CN101103122A - 高质量核酸的无细胞生物合成及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种改进的能产生大量治疗品质的核酸无细胞扩增方法以及在研究、治疗学和其他的应用中使用该合成的核酸的方法。该方法联合了本领域内几种不同的最先进方法并协调了它们的应用以经济地合成用于治疗目的核酸。其联合了体外滚环扩增、高保真度聚合酶、高亲和性引物以及特别设计用于特殊用途的精简模板。为了表达的目的,模板包含一包括真核启动子的试剂盒、目的基因的编码序列、以及真核终止序列。扩增后,随后根据预期的用途处理多联体,可能包括限制酶消化得到短表达试剂盒产物(SECs)、使SEC(CNAs)环化的连接步骤和/或产生sCNAs的超螺旋化步骤。最终产物包含几乎是非检测水平的细菌内毒素。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产高品质核酸的方法及其用途。
背景技术
在基因转移、基因治疗和DNA疫苗中,基于DNA的治疗方法的出现加大了对在纯度、效能、功效和安全性方面满足严格的质量标准的DNA的大量需求。因为在靶组织中,基因表达的功效相对较低且持续时间相对较短,就这类应用而言,通常需要大量的DNA。
本领域的现状是依赖细菌培养物中质粒的生长以及依赖昂贵的纯化技术制造治疗品质的核酸。典型的从细菌和其他细胞源中纯化质粒的方法包括使用有机的、致突变的和有毒的化合物,包括酚、溴化乙锭、和氯化铯,以及酶,如溶菌酶、蛋白酶K和核糖核酸酶A。如果在基于DNA的治疗中,上述物质作为污染物而被注射,则构成了潜在的健康危害。这样的方法也存在一个潜在的风险,即:把不想要的污染转座子和其他的异源游离基因的DNA掺入至质粒中(Haapa,S.,Nuc.Ac.Res.,27(13):2777-84,1999)。残余的寄主细胞核酸、其他的细胞蛋白和内毒素,也有形成污染的可能。这些混杂物不但将DNA吸收的效率降至最小,而且导致了剂量有关的毒性。为了消除这些混杂物,可接受的纯化方法经常使用多种层析措施,如阴离子交换、亲和性以及尺寸排阻。这些纯化方法非常昂贵。
美国专利号5,561,064(‘064)公开了与从细菌培养物中获得药物级别的质粒DAN有关的成就。该专利描述了用聚乙二醇溶解细菌细胞,随后在不使用额外的有毒化学药品的情况下进行一系列的层析分离以产生比较清洁的可用于基因治疗的DNA的方法。这个方法仍然依赖于在有可能有毒的细胞环境中产生质粒,尽管在纯化过程中没有加入其他的组分。
相反,由于改进的生产过程和简化的纯化方法,无细胞核酸扩增能显著节省费用,同时还排除了通常和细菌产生的质粒相伴的混杂物。体外扩增,如聚合酶链式反应(PCR),自20世纪80年代中期以来,已经成功地用于实验室。PCR快速又经济。然而,PCR依赖于快速的热循环,这对大量的应用来说,是不切实际的。
体外等温扩增技术是公知的,但主要是用于研究核酸的复制机制。1984年,Blanco和Salas分离了噬菌体Phi29 DNA聚合酶,其是高进行性的(highly processive)链置换聚合酶。Phi29 DNA聚合酶能可靠地复制大于70,000个碱基(Phi29基因组的全长)的DNA链(Blanco,L.and Salas,M.,PNAS 81(17):5325-5329,1984)。Phi29聚合酶用于DNA的体外高效等温扩增时需要一末端蛋白、一双链DNA结合蛋白以及一单链DNA结合蛋白(SSB)(Blanco,L.et al.,PNAS 91:12198-202,1994)。
美国专利号5,001,050(‘050)要求Phi29 DNA聚合酶在DNA测序、DNA扩增以及合成大于10,000个碱基的DNA中的用途的权利。与此有关联的美国专利,如专利号为5,198,543(‘543)和5,576,204(‘204)的专利要求修饰的Phi29 DNA聚合酶的权利,包括用于改进型测序反应中的Phi29聚合酶的核酸外切酶缺陷型。然而,这些修饰的聚合酶具有较低的保真度,且仅用在测序反应中。
实际上,环状DNA分子的复制,包括质粒和一些病毒DNA,经常通过滚环扩增(RCA)的方式发生,环状DNA模板被复制成一长串联重复多联体(concatamer),随后该多联体被切断并包装入一蛋白外膜内(Dean,F.B.etal.,Genome Res.11:1095-99,2001)。几个试验室已经利用RCA开发了用于各种目的扩增DNA的方法,这些目的包括DNA测序、克隆、文库构建和筛选(Inoue-Nagata,et al.,J.Virological Methods 116:209-211,2003)。
美国专利号5,654,033、6,210,884、6,316,229、6,344,329以及6,797,474(分别为‘033,‘884,‘229,‘329和‘474)和RCA的技术有关,但仅用于研究性应用,如在给定的样品中测定靶信息的拷贝数目。这个方法第一次把DNA样品转变为环状模板,接着用可控制的循环扩增测定新的信息对于原信息的相对量。另一个申请将这类定量扩增和检测靶基因的突变体等位基因的能力结合起来。
美国专利号6,280,949和6,124,120公开了RCA在使用随机引物扩增全基因组中的应用。一些实施例把随机引物和特异引物结合起来扩增基因组的特定区域。
美国专利号6,329,150公开了改良的RCA技术,该技术使用专门设计以套入新合成DNA的引物来启动扩增产物的次级合成。如此,扩增能以指数式产生且同时为检测多重目标的PCR提供了一恒温的替代方法。美国专利号6,255,082公开了长末端重复片段促进巢式扩增(nestedamplications)的使用方法。这些专利改良了RCA以快速地鉴定样品中特定序列的存在。
美国专利号6,642,034公开了一使用多重引物和链置换DNA聚合酶扩增的一般方法。该方法用于鉴定靶序列、全基因组的扩增、靶序列或突变的探测、地址标记的合成和探测、以及寡核苷酸的合成。
RCA的其他应用包括测序、克隆、构建图谱、基因分型、探针产生和诊断筛选。已公布的申请号码为2003/0207267的美国专利公开了利用具有3’和5’核酸外切酶活性的不同DNA聚合酶,利用多重引物,同时扩增目标环,以提高扩增速率。
目前大多数的RCA技术集中在对Phi29 DNA聚合酶的使用上,虽然偶尔也有报道使用了其他的聚合酶。这是因为Phi29聚合酶的高进行性可使其能快速合成核酸的长多联体,且Phi29聚合酶具有链置换活性,这使它能置换所遇到的任意次级引物并连续地合成新的核酸序列。另外在无热循环的情况下,它能在一个相对短的时段内产生大量的高保真度核酸。Phi29聚合酶具有极低的4×10-6的平均错误率(Esteban,J.A.,et al.,J.Biol.Chem.,268(4):2719-2726,1993)。
尽管大多数RCA技术使用了Phi29 DNA聚合酶,但美国专利号为6,576,448和6,235,502的专利公开了细菌DNA聚合酶III(Pol III)在RCA中的使用。据报道,Pol III具有类似夹状结构(clamp-like)的活性,这种活性提供了一提高的DNA合成速率(大约每秒700-800个核苷酸),它也可以通过加入解旋酶或稳定蛋白质而得以最优化。细菌DNA聚合酶I(Pol I)也用于RCA中扩增小于100bp的模板(Fire and Xu,PNAS 92:4641-45,1995)。Pol I主要使用单链模板,因此如果没有与极短的双链模板有关的空间障碍,环状模板可以很容易地形成。美国专利号5,614,365公开了一修饰的Pol I,其包括一个T7 DNA聚合酶序列,能够提高它的效率达500倍(fold)。这个酶具有减弱的识别脱氧和双脱氧核苷酸的能力,并且适于测序反应。
通常,RCA反应能利用单链或者双链核酸模板。Phi29 DNA聚合酶能使用单链或双链模板,而Pol I仅能使用单链模板。另外,Phi29聚合酶能使用RNA或DNA模板。因此,Phi29聚合酶在RCA或其他的扩增中具有更普遍的应用。
美国专利6,368,802、6,096,880和5,714,320公开了使用RCA利用恰当的聚合酶和小的单链环状DNA模板产生RNA或DNA寡核苷酸(28-74个核苷酸长度)的方法。如此而产生的DNA寡核苷酸缺少在细胞中表达所需的遗传信息。
Moreno S等开发了一产生DNA疫苗的最小化的、免疫原性确定的基因表达载体(MIDGE)(Vaccine,22:1709-1716,2004)。这些载体仅包含真核基因表达和诱导免疫应答的最小序列。另外,线性表达盒的末端可以被修饰成具有发夹环以提高它们的寿命和表达效率。尽管这个方法代表了较大的进步,但它涉及一费事的步骤,因为从细菌培养物中纯化质粒后,需要除去不必要的细菌序列。MIDGE方法仍然依赖细菌质粒作为前体(precursors)。
Chen,Z.Y.等以相似的方式开发了能从载体上除去细菌序列的小环。他们证明顺式连接的细菌序列能沉默(silence)真核表达(Human GeneTher.16:126-131,2005),他们还证明未连接任何细菌遗传物质的线性表达盒的表达效率比共价闭环质粒的高10-100倍,该质粒具有一个连接于细菌质粒骨架的表达盒。转染后,无细菌表达盒的表达可持续长达90天。
这个小组在已公布的申请号2004-0214329的美国专利中描述了这一方法,公开了环状表达盒、用环状表达盒制备的治疗组合物以及把环状表达盒引入靶细胞的方法。另外,通过重组,该申请用在表达盒侧翼的attB和attP序列促进细菌序列的移除。在正常的条件下培养细菌以后,也携带编码重组酶(Recombinase)诱导盒的细菌,在足够的质粒产生后,可以被诱导产生重组酶以在attB和attP位点诱导重组。细胞内的重组产生了两个分离的小环:一个具有表达盒,而另一个具有细菌的遗传物质。尽管该方法被改进以便使细菌基因污染最小化,然而这个方法仍然依赖在细菌培养物中产生质粒。
使用DNA的治疗应用要求严格地坚持安全和效力标准(Prazeres,D.M.,et al.,Trends Biotechnol 17(4):169-173,1999)。在大规模的设备中产生的质粒DNA应该没有造成污染的基因组DNA(<10ng/剂量)、寄主蛋白(<10ng/剂量)、RNA(在0.8%的琼脂糖凝胶上检测不到)以及内毒素(<1单位/kg体重或<0.1EU/μg质粒)。此外,质粒应该无菌且优选是能够更有效地表达的超螺旋型。其他的需要从最终的制剂中除去的污染物包括纯化试剂,如溴化乙锭、氯仿、酚、溶菌酶、蛋白酶K,核糖核酸酶A,以及可从纯化柱中沥滤的任意潜在的污染物,如来自阴离子交换剂(anion exchanger)的季铵类(quaternary amines)。
对细菌产生的质粒,通过大量使用通常是很昂贵的纯化技术,这些纯度标准已能够达到。如上所述,可接受的纯化方法主要使用多重层析法,可能包括阴离子交换、亲和性、以及尺寸排阻层析纯化步骤的组合。显然,从细菌中生产治疗品质的质粒所需要的纯化方法要求专业化的设备、昂贵的树脂、大量的庇护设备(extensive housing facilities)和时间。目前非GMP(研究品质)的质粒DNA每克终产物的成本为30,000-150,000美元,而GMP品质的DNA成本大约比其高2-3倍。简而言之,利用细菌产生的质粒DNA,生物制造治疗用DNA极其昂贵。
因为能避免接触大量的细菌污染物,使用无细胞扩增的方法能有效地节省成本和时间。在无细胞体系中,每件事都是清晰确定的。假如仅使用了高质量的试剂和酶,那么仅有痕量的污染物存在于体系中。因此,最后的纯化可以用简单的方法,如透析、超过滤和/或凝胶过滤,并且,仅需要纯化小体积的反应混合物。
目前,RCA体系还不适合用于基因治疗、DNA疫苗或其他的治疗应用方面的核酸无细胞生产。相反,大多数文献表明,其适合于严格的诊断和研究用途,包括测序、基因组扩增、基因组分析、标记、克隆、PCR型应用、文库构建和其他的分析应用。
发明内容
本发明的简要概述
本发明一方面涉及用精简的表达盒模板、高特异性引物或随机引物、高保真度聚合酶及最小缓冲液体系最优化体外RCA体系,以便为大批量(如>1mg)核酸生产构建无细胞体系。仅需要最小限度且便宜的纯化程序,这个体系能用来在小体积和短时期内制造大量的核酸。因此,该体系能为任意基础分析或研究目的,更重要的是,为治疗应用,制造高质量的治疗级别的核酸。
出于为治疗、诊断和研究应用经济地制造大量高质量核酸的目的,本发明融合了几项技术。本发明产生的核酸能比在细菌培养物的可比较容积中产生的多250-300倍。在本发明中,除了最低限度包含在所用的试剂中的内毒素,没有内毒素污染源。其他的优点包括:在实验室小烧瓶(laboratory flask)中,能产生类似发酵的大量产物;仅需要极少数几种试剂;能在相对短的时期内产生大量产物;以及简捷的纯化步骤。所有这些优点意味着经济地为治疗用途制造大量的高质量核酸。
在本发明的一个实施例中,用一个修饰质粒做模板,该质粒缺少在细菌中质粒的选择和复制所需的典型遗传序列。可以使用任一环状核酸模板。根据本发明的实施例,模板可是包含目的基因的环状表达盒,该基因的侧翼具有在寄主细胞中表达和处理表达产物所需要的遗传元素。
尽管常规的质粒能使用本发明的方法复制,但无额外遗传序列的精简模板具有多重优势:它可消除任何可能沉默(silence)目的基因表达的外来序列;较小的结构物更紧凑且能更有效地被靶细胞吸收,其结果是更高的转染效率;它还具有更高的成本效益,其原因在于产生了大量具有较少物质的表达盒、统计上终产物保真度的增加以及不需要复杂的纯化。
尽管可以使用随机引物或者序列特异性引物,但序列特异性引物更有效且在大规模扩增中更经济。引物的大小可以从4到多于20个核苷酸,为了提高亲和性与稳定性和延长保存期,引物可以包含修饰的碱基和/或骨架。在一个实施例中,具有硫代磷酸(phosphorothioate)末端修饰的特异性引物可以用来产生大量(在1ml中大约1.5mg)的核酸。
扩增步骤可以使用任意特异性聚合酶,只要缓冲液和温度条件调整为适合该酶的特异性需要。例如,当使用类似Taq酶的高温类聚合酶时,要包括必要的变性和退火步骤。但本发明的优选实施例使用进行性的链置换聚合酶,如类似Phi29的聚合酶,以便在无热循环时高效地扩增模板。优选实施例使用Phi29或类似Phi29的聚合酶,但也可使用其他的聚合酶,如Pol I、Pol III、T7 DNA聚合酶以及它们的衍生物。本发明也使用其他的适于提高效率和/或保真度的修饰的或嵌合的聚合酶。
扩增后,核酸产物可以进一步进行某种处理,以利于既定的用途。研究目的,包括检测、鉴定或测序,通常仅需要多联体的短线性单位(送递单位,delivery unit),该多联体可以通过限制酶切、物理方法或化学方法获得,如在特异的光不稳定的核苷酸(photolabile nucleotide)处剪切或诱导切割。细胞转染可以各种形式实现,但高效的吸收通常通过环式或超螺旋核酸获得。一实施例利用DNA连接酶合并了随后的连接步骤,以产生环式核酸(CNAs)。另一实施例使用重组酶或类似的酶将送递单位环化得到CNAs。另一实施例包括用DNA促旋酶超螺旋化产物以获得超螺旋的CNA(sCNA)的额外步骤。
如果产物要在真核细胞中表达,无论是在培养还是在治疗应用中,被细胞吸收是很关键的。用环式超螺旋CNA或特别设计的线性形式,可完成转染,该线性形式可以在内部碱基和/或线性单位的末端进行修饰而稳定。此类修饰包括:通过Klenow片段类酶填充钝化末端;以适当的修饰碱基硫代磷酸化线性链的末端;在扩增过程中或者在多联体消化后,掺入其他的修饰碱基,修饰碱基可在体内稳定线性链或者令其降解最小化;以及设计包含稳定序列的表达盒,该序列可促进快速的吸收和/或延长在细胞中表达盒的表达寿命(Kay,M.A.et al.,Molec.Ther.3(3):403-410,Mar.2001)。
无细胞扩增步骤后,修饰或处理的程度依赖于产物的既定用途。接着,对处理过的终产物进行纯化,以除去试剂、污染物和/或产物的选择性形式。产物的不同形式可包括:线性片段,开环,包括单体、二聚体、三聚体等的共价闭环,以及超螺旋环。所需的形式依赖于特定的用途且可在任意前述的形式中交替。依赖于所用试剂的数量和所需纯净程度,对产物可以进行色谱法分析、超过滤、透析、核酸沉淀或以本领域所知的其他任何适当的方式处理。采用了凝胶过滤和/或透析的实施例能为治疗应用提供高质量的产物。
本发明的详细描述
本发明的实施例涉及生产大量核酸的方法和装置。本发明的方法使用基于滚环扩增(RCA)的无细胞系产生制药学上有用的最低限度污染的核酸产品(图2)。
本发明的上下文中所用的“核酸(nucleic acid)”、“核酸寡聚物(oligo)”、“寡核苷酸(oligonucleotide)”可以是DNA或RNA或其类似物[如硫代磷酸(phosphorothioate)类似物]。核酸或寡核苷酸也可以包括修饰碱基、骨架和/或末端。合成的骨架包括硫代磷酸(phosphorothioate,Pt)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA,locked nucleicacid)、木糖核酸(xylosenucleic acid,XNA)或其使核酸具有稳定性和/或其他优势的类似物。
如图2所示,依据本发明的实施例,方法是基于RCA的。该方法使用聚合酶以环式模板合成多联体。多联体可以处理成至少含有一个完整表达盒的小片段。合成的产物可以用作短的线性单位或进一步处理以产生环化核酸(CNAs)或超螺旋环式核酸(sCNAs)。
本发明的方法可从DNA或RNA模板开始。那些从RNA模板开始的要包括反转录酶,如禽类成髓细胞瘤病毒反转录酶,以产生cDNA模板。如图2所示,本领域所知的任意方法可用以制备本发明所用的环式模板。在下文将对这些方法中的一些参阅图1进行详细描述。
对一些聚合酶而言,单链结合蛋白可用于稳定模板和改善扩增效率。其他的酶也可以包括在扩增反应中以修正错误。蛋白质介导的错误纠正酶,如突变剪切蛋白(MutS),能有效地提高聚合酶的总体保真度,也可以用于扩增反应中或扩增反应后(Carr,P.,et al.,Nuc Ac Res 32(20):e162,2004)。
依赖于既定的用途,在本发明的方法中所用的DNA聚合酶可以是任意已知的原核、真菌、病毒、噬菌体、植物或真核DNA聚合酶,还可以包括全酶以及全酶的任意功能部分或能完成核酸分子合成的任一修饰的聚合酶。有用的DNA聚合酶包括:噬菌体phi29 DNA聚合酶,其他的类似phi29的聚合酶(如噬菌体M2 DNA聚合酶,噬菌体B103 DNA聚合酶或噬菌体GA-1DNA聚合酶),噬菌体phi-PRD1聚合酶,VENT DNA聚合酶,DEEP VENTDNA聚合酶,KlenTaq DNA聚合酶,DNA聚合酶I,DNA聚合酶I的Klenow片段,DNA聚合酶III全酶,T5 DNA聚合酶,T4 DNA聚合酶全酶,T7 DNA聚合酶,Bst聚合酶,rBST DNA聚合酶,N29 DNA聚合酶,TopoTaq DNA聚合酶以及ThermoPhiTM DNA聚合酶。本发明优选实施例使用Phi29聚合酶,类Phi29聚合酶或其他的高保真度的聚合酶(如杂交融合聚合酶)。
本发明优选的实施例使用进行性链置换聚合酶在高保真度碱基掺入(base incorporation)的条件下扩增DNA。在本发明的上下文中,高保真度“DNA聚合酶”是指,在推荐的条件下,其错误掺入率等于或低于通常所用的温度稳定PCR聚合酶如Vent DNA聚合酶、KlenTaq DNA聚合酶或T7 DNA聚合酶的错误掺入率(1.5×10-5-5.7×10-5)。其他的酶,包括蛋白质介导的错误纠正酶如MutS,其在聚合酶反应中或聚合酶反应后有效提高聚合酶保真度(Carr,P.et al.,Nuc Ac Res 32(20):e162,2004),可包含在反应中以最大限度地减少错误掺入。
同样,高保真度“RNA聚合酶”具有等于或低于普通RNA聚合酶(Promega技术信息)的错误掺入率。在本发明中,有效的RNA聚合酶包括T7 RNA聚合酶,SP6 RNA聚合酶,T3 RNA聚合酶以及其修饰或嵌合形式。
在扩增反应中,当存在脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、核糖核苷三磷酸(NTPs)或修饰的副本(modified counterparts)时,环式模板由聚合酶复制,形成包含模板串联重复的长多联体。多联体随后通过限制酶切或物理剪切等方法被切割成称为“短表达盒”(SECs)的较小片段。SEC包含目的序列,并可任选地包含真核表达序列(或真核表达盒)。优选实施例使用至少包含一个真核表达盒的SECs。与通常细菌产生的质粒不同,本发明的SEC仅由一个目的序列所组成,其所需的真核序列位于其侧翼,但没有细菌的遗传物质。
“短表达盒”(short expression cassette)可包括:被靶细胞识别的真核启动子;目的序列,其可以是完整基因,基因片段或特定目的序列(SOI);以及转录终止序列。其他的序列可以位于短的表达盒的侧翼,以促进连接(如产生CAN)或稳定线性片段。表达盒与期望的侧翼序列组成一“送递单位”(delivery unit,DU),并不含有不必要的遗传物质,该遗传物质仅用于选择和复制细菌培养物中产生的质粒。通过将在真核细胞中无价值的细菌的遗传物质减少到最低程度,可以产生高浓度、高质量具有生物活性的DNA分子。产生的核苷酸比典型的质粒小,能更有效地转染至细胞,且转染后更有效地在细胞内表达。
通过使用酶或化学方法除去由聚合中的差错而产生的具有错误匹配的核苷酸的DU,可提高终产物的同质性。例如,用于突变检测的酶(如解离酶,T4核酸内切酶VII,或T7核酸内切酶I)或用于检测基因突变或多态性以及在点突变的高通量筛选中的其他酶,可用来完成这个目标。
如上所述,任一方法可用来制备本发明的方法所用的环式模板。图1所示为三个通常用于产生有用的环式模板的方法,该模板至少包括一目的基因(SEC或DU)。一方法涉及酶修饰现有的质粒,由此,包括真核表达盒的DU被限制性核酸内切酶消化选择性地从质粒切除。DU无复制起点或选择性的标记基因,如抗生素抵抗介质,其可沉默SOI在体内的表达。
本发明优选的实施例使用包含完整真核表达盒的模板,侧翼序列位于盒两侧的任一侧(图1),以能使线性SEC环化成CNA。模板可以是任一单链或双链的核酸(DNA或RNA),其被转变成环式模板并包括质粒和微环DNA。预连接反应可在使用锁式探针(padlock probes)的情况下进行(Baner,J.,et al.,Nuc Ac Res 26(22):5073-78,1998)。
依赖于所使用的聚合酶,双链模板最初可能需要变性以便最优化聚合酶反应。在这样的反应中,正向和反向链可以在同一反应中同时扩增。接着,随后的处理过程可能需要加入限制性核酸内切酶、连接酶和/或促旋酶。产物接着可以进行纯化以便产生治疗上应用的DUs。
另一个产生模板的方法涉及用指定的寡核苷酸以较大的DNA为模板进行PCR扩增以产生相对较短的DUs从而进行环化,该寡核苷酸位于特定表达盒的侧翼。
第三个产生模板的方法涉及寡核苷酸(核酸寡聚物)的化学合成以产生单核酸链或互补链,接着将其环化以产生包含DU或表达盒的模板(图1)。
在扩增中,模板可自由地悬浮于溶液中或与载体结合,如和染色体或蛋白质结合(美国专利号5,854,033),或与固体载体,如玻璃珠或聚苯乙烯珠结合。
根据本发明的实施例,一替代方法显示在图3中。如图所示,双链模板的每一个链可以使用适当设计的引物单独扩增以产生单链的DUs多联体。单独扩增的多联体各自和含有特异限制性位点的核苷酸寡聚物混合并用限制性酶切割。将这些片段的临时双链末端连接以形成环式单链产物(Dahl,F.,et al.,PNAS 101(13):4548-53,2004)。该方法的优势是,每一反应的单链环之后能结合形成一类单独的双链单体环,因而可避免从反应中得到的其他的多聚体型中纯化得到单体。接着单体环以DNA促旋酶或类似的酶超螺旋化以提高表达盒的吸收和表达效率。
多个实施例使用环式双链DNA模板和引物,该引物可以特异性地在指定的位点结合以启动多联体的合成。引物可包含任意不同的核酸变异以提高稳定性,还可以具有各种长度,该长度是由所用的DNA聚合酶的退火温度所决定的。引物序列可包含随机或特异序列,可被设计成具有特异的序列交替,或包含标记物或探测序列,为了便于扩增序列的操作或分析,探测序列与模板不互补。例如,在一个实施例中,随机六碱基引物用于有效地扩增DU,其通过处理和转染至细胞,能产生期望的效果。其它的实施例使用特别设计的引物,该引物通过隔开起始位点以及引物可控制的亲和性最优化反应条件,能控制RCA反应。序列特异性引物,可短至只有四个碱基,可用于有效地扩增特殊的DU。
在大多数应用中,聚合酶、限制性核酸内切酶、连接酶和其它本发明所用的酶为酶的可溶形式。然而,固相扩增反应或固相处理反应,包括限制性酶切、连接和超螺旋化反应,也可用于改进扩增过程。另外可以使用包含不同酶(特别是聚合酶)的最理想区域的融合蛋白,该理想区域适于提高保真度、效率和处理终产物。也可以使用包含一个或多个亲和性标记(如6XHis,S-Tag,钙调蛋白结合肽,蛋白A和其它)的酶的重组体形式,该标记在细菌、真菌、植物、昆虫或动物细胞中表达。使用这些经标记的酶的优势在于,可以很容易地用亲和性层析从终产物中把它们除去。纯化后,重新获得的酶,用标记部分(tag moiety)固定在固体基质上,可以在随后的酶反应中使用。
扩增后,多联体切割成至少包含一个DU的短表达盒(SECs),其中,单一的SEC可能包含DU的多重拷贝,也可以进行某种设计以最优化送递和表达。线性SECs可以作为线性片段、环化片段(CNA)或超螺旋环化片段(sCNA)施用以促进靶细胞吸收。如此,扩增后处理可以根据既定目的而改变。
SEC的处理可以包括以下方式的任意一种或多种:采用其它的物理方式或酶方式进行额外切割;通过酶切割,如用Klenow,或通过化学方式,填充或处理SEC的末端;内连接SEC的两个末端以产生环化CNA;以促旋酶类型的酶,包括II型拓扑异构酶,超螺旋化CNA;酶或化学处理任意形式以具有修饰的内部碱基或修饰的末端;将两个或多个SECs连接在一起;或者将SEC连接至一个配体以产生一个功能共轭物。术语“配体”,如同在本发明的上下文中所定义的,包括:核酸,包括DNA、RNA、PNA、LNA,或其修饰物;肽,或用于促进寻靶(targetting)和细胞吸收,或用于增加疗效;多肽,其可具有酶活性的或物理功能;适体,识别、结合和修饰蛋白质功能的核酸;生物物理标记,包括荧光、磁和放射标记组分;以及多聚体,其或者能促进核酸的稳定,或者能促进产物定位于靶细胞或组织。
治疗应用,其可由本发明产生的DNA成功地实现,对DNA治疗方法而言,包括几个途径,包括抗体产生和基因沉默。例如,在成功地施以恰当的适于预防或治疗由病原体如流行性感冒病毒和HIV引起的疾病的表达盒后,能在体内产生抗体。例如,编码流行性感冒血凝素的序列在真核启动子的控制下,可用以引起被流行性感冒病毒A感染的动物的体液免疫反应或细胞免疫反应。同样的,编码一截短的人类免疫缺陷病毒(HIV)包膜蛋白的序列的表达能成功地诱导小鼠体内抗HIV的有效免疫原性应答。
本发明的扩增核酸也被证明能在体内介导靶向基因沉默。单纯疱疹病毒(HSV),能引起疼痛的水泡以及全身各部分的疼痛,以及带状疱疹病毒,能引起水痘(初期感染)和带状疱疹(通过复发),都是病毒同一科的成员,该科病毒需要表达ICP4和ICP47以完成病毒感染。通过在细胞培养物中转染,扩增的能表达反义核酸寡聚物的SECs—该核酸寡聚物对ICP4或ICP47具有特异性,可用于在体内调控这些蛋白的表达,还能进一步将病毒的增殖降至最低。抗ICP4转录本在体内的表达成功地抑制ICP4基因并能阻遏ICP4蛋白在细胞内的产生。通过这个方法产生的ICP47表达盒表达后,也可观察到类似的作用。
ICP47的功能是抑制主要组织相容性复合体(MHC)呈递途径,其对屏蔽病毒不受宿主免疫原性攻击非常关键。ICP47的基因产物结合于一转运蛋白,该转运蛋白和已感染的细胞的外部抗原呈递有关,因而阻遏I类主要组织相容性复合体抗原呈递途径。结果,感染HSV的细胞被掩蔽,免受细胞毒性T淋巴细胞的免疫识别。因此,ICP47在HSV感染中起着关键的作用。
Western印迹分析法检测显示,以根据本发明扩增的ICP47 SEC转染肺癌细胞系A549,可以有效地表达反义序列,阻遏ICP47蛋白的产生。在单纯疱疹基因组中,还有其它感染细胞蛋白(ICP’s)也可以用同样的方法使其沉默(silenced)。
其它基因沉默靶子包括呼吸病毒如鼻病毒(rhinoviruses)、冠状病毒(corona virus)、腺病毒(adenovirus)、流感病毒(influenza virus)和副流感病毒(parainfluenza virus),其经常与上呼吸道和下呼吸道感染有关,包括普通感冒、肺炎、哮喘以及慢性阻塞性肺病(chronic obstructivepulmonary disease,COPD)。人类鼻病毒(HRV)有一大小约为7.2KB的单链RNA基因组,具有一编码衣壳蛋白、RNA聚合酶以及两个病毒蛋白酶的单开放阅读框(single-open-reading frame)。通过感染,病毒蛋白有效地改变宿主系统(host machinery)以产生数千病毒颗粒,这些颗粒最后在细胞溶解后得以释放。
大多数鼻病毒(rhinoviruses)利用细胞间粘附分子I(ICAM-1)作为受体来感染细胞。扩增的编码ICAM-1信息的反义(antisense)的SEC的表达,能有效地阻遏ICAM-1蛋白在体内的表达,该表达有可能最大限度降低病毒感染。其它抵抗呼吸疾病的有效策略包括类反义分子(反义、适体、形成三联体的分子以及类似的分子)的体内表达,以阻遏必须蛋白质的活性,该蛋白质介导感染,如加工病毒颗粒所需要的病毒蛋白酶。其它的方法包括用SEC阻遏病原体诱导的组织反应的介体(如缓激肽、前列腺素、速激肽、组胺和各种细胞因子),或阻遏完成这些介体引起的生理效应的细胞受体。
本发明治疗应用的其它目标包括调节人类乳头状瘤病毒(HPVs)引起的感染,这种感染最初表现为良性的非癌性瘤,但在一些情况下可发展成恶性生长。例如,生殖器HPVs(genital HPVs)可以通过性交以及通过口交或肛交从一个人传递至另一个。感染病毒的子宫颈细胞能从良性瘤转变为癌变前细胞并最终发展为癌。子宫颈癌可能是病毒感染怎样导致癌症最知名的例子中一个。在人类和动物中,细胞分裂主要受Rb和p53调节。HPV的E6和E7蛋白直接附着于Rb和/或p53,抑制蛋白的肿瘤抑制作用并引起感染细胞无控制地增殖(Didelot,C.et al.,Intl J Oncology23:81-87,2003)。然而病毒仅仅充当初因事件,随着时间的流逝,一些无控制生长的细胞的遗传结构发生了不可修复的永久性变化。通过表达适于阻遏E6和E7的类反义构造,将致使病毒感染无效。
其它类型的HPV感染表现为男性和女性生殖器和肛门上或其附近的瘤,并且,通过利用本发明产生的核酸的类反义表达可能得到有效治疗。对女性来说,可视的瘤也可出现在子宫颈上。这类瘤的学术名称是尖锐湿疣,并且一般和两类HPV有关,即第6型和第11型。这些瘤很少发展成癌,并被认为是“低风险”病毒。其它性传播的HPVs已被认为和男性和女性的生殖器癌或肛门癌有关。它们被称为“高风险”HPV类型,包括HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-45及其它。高风险类型HPV通常不包含在可视的瘤中,但高风险和低风险HPVs都能引起子宫颈中非正常细胞的生长。这两类型HPV感染都能用有效的体内类反义表达治疗剂进行有效的控制。
本发明的扩增也可以用于扩增包含细菌序列的完整质粒或者扩增质粒的修饰型以排除这些序列。例如,单链DNA表达载体,pssXE,其包括:1)编码一截短的但具有完全活性的莫洛尼氏白血病毒反转录酶(MoMuLV RT)的基因;2)具有由MoMuLV RT启动的反转录所必须的侧翼区域的引物结合位点(PBS);3)产生一反义、适体、DNA酶或诱导形成三联体的序列的靶向基因编码序列;和4)适于终止反转录反应的茎环结构,作为完整的表达盒,能根据本发明得到有效的扩增。扩增的产物可以转染并且可以用于有效地沉默哺乳动物、病毒和细菌的基因。通过细胞内表达,转染的RT随后用寄主的内源tRNA(如tRNAPro或tRNAVal)作为引物在RNA转录本的3’末端与引物结合位点(PBS)结合并启动ssDNA的合成。反转录后,当mRNA在RNase H或RT的RNase H活性作用下降解时,ssDNA得以释放。
核酸(SEC)的送递可通过将在稳定的缓冲液中的裸核酸注射入靶向体来完成。本发明的实施例也用送递载体,该送递载体能提高核酸靶向性及协助送递至细胞(Dias,N.Molec Cancer Ther 1:347-355,2002)。一些实施例使用病毒载体系统,其可以是削弱的病毒系统,即包括很少或没有免疫原性蛋白的病毒包装系统(Srivastava,I.K.and Liu,M.A.AnnIntern Med.138:550-559,2003)。其它的实施例包括使用中性的或阳离子的脂质体,其或者能封装核酸或者能通过静电相互作用和核酸结合。这些实施例也可以使用辅助分子[如氯奎或1,2-二油酰磷脂酰乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine)]以阻止送递的核酸在内体区室(endosomal compartments)的隔离(sequestering)。商业上可用的脂质体载体包括Lipofectin、Eufectins、Cytofectin和Lipofectamine。
其它的送递方法包括核酸与阳离子肽(cationic peptides)的共价结合,其能通过物理的相互作用、或受体或者转运蛋白介导的机制调节质膜的渗透性。这样的结合增加了送递核酸的效力,该核酸被直接送递至细胞质并易于转运至细胞核进行表达(Luo,D.and Saltzman,W.M.NatureBiotech 18:33-37,2000)。其它的实施例还使用阳离子多聚体,其和治疗核酸发生静电相互作用,从而将核酸送递至细胞。阳离子多聚体,其例子可包括聚左旋赖氨酸(PLL)、聚乙二醇(PEG)、PEG-block-PLL-dendrimers、聚酰胺-胺型树枝状高分子(polyamidoamine(PAMAM)dendrimers)、聚氰基丙烯酸酯纳米颗粒(polyalkylcyano-acrylate nanoparticles)以及聚乙烯亚胺(PEI)和其共轭物(如甘露糖-PEI、运铁蛋白-PEI、线性PEI)。
气雾剂送递是送递至呼吸道上皮和肺面的非入侵方式。例如,通过喷雾,包含PEI和核酸的配方能完成高水平的呼吸道的或肺的转染。这种PEI-核酸复合物的应用能实现比许多阳离子油脂配方(catinoic lipidformulation)更高水平的基因表达,并显示出其能高效率地(接近100%)转染至呼吸道上皮细胞和肺实质。另外,基于PEI配方的气雾剂的重复施用仅具有很低的毒性。与静脉内注射PEI核酸或阳离子脂质体-核酸复合物喷雾相比,这种送递方式仅最低限度地诱导肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)。
使用细菌产生的质粒DNA的常见问题起因于寄主接触了细菌处理的DNA中固有的未甲基化的基序。未甲基化的DNA能诱导CpG介导的细胞因子反应和促炎细胞因子的诱导,且促炎细胞因子的诱导是和肺毒性以及治疗应用效率降低有关的重要问题。因此,细菌产生的DNA的使用已严重地阻碍了许多目前所用的基因治疗方法。用PEI遮蔽CpG反应能促进持续的基因表达,这些基因经由PEI基因气雾剂送递,因而能获得持续的治疗反应。当与由本发明的无细胞扩增方法产生的核酸组合使用时,对DNA治疗方法而言,基于PEI的气雾剂是非常有效的到达肺部和呼吸道上皮的送递体系。
一些实施例也使用长期的释放体系。生物相容性的控制释放的多聚体如乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(D,L-lactide-co-glycolide,PLGA)微球体以及乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(poly(ethylene-co-vinyl-acetate,EVAc)基膜(matrices)能实现生物活性核酸受控的、能调节且可预计的释放,两个组分都获得了美国食品与药品管理局的治疗应用许可。
也可以使用物理送递体系。电穿孔可有效地将治疗剂转移至皮肤细胞、角膜内皮和包括肌肉在内的其他组织。压力介导注射或水压注射在哺乳动物体系中可实现高达50%的效率。其他的方法包括在许多不同类型的细胞包括植物细胞中超声波气雾化送递DNA-油脂复合体,对植物而言,基因枪法(particle bombardment)也有效。
无细胞扩增方法的按比例增加(scale-up)可以使用半自动或全自动平台进行,为实现理想的效率,可以严格控制盐、酶和核酸的顺序加入,以及温度和培育时间(图4)。在一实施例中,通过增加反应的数量但维持每一个反应体积(volume)相对较小(<1ml),可以实现按比例增加,由此,使用多孔板在标准或者定制的平台上,模板得以同时扩增(图5A)。作为选择,按比例增加可包括较大的体积(如10升)以用类似发酵桶的容器在环境条件的控制下在一个单独的运行中产生大量的(公斤级)单独的核酸产物(图5B)。较大体积可用于产生更大产量的产物。不同容量的多重平台可在限定的空间内平行排列并能以同等的方式作为一更大的生物制造设备的一部分起作用,该生物制造设备可满足各种扩增等级的要求。
在小体积内产生大量的核酸存在将试剂混合成高粘性反应混合物的问题。本发明包括一个反应容器,其可以是硬的预成型容器或者柔软的容器如自带的塑料袋。在优选的实施例中,反应容器和与反应混合物接触的所有组分干净、无菌而且没有污染的核酸序列。硬的预成型容器的内容物优选由一包含在反应容器内的装置混合,但也可包括一再循环装置。柔软的容器优选由一个再循环的机械装置混合,该机械装置包括蠕动泵或可包含一外部的机械装置如自动挤压装置或避免核酸产物剪切的低能震动装置。
内部的装置可以用几个不同的机械装置,包括具电控速度和自动定时的类似螺旋桨的搅拌装置(图6A),或者可控的液体移置方法,用一个打孔的圆盘固定至一个轴上,并在反应容器的内直径内上下运动(图6B)。圆盘在液体内以各种速度上升或下降以充分地混合反应混合物。这两个混合小室都可装配一分发装置,该分发装置包括一个附着于每一个搅拌器轴的小试管,该试管用蠕动泵将各种原料组分送递至反应混合物,原料组分在混合容器外单独地装入小室中,以控制各种试剂准确和有序的送递。
另一实施例采用一个系统,在该系统中,稳定不变的反应混合物流从小室里泵出再泵入。例如,位于小室底部的出口能使小液流和加入的试剂混合,并且能通过位于相同反应小室上部的入口导回,以完成混合(图6C)。蠕动泵和进口阀在再循环过程中控制和监控各种溶解物和酶的分配(图6C)。
另一个实施例利用DNA混合物具有触变作用的特性,其中,使混合物成拉长的圆柱形。具有触变作用的复合物能根据施加于该复合物的剪切力改变粘性。通常,剪切力的增加能降低具有触变作用的复合物的粘性。一旦剪切力消失,这样的复合物将开始恢复至其最初的粘性。在这个实施例中,盛有粘性反应混合物的容器具有均匀隔开的孔,通过这些孔注射必需的化学药品用以处理。因而,通过小直径圆柱体,粘性反应混合物的延长充分地改变了粘性以促进与试剂的局限性混合,该试剂在一个足够长的能完成混合的时间段内慢慢的融合至小直径圆柱体和较小粘性的反应混合物混合。
装置优选包括一个或多个所有相关物理和生化参数的内嵌实时监控以检验产品的稳定性和维持质量控制和确保品质,这对坚持治疗应用上可接受的产品所需的良好制造规范(cGMP)是必须的。该装置可包括计算机或类似的装置,用于监控粘性、核酸的浓度、溶液的浊度、传导性、pH值、温度、蛋白质含量、内毒素、生物负荷(bioburden)和/或由体系可降解组分引起的化学污染物。
线性SEC成为环式SEC的处理要求连接步骤相对于分子间的反应更有利于分子内(自身粘附)的反应。对最终的扩增产物进行通常使用的稀释可以调节摩尔比以促成分子内连接。然而,优选实施例将全部的反应体积降至最小,通过将少量反应混合物混合入包含酶和缓冲液组分的连接混合物(ligation cocktail)。在一个实施例中,扩增的产物以很慢或脉动泵的速度加入小股反应混合物中,如图6C所示。其他的实施例将反应混合物逐滴加入至包含连接混合物的第二容器中,从而在没有产生大体积已连接的反应混合物的情况下得以稀释(图7)。每一等分试样(aliquot)之间留有足够的时间间隔以优化加入的每一个新的等分试样的分子内连接过程。一旦等分试样的连接完成,环式DNA就不再是酶的底物而成为稀释混合物的一部分。于是分发第二等分试样重复这个循环直到扩增的DNA被全部加入和连接。这个方法允许在没有最初扩增反应的大量稀释时发生分子内连接,并且能结合多重分发室用以实现多个等分试样的同时连接并将处理时间缩减至最短。
在反应过程中使用基于渗透性膜的方法,从而简化产物的最后纯化。这些膜允许扩增的DNA反应混合物中的小分子量的分子(盐、未结合的引物、dNTPs、NTPs、以及其他的小分子)扩散掉而保留产物。改良的血液透析方法(hemodialysis process)可以用于允许选择性保留扩增的DNA而不保留其它反应组分。一旦反应完成,扩增反应体系从反应容器泵入包含具有特定截留分子量的过滤膜的过滤器。当较小的试剂从反应体系透过具有许多小毛细管的膜扩散时,DNA至少得到部分纯化。然后将纯化的DNA集中起来,或者评估质量和/或分装用于最终应用,或者被分成等分试样并保存用于以后的分析。其他的实施例利用超过滤纯化步骤,该步骤包含一个从原料流中区分高分子量复合物的低压膜分离过程以获得所期望的纯化的RCA终产物。
通过传统的方法,可以分析终产物的大小、类型、污染程度和表达能力。凝胶电泳、测序以及生化分析或HPLC分析都是常规方法。终产物的表达可以通过使用标准技术如磷酸钙处理、电穿孔或相关技术转染至合适的细胞来测试。
扩增产物作为治疗复合物的施用可以包括但不局限于局部应用、静脉注射、肌肉注射以及组织内注射、经鼻给药、栓剂给药、用植入式药盒(implanted reservoirs),如Omaya氏注药囊(Omaya reservoirs),注射和/或泵入、滴眼给药、口服药品以及用超声技术送递。送递媒介物的例子可以包括脂质体介导的或基于多聚体的运输媒介物以及各种胶囊或蛋白靶向载体(protein-targeting vehicles),和用于呼吸使用的合适的气雾剂载体。
附图说明
图1绘示产生有用模板的多重机制。如模板可以通过质粒修饰、PCR扩增、化学合成或cDNA合成而产生。
图2根据本发明的一实施例绘示基于RCA的扩增方法。该方法使用聚合酶由环式模板合成一多联体。多联体可以处理成较小的至少包含一完整表达盒的片段。合成的产物可用作短的线性单位、环式核酸(CNAs)或超螺旋环式核酸(sCNAs)。
图3是根据本发明的一实施例绘示一方法。该方法包含分别扩增双链模板的正向链(A)和反向链(B)。在两个独立的反应容器中,将每一个链扩增并环化成单链环。在每一个容器中,仅一个链用链特异性引物得到扩增。一包含限制位点(OR1或OR2)序列的次级寡核苷酸接着和单链多联体中一预先设计的位点退火,由此,产生双链模板的短的部分,使限制酶的消化成为可能。消化之后但在变性之前,双链的末端用DNA连接酶环化。连接后,将寡核苷酸变性以形成单链环,其接着和互补的单链环结合形成仅包含单体的双链环。该方法将二聚体、三聚体和其他多聚体副产物的形成降至最低。
图4为根据本发明的一实施例,描述RCA过程按比例增加。这个过程包括在指定的时间按顺序加入模板、引物、缓冲液组分和酶并转变为指定的温度。其提供了一在段时期内产生大量产物的高效的方法。在连接之前,稀释反应体积(reaction volume)可促成单体环式产物的形成。
图5为绘示自动化扩增装置的设计图。(A)代表一个模型,在该模型中,大量的单个反应,包含小于1ml的体积,可用来同时扩增许多单个的模板。(B)展示能合成大量单一DNA产物的单一容器的用途。(1)控制反应参数的程序控制的计算机途径;(2)评估和调整反应参数的监视器;(3)包括酶、缓冲液和其他组分的原料溶液的控温室;(4)向反应容器中加入试剂的分发口;(5)温度受控制的反应容器;(6)多孔分液器(multiple-well dispenser);(7)多孔反应容器平板;(8)多孔平板控温室。
图6是总结粘性反应混合物的各种合成策略的示意图。(A)类螺旋推进器混合容器;(B)打孔的圆盘混合容器;(C)使用蠕动泵的再循环混合容器。在(C)中,(1)可调节的自动控制器和进出口,用以保存于(2)中的试剂的定量加入;可调节的控制器(1)使试剂与小流反应混合物的混合成为可能,并通过将加了试剂的反应混合物送回到小室中与出口相对的位置支持反应混合物全面的混合。不添加试剂的持续泵送有利于充分混匀。
图7是描述分子内连接的过程。容器(B)中扩增和消化DNA后,将反应混合物缓慢地加入至含有连接混合物(Ligation cocktail)的第二容器(A)。缓慢地将DNA加入容器(A)对DNA进行足够的稀释,以促进单体CNA的形成。
图8显示在用一质粒、依据本发明的一实施例产生的一短表达盒(合成的DNA,synDNA)以及一对照溶液免疫后,IgG抗体抗Balb/c小鼠中产生的gp160的效价。这些结果清晰显示这些合成的DNA在小鼠中诱导免疫应答是非常有效的。
图9是显示用质粒或合成的DNA(表达盒)对兔的免疫结果,合成的DNA是根据本发明的实施例制备的,包含乙肝病毒小表面抗原(HBs(S))。这些结果表明本发明合成的表达盒在诱导兔免疫应答方面是非常有效的。
图10显示BALBc小鼠注射后,抗流行性感冒H1N1病毒的免疫结果。数字显示记录为最后稀释的病毒中和效价,在最后稀释中,抑制了各种遗传免疫试验的病毒的复制。
具体实施方式
实施例1-β-半乳糖苷酶(LacZ-DU)的合成和无细胞扩增
a)基于质粒的模板pSV-β-半乳糖苷酶载体(Promega公司,Madison,WI,USA)用EcoR I和Pst I进行部分消化。分离包含CMV启动子、Lac Z ORF以及SV40的小T抗原终止序列的约4.2kb的片段(LacZ-DU),以T4 DNA聚合酶做成平末端并克隆至pGEMTM-7Zf(+)(Promega公司,Madison,WI,USA)的Sma I位点,产生pGEM-LacZ-DU载体。随后按照制造商的建议,以Xba I将LacZ-DU从pGEM-LacZ-DU切除、凝胶纯化并以T4 DNA连接酶(New England Biolabs,Beverly,MA,USA)环化。
b)基于PCR的模板 使用包含BamH I核酸内切酶识别位点的正向引物(5’-CG
GGATCCGACTCTTCGCGATGTAC-3’)、反向引物(5’-CG
GGATCCCAGCATGCCTGC-3’),由pVAXTM 200-GW/lacZ载体(InvitrogenCarlsbad,CA,USA)扩增LacZ-DU。在含有200ng每一个引物、10ngpVAXTM 200-GW/lacZ载体、0.2mM dNTPs、1×Herculase缓冲液以及2.5UHerculaseTM聚合酶(Stratagene,La Jolla,CA,USA)的50μl的反应中,扩增LacZ-DU。扩增在RoboCycler Gradient 40(Stratagene,La Jolla,CA,USA)中按如下条件进行:94℃ 2min;5个循环(92℃ 30sec;40℃ 30sec,72℃ 5min);25个循环(92℃ 30sec;55℃ 30sec;72℃ 5min)以及72℃10min。约4.2kb的扩增产物以BamH I消化、凝胶纯化并用T4 DNA连接酶环化。
c)以6碱基随机引物(random hexamers)扩增 将包含pH8的10mM Tris、10ng的环式LacZ-DU以及200pmol 6碱基随机引物(IntegratedDNA Technologies,Inc.Coralville IA,USA)的反应加热至95℃达3min并冷却至室温。加入Phi29 DNA聚合酶(10U,New England Biolabs,Beverly,MA,USA)、0.2mM的dNTPs以及100μg/ml的BSA。30℃下,在50mM pH7.5的Tris-HCl、10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4以及4mM DTT中扩增16hr。扩增后,将phi29 DNA聚合酶热失活(5min 65℃),乙醇/盐沉淀所扩增的LacZ-DU多联体并根据酶制造商的建议用恰当的核酸内切酶(Xba I或BamHI)消化。
d)用特异引物扩增 使用上述的相同条件,用确定序列的两个引物和对应的互补链的两个引物选择性地扩增2788bp的DU。每一确定的引物的使用浓度为200pmol并且由下列序列组成:正向引物:5’-CTGCCAACAAGGTACTCG-3’;反向引物:5’-AGCTGCTACTGGGTCTAG-3。扩增按以前描述的方式进行并用凝胶电泳检查以评估成功的扩增。
e)以单一的确定序列的六碱基引物(hexamer)扩增在40mMTris-HCl pH8、10mM MgCl2中将反应和10ng环式Lac-DU加热至95℃计3min并冷却至室温,该反应含有400pmol的六碱基引物5’-GpGpApApApA-3’,其在Lac-DU上8个不同的位点退火(4个在反向DNA链的464、1325、2579以及3911位点;4个在正向链的750、2871、3239以及3260位点)。加入Phi29 DNA聚合酶(10U,New England Biolabs,Beverly,MA,USA)、1mM dNTPs、5%的丙三醇、0.7U酵母无机焦磷酸酶(yeast inorganic pyrophosphatase)(Sigma,St.Louis,MO,USA)以及100μg/ml BSA。30℃下,在50mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4以及4mM DTT中扩增16hr。扩增后,将phi29 DNA聚合酶热失活(10min 65℃),乙醇/盐沉淀所扩增的LacZ-DU多联体并根据酶制造商的建议用恰当的核酸内切酶(Xba I)消化。核酸内切酶失活后(65℃计20min),在22℃(或稍低温度)下,在对每100fmol的DNA约具有0.1Unit/μL T4 DNA连接酶(Invitrogen Carlsbad,CA,USA)的连接缓冲液中(pH7.6的50mM Tris-HCl、5mM MgCl2、1mM ATP、1mM DTT、5%PEG-8000)进行线性LacZ-DU的环化。然后乙醇/盐沉淀环式的LacZ-DU并在pH8的10mM Tris-HCl中重悬浮。
f)以单一的抗核酸外切酶的确定序列的六碱基引物(hexamer)扩增用上述相同条件,以3’末端具有两个硫代磷酸键(thiophosphate linkages)的确定的六碱基引物(5’GpGpApApsApsA-3’)扩增LacZ-DU。
g)以单一确定序列的五碱基引物(pendamer)扩增 用上述相同条件,用序列确定的五碱基引物(5’GpGpApApA-3’)扩增LacZ-DU,该五碱基引物与LacZ-DU在19个不同的位点退火:8个在反向链的465、889、1326、1695、2580、3666以及3912位点;11个在正向链的80、119、191、602、750、912、2871、3239、3606和3815位点。
h)以单一抗核酸外切酶及确定序列的五碱基引物(pendamer)扩增使用上述的相同条件,LacZ-DU用确定序列的抗核酸外切酶的五碱基引物(5’GpGpApsApsA-3’)扩增,该五碱基引物具有两个3’末端核苷酸的硫代磷酸键(thiophosphate linkages)。
i)用聚合酶混合物(polymerase cocktail)扩增 用上述1-e中所述条件,在phi29 DNA聚合酶和T4 DNA聚合酶存在时,扩增LacZ-质粒,其中phi29酶单位∶T4酶单位为10∶3至3∶10。显示理想的扩增条件也适于其它的模板,如荧光素酶DU。
实施例2-荧光素酶的合成和无细胞扩增(Luc-DU)
以Sal I和Xho I消化pGL3载体(Promega Corp.Madison,WI,USA)。分离2.17kb含有SV40启动子、荧光素酶ORF以及SV40小T抗原终止序列的片段(Luc-DU),纯化,并按照酶制造商的建议,用T4 DNA连接酶(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)再环化(re-circularized)。
a)无细胞扩增 将含有浓度各为400pmol的六碱基引物(hexamers)5’-ApApTpTpsGpsC-3’以及5’-ApGpCpApsApsT-3’以及10ng/25μl环式Luc-DU反应的反应在40mM Tris-HCl pH8、10mM MgCl2中加热至95℃计3min,并降至室温。加入Phi29 DNA聚合酶(10U,NewEngland Biolabs,Beverly,MA,USA)、1mM dNTPs(25/25/25/25)、5%丙三醇、0.7U酵母无机焦磷酸酶(Sigma,St.Louis,MO,USA)以及100μg/ml BSA。30℃下,在50mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4以及4mM DTT中扩增16hr。扩增后,将phi29 DNA聚合酶热失活(10min,65℃),并乙醇/盐沉淀扩增的Luc-DU多联体以及根据酶制造商的建议用合适的内切酶(BamH I)消化。核酸内切酶失活(65℃,20min)后,14℃下在每μl具有0.1Unit的T4 DNA连接酶的缓冲溶液中(pH7.6的50mMTris-HCl、5mM MgCl2、1mM ATP、1mM DTT和5%PEG-8000)进行线性Luc-DU的环化达12-16hr。然后乙醇/盐沉淀环式Luc-DU并在pH8的10mM Tris-HCl溶液中重悬浮。
实施例3-扩增的DNA在人类细胞中的表达
在37℃和5%的CO2环境下于Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM;Invitrogen Carlsbad,CA,USA)中培养人肺癌细胞A549(ATCC),该培养基补充了10%的热失活胎牛血清(Hyclone,Logan,UT,USA)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素(Invitrogen Carlsbad,CA,USA)。
a)DNA转染 转染之前日,A549细胞以1×105细胞/ml的密度在6孔板中接种(seeded)。GenePORTER2转染试剂(Gene Therapy System,SanDiego,CA,USA)按照制造商的说明用于细胞转染。不久,在50μl DNA稀释液B中,将无细胞扩增的DU或亲本质粒DNA(Promega Corp.Madison,WI,USA)与2μg载体pssXE DNA(Chen and McMicken,Gene Ther 10:1776-1780,2003)混合并在室温下培育5min。将DNA溶液与7μl在50μl的无血清/抗生素的DMEM中预稀释的GenePORTER 2试剂混合并在室温下进行5min的额外培育。此时,A549细胞用PBS冲洗,加0.9ml的无血清/抗生素的DMEM,随后再将DNA/GenePORTER溶液加入其中。在正常生长环境中培育4hr后,以PBS冲洗细胞并以补充了10μl/m Booster 3(GeneTherapy System,San Diego,CA,USA)的正常生长培养基替代转染培养基。在用LacZ作为报道基因(reporter)的实验中,用50-100ng的LacZ-DU(~4.2kb)的转染与用100ng亲本pGEM-LacZ-DU质粒(~7.2kb)的转染做了比较。在其他的用荧光素酶(Luciferase enzyme)作为报道基因(reporter)的实验中,249ng的Luc-DU(~2.17kb)与570ng的pGL3亲本载体(5.01kb,Promega公司)的转染做了比较。
b)检测转染细胞中β-半乳糖苷酶的活性 转染完成24hr后,用PBS冲洗A549细胞并在室温下在200/250ml pH7.5的0.1M磷酸缓冲液与0.02%Triton X-100中裂解1hr。随后通过10-13,000rpm离心5min,除去细胞残骸。在280nm下以分光光度计或用改良的Bradford检测测定细胞溶解产物的蛋白质总浓度。50μg的总蛋白与pH7.5的0.01M磷酸缓冲液、0.1MgCl2、45nMβ-巯基乙醇以及0.01mM(p-nitrophenyl β-D-galactopyronidase)在1ml的反应中混合。37℃下培育1-16hr后,测量410nm下的吸光度。
c)检测转染细胞中荧光素酶活性 转染完成24hr后,按上述方式处理细胞。随后调整细胞溶解产物以得到等蛋白总浓度,并与等体积的2×Bright-GloTM底物(Promega公司)混合。用Turner Biosystem20/20n光度计直接测量光发射。
实施例4-扩增条件
a)扩增缓冲液
丙三醇浓度-如实施例2所述,准备各用10ng Luc-DU模板的2个扩增反应。一个不加入丙三醇而以水替代。扩增后,乙醇/盐沉淀DNA,随后用适当的限制酶消化,然后在260nm和280nm波长下以分光光度计定量。在丙三醇浓度低于4%w/v(phi29 DNA聚合酶以及无机焦磷酸酶储备溶液中的携带量)时,观察到扩增效率有5.65%的增加。
加入分子海绵(molecular sponge):如实施例2所述,准备各用10ngLuc-DU模板的2个扩增反应。在一个扩增反应中加入5%w/v PEG-8000。扩增后,乙醇/盐沉淀DNA,随后以适当的限制酶消化,然后在260nm和280nm波长下定量。没有在扩增产量上显示出增加。
b)模板浓度 按实施例2中所述,制备包含浓度范围为1,156nM-29nM的Luc-DU模板的扩增反应。扩增后,乙醇/盐沉淀DNA并随后以适当的限制酶消化。以分光光度计在260nm和280nm波长下测定核酸浓度。在上述的扩增条件下,使用578nM模板,观察到了670倍的扩增。
c)脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)浓度 按实施例2中所述,制备包含578nM DU模板的扩增反应。测试包含dATP、dCTP、dGTP以及dTTP(比例25/25/25/25)的反应,其浓度范围为1mM-9mM。扩增后,用适当的限制酶消化DNA并用分光光度计法测定核酸的浓度。在上述的扩增条件下,存在6mM dNTPs时,扩增大约是3,000倍(fold)。
d)定制dNTP与模板的比例 基本上按实施例2中所述,制备包含578nM Luc-DU模板的扩增反应。分别将dATP、dCTP、dGTP以及dTTP加入扩增混合物,至终浓度为9mM。根据全池(entire pool)调节每一dNTP的比例以反映荧光素酶模板DNA单位的组成即A 27.2%,C 22.3%,G 24.2%以及T 26.3%。扩增后,乙醇/盐沉淀DNA并随后以适当的限制酶消化。在260nm和280nm波长下以分光光度计法测定核酸的浓度。在上述的扩增条件下,使用578nM模板,显示了2780倍的扩增。
e)Phi29 DNA聚合酶浓度 按上述方法,制备扩增反应,在扩增反应中,在9mM dNTPs存在下测试对应578nM DNA模板phi29 DNA聚合酶(New England Biolabs)1-20U范围之间的各种浓度。扩增后,用适当的限制酶消化DNA并用分光光度计法测定核酸的浓度。1U的phi29 DNA聚合酶/578nM足以产生290倍的扩增,而20U的phi29 DNA聚合酶可以将10ng的模板DNA扩增3985倍。
f)确定序列的抗核酸外切酶六碱基引物(hexamer)浓度 按上述方法,制备扩增反应,在扩增反应中,测试确定序列的抗核酸外切酶六碱基引物的最高至800pmol的各种浓度。扩增后,用适当的限制酶消化DNA并用分光光度计法测定核酸的浓度。在最初反应条件(实施例2)中的引物浓度基础上增至2倍在扩增产量上显示出了1.25倍的增加。
g)一步扩增限制酶消化反应 按实施例2所述,制备包含578nMLuc-DU模板的扩增反应。扩增后,在65℃计20min,将phi29 DNA聚合酶热失活并向反应中直接加入6U BamHI酶。37℃下处理2hr后,酶被热失活并乙醇/盐沉淀DNA。通过如上所述的琼脂糖凝胶电泳,可视化地评估DNA消化效率。
h)可变的温度 用上述(实施例1)所设立的条件,LacZ-质粒的扩增在温度范围为25℃-34℃下进行。以DNA的产量和质量为标准确定理想的温度。以分光光度计法测定DNA产量,而DNA的质量通过使用改良的Kunkel法得以评价(Kunkel T.A;JBC 260:5787-5796,1985;描述于Nelson,J.R.et al.,BioTechniques 32:S44-S47,2002),该方法使用全长的LacZ基因(3046bp)作为报道基因(reporter)。在32℃下进行的扩增,结果为大于3300倍的、错误率为1.22×10-6的扩增(比Phi29 DNA聚合酶的报道错误率降低2.5倍)。
i)不同反应时间的扩增 用实施例1所述的条件,在32℃下进行可变时间段(反应时间)的LacZ质粒的扩增,变化范围为1-16hr。在每一个时间点上,在65℃下处理20min令DNA聚合酶热失活并以适当量的直接加入反应中的限制性核酸内切酶消化。基于DNA产量和质量,测定理想的反应时间。理想的反应时间下可实现一大于3800倍、聚合的错误率为1.7×10-6的扩增。
j)采用较低浓度的酶与模板的扩增用实施例1所述的条件,在包含半数总的酶浓度(包括Phi29 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶以及无机焦磷酸酶)以及289nM DNA模板的反应中扩增LacZ质粒和荧光素酶DU。扩增在32℃下进行16hr。热失活聚合酶,随后用核酸内切酶消化扩增产物,按上述方法测定DNA产量和质量。半数于最初试验条件(实施例1)的酶和模板的浓度实现了大于5000倍、聚合错误率为7.7×10-7的扩增(比已报道的Phi29DNA聚合酶错误率大约降低了4倍)。
k)在RCA过程中排除/减少多联体形成 用实施例1所述的条件,在除了DNA聚合酶以外还包含2U的甲基化敏感SexAI内切酶的反应中扩增LacZ质粒。反应在32℃下进行16hr。扩增/消化后,通过琼脂糖凝胶电泳对DNA的分析显示存在小的线性DNA单位。
实施例5-分子内连接条件
a)T4 DNA连接酶 限制酶消化无细胞扩增的DNA、热失活所述的酶以及乙醇/盐沉淀DNA后,在1×连接缓冲液(5%PEG-8000、pH7.5的50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT以及1mM ATP)中,分别在包含700fmol DNA的138μl以及690μl的反应中进行线性DU的分子内连接(自我连接)。接着加入不同数量(0.6-1.5U)的T4 DNA连接酶(InvitrogenCarlsbad,CA,USA)并在14℃下连接至少1hr。随后通过所述DNA的琼脂糖凝胶电泳可视化地测定连接效率。在690μl反应中,290μU的T4 DNA连接酶足以催化1fmolDNA的单体环式DU的形成。
b)其他DNA连接酶 以适当的限制酶线性化DNA以及热失活所述限制酶后,进行线性DU分子内连接(自我连接)。连接以E.coli DNA连接酶(NEB)或Taq DNA连接酶(NEB)实现,根据制造商的建议分别在14℃或45℃下进行。随后通过琼脂糖凝胶电泳可视化地测定连接效率并和T4 DNA连接酶产物比较。
实施例6-浓缩双链环式DNA
乙醇/盐沉淀T4 DNA连接产物,并按照制造商的建议,在20μl包含5U依赖ATP的DNase的Plasmid SafeTM DNase(脱氧核糖核酸酶)缓冲液(Epicenter)中重悬浮。37℃培育30min后,DNase在65℃下加热20min失活。通过琼脂糖凝胶电泳可视化地测定反应效率,表明仅存在环式dsDNA,其可以用适当的限制酶消化成线性形式。
实施例7-扩增DNA在小鼠中的表达
制备各种形式的Luc-DU,包括:线性形式、硫代磷酸修饰的线性形式(phosphorothioate modified linear form)、环式、以依赖ATP的Plasmid-SafeTM DNase(Epicenter,Madison,Wisconsin)处理的环式。将1μg各种类型的Luc-DUs与MAA-PEI以15∶1的N∶P比在PBS中混合,对每只小鼠其终体积为200μL。每五只BALB/c小鼠为一组,在未麻醉的情况下,用单一类型的MAA-PEI-Luc-DU通过尾静脉注射。注射完成24hr后,获得小鼠的肺并在荧光素酶检测缓冲液中得到匀浆(homogenized)。根据制造商的说明,用Promega的Bright-GloTM试剂盒测量荧光素酶基因的表达。
表1 Luc-DU在小鼠肺中的表达(ng荧光素酶/肺;背景修正)
A | B | C | D | E | |
第1笼第2笼第3笼第4笼 | 0.3990.2990.313 | 0.2720.2810.257 | 0.0690.0360.098 | 0.0020.1690.269 | 0.0580.1250.147 |
平均值标准偏差(Std Dev) | 0.340.05 | 0.270.01 | 0.070.03 | 0.150.13 | 0.110.05 |
A:环式Luc-DU;B:以DNase处理的环式Luc-DU;C:线性Luc-DU;D:对照质粒;E:硫代磷酸修饰的Luc-DU(phosphorothioate modified)(背景平均值:0.05ng/肺)
在没有与DNA复合的MAA-PEI的其他试验中,改变了荧光素酶表达盒以适于更强的启动子并且重复了上述试验。下表总结了这一结果。
表2 Luc-DU在小鼠肺中的表达(ng荧光素酶/肺)
质粒 | 环式 | 线性 | |
第1笼第2笼第3笼 | 369457475 | 194280283 | 392407587 |
平均值标准偏差(Std Dev) | 433.666756.72154 | 252.333350.54041 | 462108.5127 |
也实施了用“裸”DNA的试验。在这个试验中,在不添加载体的情况下,将15μg各种表达荧光素酶基因的DNA通过皮内注射输入小鼠。尾巴的上部和中部作为注射位点。注射完成24hr后,处死小鼠并将小鼠尾巴的中部和上部分割、匀浆并按上述方法检测荧光素酶的表达。这些试验的结果总结如下。
表3 Luc-DU在小鼠皮肤的表达(ng荧光素酶/注射位点)
小鼠 | 质粒 | 环式 | 线性 |
1上部1中部2上部2中部3上部3中部4上部4中部 | 121100110100378800898000166400068260233900133600 | 279100187700784000169400190700127900010650011120 | 7509038040099280089240022310610800381800307400 |
平均数(Mean)SDng/注射 | 质粒450970560076.9质粒 | 环式375940432518.7环式 | 线性457875352342.5线性 |
小鼠 | 质粒 | 环式 | 线性 |
4509.75600.769 | 3759.44325.187 | 4578.753523.425 |
实施例8-小鼠中抗HIV-1蛋白gp160的遗传免疫
按实施例2所述,以表达修饰类型的人类免疫缺陷病毒(HIV-1)包膜蛋白gp160(gp145ΔCF1;Chakrabarti et al.,J.Virol.2002;76:5357-68;Kong et al.,J.Virol.2003;77:12764-72)的真核盒为模板产生大量的线性gp145ΔCF1-DU表达盒。
所有的试验获得了动物研究伦理审查委员会的批准(Baylor Collegeof Medicine;BCM)。在无菌的盐溶液中稀释超螺旋化质粒DNA以及表达gp145ΔCF1蛋白的无细胞扩增的线性DNA(无质粒骨架序列)并注射入BALB/c小鼠的胫骨前肌(anterior tibialis muscle)。每一个小鼠在0天、14天以及28天时每只腿各接受了50ng的注射。在14天(2周)、28天(4周)、42天(6周)以及56天(8周)时收集血液样本。5只小鼠一组(groupsof mice)用于每一个DNA类型,除了仅注射了盐的对照组以外。在酶联免疫吸附测定(ELISA)中用每一血液样本的血清评估IgG抗体抗gp160的效价。简要而言,用含有12.5ng/μl纯化的重组体HIV-1IIIB gp160(AdvancedBiotechnologies Inc.)的50mM pH9.5碳酸盐缓冲液包被96孔微孔板(96 well microtiter plates)。随后用含有0.05%Tween 20的PBS(PBS-T)冲洗微孔,并用含3%的BSA的PBS-T封闭(blocked)。然后,加入100μl连续稀释的小鼠的抗血清(在3%的BSA中)并将平板在4℃下培育过夜。然后用PBS-T冲洗平板并加入100μL以1∶10,000比例稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(Pierce)。多次冲洗后,加入50μL的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(Tetramethybenizdine)(Sigma)并以0.5NH2SO4停止比色反应。在460nm下得到读取光密度。
实施例9-扩增产物的纯化
一旦处理成最终形式(线性、环式或其他形式),扩增的产物用Sephacryl SF-1000(GEHC)通过凝胶过滤层析法纯化。简要而言,DNA加到1.7m×1.5cm Econo-柱上(Bio-Rad)并用pH8的10mM Tris、150mMNaCl以及5mM EDTA以1mL/3.6min的流动速度洗脱。每一部份洗出液中的DNA含量用琼脂糖凝胶电泳监控并将所期望的部分集中(pooled)。随后根据制造商的建议,用Centriplus 300 Cartridges(Millipore公司)浓缩。
一种选择是使用阴离子交换层析,该阴离子交换层析使用垂直于FPLC或HPLC体系的Q sepharose column(一种琼脂糖柱)。将在低盐缓冲液(LSB;pH8的10mM Tris-Cl)中的DNA上样。以10倍柱体积(10 column volume)的LSB冲洗柱子。用20倍柱体积为10-100%浓度呈线性梯度的洗脱缓冲液(EB;LSB+3M NaCl),从树脂中洗脱DNA。在254nm下监控洗出液并且只收集包含DNA的峰。随后用Millipore公司的Pellicon II UF膜进行超过滤脱盐。通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA的质量/完整性。
实施例10-无细胞扩增的DNA的质量评估
每一批产品被分配了一鉴别号并通过一系列检测以测定DNA的浓度、纯度以及完整性。通过在260nm波长下读取的光度计的吸光度测定DNA浓度。用几种方法测定DNA纯度。光度计的A260/280比、实时PCR(基因组DNA污染)、HPLC(RNA污染)、Micro-BCA试验(蛋白质含量,Pierce试剂盒)以及LAL试验(内毒素含量,Cambrex试剂盒)。另外,进行生物负荷(bioburden)试验以证实终产物的无菌性。每一套试验需要符合治疗行业设立的规范。
表3典型的质量测试评估概表
测试 | 方法 | 技术指标 |
DNA浓度 | 测定A260光密度测定法 | 1.0-5.0mg/ml |
纯度 | 测定的A260/280比 | 1.80-1.98 |
外观 | 可视 | 透明无色溶液 |
基因组DNA | 实时PCR(Real time PCR) | <1%w/w |
RNA | HPLC/1%琼脂糖凝胶电泳 | <1%w/w |
蛋白质 | 比色法(BCA Test) | <100ng/mg |
生物负荷 | 液体LB培养基(16-24hrs,37℃) | OD600=0 |
内毒素 | LAL显色法(Chromogenic LALtest) | <5EU/mg |
同一性 | 限制酶分析(RestrictionEnzyme Analysis) | 与指定的片段长度一致 |
实施例11-兔抗乙肝病毒(HBV)的遗传免疫
如实施例2所述,用表达乙型肝炎表面S抗原(HBs(S);Davis etal.,1993;Human Mol.Gen.2:1847-1851)的真核盒做模板产生大量线性HBs(S)-DU表达盒。经由在0日、28日以及56日对双后肢肌内注射,每组3只NZ雌白化病兔得以免疫,其每次注射总剂量为400μg的质粒或者无细胞扩增的线性DNA的等量基因。于0日、28日、42日、56日以及63日获得血清并用已确定的ELISA方法分析以测定体液免疫应答的程度。图9显示读取的血清的ELISA检测吸光度,该血清取自3只受到用HBs(S)超螺旋化的质粒或无细胞扩增的HBVs(S)-DU线性DNA免疫了28天和63天(以0天所对应的值标准化)的兔子。
实施例12-小鼠抗流感H1N1病毒的遗传免疫
在每一个试验中利用5只BALB/c小鼠。所有的小鼠试验获得了动物研究伦理审查委员会的批准(Baylor College of Medicine;BCM)。从BCM呼吸病原体研究小组获得了流感A/Puerto Rico/8/34(A/PR8;H1N1)。按照上述方法用PBS中的50μg总核酸进行DNA免疫。从pCAG-HA-WPRE质粒(Garg et al,2004,J.Immunol.173(1):550-8)中分离来自病毒株A/PR8/34的流感血凝素开放读码框(HA)并亚克隆至pCMV-MCS(Stratagene)得到pCMV-HA。按实施例2所述,扩增无质粒骨架的CMV-HA表达盒(HA-DU)。在0周、2周以及6周,对小鼠进行3次注射。进行如下5个不同的试验。1)用50μg pCMV-HA免疫小鼠。2)用50μg HA-DU免疫小鼠。3)用25μg HA-DU和25μg无任何表达盒的质粒DNA(空载体,pEV)的混合物免疫小鼠。4)用16.7μg HA-DU以及两个细胞因子表达质粒即16.7μg pCMVi-GMCSF和16.7μg pCAGGSIL12(Orson et al.,2005,Protection against influenza infection by cytokine enhanced aerosolgenetic immunization(付印中))的混合物免疫小鼠。5)用16.7μg pCMV-HA和上述的两个细胞因子表达质粒的混合物免疫小鼠。
免疫8周后,从每只小鼠中取得血清样品且进行病毒中和试验。热失活(56℃,30min)在免疫试验中收集的血清,并用标准的微中和试验在体外评估中和效率。简要而言,用MEM做稀释剂,血清样品在96孔圆底的组织培养平板(Falcon 3077)上连续地1∶2稀释两份。然后,将大约100个半数组织培养物感染量(TCID50)的流感A/PR8病毒加入到孔中。这次也进行测试病毒的回滴定。含有血清和病毒的平板在37℃下培育90min,然后圆底平板的容纳物转移至一新的包含单层犬肾细胞(Madin Darbycanine kidney;MDCK)的平板。在37℃下过夜培育后,从每一个孔中除去培养基并以MEM替代,MEM包含2μg/ml的Worthington胰岛素(Worthington Biochemical Corp.,cat.No.32C5468)、青霉素和链霉素,但无任何血清。4天后,将在PBS中冲洗并重悬浮过的鸡红细胞(rbc)0.5%悬浊液加入至每一个孔。当在对照孔中的rbc形成紧密的类似钮扣的东西时,读取并记录每一个孔中血细胞凝集模式。具有rbc的紧密类似钮扣东西的孔被认为是FV阴性的,而具有弥漫的血细胞凝集模式的那些孔被记录为病毒阳性的。图10显示记录为末次稀释的病毒中和效价,其中,各种遗传免疫试验的病毒复制受到抑制。
Claims (20)
1、一种在无细胞体系中产生高质量核酸的方法,其特征在于该方法包括以下步骤:
(a)使反应混合物中的环式模板和一个或多个引物结合,该引物至少与环式模板的一个链互补从而形成模板-引物复合物;
(b)以至少一种高保真核酸聚合酶培育模板-引物复合物以产生含有串联排列的环式模板单位的多联体;以及
(c)将多联体切割成较小的至少包含一个具有目的基因的送递单位(delivery unit)。
2、根据权利要求1所述的在无细胞体系中制造高质量核酸的方法,其特征在于其进一步包括:
(d)通过以下步骤中的一个或多个处理较小片段:填充或者除去较小片段的末端;连接较小片段的末端以产生环化的较小片段;以及超螺旋化环化的较小片段。
3、根据权利要求1或2所述的在无细胞体系中制造高质量核酸的方法,其特征在于其进一步包括:
修饰较小的片段或环化的较小片段以产生修饰的末端和/或修饰的内部碱基。
4、根据权利要求1-3中任一项权利要求所述的在无细胞体系中制造高质量核酸的方法,其特征在于其进一步包括:
将较小片段或环化的较小片段与肽结合。
5、根据权利要求1-4中任一项权利要求所述的在无细胞体系中制造高质量核酸的方法,其特征在于其中所述的送递单位(delivery unit)包含一个或多个表达盒。
6、根据权利要求1-5中任一项权利要求所述的在无细胞体系中制造高质量核酸的方法,其特征在于其中所述的高保真度核酸聚合酶是Phi29DNA聚合酶或其衍生物。
7、根据权利要求1-5中任一项权利要求所述的在无细胞体系中制造高质量核酸的方法,其特征在于其中所述的高保真度核酸聚合酶是选自下列聚合酶中的一种:DNA聚合酶I,DNA聚合酶III,T3 DNA聚合酶,T4 DNA聚合酶,T5 DNA聚合酶,T7聚合酶,以及它们的衍生物。
8、根据权利要求1-7中任一项权利要求所述的在无细胞体系中制造高质量核酸的方法,其特征在于其中所述的切割多联体是通过使用限制酶完成的。
9、一组合物,其特征在于该组合物包含通过权利要求1-8中任一项权利要求的方法制备的送递单位(delivery unit)。
10、由权利要求1-8中任一项权利要求的方法制备的送递单位(delivery unit)在制造预防或治疗疾病或人类、动物或植物的遗传病中的用途。
11、根据权利要求10所述的用途,其特征在于其中所述的疾病是由下列病毒中的一个引起的:HIV,流感病毒(influenza virus),副流感病毒(parainfluenza virus),腺病毒(adenovirus),冠状病毒(corona virus),单纯疱疹病毒(herpes simplex virus),带状疱疹病毒(herpes zostervirus),乳头瘤病毒(papilloma virus)以及鼻病毒(rhino virus)。
12、根据权利要求10所述的用途,其特征在于其中所述的疾病是由细菌(bacteria)、分枝杆菌(mycobacteria)、真细菌(eubacteria)或真菌(fungi)引起的。
13、由权利要求1-8中任一项权利要求的方法制备的送递单位(delivery unit)或权利要求9所述的组合物在人类或动物免疫中的用途。
14、根据权利要求13所述的用途,其特征在于其中所述的送递单位(delivery unit)或组合物是通过定向注射、气雾剂、脂质体或病毒衍生颗粒(virus derived particle)送递。
15、一种制造高质量核酸的装置,其特征在于该装置包含:
一个能不断可证实地保证cGMP(certified Good ManufacturingPractice)质量的反应容器,其具有至少一个入口和一个出口;
一与入口连接的输入设备并且该设备从一外部储存腔(outsideholding chamber)向反应容器中加进至少一外部组分;
至少一连接于输入设备的外部储存腔;
一种将外部组分从储存腔通过输入设备泵入反应容器的工具;
一与反应容器出口连接的输出设备;
至少一连接于输出设备的外部接收腔(outside receiving chamber);
一调节反应容器温度的工具;
一监控混合反应容器中反应混合物进程的工具;以及
一混合反应混合物的工具。
16、根据权利要求15所述的装置,其特征在于其中所述的反应容器或者是由柔韧性的材料制成的,其中混合工具应用于容器的外部;或者是硬化的预成型的材料制成的,其中混合工具应用于容器的内部。
17、根据权利要求15或16所述的装置,其特征在于其中所述的泵包含蠕动泵。
18、根据权利要求15、16或17中任一项权利要求所述的装置,其特征在于其中所述的输入设备可与输出设备相连通以促进反应混合物在反应容器中流通。
19、根据发权利要求15、16或17中任一项权利要求所述的装置,其特征在于其中所述的容器进一步包含一第二入口和一第二出口,且其中具有泵送反应混合物的工具的流通设备将第二入口与第二出口连接起来。
20、根据权利要求18所述的装置,其特征在于其中所述的流通设备包含一从外部储存腔(outside holding chamber)将至少一外部组分加入至包含于流通设备中的反应混合物中的工具。
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