완료되면, 증폭 반응물이 용기로부터 특정 분자량 컷-오프를 가진 멤브레인을 포함한 여과기로 펌프된다. DNA는 더 적은 시약이 이들 작은 모세관의 멤브레인을 거쳐서 반응물로부터 확산될 때 적어도 부분적으로 정제된다. 그 다음 정제된 DNA를 풀(pool)로 만들고, 품질에 대하여 평가하고/거나 최종-사용 용도로 분배하거나 직접 분액하고 다음 시간에 분석하기 위해 저장한다. 다른 구체예는 최종 RCA 제품의 원하는 정제를 얻기 위하여 공급류로부터 고분자량 화합물을 나누는 저압 멤브레인 분리 과정을 포함한 초미세여과 정제 단계를 이용한다.
최종 생성물은 크기, 형태, 오염, 및 발현 용량에 대하여 전통적 방법으로 분석될 수 있다. 겔 전기영동, 시퀀싱, 및 생화학적 또는 HPLC 분석이 일반적이다.표준 기술, 예를 들면 인산칼슘 처리, 일렉트로포레이션 또는 관련 기술을 사용하여 적합한 세포에 트랜스팩션함으로써 최종 생성물의 발현을 시험한다.
치료적 화합물로서 증폭된 생성물의 투여는, 한정하는 것은 아니지만, 국소 용도, 정맥내, 근육내 및 조직내 주사, 비강 용도, 좌약 용도, 이식 저장소 및/또는 오마야 저장소와 같은 펌프를 사용하는 주사, 점안액 용도, 경구 투여되는 약제, 및 초음파 기술을 사용한 전달을 포함할 수 있다. 예를 들면, 전달 비히클은 다양한 캡슐 또는 단백질-표적 비히클, 및 호흡기 투여를 위한 적합한 에어로졸 담체뿐만 아니라 리포좀-매개 또는 폴리머-기재 운반 비히클을 포함할 수 있다.
실시예 1 - β- 갈락토시다제(LacZ-DU)의 합성 및 무세포 증폭.
a) 플라스미드-기재 주형. pSV-β-갈락토시다제 벡터 (Promega Corp. Madison, WI, USA)를 부분적으로 EcoR I과 Pst I으로 분해하였다. CMV 프로모터, Lac Z ORF 및 SV40 작은 T 항원 종결 서열(LacZ- DU)을 함유한 약 4.2 kb의 단편을 분리하고, T4 DNA 폴리머라제로 평활 말단을 만든 후 pGEMTM-7Zf(+) (Promega Corp. Madison, WI, USA)의 Sma I 부위에 클로닝하여 pGEM-LacZ-DU 벡터를 제조하였다. 그 후, LacZ-DU를 Xba I으로 pGEM-LacZ-DU에서 절단하고, 겔 정제하여 제조업자의 추천에 따라서 T4 DNA 리가제(New England Biolabs, Beverly, MA, USA)를 사용하여 환형으로 만들었다.
b) PCR -기재 주형. BamH I 엔도뉴클레아제 인식 부위를 함유한 순방향 (5'-CGGGATCCGACTCTTCGCGATGTAC-3') 및 역방향 (5'-CGGGATCCCAGCATGCCTGC-3') 프라이머를 사용하여 pVAXTM200-GW/lacZ 벡터(Invitrogen Carlsbad, CA, USA)로부터 LacZ-DU를 증폭하였다. 200 ng의 각 프라이머 10 ng pVAXTM200-GW/lacZ 벡터; 0.2 mM dNTP; 1x 헤르큘라제 완충액 및 2.5 U HerculaseTM 폴리머라제 (Stratagene, La Jolla, CA, USA)로 50 ㎕ 반응에서 LacZ-DU를 증폭하였다. 다음 조건 하에 RoboCycler Gradient 40(Stratagene, La Jolla, CA, USA)에서 증폭을 수행하였다: 94℃에서 2분; 5 순환 (92℃ 30초; 4O℃ 30초, 72℃ 5분); 25 순환 (92℃ 30초; 55℃ 30초, 72℃ 5분) 및 72℃ 10분. ~4.2kb 증폭 생성물을 BamH I으로 분해하고, 겔 정제하고 T4 DNA 리가제로 환형으로 만들었다.
c) 무작위 헥사머를 통한 증폭.
10 mM Tris pH 8, 10 ng의 환형의 LacZ-DU 및 200 pmol 무작위 헥사머(Integrated DNA Technologies, Inc. Coralville IA, USA)를 함유한 반응물을 95℃에서 3분 동안 가열하고 실온으로 냉각시켰다. Phi29 DNA 폴리머라제 (10 U, New England Biolabs, Beverly, MA, USA); 0.2 mM dNTP 및 lOO μg/ml BSA를 첨가하였다. 16시간 동안 3O℃ 50 mM Tris-HCl pH7.5; 10 mM MgCl2; 10 mM (NH4)2SO4, 4 mM DTT에서 증폭을 수행하였다. 증폭 후, phi29 DNA 폴리머라제를 가열하여 비활성화하고(5분; 65℃) 증폭된 LacZ-DU 직렬연쇄체를 에탄올/염 침전시키고, 효소 제조업자가 추천한 바와 같이 적합한 엔도뉴클레아제(Xba I 또는 BamHI)로 분해하였다.
d) 특정 프라이머를 통한 증폭. 전술한 바와 동일한 조건을 사용하여, 2788 bp DU를 증폭하는 데 정의된 서열 및 반대 상보서열의 두 프라이머를 사용하였다. 정의된 프라이머를 각각 200 pmole 농도로 사용하였으며 다음 서열로 구성되었다: 순방향 프라이머: 5'-CTGCCAACAAGGTACTCG-3'; 역방향 프라이머: 5'-AGCTGCTACTGGGTCTAG-3'. 이전에 설명한 바와 동일한 방식으로 증폭을 수행하고, 성공적인 증폭을 판단하기 위하여 겔 전기영동으로 조사하였다.
e) 단일 서열-정의된 헥사머를 통한 증폭. LacZ-DU 상의 8개의 상이한 부위(464, 1325, 2579 및 3911 위치의 역방향 DNA 가닥에 4개; 750, 2871, 3239, 및 3260 위치의 순방향 DNA 가닥에 4개)에 어닐링하는 400 pmol의 헥사머 5'-GpGpApApApA-3' 및 10 ng의 환형 LacZ-DU를 함유한 반응물을 40 mM Tris-HCl pH 8; 10 mM MgCl2에서 3분 동안 95℃로 가열하고 실온으로 냉각하였다. Phi29 DNA 폴리머라제 (10U, New England Biolabs, Beverly, MA, USA); 1 mM dNTP; 5% 글리세롤; 0.7 U 효모 무기 피로포스파타제(Sigma, St.Louis, MO, USA) 및 lOO μg/ml BSA를 첨가하였다. 3O℃ 50 mM Tris-HCl pH 7.5; 10 mM MgCl2; 10 mM (NH4)2SO4, 4 mM DTT에서 16 시간 동안 증폭을 수행하였다. 증폭 후, phi29 DNA 폴리머라제를 열처리 비활성화하고(10 분; 65℃) 증폭된 LacZ-DU 직렬연쇄체를 엔탄올/염 침전시키고 효소 제조업자가 추천한 바에 따라서 적합한 엔도뉴클레아제(Xba I)으로 분해하였다. 엔도뉴클레아제의 비활성화(65℃에서 20분 동안) 후, 약 22℃ (또는 약간 더 낮은)에서 16 시간 동안 100 fmol DNA 당 약 0.1 유닛/μL T4 DNA 리가제(Invitrogen Carlsbad, CA, USA)로 리게이션 완충액(50 mM Tris-HCl pH 7.6; 5 mM MgCl2; 1 mM ATP; 1 mM DTT; 5% PEG-8000)에서 선형 LacZ-DU를 환형으로 만들었다. 그 다음, 환형 LacZ-DU를 에탄올/염 침전하고 10 mM Tris-HCl pH 8에 재현탁하였다.
f) 단일 엑소뉴클레아제 -내성 서열-정의된 헥사머를 통한 증폭. 상기와 동일한 조건을 사용하면서, 3' 말단에 두 개의 티오포스페이트 결합을 가진 정의된 헥사머(5'GpGpApApsApsA-3')를 사용하여 LacZ-DU를 증폭하였다.
g) 단일 서열-정의된 펜타머를 통한 증폭. 상기와 동일한 조건을 사용하면서, 19개의 상이한 부위(465, 889, 1326; 1695, 2580, 3666 및 3912 위치의 역방향 가닥에 8개; 80, 119, 191, 602, 750, 912, 2871, 3239, 3606, 3815 위치의 순방향 가닥에 11개)에서 LacZ-DU에 어닐링하는 서열 정의된 펜타머(5'GpGpApApA-3')를 사용하여 LacZ-DU를 증폭하였다.
h) 단일 엑소뉴클레아제 -내성 및 서열-정의된 펜타머를 통한 증폭. 상기와 동일한 조건을 사용하면서, 두 3' 말단 뉴클레오티드에 티오포스페이트 결합을 가진 서열 정의된 엑소뉴클레아제 내성 펜타머(5'GpGpApSApSA-3')를 사용하여 LacZ-DU를 증폭하였다.
i) 폴리머라제 칵테일을 사용한 증폭. 섹션 1-e에 설명한 바와 동일한 조건을 사용하여, 10:3 내지 3:10 (Phi29 효소 유닛:T4 효소 유닛) 비율의 phi29 DNA 폴리머라제와 T4 DNA 폴리머라제의 존재 하에 LacZ-플라스미드를 증폭하였다. 최적 증폭 조건은 다른 주형, 즉 루시페라제 DU에도 작동하는 것으로 나타났다.
실시예 2 - 루시페라제(Luc-DU)의 합성 및 무세포 증폭.
pGL3 벡터 (Promega Corp. Madison, WI, USA)를 Sal I과 Xho I으로 분해하였다. SV40 프로모터, 루시페라제 ORF 및 SV40 작은 T 항원 종결 서열(Luc-DU)을 함유한 약 2.17 kb를 분리하여, 정제하고, 제조업자의 추천에 따라서 T4 DNA 리가제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 다시 환형으로 만들었다.
a) 무세포 증폭. 각각 400 pmol로 5'-ApApTpTpSGpSC-3' 과 5'-ApGpCpApSApST-3'를 함유한 반응물 및 환형 Luc-DU의 10 ng/25 ㎕ 반응물을 40 mM Tris-HCl pH 8; 10 mM MgCl2에서 3분 동안 95℃로 가열하고 실온으로 냉각하였다. Phi29 DNA 폴리머 라제 (1OU, New England Biolabs, Beverly, MA, USA); 1 mM dNTP (25/25/25/25); 5% 글리세롤; 0.7 U 효모 무기 피로포스파타제(Sigma, St.Louis, MO, USA) 및 1OO μg/ml BSA를 첨가하였다. 16 시간 동안 3O℃, 50 mM Tris-HCl pH 7.5; 10 mM MgCl2; 10 mM (NH4)2SO4, 4 mM DTT에서 25 ㎕ 반응으로 증폭을 수행하였다. 증폭 후, phi29 DNA 폴리머라제를 열처리 비활성화하고(65℃: 10분) 증폭된 Luc-DU 직렬연쇄체를 에탄올/염 침전하고 효소 제조업자가 추천한 바와 같이 엔도뉴클레아제(BamH I)로 분해하였다. 엔도뉴클레아제의 비활성화(65℃ 2분) 후, 14℃에서 12-16 시간 동안 DNA의 μg 당 0.1 유닛/㎕ T4 DNA 리가제(Invitrogen Carlsbad, CA, USA)로 리게이션 완충액(50 mM Tris-HCl pH 7.6; 5 mM MgCl2; 1 mM ATP; 1 mM DTT; 5% PEG-8000)에서 선형 Luc-DU를 환형으로 만들었다. 그 다음, 환형 Luc-DU를 에탄올/염 침전하고 10 mM Tris-HCl에서 재현탁하였다.
실시예 3 - 사람 세포에서 증폭된 DNA 의 발현.
10% 열처리 비활성화된 소태아혈청(Hyclone, Logan, UT, USA), 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토미신(Invitrogen Carlsbad, CA, USA)으로 보충된 둘베코스 변형 이글스 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM; Invitrogen Carlsbad, CA, USA)에서 사람 A549 폐 암세포(ATCC)를 배양하고 37℃ 5% CO2 환경에서 인큐베이션하였다.
a) DNA 트랜스팩션 . 트랜스팩션하기 전일에, A549 세포를 6-웰 플레이트에 1 x 105 세포/ml의 밀도로 시딩하였다. 제조업자가 지시한 바와 같이 GenePORTER 2 트 랜스팩션 시약(Gene Therapy System, San Diego, CA, USA)을 모든 트랜스팩션에 사용하였다. 간단히 말해서, 무세포 증폭된 DU 또는 모 플라스미드 DNA(Promega Corp. Madison, WI, USA)를 50 ㎕의 DNA 희석제 B에서 2 μg의 담체 pssXE DNA (Chen and McMicken, Gene Ther 10:1776-1780, 2003)와 혼합하고 5 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그 다음, DNA 용액을 50 ㎕의 무-혈청/항생제 DMEM에 사전-희석된 7 ㎕의 GenePORTER 2 시약과 혼합하고 추가 5 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 한편, A549 세포를 PBS로 세척하고 0.9 ml의 무-혈청/항생제 DMEM으로 토핑하고, 여기에 DNA/GenePORTER 용액을 이어서 첨가하였다. 정상적인 성장 환경에서 4 시간 인큐베이션한 후, 세포를 PBS로 세척하고 트랜스팩션 배지를 10 ㎕/m의 부스터 3(Gene Therapy System, San Diego, CA, USA)으로 보충된 정상적인 성장 배지로 교체하였다. 리포터로서 LacZ를 사용하는 실험에서, 50-100 ng의 LacZ-DU(~4.2 kb)로 트랜스팩션하는 것은 100 ng의 모 pGEM-LacZ-DU 플라스미드(~7.2 kb)로 트랜스팩션하는 것에 비교되었다. 리포터로서 루시페라제 효소를 사용하는 다른 실험에서, 249 ng의 Luc-DU (~2.17 kb)는 570 ng의 pGL3 모 벡터 (5.01 kb; Promega Corp.)로 트랜스팩션하는 것에 비교되었다.
b) 트랜스팩션된 세포에 β- 갈락토시다제 활성의 검출. 트랜스팩션 후 24시간에, A549 세포를 PBS로 헹구고, 실온에서 1 시간 동안 200/250 ml의 0.1 M 인산염 완충액 pH 7.5; 0.02% Triton X-100에서 용해시킨다. 그 후, 세포 조직파편을 5분 동안 10-13,000 rpm에서 원심분리하여 제거하였다. 세포 용해물의 전체 단백질 농도를 280 nm에서 분광광도계로 또는 변형된 브래드포드 분석에 의하여 결정하였 다. 50 μg의 전체 단백질을 1 ml 반응에서 0.01 M 인산염 완충액 pH 7.5; 0.1 M MgCl2, 45 mM β-머캅토엔탄올 및 0.01 mM (p-니트로페닐 β-D-갈락토피로니다제)와 혼합하였다. 37℃에서 1-16 시간 동안 인큐베이션한 후, 410 nm에서 흡광도를 측정하였다.
c) 트랜스팩션된 세포에서 루시페라제 활성의 검출. 트랜스팩션 후 24 시간에, 전술한 바와 같이 세포를 가공하였다. 그 후, 동일한 전체 단백질 농도를 반영하도록 세포 용해물을 조절하고 동일한 부피의 2x Bright-GloTM 기질(Promega Corp.)와 혼합하였다. 터너 바이오시스템 20/20n 루미노미터를 사용하여 발광을 즉시 기록하였다.
실시예 4 - 증폭 조건.
a) 증폭 완충액 .
글리세롤 농도 - 실시예 2에 설명한 바와 같이 각각 10 ng의 Luc-DU 주형을 사용한 두 증폭 반응을 준비하였다 하나에는, 글리세롤의 첨가를 생략하고 물로 대체하였다. 증폭 후, DNA를 에탄올/염 침전시키고 이어서 260과 280 nm 파장에서 분광광도계 정량 전에 적합한 제한효소로 분해하였다. 글리세롤 농도가 4% w/v 미만인 반응에서(phi29 DNA 폴리머라제 및 무기 피로포스파타제 원액 용액에서 전달), 증폭 효율성이 5.65% 증가한 것이 관찰되었다.
분자 스폰지의 첨가: 실시예 2에 설명한 바와 같이, 각각 10 ng의 Luc-DU 주형을 사용한 두 증폭 반응을 준비하였다. 하나에는, 5% w/v PEG-8000을 첨가하였 다. 증폭 후, DNA를 에탄올/염 침전시키고 이어서 260과 280 nm 파장에서 정량 전에 적합한 제한효소로 분해하였다. 증폭 수율에 아무런 양성 효과도 기록되지 않았다.
b) 주형 농도. 실시예 2에서 설명한 바와 같이, 1,156 nM 내지 29 nM 범위의 Luc-DU 주형 농도를 함유한 증폭 반응을 준비하였다. 증폭 후, DNA를 에탄올/염 침전시키고 이어서 적합한 제한효소로 분해하였다. 핵산 농도를 260 및 280 nm 파장에서 분광광도계로 결정하였다. 전술한 증폭 조건 하에서 578 nM 주형을 사용하여 670배 증폭을 관찰하였다.
c) 디옥시리보뉴클레오시드 트로포스페이트 ( dNTP ) 농도.
실시예 2에 설명한 바와 같이, 578 nM DU를 함유한 증폭 반응을 준비하였다. 1 mM 내지 9 mM 범위의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP(25/25/25/25의 비율) 농도를 함유한 반응을 시험하였다. 증폭 후, 적합한 제한효소로 분해하고 핵산 농도를 분광광도계로 결정하였다. 증폭은 전술한 증폭 조건 하에 6 mM dNTP의 존재에서 약 3,000 배였다.
d) 주형에 대한 dNTP 비율의 맞춤화. 실시예 2에 설명한 바와 같이 578 nM Luc-DU 주형을 함유한 증폭 반응을 필수적으로 준비하였다. dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 최종농도 9 mM로 증폭 혼합물에 각각 첨가하였다. 전체 풀에 관한 각 dNTP의 비율을 루시페라제 주형 DNA 유닛의 조성물을 반영하도록 즉 27.2% A, 22.3% C, 24.2% G 및 26.3% T로 맞추었다. 증폭 후, DNA를 에탄올/염 침전시키고, 이어서 적합한 제한효소로 분해하였다. 핵산 농도를 260 및 280 nm 파장에서 분광광도계로 결정하였다. 전술한 증폭 조건 하에 578 nM 주형을 사용하여 2,780배의 증폭이 기록되었다.
e) Phi29 DNA 폴리머라제 농도. 전술한 바와 같이 증폭 반응을 준비하였으며, 9 mM dNTP의 존재하에 1 내지 20 U/578 nM DNA 주형 범위의 다양한 phi29 DNA 폴리머라제(New England Biolabs) 농도를 시험하였다. 증폭 후, DNA를 적합한 제한효소로 분해하고 핵산 농도를 분광광도계로 결정하였다. 1 U의 phi29 폴리머라제/578 nM는 290배 증폭을 만들기에 충분하며, 20 U의 phi29 DNA 폴리머라제는 10 ng의 주형 DNA를 3,985배 증폭하였다.
f) 서열-정의된 엑소뉴클레아제 내성 헥사머 농도. 전술한 바와 같이 증폭 반응을 준비하였으며, 800 pmol까지의 서열-정의된 엑소뉴클레아제 내성 헥사머의 다양한 농도를 시험하였다. 증폭 후, DNA를 적합한 제한효소로 분해하고 핵산 농도를 분광광도계로 결정하였다. 초기 실험 조건(실시예 2)에서 2배 프라이머 농도를 증가시키면 증폭 수득량이 1.25배 증가하였다.
g) 1 단계 증폭 제한효소 분해 반응. 실시예 2에 설명한 바와 같이, 578 nM Luc-DU 주형을 함유한 증폭 반응을 준비하였다. 증폭 후, phi29 DNA 폴리머라제를 65℃에서 2 분 동안 비활성화하고 6 U의 BamHI 효소를 반응물에 직접 첨가하였다. 37℃에서 2 시간 후, 효소를 열처리 비활성화하고 DNA를 에탄올/염 침전시켰다. DNA 분해의 효율성은 전술한 아가로스 겔 전기영동으로 시각적으로 평가하였다.
h) 가변 온도. 상기(실시예 1)에 확립된 조건을 사용하여, 25 내지 34℃의 다양한 온도에서 LacZ-플라스미드의 증폭을 수행하였다. 최적 온도는 DNA 수득량 및 품질에 기초하여 결정하였다. DNA 수득량은 분광광도계로 결정하는 한편, DNA 품질은 리포터로서 전체 길이 LacZ 유전자(3046)를 사용하는 변형된 Kulkel 방법(Kunkel T.A; JBC 260:5787-5796,1985) Nelson, J.R. et al., BioTechniques 32:S44-S47, 2002)에 설명됨)을 사용하여 오류율을 결정함으로써 평가하였다. 32℃에서 수행된 증폭은 1.22 x 10-6의 오류율(Phi29 DNA 폴리머라제의 보고된 오류율의 2.5배 감소)을 가진 >3300-배 증폭을 야기하였다.
i) 가변 반응 시간을 통한 증폭. 실시예 1에 설명한 조건을 사용하여, 1 내지 16 시간 범위의 가변 시간(반응시간) 동안 32℃에서 LacZ-플라스미드의 증폭을 수행하였다. 각 시점에, DNA 폴리머라제를 65℃에서 20분 동안 열처리 비활성화하고 DNA를 반응물에 직접 첨가된 적합한 양의 제한효소로 분해하였다. 최적의 반응 시간은 DNA 수득량 및 품질에 기초하여 결정하였다. 최적의 반응시간은 1.7 x 10- 6 의 중합화 오류율을 가진 >3800배 증폭을 야기하였다.
j) 더 낮은 효소 및 주형 농도를 통한 증폭. 실시예 1에 설명한 조건을 사용하여, 전체 효소 농도(Phi29 DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제 및 무기 피로포스파타제) 및 289 nM DNA 주형의 반을 함유한 반응에서 LacZ-플라스미드 및 루시페라제 DU를 증폭하였다. 32℃에서 16 시간 동안 증폭을 수행하였다. 폴리머라제의 열처리 비활성화와 이어서 증폭 생성물의 엔도뉴클레아제 분해 후, DNA 수득량 및 품질을 전술한 바와 같이 결정하였다. 초기 실험 조건(실시예1)의 효소 및 주형 농도를 반으로 하면 7.7 x 10-7의 중합화 오류율(Phi29 DNA 폴리머라제의 보고된 오류율 에서 약 4 배 감소)을 가진 증폭 수득량이 >5000배가 되었다.
k) RCA 동안 직렬연쇄체 형성의 제거/감소. 실시예 1에 설명된 조건을 사용하여, DNA 폴리머라제뿐만 아니라 2U의 메틸화 민감성 SexAI 엔도뉴클레아제를 함유한 반응에서 LacZ-플라스미드를 증폭하였다. 32℃에서 16 시간 동안 반응을 수행하였다. 증폭/분해 후, 아가로스 겔 전기영동에 의한 합성된 DNA의 분석을 통하여 구별된 선형 DNA 유닛의 존재를 밝혔다.
실시예 5 - 분자내 리게이션 조건.
a) T4 DNA 리가제 . 무세포 증폭된 DNA의 제한효소 분해, 상기 효소의 열처리 비활성화 및 DNA의 에탄올/염 침전 후, 1x 리게이션 완충액(5% PEG-8000; 50 mM Tris-HCl pH 7.5; 10 mM MgCl2; 1 mM DTT; 1 mM ATP)에 700 fmol의 DNA를 각각 함유한 138 ㎕와 690 ㎕ 반응에서 선형 DU의 분자간 리게이션(자기-리게이션)을 수행하였다. 그 후, 다양한 양의 T4 DNA 리가제(Invitrogen Carlsbad, CA, USA)를 첨가하고(0.6-1.5 U) 리게이션을 14℃에서 적어도 1 시간 동안 수행하였다. 그 후, 상기 DNA의 아가로스 겔 전기영동에 의하여 리게이션 효율을 시각적으로 결정하였다. 690 ㎕ 반응에서 fmol DNA 당 290 μU의 T4 DNA 리가제는 모노머 환형 DU의 합성을 유도하기에 충분한 것으로 간주된다.
b) 다른 DNA 리가제 . 적합한 제한효소를 통한 DNA의 선형화 및 상기 효소의 열처리 비활성화 후, 선형 DU의 분자간 리게이션(자기-리게이션)을 수행하였다. 14℃와 45℃에서 각각 제조업자의 추천에 따라서 대장균 DNA 리가제(NEB) 또는 Taq DNA 리가제(NEB)로 리게이션을 수행하였다. 그 후, 상기 아가로스 겔 전기영동에 의하여 리게이션 효율을 시각적으로 결정하고 T4 DNA 리가제 생성물과 비교하였다.
실시예 6 - 이중 가닥 환형 DNA 의 농축.
T4 DNA 리게이션 생성물을 에탄올/염 침전시키고 제조업자의 추천에 따라서 5U의 ATP-의존성 DN아제를 함유한 20 ㎕의 플라스미드 SafeTM DN아제 완충액(Epicenter)에 재현탁하였다. 37℃에서 30분 인큐베이션한 후, DN아제 효소를 65℃에서 20분 동안 열처리 비활성화하였다. 적합한 제한효소로 선형 형태로 분해될 수 있는 환형 dsDNA만의 존재를 밝히는 아가로스 겔 전기영동에 의하여 반응 효율을 시각적으로 결정하였다.
실시예 7 - 마우스에서 증폭된 DNA 의 발현.
선형, 포스포로티오에이트 변형된 선형, 환형, 플라스미드-Safe(TM) ATP-의존성 DN아제(Epicenter, Madison, Wisconsin)로 처리된 환형을 포함한 다양한 형태의 Luc-DU를 준비하였다. 1 μg의 다양한 형태의 Luc-DU는 최종 농도 200 μL/마우스의 PBS에서 15:1의 N:P 비율로 MAA-PEI와 복합체를 이루었다. 5 BALB/c 마우스를 포함하는 각 군을 MAA-PEI-Luc-DU의 단일 형태로 마취없이 꼬리 정맥을 통하여 주사하였다. 주사 후 24시간에 마우스 폐를 수확하여 루시페라제 분석 완충액에서 조직분쇄하였다. 제조업자의 지시에 따라서 Promega의 Bright-GloTM 키트를 사용하여 루시페라제 유전자 발현을 측정하였다.
Figure 112007049804589-PCT00001
DNA와 복합체를 이룬 MAA-PEI가 없는 다른 실험에서, 루시페라제 효소의 발현 카세트를 더 강한 프로모터로 바꾸고 전술한 실험을 반복하였다. 그 결과를 아래 표에 요약한다.
Figure 112007049804589-PCT00002
"네이키드" DNA를 사용하는 실험을 수행하였다. 이 실험에서, 루시페라제 유전자를 발현하는 15 μg의 다양한 DNA를 어떤 담체도 첨가하지 않고 피내 주사하여 마우스에 도입하였다. 상부 및 중간 꼬리 부분을 주사 부위로 선택하였다. 주사 후 24시간에, 동물을 희생시키고 상부 및 중간 꼬리 부분을 절개하고, 조직분쇄하여 전술한 바와 같이 루시페라제의 발현에 대하여 분석하였다. 이들 실험결과를 아래에 요약한다.
Figure 112007049804589-PCT00003
실시예 8 - HIV -I의 gp160 단백질에 대한 마우스에서의 유전적 면역화.
사람 면역결핍 바이러스(HIV-1) 외피 단백질 gp160(gp145△CF1; Chakrabarti et al, J. Virol. 2002; 76: 5357-68; Kong et al, J. Virol. 2003; 77: 12764-72)의 변형된 형태를 발현하는 진핵세포 카세트를 실시예 2에 설명한 대량의 선형 gp145△CF1-DU 발현 카세트를 생성하는 주형으로 사용하였다.
모든 동물 실험은 동물 연구의 기관심사위원회(Baylor College of Medicine; BCM)에 의하여 승인을 받았다. 수퍼코일 플라스미드 DNA 및 gp145△CF1 단백질을 발현하는 무세포 증폭된 선형 DNA(플라스미드 백본 서열이 결여된)를 멸균 식염수 용액에 희석하여 BALB/c 마우스의 전경골근에 주사하였다. 각각의 마우스는 0일, 14일 및 28일에 각각의 발에 50 μg의 주사를 수용하였다. 14일(2 주), 28일(4 주), 42일(6 주) 및 56일(8 주)에 혈액 샘플을 수집하였다. 5마리 마우스의 군을 식염수만을 주사한 대조군뿐만 아니라 각 DNA 유형에 사용하였다. 그 다음, gp160에 대한 IgG 항체 역가를 평가하기 위하여 각 혈액 샘플의 혈청을 효소-결합면역항체법(ELISA)에 사용하였다. 간단히 말하면, 96 웰 마이크로적정 플레이트를 50 mM 탄산염 완충액 pH 9.5에서 12.5 ng/μL의 정제된 재조합 HIV-1IIIB gp160(Advanced Biotechnologies Inc.)의 용액으로 코팅하였다. 그 후, 웰을 0.05% Tween 20 (PBS- T)을 함유한 PBS로 세척하고 PBS-T 중의 3% BSA 용액으로 차단하였다. 그 다음, 100 μL의 순차적으로 희석한 마우스 항혈청(3% BSA 중)을 가하여 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T로 세척하고 양고추냉이 페록시다제-콘쥬게이트된 염소 항-마우스 2차 항체(Pierce)의 1:10,000 희석물 100 μL로 채웠다. 넓게 세척한 후, 50 μL의 3,3',5,5'-테트라메티벤지딘(Sigma)을 첨가하고 비색 반응을 0.5 N H2SO4로 중단시켰다. 광학밀도 판독은 460 nm에서 하였다.
실시예 9 - 증폭 생성물(들)의 정제
최종 형태(선형, 환형 등)로 가공되면, 증폭 생성물을 세파크릴 SF-1000 (GEHC)을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피로 정제한다. 간단히 말하면, DNA를 1.7 m x 1.5 cm 이코노-칼럼(Bio-Rad)에 첨가하고 1 mL/3.6분의 유속으로 10 mM Tris Ph 8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA로 용리하였다. 각 용리 분획의 DNA 양을 아가로스 겔 전기영동으로 모니터하고 원하는 분획을 풀로 만들었다. 그 후, 분획을 제조업자가 추천한 센트리플러스 300 카트리지(Millipore Corp.)를 사용하여 농축하였다.
대안적으로, FPLC 또는 HPLC 시스템에 수직인 Q 세파로스 칼럼을 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 낮은 염 완충액(LSB; 10 mM Tris-Cl pH 8) 중의 DNA를 칼럼에 로딩한다. 칼럼을 10 칼럼 부피의 LSB로 세척한다. DNA를 20 칼럼 부피에서 10-100% 용리 완충액(EB; LSB + 3 M NaCl)의 선형 구배로 수지에서 용리한다. 용리액을 254 nm에서 모니터하고 DNA를 함유한 피크(들)만을 수집한다. 밀리포어 펠리콘 II UF 멤브레인을 사용한 초미세여과에 의한 탈염을 수행한다. DNA 품질/무결성을 아가로스 겔 전기영동으로 분석한다.
실시예 10 - 무세포 증폭된 DNA 의 품질 평가
각 생산 로트는 고유번호가 배당되고 DNA 농도, 순도 및 무결성을 결정하기 위하여 일련의 시험을 거친다. DNA 농도는 260 nm에서 광도계 흡수 판독에 의하여 결정한다. DNA 순도를 몇 가지 방법으로 결정한다: 광도계 A260/280 비율, 실시간 PCR(유전체 DNA 오염); HPLC(RNA 오염); 마이크로-BCA 시험(단백질 양, 피어스 키트) 및 LAL 시험(내독소 양, 캠브렉스 키트). 게다가, 최종 생성물의 멸균을 확인하기 위하여 생균수 시험을 수행한다. 각 세트의 시험은 치료 산업이 정한 설명서를 따를 필요가 있다.
Figure 112007049804589-PCT00004
실시예 11 - B형 간염 바이러스( HBV )에 대한 토끼에서의 유전자 면역화.
B형 간염 작은 표면 항원(HBs(S); Davis et al., 1993; Human MoI. Gen. 2: 1847-1851.)을 발현하는 진핵세포 카세트를 주형으로 사용하여 실시예 2에서 설명하는 바와 같이 대량의 선형 HBs(S)-DU 발현 카세트를 생성하였다. 3 NZ 암컷 알비노 토끼 그룹을 0일, 28일, 및 56일에 매시간 전체 투여량 400 μg의 플라스미드 또는 무세포 증폭된 선형 DNA의 유전자 균등량으로 좌우양측(후지) 근육내 주사를 통하여 면역화하였다. 체액성 면역반응의 양을 결정하기 위하여 0, 28, 42, 56 및 63일에 취한 각 샘플로부터의 혈청을 수립된 ELISA 프로토콜로 분석하였다. 도 9는 28일 및 63일(0일에 대하여 표준화) 동안 HBs(S) 수퍼코일 플라스미드 또는 무세포 HBVs(S)-DU 선형 DNA로 면역화된 3마리의 토끼에서 취한 혈청의 ELISA 분석 흡광도 판독을 나타낸다.
실시예 12 - 인플루엔자 H1N1 바이러스에 대한 마우스에서의 유전자 면역화.
각 실험에서 5 마리의 BALB/c 마우스를 이용하였다. 모든 동물 실험은 동물 연구의 기관심사위원회(Baylor College of Medicine; BCM)의 승인을 얻었다. 인플루엔자 A/Puerto Rico/8/34 (A/PR8; H1N1)을 호흡성 병원균 연구 유닛, BCM에서 얻었다. PBS에 전체 핵산 50 μg을 사용하여 전술한 바와 같이 DNA 면역화를 수행하였다. 바이러스 균주 A/PR8/34 (HA)로부터의 인플루엔자 헤마글루티닌 오픈리딩프레임을 pCAG-HA-WPRE 플라스미드(Garg et al, 2004, J. Immunol. 173(1):550-8)로부터 분리하고 pCMV-MCS(Stratagene)에 서브클로닝하여 pCMV-HA를 만들었다. 플라스미드 백본(HA-DU)이 결핍된 CMV-HA 발현 카세트를 실시예 2에 설명한 바와 같이 증폭하였다. 동물을 0, 2, 및 6 주에 3회 주사하였다. 5 가지의 다른 실험을 수행하였다. 1) 마우스를 50 μg의 pCMV-HA로 면역화하였다. 2) 마우스를 50 μg의 HA-DU로 면역화하였다. 3) 마우스를 25 μg의 HA-DU와 임의의 발현 카세트가 결핍된 25 μg의 플라스미드 DNA(빈 벡터, pEV)의 혼합물로 면역화하였다. 4) 마우스를 16.7 μg의 HA-DU와 두 사이토카인-발현 플라스미드, 즉 16.7 μg의 pCMVi-GMCSF와 16.7 μg의 pCAGGSIL12의 혼합물로 면역화하였다(Orson et al., 2005, Protection against influenza infection by cytokine enhanced aerosol genetic immunization (In Press). 5) 마우스를 상기와 같이 16.7 μg의 pCMV-HA와 두 사이토카인-발현 플라스미드의 혼합물로 면역화하였다.
면역화 후 8주에, 혈청 샘플을 각 동물에서 취하여 바이러스 중화 분석을 수행하였다. 면역화 실험에서 수집된 혈청을 열처리 비활성화하고(56℃, 30분) 그 다음 표준화된 마이크로중화 분석을 사용하여 중화 효율에 대하여 시험관내에서 평가하였다. 간단히 말하면, 혈청 샘플을 희석제인 MEM을 사용하여 96-웰, 둥근 바닥 조직 배양 플레이트(Falcon 3077)에 2개씩 1:2 순차 희석하였다. 인플루엔자 A/PR8 바이러스의 약 100 중앙값 조직 배양 감영 투여량(TCID50)을 각 웰에 첨가하였다. 또한 이 시간에 시험 바이러스의 역적정을 수행하였다. 혈청과 바이러스를 함유한 플레이트를 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하고, 그 후 둥근 바닥 플레이트의 내용물을 마딘 다비 개 신장(MDCK) 세포의 단일막을 함유한 새 플레이트에 옮겼다. 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 각 웰에서 배지를 제거하고 어떤 혈청도 없지만, 2 μg/ml의 워싱턴 트립신(Worthington Biochemical Corp., cat. no. 32C5468), 페니실린 및 스트렙토미신을 함유한 MEM으로 교체하였다. 4일 후, PBS에서 세척하고 재현탁한 닭 적혈구 세포(rbc)의 0.5% 현탁액을 각 웰에 첨가하였다. 혈청 통제 웰에 있는 rbc가 팽팽한 단추모양을 형성할 때, 각 웰의 혈구응집 패턴을 판독하고 기록하였다. 팽팽한 단추모양의 rbc가 있는 웰은 FV에 음성으로 간주하고, 흐트러진 응집 모양을 가진 것들은 바이러스에 양성으로 기록하였다. 도 10은 다양한 유전자 면역화 실험을 하는 동안 바이러스 복제가 억제되는 최종 희석으로 기록된 바이러스-중화 역가를 나타낸다.

Claims (20)

  1. 무세포 시스템에서 고품질 핵산을 생산하는 방법으로서,
    (a) 반응 혼합물 중의 환형 주형을 환형 주형의 적어도 한 가닥에 상보적인 하나 이상의 프라이머와 결합시켜 주형-프라이머 복합체를 형성하는 단계;
    (b) 주형-프라이머 복합체를 적어도 하나의 고-충실도 핵산 폴리머라제와 인큐베이션하여 환형 주형의 연쇄 유닛을 포함한 직렬연쇄체를 생성하는 단계;
    (c) 직렬연쇄체를 관심대상의 서열을 가진 적어도 하나의 전달 유닛을 포함한 더 작은 단편으로 절단하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    (d) 더 작은 단편을 하나 이상의 다음 단계에 의하여 가공하는 단계: 더 작은 단편의 말단을 채우거나 제거하는 단계; 더 작은 단편의 말단을 리게이션하여 환형화된 더 작은 단편을 생성하는 단계; 및 환형화된 더 작은 단편을 수퍼코일로 만드는 단계
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    더 작은 단편 또는 환형화된 더 작은 단편을 변형하여 변형된 말단 및/또는 변형된 내부 염기를 생성하는 단계
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    더 작은 단편 또는 환형화된 더 작은 단편을 펩티드와 결합시키는 단계
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 유닛은 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 고-충실도 핵산 폴리머라제는 Phi29 DNA 폴리머라제 또는 그것의 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 고-충실도 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제 I, DNA 폴리머라제 III, T3 DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제, T5 DNA 폴리머라제, T7 폴리머라제, 및 그것의 유도체 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 제한효소를 사용하여 직렬연쇄체의 절단을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해서 제조된 전달 유닛을 포함한 조성물.
  10. 사람, 동물 또는 식물의 질환 또는 유전적 장애를 예방하거나 치료하기 위한 의약의 제조시 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해서 제조된 전달 유닛의 사용.
  11. 제 10 항에 있어서, 질환은 HIV, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 코로나 바이러스, 단순포진 바이러스, 대상포진 바이러스, 파필로마 바이러스, 및 리노 바이러스 중에서 선택된 바이러스에 의하여 야기되는 것을 특징으로 하는 사용.
  12. 제 10 항에 있어서, 질환은 박테리아, 마이코박테리아, 유박테리아 또는 곰팡이에 의하여 야기되는 것을 특징으로 하는 사용.
  13. 사람 또는 동물의 면역화에서 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의하여 제조된 전달 유닛 또는 제 9 항의 조성물의 사용.
  14. 제 13 항에 있어서, 전달 유닛 또는 조성물은 방향 주사, 에어로졸, 리포좀, 또는 바이러스 유래 입자에 의하여 전달되는 것을 특징으로 하는 사용.
  15. 고품질 핵산을 생성하는 장치로서,
    적어도 하나의 입구 및 하나의 출구를 가진 계속적으로 검증할 수 있는 cGMP-품질 반응 용기;
    입구에 부착되어 있고 외부 유지 챔버로부터 반응 용기로 적어도 하나의 외부 성분을 공급하는 입력 장치;
    입력 장치에 연결된 적어도 하나의 외부 유지 챔버;
    외부 성분을 유지 챔버로부터 입력 장치를 통하여 반응 용기로 펌프하는 수단;
    반응 용기의 출구에 부착된 출력 장치;
    출력 장치에 연결된 적어도 하나의 외부 수용 챔버;
    반응 용기의 온도을 조절하는 수단;
    반응 용기 내의 반응 혼합물의 진행을 모니터하고 조절하는 수단; 및
    반응 혼합물을 혼합하는 수단
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  16. 제 15 항에 있어서, 반응 용기는 혼합 수단이 용기의 외부에 가해지는 유연성 물질 또는 혼합 수단이 용기의 내부에 가해지는 경화성 사전-형성된 물질로 만들어지는 것을 특징으로 하는 장치.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 펌프는 액체이송 펌프를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  18. 제 15 항, 제 16 항, 또는 제 17 항에 있어서, 입력 장치는 반응 용기를 통하여 반응 혼합물을 순환시키는 것을 촉진하는 출력 장치에 연결될 수 있는 것을 특징으로 하는 장치.
  19. 제 15 항, 제 16 항, 또는 제 17 항에 있어서, 반응 용기는 두 번째 입구 및 두 번째 출구를 더 포함하며 반응 혼합물을 펌프하는 수단을 가진 순환 장치는 두 번째 입구를 두 번째 출구에 연결하는 것을 특징으로 하는 장치.
  20. 제 18 항에 있어서, 순환 장치는 적어도 하나의 외부 성분을 외부 유지 챔버로부터 순환 장치에 함유된 반응 혼합물에 첨가하는 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
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