CN104093850A - 用于减少非特异性核酸扩增的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于核酸的有效扩增的方法和试剂盒。本公开主要涉及用于所关心的靶核酸的核酸扩增的试剂盒和方法。本文描述的方法通过在扩增过程中使用新的修饰引物，减少不需要的引物二聚体结构和嵌合核酸产物的产生而促进靶核酸（即，模板核酸）的合成。

Description

用于减少非特异性核酸扩增的方法和试剂盒
相关申请的交叉引用
本申请要求保护提交于2012年4月13日的美国专利申请第13/446,474号的优先权，该专利申请要求提交于2012年2月15日的美国临时申请第61/599,119号的权益，所述临时申请通过全文引用并入此处。
发明领域
本公开主要涉及用于扩增所关心的靶核酸的方法和试剂盒。在这里描述的方法和组合物通过使用新引物促进所需靶核酸的扩增，从而减少不需要的扩增产物（如，引物二聚体和嵌合核酸）的产生。
发明背景
多种技术目前可以用于甚至从起始核酸模板的数个分子有效扩增核酸。这些包括聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、自持序列复制（3SR）、基于核酸序列的扩增（NASBA）、链置换扩增（SDA）、多重置换扩增（MDA）和滚环扩增（RCA）。这些技术很多涉及对起始核酸模板的指数扩增并能够快速地产生大量的扩增产物。用于靶核酸的扩增的试剂盒可市购（例如，GenomiPhi™（General Electric, Inc）和RepliG™（Qiagen, Inc.），但对于这些方法的改进会是有利的。
核酸扩增技术常常应用于基于核酸的测定，其用于分析物的探测、传感、法医和诊断应用、基因组测序、全基因组扩增等。这类应用常常要求扩增技术具有高特异性、灵敏性、准确性和稳健性。但是，当前可用于核酸扩增的技术大多数受到高背景信号的妨害，这些高背景信号由产生不需要的扩增产物的非特异性扩增反应产生。这些非特异性扩增反应妨碍了很多这些技术在重要的基于核酸的测定中的有效应用。例如，传统扩增反应的应用可产生假阳性结果，从而导致不正确的诊断。这种非特异性的背景扩增反应在仅痕量的待扩增靶核酸可用（例如，从单一的DNA分子中扩增全基因组）时变得甚至更成问题。
非特异性背景扩增反应可归因于例如样品中污染核酸序列的扩增，引物二聚体的形成，或嵌合核酸的产生（例如，产生于所需核酸产物的自杂交）。在核酸扩增反应中非特异性扩增的常见来源产生于多种不希望有的引物相互作用。引物可与靶核酸中的核酸区域杂交，或与同靶核酸的一部分具有共享某种同源性的污染核酸中的核酸区域杂交。如果引物的3'末端对于非靶定区域具有足够的同源性，这一区域可被扩增。
非特性扩增也可产生于计划外的核酸模板不依赖性的引物-引物相互作用。引物可通过链内或链间引物退火（例如，分子内或分子间的杂交）形成引物二聚体结构，导致不需要的核酸的扩增。所产生的假引物延伸产物可进一步被扩增且有时可支配、抑制或掩弊所需的靶序列扩增。此外，扩增产物可自杂交，在扩增反应过程中允许核酸聚合酶产生杂交产物或嵌合产物。
为引发DNA合成，目前MDA配方常常利用带有序列5'-NNNNN*N的随机六聚体，其中“N”表示脱氧腺苷（dA）、脱氧胞苷（dC）、脱氧鸟苷（dG）或脱氧胸苷（dT），“*”表示硫代磷酸酯键。
不能通过分子内或分子间杂交作用交叉杂交的受限型随机化六聚体引物（例如，R6，其中R=A/G）已用于在核酸扩增过程中抑制引物二聚体结构的形成。但是，这些受限型随机化引物在核酸扩增反应中给予了相当大的偏倚。这类引物对于序列非特异性或序列非偏倚性核酸扩增反应（例如，全基因组或未知核酸序列扩增）也具有有限的应用。
为引发DNA合成，MDA配方常常利用带有如下序列的随机六聚体：5'-NNNNN*N，其中“N”表示脱氧腺苷（dA），脱氧胞苷（dC），脱氧鸟苷（dG）或脱氧胸苷（dT），“*”表示硫代磷酸酯键。使竞争性非靶核酸（即，模板DNA）扩增最小化的一种解决方案是以使得抑制它们彼此退火的能力的方式修饰寡核苷酸引物。
用于克服与使用上述随机六聚体引物的核酸扩增相关的问题的以前的研究包括在美国专利第7,993,839号（2011年8月9日授予）中公开的那些方法和试剂盒。此专利中描述的技术包括但不限于如下通用结构的六聚体引物的使用：5'-+W+WNNN*S-3'，其中“＋”在锁定核苷酸碱基之前（即，“LNA碱基”；例如，+A=腺苷LNA分子），“W”表示仅dA和dT的混合物，“S”表示仅dC和dG的混合物。所述“*”表示两个核苷酸间的硫代磷酸酯键。由于“W”碱基不能与“S”碱基稳定地配对，抑制了寡核苷酸双链体的形成，这导致非模板核酸的扩增减少。这些方法和试剂盒可称为“SD GenomiPhi”。
当扩增痕量核酸样品时，对MDA的速度和灵敏性的一个改进是将LNA并入寡核苷酸引物。LNA是一类构象受限制的核苷酸类似物，其用于提高碱基配对的速度、效率和稳定性，从而促进修饰寡核苷酸与所关注的核酸中的其靶序列杂交。对于被并入到寡核苷酸引物中的每一个LNA单体，双链体解链温度（Tm）被提高2-8℃。双链体的Tm的提高允许在更严格条件下比如在更高的温度下或用更低的盐浓度（例如，与用于使用未修饰引物的传统扩增反应中的75 mM KCl相对的15 mM KCl），进行MDA反应。虽然通过将LNA并入随机引物中显著地提高了使用MDA的扩增动力学，但是一个缺点是六聚体相互之间也更有效地退火，导致不需要的核酸（例如，引物二聚体）的扩增。
与非靶核酸不希望有的扩增相关的问题亦已从消除来自用于核酸扩增方法中的试剂和试剂溶液的污染核酸的角度研究解决。在美国专利申请公布第2009/0155859号中公开了制备用于核酸扩增的无核酸污染的试剂和试剂溶液的试剂盒和方法。这些方法包括处理聚合酶溶液、核苷酸溶液和引物溶液，以使污染核酸无活性。这些方法应用聚合酶和/或核酸外切酶的校正活性以消除试剂和试剂溶液中的污染。这些在美国专利申请公布第2009/0155859号中描述的方法有时可被称为“Clean GenomiPhi”或“Clean GPhi”。
尽管有这些进步，但是依然存在对开发更有效的、在序列覆盖率方面有更低偏崎及产生更低水平的非特异性背景扩增的核酸扩增方法的需求。在本领域中需要开发没有序列偏崎的用于核酸扩增的引物，其也降低引物-引物相互作用，且最小化嵌合核酸（例如，由六聚体引物与靶核酸扩增产物退火产生的不需要的核酸产物）的产生。
发明简述
本发明提供了用于靶核酸的扩增的方法和组合物。在不意图局限于特定作用机制的情况下，认为在这里公开的方法通过使用被设计用于最小化或防止用其它核酸扩增方法和试剂盒所观察到的不需要的引物二聚体和嵌合产物的产生的修饰引物，更有效地扩增所需的靶核酸（例如，“DNA模板”或“核酸模板”）。本文所描述的方法利用新引物设计方法以避免假核酸扩增产物的产生。例如，在一个实施方案中，使含有2-氨基-脱氧腺苷(2-氨基-dA)和2-硫代-脱氧胸苷(2-硫代-dT)的随机六聚体产生并运用于核酸的扩增反应（例如，MDA）。在这里描述的方法和试剂盒可称为“AT GenomiPhi”。
在本发明的一方面中，这些修饰六聚体具有如下通式：+N+N(atN)(atN)(atN)*N，其中如前面所述，“＋”在LNA碱基之前，(atN)表示2-氨基-dA、dC、dG和2-硫代-dT的随机混合物。用于本公开的另一个方面中的六聚体包含：(atN)(atN)(atN)(atN)(atN)*N，其中的符号在这两个六聚体设计之间是一致的。如下面所更详细描述的，在核酸扩增技术中使用这些六聚体通过如下致力于最小化或消除与传统方法中所观察到的引物二聚体形成和嵌合核酸的产生相关的问题：通过抑制随机六聚体彼此退火的能力，通过增加引物的解链Tm，经由向引物加入LNA和2-氨基-dA改善六聚体与靶核酸的结合效率，和经由将2-硫代-dT并入随机六聚体防止靶DNA与自身退火。此外，这些增强它们与靶核酸的结合强度的引物修饰，允许利用更严格的杂交缓冲液，其进一步最小化引物二聚体和嵌合核酸产物的产生可能性。
附图简述
当参照附图阅读下面的详细描述时，化学修饰的多孔膜的这些和其它特征、方面和优点将变得更好地理解，在附图中，相似字符在整个附图中表示相似部分，其中：
图1描写了1）2-氨基-脱氧腺苷（2-氨基-dA）与2-硫代-脱氧胸苷（2-硫代-dT）和2）2-氨基-dA与未修饰的T的碱基配对组合。虽然2-氨基-dA/2-硫代-dT配对非常不稳定，但是2-氨基-dA/T配对实际上比标准A/T配对更稳定。
图2描绘对标准的GenomiPhi™配方的改进为添加酶清除反应、调节氯化钾浓度和随机六聚体寡核苷酸的组成。本图中运用的缩写如下：N＝随机碱基；*＝硫代磷酸酯键；＋，在LNA碱基之前；W=仅碱基A或T；S=仅碱基C或G。
图3A提供了使用标准GenomiPhi™试剂盒或利用“经清除的”GenomiPhi、SD GenomiPhi或AT GenomiPhi配方实施的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)染色体DNA的系列稀释物或无核酸对照（NTC）的扩增反应结果。将各反应中DNA扩增信号增加超过背景的阈值时间针对作为输入模板加入反应的DNA的量绘图。图3B提供了利用使用六聚体序列NNNN*N*N和75mM KCl的标准GenomiPhi™试剂盒、如上文所述的“经清除的”GenomiPhi SD或GenomiPhi AT配方实施的枯草芽孢杆菌染色体DNA的扩增反应结果。还实施了无模板对照（NTC）。细节在实施例1中阐明。
图4A提供了从所标示量的染色体DNA实施的枯草芽孢杆菌全基因组扩增反应的结果。还实施了无模板对照（NTC）。细节在下面实施例3中阐明。此图的图例如下：1）实线空心正方形：NNNN*N*N（其中*表示硫代磷酸酯键），2）实线实心三角形：(atN)(atN)(atN)(atN)*(atN)*N（其中随机碱基的混合物，其中：2-氨基-A取代A，2-硫代-T取代T），3）实线空心三角形：+N+N+N+N+N*，4）虚线空心四菱形：+N+N(atN)(atN)(atN)*N，5）实线空心圆形：WWN+N+N*S，和6）实线实心圆形：+W+WNNN*S。图4B以柱状图的形式概括了数据。
图5提供了图2中扩增反应的对于基因组的每100个碱基对窗所测定的覆盖率水平和窗的GC含量。所述覆盖率水平针对具有该GC含量的窗的分数覆盖率绘制。此实施例细节在下面实施例3中阐明。
图6A提供了来自使用改进的AT GenomiPhi方法实施的大肠杆菌染色体DNA扩增反应的结果。还实施了无模板对照（NTC）。额外的细节在实施例4中阐述。图6B概述了通过PCR进行的分析。图6C提供了覆盖率水平、经映射的读出百分数和基因组覆盖率水平的柱状图。实验细节公开于实施例4中。
发明详述
涉及单分子DNA扩增或全基因组扩增的基于核酸的测定要求具有高产率、高保真性及在序列覆盖率方面具有低偏崎的高效率核酸扩增方法。目前可用的多种方法包括但不局限于：聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、自持序列复制（3SR）、基于核酸序列的扩增（NASBA）、链置换扩增（SDA）和滚环扩增（RCA）。应用随机引物的等温核酸扩增反应如滚环扩增（RCA）或多重置换扩增（MDA）比温度依赖型核酸扩增反应（例如，PCR）更适于这样的应用。但是，由于不希望有的非特异性核酸扩增反应，特别当靶核酸模板浓度低（例如，低于1 ng）时，这些方法常常产生占优势的背景信号。
在这里所描述的方法和试剂盒意图高效扩增靶核酸，具有减少用其它核酸扩增方法观察到的非靶核酸（例如引物二聚体、嵌合核酸产物等）的非特异性扩增的额外优点。在不意图局限于特定作用机制的情况下，所公开方法通过并入提高Tm（例如，在六聚体中每掺入一个2-氨基-dA碱基提高Tm大约3℃）或防止不希望有的引物二聚体形成的核苷酸类似碱基而实现这些目标。在某些实施方案中，将2-氨基-脱氧腺苷（2-氨基-dA）、2-硫代-脱氧胸苷（2-硫代-dT）或其它所关心的核苷酸类似物并入用于扩增靶核酸的随机六聚体。如图1所示，核苷酸类似物碱基由于空间障碍不会彼此稳定地配对（例如，与用未修饰的dA和dT观察到的三个氢键相对，2-氨基-dA与2-硫代-dT只形成一个氢键），不需要的核酸双链体的形成显著减少，从而导致对非靶核酸扩增的全面抑制。事实上，因为2-氨基-dA与未修饰的脱氧胸苷（dT）形成三个氢键，并且类似地2-硫代-dT与其未修饰的配偶体（即，脱氧腺苷（dA））形成正常的稳定配对，所以这些核苷酸类似碱基的掺入实际上改进引物与靶核酸杂交的能力。
当与一种或多种LNA核苷酸组合时，在这里所阐述的方法产生甚至更稳健的结果。对于并入到寡核苷酸引物中的每一个LNA核苷酸，提高Tm达2-8℃。修饰核苷酸类似物碱基和LNA核苷酸的应用还允许使用更严格的杂交缓冲液，从而进一步减少不需要的非靶核酸扩增的产生。另外，更高的温度和更低的盐浓度也可用于核酸扩增反应以促进所关心的特定靶核酸的扩增。
定义
为了更清楚准确地描述和指出所要求发明的主题，对下面说明书和附加权利要求中使用到的特定术语提供了以下定义。在整个说明书中，特定术语的例示应该被认为是非限定性实例。
除非前后文另外明确指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包含复数所指物。在贯穿说明书和权利要求中在本文用到的近似用语可用于修饰任意定量的表述，其可容许变化而不导致与其相关的基本功能的变化。因此，被术语如“约”修饰的数值不局限于规定的精确的数值。在某些实例中，近似用语可与测量数值的仪器的精确性对应。相似地，“无”可与术语结合使用，并可包括无实质数量或痕量，同时仍被认为不含所修饰的术语。当需要时，提供范围，并且这些范围包括其间的所有亚范围。
在这里所使用的术语“核苷”是指糖基胺化合物，其中核酸碱基（例如，核碱基(nucleobase)）与糖部分连接。核酸碱基可为天然核碱基或修饰过的或合成的核碱基。核酸碱基包括但不局限于嘌呤碱基（例如，腺嘌呤或鸟嘌呤）、嘧啶（例如，胞嘧啶，尿嘧啶，或胸腺嘧啶）或脱氮杂嘌呤碱基。核酸碱基可连接至1＇位置或者在戊糖（例如，核糖或脱氧核糖）糖部分的等价位置上。糖部分包括但不局限于天然糖、糖替代物（例如，碳环的或无环的部分）、取代糖或修饰的糖（例如，如在LNA核苷酸中的二环呋喃糖单元）。核苷可包含糖部分的2'-羟基、2'-脱氧或2', 3'-双脱氧形式。
本文中所使用的术语“核苷酸”或“核苷酸碱基”是指核苷磷酸。它包括但不局限于天然核苷酸、合成的核苷酸、修饰过的核苷酸或替代物置换部分（例如，肌苷）。所述核苷磷酸可为核苷一磷酸、核苷二磷酸或核苷三磷酸。核苷磷酸的糖部分可为戊糖如核糖，且磷酸酯化位点可对应于与核苷的戊糖的C-5位置连接的羟基。核苷酸可为但不局限于脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）或核糖核苷三磷酸（NTP）。核苷酸可用字母表字母表示（字母标识），如表1所描述。例如，A表示腺苷（即，包含核碱基腺嘌呤的核苷酸），C表示胞嘧呤，G表示鸟苷，和T表示胸苷。W表示A或T/U，S表示G或C。N表示随机核苷酸（即，N可为A、C、G或T/U中的任意一种）。置于字母标识之前的加（＋）号表示该字母所标识的核苷酸是LNA核苷酸。例如，+A表示腺苷LNA核苷酸，+N表示随机锁定核苷酸（随机LNA核苷酸）。置于字母标识之前的星（*）号表示该字母标识的核苷酸是硫代磷酸酯修饰的核苷酸。例如，*N表示硫代磷酸酯修饰的随机核苷酸。
在这里使用的术语“核苷酸类似物”是指经修饰的与天然存在的核苷酸结构上相似的化合物。核苷酸类似物可具有经改变的硫代磷酸酯主链、糖部分、核碱基或其组合。通常，带有经改变的核碱基的核苷酸类似物尤其赋予不同碱基配对和碱基堆积的特性。具有经改变的磷酸酯－糖主链的核苷酸类似物（例如，PNA，LNA等）常常尤其修饰链特性，如二级结构的形成。在本申请中有时术语“核苷酸类似物”、“核苷酸类似碱基”、“修饰的核苷酸碱基”或“修饰的碱基”可交换使用。
任意最小化或防止非靶核酸扩增的核苷酸类似物可应用于本发明的实践中。除了上文所描述的那些核苷酸类似物之外，多种具有所需要的能力的核苷酸类似物为本领域的技术人员所熟知的。参见例如美国专利第5,912,340号；国际公布号WO 2010/021702；以及Hoshika等（2010） Angew . Chem. Int. Ed. 49:5554-5557，这些全部通过引用以其整体合并于本文。这些核苷酸类似物包括但不局限于“自避免分子识别系统”（SAMRS）。由Hoshika等所描述的SAMRS基于作为T*、A*、G*和C*的2-硫代胸腺嘧啶、2-氨基嘌呤、次黄嘌呤和N4-乙基胞嘧啶。当将这些单独引入参照DNA双链体时，相应的SAMRS：标准品对以与A:T对相同的程度促成双链稳定性。SAMRS:SAMRS对比相应的SAMRS：标准品对小地促成参照双链体的稳定性。Hoshika等（2010） Angew . Chem. Int. Ed. 49:5554-5557.
表 1 ：多种核苷酸的字母标识
在这里使用的术语“LNA（锁定核酸）核苷酸”是指核苷酸类似物，其中核苷酸的糖部分包含锁定在模拟核糖核酸（RNA）的糖构象中的二环呋喃糖单元。从脱氧核糖核苷酸(或核糖核苷酸)到LNA核苷酸的结构变化从化学观点而言是受限的，即引入2＇位的碳原子和4＇位的碳原子间额外的键（例如，2'-C, 4'-C-氧亚甲基键，参见例如Singh, S. K.,等, Chem. Comm., 4, 455−456, 1998,或Koshkin, A. A.,等, Tetrahedron, 54, 3607−3630, 1998.））。所述LNA核苷酸中呋喃糖单元的2'和4'位置可通过O-亚甲基（例如，氧-LNA：2'-O, 4'-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖基核苷酸）、S-亚甲基（硫代-LNA）或NH-亚甲基部分（氨基-LNA）等连接。这样的键限制呋喃糖环的构象自由。LNA寡核苷酸展现出对互补单链RNA和互补单链或双链DNA增强的杂交亲和力。LNA寡核苷酸可诱导A型（RNA样）双链体构象。
在这里使用的术语“寡核苷酸”是指核苷酸或其衍生物的低聚体。在这里使用的术语“核酸”是指核苷酸或其衍生物的聚合物。“靶核酸”或“核酸模板”意指意图和需要被扩增的特定序列。在这里使用的术语“序列”是指寡核苷酸或核酸的核苷酸序列。在整个说明书中，每次寡核苷酸/核酸通过字母序列表示时，核苷酸都从左至右按5＇→3＇顺序。例如，用字母序列(W)x(N)y(S)z(其中x=2，y=3和z=1)表示的寡核苷酸表示寡核苷酸序列WWNNNS，其中W是5＇末端核苷酸和S是3＇末端核苷酸。寡核苷酸/核酸可以是DNA、RNA或他们的类似物（例如，硫代磷酸酯类似物）。寡核苷酸或核酸也可包含修饰的碱基和/或主链（例如，修饰的磷酸酯键或修饰的糖部分）。赋予核酸稳定性和/或其他优点的合成主链的非限制性实例可包括硫代磷酸酯键、肽核酸、锁定核酸、木糖核酸或其类似物。
在这里使用的术语“末端核苷酸”是指位于寡核苷酸序列末端位置的核苷酸。位于3＇末端位置的末端核苷酸被称为3＇末端核苷酸，位于5＇末端位置的末端核苷酸被称为5＇末端核苷酸。邻近末端核苷酸的核苷酸是指位于距末端位置倒数第二位置的核苷酸。
在这里使用的术语“引物”或“引物序列”是指短的线性寡核苷酸，其与靶核酸序列（例如，待扩增的DNA模板）杂交以引发核酸合成反应。引物可为RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或嵌合序列。引物可包含天然的、合成的或核苷酸类似物（例如，提高Tm的那些）。引物长度的上限和下限都凭经验确定。引物长度的下限是在核酸扩增反应条件下在与靶核酸杂交时形成稳定双链体所需的最小长度。非常短的引物（通常长度小于3个核苷酸）不会在这样的杂交条件下与靶核酸形成热力学稳定的双链体。上限常常取决于在靶核酸中预定核酸序列外的区域形成双链体的可能性。通常，合适的引物长度是在约3个核苷酸长度到约40个核苷酸长度的范围内。用于本文所描述的靶核酸的扩增方法中的“寡核苷酸引物”可具有适于特定的实验条件组的长度。确定引物长度完全在本领域技术人员日常能力范畴之内。在本申请中描述的某些实施方案中，寡核苷酸引物为六聚体，更具体地为包含至少一个核苷酸类似物的六聚体，所述核苷酸类似物提高Tm和/或防止引物二聚体形成。本公开的引物可进一步包含LNA核苷酸碱基。
在这里使用的术语“随机引物”或“完全随机引物”是指引物序列的混合物，其通过在寡核苷酸序列的任意给定位置以使得给定的位点可由任何可能的核苷酸或其类似物组成的方式（例如，完全随机化）随机化核苷酸而产生。因此随机引物为寡核苷酸序列的随机混合物，由序列内核苷酸的每一种可能组合组成。例如，六聚体随机引物可用序列NNNNNN或(N)6表示。六聚体随机DNA引物由4种DNA核苷酸A、C、G和T的每一种可能的六聚体组合组成，导致产生包含46 （4,096）个独特的六聚体DNA寡核苷酸序列的随机混合物。当靶核酸序列未知时，随机引物可有效地用于引发核酸合成反应。
在这里描述的“部分约束的引物”是指通过完全地随机化寡核苷酸序列的一些核苷酸（即，核苷酸可为A、T/U、C、G或它们的类似物中的任一种），同时限制一些其他核苷酸的完全随机化（即，在某些位置的核苷酸的随机化程度比可能的组合A、T/U、C、G或其类似物低）而产生的引物序列混合物。例如，用WNNNNN所代表的部分约束的DNA六聚体引物表示其中混合物中所有序列的5＇末端核苷酸是A或T的引物序列混合物。此处，5＇末端核苷酸相对于完全随机DNA引物（NNNNNN）的最大化的四种可能组合（A、T、G或C）被局限于两种可能的组合（A或T）。部分约束的引物的合适引物长度可在约3个核苷酸长到约15个核苷酸长的范围内。
这里描述的术语“具有末端错配引物二聚体结构的部分约束的引物”是指部分约束的引物序列，其中当部分约束的引物中带有三个或更多个核苷酸的内部同源性的两个单独的引物序列互相分子间杂交，以形成没有凹缺末端的引物二聚体结构，或具有单个核苷酸碱基3＇凹缺末端的引物二聚体结构，或具有两个核苷酸碱基3＇凹缺末端的引物二聚体结构时，在引物二聚体结构中两个3＇末端核苷酸都存在核苷酸错配（即，核苷酸并不碱基配对）。例如，当其分子间杂交形成不含有凹缺末端的引物二聚体结构时，由WNNNS所代表的部分约束的五聚体引物在两个3＇末端核苷酸处均提供末端错配。在引物二聚体结构中，存在三个核苷酸的内部同源性（即，当通过分子间杂交形成不含凹缺末端的引物二聚体结构时WNNNS中的三个随机核苷酸可相互碱基配对）。然而，当其分子间杂交以形成带有单个核苷酸碱基3＇凹缺末端的引物二聚体结构时，这种引物实例并不提供末端错配。类似地，当其分子间杂交形成不含凹缺末端的引物二聚体结构时，由WWNNNS所代表的部分约束的六聚体引物在两个3＇末端核苷酸处提供末端错配。此外，甚至当其分子间杂交形成含有单个核苷酸碱基3＇凹缺末端的引物二聚体结构时，这种引物实例在两个3＇末端核苷酸处提供末端错配。当其分子间杂交形成不含有凹缺末端的引物二聚体结构时，由WWWNNNS所代表的部分约束的七聚体引物在两个3＇末端核苷酸处提供末端错配。进一步地，当其分子间杂交以形成含有单个核苷酸碱基3＇凹缺末端的引物二聚体结构或形成含有两个核苷酸碱基3＇凹缺末端的引物二聚体结构时，这种引物实例在两个3＇末端核苷酸处提供末端错配。
在这里使用的术语“质粒”是指与染色体核酸分离的染色体外的核酸。在细胞中质粒DNA可能能够独立于染色体核酸（染色体DNA）复制。质粒DNA通常为环形和双链的。
在这里使用的术语“扩增（amplification）”、“核酸扩增”或“扩增（amplifying）”是指核酸模板多个拷贝的生成，或与核酸模板互补的多个核酸序列拷贝的生成。在本申请中这些术语可交替地使用。
在这里使用的术语“靶核酸”是指在核酸扩增反应中需要扩增的核酸。例如，靶核酸包含核酸模板。
在这里使用的术语“DNA聚合酶”是指使用核酸链作为模板从头合成DNA链的酶。DNA聚合酶使用存在的DNA或RNA作为DNA合成的模板并沿着其读取的模板链催化脱氧核糖核苷酸的聚合。新合成的DNA链与模板链互补。DNA聚合酶只能将自由核苷酸添加到新形成链的3＇-羟基端。它通过从脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)转移核苷一磷酸至成长的寡核苷酸链的3’-羟基来合成寡核苷酸。这导致新链以5’→3’方向延伸。因为DNA聚合酶仅可在预先已有的3’-OH基团添加核苷酸以开始DNA合成反应，所以DNA聚合酶需要其可添加第一个核苷酸的引物。适合的引物包括RNA或DNA的寡核苷酸。DNA聚合酶可以是天然存在的DNA聚合酶或具有上述活性的天然酶的变体。例如，它可以包括具有链置换活性的DNA聚合酶、缺乏5’→3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶、具有逆转录酶活性的DNA聚合酶或具有核酸内切酶活性的DNA聚合酶。
在这里使用的术语“校正DNA聚合酶”是指在进行DNA合成时能够纠正其错误的任意DNA聚合酶。校正DNA聚合酶除了其聚合酶活性外还拥有3＇→5＇核酸外切酶活性，并且这种核酸外切酶活性被称作校正活性。这种聚合酶的校正活性在新合成的DNA中纠正错误。在DNA合成期间，当识别错误的碱基对时，校正DNA聚合酶通过DNA的一个碱基对逆转其方向。该酶的3＇→5＇核酸外切酶活性（校正活性）允许将不正确的核苷酸碱基对切除。切除该核苷酸碱基后，该聚合酶再次插入正确的核苷酸碱基，并继续DNA合成。当自由dNTP存在于适合DNA合成的溶液或反应混合物中时，校正DNA聚合酶的主要活性为DNA合成。但是，当没有可利用于DNA合成反应的dNTP时，校正DNA聚合酶的主要活性可为它的3＇→5＇核酸外切酶活性。一些校正DNA聚合酶对于其校正活性和其聚合酶活性可能需要二价阳离子的存在。可开启校正聚合酶的校正活性的合适的二价阳离子包括但不局限于镁或锰。
这里使用的“链置换核酸聚合酶”是指除了其核酸合成活性外还具有链置换活性的核酸聚合酶。换句话说，链置换核酸聚合酶可在置换已经退火到模板链上的互补链的同时，基于核酸模板链序列（即，读取模板链）继续核酸合成。
在这里使用的术语“互补的”当用于相对于第二条核酸/寡核苷酸序列描述第一条核酸/寡核苷酸序列时，指包含第一条核酸/寡核苷酸序列的寡核苷酸在一定杂交条件下与包含第二条核酸/寡核苷酸序列的寡核苷酸杂交(例如形成双链体结构)的能力。杂交通过核苷酸(互补核苷酸)的碱基配对来进行。核苷酸的碱基配对可经由沃森-克里克碱基配对、非沃森-克里克碱基配对或通过非天然的/修饰的核苷酸形成的碱基配对来进行。
在这里使用的术语“高严格杂交条件”，指对于核酸杂交事件赋予比通常用于核酸扩增反应的条件所提供的严格性更高严格性的条件。例如，在核酸扩增反应中，可通过增加反应温度或通过降低盐浓度来实现高严格杂交条件。含有短引物的核酸扩增反应常常在约75 mM盐浓度下进行。相反，在约15 mM盐浓度下进行的核酸扩增反应可提供高严格杂交条件。可通过自常用的约30℃提高温度于体外等温核酸扩增反应中提供高严格杂交条件。例如，等温核酸扩增反应可在大约35℃至大约45℃下实施以提供高严格杂交条件。
在这里使用的术语“滚环扩增(RCA)”，指经由滚环机制扩增环状核酸模板(例如单链DNA环)的核酸扩增反应。滚环扩增反应可由引物与环状(通常为单链)核酸模板杂交引发。然后核酸聚合酶通过在环状核酸模板周围连续前进来延伸与环状核酸模板杂交的引物，以反复复制核酸模板序列(滚环机制)。滚环扩增通常产生包含环状核酸模板序列的串联重复单元的多联体。滚环扩增可为显示线性扩增动力学的线性RCA (LRCA) (例如用单一特异性引物的RCA)，或可为显示指数扩增动力学的指数RCA (ERCA)。滚环扩增也可以用多引物进行(多重引发的滚环扩增或MPRCA)，这导致超分支多联体。例如，在双引发的RCA中，如在线性RCA中一样，一种引物可与环状核酸模板互补，然而另一引物可与RCA产物的串联重复单元核酸序列互补。因此，双引发的RCA可以以具有指数(几何)扩增动力学的链式反应进行，其特征为涉及两种引物的多重杂交、引物延伸和链置换事件的分支级联。这通常产生多连环双链核酸扩增产物的离散集合。滚环扩增可以在等温条件下用适合的核酸聚合酶例如Phi29 DNA聚合酶在体外实施。
在这里使用的多重置换扩增(MDA)是指核酸扩增方法，其中扩增包括使引物与变性核酸退火，接着链置换核酸合成的步骤。随着通过链置换合成核酸，出现逐渐增加的引发事件数目，形成超分支核酸结构的网络。MDA高度地可用于用于自少量基因组DNA样品产生具有有限序列偏崎的高分子量DNA的全基因组扩增中。可将诸如Phi29 DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶的大片段等链置换核酸聚合酶用于多重置换扩增。MDA经常在等温反应条件下进行，随机引物用于所述反应以达到具有有限序列偏崎的扩增。
在这里使用的术语“反应混合物”是指用于实施化学分析或生物测定的试剂或试剂溶液的组合。在某些实施方案中，反应混合物包含用于进行核酸（DNA）合成/扩增反应的所有必需成分。
在这里使用的术语“试剂溶液”或“适合于实施DNA合成反应的溶液”或“扩增溶液”是指任意的或全部的常用于实施扩增反应或DNA合成的溶液。它们包括但不局限于用于等温DNA扩增方法的溶液、用于PCR扩增反应的溶液等。适合于DNA合成反应的溶液可包含缓冲液、盐和/或核苷酸。它可进一步包含引物和/或待扩增的DNA模板。
在某些实施方案中，提供用于核酸扩增的试剂盒。所述试剂盒包含包装在一起的试剂，需要这些试剂以实施当前描述的核酸扩增方法。在一个实施方案中，该试剂盒包含核酸聚合酶、上述核苷酸类似物（例如，2-氨基-dA和2-硫代-dT）和LNA碱基。核酸聚合酶和其它试剂可包装于单一的容器中或它们可包装于分开的容器中。
在一个实施方案中，试剂盒包含包装在一起的Phi29 DNA聚合酶和具有末端错配引物二聚体结构的部分约束的引物。该试剂盒中的部分约束的引物可包含核苷酸类似物，如LNA核苷酸。在某些实施方案中，部分约束的引物为DNA-LNA嵌合引物。该试剂盒中的部分约束的引物可为核酸酶抗性引物，例如核酸外切酶抗性引物。该试剂盒中的这些核酸酶抗性引物可在核苷酸间包含一个或多个硫代磷酸酯键。在一个实施方案中，试剂盒包含Phi29 DNA聚合酶和5'- +W+WNNN*S-3'，其中“+”在锁定核酸碱基之前（即,“LNA碱基”，例如，+A＝腺苷LNA分子，对于其它核苷酸亦类似），“W”表示仅dA和dT的混合物，“S”表示仅dC和dG的混合物，“*”表示两个核苷酸间的硫代磷酸酯键。
在进一步的实施方案中，试剂盒包含用于实施这里描述的GenomiPhi AT方法的随机六聚体。具体而言，这种试剂盒包含具有如下通式的修饰六聚体：+N+N(atN)(atN)(atN)*N，其中如上文所描述，“+”在LNA碱基之前，(atN)表示2-氨基-dA、dC、dG和2-硫代-dT的随机混合物。备选地，这些试剂盒可包含由式(atN)(atN)(atN)(atN)(atN)*N表示的六聚体。
该试剂盒可进一步包含实施核酸扩增反应所需的试剂或试剂溶液。它可进一步包含详述试剂盒中所包含的具体成分或用于在核酸扩增反应中使用它们的方法或两者的说明书手册。
通过例示方式而非限制方式提供下列实施例。
实施例
实施例 1: MDA 速度和灵敏性上的改进
使用带有六聚体序列NNNN*N*N和75 mM KCl的标准GenomiPhi™试剂盒或利用“经清除的”GenomiPhi （参见，例如美国专利申请公开第2009/0155859号）、GenomiPhi SD （例如，美国专利第7,993,839号）或GenomiPhi AT配方实施扩增反应。使用枯草芽孢杆菌染色体DNA的系列稀释物，通过将少量的SYBR green I添加至扩增混合物中，并在Tecan平板读数器中监控荧光随时间的增加，实施实时扩增。也分析了无模板对照（NTC）。
将各反应中DNA扩增信号增加超过背景的阈值时间针对作为输入模板加入反应的DNA的量绘图。包含带有LNA和氨基-A/硫代-T的引物的反应在扩增动力学上显示大约10倍的增加。结果在图3A和图3B中进行了概述。
实施例 2: 包含 2- 氨基 -dA 和 2- 硫代 -dT 的寡核苷酸改进 MDA 的覆盖率和整体扩增偏倚
用100 pg枯草芽孢杆菌输入DNA实施了具有所示配方的标准GenomiPhi™反应或MDA反应。所述反应中的总扩增大约是20,000倍。将经扩增的DNA处理成文库并进行具有51个核苷酸的读取长度的Illumina GA全基因组测序。将每个样品的8-10百万个读出映射到枯草芽孢杆菌参照基因组中。图4A提供跨越基因组长度映射覆盖率水平的柱状图。相对标准偏差按以下公式计算：覆盖率标准偏差/平均覆盖率×100。也指出了覆盖率间隙的数量和这些间隙的平均长度。图4B提供了比较所述配方的柱状图表。
实施例 3 ：包含 2- 氨基 -dA 和 2- 硫代 -dT 的寡核苷酸改进 MDA 的序列偏倚
对于实施例3中所描述的扩增反应，针对基因组的每100个碱基对窗测定了覆盖率水平。将窗的GC含量针对具有该GC含量的窗的分数覆盖率绘图。结果展示于图5中，表明在扩增引物中包含氨基-A/硫代-T和LNA核苷酸提供增加的代表性扩增和降低的扩增偏倚两者。
实施例 4 ：使用 GenomiPhi AT 配方进行的单细菌细胞扩增
使用改进的GenomiPhi AT配方实施了扩增反应。通过将少量的SYBR green I添加至扩增混合物中，并在Tecan平板读数器中监控荧光随时间的增加，实施了实时扩增。将大肠杆菌细胞用含有10 mM Tris，pH 7.5，100 mM NaCl和0.1 mM EDTA的缓冲液稀释，用FM1-43FX染料（Invitrogen）染色，点样到384孔板的孔中，并用倒置荧光显微镜（Nikon）对细胞计数。将细胞通过加入1μl 0.2 M NaOH, 0.015% Tween-20裂解，在室温下孵育10min，并通过加入0.5 µl 0.4 M HCl, 0.6 M Tris, pH 7.5中和。向该混合物中加入扩增试剂，使反应物在30℃孵育所标示的时间。亦分析了无模板对照（NTC）。结果在图6A中进行了概述。
依照制造商说明书使用16S现成引物（NEB）和Amplitaq Gold试剂（Invitrogen）实施了PCR。将DNA通过1%琼脂糖凝胶电泳进行了分析，用SYBR金（Invitrogen）染色，并经Typhoon成像仪（GE Healthcare）扫描显现。参见图6B。
对经扩增的DNA进行了处理并进行如上所述的Illumina GA全基因组测序。在图6C中描绘了覆盖率水平、经映射的读出百分数和基因组覆盖率水平的柱状图。
在这里提到的所有的出版物、专利及专利申请均通过引用以其整体并入，其引用程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请均具体地和单独地被指出通过引用并入一样。
虽然在这里已阐明和描述了本发明的仅仅某些特征，但是本领域的技术人员可想到很多更改和变化。因此，应该理解的是，附加权利要求意图覆盖所有这样的落入本发明的真实精神内的更改和变化。

Claims (20)

1. 用于扩增核酸的方法，包括：
a）提供核酸模板；
b）使核酸模板与包含DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸和具有3'末端和5'末端的引物的反应溶液接触，其中所述引物包含：（i）提高引物的解链温度（Tm）的核苷酸类似物和（ii）防止引物二聚体形成的核苷酸类似物；以及
c）扩增所述核酸模板。
2. 权利要求1的方法，其中扩增所述核酸模板在等温条件下实施。
3. 权利要求1的方法，其中扩增所述核酸模板在高严格条件下实施。
4. 权利要求1的方法，其中所述DNA聚合酶为phi29 DNA聚合酶。
5. 权利要求1的方法，其中所述引物为随机引物。
6. 权利要求1的方法，其中所述引物为硫代酯化的(thioated)。
7. 权利要求1的方法，其中所述引物中的一种核苷酸类似物是在核苷酸碱基之前的锁定核酸（LNA），其中在所述引物中所述LNA核苷酸碱基的并入提高引物的Tm。
8. 权利要求7的方法，其中所述LNA核苷酸碱基不位于该引物的 3'末端。
9. 权利要求1的方法，其中所述引物中的一种核苷酸类似物为2-氨基-脱氧腺苷（2-氨基-dA），其中2-氨基-dA的并入提高所述引物的Tm。
10. 权利要求9的方法，其中所述引物进一步包含核苷酸类似物2-硫代-脱氧胸苷（2-硫代-dT），其中在所述引物中核苷酸类似物2-氨基-dA和核苷酸类似物2-硫代-dT的并入防止引物二聚体的形成。
11. 权利要求10的方法，其中所述引物进一步包含在核苷酸碱基之前的LNA。
12. 权利要求1的方法，其中所述引物是六聚体。
13. 权利要求12的方法，其中所述六聚体具有如下通用结构：(atN)(atN)(atN)(atN)(atN)*N，其中(atN)是六聚体的5'末端核苷酸，*N是六聚体的3'末端核苷酸，以及其中“N”表示脱氧腺苷（dA）、脱氧胞苷（dC）、脱氧鸟苷（dG）或脱氧胸苷（dT），“+”表示在核苷酸碱基之前的LNA，(atN)表示2-氨基-dA、dC、dG和2-硫代-dT的随机混合物，“*”表示硫代磷酸酯键。
14. 权利要求1的方法，其中扩增所述核酸模板包括滚环扩增（RCA）或多重置换扩增（MDA）。
15. 权利要求1的方法，其中所述方法允许痕量核酸的扩增。
16. 用于扩增核酸的试剂盒，包括：
（a）DNA聚合酶；
（b）脱氧核糖核苷三磷酸;以及
（c）具有3'末端和5'末端的引物，其包含：（i）提高引物的解链温度（Tm）的核苷酸类似物和（ii）防止引物二聚体形成的核苷酸类似物。
17. 权利要求16的试剂盒，其中所述DNA聚合酶为phi29 DNA聚合酶。
18. 权利要求16的试剂盒，其中所述引物为六聚体。
19. 权利要求18的试剂盒，其中所述六聚体具有如下通用结构：(atN)(atN)(atN)(atN)(atN)*N，其中所述六聚体的5'末端是(atN)，所述六聚体的3'末端是*N，“N”表示dA、dC、dG或dT，其中(atN)表示2-氨基-dA、dC、dG和2-硫代-dT的随机混合物，“*"表示硫代磷酸酯键。
20. 权利要求18的试剂盒，其中所述引物包含核苷酸类似物2-氨基-dA和核苷酸类似物2-硫代-dT。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109072244A (zh) * 2016-05-04 2018-12-21 通用电气公司 使用滚环扩增产物的无细胞蛋白质表达
CN110295241A (zh) * 2019-07-11 2019-10-01 深圳易致生物科技有限公司 用于检测尿路感染的引物组和包含该引物组的试剂盒
CN110997922A (zh) * 2017-08-11 2020-04-10 通用电气公司 使用双链多联体dna的无细胞蛋白质表达
CN111334562A (zh) * 2018-12-19 2020-06-26 合肥铼科生物科技有限公司 一种含有修饰引物的核酸扩增方法和试剂盒
CN112899346A (zh) * 2021-01-05 2021-06-04 南京普济生物有限公司 一种降低pcr非特异性扩增的核苷酸及其设计方法与应用
CN114277103A (zh) * 2022-01-21 2022-04-05 杭州飞时达生物科技有限公司 一种基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4071253A1 (en) 2012-07-26 2022-10-12 Illumina, Inc. Compositions and methods for the amplification of nucleic acids
US9938568B2 (en) 2013-07-26 2018-04-10 General Electric Company Ligase-assisted nucleic acid circularization and amplification
US9587263B2 (en) * 2014-03-26 2017-03-07 General Electric Company Isothermal amplification under low salt condition
US10683534B2 (en) * 2015-01-27 2020-06-16 BioSpyder Technologies, Inc. Ligation assays in liquid phase
EP3201350B1 (en) * 2014-09-30 2020-12-02 Global Life Sciences Solutions USA LLC Method for nucleic acid analysis directly from an unpurified biological sample
CN115161178A (zh) 2015-09-09 2022-10-11 集联健康有限公司 用于样品收集、稳定化和保存的系统、方法和装置
US11299776B2 (en) 2017-05-10 2022-04-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and devices related to amplifying nucleic acid at a variety of temperatures
FR3110602A1 (fr) 2020-05-20 2021-11-26 Anova-Plus Methode de detection sur le terrain de la presence et de la mutliresistance d’un bio-agresseur, notamment dezymo-septoria tritici,dans des culturescerealieres
FR3129407A1 (fr) 2021-11-25 2023-05-26 Anova-Plus Methode de detection de la presence d’un pathogene et determination de ses caracteristiques en sante humaine et animale

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002042490A1 (en) * 2000-11-24 2002-05-30 Asper OÜ Method of optimising the sequences of synthetic nucleic acids

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040086880A1 (en) * 1999-07-20 2004-05-06 Sampson Jeffrey R Method of producing nucleic acid molecules with reduced secondary structure
US7993839B2 (en) * 2001-01-19 2011-08-09 General Electric Company Methods and kits for reducing non-specific nucleic acid amplification
US20020197618A1 (en) * 2001-01-20 2002-12-26 Sampson Jeffrey R. Synthesis and amplification of unstructured nucleic acids for rapid sequencing
US6617137B2 (en) 2001-10-15 2003-09-09 Molecular Staging Inc. Method of amplifying whole genomes without subjecting the genome to denaturing conditions
US20030165859A1 (en) * 2001-10-23 2003-09-04 Invitrogen Corporation Primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
US7176002B2 (en) 2002-05-16 2007-02-13 Applera Corporation Universal-tagged oligonucleotide primers and methods of use
EP1426448A1 (en) 2002-12-03 2004-06-09 bioMérieux BV Method for lowering the effects of sequence variations in a diagnostic hybridization assay, probe for use in the assay and assay
US8871469B1 (en) 2004-11-13 2014-10-28 Steven Albert Benner Self-avoiding molecular recognition systems in DNA priming
DK1885880T3 (da) 2005-04-29 2010-11-08 Synthetic Genomics Inc Amplifikation og kloning af enkelte DNA-molekyler ved anvendelse af rolling circle-amplifikation
ES2360738T3 (es) 2006-06-01 2011-06-08 Trilink Biotechnologies Cebadores de oligonucleótidos modificados químicamente para la amplificación de ácido nucleico.
ES2647237T3 (es) 2007-07-03 2017-12-20 Genaphora Ltd. Cebadores quiméricos para reacciones de amplificación de ácidos nucleicos mejoradas
EP2212434A1 (en) 2007-10-01 2010-08-04 Applied Biosystems Inc. Chase ligation sequencing
JP2013507910A (ja) 2009-10-13 2013-03-07 シンテッツァ モレキュラー ディテクション イスラエル リミテッド 核酸試料から標的配列を増幅するための方法および組成物
US20110195457A1 (en) 2010-02-09 2011-08-11 General Electric Company Isothermal amplification of nucleic acid using primers comprising a randomized sequence and specific primers and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002042490A1 (en) * 2000-11-24 2002-05-30 Asper OÜ Method of optimising the sequences of synthetic nucleic acids

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DETTER J.C.等: "Isothermal strand-displacement amplification applications for high-throughput genomics", 《GENOMICS》 *
LATORRA D.等: "Design considerations and effects of LNA in PCR primers", 《MOLECULAR AND CELLULAR PROBES》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109072244A (zh) * 2016-05-04 2018-12-21 通用电气公司 使用滚环扩增产物的无细胞蛋白质表达
US11421259B2 (en) 2016-05-04 2022-08-23 Global Life Sciences Solutions Operations UK Ltd Cell-free protein expression using rolling circle amplification product
CN110997922A (zh) * 2017-08-11 2020-04-10 通用电气公司 使用双链多联体dna的无细胞蛋白质表达
CN110997922B (zh) * 2017-08-11 2024-04-16 环球生命科学解决方案运营英国有限公司 使用双链多联体dna的无细胞蛋白质表达
CN111334562A (zh) * 2018-12-19 2020-06-26 合肥铼科生物科技有限公司 一种含有修饰引物的核酸扩增方法和试剂盒
CN110295241A (zh) * 2019-07-11 2019-10-01 深圳易致生物科技有限公司 用于检测尿路感染的引物组和包含该引物组的试剂盒
CN112899346A (zh) * 2021-01-05 2021-06-04 南京普济生物有限公司 一种降低pcr非特异性扩增的核苷酸及其设计方法与应用
CN114277103A (zh) * 2022-01-21 2022-04-05 杭州飞时达生物科技有限公司 一种基于六聚体随机引物高效滚环扩增方法

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