CN109072244A - 使用滚环扩增产物的无细胞蛋白质表达 - Google Patents

使用滚环扩增产物的无细胞蛋白质表达 Download PDF

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Abstract

提供用于从RCA产物体外转录和翻译的方法。所述方法包括提供双链RCA产物，其中双链RCA产物基本上由最小表达序列的串联重复组成。所述方法进一步包括在无细胞表达系统中从双链RCA产物表达蛋白。

Description

使用滚环扩增产物的无细胞蛋白质表达
序列表
本申请包含序列表，其已经以ASCII格式电子提交，并通过引用以其整体结合到本文中。所述ASCII副本，创建于2016年4月26日，命名为285524-1_SL.txt，大小为11,010字节。
发明领域
本发明一般地涉及通过滚环扩增具有最小表达序列的脱氧核糖核酸(DNA)小环，产生滚环扩增产物。其进一步涉及改进的无细胞蛋白表达系统，所述系统涉及体外转录和翻译滚环扩增产物。
背景
无细胞蛋白表达系统提供用于在没有细胞培养、细胞工程改造或细胞转染的复杂情况下产生蛋白的简单和有效方法。用于表达重组蛋白的无细胞系统解决基于细胞的表达系统的各种限制，例如蛋白毒性、蛋白降解、蛋白聚集和错误折叠、不受控的翻译后修饰或由于隔离细胞机器导致的蛋白表达对细胞生长的负面作用。使用无细胞蛋白表达系统，显著更高量的蛋白可在较短的时期内表达，其可用于下游高通量结构和功能分析。这种体外蛋白表达还在以下方面具有显著优势：费用节省、流水线生产、更容易放大和简化纯化。在无细胞蛋白表达系统中，期需的目的蛋白通过将编码目的蛋白的基因的DNA或RNA加入有能力转录-翻译的细胞提取物，和进行目的基因的转录和/或翻译进行表达。转录和翻译可在单一反应中偶联，以使得能够将新合成的mRNA立即翻译成蛋白(偶联的体外转录-翻译系统，或在无细胞系统中偶联的转录-翻译)。偶联的体外转录和翻译一般增加所表达的蛋白的产量，伴随较少的时间和体外操作。立即翻译mRNA避免与mRNA降解和错误折叠相关的可能的不利作用。
体外转录-翻译系统的一个限制为其需要大量(一般微克量)的DNA模板。一般地，足够量的DNA可通过多个工作流步骤和显著的劳动力获得，例如通过将DNA克隆入质粒载体和在宿主细胞(例如，大肠杆菌(E. coli))中扩增质粒或通过从多重聚合酶链反应(PCR)合成DNA。然而，PCR常常不适合大规模产生高质量DNA，这部分上是因为PCR的高突变率。另外，由于在大体积中温度可变速的程度的限制，PCR反应的热循环难以放大为较大的反应。此外，PCR产物为线性DNA序列，其可通过无细胞转录-翻译提取物中存在的核酸酶的作用迅速降解。此外，将目的基因亚克隆入质粒载体接着通过遗传选择在大肠杆菌中大规模扩增是耗时并且劳动密集的。
等温DNA扩增技术例如滚环扩增(RCA)可用来以较少的精力、时间和花费从环状核酸模板开始，产生大量的高质量DNA。滚环扩增反应为等温的，使得放大至较大的反应规模简单，这是因为不需要迅速加热和冷却。滚环扩增产生RCA产物，其为模板核酸序列的串联重复单元(多联体)。质粒DNA的RCA接着偶联的体外转录和翻译可能产生目的蛋白。然而，这些质粒经由涉及在宿主细胞例如大肠杆菌中遗传选择的标准克隆方法建立。因此这样的质粒包含许多额外的编码和非编码序列，包括用于复制起点的序列(例如，oriC)、用于抗生素选择的序列(例如对于β-内酰胺酶，amp)，和用于在宿主细胞中选择和/或筛选质粒的附属序列，例如lacZ，β-半乳糖苷酶。相对于精心亚克隆入质粒的目的基因，这些辅助序列的转录和/或表达不期需，或可认为无效。因此，质粒内目的基因的PCR扩增常常用于无细胞蛋白表达。
存在对改进的体外转录和翻译系统的需求，用于容易地产生从任选无任何无关序列和宿主细胞污染物并且不需PCR合成的DNA转录和翻译的期需蛋白。同样，期需使用简化和省时的方法增加无细胞蛋白系统的产量。
概述
在一些实施方案中，提供用于使用RCA产物体外转录和翻译的方法。所述方法包括步骤(a) 提供双链滚环扩增(RCA)产物，其中所述双链RCA产物基本上由最小表达序列的串联重复组成，和(b) 在无细胞表达系统中从双链RCA产物表达蛋白。最小表达序列基本上由启动子、开放阅读框、核糖体结合位点和翻译终止序列组成。
在一些实施方案中，提供用于使用DNA小环体外转录和翻译的方法。所述方法包括步骤(a) 提供脱氧核糖核酸(DNA)小环，其中所述DNA小环基本上由最小表达序列组成，(b)通过DNA小环的滚环扩增产生双链滚环扩增(RCA)产物，和(c) 在无细胞表达系统中从双链RCA产物表达蛋白。最小表达序列基本上由启动子、开放阅读框、核糖体结合位点和翻译终止序列组成。
图
本发明的这些和其它特征、方面和优点将会在参考附图阅读下列详述时更好地得到理解。
图1说明使用衍生自小环的RCA产物的体外转录和翻译方法的实施方案的图示。
图2说明使用不同的引物和反应条件从DNA小环衍生的RCA产物的产量。
图3说明与PCR-扩增的DNA模板相比，当衍生自DNA小环的RCA产物用于体外转录和翻译时增加的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达，其中EGFP编码区域使用前后密码子偏好设计。
图4说明与PCR-扩增的DNA模板相比，当衍生自DNA小环的RCA产物用于体外转录和翻译时增强的EGFP表达，其中EGFP编码区域使用单个密码子偏好设计。
图5说明通过使用衍生自DNA小环的RCA产物(含有或不含硫化核苷酸)和无任何硫化核苷酸的PCR-扩增的DNA的体外转录和翻译，EGFP表达的产量。
图6说明通过使用衍生自DNA小环的RCA产物(含有或不含硫化核苷酸)和无任何硫化核苷酸的PCR-扩增的DNA的体外转录和翻译，EGFP表达的产量。
图7描绘SDS-PAGE凝胶，其说明与PCR扩增的DNA模板和无模板对照(NTC)表达反应相比，使用衍生自DNA小环的RCA产物通过偶联的体外转录和翻译，BODIPY-标记的人白细胞介素2 (IL-2, ~16kD)的表达。
图8说明通过图7的图像密度测定，IL-2的无细胞表达产量。
图9说明与衍生自质粒DNA的RCA产物相比，通过体外转录和翻译从具有最小表达序列的DNA小环产生的RCA产物，EGFP的表达增强。
详述
下列详述为示例性的，不意在限制本发明或本发明的用途。遍及说明书，特定术语的例示应认为是非限制性的实例。单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数参考，除非上下文另有清楚指示。如在本文中遍及说明书和权利要求书所使用的，近似语言可应用于修饰任何定量表示，其在不导致与其相关的基础功能改变的情况下可允许变化。相应地，由术语例如“约”所修饰的值不限于所指定的精确值。除非另有说明，说明书和权利要求书中所使用的表述成分的量、性质例如分子量、反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下被术语“约”修饰。相应地，除非表明相反，下列说明书和所附的权利要求书中所阐述的数字参数为近似值，其可根据试图通过本发明获得的期需性质而不同。必要时，提供范围，并且那些范围包含其间的所有子范围。为了更清楚和简明地描述和指出所要求的发明的主题，下列定义为下列描述和所附权利要求书中使用的特定术语而提供。
如本文所使用的，术语“核苷”指葡基胺化合物，其中核酸碱基(核碱基)与糖部分连接。“核苷酸”指核苷磷酸。核苷酸可使用其核苷所对应的字母(字母名称)表示，如表1中所描述的。例如，A表示腺苷(包含核碱基腺嘌呤的核苷)，C表示胞苷，G表示鸟苷，U表示尿苷，T表示胸苷(5-甲基尿苷)。W表示A或T/U，S表示G或C。N表示随机核苷，dNTP指脱氧核糖核苷三磷酸。N可为A、C、G或T/U的任何一个。
表1：各种核苷酸的字母名称
符号字母 符号字母代表的核苷酸
G G
A A
T T
C C
U U
R G或A
Y T/U或C
M A或C
K G或T/U
S G或C
W A或T/U
H A或C或T/U
B G或T/U或C
V G或C或A
D G或A或T/U
N G或A或T/U或C
如本文所使用的，术语“核苷酸类似物”指与天然存在的核苷酸结构上类似的化合物。核苷酸类似物可具有改变的磷酸骨架、糖部分、核碱基或其组合。核苷酸类似物可为天然核苷酸、合成的核苷酸、修饰的核苷酸或替代置换部分(例如，肌苷)。一般地，具有改变的核碱基的核苷酸类似物特别赋予不同的碱基配对和碱基堆积性质。如本文所使用的，术语“LNA(锁核酸)核苷酸”指核苷酸类似物，其中核苷酸的糖部分包含锁在核糖核酸(RNA)-模仿糖构象中的二环呋喃糖单元。从脱氧核糖核苷酸(或核糖核苷酸)到LNA核苷酸的结构变化从化学角度受到限制，即在2’位置和4’位置的碳原子之间引入额外的连键(例如，2’-C, 4’-C-氧基亚甲基连键；参见，例如，Singh, S. K.,等人, Chem. Comm., 4, 455−456, 1998，或Koshkin, A. A.,等人, Tetrahedron, 54, 3607−3630, 1998)。LNA核苷酸中呋喃糖单元的2’和4’位置可通过O-亚甲基(例如，氧-LNA: 2'-O, 4'-C-亚甲基β-D-呋喃核糖基核苷酸)、S-亚甲基(硫-LNA)或NH-亚甲基部分(氨基-LNA)等连接。这样的连键限制呋喃糖环的构象自由。LNA寡核苷酸显示对互补的单链RNA和互补的单链或双链DNA的杂交亲和性提高。LNA寡核苷酸可诱导A-型(RNA样)双链体构象。具有改变的磷酸-糖骨架的核苷酸类似物(例如，PNA、LNA)常常特别改变链性质，例如二级结构形成。字母名称前的星号(*)符号表示该字母指定的核苷酸为硫代磷酸酯修饰的核苷酸。例如，*N代表硫代磷酸酯修饰的随机核苷酸。字母名称前的加号(+)符号表示该字母指定的核苷酸为LNA核苷酸。例如，+A代表腺苷LNA核苷酸，+N代表锁定的随机核苷酸(即，随机的LNA核苷酸)。
如本文所使用的，术语“寡核苷酸”指核苷酸的寡聚体。如本文所使用的术语“核酸”指核苷酸的聚合物。如本文所使用的术语“序列”指寡核苷酸或核酸的核苷酸序列。遍及说明书，在寡核苷酸或核酸通过字母序列表示时，核苷酸从左至右为5´→3´次序。例如，字母序列(W)x(N)y(S)z (其中x=2，y=3和z=1)表示的寡核苷酸代表寡核苷酸序列WWNNNS，其中W为5’端核苷酸，S为3’端核苷酸。寡核苷酸或核酸可为DNA、RNA或其类似物(例如硫代磷酸酯类似物)。寡核苷酸或核酸可还包含修饰的碱基和/或骨架(例如，修饰的磷酸连键或修饰的糖部分)。赋予核酸稳定性和/或其它优点的合成骨架的非限制性实例可包括硫代磷酸酯连键、肽核酸、锁核酸、木糖核酸或其类似物。
如本文所使用的，术语“引物”指短的线性寡核苷酸，其与靶核酸序列(例如，待扩增的DNA模板)杂交以引发核酸合成反应。引物可为RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或嵌合序列。引物可包含天然的、合成的或修饰的核苷酸。引物长度的上限和下限二者均经验确定。引物长度的下限为当在核酸扩增反应条件下与靶核酸杂交时形成稳定双链体所需的最小长度。非常短的引物(通常小于3个核苷酸长)在这样的杂交条件下不与靶核酸形成热力学稳定的双链体。上限常常通过在靶核酸中除了预定的核酸序列以外的区域具有双链体形成的可能性确定。一般地，合适的引物长度在约3个核苷酸长-约40个核苷酸长的范围内。
如本文所使用的，术语“随机引物”指引物序列的混合物，其通过以使给定位置可由任何可能的核苷酸或其类似物组成(完全随机化)的方式，随机化寡核苷酸序列的任何给定位置处的核苷酸产生。因此随机引物为寡核苷酸序列的随机混合物，其由序列中每一可能的核苷酸组合组成。例如，六聚体随机引物可通过序列NNNNNN或 (N)6表示。六聚体随机DNA引物由4个DNA核苷酸A、C、G和T的每一可能的六聚体组合组成，导致包含46 (4,096)个独特的六聚体DNA寡核苷酸序列的随机混合物。当靶核酸的序列未知或用于进行全基因组扩增反应时，随机引物可有效用于引发核酸合成反应。随机引物还可有效引发和产生双链滚环扩增(RCA)产物，而不是单链RCA产物，这取决于引物的浓度。
如本文所使用的，术语“滚环扩增 (RCA)”指经由滚环机制扩增环状核酸模板(例如，单/双链DNA环)的核酸扩增反应。滚环扩增反应由引物与环状(常常单链)核酸模板杂交启动。核酸聚合酶然后通过环绕环状核酸模板连续前进以反复不断地复制核酸模板序列(滚环机制)，延伸与环状核酸模板杂交的引物。滚环扩增通常产生包含环状核酸模板序列的串联重复单元的多联体。滚环扩增可为线性RCA (LRCA)，显示线性扩增动力学(例如，使用单一特异性引物的RCA)，或可为指数RCA (ERCA)，显示指数扩增动力学。滚环扩增也可使用多个引物进行(多重引发的滚环扩增或MPRCA)，导致高分支的多联体。例如，在双重引发的RCA中，一个引物可与环状核酸模板互补(如在线性RCA中)，而另一个可与RCA产物的串联重复单元核酸序列互补。因此，双重引发的RCA可作为具有指数扩增动力学的链反应进行，具有涉及两个引物和两条链的系列多重杂交、引物延伸和链置换事件的级联的特征。这常常产生多联的双链核酸扩增产物的离散集合。RCA可在等温条件下使用合适的核酸聚合酶例如Phi29 DNA聚合酶体外进行。合适的聚合酶具有链置换DNA合成能力。
一个或多个实施方案涉及用于在无细胞表达系统(例如，体外转录和翻译系统)中表达蛋白的方法。在一个实施方案中，蛋白通过体外转录和翻译通过滚环扩增产生的RCA产物表达。这些体外转录和翻译反应产生缺乏任何完整细胞的蛋白。产生这样的蛋白在包括结构和功能蛋白组学在内的大量应用中可为期需的。这种蛋白的无细胞表达对于治疗应用可为特别需要的。
无细胞表达一般包括两种模式：(1) mRNA和蛋白在单一反应中制造，或(2) mRNA在第一个反应中制造，将所得的mRNA产物加入第二个单独的翻译反应。衍生自DNA小环的RCA产物可用于任一模式，(1)或(2)。例如，在一个实施方案中，RCA产物可提供给“偶联的体外转录-翻译反应”，其中在包括产生mRNA和蛋白两种能力的一个反应混合物中RCA产物DNA转变为mRNA并且mRNA同时表达为蛋白。在另一个实施方案中，RCA产物可提供给“连接的转录-翻译反应”，其中RCA产物DNA首先转变为mRNA，将mRNA单独加入翻译反应混合物中以表达蛋白。
提供用于从双链RCA产物体外转录和翻译的方法的一个或多个实施方案。在一个示例性的实施方案中，所述方法包括提供双链RCA产物和在无细胞表达系统中从双链RCA产物表达蛋白的步骤。双链RCA产物基本上由最小表达序列的串联重复组成，其中最小表达序列基本上由启动子、开放阅读框、核糖体结合位点和翻译终止序列组成。
如所指出的，双链RCA产物基本上由最小表达序列的串联重复组成。最小表达序列至少包括启动子、开放阅读框、核糖体结合位点和转录终止序列。其可额外包含不显著影响RCA产物的体外转录和/或翻译的序列。例如，其可进一步包含序列，例如翻译增强子序列、绝缘子序列或转录终止序列。然而，最小表达序列和所得的双链RCA产物不包含可负面影响RCA产物的体外转录和翻译的任何额外序列。例如，RCA产物排除任何无关序列，例如复制起点、抗生素选择基因或在宿主细胞中克隆、选择、筛选和/或复制所需的任何其它附属序列。RCA产物中这种无关序列的存在将会显著影响在无细胞蛋白表达中的转录和/或翻译。
最小表达序列为包含特定目的基因的核酸序列。最小表达序列可还包含表达特定目的基因所需的最小遗传元件或序列(例如，启动子序列或增强子序列)。在一个或多个实施方案中，最小表达序列基本上由启动子、开放阅读框、核糖体结合位点和翻译终止序列组成。合适的启动子的很多实例为本领域所已知，包括，例如，T7 RNA聚合酶启动子序列。同样地，合适的核糖体结合位点的很多实例为本领域所已知，包括例如内部核糖体进入位点(IRES)、polyA段、物种-非依赖性翻译前导区(SITS)、Kozak共有序列和Shine-Dalgarno序列。如上文所指出的，最小表达序列可额外包含不显著影响RCA产物的体外转录和翻译的元件。例如，在一些实施方案中，最小表达序列可额外地包含翻译增强子序列、绝缘子序列、转录终止序列或其组合。在所述方法的一个实施方案中，最小表达序列基本上由启动子、开放阅读框、核糖体结合位点、翻译终止序列和绝缘子序列组成。绝缘子序列一般增强核糖体结合或翻译起始的效率。合适的绝缘子序列的很多实例在本领域存在，包括例如，编码聚组氨酸段的序列。在一些实施方案中绝缘子序列可通过在核糖体结合位点周围插入间隔序列或通过优化或插入在所表达的蛋白的N端内的密码子，经验上确定。最小表达序列可进一步包含前启动子序列、用于蛋白酶切割或核苷酸切割的序列、用于蛋白纯化的序列或其组合。选择最小表达序列以致于其不包含阻碍或抑制期需蛋白产物的转录和/或翻译或在其它方面使得蛋白产生更麻烦的任何序列。
在一个或多个实施方案中，RCA产物从作为模板的DNA小环产生，其中DNA小环基本上由最小表达序列组成。RCA产物可为线性或分支的多联体，其中多联体包含衍生自DNA小环的最小表达序列的串联重复。在优选的实施方案中，RCA线性多联体为双链的。如所指出的，DNA小环基本上由最小表达序列组成，这意指DNA小环仅包含最小表达序列，排除最小表达序列以外的任何序列，例如任何无关序列。因此，包含最小表达序列的DNA小环的扩增可仅在细胞外完成。
“无关序列”包括非编码或表达期需蛋白所必需的序列。无关序列可包括用于在宿主细胞中选择、筛选和/或扩增质粒的附属序列，例如lacZ，β-半乳糖苷酶。无关序列可包括用于复制起点、抗生素选择基因、用于插入基因的适当限制位点(例如多克隆位点)或其组合的序列。无关序列可进一步包括克隆入宿主细胞或在宿主细胞中检测所需的任何其它序列。
在一个或多个实施方案中，最小表达序列的开放阅读框包含密码子优化的序列、纯化标签序列、蛋白酶切割位点或其组合。为了产生密码子优化的序列，密码子偏倚、前后密码子偏好和/或单个密码子偏好为一般考虑的因素。
开放阅读框的密码子优化的序列可提高RCA产物翻译的速率或质量。密码子优化一般通过增加目的基因的翻译效率来改进蛋白表达。基因的功能性也可通过优化定制设计的基因内的密码子使用来增加。在密码子优化实施方案中，在物种中低频率的密码子可用高频率的密码子代替，例如，对于亮氨酸，低频率的密码子UUA可用高频率的密码子CUG代替。密码子优化可增加mRNA稳定性，并因此改变蛋白翻译或蛋白折叠的速率。此外，密码子优化可定制转录和翻译控制，修饰核糖体结合位点或稳定mRNA降解位点。
在一个实例中，密码子优化RCA产物54 (衍生自编码人IL-2的SEQ ID No. 8的DNA小环，其具有转录终止序列和对于每一单个密码子进行密码子优化)之后观察到意外的高分子量蛋白(26kD-72kD)表达(图7)。在图7中所提供的实施例中，RCA产物的最小IL2表达序列或PCR扩增的对照DNA(衍生自SEQ. ID. No. 7和SEQ. ID. No. 8)事实上是相同的，除了IL-2开放阅读框中的密码子使用。SEQ ID No.8根据JCat工具[Grot等人, Nucleic AcidsRes. Jul 1, 2005; 33 (Web Server issue: W 526-531). JCat: a novel tool toadapt codon usage of a target gene to its potential expression host.]进行密码子优化，其将靶基因中的单个密码子使用最大化为表达宿主的密码子偏好。相反，SEQ IDNo. 7基于从人IL-2的天然编码序列开始的密码子优化过程前后适应，其中仅特定位点重新编码。IL-2的编码序列包含两个二赖氨酸重复，通过JCat工具将其重新编码为polyA段，因为AAA密码子在大肠杆菌中明显比AAG偏好。这些二赖氨酸重复通过前后密码子优化过程在SEQ ID No. 7中实质上未重新编码。AAAAAA段通常称为核糖体滑动序列，其可移码翻译的产物(Yan等人, Cell.160:870-81, 2015)和通过核糖体失速施加额外的翻译控制(Arthur等人, Sci Adv.1: e1500154, 2015)。对于编码IL2的线性DNA模板，这样的移码可改变翻译产物，以致于下游翻译终止密码子读通。然而，由于线性DNA模板为有限的，相应的mRNA转录物也有限，核糖体最终到达信使末端(移码后)并失速，而不释放翻译产物。在实施例中，衍生自从SEQ ID No. 8产生的DNA小环的RCA产物，作为包含AAAAAA核糖体滑动序列的串联IL2重复序列的多联体的RCA产物。当多顺反子失控产物通过读通转录终止子序列从RCA产物转录时，则相应的多顺反子信使中的核糖体滑动序列促成翻译终止密码子的额外读通。因此，多顺反子信使产生高分子量的翻译产物，其不是IL-2，而是脱靶的、高分子量并且是不期需的。事实上，RNA聚合酶的转录终止由于多种因素高度无效，这些因素包括影响RNA折叠的序列特异性参数和环境参数。一般地，T7 RNA聚合酶在衍生自大肠杆菌rrnB操纵子的I/II类转录终止序列处仅以52%的效率终止，并且转录终止的效率作为增加的dNTP浓度的函数下降。因此图8和9中呈现的数据显示在偶联的转录-翻译反应中顺反子或多顺反子mRNA的串联重复从RCA产物模板广泛产生(尽管存在转录终止序列)，相应的mRNA可被核糖体有效或无效加工，部分上取决于密码子使用，这最终增强或减少无细胞蛋白产量，取决于信使中的下游顺反子是否被适当设计。
在密码子优化的另一个实例中，SEQ ID No.2和SEQ ID No.4包含根据JCat工具密码子优化的EGFP开放阅读框，JCat工具将靶基因的单个密码子使用最大化为表达宿主的密码子偏好。此外，SEQ ID No.1和SEQ ID No.3包含EGFP的开放阅读框，其基于下列过程前后适应：从EGFP的天然编码序列开始，仅特定位点重新编码以避开隐含的起始位点(ATG)、隐含的核糖体结合位点(例如，AGGA、GAGG、GGAG)、II类终止序列[(A、C或T)ATCTGTT]、核糖体滑动序列[NNNYYY，其中Y=(A、T)]和内部ATG甲硫氨酸上游的核糖体暂停位点(例如，AGG、GGA、GAG、GGG、GGT、GTG)。图3和4中呈现的数据说明EGFP的无细胞表达产量部分上受密码子使用影响。
在一些实施方案中，最小表达序列的开放阅读框包含标签序列用于纯化所表达的蛋白。标签序列可为亲和标签、用于蛋白酶切割的标签或其组合。亲和标签可用于迅速纯化和检测重组蛋白。亲和标签可包括聚组氨酸标签(his6 (SEQ ID NO: 9))、谷胱甘肽S-转移酶标签(GST)、血细胞凝集素(HA)、myc (衍生自c-myc基因产物)、FLAG (由八个氨基酸Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO: 10)组成，包含肠激酶切割位点)或其组合。尽管融合标签帮助迅速纯化或检测期需蛋白，但标签可能不认为是重组蛋白的永久附属或结构域。因此，对于重组蛋白结构和功能的高度分析研究常常需要移除融合标签。用于纯化的标签可通过使用另一个类型的标签，例如蛋白酶切割标签从蛋白移除。蛋白酶切割标签可用于切割特定蛋白或肽序列内的不同的肽键。蛋白酶切割标签可包括，例如PreScissionProtease标签(GE Healthcare)或凝血酶蛋白酶标签(GE Healthcare)。
如所指出的，在一些实施方案中，最小表达序列进一步基本上由转录终止序列组成。转录终止序列一般位于DNA模板中基因的3’端。转录终止序列在新合成的mRNA中提供信号以启动从转录复合体释放mRNA的过程，其还可帮助有效翻译期需的蛋白产物。
在衍生自小环的RCA产物中无效转录终止的作用与衍生自质粒DNA的RCA产物相比很大程度上无关紧要。在一些情况下，包含目的基因的质粒DNA必须使用限制酶消化以在紧接基因之后创建双链DNA断裂，以防止当RCA产物衍生自质粒时转录超越该点。如果失控转录发生，包含许多编码和非编码序列(包括用于复制起点的序列、用于抗生素选择的序列和用于在宿主细胞中选择、筛选和/或扩增质粒的附属序列)的质粒的其它部分将被转录。当以未消化的状态使用时，衍生自质粒DNA的RCA产物经由转录读通可能产生不想要的mRNA种类，这具有与目的蛋白一起(或以比目的蛋白更大的量)产生蛋白污染物的风险。然而，在衍生自小环的RCA产物中差转录终止仍可准确产生mRNA。因此，与衍生自质粒的RCA产物或PCR扩增的质粒DNA相比，来自衍生自DNA小环的RCA产物的无细胞蛋白的产量更好。相似的表达益处甚至在衍生自DNA小环的RCA产物完全缺乏转录终止序列时观察到，这是出乎意料的结果。这在不同的实施例中说明，例如实施例2和3，结果在图3、4和6中描绘。对于图3和4中提供的实施例，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2编码具有转录终止序列的EGFP，而SEQ ID No.3和SEQ ID No.4编码无转录终止序列的EGFP。与PCR扩增的DNA产物26 (衍生自SEQ ID No.3)相比，RCA产物22 (衍生自SEQ ID No.3的DNA小环)产生更高的EGFP表达，并且来自RCA产物22 (衍生自SEQ ID No.3的DNA小环)的总体EGFP产量与PCR扩增的DNA产物24 (衍生自SEQID No.1)相当(图3)。对于EGFP使用不同的密码子优化策略，RCA产物30 (衍生自SEQ IDNo.4的DNA小环)产生比PCR扩增的DNA产物32 (衍生自SEQ ID No. 2的DNA)或PCR扩增的DNA产物34 (衍生自SEQ ID No.4的DNA)更高量的EGFP (图4)。然而EGFP表达产量使用RCA产物20 (衍生自SEQ ID No. 1的DNA小环)和28 (衍生自SEQ ID No. 2的DNA小环)最大。这些实施例显示尽管转录终止序列对蛋白从PCR扩增的DNA表达必不可少，但其对于从衍生自DNA小环的RCA产物的稳健蛋白表达不必要。这些RCA产物通过产生串联重复的顺反子mRNA种类改进无细胞蛋白表达，其中mRNA的每一顺反子包含期需靶基因。串联重复的顺反子可继而改进mRNA稳定性，特别是当转录终止信号不存在时，并且有助于期需蛋白产物的更高的翻译通量。
在一个或多个实施方案中，所述用于体外转录和翻译的方法使用双链RCA产物作为DNA模板。在这些实施方案中，双链DNA模板的分子内连接产生双链的DNA小环，其用作RCA反应的模板。无细胞转录反应中使用的RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶)一般需要双链DNA启动子序列用于有效结合DNA编码序列。RNA聚合酶与双链DNA启动子序列的有效结合启动有效的转录。因此，促进产生双链RCA产物的RCA反应条件是有效的体外转录和翻译所期需的。
在一些实施方案中，双链RCA产物无需进一步加工而提供给无细胞表达系统。在一个实施方案中，RCA产物在扩增后直接加入无细胞系统中。术语“进一步加工”意指包括RCA产物的限制性消化、连接或其组合的行为。然而，在一些实施方案中，RCA产物可分离(例如，通过沉淀)以从反应介质移除盐或任何其它污染物，例如引物或更小的片段化的DNA，然后使用真核细胞提取物进行无细胞表达。
在一个示例性的实施方案中，双链RCA产物具有最小表达序列的串联重复。在该实施方案中，最小表达序列缺乏DNA在宿主细胞中扩增所需要的任何无关序列。此外，该实施方案的双链RCA产物无需任何限制性消化和/或连接而提供给无细胞表达系统。
来自使用从DNA小环产生的RCA产物的无细胞表达反应的蛋白产量远高于从质粒DNA产生的RCA产物，这在实施例5中详细描述和在图9中描绘。在该实施例中，与RCA产物72 (衍生自包含SEQ ID No.1的质粒)相比，EGFP的无细胞产量在表达RCA产物70 (衍生自编码EGFP并具有转录终止序列的SEQ ID No.1的DNA小环)时提高。此外，在不存在转录终止序列时，相对于RCA产物76 (衍生自包含SEQ ID No.3的质粒DNA)，使用RCA产物74 (衍生自SEQ ID No.3的DNA小环)，EGFP的表达也提高。这些实施例显示在质粒DNA的RCA产物内作为多联体重复的无关序列(例如复制起点、抗生素选择和lacZ选择序列)的存在阻碍期需蛋白靶的无细胞表达。
与通过PCR扩增的核酸相比，衍生自DNA小环的RCA产物的无细胞表达还导致更高的蛋白产量。例如，将EGFP蛋白通过偶联的体外转录和翻译的合成在PCR扩增的DNA和衍生自DNA小环的RCA产物之间比较。分别与使用PCR扩增的DNA 24、26和32、34相比，当RCA产物20、22和28、30表达时提高的EGFP产量在图3和4中示出。
在一些实施方案中，用于体外转录-翻译反应的双链RCA产物包含硫化核苷酸。在这些实施方案中，RCA反应在dNTP混合物中补充有硫化dNTPs，例如α-S-dATP或α-S-dTTP，用于在扩增时向RCA DNA产物中随机掺入硫化碱基。与非硫化的RCA产物相比，无细胞蛋白表达在包含硫化核苷酸的RCA产物用于体外转录和翻译时改进。例如，相对于PCR扩增的DNA产物42 (衍生自SEQ ID No.5的DNA)或非硫化的RCA产物38 (衍生自含AT六聚体的SEQ IDNo.5的DNA小环)或非硫化的RCA产物40 (衍生自含随机六聚体的SEQ ID No.5的DNA小环)，当硫化RCA产物36 (衍生自SEQ ID No.5的DNA小环)表达时，EGFP蛋白产量更高，如图5中所显示的。此外，在其中转录终止序列从EGFP编码序列下游移除的另一个实施例中，与非硫化的PCR扩增的DNA产物48 (衍生自SEQ ID No.6的DNA)或非硫化的RCA产物46 (衍生自含AT六聚体的SEQ ID No.6的DNA小环)相比，当硫化的RCA产物44 (衍生自SEQ ID No.6的DNA小环)表达时无细胞EGFP蛋白产量高得多，如图6中所显示的。
用于无细胞蛋白表达的本方法包括体外转录和体外翻译。体外转录反应使用双链RCA产物，其中双链RCA产物基本上由最小表达序列的串联重复组成。最小表达序列包含启动子序列。启动子序列存在于待转录的目的基因的上游(5’)。DNA依赖的RNA聚合酶结合双链DNA启动子区域以启动基因转录。各种合适的RNA聚合酶为本领域所已知，包括仅具有一个亚基的那些(例如，来自噬菌体样T3和T7以及线粒体的那些)以及衍生自细菌和真核生物的多结构域RNA聚合酶。RNA聚合酶可进一步需要额外的蛋白辅因子用于有效转录。
在无细胞翻译反应的一些实施方案中，生物分子翻译机器从细胞提取并用于体外翻译。在一个或多个实施方案中，密码子优化的开放阅读框序列提高翻译速率。翻译所需的组合物、酶的比例和构件由无细胞提取物提供，或可补充有合成的组分。通过转录合成的mRNA在翻译反应中表达，这在无细胞提取物中产生靶蛋白。在体外表达反应的一些实施方案中，蛋白合成在无细胞提取物中而不是在培养的细胞内发生(来自细胞的提取材料在本文中可称为“无细胞提取物”或“细胞提取物”)。细胞提取物一般包含细胞的细胞溶质和细胞器组分。无细胞提取物可提供无细胞转录和翻译所需要的所有或大多数分子，例如用于翻译的核糖体、tRNA和氨基酸、酶的辅因子和能量源以及蛋白折叠所必需的细胞组分。
在一些实施方案中，无细胞表达系统包含原核细胞提取物、真核细胞提取物或其组合。在又一个实施方案中，无细胞表达系统从各个纯化的组分配制。在一个实施方案中，为了无细胞蛋白表达开发的细胞提取物衍生自原核生物。在该实施方案中，衍生自RCA产物DNA的mRNA可加入原核提取物中，或在其中产生，以表达蛋白。能够支持翻译的原核提取物可衍生自大肠杆菌。在一些其它的实施方案中，细胞提取物衍生自真核细胞，例如原生动物、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或人细胞。在这些实施方案中，衍生自RCA产物DNA的mRNA可加入真核细胞提取物，例如，兔网织红细胞裂解物(RRL)、小麦胚提取物、昆虫细胞裂解物(例如SF9或SF21)、哺乳动物裂解物(例如CHO)、人裂解物(例如HeLa)或原生动物裂解物(例如利什曼原虫(Leishmania))，或在其中产生。衍生自真核系统的无细胞提取物包含有效蛋白合成所需的必需细胞大分子，例如核糖体、翻译因子和tRNAs，其中能量源和氨基酸可能需要补充。
在一个示例性的实施方案中，用于RCA反应的核酸模板为脱氧核糖核酸(DNA)模板。DNA模板可为合成的DNA或天然DNA。DNA模板可为环状DNA模板、线性DNA模板或切口DNA模板。在一些实施方案中，核酸模板为DNA小环模板，并且RCA用于扩增无细胞系统中的DNA小环模板。在一个实例实施方案中，线性核酸模板的环化通过酶促反应，例如，通过用连接酶例如DNA连接酶孵育完成。在一些实施方案中，DNA小环模板包含最小表达序列。在一些实施方案中，DNA小环模板的RCA包含最小表达序列以产生串联重复的DNA序列。所产生的串联重复序列基本上由多个最小表达序列单元组成。用于体外转录-翻译的RCA产物可为完整的、非降解的状态。
滚环扩增反应常常使用试剂例如引物、聚合酶和游离核苷酸(dNTPs)。在一些实施方案中，RCA可通过使双链DNA小环接触包含随机引物混合物的引物溶液以形成核酸模板-引物复合体，使核酸模板-引物复合体接触DNA聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸，和扩增核酸模板进行。扩增反应中使用的核酸聚合酶可为校对核酸聚合酶。RCA可通过使用本领域已知的任何DNA聚合酶进行，包括，但不限于，Phi29 DNA聚合酶。扩增反应混合物可进一步包含额外的试剂例如适当的扩增反应缓冲液。
在一些实施方案中，核酸扩增反应中使用的每一试剂可预先处理以移除任何污染核酸。在一些实施方案中，试剂的预处理包括在紫外辐射的存在下孵育试剂。在一些其它实施方案中，通过在核酸酶和其辅因子(例如金属离子)的存在下孵育试剂来净化试剂。合适的核酸酶包括，但不限于，外切核酸酶，例如外切核酸酶I或外切核酸酶III。在一些实施方案中，用于DNA扩增反应的校对DNA聚合酶可通过在dNTPs不存在下用二价金属离子(例如，镁或锰离子)孵育来净化。
RCA反应可使用随机引物混合物进行。在一些实施方案中，特异性引物用于RCA反应。包含一个或多个核苷酸类似物的引物序列也可使用。在一个或多个实施方案中，RCA使用包含核苷酸类似物的随机引物混合物进行。核苷酸类似物可为肌苷、锁核酸(LNA)核苷酸、肽核酸(PNA)核苷酸、硫化核苷酸、2-氨基-脱氧腺苷、2-硫代-脱氧胸苷、聚阳离子核苷酸、拉链核酸(ZNA)聚阳离子修饰的核苷酸或其组合。在一个或多个实施方案中，随机引物混合物具有序列+N+N(atN)(atN)(atN)*N (AT六聚体引物)。在一些实施方案中，核酸酶-抗性引物(例如，在适当位置包含硫代磷酸酯基团的引物序列)用于扩增反应(例如，NNNN*N*N)。在一些实施方案中，DNA小环的扩增使用随机六聚体或六聚体引物+N+N(at N)(at N)(at N)*N (AT六聚体引物)，其中“N”代表随机核苷酸(即，N可为A、C、G或T/U的任何一个)，“at N”代表包含2-氨基dA、2-硫代-dT、正常G和正常C的随机混合物，字母名称前的加号(+)表示该字母指定的核苷酸为锁核酸(LNA)核苷酸，字母前的星号(*)表示该字母指定的核苷酸为硫代磷酸酯修饰的核苷酸。
扩增反应期间，DNA小环模板在脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)或其修饰的对应物的存在下由聚合酶复制。核酸模板扩增中使用的游离核苷酸可包括天然核苷酸(例如，dATP、dGTP、dCTP或dTTP)，或其修饰的类似物。在一些实施方案中，反应混合物补充有硫化dNTPs。硫化dNTPs可包括但不限于α-S-dGTP、α-S-dCTP、α-S-dATP和α-S-dTTP。硫化dNTPs例如α-S-dATP或α-S-dTTP可加入dNTP混合物中用于向RCA产物中随机掺入硫化碱基。
在一些实施方案中，RCA使用范围为约10 µM-约10 mM的dNTPs终浓度进行。在RCA反应的一个或多个实施方案中，dNTP浓度小于10 mM。在这些实施方案中，dNTPs的浓度保持在10 mM以下以避免从RCA产物形成水凝胶和保持在低于或等于反应缓冲液中存在的二价阳离子(例如镁)的量的浓度。水凝胶形成可在高浓度dNTPs存在下在扩增之后发生，其可进一步复杂化下游操作例如吸液和加工RCA产物。水凝胶形成可在RCA反应中使用50 mM或更高的dNTP浓度时观察到。
RCA可使用市售可得的RCA扩增试剂盒例如illustra™ TempliPhiTMAmplification Kit (GE Healthcare)进行。TempliPhi滚环扩增使用修饰的随机引物，其提供更高的灵敏度和扩增平衡。在一些实施方案中，核酸酶抗性引物用于RCA反应。由于本发明的体外转录和翻译方法需要高浓度的模板DNA，具有更快的动力学和更高产量的更平衡的DNA扩增可使用RCA取得。
各种各样的方法可用于制备用于本发明的方法的DNA小环模板。在一些实施方案中，线性DNA模板可环化以产生DNA小环模板。在一个实例实施方案中，线性DNA模板的环化可通过酶促反应，例如，通过用连接酶例如DNA连接酶孵育实现。在一些实施方案中，线性DNA模板的末端与核酸序列杂交以致于末端极为接近。用连接酶孵育可然后实现杂交的线性DNA模板环化以产生DNA小环。合适的DNA小环模板还可通过使用适当的PCR引物，PCR扩增较大DNA (例如，基因组DNA或来自DNA文库的DNA)的一部分，接着环化PCR产物产生。DNA小环也可通过化学合成适当的线性寡核苷酸，接着环化合成的寡核苷酸产生。在一些实施方案中，合成的线性寡核苷酸可基本上由最小表达序列组成，并经由DNA连接酶达到环化以产生DNA小环。
一种或多种方法可进一步包括纯化、分析和/或定量DNA小环的步骤。分离或纯化dsDNA小环和/或移除污染物例如酶或未连接的DNA形式可在扩增反应之前进行。用于纯化、分析或定量核酸的任何适当的技术均可使用。非限制性实例包括沉淀、过滤、亲和捕获、凝胶电泳、测序或HPLC分析。例如，环状核酸的纯化可通过亲和捕获达到。在一些实施方案中，所述方法可进一步包括处理产生的DNA小环。产生的DNA小环的后处理可根据预期用途而不同。
实施例：
除非另有说明，实施例中描述的成分从常见的化学品供应商市售可得。实施例部分中使用的一些缩写扩展如下：“mg”：毫克；“ng”：纳克；“pg”：皮克；“fg”飞克；“mL”：毫升；“mg/mL”：毫克每毫升；“mM”：毫摩尔的；“mmol”：毫摩尔；“pM”：皮摩尔的；“pmol”：皮摩尔；“μL”：微升；“min”：分钟和“h”：小时。
图1为使用衍生自DNA小环的RCA产物的体外转录和翻译方法的一般性实施方案之一的图示。将基本上由最小表达序列12组成的DNA表达构建体10通过连接反应环化以产生DNA小环14。DNA小环14通过RCA扩增。扩增反应产生多联体RCA产物16，其具有包含最小表达序列12的表达构建体10的串联重复单元，缺乏任何无关序列。正因如此，DNA小环不适合在细胞内扩增。RCA产物16然后在体外转录-翻译反应中表达。在一些实施例中，DNA小环14的最小表达序列包含转录终止序列。从这样的DNA小环形成的RCA产物将在每一串联重复中具有转录终止序列。随后，从该实施例的RCA产物16产生的mRNA 17可在每一串联重复单元的转录终止序列处终止。然而，如果任何一个转录终止序列的读通发生(例如mRNA 18)，下游mRNA序列仍编码预期的蛋白靶。在一些其它实施例中，DNA表达构建体10的最小表达序列不包含转录终止序列。从这种实施例的RCA产物产生的mRNA 18不在每一串联重复单元处得到终止，因此转录持续通过RCA产物的多个串联重复序列。然而，在任一情况下，因为DNA表达构建体10中存在翻译终止序列，mRNA翻译为具有期需序列19的蛋白。
实施例1：DNA小环的滚环扩增
产生DNA小环：
EGFP和人白细胞介素-2 (IL-2)的最小表达序列用计算机设计并体外合成。所有这些表达序列包含T7启动子和+1序列(所得的mRNA的5’非翻译区的第一个核碱基位置)以及随后的T7 phi10启动子茎环序列。各种各样的额外的非编码和编码参数在设计最小表达序列期间包括在内，包括：T7前启动子序列、核糖体结合序列、用于增强核糖体结合的绝缘子序列、用于增强核糖体启动的绝缘子序列、转录终止序列、翻译起始和终止序列、前导序列蛋白酶切割位点和密码子优化。具有这些参数的代表性的最小表达序列作为SEQ ID No. 1-8列出(表2)。序列大小范围为655 – 970个碱基对。
表2：各个最小表达序列的序列
合成线性双链DNA (GenScript, Inc.)，在5’和3’两个末端具有独特的限制位点(分别为BamHI和BglII)。为了创建DNA小环，将dsDNA用两种内切核酸酶消化以产生互补的粘性悬突。将该消化的DNA使用T4 DNA连接酶连接。限制性消化和连接步骤使用包含20 U BamH1、10 U BglII、400 U T4连接酶、1 mM ATP、100 µg/mL牛血清白蛋白(BSA)、100 mM NaCl、10mM MgCl2、50mM Tris-HCl pH 7.5和10 mM二硫苏糖醇(DTT)的反应混合物，序贯(例如，在不同的管中)或同时(例如，在同一管中)进行。将所有的连接产物(DNA小环)随后用外切核酸酶I和外切核酸酶III处理以消化任何剩余的线性DNA片段。外切核酸酶通过在80℃孵育连接产物20 min热灭活。热灭活外切核酸酶后，将5 μL (25ng DNA)的完成的连接反应物直接用于使用Phi29 DNA聚合酶的等温RCA反应。
DNA小环的扩增
DNA小环模板的RCA产生高分子量、高分支的多联体，其基本上由最小表达序列的串联重复组成。RCA试剂，包括水、反应缓冲液、引物和phi29酶预先净化，然后加入连接的模板和dNTPs以最小化脱靶扩增。在一些实施方案中，包含外切核酸酶抗性引物和核苷酸(dNTPs)的引物-核苷酸溶液(引物-核苷酸混合物)通过用外切核酸酶I、外切核酸酶III和单链DNA结合蛋白(SSB蛋白)的组合孵育引物-核苷酸混合物净化。包含DNA聚合酶的酶混合物任选在外切核酸酶的存在下(如果使用的DNA聚合酶包括非校正DNA聚合酶)，通过用二价阳离子(例如，Mg2+)孵育来净化。DNA小环的扩增使用这样净化的酶混合物和引物-核苷酸混合物进行。例如，包含200 ng Phi29 DNA聚合酶的聚合酶溶液在包含15 mM KCl、20 mM MgCl2、0.01% 吐温-20和1 mM TCEP 的5 μL 50 mM HEPES缓冲液(pH=8.0)中用0.1单位的外切核酸酶III孵育。孵育在30℃进行约60 min，或在4 ℃进行12 h。将净化的Phi29 DNA聚合酶溶液转移至冰浴，然后无需在先灭活外切核酸酶III，用于靶RCA测定。
DNA小环的扩增使用随机六聚体或具有序列+N+N(at N)(at N)(at N)*N (AT六聚体)的六聚体引物进行，其中“N”代表随机核苷酸(即，N可为A、C、G或T/U的任何一个)，“atN”代表包含2-氨基dA、2-硫代-dT、正常G和正常C的随机混合物，字母名称前的加号(+)表示该字母指定的核苷酸为锁核酸(LNA)核苷酸，字母前的星号(*)表示该字母指定的核苷酸为硫代磷酸酯修饰的核苷酸。对于所有的RCA反应，dNTP浓度维持在1 mM以下(通常400-800 μM)以避免扩增的RCA产物DNA形成水凝胶，其可潜在地复杂化从RCA产物转录和翻译的下游过程。
DNA扩增反应通过在30℃用DNA小环模板孵育净化的引物-核苷酸混合物和净化的酶混合物约400 min进行。扩增反应混合物由40 μM引物、400 μM dNTPs (各自400 μM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、1 pg DNA小环和200 ng phi29 DNA聚合酶组成。将反应混合物在包含15 mMKCl、20 mM MgCl2、0.01% (v/v) 吐温-20、1 mM TCEP的50 mM HEPES缓冲液(pH = 8.0)中孵育。孵育结束时，反应混合物中的Phi29 DNA聚合酶通过在65℃加热反应混合物10分钟灭活。
表3和图2概述来自使用SEQ ID No. 6制备的DNA小环(用BamHI和BglII消化并通过连接环化)的RCA产物的代表性产量。RCA反应在三个不同的试验条件下进行：(i) 使用随机六聚体和dNTPs，(ii) 使用AT-六聚体引物和dNTPs和(iii) 使用AT六聚体和与硫化dATPs混合的dNTPs。RCA反应使用大约28 ng外切核酸酶处理的连接产物(DNA小环)一式两份(在可能时)进行。所有RCA反应物包含0.4 mM dNTP和40 μM引物(随机六聚体或AT六聚体)，除了对于一个反应，硫化dATP以相对于非硫化dATP为1:40比率加入(0.01mM α-S-dATP)。
从100 μL的总RCA反应体积，使用Quant-It™ Picogreen® dsDNA Assay Kit(ThermoFisher Inc.)定量RCA产物。还进行限制酶切的DNA产物的琼脂糖凝胶电泳，将电泳条带的强度与具有已知浓度的DNA的标准品进行比较。使用Quant-It PicoGreen dsDNAAssay Kit，通过使用AT六聚体、随机六聚体和AT六聚体以及与硫化dATP混合的dNTPs (AT六聚体 + α-S-dATP)的RCA产物DNA的产量在表3中示出。对于包含AT六聚体和α-S-dATP的RCA试验条件仅进行单次反应，而非一式两份反应。
表3：RCA产物DNA的产量
RCA试验条件 反应#1 RCA DNA产量(ng/μL) 反应#2 RCA DNA产量(ng/μL)
随机六聚体 294.4 323.3
AT六聚体 548.2 563.4
AT六聚体 + α-S-dATP 590.8 -
如表3和图2中所呈现的，与随机六聚体相比，当使用AT六聚体时RCA产物DNA的产量增加。如图2中所说明的，当AT六聚体用于RCA反应时，RCA产物的产量为大约55 μg，而当随机六聚体用于RCA反应时RCA产物的产量为大约28 μg。相似的高产量在用AT六聚体引发扩增反应后将硫化碱基随机掺入RCA产物时观察到。由于偶联的体外转录和翻译一般需要至少1微克模板DNA，在RCA反应中使用AT六聚体引物的更高DNA产量使得能够更大地放大随后的转录和翻译。
在随后的实施例中，为了无细胞表达比较，产生各种DNA扩增产物(样品)，如表4中所列出的。表4还说明每一模板和相应的扩增的核酸中存在的不同的序列参数(例如，存在或不存在转录终止序列)和/或修饰(例如，存在或不存在硫化DNA，或密码子使用)，其中“cc”表示前后密码子偏好，“ic”表示单个密码子偏好。
表4：随后的实施例中使用的不同的扩增产物(样品)的特征
实施例2：通过从RCA产物的偶联的体外转录和翻译的增强的蛋白合成
通过偶联的体外转录和翻译的蛋白表达使用ExpresswayTM Mini 无细胞表达系统(ThermoFisher Inc.)评估，其为适于线性和质粒DNA模板的基于大肠杆菌的偶联的体外转录和翻译反应。按照制造商的说明，Expressway系统需要148 ng/μL的DNA模板最小浓度，以便将1微克模板DNA加入50 μL反应。将通过偶联的体外转录和翻译的EGFP蛋白合成在PCR扩增的DNA和从衍生自SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4的DNA小环制备的RCA产物之间比较。所有这些序列包含编码EGFP的基因，但在若干方面不同。例如，SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2包含衍生自大肠杆菌rrnB操纵子的终止子T1的I/II类转录终止子序列，而SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4缺乏转录终止序列。此外，SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 4包含按照JCat工具[Grote等人, Nucleic Acids Res. 2005 Jul 1; 33(Web Server issue:W526-531). JCat: a novel tool to adapt codon usage of atarget gene to its potential expression host]密码子优化的EGFP开放阅读框，所述工具将靶基因的单个密码子使用最大化为表达宿主的密码子偏好。SEQ ID No. 1和SEQ IDNo. 3包含基于下列过程前后适应的EGFP开放阅读框：从EGFP的天然编码序列开始，仅特定位点重新编码以避免隐含的起始位点(ATG)、隐含的核糖体结合位点(AGGA、GAGG、GGAG)、II类终止序列[(A、C或T)ATCTGTT]、核糖体滑动序列[NNNYYY，其中Y=(A、T)]和内部ATG甲硫氨酸上游的核糖体暂停位点(例如，AGG、GGA、GAG、GGG、GGT、GTG)。
包含序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4的DNA小环通过连接制备，随后用AT六聚体通过RCA扩增，如实施例1中所描述的。RCA产物的产量使用Quant-It PicoGreen dsDNA Assay Kit (ThermoFisher Inc.)定量。将大约1微克衍生自DNA小环模板的RCA产物无需任何中间的净化或纯化步骤直接应用于Expressway Mini无细胞表达反应。此外，在加入Expressway Mini无细胞表达反应之前，在限制性消化和/或连接方面没有额外的RCA产物处理。在单独的无细胞表达反应中，还测试了1微克用SEQ ID No.1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4 (由GenScript经由重叠延伸PCR合成)PCR扩增的DNA，连同无模板对照(NTC)。将所有无细胞表达反应物在EppendorfThermoMixer中在30℃摇动(1200 rpm)孵育6小时以合成EGFP蛋白。通过在4℃孵育过夜，允许合成的EGFP蛋白折叠为活性形式，然后通过基于荧光的测定定量。折叠的EGFP的荧光使用SpectraMax® M5 Microplate Reader (Molecular Devices, LLC)从10倍稀释的表达的提取物样品(在PBS中)相对纯化的EGFP参考曲线(BioVision, Inc.)测量。来自体外转录和翻译的总EGFP产量以μg/mL单位计算。
来自从SEQ ID No. 1制备的RCA产物DNA和从SEQ ID No. 3制备的PCR扩增的DNA的EGFP蛋白产量在图3中描绘。图3说明与使用PCR扩增的DNA 24和26的体外转录-翻译反应相比，EGFP表达在RCA产物20和22用于体外转录-翻译时增强。图3还显示与PCR扩增的DNA26相比，RCA产物22产生更高的EGFP表达，即使最小表达序列缺乏任何转录终止序列。
来自从SEQ ID No. 2制备的RCA产物或从SEQ ID No. 4制备的PCR扩增的DNA的体外转录-翻译的EGFP蛋白产量在图4中描绘。如图4中所描绘的，与PCR扩增的DNA 32、34相比，EGFP产量在RCA产物28、30用于无细胞表达时高得多。图4还显示与PCR扩增的DNA 34相比，RCA产物30产生更高的EGFP产量，即使最小表达序列缺乏转录终止序列。与PCR扩增的DNA相比，使用RCA产物的更高的无细胞蛋白产量是出乎意料的。一般而言，转录终止信号为mRNA的稳定性和/或释放，以及mRNA的有效翻译所需要的。例如，来自PCR扩增的DNA 26 (图3)和34 (图4)的蛋白表达分别显著低于PCR扩增的DNA 24 (图3)和32 (图4)。PCR扩增的DNA 24和32的最小表达序列具有I/II类转录终止子(如图3和4中所示)，PCR扩增的DNA 26和34的最小表达序列缺乏转录终止子。因此，该数据显示衍生自最小DNA小环的RCA产物通过产生顺反子mRNA种类的串联重复，改进蛋白表达，其中每一顺反子包含期需靶基因的mRNA。顺反子的串联重复可改进总体mRNA稳定性，特别是当转录终止信号不存在时，因此有助于期需蛋白产物的更高翻译通量。
实施例3：RCA产物的硫化改进偶联的体外转录-翻译系统中的蛋白产生
通过偶联的体外转录和翻译的蛋白(EGFP)表达使用Expressway Mini无细胞表达系统(ThermoFisher Inc)和PCR扩增的DNA或RCA产物评估。对于这些实验，SEQ ID No. 5和SEQID No. 6配置增加翻译效率的强T7基因10翻译增强子序列和T7基因10核糖体结合序列。另外，SEQ ID No. 5包含I类转录终止子(衍生自T7 T-phi终止子序列)，其根据反应条件和上游的DNA序列元件增加终止效率。EGFP编码区域经前后优化，并且在SEQ ID No. 5和SEQ IDNo. 6之间相同。DNA小环通过分子内连接每一序列，SEQ ID No. 5或SEQ ID No. 6制备。连接的DNA小环随后用随机六聚体、AT六聚体或在硫化dATPs存在或不存在下的AT六聚体，通过RCA扩增，如实施例1中所描述。RCA产量使用Quant-It PicoGreen dsDNA Assay Kit(ThermoFisher)定量。将0.5微克RCA产物DNA无任何中间净化步骤直接应用于ExpresswayMini无细胞表达反应。在单独的无细胞表达反应中，还测试了0.5微克SEQ ID No. 5或SEQID No. 6 (由GenScript经由重叠延伸PCR合成)的PCR扩增的DNA，连同无模板对照(NTC)。将所有无细胞表达反应物在Eppendorf ThermoMixer (1200 rpm)中在30℃孵育6小时，合成的EGFP蛋白在4 ℃折叠过夜，然后荧光定量。折叠的EGFP的荧光使用SpectraMax M5Microplate Reader (Molecular Devices, LLC)从100倍稀释的提取物样品(在PBS中)相对纯化的EGFP参考曲线(BioVision, Inc.)测量。总EGFP产量以μg/mL单位计算。
将来自RCA产物(包括衍生自从SEQ ID No. 5制备的小环的正常或硫化DNA)的EGFP蛋白产量与来自PCR扩增的DNA (从SEQ ID No. 5制备，无硫化)的产量比较。如图5中所描绘的，与PCR扩增的DNA 42或不包含任何硫化核苷酸的RCA产物38和40相比，来自用硫化核苷酸部分置换的RCA产物36的EGFP蛋白表达高得多。
相似地，来自SEQ ID No. 6的EGFP蛋白的表达产量从RCA产物(具有或不具硫化)测定，与非硫化的PCR扩增的DNA比较。图6显示与非硫化的RCA产物46或非硫化的PCR扩增的模板48相比，EGFP的产量对于用硫化核苷酸部分置换的RCA产物44相对更高。对于PCR扩增的DNA 48，在无细胞反应中事实上无EGFP表达(图6)。与先前的实施例相似，该数据证实转录终止信号为mRNA的有效翻译所需要，除了当最小表达盒转换为RCA产物时。
实施例4：RNA聚合酶失控以前后依赖的方式影响使用RCA产物的体外转录和翻译系统中的蛋白产生
在人IL-2的体外转录和翻译测定中PCR扩增的DNA或RCA产物的表达使用ExpresswayMini 无细胞表达系统(ThermoFisher Inc.)评估。对于这些实验，SEQ ID No. 7和SEQ IDNo. 8 (编码无信号肽的IL-2)用衍生自大肠杆菌rrnB操纵子的终止子T1的I/II类转录终止子序列创建。SEQ. ID. No. 7和SEQ ID No. 8的最小表达序列事实上相同，除了IL-2开放阅读框内的密码子使用。SEQ ID No.8按照JCat工具密码子优化，所述工具将靶基因的单个密码子使用最大化为表达宿主的密码子偏好。SEQ ID No. 7基于下列过程前后适应：从人IL-2的天然编码序列开始，仅特定位点重新编码以避免隐含的起始位点(ATG)、隐含的核糖体结合位点(例如，AGGA、GAGG、GGAG)、II类终止序列[(A、C或T)ATCTGTT]、核糖体滑动序列[NNNYYY，其中Y=(A、T)]和内部ATG甲硫氨酸上游的核糖体暂停位点(例如，AGG、GGA、GAG、GGG、GGT、GTG)。DNA小环通过分子内连接每一序列，SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8制备。小环随后用AT六聚体通过RCA扩增，如实施例1中所描述的。RCA产物的产量使用Quant-ItPicoGreen dsDNA Assay Kit Assay Kit (ThermoFisher)定量。将1微克RCA DNA无任何中间净化步骤直接应用于Expressway Mini无细胞表达反应。在单独的无细胞表达反应中，还测试了1微克SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8 (由GenScript经由重叠延伸PCR合成)的PCR扩增的DNA，连同无模板对照(NTC)。每一无细胞表达反应物额外包含2 μL的FluoroTect™GreenLYS体外翻译标签(Promega)以用荧光BODIPY-FL标签随机标记新生的赖氨酸残基(经由反密码子UUU tRNA)。所有无细胞表达反应物在Eppendorf ThermoMixer (1200 rpm)中在30 ℃孵育6小时，然后在分析之前在4 ℃保持过夜。将大约2 μL无细胞表达反应混合物通过SDS-PAGE分离，包含BODIPY-FL的所有翻译产物通过凝胶内荧光使用TyphoonVariable Mode Imager (GE Healthcare)检测。荧光的IL-2带(~16kD)使用ImageJ软件数字化定量。
图7显示使用偶联的体外转录和翻译表达的IL-2蛋白的SDS-PAGE凝胶。表达的蛋白从无细胞表达反应收集并上样SDS-PAGE用于分析。蛋白从由SEQ ID No. 7制备的RCA产物50、由SEQ ID No. 8制备的RCA产物54、由SEQ ID No. 7制备的PCR扩增的DNA 52和由SEQID No. 8制备的PCR扩增的DNA 56单独表达。如图7中所描绘的，除了NTC反应(泳道2)中也存在的背景BODIPY-FL tRNA信号之外，来自SEQ ID No. 7的荧光信号主要作为~16kD的翻译的IL-2蛋白观察到(泳道3-4)。相反，对于PCR扩增的DNA 56 (图7，泳道5)无IL-2蛋白观察到。使用RCA产物54 (SEQ ID No. 8)，高分子量蛋白(26kD-72kD)意外表达，如图7泳道6中所示。图7的泳道1代表标准蛋白分子量标志(M)。原因可能是在IL-2序列中存在两个二赖氨酸重复，其通过JCat工具重新编码为polyA段，因为在大肠杆菌中AAA密码子明显比AAG优选。这些二赖氨酸重复在SEQ ID No. 7中实质上未通过前后密码子优化过程重新编码。AAAAAA段通常称为核糖体滑动序列，其可潜在地移码翻译产物(Yan S等人; 2015,Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching offrameshift pathways; Cell. 160: 870-81)和通过核糖体失速施加额外的翻译控制(Arthur等人, 2015, Translational control by lysine-encoding A-rich sequences;Science Advances. Vol.1; No.6: pg 1-11; e1500154)。
图8显示来自RCA产物50 (从SEQ ID No. 7制备)、RCA产物54 (从SEQ ID No. 8制备)、PCR扩增的DNA 52 (从SEQ ID No. 7制备)和PCR扩增的DNA 56 (从SEQ ID No. 8制备)的16kD IL-2蛋白的相对产量。图8显示与PCR扩增的DNA 52相比，IL-2的产量在RCA产物50用于无细胞表达时增加。图7和8中呈现的数据也显示顺反子mRNA的串联重复从RCA产物产生，尽管存在转录终止序列。相应的信使被核糖体有效或无效加工以影响无细胞蛋白产量，只要信使中的下游顺反子被适当设计。
实施例5：与从质粒DNA产生的RCA产物相比，使用从DNA小环产生的RCA产物的无细胞表达系统中的蛋白产生
无细胞系统中EGFP的表达在使用SEQ ID No. 1 (具有大肠杆菌rrnB操纵子的I/II类转录终止子序列)或SEQ ID No. 3 (缺乏转录终止子序列)，从基本上由最小表达序列组成的DNA小环产生的RCA产物中比较。对于这些实验，DNA小环通过分子内连接SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 3制备，如实施例1中所描述的。对于质粒产生，将 SEQ ID No. 1或SEQ ID No.3连接入pUC19的EcoRI和KpnI位点，转染入One Shot® TOP10化学感受态大肠杆菌(Invitrogen #C4040)，并选择氨苄西林抗性。单个质粒克隆使用PureLink® HQ MiniPlasmid Purification Kit (Invitrogen #K2100-01)从大肠杆菌纯化并通过BamHI限制性消化验证。所有的DNA小环和质粒DNA模板用AT六聚体通过RCA扩增，如实施例1中描述的。RCA产物使用Quant-It PicoGreen dsDNA Assay Kit (ThermoFisher)定量。将0.5微克RCA产物DNA无任何中间净化直接应用于Expressway Mini无细胞表达反应。将无细胞表达反应物(包括无模板对照)在Eppendorf ThermoMixer (1200 rpm)中在30 ℃孵育5小时，合成的EGFP蛋白在4 ℃保持过夜以允许折叠，然后荧光定量。折叠的EGFP的荧光使用SpectraMaxM5 Microplate Reader (Molecular Devices, LLC)从10倍稀释的裂解物样品(在PBS中)相对纯化的EGFP参考曲线(BioVision, Inc.)测量。总EGFP产量以μg/mL单位计算。
来自使用从DNA小环扩增的RCA产物(70、74)和质粒DNA的RCA产物(72、76)的无细胞表达反应的EGFP蛋白的产量在图9中描绘。结果显示EGFP的无细胞产量在RCA产物从DNA小环而不是质粒DNA产生时提高。此外，与衍生自质粒的RCA产物(76)相比，使用衍生自DNA小环的RCA产物(74)，EGFP可甚至在不存在转录终止序列时表达。该数据显示从质粒DNA产生的RCA产物中存在的各种间插序列，例如复制起点、抗生素选择序列和克隆筛选中涉及的无关序列，可损害期需蛋白靶的无细胞表达。相反，当RCA多联体从基本上由最小表达序列组成的DNA小环产生时，甚至在不存在转录终止(其一般使mRNA转录物失稳)时，有益和生产性失控可发生。
前述实施例说明本发明的一些特征，为从多种多样的所有可能的实施方案选择的实施方案。本发明可以以其它特定形式体现，而不脱离其精神或基本特征。尽管仅本发明的某些特征在本文中说明和描述，但鉴于本公开内容的益处，本领域技术人员将能够进行修饰/改变以优化参数。因此前述实施方案在所有方面被认为是说明性的，而不是对本文所描述的发明的限制。必要时，提供范围，并且那些范围包含在其之间的所有子范围。

Claims (20)

1. 用于体外转录和翻译的方法，包括：
提供双链滚环扩增(RCA)产物，其中所述双链RCA产物基本上由最小表达序列的串联重复组成；和
在无细胞表达系统中从双链RCA产物表达蛋白，
其中最小表达序列基本上由启动子、开放阅读框、核糖体结合位点和翻译终止序列组成。
2.权利要求1的方法，其中最小表达序列缺乏质粒在宿主细胞中扩增所需的任何无关序列。
3.权利要求1或2的方法，其中双链RCA产物无需任何进一步处理而提供给无细胞表达系统。
4.权利要求1、2或3的方法，其中双链RCA产物包含硫化核苷酸。
5.上述权利要求中一项或多项的方法，其中最小表达序列进一步基本上由转录终止序列、绝缘子序列或其组合组成。
6.上述权利要求中一项或多项的方法，其中开放阅读框包含密码子优化的序列用于提高翻译速率。
7.上述权利要求中一项或多项的方法，其中开放阅读框包含标签序列用于蛋白纯化。
8.上述权利要求中一项或多项的方法，其中无细胞表达系统包含原核细胞提取物、真核细胞提取物或其组合。
9.用于体外转录和翻译的方法，包括：
提供脱氧核糖核酸(DNA)小环，其中所述DNA小环基本上由最小表达序列组成；
通过DNA小环的滚环扩增产生双链滚环扩增(RCA)产物；和
在无细胞表达系统中从双链RCA产物表达蛋白，
其中最小表达序列基本上由启动子、开放阅读框、核糖体结合位点和翻译终止序列组成。
10.权利要求9的方法，其中最小表达序列缺乏质粒在宿主细胞中扩增所需的任何无关序列。
11.权利要求9或10的方法，其中双链RCA产物无需任何进一步处理而提供给无细胞表达系统。
12.权利要求9、10或11的方法，其中双链RCA产物包含硫化核苷酸。
13.权利要求9-12中一项或多项的方法，其中最小表达序列进一步基本上由绝缘子序列、转录终止序列或其组合组成。
14.权利要求9-13中一项或多项的方法，其中开放阅读框包含标签序列用于纯化表达的蛋白。
15. 权利要求9-14中一项或多项的方法，其中滚环扩增使用范围为约10 µM-约10 mM的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的终浓度进行。
16.权利要求9-15中一项或多项的方法，其中滚环扩增使用包含核苷酸类似物的随机引物混合物进行。
17.权利要求16的方法，其中所述核苷酸类似物为肌苷、锁核酸(LNA)核苷酸、肽核酸(PNA)核苷酸、硫化核苷酸、2-氨基-脱氧腺苷、2-硫代-脱氧胸苷、聚阳离子核苷酸或拉链核酸(ZNA)聚阳离子修饰的核苷酸。
18.权利要求16或17的方法，其中随机引物混合物具有序列+N+N(atN)(atN)(atN)*N。
19.权利要求9-18中一项或多项的方法，其中无细胞表达系统包含原核细胞提取物、真核细胞提取物或其组合。
20.权利要求9-19中一项或多项的方法，其中开放阅读框包含密码子优化的序列用于提高翻译速率。
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