JP2013507910A - 核酸試料から標的配列を増幅するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、概して、所定の標的配列のホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物を含むＰＣＲ反応混合物、たとえば多重ＰＣＲ反応混合物；１以上の標的ポリヌクレオチド配列の検出のためにこれを利用する方法；およびこれを含むキットに関する。
【選択図】図１

Description

本発明は、概して、所定の標的配列のホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物、例えば多重ＰＣＲ反応混合物；対象の標的ポリヌクレオチド配列の検出のためにこれを利用する方法；ならびにこれを含むキットに関する。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリアルタイム定量ＰＣＲ
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の発明により、核酸配列のインビトロ増幅が可能になった。ＰＣＲは、米国特許第ＵＳ４，６８３，１９５号；第ＵＳ４，６８３，２０２号；および第ＵＳ４，９６５，１８８号に記載されている。

さらに、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティー）などの商業的製造供給元が、ＰＣＲ試薬を販売し、ＰＣＲプロトコルを公開している。

ＰＣＲは、典型的には、第１増幅サイクルにおいてテンプレートの有効な利用を可能にする初期変性ステップから開始し、続いてＰＣＲ増幅のサイクルを行う。ＰＣＲ増幅の各サイクルで、二本鎖標的配列を変性させ、プライマーを変性した標的の各鎖にアニールし、そしてプライマーは、「変性」、「アニーリング」、および「伸長」ステップと呼ばれるＤＮＡポリメラーゼの作用により伸長される。新たに合成されたＰＣＲ産物の突出末端を埋めるために、最終伸長ステップを含めることができる。増幅の特異性は、プライマーハイブリダイゼーションの特異性に依存する。プライマーは、標的核酸配列の核鎖の３’末端に存在する配列と相補性であるか、または実質的に相補性であるように選択される。

定量ＰＣＲ（「リアルタイムＰＣＲ」または「ｑＰＣＲ」と呼ばれる場合もある）は、２つのオリゴヌクレオチドプライマーが増幅されるＤＮＡの側面に位置する、ＰＣＲと同じ増幅スキームを利用する。ｑＰＣＲでは、反応産物が形成される際にそれらをモニタリングする。蛍光標識に依存するいくつかの方法を、リアルタイムモニタリングに用いることができる。リアルタイムモニタリングで用いられる一般的な一方法は、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ蛍光染料などのＤＮＡ結合蛍光染料を用いる。別の方法は、蛍光タグで一端が標識され、蛍光クエンチャー（ＦＲＥＴプローブ）で他端が標識された標的特異的オリゴヌクレオチドプローブを添加する。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）は、２つの蛍光分子間のエネルギー転移機構である。ＴａｑＭａｎ（登録商標）変異体では、オリゴヌクレオチドの一端の蛍光標識をその特異的蛍光励起波長で励起する。この励起状態を次いでオリゴヌクレオチドの他端のクエンチャー分子標識に非放射活性的に移す。定量ＰＣＲ反応では、ＤＮＡ標的と結合するプローブをプライマー伸長中にプローブから切断し、それにより蛍光タグを放出して、エネルギーが転移することなくその特異的蛍光励起波長でシグナルを放出する。

オリゴヌクレオチドＦＲＥＴプローブにより放出されるシグナルは、典型的には、反応におけるＰＣＲ産物の量に正比例して増大する。各サイクルでの蛍光発光の量を記録することにより、ＰＣＲ反応を、ＰＣＲ産物の量における第１の有意な増加が標的テンプレートの初期量に相関する対数期中モニタリングする。出発核酸標的のコピー数が高いほど早く蛍光において有意な増加が観察される。サイクル１０を越える各サイクルで測定されるベースライン値を上回る蛍光における有意な増加は、蓄積されたＰＣＲ産物の検出を示す。当業者は、米国特許第５，９２５，５１７号、第６，０３７，１３０号、第６，１０３，４７６号、第６，１５０，０９７号、第６，４６１，８１７号および第７，３８５，０４３号に記載されている分子ビーコン、エクリプスプローブ（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｒｏｂｅｓ）、およびスコーピオンプライマー（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ Ｐｒｉｍｅｒ）およびサンライズプライマー（Ｓｕｎｒｉｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ）変異体におけるような蛍光標識されたプライマーの使用をはじめとするさらなる周知方法を認識しているであろう。

臨床材料において対象のポリヌクレオチド配列を検出するためのｑＰＣＲの使用
試験試料において対象の標的ポリヌクレオチド配列を検出するために、ｑＰＣＲが使用されてきた。標的ポリヌクレオチド配列の１つの例示的タイプは、典型的には、感染性疾患について試験するために臨床材料において分析される、対象の病原体に特徴的なものである。ＵＳ６６６４０８０（Ｋｌａｕｓ Ｐｆｅｆｆｅｒ、標題“ＴａｑＭａｎ■−ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎｓ”）は、ＰＣＲベースのアッセイにおいて、腸毒素原性、腸管凝集性、腸管組織侵入性、腸内病原性および腸管出血性大腸菌株をはじめとする病原性大腸菌株のサブグループを検出するために有用なプローブおよびプライマーを記載している。中でも、米国特許出願第２００９／０１８１３６３号、標題“Ｎｏｎ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｓｈ Ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ”、米国特許出願第２００６／０１７７８１８号、標題“Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ”、およびその中での引用文献に記載されているように、ｑＰＣＲは、ウイルスを検出するためにも用いられてきた。

ｑＰＣＲは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）などの抗生物質耐性病原体を特異的に検出するためにも用いられてきた。米国特許出願第２００９／００８１６６３号（Ｙｏｓｅｆ Ｐａｉｔａｎ、標題“Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｋｉｔｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｂａｃｔｅｒｉａ”は、例えば、（ａ）標的細菌に対して特異的な遺伝子；（ｂ）抗生物質耐性遺伝子；および（ｃ）細菌ゲノムの既知領域と抗生物質耐性カセットの通常の組み込み部位との間の架橋領域を増幅する多重ｑＰＣＲの使用を記載している。ＵＳ６３２９１３８（Ｈａｎｓ Ｄｅ Ｂｅｅｎｈｏｕｗｅｒら、標題“Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ”は、リファンピシンおよびその類似体に対して耐性であるヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）株を検出するためのＰＣＲベースのアッセイで有用なプローブおよびプライマーを記載している。ＵＳ７０４５２９１（Ｎａｎｃｙ Ｈａｎｓｏｎら、標題“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡｍｐＣ ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ ｇｅｎｅｓ”は、あるＡｍｐＣベータラクタマーゼを検出するためのプローブを記載している。ＵＳ５９９４０６６、ＵＳ６００１５６４、および国際特許出願第ＷＯ／１９９６／００８５８２号（Ｂｅｒｇｅｒｏｎら、クレイトン大学に譲渡）は、インフルエンザ菌（Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、腐性ブドウ球菌（Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、および種々のストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）から選択される特定の細菌種からのｂｌａ_ｔｅｍ、ｂｌａ_ｒｏｄ、ｂｌａ_ｓｈｖ、ｂｌａ_ｏｘａ、ｂａｌ_ｚ、ａａｄＢ、ａａｃＣ１、ａａｃＣ２、ａａｃＣ３、ａａｃＡ４、ａａｃ６’−ＩＩａ、ｅｒｍＡ、ｅｒｍＢ、ｅｒｍＣ、ｍｅｃＡ、ｖａｎＨ、ｖａｎＸ、ｖａｎＢ、ｓａｔＡ、ａａｃＡ−ａｐｈＤ、ｖａｔ、ｖｇａ、ｍｓｒＡ、ｓｕｌおよびｉｎｔから選択される細菌の抗生物質耐性遺伝子を検出するためのプローブを記載している。米国特許出願第２００４／０１８５４７８は、微生物学研究室での診断のために臨床材料から細菌性および真菌性病原体ならびにそれらの抗生物質耐性遺伝子を迅速に検出および同定するための種特異的プローブ、属特異的プローブおよびユニバーサルＤＮＡプローブおよび増幅プライマーを記載している。Ｈｕｌｅｔｓｋｙ Ａら（Ｎｅｗ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｆｒｏｍ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００４；４２（５）：１８７５−８４）も参照。

ｑＰＣＲは、とりわけＵＳ６６７３５４１および５８６１５０４ならびに米国特許出願第２００９／００２３６０３号、第２００６／００９９６２０号、および第２００８／０２８６７７３号で記載されているように、法医学試料において標的ポリヌクレオチド配列を特異的に検出するためにも用いられてきた。多くの場合、いくつかの増幅反応を多重アッセイで実施して、非常に限られた利用可能なＤＮＡ試料を最大限利用する。

ｑＰＣＲは、とりわけＵＳ７５０７８００および６０８３６９８ならびに米国特許出願第２００５／００９５５９２号で記載されているように、ヒトＤＮＡマーカー、例えばＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２を特異的に検出するためにも用いられてきた。多くの場合、いくつかの増幅反応を多重アッセイで実施して、コストおよび速度を最小限に抑える。

ＰＣＲにおける非特異的ハイブリダイゼーション
ＰＣＲでは、非特異的増幅産物の生成が起こる可能性がある。人工物が、プライマー間またはプライマーとＴａｑＭａｎ（登録商標）や分子ビーコンプローブなどのプローブとの間の弱い相互作用の結果として、「プライマー−二量体」（Ｒｙｃｈｌｉｋ， １９９５）および「プライマー−プローブ二量体」として表される不適切なハイブリダイゼーション産物から誘導される場合がある。プライマーの３’末端と反応ミックス中の非標的オリゴヌクレオチド鎖中の塩基との間の弱い相補性の結果として、望ましくない産物が形成される可能性がある。これにより、プライマーの非標的鎖へのアニーリングと、それに続く熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによる非特異的二量体の開始および伸長が可能になり、望ましくない副生成物の増幅に至る。

リアルタイムＰＣＲでは、アッセイの感度のためにこの問題が悪化する可能性がある。この問題は、多重ＰＣＲ増幅反応では、反応ミックス中に複数のプライマーセットおよびプローブが存在することにより、非特異的ハイブリダイゼーションの尤度が増大して、さらに悪化する。これらの問題は、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０（７）：１７１７−１７２３でさらに議論されるように、感度およびデータ品質の低下につながる可能性がある。非特異的増幅はまた、実施できるサイクル数を減少させ、アッセイの感度を低下させる。

「ホットスタート」法および非特異的増幅に対する他の解決策
反応の開始前に、非標的配列に結合したプライマーからの伸長産物の形成を減少させることによって、非特異的増幅を低減することができる。非特異的増幅の問題に対処する一方法は、「ホットスタート」プロトコルと呼ばれ、この方法では、温度が、必要とされるハイブリダイゼーション特異性を提供するために十分上昇するまで、１以上の重要な試薬を反応混合物に添加しない。このように、反応混合物は、反応条件が非特異的プライマーハイブリダイゼーションを許容する期間中はプライマー伸長を支援することができない。

最初の高温インキュベーションステップ後に反応管を開け、そして失われた試薬を添加することにより、ホットスタート法を手動で実施することができる。しかし、手動ホットスタート法は、労力を要し、反応混合物の汚染のリスクも増加することは言うまでもない。反応成分を分離または隔離するためにワックスなどの熱不安定材料を使用するホットスタート法は、米国特許第５，４１１，８７６号およびＣｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， １９９２（上記）に記載されている。これらの方法では、高温プレ反応インキュベーションにより熱不安定材料を融解させ、それにより試薬を混合させる。

反応開始前に非標的配列に結合したプライマーからの伸長産物の形成を低減する別の方法は、熱可逆的な方法でＤＮＡポリメラーゼに非共有結合する化合物を用いて、ＤＮＡポリメラーゼを阻害することによる。米国特許第５，３３８，６７１号は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害するための、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対して特異的な抗体の使用を記載している。この方法の短所は、ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体の産生が、特に大量では、高価であり、時間がかかることである。さらに、反応混合物に抗体を添加することは、増幅反応の再設計を必要とする可能性がある。

米国特許第５，６７７，１５２号および第５，７７３，２５８号（Ｄａｖｉｄ Ｅｄｗａｒｄ Ｂｉｒｃｈら、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃに譲渡、どちらも標題 “Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｅｎｚｙｍｅ”）は、「ホットスタートポリメラーゼ」として知られる、非特異的増幅反応を減少させる別の方法を記載している。Ｔａｑポリメラーゼ酵素は、化学修飾によって可逆的に不活性化される。酵素活性は、増幅反応前に、または増幅反応の一部として、反応混合物を高温でインキュベートすることにより回復される。非特異的増幅は減少する。なぜなら、反応混合物は、活性化高温インキュベーション前に伸長産物の形成を支援しないからである。

米国特許出願第２００４／０１９７８００（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂｏｒｎｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅに譲渡）は、ホットスタートおよび非ホットスタートＤＮＡポリメラーゼのブレンドを開示している。

非特異的増幅反応を減少させる別の方法は、米国特許出願第２００５／０２５５４８６号および第２００８／００３８７２４号（Ｍａｒｋ Ｂｅｈｌｋｅら、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃに譲渡、標題“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ”に記載されている。増幅で用いられるプライマーセットは、２種のプライマーの混合物から構成されている。一方向の伸長に関しては、プライマーは、プライマーとして機能的であるが、すべて、ＤＮＡポリメラーゼによって複製できるテンプレートとして機能するそれらの能力を排除する修飾を含む。反対方向の伸長に関しては、セットは、テンプレートとして機能でき、その全長にわたってＤＮＡポリメラーゼにより複製できる少なくとも１つプライマーを含む。プライマーセット中の少なくとも１つプライマーは核酸ポリマーとハイブリダイズする。非複製可能プライマーが核酸ポリマーとハイブリダイズし、伸長されて、核酸ポリマー由来の配列を含む伸長産物を産生し、これに対して複製可能なプライマーが次にハイブリダイズするのが好ましい。

ＬＧ Ｐｕｓｋａｓらによる論文（Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ ｉｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ＰＣＲ；Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １９９５；５（３）：３０９−１１）は、３’−ジデオキシ−末端コンペティターオリゴヌクレオチドを増幅混合物に添加することにより、非特異的増幅を減少させる別の方法を記載している。コンペティターオリゴヌクレオチドは、報告によると、非特異的増幅反応を阻害する。

非特異的ハイブリダイゼーションを減少させるために修飾されたプライマー
ＵＳ６，００１，６１１（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｇｏｒｄｏｎ Ｗｉｌｌ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃに譲渡、標題“Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒｓ”， は、一般構造：
（式中、Ｓ_１は、約５〜約５０ヌクレオチドの長さのヌクレオチドの第１の配列を表し；
式中、Ｓ_２は、１〜３ヌクレオチドの長さの第２の配列を表し；
式中、Ｎは、環外アミンを含むプリンまたはピリミジン塩基を含むヌクレオチドを表し；
式中、Ｒはモディファイアー基を表し、Ｒは環外アミンの窒素原子と共有結合し、Ｒは構造：
を有する）
を有する別の種類の修飾されたオリゴヌクレオチドプライマーを記載している。

修飾されたプライマーは報告によると、非特異的増幅、特にプライマー−二量体形成を減少させ、および／または、修飾された塩基と相補性塩基とのワトソン・クリック塩基対形成および／または修飾されたプライマーの伸長と干渉することにより、修飾されていないプライマーを用いて実施した増幅に関して意図される標的の収率を付随して増大させる。

ホットスタートプライマー
非特異的反応を減少させるための別の機構は、「ホットスタートプライマー」として知られる、高温で活性化されるプライマーの使用である。ホットスタートプライマーの１種は、ＵＳ６，４８２，５９０（Ｅｄｗｉｎ Ｕｌｌｍａｎら、Ａｖｅｎｔｉｓ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＧｍｂＨに譲渡、標題“Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”、これはポリヌクレオチドにそって非効率的にしか伸長できない３’末端を有する修飾オリゴヌクレオチドを記載する）に記載されている。修飾されたヌクレオチドは、報告によれば、周囲温度でのＰｆｕポリメラーゼ活性の３’−エキソヌクレアーゼ活性に対して比較的耐性であるが、温度が上昇するにつれてゆっくりと分解されて、修飾されたヌクレオチドが除去され、結果として、機能的プライマーがＰＣＲ反応中に徐々に導入され、それにより全体的な特異性が改善される。

米国特許出願第２００７／０１２８６２１号（Ａｐｐｌｅｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに譲渡）は、ステムループ構造を有し、ｍＲＮＡ標的に対するホットスタートプライマーとミクロＲＮＡ標的に対するレギュラープライマーとを含むｍＲＮＡおよびミクロＲＮＡ標的の多重増幅のＰＣＲ反応混合物を記載している。

米国特許出願第２００７／０２８１３０８号（Ｇｅｒａｌｄ Ｚｏｎら、標題“Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”は、熱により除去可能な修飾基を、好ましくは３’末端で含むプライマーを開示し、この基は、増幅の初期変性ステップ中に解離する。不活性プライマーが機能的プライマーとの混合集団中に存在する可能性がある。

国際特許出願第ＷＯ２００９／００４６３０（Ｏｆｅｒ Ｐｅｌｅｇ ｏｆ Ｇｅｎａｐｈｏｒａ Ｌｔｄ、標題“Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ”）、およびＰｅｌｅｇらによる論文（Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＤＮＡ／ＲＮＡ ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ ａｎｄ Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００９；７５（１９）：６３９３−８）は、非特異的増幅反応を減少させるために用いられる別の種類のプライマーを記載している。開始ゾーンに近接した隣接しない位置にいくつかのリボヌクレオチドを組み入れるこれらのプライマーは、報告によれば、非特異的増幅産物の形成を減少させる。

別の種類のホットスタートプライマーが、Ｍ Ａｉｌｅｎｂｅｒｇらによる論文（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｈｏｔ ｓｔａｒｔ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｏｕｔ ＰＣＲ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｏｕｃｈ−ｕｐ ａｎｄ ｌｏｏｐ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ （ＴＵＬＩＰＳ）． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． ２０００；２９（５）：１０１８−２０， １０２２−４）およびＯＫ Ｋａｂｏｅｖら（ＰＣＲ ｈｏｔ ｓｔａｒｔ ｕｓｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ（ｈａｉｒｐｉｎ−ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０００；２８（２１）：Ｅ９４）（これらは、３’領域にセルフアニーリングし、重合の開始を阻害するさらなる非テンプレート５’配列を含むループプライマーを記載している）に記載されている。反応混合物を加熱すると、プライマーのループ領域は、報告によれば融解し、活性化する。

共有結合性化学修飾を含むホットスタートプライマーも文献で記載されている。米国特許出願第２００３／０１１９１５０号（Ｗａｌｔｒａｕｄ Ａｎｋｅｎｂａｕｅｒら、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓに譲渡、標題“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｈｏｔ ｓｔａｒｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”は、少なくとも１つプライマーの３’末端で化学修飾を含むプライマーの使用を記載している。反応混合物はさらに、周囲温度で不活性であり、熱安定性エキソヌクレアーゼも含み、したがって修飾されたプライマーが影響を受けないまま残る。温度が上昇すると、エキソヌクレアーゼは活性になり、プライマーの３’修飾を除去し、増幅のためにプライマーを活性化する。

米国特許出願第２００３／０１６２１９９号（Ａｌｅｘ Ｂｏｎｎｅｒ、ＢｉｏＬｉｎｋ Ｐａｒｔｎｅｒｓ， Ｉｎｃに譲渡、標題“Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”は、標的核酸（複数可）、プライマー（複数可）またはヌクレオシド三リン酸の、熱を用いて核酸から放出することができる除去可能な保護基での修飾を記載している。化学修飾は、グリオキサール、その誘導体、３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸無水物、３−エトキシ−２−ケトブチルアルデヒド（ケトキサール）、ニンヒドリン、ヒドロキシアセトン、シュウ酸ジエチル、メソシュウ酸ジエチル、１，２−ナフトキノン−４−スルホン酸、ピルボアルデヒド、アミド、γ−カルボキシアシルアミド、アミジン、およびカーバメートから選択することができる。

ＡＶ Ｌｅｂｅｄｅｖらによる論文（Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｈｅａｔ−ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ ｐｒｉｍｅｒｓ： ａ ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＰＣＲ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００８． ３６（２０）：ｅ１３１）は、１〜２個の熱不安定性４−オキソ−１−ペンチル（ＯＸＰ）ホスホトリエステル（ＰＴＥ）修飾基を３’末端で、そして３’末端から２番目のヌクレオチド間結合を含む別の種類のホットスタートプライマーを記載している。これらの修飾は、報告によれば、プレ反応条件下でＤＮＡポリメラーゼプライマー伸長を損なう。高温でのＯＸＰ修飾プライマーのインキュベーションにより、対応する非修飾ホスホジエステル（ＰＤＥ）プライマーを得、これは好適なＤＮＡポリメラーゼ基質である。

ＵＳ６，７９４，１４２号（Ｗａｌｔｅｒ Ｊ． Ｌａｉｒｄら、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃに譲渡、標題“Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ”）は、３つの３’末端ヌクレオチド位置内に修飾ヌクレオチドを含むホットスタートプライマーを記載し；この場合、修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−フルオロ−ヌクレオチド、２’−アミノヌクレオチド、またはアラビノースヌクレオチドである。これらの修飾プライマーは、報告によれば、初期プライマー伸長が起こるのに必要な時間を増加させることにより、おそらくはプライマー−標的二本鎖を伸長に関してあまり好ましくないテンプレートにすることによって、非特異的増幅を減少させる。これにより、プレ反応条件下でのプライマー間などの不安定で一時的なハイブリダイゼーション二本鎖が、プライマー伸長が起こるために十分な時間存在する可能性が減少する。

異なる種類のホットスタートプライマーがＤＤ Ｙｏｕｎｇら（Ｌｉｇｈｔ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ． Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ （Ｃａｍｂ）． ２００８；（４）：４６２−４）による論文で記載されている。これらのプライマーは、ＵＶ照射により除去可能である立体的に要求が厳しいケージ作用を有する基で修飾されている。修飾されていないプライマーは、報告によれば、ＵＶ照射に暴露されるまではＰＣＲ反応を触媒することができず、その後、反応は正常に進行する。そのようなプライマーは、反応混合物がアニーリング温度まで加熱され、次いでＵＶ照射に暴露される、ホットスタートプロトコルに好適である。

「リボプライマー」
米国特許出願第２００９０３２５１６９号およびが第２０１００１６７３５３号（どちらもＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（ＩＤＴ）に譲渡、標題“ＲＮａｓｅ Ｈ−Ｂａｓｅｄ Ａｓｓａｙ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＲＮＡ Ｍｏｎｏｍｅｒｓ”は、別の種類のホットスタートＰＣＲプライマーである「リボプライマー」を記載している。これらのプライマーは、ホットスタート成分が熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈまたはこの反応で用いられる高温で活性を獲得する他のニッキング酵素であるＰＣＲ反応ミックスに好適である。修飾プライマーは、ＤＮＡと結合する場合にＲＮａｓｅ Ｈ２切断部位を生成する内部修飾ヌクレオチドを有する。加えて、プライマーは、３’ブロッキング基を含み、これは、ブロッキング基が除去されるまでＰＣＲを支援するプライマーの能力を排除する。ＲＮａｓｅ Ｈ２による切断は、プライマーおよび標的の二本鎖形成を必要とし、プライミングの特異性を増大させ、これはプライマー−二量体形成の影響を減少させて、これによりバックグラウンドシグナルを低下させ、全体的な反応特異性を改善する。

核酸増幅反応における他の種類の非機能的プライマー
多くの他の参考文献は、核酸増幅反応における非機能的または拮抗的プライマーの使用を記載している。米国特許出願第２００３／０１０４４３０号および国際出願第ＷＯ００／６１８１７号（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｎｅｒｅｎｂｅｒｇら、標題“Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”）は、たとえば、バイオ電子マイクロチップ技術と組みあわせた、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）のためのプライマーミックス中の非切断性プライマーの使用を記載している。ＳＤＡは、等温性非同期性核酸増幅プロセスである。非切断性プライマーは、二本鎖テンプレートの変性前にニッキングされ、かくして固定ＳＤＡにおけるシグナル強度を改善するシグナルを保持するか、または増幅を所望の方向になるようバイアスをかけることが意図される。非切断性プライマーは、正常なＳＤＡプライマーとの組みあわせで提供することができる。

米国特許第５，７１２，３８６号（Ｃｈａｎｇ−Ｎｉｎｇ Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに譲渡）は、プライマーとハイブリダイズするブロッキングヌクレオチドを開示している。ブロッキングヌクレオチドおよびプライマーは、０．３〜５．０のブロッキングヌクレオチド／プライマーモル比で存在し得る。

ホットスタートプライマーを使用する多重ＰＣＲ反応で増幅に失敗する問題
理想的には、コストや複雑さを最小限に抑え、できるだけはやく試験結果を得るために、ｑＰＣＲアッセイは、広範なＤＮＡ精製手順を必要とすべきではなく、１つの試験管中で実施するべきである。しかし、ある種類の多重ＰＣＲ、たとえば（ａ）抗生物質耐性病原体の検出；（ｂ）細菌性もしくはウイルス性病原体またはヒトＤＮＡマーカーの１以上のパネルの検出のための多重ＰＣＲスクリーニング試験；および（ｃ）法医学試料のＰＣＲアッセイは、この点に関して独自の課題を提示する。いくつかの増幅反応は平行して実施しなければならないので、そのような高感度アッセイで重大なシグナルを生成しやすい非特異的増幅の可能性が増大する。菌株間の配列変動は、問題をさらに複雑にする。したがって、臨床材料の多重ＰＣＲ増幅を可能にする反応混合物が当該技術分野で差し迫って必要とされている。これらの問題に対処するために、リボプライマーなどのホットスタートプライマーが開発されてきた。

しかし、本明細書中で示されるように、リボプライマーなどのホットスタートプライマーに関してさらなる問題が観察される可能性がある。これらのプライマーは、特に多重反応で、広範に精製されなかったＤＮＡ試料では１以上の標的を効率的に増幅できない可能性がある。このように、従来技術では、臨床材料の多重ＰＣＲ増幅を可能にする反応混合物を提供する問題に有効に対処することができなかった。本発明の方法および組成物は、従来技術のこれらの不備を克服することを目的とする。

本明細書中で以下に記載する本発明は、既存のｑＰＣＲ法の限界、特に背景技術の部分で記載した不備の少なくとも一部を克服することに関する。

本発明の実施形態は、効率的な多重ＰＣＲ増幅の問題に対する簡単で経済的な解決策を提供する、プライマーベースのインビトロ核酸増幅のための方法および試薬に関する。

本発明の一態様は、プライマーベースの増幅反応を用いた核酸配列のインビトロ増幅用キットに関し、このキットは、ホットスタートプライマーおよびレギュラープライマーの混合物（どちらも特定のアンプリコンの同じ末端に対する）を含む。異なるプライマーによって認識される配列は、同一であるか、重複するか、または重複しない可能性がある。キットは、典型的には１以上の増幅試薬、たとえば、核酸ポリメラーゼ，ヌクレオシド三リン酸、および／または好適な緩衝液を含む。さらに、キットは、増幅産物を検出するための手段などのさらなる成分を含んでもよい。

本発明の別の態様は、核酸を増幅するための方法に関し、この方法は、ホットスタートプライマーおよびレギュラープライマーの混合物（どちらも特定のアンプリコンの同じ末端に対する）を用いてプライマーベースの核酸増幅反応を実施するステップを含む。したがって、本発明は、試料中に含まれる標的核酸を増幅するための方法であって：（ａ）標的核酸および１対のプライマー（ホットスタートプライマーおよびレギュラープライマーの前記混合物を含む）を含む増幅反応混合物を提供するステップ；および（ｂ）ステップ（ａ）の反応混合物を核酸の増幅に好適な条件下で処理するステップを含む方法を提供する。ある実施形態では、多重ＰＣＲ反応が実施されるように、複数のプライマーセットが含まれる。ある他の実施形態では、分析される試料は臨床材料由来であり、試料の核酸は広範に精製されていない。

本発明のある実施形態では、本発明の方法および組成物は、ホットスタートプライマーおよびレギュラープライマーの混合物である、１以上の標的に対するプライマー、ならびにホットスタートプライマーのみである、１以上の他の標的に対するプライマーのどちらも使用する。

本発明の別の態様は、ホットスタートプライマーおよびレギュラープライマーの混合物（どちらも特定のアンプリコンの同じ末端に対する）を含む増幅反応混合物に関する。

本発明の別の態様は、不活性化化学修飾を含む少なくとも１つのホットスタートプライマーを利用するＰＣＲ増幅の改善法に関し、この場合、ホットスタートプライマーが高温で相補配列とハイブリダイズする場合、不活性化化学修飾は可逆性であり、改善は、ホットスタートプライマーと同じ標的に対する（同じ配向で、同じアンプリコンに対する）非ホットスタート／機能的プライマーを提供することからなる。別の実施形態において、改善は、ホットスタートプライマーと同じ標的に対する非ホットスタート／機能的プライマーを提供することを含む。ある実施形態では、多重ＰＣＲ反応が実施されるように、複数のプライマーセットが含まれる。ある他の実施形態では、分析される試料は臨床材料由来であり、この試料の核酸は広範に精製されていない。ある実施形態では、改善は、本明細書中に記載される本発明のさらなる態様をさらに構成し得る。

本発明の方法および組成物のある実施形態は、特にこれらは一般的に広範なＤＮＡ精製手順を必要とせず、単一の試験管中で実施することができるので、コストや複雑さの低減および試験結果の迅速な取得を可能にする。ヒト同一性を決定するためにまとめて用いることができる複数のヒトＤＮＡマーカーの検出のために法医学試料をスクリーニングするための多重ＰＣＲでは、複数の増幅反応を平行して実施して、多くの場合、非常に限られた利用可能なＤＮＡ試料を最大限に利用する。抗生物質耐性病原体を検出するための多重ＰＣＲでは、複数の増幅反応を平行して実施し（たとえば、米国特許出願第２００９／００８１６６３号を参照）、ｑＰＣＲなどの高感度法を用いて検出されやすい非特異的増幅の可能性を増大しなければならない。細菌性またはウイルス性病原体の１以上のパネルを検出するための多重ＰＣＲスクリーニング試験についても同じ要求が存在し、この場合、相対的定量的な細菌またはウイルス負荷は臨床的に関連するものである。加えて、本明細書中に提示される知見は、臨床材料が、ミスマッチまたはプライマー−標的ハイブリダイゼーション結合の弱化に寄与する他の因子が存在する場合に、ＰＣＲの効率を低下させ、ホットスタートプライマーを用いるＰＣＲを阻害する物質を含むことが多いことを示す。これらの課題は、本発明の範囲内の特定の方法および組成物によって対処される。

ホットスタートプライマー、たとえばリボプライマー、および類似した種類のプライマーは、プライマー−二量体形成および他の非特異的反応を低減し、したがって多重ＰＣＲ反応において著しい進歩である。しかし、高度の精製に付されていない臨床材料が、リボプライマーを利用するＰＣＲ反応を阻害し得る１以上の因子を含むということがここでは意外にも見いだされた。場合によっては、阻害は、１以上の特異的増幅シグナルを減少させ、アッセイ感度に対して悪影響を及ぼす可能性がある。本発明の方法および組成物のある実施形態は、意外にも、この種の阻害を劇的に改善することが見いだされた。これらの方法および組成物が、反応の特異性を損なったり、または非特異的増幅産物を導入したりすることなく、前記阻害を克服できることは、さらに予想外であった。

本明細書中で用いられる場合、「含む」とは、記載される所定の特徴、整数、ステップ、または成分の存在を規定するが、１以上の特徴、整数、ステップ、もしくは成分、またはそれらの群の存在または付加を排除しないと解釈される。したがって、たとえば、所与の配列を含むプライマーは、所与の配列の５’末端もしくは３’末端の一方または両方でさらなる核酸を含み得る。さらに、「含む」という用語は、「本質的に〜からなる」および「〜からなる」という用語により含まれる実施形態を包含することが意図される。同様に、「本質的に〜からなる」という用語は、「〜からなる」という用語により含まれる実施形態を包含することが意図される。

量、濃度、または他の値もしくはパラメータが好ましい上限値および好ましい下限値のリストのいずれかとして与えられる場合、これは、範囲が個別に開示されているかどうかに関係なく、任意の上限範囲または好ましい値および任意の下限範囲または好ましい値の任意の対から形成される全範囲を具体的に開示すると理解されるべきである。数値範囲が本明細書中で記載される場合、特に明記しない限り、範囲はそれらのエンドポイント、ならびにその範囲内のすべての整数及び分数を包含することが意図される。本発明の範囲は、範囲を規定する場合、記載される具体的な値に限定されることは意図されない。

すべてのリボプライマーを利用し、細菌試料由来の精製されたＤＮＡを標的とするＰＣＲ増幅。この図面や後に続くすべての図面では、水平軸はサイクル数を表し、垂直軸は適切な波長の蛍光レベルを表す。 全ホットスタートプライマーを利用し、２つのバージョン：直接抽出された細菌（「直接試料」）および鼻腔用綿棒上にスパイクされた細菌の試料（「スパイクされた鼻試料」）でＭＲＳＡ株＃２から抽出されたＤＮＡを標的とするＰＣＲ増幅。 全ホットスタートプライマーを利用し、２つのバージョン：直接試料およびスパイクされた鼻試料でＭＲＳＡ株＃１から抽出されたＤＮＡを標的とするＰＣＲ増幅。 ２つの別のプライマー混合物を利用する、スパイクされた鼻試料由来のＭＲＳＡ株＃３から抽出されたＤＮＡを標的とするＰＣＲ増幅。混合物＃１は、全ホットスタートプライマーを含み、そして混合物＃２は、ホットスタートプライマー＋非ホットスタートプライマー（３つの臨床的遺伝子標的アッセイについて１０％のホットスタートプライマーモル濃度）と、ＩＣについてはホットスタートプライマーのみのセットを含む。 内部標準標的アッセイのホットスタートプライマーおよび３つの臨床的遺伝子標的アッセイについては１０％の濃度のレギュラープライマーのみを含む第３の交互プリマ−混合物を利用するスパイクされた鼻試料から誘導されたＭＲＳＡ株＃３から抽出されたＤＮＡを標的とするＰＣＲ増幅。 ＭＲＳＡ株＃３の直接試料およびスパイクされた鼻ＤＮＡ試料を標的とし、ＯｒｆＸおよび内部標準アッセイに関してはホットスタートプライマーのみ、そしてｍｅｃＡおよびｎｕｃに関してはレギュラープライマーのみを含む、ＰＣＲ増幅。 全ホットスタートプライマーを利用し、ＭＲＳＡ株＃３の直接試料およびスパイクされた鼻ＤＮＡ試料を標的とするＰＣＲ増幅。 ＡおよびＢについて記載されたＰＣＲ混合物を用いるスパイクされた鼻試料の増幅を並べた図。 スパイクされた鼻試料由来の未精製ＭＲＳＡ株＃３を標的とするＰＣＲ増幅。多重アッセイは、ＩＣについてはホットスタートプライマーのみ、そしてｏｒｆＸ、ｎｕｃおよびｍｅｃＡのプライマーについては３つの異なるプライマー混合物を利用する。混合物＃１：８０％のホットスタートプライマーおよび２０％のレギュラープライマー。混合物＃２：レギュラープライマーのみ（混合物＃１と同じ量）。混合物＃３：１００％のホットスタートプライマーおよび０％のレギュラープライマー。 図５について記載したのと類似しているが、ｎｕｃおよびｍｅｃＡ遺伝子を標的とするアッセイ用のレギュラープライマーよびホットスタートプライマーの比が最適化されたＰＣＲ増幅。

本発明は、特定のアンプリコンの同じ末端に対するホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物を含むＰＣＲ反応混合物、例えば多重ＰＣＲ反応混合物；これを用いる方法；およびこれを含むキットを提供する。

これを可能にする範囲で、本明細書中で言及されるすべての特許、特許出願、及び刊行物は、上記のもの及び下記のもののどちらも、参照することによって本明細書中に組み込まれる。

一般的定義
「株」という用語は、本明細書中で用いられる場合、識別可能な差異により同じ種の他の細菌とは異なる細菌種のサブセットを指す。

一実施形態では、本発明は：ａ）対象の種に特徴的な標的ポリヌクレオチド配列（本明細書中では、以下、「種特異的遺伝子」と呼ぶ）を増幅できる少なくとも１つの順方向プライマーおよび少なくとも１つ逆方向プライマーを含む、プライマーのセット；およびｂ）活性化酵素を含むＰＣＲ反応混合物を提供し、この場合、前記順方向プライマーおよび前記逆方向プライマーの少なくとも１つは、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物として提供される。典型的には、反応混合物は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、及び二価カチオン（多くの場合、マグネシウムイオン）の１以上をさらに含む。ホットスタートプライマーは、反応混合物中に存在する活性化酵素の作用により逆転される不活性化化学修飾を含む。個々のホットスタートプライマー分子は、ホットスタートプライマーがプライマーに対して相補的な配列と高温でハイブリダイズする場合に、活性化酵素の基質になる。ある実施形態では、ＰＣＲ反応混合物はリアルタイムＰＣＲに好適なプローブをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーは、ホットスタートプライマーの非ホットスタートプライマーに対する比が１：９〜１９：１（両端を含む）で存在する。最適の好ましい比の決定は、種々の多重ＰＣＲアッセイによって変わり、１つには、プライマーの非特異的結合の可能性に依存するであろう。これは次に、アッセイのプライマーの一方または両方とそれら自身、または試料中に存在する他のオリゴヌクレオチド、および／または非標的核酸配列との間の相補性の程度に主に依存するであろう。高い非特異的相補性の存在下で、非ホットスタートプライマーの割合は、典型的には２０％以下、言い換えれば、ホットスタート対非ホットスタートプライマーの比が４：１〜１９：１（両端を含む）に限定される。

プライマーハイブリダイゼーションが増幅の一端のみで問題となる他のある実施形態では、非ホットスタートプライマーおよびホットスタートプライマーの混合物を増幅の一端のみについて使用し、一方、増幅の他端はホットスタートプライマーのみにより支配される。経験的方法を用いて、順方向プライマー、逆方向プライマー、または両者を、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物の使用のために選択するかどうかを決定することができることは、当業者には理解されるであろう。

別の実施形態において、本発明は、：（ａ）第１標的ポリヌクレオチド配列を増幅するためのプライマーの第１セット；（ｂ）第２標的ポリヌクレオチド配列を増幅するためのプライマーの第２セット；および（ｃ）活性化酵素を含む、多重ＰＣＲのためのＰＣＲ反応混合物を提供し、ここで：
（ｉ）第１標的ポリヌクレオチド配列の少なくとも１つの末端にハイブリダイズするプライマーはホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物であり、この場合、非ホットスタートプライマーを用いて第１標的ポリヌクレオチド配列を増幅する反応の生成物は、ホットスタートプライマーを用いる増幅の基質であり；そして
（ｉｉ）プライマーの第２セットはホットスタートプライマーからなる。

典型的には、反応混合物は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、およびマグネシウム、マンガン、ニッケル、またはコバルトイオンから選択される二価カチオンの１以上をさらに含む。本明細書中で「非ホットスタートプライマーを用いて［標的ポリヌクレオチド配列］を増幅する反応の生成物」、または類似の言い回しについての言及が、順方向および逆方向非ホットスタートプライマー（それらが反応混合物中に存在するならば）を用いた増幅を指すことを当業者は容易に理解するであろう。非ホットスタートプライマーが増幅の一端でのみ存在するならば、非ホットスタートプライマーを逆の配向を有する供給されたホットスタートプライマーとの組みあわせで用いる増幅を意味する。同様に、「ホットスタートプライマーを用いる増幅」、または類似の言い回しは、順方向および逆方向ホットスタートプライマー（それらが反応混合物中に存在するならば）を用いる増幅を指す。ホットスタートプライマーが増幅の一端でのみ存在するならば、ホットスタートプライマーを、逆の配向を有する供給された非ホットスタートプライマーと組みあわせて使用する増幅を意図する。

ある実施形態では、ホットスタートプライマーは不活性化化学修飾を含み、これは反応混合物中に存在する活性化酵素の作用により逆転される。個々のホットスタートプライマーは、プライマーに対して相補性である配列にホットスタートプライマーが高温でハイブリダイズする場合、活性化酵素の基質になる。典型的には、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物は、ホットスタートプライマー対非ホットスタートプライマーの比が１：９〜１９：１（両端を含む）で存在する。

ある実施形態では、ＰＣＲ反応混合物はリアルタイムＰＣＲに好適なプローブをさらに含む。

上述のように、最適の好ましい比の決定は、異なる多重ＰＣＲアッセイについて様々であり、１つには、非特異的ハイブリダイゼーションをもたらし得る標的を含有する反応混合物中に存在する相補性の程度および増幅の阻害の程度に依存するであろう。増幅の２つの末端のうちの一端だけが伸長から阻害されるようであり、阻害アッセイのホットスタートプライマーに相補性である配列の存在が低いので、阻害アッセイのための非ホットスタートプライマーの使用することで非特異的増幅の存在が実質的に増加しないある実施形態では、その位置でのホットスタート−プライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物が最適には非ホットスタートプライマーの大部分を含むであろう。そのような場合でも、おそらく標的配列に対するハイブリダイゼーションについて非ホットスタートプライマーと競合することにより、ホットスタートプライマーは有利には非ホットスタートプライマーが関与する増幅を減速させることが本明細書中で示されている。

本明細書中で提示する実験の前に、ＤＮｅａｓｙ（商標）Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）を用いて精製されたＤＮＡ試料に関してリボプライマーを用いる多重ＰＣＲの実施に成功した。これらのアッセイが、たとえば、広範の精製手順を用いることなく鼻腔用綿棒からの単離された核酸などの臨床設定でうまく機能するかどうかを判定することにした。このために、精製されたＤＮＡをボランティアの鼻腔用綿棒上にスパイクした。本明細書中で以下に記載するように、リボプライマーを用いる多重ＰＣＲを阻害した鼻腔用綿棒中に生物学的因子が存在することが見いだされた。阻害は、ＤＮＡをさらに広範の精製に付すか、またはテンプレートの量を増やすか、または単一アッセイで個々にアッセイを実施するかのいずれかにより、克服することができる。これらの解決策のそれぞれは、実施不可能および／または臨床設定で不好適であり、この不備に対処するために本発明が開発された。

本発明のいくつかの実施形態のキットは、広範の核酸精製を必要とすることなく、実在の試料とともにうまく用いることができ、それ自体が多くの実際的利点をもたらす。たとえば、実施例２で記載するように、Ｄｅｔｅｃｔ−Ｒｅａｄｙ（商標）ＭＲＳＡ Ｌｙｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， Ｉｎｃ．）を用いることができる。本発明のいくつかの実施形態がＰＣＲ増幅前の試料調製を簡素化できることは、したがって、時間やヘルスケア設備の出費を節約することができる。節約された時間は、ある実施形態では、タイムリーな臨床介入と患者を救うには遅すぎる臨床介入との間の差をも意味する。他の実施形態では、試料調製を簡素化することで、試料汚染の機会も減少する。

本明細書中、実施例で提供するようにプライマー−標的ミスマッチを含む標的ポリヌクレオチド配列のホットスタートプライマーｑＰＣＲ増幅は、明らかに弱い（実施例１）。この阻害は、広範の精製（実施例２）に付されていない臨床材料由来の核酸に対して実施された多重ＰＣＲにおいても観察することができる。「〜に由来する」とは、この文脈では、任意の形態の均質化、溶媒もしくは溶液中の溶解、分画、またはそれらの組みあわせを、単独またはＰＣＲ増幅に好適な試料を臨床材料から生成させることができる任意の他の適切な手段と組みあわせて包含することが意図される。本発明の方法および組成物のある実施形態は、意外にも、あるＰＣＴ反応においてリボプライマーで観察される阻害を劇的に改善することが見いだされた。

いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、広範の精製に必ずしも付されてない臨床材料由来の核酸調製に用いられる。たとえば、非限定的実施形態において、本発明の方法および組成物は、２．０未満のＡ_２６０／Ａ_２８０比を有する試料とともに使用するために好適である（Ａ_２６０／Ａ_２８０比は核酸調製の純度の尺度である）。別の実施形態において、本発明の方法および組成物は、１．９未満のＡ_２６０／Ａ_２８０比を有する試料とともに使用するために好適である。別の実施形態において、本発明の方法および組成物は、１．８未満のＡ_２６０／Ａ_２８０比を有する試料とともに使用するために好適である。別の実施形態において、本発明の方法および組成物は、１．７未満のＡ_２６０／Ａ_２８０比を有する試料とともに使用するために好適である。別の実施形態において、本発明の方法および組成物は、１．０〜２．０のＡ_２６０／Ａ_２８０比を有する試料とともに使用するために好適である。別の実施形態において、本発明の方法および組成物は、１．０〜１．９のＡ_２６０／Ａ_２８０比を有する試料とともに使用するために好適である。別の実施形態において、本発明の方法および組成物は、１．０〜１．８のＡ_２６０／Ａ_２８０比を有する試料とともに使用するために好適である。別の実施形態において、本発明の方法および組成物は、１．０〜１．７のＡ_２６０／Ａ_２８０比を有する試料とともに使用するために好適である。それぞれの可能性は本発明の別の実施形態であると見なすことができる。

臨床材料に関する多重ＰＣＲのさらなる潜在的な危険性を実施例４で示し、これは、ホットスタートプライマーのみを利用する増幅が、レギュラープライマーのみを利用する他の増幅の存在下で阻害される可能性が高いことを示す。同じ検体を用いて個々に実施する場合、増幅は阻害されなかった（データは不掲載）。特定の理論または作用機構により拘束されることを望まないが、この場合のホットスタート増幅の阻害は、反応管中のｄＮＴＰなどのリソースについての増幅間の競合によると考えられる。

本明細書中でさらに提供されるように、１つの増幅のためのホットスタートプライマー
およびレギュラープライマーの混合物の使用は、レギュラープライマーおよびホットスタートプライマーが同じ標的配列を認識するか（実施例５〜６）またはレギュラープライマーがホットスタートプライマーの側面に位置するネスト化構造で設計されているか（実施例３）にかかわらず、多重ｑＰＣＲにおいてリボプライマーを使用する限界を克服し、すべての標的の効率的な増幅を可能にする。さらに、本発明のいくつかの実施形態は、本発明者らが知っている従来技術の解決策に対して、臨床材料由来の未精製核酸から増幅することができるアンプリコンの数を増大させ、それによりコストを著しく低下させ、アッセイ速度を増大させる。

特定の標的ポリヌクレオチド配列を増幅させるためのプライマーのセットを含む反応混合物もここでは提供され、この場合、標的配列の少なくとも１つの末端を増幅するためのプライマーは、１０〜９５％のホットスタートプライマーおよび５〜９０％の非ホットスタートプライマーの混合物を含む。本明細書中で提供されるように、そのような反応混合物は、ホットスタートプライマー単独または非ホットスタートプライマー単独のいずれかを含む混合物よりも優れた特性を示す。

たとえば、標的配列を増幅するための順方向プライマーセットは、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物から構成され得る。別の実施形態において、逆方向プライマーセットは、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物から構成される。他の実施形態では、順方向及び逆方向プライマーセットはどちらもホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物から構成される。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態であると見なすことができる。

別の実施形態において、細菌性「架橋領域」の順方向プライマーについて本明細書中で例示されるように、配列変動は、複数の順方向プライマーおよび／または複数の逆方向プライマーを配列変異体の増幅のために必要とする可能性がある。この場合、ある実施形態では、交互プライマーの各プライマーセット（プライマーのセットは、この場合、特定の配列変異体を認識するプライマーを示すために用いられる）は、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの所定の比での混合物である。ある他の実施形態では、交互プライマーのセットの１以上は、ホットスタートプライマーから構成され、一方、交互プライマーの他のセットは、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの所定の比での混合物を含む。典型的には、ホットスタート：非ホットスタート混合物比は交互プライマーの各セットについて同じである。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態であると見なすことができる。

本明細書中で提供されるように、非ホットスタートプライマーを使用する増幅産物が、ホットスタートプライマーを使用する増幅の基質である本発明の反応混合物は、特に有効である。ある実施形態では、本明細書中の実施例で示されるように、非ホットスタートプライマーの相補配列は、ホットスタートプライマーの相補配列の側面に位置する可能性がある（「ネスト化構造」）。他の実施形態では、非ホットスタートプライマーが１つの配向でのみ存在するならば、非ホットスタートプライマーは、対応するホットスタートプライマーの上流の配列を結合することができる。他の実施形態では、本明細書中の実施例で示されるように、非ホットスタートプライマーの相補配列は、ホットスタートプライマーの相補配列と重複し得るか、またはホットスタートプライマーの相補配列と同一であり得る。場合によっては、ホットスタートプライマーは、ホットスタート修飾以外は非ホットスタートプライマーと同一であり得る。たとえば、ＣＧＣＡＴＧＡＣＣＣＡＡＧＧＧＣＡｒＡＡＧＣＧ−■（配列番号５）は、配列ＣＧＣＡＴＧＡＣＣＣＡＡＧＧＧＣＡＡＡＧＣＧ（配列番号３５）と、リボヌクレオシド残基（「リボ塩基」）およびブロッキング基が前者において存在する以外は同一である。他の実施形態では、ホットスタートプライマーは、非ホットスタートプライマーと、とりわけ配列対５と１８および１２と２５によりそれぞれ本明細書中で例示されるように、ホットスタート修飾およびリボ塩基に対して３’側のさらなる相補配列以外は同一であり得る。本明細書中で提示される知見を考慮して、非ホットスタートプライマーの増幅産物がホットスタートプライマーを用いた増幅の基質であるとすると、本発明の方法及び組成物の有効性は、非ホットスタートプライマーおよびホットスタートプライマーの標的配列の正確な関係に依存しないことは、当業者には理解されるであろう。それぞれの可能性は本発明の別の実施形態であると見なすことができる。

別の実施形態において、プライマーの第１セットに加えて、ＰＣＲ反応混合物は、異なる標的ポリヌクレオチド配列を標的とするプライマーの第２セットを含む。第２標的ポリヌクレオチド配列は当該技術分野で公知の任意の標的配列であり得ることは当業者には明かであろう。

いくつかの非限定的実施形態において、典型的には、これもまた１：９〜１９：１のホットスタートプライマー対非ホットスタートプライマー比で存在する、異なるポリヌクレオチド配列に対する別のホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物を用いることができる。他の実施形態では、本明細書中で記載される他の比のいずれかを用いることができ、そのそれぞれは本発明の別の実施形態を構成する。本明細書中、実施例３および５で記載するように、ホットスタートプライマーのみであるプライマーセットを含み、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物である他のプライマーセットを含み、各プライマーセットが異なる核酸標的を標的とするプライマーセットを含む多重増幅反応は、ホットスタートプライマーＰＣＲの阻害物質を含む可能性がある臨床材料中の抗生物質耐性病原体株を検出するアッセイにより例示されるように、臨床材料に関する多重ＰＣＲにおいて特に有効であることが示されている。

たとえば、第２標的ポリヌクレオチド配列を増幅するための順方向プライマーは、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物から構成される可能性がある。別の実施形態において、逆方向プライマーは、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物から構成される。他の実施形態では、順方向プライマーおよび逆方向プライマーはどちらもホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物から構成される。それぞれの可能性は本発明の別の実施形態であると見なすことができる。

別の実施形態において、プライマーの第１および第２セットに加えて、ＰＣＲ反応混合物は異なる標的ポリヌクレオチド配列を標的とするプライマーの第３セットを含む。第３の標的ポリヌクレオチド配列が当該技術分野で公知の任意の標的配列であり得ることは、当業者には明かであろう。

さらなる非限定的実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列の少なくとも一端とハイブリダイズするプライマーの第３セット中のプライマーは、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物である。典型的には、この混合物もまた、１：９〜１９：１（両端を含む）のホットスタートプライマー対非ホットスタートプライマーで存在する。他の実施形態では、本明細書中で記載する他の比のいずれかを用いることができ、そのそれぞれが本発明の別の実施形態を構成する。たとえば、順方向プライマーは、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物から構成され得る。別の実施形態において、逆方向プライマーは、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物から構成される。他の実施形態では、順方向プライマーおよび逆方向プライマーはどちらもホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物から構成される。それぞれの可能性は本発明の別の実施形態であると見なすことができる。

本明細書中、実施例３および５で記載するように、多重ｑＰＣＲにおいて３つの異なる標的ポリヌクレオチド配列（アンプリコン）を標的とするホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物を、第４のアンプリコン標的とするホットスタートプライマーのみとともに含む多重増幅反応は、ある増幅反応がミスマッチおよび／またはあるハイブリダイゼーションを阻害する可能性がある試料中の物質に対して感受性である多重ＰＣＲにおいて効率的に機能した。

さらなる非限定的実施形態では、本発明のＰＣＲ反応混合物または方法は、３つのプライマーセットを含み、それぞれは異なるアンプリコンを増幅することができる。別の実施形態において、本発明のＰＣＲ反応混合物または方法は４つのプライマーセットを含み、それぞれは異なるアンプリコンを増幅することができる。更に別の非限定的実施形態において、本発明のＰＣＲ反応混合物または方法は５つのプライマーセットを含み、それぞれは異なるアンプリコンを増幅することができる。本発明のさらに別の実施形態では、本発明のＰＣＲ反応混合物または方法は６つのプライマーセットを含み、それぞれは異なるアンプリコンを増幅することができる。本発明のさらに別の実施形態では、本発明のＰＣＲ反応混合物または方法は６以上のプライマーセットを含み、それぞれは異なるアンプリコンを増幅することができる。本発明のさらに別の実施形態では、本発明のＰＣＲ反応混合物または方法は６〜５００（両端を含む）のプライマーセットを含み、それぞれは異なるアンプリコンを増幅することができる。実施例１〜６は４つのプライマーセットを含むＰＣＲ混合物を提示し、それぞれは異なるＤＮＡ標的を増幅することができる。当業者には知られているように、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ（登録商標）Ｑ（Ｑｉａｇｅｎ）およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）などの装置は、６セットまでのプライマーを含む多重ＰＣＲ反応の実施を可能にし、ＦＬＥＸＭＡＰ ３Ｄ（商標）（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は５００までの異なるＰＣＲプライマーセットを用いる多重ＰＣＲを可能にする。

本発明の方法および組成物は、典型的には１：９〜１９：１（両端を含む）のホットスタートプライマー対非ホットスタートプライマー比で存在する、特定のポリヌクレオチド配列に対するホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの１以上の混合物を含むことを記載した。さらに具体的な実施形態では、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの各混合物（言い換えれば、特定のアンプリコンの各末端に対する混合物）は１：５および１９：１（両端を含む）のホットスタートプライマー対非ホットスタートプライマー比で存在する。他の実施形態では、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの各混合物は、１：４〜１４：１（両端を含む）のホットスタートプライマー対非ホットスタートプライマー比で存在する。他の実施形態では、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの各混合物は、１：３〜１４：１（両端を含む）のホットスタートプライマー対非ホットスタートプライマー比で存在する。他の実施形態では、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの各混合物は１：２〜１４：１（両端を含む）のホットスタートプライマー対非ホットスタートプライマー比で存在する。他の実施形態では、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの各混合物は１：１〜１４：１（両端を含む）のホットスタートプライマー対非ホットスタートプライマー比で存在する。他の実施形態では、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの各混合物は１：１〜９：１（両端を含む）のホットスタートプライマー対非ホットスタートプライマー比で存在する。他の実施形態では、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの各混合物は２：１〜１４：１（両端を含む）のホットスタートプライマー対非ホットスタートプライマー比で存在する。他の実施形態では、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの各混合物は２：１〜９：１（両端を含む）のホットスタートプライマー対非ホットスタートプライマー比で存在する。他の実施形態では、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの各混合物は３：１〜９：１（両端を含む）のホットスタートプライマー対非ホットスタートプライマー比で存在する。他の実施形態では、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの各混合物は４：１〜９：１（両端を含む）のホットスタートプライマー対非ホットスタートプライマー比で存在する。それぞれの可能性は本発明の別の実施形態であると見なすことができる。

いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物において用いられる二価カチオンは、反応混合物の他の成分と別々に貯蔵及び／または提供され、テンプレートが添加される後まで保留され得る。他の実施形態では、二価カチオンは反応混合物の他の成分とともに提供される。

ｑＰＣＲおよび他のサイクル閾値増幅反応アッセイ
本明細書中で提供する開示を考慮して、本発明の方法は、定量的（「リアルタイム」）または非定量的のいずれであっても、任意の種類のＰＣＲ反応に好適であることは当業者には理解されるであろう。ある実施形態では、本発明の方法は、リアルタイムＰＣＲがその非限定的実施形態として提供される、閾値増幅反応に特に好適である。「閾値増幅反応」とは、閾値レベルより高い特定の標的配列の増幅が達成されるサイクル数などの閾値を決定する核酸増幅反応を指す。非限定的な一実施形態では、蛍光標識されたプローブを用いて増幅をモニタリングする。別の実施形態において、増幅をモニタリングするための当該技術分野で公知の任意の他の手段、たとえば二本鎖ＤＮＡ結合色素、たとえばＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎが用いられる。それぞれの可能性は本発明の別の実施形態であると見なすことができる。

試験試料中の対象の配列を検出するためのｑＰＣＲベースのアッセイ
ｑＰＣＲは、当該技術分野で周知である。ｑＰＣＲ反応混合物は、典型的には、４つの天然に存在するデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）；二価カチオン、およびポリメラーゼ酵素を含む。最も多くの場合、二価カチオンはマグネシウムイオンである。ある実施形態では、好熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素が用いられる。ｑＰＣＲは、ヒト動物標的核酸配列ならびに種々の用途で病原体について特異的な配列を検出するために用いられてきた。

標的ポリヌクレオチド配列の例示的な一種は、典型的には臨床材料中で分析される、対象の病原体に特徴的なポリヌクレオチド配列である。病原体一般および特に抗生物質耐性病原体の両方を検出するためのｑＰＣＲベースのアッセイの使用は当該技術分野で周知であり、たとえば、ＵＳ６６６４０８０（Ｋｌａｕｓ Ｐｆｅｆｆｅｒ、標題“ＴａｑＭａｎ（商標）−ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎｓ”）；米国特許出願第２００９／００８１６６３（Ｙｏｓｅｆ Ｐａｉｔａｎ、標題“Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｋｉｔｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｂａｃｔｅｒｉａ”）；ＵＳ６３２９１３８（Ｈａｎｓ Ｄｅ Ｂｅｅｎｈｏｕｗｅｒ ｅｔ ａｌ、標題“Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ”）；ＵＳ７０４５２９１（Ｎａｎｃｙ Ｈａｎｓｏｎら、標題“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡｍｐＣ ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ ｇｅｎｅｓ”；ＵＳ５９９４０６６および６００１５６４（Ｂｅｒｇｅｒｏｎら、クレイトン大学に譲渡）；ならびに国際特許出願第ＷＯ／１９９６／００８５８２号および米国特許出願第２００４／０１８５４７８号（それぞれＢｅｒｇｅｒｏｎら）で記載されている。これらの特許および出願のそれぞれは、参照することによって本明細書中に組み込まれる。

別の具体的な用途は、たとえばヒトの同一性を究明するために用いることができるＤＮＡマーカーなどの法医学試料中の標的ポリヌクレオチド配列を検出するためのｑＰＣＲベースのアッセイの使用である。そのような方法は、当該技術分野で周知であり、とりわけ、ＵＳ６６７３５４１および５８６１５０４ならびに米国特許出願第２００９／００２３６０３号、第２００６／００９９６２０号、および第２００８／０２８６７７３号（参照することによって本明細書中に組み込まれる）で記載されている。多くの場合、複数の増幅反応を平行して実施して、非常に限られた利用可能なＤＮＡ試料を最大限に利用する。

別の具体的な用途は、ｑＰＣＲにより、たとえば、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２などの疾患および罹病性のヌクレオチドマーカーなどの標的ポリヌクレオチド配列を検出するためのｑＰＣＲベースのアッセイの使用である。そのような方法は、当該技術分野で周知であり、とりわけ、ＵＳ７５０７８００および６０８３６９８ならびに米国特許出願第２００５００９５５９２号（参照することによって本明細書中に組み込まれる）で記載されている。

水和低減ＰＣＲ反応混合物
本明細書中で提供する開示を考慮して、当業者は、本発明の組成物および方法が、たとえばこれらに限定されるものではないが水和低減ＰＣＲ反応混合物などの通常および貯蔵安定化されたＰＣＲ反応混合物の両方と適合性であることを理解するであろう。本明細書中の実施例で使用される反応混合物を、処理して、水和を低減し、そして使用するまで室温で貯蔵した。しかし、同じでなくても非常によく似た結果を、通常のＰＣＲ反応混合物で得ることができる。したがって、一実施形態では、本発明のＰＣＲ反応混合物は水和低減ＰＣＲ反応混合物である。別の実施形態において、それらは通常の反応混合物である。別の実施形態において、それらは当該技術分野で公知の任意の種類の反応混合物である。それぞれの可能性は本発明の別の実施形態であると見なすことができる。

周囲温度安定化された水和低減ＰＣＲ反応混合物は、係属中の米国特許出願第２００８／００５０７３７号でさらに記載されている。そのような混合物は、ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはｄＮＴＰを含み、少なくとも１つ安定剤を含む緩衝液化合物も含む溶液を水和低減することにより調製され、２５℃〜１００℃の温度、典型的には約５５℃で貯蔵される。安定剤（複数可）は、とりわけ、糖およびタンパク質、たとえばスクロースおよび／またはＢＳＡであり得る。典型的には、１〜２０％のスクロースおよび０．５〜３ｍｇ／ｍｌのＢＳＡが含まれる。別の実施形態において、当該技術分野で公知の、任意の他の種類の水和低減ＰＣＲ混合物が利用される。別の実施形態において、当該技術分野で公知の任意の他の種類の周囲温度安定化ＰＣＲ混合物が利用される。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態と見なすことができる。

プライマー
「プライマー」という用語は、本明細書中で用いられる場合、天然または合成のいずれかのオリゴヌクレオチド、すなわち、ポリヌクレオチドテンプレートと二本鎖を形成する際に、核酸合成の開始点として作用することができ、一端からテンプレートに沿って伸び、したがって伸長された二本鎖（二重鎖）が形成されるものを指す。一実施形態では、ポリヌクレオチドテンプレートはＤＮＡ分子である。一実施形態では、ポリヌクレオチドテンプレートはＲＮＡ分子である。本発明のプライマーは、検出可能に標識してもよいし、または標識しなくてもよい。プライマーは、ホットスタートプライマーまたはレギュラープライマーであり得る。ホットスタートプライマーは本明細書中で後述する。「レギュラープライマー」および「非ホットスタートプライマー」という用語は、本明細書中で定義されるようなホットスタートプライマーでないプライマーを指す。特定の標的配列「についての」、特定の標的配列「に対する」、または特定の標的配列「を増幅することができる」として記載されるプライマーは、標的配列の末端に対して相補性であり、３’末端は内側に向き、したがって標的配列をＰＣＲ反応で増幅させることができる。

「ヌクレオチド」、「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド残基」、および「ヌクレオシド残基」という用語は、本明細書中で用いられる場合、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド残基、またはＰＣＲ反応での使用に好適なプライマーの成分としての働きをすることができる他の類似のヌクレオシド類似体を指す。そのようなヌクレオシドおよびその誘導体は、別の表示がされる場合を除いて、本明細書中で記載されるプライマーのビルディングブロックとして用いられる。本出願では、ＰＣＲ反応におけるそれらの安定性または有用性を増強するために化学修飾されたヌクレオシド誘導体または塩基の利用を排除することを意味しない。ただし、化学修飾は、必要に応じて、デオキシグアニン、デオキシシトシン、デオキシチミジン、またはデオキシアデニンとしてのＤＮＡポリメラーゼによるそれらの認識を妨害しないものとする。

ある実施形態では、本発明の方法および組成物で使用することができるヌクレオチド類似体には、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、および２’，３’−ジデオキシヌクレオシド誘導体、たとえばトレオース、ロックされた核酸誘導体、二環式糖、またはヘキソース、グリセロールおよびグリコール糖などの他の糖主鎖に基づく核酸類似体、非イオン性主鎖に基づく核酸類似体、たとえばペプチド核酸、たとえばデンドリマー、櫛構造、およびナノ構造などの非線形トポロジーのこれらの核酸およびそれらの類似体、ならびにそれらの末端、糖、または核酸塩基に結合したタグ（たとえば、蛍光、官能化、または結合）を有するこれらの核酸およびそれらの類似体においてと同様に、糖が修飾された誘導体が含まれる。

本発明の方法および組成物での使用に好適な非古典的ヌクレオチド類似体の非限定的な一例は、ロックされた核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド類似体である。ＬＮＡヌクレオチド類似体のある実施形態は、１以上の２’−Ｏ、４’−Ｃメチレン結合を含む二環式核酸類似体であり、これは、Ｃ３’−エンドコンフォメーションでフラノース環を有効にロックする。このメチレン結合「ブリッジ」は、リボフラノース環の柔軟性を制限し、構造をロックして硬質の二環式フォーメーションにする。その独自の構造的コンフォメーションのために、ＬＮＡヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドは、天然のＤＮＡカウンターパートよりも、それらの相補性核酸に対してはるかに高い親和性および特異性を示す。ＬＮＡは、典型的には、低い塩濃度などの悪条件下でも相補性核酸とハイブリダイズする。ＬＮＡヌクレオチド類似体は市販されており、とりわけ、米国特許第６，１３０，０３８号、第６，２６８，４９０号、および第６，６７０，４６１号で記載されている。

本発明の方法および組成物での使用に好適な非古典的ヌクレオチド類似体の別の非限定的例は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオチド類似体である。ＰＮＡヌクレオチド類似体のある実施形態では、ＤＮＡの負に荷電した糖−リン酸主鎖が、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位から構成される中性のポリアミド主鎖により置換されている（下図参照、図中、Ｂはヌクレオシド塩基を表す）。ＰＮＡの化学構造は、典型的には、ヌクレオチド塩基が天然のＤＮＡとほぼ同じ場所に位置することを可能にし、ＰＮＡを相補性ＤＮＡまたはＲＮＡ配列とハイブリダイズさせる。ＰＮＡヌクレオチド類似体は、市販されており、とりわけ、第ＷＯ９２／２０７０２号、第ＷＯ９２／２０７０３号および第ＷＯ９３／１２１２９号の公開番号を有するＰＣＴ出願に記載されている。

本発明の方法および組成物での使用に好適な非古典的ヌクレオチド類似体の別の非限定的例は、グリコール核酸（ＧＮＡ）ヌクレオチド類似体である（Ｚｈａｎｇ， Ｌ ｅｔ ａｌ （２００５） Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｇｌｙｃｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２７：４１７４−４１７５）。ＧＮＡヌクレオチド類似体のある実施形態は、非環式プロピレングリコールホスホジエステル主鎖を有し、そして下記構造のうちの１つ（図中、Ｂはヌクレオシド塩基を表す）を有する：

本発明の方法および組成物における使用に好適な非古典的ヌクレオチド類似体の別の非限定的例は、トレオース核酸（ＴＮＡ）ヌクレオチド類似体である（Ｗｕ ｅｔ ａｌ， Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２００２， ４（８）：１２７９−１２８２）。ＴＮＡヌクレオチド類似体のある実施形態は、下記構造（図中、Ｂはヌクレオシド塩基を表す）を有する：

本発明の方法および組成物における使用に好適な非古典的ヌクレオチド類似体の別の非限定的例は、二環式および三環式ヌクレオシド類似体である（Ｓｔｅｆｆｅｎｓ ｅｔ ａｌ， Ｈｅｌｖ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ （１９９７） ８０：２４２６−２４３９；Ｓｔｅｆｆｅｎｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ （１９９９） １２１： ３２４９−３２５５；Ｒｅｎｎｅｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ （２００２） １２４： ５９９３−６００２；およびＲｅｎｎｅｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ （２００２） ３０： ２７５１−２７５７）。

本発明の方法および組成物における使用に好適な非古典的ヌクレオチド類似体の別の非限定的例は、リン基を主鎖中に組み入れるホスホノモノエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｍｏｎｏｅｓｔｅｒ）核酸、例えば、ホスホノアセテートおよびチオホスホノアセテートヌクレオシド間結合を有する類似体である（米国特許出願第２００５／０１０６５９８；Ｓｈｅｅｈａｎ ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ （２００３）；３１（１４）：４１０９−１８）。他の実施形態では、シクロブチル環は、天然に存在するフラノシル環を置換する。

本発明の方法および組成物における使用に好適な非古典的ヌクレオチド類似体の他の実施形態では、塩基が修飾されている。修飾された核酸塩基の代表的な非限定的リストには、５−メチルシトシン（５-ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ_３）ウラシルおよびシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アザウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。さらなる修飾核酸塩基としては、三環式ピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば置換フェノキサジンシチジン（たとえば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド（４，５−ｂ）インドール−２−オン）、およびピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３−ｄ）ピリミジン−２−オン）が挙げられる。修飾核酸塩基には、プリンまたはピリミジン塩基が他のヘテロ環で置換されたもの、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンも含まれ得る。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号で開示されているもの；Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ｐａｇｅｓ ８５８−８５９， Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ， Ｊ． Ｉ．， ｅｄ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９０で開示されているもの；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９１， ３０， ６１３により開示されているもの；およびＳａｎｇｈｖｉ， Ｙ． Ｓ．， Ｃｈａｐｔｅｒ １５， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐａｇｅｓ ２８９−３０２， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ． Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ．， ｅｄ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３により開示されているものが挙げられる。これらの核酸塩基のうちのいくつかは、本発明の化合物の結合親和性を増大させるのに好適であるとして当業者に知られている。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン、たとえば２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが含まれる。修飾された核酸塩基およびそれらの使用は、とりわけ、米国特許ＵＳ３，６８７，８０８、ＵＳ４，８４５，２０５；ＵＳ５，１３０，３０２；ＵＳ５，１３４，０６６；ＵＳ５，１７５，２７３；ＵＳ５，３６７，０６６；ＵＳ５，４３２，２７２；ＵＳ５，４５７，１８７；ＵＳ５，４５９，２５５；ＵＳ５，４８４，９０８；ＵＳ５，５０２，１７７；ＵＳ５，５２５，７１１；ＵＳ５，５５２，５４０；ＵＳ５，５８７，４６９；ＵＳ５，５９４，１２１、ＵＳ５，５９６，０９１；ＵＳ５，６１４，６１７；ＵＳ５，６４５，９８５；ＵＳ５，８３０，６５３；ＵＳ５，７６３，５８８；ＵＳ６，００５，０９６；ＵＳ５，６８１，９４１；およびＵＳ５，７５０，６９２に記載されている。

本発明の方法および組成物における使用に好適な非古典的ヌクレオチド類似体の別の非限定的例は、天然に存在する複素環式塩基部分の１以上の代わりに多環式複素環式化合物である。多くの三環式複素環式化合物は以前に報告されている。これらの化合物は、アンチセンス適用において、標的鎖に対する修飾鎖の結合特性を増大させるために慣例的に用いられる。最も研究されている修飾は、グアノシンを標的とし、したがって、Ｇ−クランプまたはシチジン類似体と呼ばれる。第２の鎖中のグアノシンと３つの水素結合を形成する代表的なシトシン類似体としては、１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｋｕｒｃｈａｖｏｖ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １９９７， １６， １８３７−１８４６）、１，３−ジアザフェノチアジン−２−オン、（Ｌｉｎ， Ｋ．−Ｙ．；Ｊｏｎｅｓ， Ｒ． Ｊ．；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ， Ｍ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９５， １１７， ３８７３−３８７４）および６，７，８，９−テトラフルオロ−１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｗａｎｇ， Ｊ．；Ｌｉｎ， Ｋ．−Ｙ．， Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ， Ｍ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． １９９８， ３９， ８３８５−８３８８）が挙げられる。オリゴヌクレオチド中に組み入れられると、これらの塩基修飾は相補性グアニンとハイブリダイズすることが示され、後者はさらに、アデニンとハイブリダイズし、拡張されたスタッキング相互作用により螺旋熱安定性を増強することが示された（米国特許付与前公開第２００３／０２０７８０４号および第２００３／０１７５９０６号も参照）。

別の実施形態において、本発明の方法および組成物において用いられるプライマーは、１以上のユニバーサルヌクレオシドを含み得る。ユニバーサルヌクレオシドの非限定的例は、とりわけＵＳ２００９／０３２５１６９および２０１０／０１６７３５３で記載されているような５−ニトロインドールおよびイノシンである。

ホットスタートプライマー
「ホットスタートプライマー」という用語は、本明細書中で用いられる場合、高温にさらされるまでは、不活性であるか、または低い活性を有するプライマーを指す。これらに限定されるものではないが、プライマーの３’末端で修飾ヌクレオチドを含むプライマー（例えば、米国特許第６，４８２，５９０号を参照）、ステムループまたはヘアピン構造を有するプライマー（例えば、米国特許出願第２００７／０１２８６２１号を参照）、プライマーの３’末端で熱により除去可能な化学修飾を含むプライマー（例えば、米国特許出願第２００７／０２８１３０８号を参照）、ブロッキングオリゴヌクレオチドに結合したプライマー（例えば、米国特許第５，７１２，３８６号を参照）、およびリボプライマー（例えば、米国特許出願第２００９／０３２５１６９号および第２０１０／０１６７３５３号を参照）をはじめとする多種のホットスタートプライマーが当該技術分野では存在し、当業者には周知である。ホットスタートプライマーのサブセットは、多サイクル増幅の過程全体にわたって伸長可能なプライマーを徐々に生成するプライマーである。これらの種類のプライマーは、変性ステップ中に多量の伸長可能なプライマーを生成するある種のホットスタートプライマーとは対照的に、すべてのサイクルで増大した反応特異性を付与する。

ある他の実施形態では、本発明で有用なホットスタートプライマーは、高温である際に相補配列にハイブリダイズする場合だけ、伸長可能なプライマーを生成するような修飾を含むものである。本明細書中で「リボプライマー」と総称されるこの種のホットスタートプライマーの１つの例示的非限定的サブクラスは、それらがＤＮＡポリメラーゼのプライマーとしての働きをすることができないように可逆的に化学修飾されているものである。リボプライマーはまた、ＤＮＡ標的配列とハイブリダイズする場合、本明細書中で例示されるように、結果として化学修飾の除去をもたらす、ＲＮａｓｅＨ２エンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼによる切断の基質である。ある実施形態では、そのような修飾されたプライマーは、ＲＮＡ部分を含み得、これはＲＮａｓｅ Ｈ切断部位としての働きをする。リボプライマーの種々の実施形態を本明細書中、以下でさらに記載する。

リボプライマーのブロッキング修飾（あるいは本明細書中では「不活性化化学修飾」とも称する）は、好ましくはＲＮａｓｅＨ２エンドヌクレアーゼの切断部位の３’側（下流）に位置する。更に好ましくは、ブロッキング修飾はリボプライマーの３’末端に位置する。ある実施形態では、ブロッキング修飾は、本発明のオリゴヌクレオチドの３’末端から約１０残基までに位置する可能性があり、続いて標的に対してほぼ非相補性でもなく完全に非相補性でもないヌクレオチド配列がある。いずれの場合も、本明細書中で定義される「リボプライマー」は、伸長のためのプライマーとしてのその適合性を排除し、エンドヌクレアーゼ（本明細書中では「活性化酵素」とも称する）の作用により逆転される修飾を含む。典型的には、逆転は、修飾の物理的除去を含む。

他の実施形態では、「リボプライマー」という用語は、以下の修飾を含む、標準的ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーの変異体を指す：少なくとも１つのＲＮＡ残基が標準的ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端で付加され、続いて少なくとも３つのさらなるＤＮＡ残基およびブロッキング基が付加される。リボプライマーのＲＮＡおよびＤＮＡ残基によって形成されるプライマー配列は、標的ＤＮＡの配列と部分的または完全な相補性を示す。ＤＮＡ標的に結合したリボプライマー内の１つのＲＮＡ残基は、典型的には、ヘテロ二重鎖をＲＮａｓｅＨ２によるエンドヌクレアーゼ切断の基質にするために十分であり、切断はＲＮＡ残基のすぐ５’側で起こり、ＲＮＡ残基自体、ならびにＲＮＡ残基に対して３’側のすべての残基および修飾を除去する。第１のＲＮＡ残基に対して３’側に位置する１以上のさらなる相補性ＲＮＡ残基がリボプライマー内に存在することは、プライマーがＲＮａｓｅＨ２によるエンドヌクレアーゼ切断の基質としての働きをする能力に、典型的には悪影響を及ぼさないことを、当業者は理解するであろう。

別の実施形態において、本発明の方法または組成物で用いられるリボプライマーは、その内部位置で１つの２’−フルオロ−修飾残基を含む。ＲＮａｓｅ Ｈ２による切断は、典型的には、２’−フルオロ−修飾残基の５’側で起こる。別の実施形態において、リボプライマーは、２つの隣接する２’−フルオロ−修飾残基を含むＲＮａｓｅ Ｈ２切断ドメインを含む。この実施形態では、切断は主に２’−フルオロ−修飾残基間で起こる。一実施形態では、１以上の２’−フルオロ−修飾残基はＤＮＡ残基である。別の実施形態において、１以上の２’−フルオロ−修飾残基はＲＮＡ残基である。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態である。

これらに限定されるものではないが、２’−Ｏ−アルキル−修飾残基、好ましくは２’−Ｏ−メチル−修飾残基、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、２’−ＥＮＡ残基（エチレン核酸）、２’−アルキル−修飾残基、２’−アミノ−修飾残基、および２’−チオ−修飾残基をはじめとする他の種類の修飾残基もリボプライマー中に存在する可能性がある。ある実施形態では、これらの修飾は、ＲＮＡ残基のすぐ隣、またはそれからさらに離れた位置のいずれかの意図される酵素切断部位でＲＮＡ残基以外の残基に対してなすことができる。他の実施形態では、これらの修飾残基を、意図される酵素切断部位でＲＮＡ残基の代わりに導入することができる。１以上の具体的な実施形態では、２’−フルオロ−修飾ＲＮＡ残基を２’ＬＮＡ−修飾ＲＮＡ残基と組み合わせて用いる。

さらに具体的な実施形態では、ＲＮＡ残基の２’−ヒドロキシ基は、前記の別の官能基のうちの１つと置換されている。他の実施形態では、意図されるＲＮａｓｅ ＨのＲＮＡ残基に対してすぐ３’側のリン酸基を、ヌクレアーゼ耐性結合で置換して、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素による異常な切断を防止する。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドを、ＲＮＡ残基の３’−リン酸基からさらに下流またはＲＮＡ残基の５’側のヌクレアーゼ耐性結合または残基で修飾する。ある実施形態では、使用されるヌクレアーゼ耐性結合は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、またはボロネート結合から選択される。別の実施形態において、Ｃ３スペーサーなどの脱塩基残基をＲＮＡ残基に対してすぐ３’側に挿入して、異常な切断を防止する。あるいは、隣接する残基の５’炭素上の水素原子の一方または両方をメチル基などのさらに嵩高い置換基で置換して、リボヌクレオチド残基のバックグラウンド切断を阻害することができる。これらの種々の修飾の組み合わせも用いることができる。前記修飾は、当該技術分野で周知である。典型的には、そのような修飾は、ＡＳ−ＰＣＲ（本明細書中で後述する）などのミスマッチ識別に使用されるＰＣＲ反応に最も有用である。

ある実施形態では、Ｍｎ^２＋、Ｎｉ^２＋又はＣｏ^２＋（Ｍｇ^２＋の有無を問わない）などの別の二価カチオンを、リボプライマーとともに使用されるアッセイ緩衝液中に組み入れる。本発明のある実施形態では、そのような別の二価カチオンが存在する場合、ＲＮａｓｅ Ｈ２による増強された切断が達成される。１以上の具体的な実施形態では、Ｍｇ^２＋と組み合わされたＭｎ^２＋を、２つの隣接した２’−フルオロ−修飾残基を含むリボプライマーとともに使用することが意図される緩衝液中に含める。

本明細書中で記載する実施形態をはじめとするリボプライマーの種々の実施形態は、米国特許出願公開第２００９０３２５１６９号及び第２０１００１６７３５３号で記載されている。

リボヌクレオチドまたは他の修飾残基の位置は、リボプライマーがＲＮａｓｅ Ｈ２の基質としての働きをする能力に影響を及ぼす。好ましくは、本発明の方法および組成物で用いられるリボプライマーのリボヌクレオチドまたは他の修飾残基は、その３’側で合計約１〜１０個のＤＮＡ残基の側面に位置する。他の実施形態では、合計約３〜６個のＤＮＡ残基がその３’側でリボヌクレオチドまたは他の修飾残基の側面に位置する。他の実施形態では、合計約２〜５個のＤＮＡ残基がその３’側でリボヌクレオチドまたは他の修飾残基の側面に位置する。他の実施形態では、合計約３〜５個のＤＮＡ残基がその３’側でリボヌクレオチドまたは他の修飾残基の側面に位置する。他の実施形態では、合計約４〜５個のＤＮＡ残基がその３’側でリボヌクレオチドまたは他の修飾残基の側面に位置する。他の実施形態では、標的配列に対して相補性である約４〜５個のＤＮＡ残基がその３’側でリボヌクレオチドまたは他の修飾残基のすぐ隣に位置する。場合によって、標的配列に対して相補性でない１以上のさらなるＤＮＡ残基が、これらの４〜５個の相補性ＤＮＡ残基に対して３’側に存在する可能性がある。

他の実施形態では、標的配列に対して相補性である少なくとも８個のデオキシリボヌクレオチドがその５’側でリボヌクレオチドまたは他の修飾残基の側面に位置する。別の実施形態において、標的配列に対して相補性である少なくとも１０個のＤＮＡ残基がその５’側でリボヌクレオチドまたは他の修飾残基の側面に位置する。他の実施形態では、標的配列に対して相補性である少なくとも１２個のＤＮＡ残基がその５’側でリボヌクレオチドまたは他の修飾残基の側面に位置する。他の実施形態では、標的配列に対して相補性である８〜５０個のＤＮＡ残基がその５’側で修飾残基の側面に位置する。別の実施形態において、標的配列に対して相補性である１０〜５０個のＤＮＡ残基がその５’側で修飾残基の側面に位置する。別の実施形態において、標的配列に対して相補性である１２〜５０個のＤＮＡ残基がその５’側で修飾残基の側面に位置する。場合によって、標的配列に対して相補性でない１以上のさらなるＤＮＡ残基が修飾残基の５’側に位置するこれらの相補性ＤＮＡ残基の５’側に存在する可能性がある。

前述の様に、ある実施形態では、本発明のホットスタートプライマーは、ＲＮａｓｅ Ｈなどのヌクレアーゼ酵素により切断されるまで、ＤＮＡポリメラーゼのプライマーとしての働きをするそれらの適合性を排除する可逆的化学修飾、例えば３’ブロッキング基を含む。ある実施形態では、ヌクレアーゼは、活性化されるようになるために、高温で切断部位の近くで正しい塩基対形成を必要とする。この文脈で「高温」という用語は、種々の実施形態で、５０℃超、６０℃超、７０℃超、または８０℃超の温度を指す。他の好ましい実施形態では、ヌクレアーゼは５０〜８０℃の温度で活性を示し、２５℃では感知され得る活性を示さない。他の好ましい実施形態では、ヌクレアーゼは反応のアニーリング温度の活性を示し、２５℃では感知され得る活性を示さない。ある他の好ましい実施形態では、ヌクレアーゼは熱安定性であり、９５℃の温度で３０分のインキュベーション後に活性を保持する。それぞれの可能性は本発明の別の実施形態であると見なすことができる。

ブロッキング修飾
本明細書中で例示されるＣ３スペーサーは、切断前のプライマー伸長を防止し、これにより非特異的プライマー伸長を減少させる。当業者は、本明細書中で提供される開示を考慮して、Ｃ３スペーサーは単にブロッキング部分の典型例であり、種々の別のスペーサー修飾およびＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．（アイオワ州コーラルビル）やＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ）などの特別に合成されるオリゴヌクレオチドの商業的供給業者から容易に入手可能な他の一般的なオリゴヌクレオチド修飾は、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの３’伸長をブロックすることができ、Ｃ３スペーサーの代わりにまたはＣ３スペーサーに加えて使用できることを認識するであろう。そのような別のブロッキング修飾としては、これらに限定されるものではないが、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、２’，３’−ジデオキシ−Ｃ、ジデオキシ−Ａ、ジデオキシ−Ｇ、ジデオキシ−Ｔ、３’デオキシリボヌクレオチド残基（例えば、デオキシリボ−Ｃ、Ａ、Ｇ、もしくはＴ、またはコルジセピン）、非ヌクレオチド結合、アルカン−ジオール修飾（とりわけ、米国特許第５，５５４，５１６号で記載のとおり）、３’ヒドロキシル置換（例えば、３−ヒドロキシプロピルなどのアルコールとの３’−ホスフェート、３’−トリホスフェートまたは３’−ホスフェートジエステル）、２’３’−環状ホスフェートの付加、末端ＲＮＡ残基の２’ヒドロキシル置換（例えば、ホスフェートまたはトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）もしくはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）などの立体的に嵩高い基）、および例えば、米国特許出願第２００７／０２１８４９０号で記載されているような、オリゴヌクレオチドの３’末端で置換されたＴＩＰＳおよびＴＢＤＭＳなどの２’−アルキルシリル基が挙げられる。嵩高い置換基はさらに、オリゴヌクレオチドの３’−末端残基の塩基上に組み入れて、プライマー伸長をブロックすることができる。他の実施形態では、ブロッキング修飾は、ＩＢＦＱ（Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ， Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アイオワ州コーラルビル）、または任意の他の好適なクエンチャー部分などの蛍光クエンチャーとしての働きをすることもできる。本明細書中で提供される開示を考慮して、本発明で用いられるリボプライマーは、プライマー特異性、結合親和性または融解温度を増加または減少させるという要望などの既知ＰＣＲプライマー設計考察に基づいて、ＲＮＡ残基の３’側またはブロッキング基の３’側に１以上のさらなるＤＮＡヌクレオチド残基をさらに含み得ることを、当業者は理解するであろう。

本明細書中で用いられるリボプライマー中に存在するＣ３部分は、式Ｃ_３３Ｈ_４３Ｎ_２Ｏ_５Ｐを有し、以下の構造：
を有する。

他の実施形態では、リボ−プライムのブロッキング基は１つのＣ３部分（本明細書中で後述する）である。ある実施形態では、１つのＲＮＡ残基に続いてＣ３部分があり、それに続いて第２のＣ３部分があり、それに続いて１以上のさらなるＤＮＡ残基がある。

ＲＮａｓｅ Ｈ酵素
本発明の方法および組成物で用いられるリボプライマーのいくつかの実施形態は、典型的には熱安定性、好熱性ＲＮａｓｅ Ｈ２酵素であるＲＮａｓｅ Ｈ２酵素を用いて活性化される。熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈ２酵素およびこれを使用する方法は、当該技術分野で周知である（Ｈａｒｕｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＲＮａｓｅ ＨＩＩ ｆｒｏｍ ａ Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ Ａｒｃｈａｅｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９８， ｐ． ６２０７−６２１４．）。例示的非限定的熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈ２酵素は、本明細書中の実施例で用いられるピロコッカス・アビシ（Ｐ．ａｂｙｓｓｉ）リボヌクレアーゼＨ２酵素である。ピロコッカス・アビシＲＮａｓｅＨ２は熱安定性好熱性ＲＮａｓｅＨ酵素である。ＲＮａｓｅＨ酵素は、リボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドに結合する領域に結合する。結合すると、酵素はＲＮＡ残基のすぐ３’側を切断する。種々の実施形態では、本発明の方法および組成物でリボプライマーとともに用いられるＲＮａｓｅ Ｈ２酵素のホットスタート／好熱性特性は、当該技術分野で周知のように、酵素に固有のものであるか、または可逆的化学不活性化もしくはブロッキング抗体の結果のいずれかであり得る。

いくつかの実施形態では、洗浄剤を反応緩衝液中に含めて、ＲＮａｓｅ Ｈ２の効率を増大させる。いくつかの更に具体的な実施形態では、洗浄剤は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、および臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）から選択される。

ＰＣＲおよびｑＰＣＲ反応インキュベーションでは、ＲＮａｓｅＨ２は典型的には高温に達したら活性化されるようになり、その基質を切断することを可能にし、それによりＲＮＡ残基およびＣ３スペーサーに対して３’側の残基を遊離させ、増幅を可能にする。ＲＮａｓｅＨ２は、プライマー／標的マッチがリボヌクレオチドに近い領域で強力なＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖を形成するために十分であることを必要とし、リボプライマー反応は、通常、標準的オリゴヌクレオチドプライマーよりもさらに特異的である。さらに、酵素は高温で活性化されるだけであるので、リボプライマー反応は、典型的には非特異的プライマー伸長を減少させ、かくして望ましくないヌクレオチド伸長および増幅を減少させる。

プローブ
本明細書中で用いられる「プローブ」という用語は、一般的に検出可能に標識され、ハイブリダイゼーションにより相補性核酸配列を同定するために用いられる、天然または合成のいずれかのオリゴヌクレオチドを指す。本発明で用いられるプライマーおよびプローブは、同一または異なる配列を有し得る。「リアルタイムＰＣＲに好適なプローブ」は、米国特許第５，９２５，５１７号、第６，０３７，１３０号、第６，１０３，４７６号、第６，１５０，０９７号、第６，４６１，８１７号および第７，３８５，０４３号（参照することによって本明細書中に組み込まれる）で記載されているものをはじめとする、標的配列の存在下、リアルタイムで検出可能なシグナルを放出する任意のプローブを指す。

別の実施形態において、プローブは、本明細書中の実施例で用いられるような二重修飾オリゴヌクレオチドである。二重修飾オリゴヌクレオチドは当該技術分野で周知であり、そしてとりわけ、国際特許出願第ＷＯ２００８／０６３１９４号および米国特許出願公開第２００９／００６８６４３号、第２００９／０３２５１６９号、および第２０１０／０１６７３５３号で記載されている。これらとしては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）および分子ビーコンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例示的非限定的種類の好適なプローブは、分子ビーコンである。分子ビーコンの使用は、当該技術分野で周知であり、とりわけ、Ｔｙａｇｉ Ｓ ａｎｄ Ｋｒａｍｅｒ ＦＲ （１９９６） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ： ｐｒｏｂｅｓ ｔｈａｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｕｐｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４， ３０３−３０８で記載されている。分子ビーコンおよびリアルタイムＰＣＲに好適な他のプローブは、典型的には、蛍光レポーター分子を５’末端で、そしてクエンチャー分子を３’末端で含む。広範囲のフルオロフォアのいずれか１つで修飾されたプローブは市販されており、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．（アイオワ州コーラルビル）、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ． （カリフォルニア州サンディエゴ）およびＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ナヴァト）などの製造業者の製品カタログに記載されている。非限定例としては、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｃｙ ５、ＴＹＥ ６６５、ＴＹＥ ５６３、Ｑｕａｓａｒカルボン酸およびＱｕａｓａｒ活性エステルが挙げられる。当業者に周知であるように、適切なクエンチャー部分の選択は、プローブのフルオロフォアの蛍光発光により決定され、これらに限定されるものではないが、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ−１、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ−２、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ−３、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ−Ｓｐ、Ｄａｂｃｙｌ、Ｄｅｅｐ Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ Ｉ、Ｄｅｅｐ Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ＩＩおよびＤｅｅｐ Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ＩＩＩが挙げられる。

他の実施形態では、プローブは、当該技術分野で公知の任意の他の種類のプローブである。当業者は、本明細書中で提供される開示を考慮して、本発明の性能にはっきりと影響を及ぼすことなく、様々な種類のプローブを本発明の増幅反応で用いることができ、異なるフルオロフォアおよびクエンチャーの任意の組み合わせを反応混合物中のプローブのそれぞれについて容易に用いることができることを理解するであろう。それぞれの可能性は本発明の別の実施形態であると見なすことができる。

標的配列
「標的核酸」、「標的ポリヌクレオチド」、「標的ポリヌクレオチド配列」、「標的ポリヌクレオチド分子」、および「標的遺伝子」という用語は、本明細書中では交換可能かつ同義的に使用され、プライマーがハイブリダイズすることが意図されるテンプレート核酸鎖上のヌクレオチド配列を指す。種々の実施形態では、標的配列はＲＮＡまたはＤＮＡ鎖を含み得る。この用語は、標的遺伝子の一部または標的遺伝子全体を指す可能性がある。別の実施形態において、本発明の方法またはキットは、対象の種に特徴的な（特異的な）標的遺伝子またはポリヌクレオチド配列を増幅するためのプライマーを使用する。１対のプライマーは、それらが内側に向いた方向で配列の反対の末端とハイブリダイズするならば、ＰＣＲ反応において特定の標的ポリヌクレオチド配列を増幅することができることを、当業者は容易に理解するであろう。ある実施形態では、遺伝子またはポリヌクレオチド配列は、対象の病原体におけるその配列が、一般的な微生物間で独特である任意の遺伝子またはポリヌクレオチド配列であり得る。「種特異的遺伝子」という用語は、本明細書中では一般的に、遺伝子または遺伝子間領域のいずれであっても任意の種特異的配列を指すために用いられる。ある実施形態では、プライマーとハイブリダイズする配列は、好ましくは反応混合物で独特である。

試験試料において対象の標的配列を検出するための方法
別の実施形態において、本発明は、試験試料における２以上の標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法を提供し、この場合、前記試験試料は臨床材料由来であり、広範に精製されておらず、当該方法は：（ａ）ＰＣＲ反応混合物を用いて試験試料から１以上の核酸を増幅するステップ；および（ｂ）増幅されたＰＣＲ産物を検出するステップを含み、ここで、ＰＣＲ反応混合物は：ｉ）前記第１標的ポリヌクレオチド配列の第１配列を増幅することができる、少なくとも１つの順方向プライマーおよび少なくとも１つ逆方向プライマーを含むプライマーの第１セット；およびｉｉ）前記第２標的ポリヌクレオチド配列の第１配列を増幅することができる、少なくとも１つの順方向プライマーおよび少なくとも１つ逆方向プライマーを含むプライマーの第２セットを含み、ここで、前記第１プライマーセットの前記順方向プライマーおよび前記逆方向プライマーのうちの少なくとも１つは、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物として提供される。好ましくは、標的ポリヌクレオチド配列の両方を増幅するために用いられるプライマーのセットは、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物として提供される順方向および／または前記逆方向プライマーを含む。典型的には、反応混合物は、核酸ポリメラーゼ酵素、ｄＮＴＰ、および二価カチオン（ほとんどの場合、マグネシウムイオン）の１以上を更に含む。ホットスタートプライマーは、反応混合物中に存在する活性化酵素の作用により逆転される不活性化化学修飾を含み得るか、または当該技術分野で公知の他の種類のホットスタートプライマーを含み得る。ある実施形態では、ＰＣＲ反応混合物は、リアルタイムＰＣＲに好適なプローブまたは二本鎖ＤＮＡ結合色素をさらに含む。この方法で用いられるＰＣＲ反応混合物は、付加標的配列の増幅のためのさらなるプライマーセットをさらに含み得ることは、当業者には理解されるであろう。

別の実施形態において、本発明は、試験試料において種特異的標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法を提供し、当該方法は：（ａ）本発明の反応混合物を用いて試験試料由来の核酸に対してＰＣＲを実施するステップ（ここで、ＰＣＲは、対象の病原体におけるその配列が一般的な微生物間で独特である配列を標的とする少なくとも１つの増幅反応を含む）；および（ｂ）増幅されたＰＣＲ産物を検出するステップを含む。

別の実施形態において、本発明は、試験試料において種特異的標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法を提供し、当該方法は：（ａ）本発明の反応混合物を用いて試験試料由来の核酸に対してリアルタイムＰＣＲを実施するステップ（ここで、ＰＣＲにおける１つの増幅反応は、対象の病原体におけるその配列が一般的な微生物間で独特である配列を標的とする）；（ｂ）種特異的遺伝子を検出するプローブによって生成するシグナルを測定するステップ；および（ｃ）サイクル数を標準試料と比較するステップを含む。この方法のある実施形態では、標準試料は、種特異的遺伝子を検出するプローブにより生成するシグナルがあらかじめ設定された強度を越えるシグナルサイクル数（「サイクル閾値」または「Ｃｔ値」）に関する。さらに具体的な実施形態では、Ｃｔ値が標準試料以下であるならば、配列は試験試料中に存在すると見なされる。別の実施形態において、本発明は、試験試料中の標的配列を検出するためのキットを提供する。それぞれの可能性は本発明の別の実施形態であると見なすことができる。

種々の実施形態では、本発明のキットは、病原体特異的遺伝子、ヒトＤＮＡマーカーまたは動物ＤＮＡマーカーであり得る。ＰＣＲによる病原体特異的配列の検出は、当該技術分野で周知であり、とりわけ、本明細書中で後述される参考文献で言及されている。

「試験試料由来の核酸」は、対象の試験試料から誘導される核酸を指す。無傷細胞を含む試験試料が、典型的にはＰＣＲ反応を実施する前に溶解処理に付されることは、当業者には理解されるであろう。ある実施形態では、試料溶解物は、増幅反応の前に核酸精製処理に付されない。他の実施形態では、試料溶解物を粗核酸精製処理に付すことができるが、広範精製処理には付されない。本明細書中で提供されるように、本発明の方法は、非精製核酸試料の増幅で遭遇する問題を克服する。

いくつかの実施形態では、本発明のキットは、必ずしも広範の精製に付されていない核酸試料に用いられる。

本明細書中で用いられる場合、「広範に精製されていない」または「広範の精製に付され」ていない核酸への言及は、溶解した細胞から抽出されるが、非核酸、可溶性細胞成分の大部分から分離されない核酸を含むことが意図される。これには、細菌培養などの臨床試料または他の種類の試料から細胞をペレット化し；それらの細胞を溶解させ；そして細胞壁成分などの不溶性細胞成分を溶解した細胞から、例えば遠心分離または濾過により除去することにより得られる核酸が含まれる。

ある実施形態では、「広範に生成されない」核酸は、２．０未満のＡ_２６０／Ａ_２８０比を有する（Ａ_２６０／Ａ_２８０比は核酸調製の純度の尺度である）。別の実施形態において、本発明の方法および組成物は、１．９未満のＡ_２６０／Ａ_２８０比を有する試料とともに使用するのに好適である。別の実施形態において、本発明のキットは、１．８未満のＡ_２６０／Ａ_２８０比を有する試料とともに使用するのに好適である。別の実施形態において、本発明のキットは、１．７未満のＡ_２６０／Ａ_２８０比を有する試料とともに使用するのに好適である。別の実施形態において、本発明のキットは、１．０〜２．０のＡ_２６０／Ａ_２８０比を有する試料とともに使用するのに好適である。別の実施形態において、本発明のキットは、１．０〜１．９のＡ_２６０／Ａ_２８０比を有する試料とともに使用するのに好適である。別の実施形態において、本発明のキットは、１．０〜１．８のＡ_２６０／Ａ_２８０比を有する試料とともに使用するのに好適である。別の実施形態において、本発明のキットは、１．０〜１．７のＡ_２６０／Ａ_２８０比を有する試料とともに使用するのに好適である。それぞれの可能性は本発明の別の実施形態であると見なすことができる。

試験試料
「試験試料」という用語は、本明細書中で用いられる場合、標的配列を含むことが疑われる任意の試料、たとえば対象の病原体または対象のヒトもしくは動物ＤＮＡマーカーを含むことが疑われる試料を指す。ある実施形態では、試験試料はほ乳類由来の臨床材料である。ある他の実施形態では、試験試料は、ヒト由来の臨床材料である。あるいは、「臨床材料」という用語は、本明細書中で用いられる場合、ほ乳類由来の体液、組織、または任意の種類の生検を処理することから得られる検体を指す。本明細書中で提供されるように、特にプライマー−テンプレート結合が弱まっている場合、たとえばホットスタートプライマーのＲＮＡ残基の近くにプライマーテンプレートミスマッチが存在する場合、ほ乳類一般および特にヒト由来の臨床材料は、ホットスタートプライマーＰＣＲを阻害する物質、たとえば多糖または粘液（たとえば、鼻、喀痰、咽頭、もしくは膣スワブ）を含む。非限定的典型例では、プライマーテンプレートミスマッチは、ホットスタートプライマー内のＲＮＡ残基に対してすぐ５’側のＤＮＡ残基である。

ある実施形態では、臨床材料は体液である。別の実施形態において、臨床材料は鼻汁である。別の実施形態において、臨床材料は鼻腔用綿棒である。別の実施形態において、臨床材料は腋窩から得たスワブである。別の実施形態において、臨床材料は鼠径部から得られるスワブである。別の実施形態において、臨床材料は全血である。別の実施形態において、臨床材料は血清である。別の実施形態において、臨床材料は血漿である。別の実施形態において、臨床材料は脳脊髄液である。別の実施形態において、臨床材料は尿である。別の実施形態において、臨床材料はリンパ液である。別の実施形態において、臨床材料は涙である。別の実施形態において、臨床材料は唾液である。別の実施形態において、臨床材料は対象の乳である。別の実施形態において、臨床材料は羊水である。別の実施形態において、臨床材料は気道の外分泌物である。別の実施形態において、臨床材料は腸管の外分泌物である。別の実施形態において、臨床材料は泌尿生殖器の外分泌物である。別の実施形態において、臨床材料は、対象の標的配列についての試験を必要とする対象の鼻汁、膣分泌物、全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液、涙、唾液、乳、羊水および気道、腸管または泌尿生殖器の外分泌物からなる群から選択される。それぞれの可能性は本発明の別の実施形態であると見なすことができる。

別の実施形態において、臨床材料は対象の生検由来の組織である。典型的には、組織を、適切に（たとえば、均質化により）処理し、それをＰＣＲ増幅用の基質にする。ある実施形態では、組織は白血球である。ある実施形態では、組織は悪性組織である。ある実施形態では、組織は絨毛膜絨毛である。ある実施形態では、組織は、白血球、悪性組織、および絨毛膜絨毛からなる群から選択される。ある実施形態では、組織は、白血球、悪性組織、および絨毛膜絨毛からなる群から選択される細胞型を含む。ある実施形態では、組織は、本質的に、白血球、悪性組織、および絨毛膜絨毛からなる群から選択される細胞型からなる。それぞれの可能性は本発明の別の実施形態であると見なすことができる。

別の実施形態において、試験試料は、法医学目的で使用され、カード上に含浸させた阻害剤を含むＦＴＡカード上の血痕、組織、皮膚、毛包、唾液およびたばこの吸い殻を含む。

臨床材料中の病原体を検出するための方法
本発明の具体的な一実施形態は、臨床材料中の病原体の抗生物質耐性株を検出する方法であって、当該方法は：（ａ）試験試料由来の核酸に関してリアルタイムＰＣＲを実施するステップ（ここで、ＰＣＲ反応混合物は本発明の反応混合物である）；（ｂ）遺伝子または遺伝子間領域（本明細書中では「病原体−特異的遺伝子」と称する）に関わらず、病原体−特異的配列および抗生物質耐性を付与するポリヌクレオチド配列（本明細書中では、「抗生物質耐性遺伝子」と称する）を検出するプローブによって生成するシグナルのＣｔ値を測定するステップ；ならびに（ｃ）病原体特異的遺伝子のＣｔ値と抗生物質耐性遺伝子のＣｔ値とを比較するステップを含む。別の実施形態において、当該方法は、「架橋領域」（抗生物質耐性遺伝子を含むエレメントの挿入の通常の地点［「挿入点」］および標的病原体のゲノム中の既知位置を連結する領域）を増幅し、そして架橋領域のＣｔ値を測定するステップをさらに含む。別の実施形態において、本発明は、試験試料中の抗生物質耐性株を検出するためのキットを提供する。それぞれの可能性は本発明の別の実施形態であると見なすことができる。

前記方法で用いることができる病原体−特異的遺伝子の非限定的実施形態は、黄色ブドウ球菌のｎｕｃ、Ｓａ４４２、およびｆｅｍＢである。これを増幅するための病原体−特異的ポリヌクレオチド配列およびプライマーは、当該技術分野において周知であり、とりわけ、米国特許出願第２００９／００８１６６３号で記載されている。抗生物質耐性遺伝子の非限定例は、ｍｅｃＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ０９７６７７）である。当業者は、抗生物質耐性に関連する遺伝子がカセットもしくはプラスミド上に位置し得るか、または病原体の染色体上に組み入れられ得ることを理解するであろう。利用できる架橋領域の非限定例は、ＳＣＣｍｅｃ：ｏｒｆＸである。架橋領域は当該技術分野で周知であり、とりわけ、ＣｕｎｙおよびＷｉｔｔｅで記載されている（ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ） ｓｔｒａｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｐｅｒｉｍｅｒ ｐａｉｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ＳＣＣｍｅｃ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｉｎｇ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｂｏｒｎｅ ｏｒｆＸ． Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ． ２００５；１１（１０）：８３４−７）。当該技術分野で既知の任意の病原体−特異的遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または架橋領域を前記方法で用いることができることは、当業者には理解されるであろう。それぞれの可能性は本発明の別の実施形態であると見なすことができる。

前記方法において、標的病原体（「対象の病原体」）は、ある実施形態では、細菌であり得る。他の実施形態では、標的病原体はウイルスである。他の実施形態では、標的病原体は真菌である。他の実施形態では、標的病原体は原虫である。他の実施形態では、標的病原体は抗生物質耐性細菌である。他の実施形態では、標的病原体は抗生物質耐性ウイルスである。他の実施形態では、標的病原体は抗生物質耐性真菌である。他の実施形態では、標的病原体は抗生物質耐性原虫である。ある実施形態では、本明細書中で例示されるように、標的病原体は黄色ブドウ球菌である。ある他の実施形態では、本明細書中で例示されるように、標的病原体はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）である。ある他の実施形態では、標的病原体はＶＲＳＡ（バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌）、ＶＲＥ（バンコマイシン耐性腸球菌）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）である。他の実施形態では、標的病原体は当該技術分野で公知の任意の標的病原体である。それぞれの可能性は本発明の別の実施形態であると見なすことができる。

前記方法により標的とされ得る抗生物質耐性遺伝子には、非限定例を挙げれば、ｍｅｃＡ、ｖａｎＡ、ｖａｎＢ、ｖａｎＣ１、ｖａｎＣ２ ｖａｎＣ３、ｖａｎＤ、ｖａｎＥ、およびｖａｎＧが含まれる。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態と見なすことができる。

別の実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、メチシリン、バンコマイシン、リネゾリド、ペニシリンクラスの抗生物質、セファロスポリンクラスの抗生物質、カルバペネムクラスの抗生物質、およびモノバクタムクラスの抗生物質からなる群から選択される１以上の抗生剤に対する耐性を付与する遺伝子である。別の実施形態において、当該技術分野で公知の任意の他の抗生剤に対して耐性を付与する抗生物質耐性遺伝子。それぞれの可能性は、本発明の別の実施形態と見なすことができる。

いくつかの実施形態では、本発明のＰＣＲ反応は、対立遺伝子−特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）反応である。ＡＳ−ＰＣＲは当該技術分野で周知であり、とりわけ、米国特許第５，４９６，６９９号で記載されている。

キット
別の実施形態において、本発明は、本発明のＰＣＲ反応混合物およびその使用説明書を含む、たとえば、臨床材料中の特異的標的配列を増幅するためのキットを提供する。別の実施形態において、キットは、試験試料中の病原体を検出するために使用され、検出のための使用説明書を含む。別の実施形態において、キットは、ヒトまたは動物ＤＮＡマーカーの検出を必要とする医学用途で使用される。それぞれの可能性は本発明の別の実施形態であると見なすことができる。

本明細書中では、特定の種特異的遺伝子を増幅するためのプライマーのセットを含む反応混合物が提供され、ここで、標的配列の少なくとも１つの末端を増幅するためのプライマーは、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの両方を含む。本明細書中で提供されるように、そのような反応混合物は、ホットスタートプライマー単独または非ホットスタートプライマー単独のいずれかを含む混合物よりも優れた特性を示す。

前記事項と併せて、本発明を非限定的に説明する以下の実施例を参照する。

一般的に、本明細書中で用いられる命名法および本発明で用いられる実験法には、分子、生化学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は、文献で十分に説明されている。たとえば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （２００１）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｒ． Ｍ．， ｅｄ． （１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， “Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ （２００９）；Ｐｅｒｂａｌ， “Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， “Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ） “Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”， Ｖｏｌｓ． １−４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９８）；ａｓ ｓｅｔ ｆｏｒｔｈ ｉｎ 米国特許第４，６６６，８２８号；第４，６８３，２０２号；第４，８０１，５３１号；第５，１９２，６５９号および第５，２７２，０５７号に記載されている方法；“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ， Ｊ． Ｅ．， ｅｄ． （１９９４）；“Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ −Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ” ｂｙ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｎ． Ｙ． （１９９４）， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ． Ｅ．， ｅｄ． （１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ）， “Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” （８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ （１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ （ｅｄｓ）， “Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８０）；特許および科学文献に広範囲に記載されている利用可能なイムノアッセイ、たとえば、米国特許第３，７９１，９３２号；第３，８３９，１５３号；第３，８５０，７５２号；第３，８５０，５７８号；第３，８５３，９８７号；第３，８６７，５１７号；第３，８７９，２６２号；第３，９０１，６５４号；第３，９３５，０７４号；第３，９８４，５３３号；第３，９９６，３４５号；第４，０３４，０７４号；第４，０９８，８７６号；第４，８７９，２１９号；第５，０１１，７７１および５，２８１，５２１号；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” Ｇａｉｔ， Ｍ． Ｊ．， ｅｄ． （１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ” Ｈａｍｅｓ， Ｂ． Ｄ．， ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ． Ｊ．， ｅｄｓ． （１９８５）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ” Ｈａｍｅｓ， Ｂ． Ｄ．， ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ． Ｊ．， ｅｄｓ． （１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ” Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ． Ｉ．， ｅｄ． （１９８６）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ” ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６）；“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ” Ｐｅｒｂａｌ， Ｂ．， （１９８４） ａｎｄ “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌ． １−３１７， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ −Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ” ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ （１９９６）；“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ： Ｐｒｏｂｅｓ ｔｈａｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｕｐｏｎ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”， Ｓａｎｊａｙ Ｔｙａｇｉ１ ＆ Ｆｒｅｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｋｒａｍｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏ技術 １４， ３０３ −３０８ （１９９６）を参照；（すべて、全体が本明細書中で完全に記載されているかのように本明細書中に組み込まれる）。他の一般的な文献をこの文書全体にわたって提供する。この文献中の手順は、当該技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供する。その文献に含まれるすべての情報は、参照することによって本明細書中に組み込まれる。

実験の詳細のセクション
材料および実験法
材料
ＭＲＳＡ株＃１： ＡＴＣＣ７００６９９ （ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）
ＭＲＳＡ株＃２： ＢＡＡ１５５６ （ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）
ＭＲＳＡ株＃３： ＢＡＡ４０ （ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）
Ｐｒｅｐ Ｔｕｂｅ：分子生物学等級の水からなる、ＴｒｉｓおよびＮａ−ＥＤＴＡからなる試料調製緩衝液１ｍｌを含むドルフィン管。
Ｄｒｉ−Ｌｙｓｅ Ｔｕｂｅ：分子生物学等級の水、Ｔｒｉｓ、およびＮａ−ＥＤＴＡからなる溶菌緩衝液により水和されて、溶解溶液を形成する安定化されたアクロモペプチダーゼを含む２ｍｌの管。
ＲＮＡｓｅ Ｈ２酵素：ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）リボヌクレアーゼ Ｈ２酵素をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．（アイオワ州コーラルビル）から入手した。

実験法（全実施例について一般的）
「リボプライマー」ホットスタートプライマー
本明細書中で用いられるリボプライマーは、以下の修飾を含む標準的ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーの変異体である：１つのＲＮＡ残基が標準的ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端に付加され、続いて４つの相補性ＤＮＡ残基およびプライマー伸長を防止するブロッキング基が付加される。ＲＮＡ残基は、プライマーを高温での３’末端による切断のための基質にする。ただし、プライマーはその標的とハイブリダイズするものとする。これらの条件が満たされた場合、ＲＮａｓｅＨ２エンドヌクレアーゼは活性になり、結果として得られるヘテロ二重鎖を切断し、それによりブロッキング修飾を放出し、伸長可能なＰＣＲプライマーを得る。

ｑＰＣＲアッセイ
ｑＰＣＲをＰａｉｔａｎら（米国特許出願第２００９／００８１６６３号）により記載されているようにして実施した。複数のプライマーおよび二重標識された分子ビーコンプローブをＭＲＳＡで見出される３つのＤＮＡ標的に対するハイブリダイゼーションに使用した。プライマー対および合成ＤＮＡの検出のプローブを内部標準として添加した。

対照ＤＮＡ
内部標準プライマー対およびプローブに対して相補性のプラスミド中３４４塩基対（ｂｐ）の合成ＤＮＡを使用して、リアルタイムＰＣＲ反応の全体性を確認した。

ＲＮａｓｅＨ２混合物
３２．５ミリ単位／反応のＲＮａｓｅＨ２エンドヌクレアーゼ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）をＴｒｉｓ、グリセロール、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００からなる緩衝液混合物中で希釈した。

ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ
ＰＣＲ反応混合物は、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ Ｐｏｌ ｆｒｏｍ Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ｄＮＴＰ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｔｒｉｓ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＢＳＡおよびスクロースを含んでいた。

実施例１：ホットスタートプライマーを用いる多重ＰＣＲは、ある条件下で増幅の問題を示す可能性がある
材料および実験法
実施例１のプローブ及びプライマー
プローブ
表１に示すような４つの二重標識された分子ビーコンプローブを使用した；１つは黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸ領域に対して相補性であり（配列番号１）、第２のものは黄色ブドウ球菌特異的ｎｕｃ遺伝子に対して相補性であり（配列番号２）、第３のものはｍｅｃＡ遺伝子に対して相補性であり（配列番号３）、そして第４のものは内部標準ＤＮＡに対して相補性である（配列番号４）。

二重標識された分子ビーコンプローブをＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ． （カリフォルニア州ナヴァト）から購入し、標準的フルオロフォアおよびクエンチャーを組み入れた。

順方向プライマー
表２に示すような４つの順方向プライマーを使用した；１つは黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸ領域に対して相補性であり（配列番号５）、第２のものは黄色ブドウ球菌特異的ｎｕｃ遺伝子に対して相補性であり（配列番号１２）、第３のものはｍｅｃＡ遺伝子に対して相補性であり（配列番号１４）、そして第４のものは内部標準ＤＮＡに対して相補性である（配列番号１６）。各プライマーは「リボプライマー」ホットスタートプライマーであり；表中のリボヌクレオチド残基の前に「ｒ」をつけ、下線を施す。

逆方向プライマー
表２に示すような９つの逆方向プライマー（リボプライマーも）を使用した：６つはＳＣＣｍｅｃ遺伝子の異なる株に対して相補性であり（配列番号６〜１１）；７番目は黄色ブドウ球菌特異的ｎｕｃ遺伝子に対して相補性であり（配列番号１３）；８番目はｍｅｃＡ遺伝子に対して相補性であり（配列番号１５）；そして９番目は内部標準ＤＮＡを検出するために用いられる逆方向プライマーである（配列番号１７）。

実験設定
１３の「リボプライマー」ホットスタートプライマー、４つの分子ビーコンプローブ、内部標準ＤＮＡおよびＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘを含むアッセイ混合物を調製し、水和低減して、５５℃で２時間加熱することにより安定性を増強した。

使用直前に、ＲＮａｓｅＨ２混合物およびＭＲＳＡの培養試料からの精製ＤＮＡを含む溶液２５μｌにより混合物を水和し、多重ｑＰＣＲ反応を実施した。

ＭＲＳＡの２つの別個の株（ＭＲＳＡ株＃１およびＭＲＳＡ株＃２）を用いてアッセイを試験し、それぞれ２連で実施した。実施例＃１について、各ＭＲＳＡ株からのＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ（商標）Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）を用いて精製し、そして合計０．０１ナノグラムの精製ＤＮＡ（約３００ＣＦＵの細菌に等しい）をそれぞれの反応について使用した。ＴＥ中アッセイ混合物を含み、テンプレートＤＮＡを含まない負の対照試料を実施に含めた。

Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ製のＲｏｔｏｒＧｅｎｅ ６０００ Ｓｙｓｔｅｍ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置を標準的ｑＰＣＲプロトコルにしたがって使用して、増幅および検出反応を実施した：
１．９５℃にて３分でＤＮＡを変性させる。
２．それぞれ以下の３つのステップを含む増幅サイクル：（ａ）９５℃で２０秒；（ｂ）５６℃で６０秒；（ｃ）７２℃で３０秒（ステップ （ｂ）の最後で、４つの蛍光染料のそれぞれについて読み取った）。

結果
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出するための多重ｑＰＣＲアッセイを実施した。このアッセイは３つの異なる配列を検出する：メチシリン耐性と関連するｍｅｃＡ遺伝子（「黄色チャンネル」）；黄色ブドウ球菌特異的ｎｕｃ遺伝子（「オレンジ色チャンネル」）；およびＳＣＣｍｅｃ：ｏｒｆＸ、ＳＣＣｍｅｃ挿入カセットと黄色ブドウ球菌ゲノムのｏｒｆＸ領域との間の領域（「架橋領域」とも称する）（「緑色チャンネル」）。アッセイは複数のプライマーおよびＳＣＣｍｅｃ：ｏｒｆＸの右端の接点のハイブリダイゼーション用の二重標識されたプローブを使用する。なぜなら、この領域は異なる黄色ブドウ球菌株間で配列変動を示すからである。プライマー対および合成ＤＮＡの検出用プローブが内部標準として含まれ（「赤色チャンネル」）、同様にテンプレートＤＮＡのない負の対照も含まれていた。ＭＲＳＡの２つの別個の株ＭＲＳＡ株＃１および＃２（それぞれ２連で実施）の培養試料から抽出された精製ＤＮＡでアッセイを実施した。ｎｕｃプライマーは黄色ブドウ球菌ｎｕｃに特異的な配列を認識し；したがってそれらは表皮ブドウ球菌（Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）を増幅しない。

図１に示すように、内部標準（ＩＣ）、ｏｒｆＸおよびｍｅｃＡ遺伝子のプローブは、それぞれ、２つのＭＲＳＡ株にわたってほぼ同一である正のシグナルを産生した。ｎｕｃ遺伝子を標的とするプローブは正のシグナルを産生するが、株＃２よりも明らかに遅れて株＃１からＤＮＡを増幅する点で、２つの株間で顕著な差を示した。２連試料は高い再現性を示した。

２つの株の公開された配列を調べることにより、株＃２は、検出アッセイで用いられる順方向および逆方向ｎｕｃプライマーの両方に対する完全な相補性を形成し、一方、株＃１は、逆ｎｕｃプライマーのＲＮＡ塩基の１塩基前二位位置する１つのミスマッチ塩基を含むことが明らかになった。まとめると、ホットスタートプライマーを含む反応混合物は、全ＤＮＡ標的を４重アッセイで増幅することができ、ミスマッチ塩基を含む１つのＤＮＡ標的は、ミスマッチ塩基を含まないＤＮＡ標的よりも明らかに弱い増幅を示した。

実施例２：臨床的鼻腔用綿棒試料ｈｚホットスタートプライマーを用いたＰＣＲを阻害する可能性がある
実験法
第１の試料タイプの調製（「スパイクされた鼻試料」）
１．単分散溶液をＴＥ中各菌株からｐＨ８．３で、Ｄｅｔｅｃｔ−Ｒｅａｄｙ（商標）ＭＲＳＡ Ｌｙｓｉｓ Ｋｉｔを用いて以下のようにして調製した：
ａ．１つのコロニーを滅菌細菌学的ループで取り、１ｍｌのＴＥ（ｐＨ８．３）緩衝液中で振とうした。
ｂ．１００μｌを９００μｌのＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）中に移し、次いで混合し、このステップをさらに２回繰り返すことにより、希釈を実施して、１０^４ｃｆｕ／ｍｌの濃度に達した。
２．滅菌ピペットチップで、１０μｌの希釈細菌コロニー（約３００ｃｆｕに等しい）を除去し、生理食塩水で湿らせた鼻腔用綿棒上にスパイクし、これでヒトボランティアの鼻孔内部を拭き取った。
３．Ｐｒｅｐ Ｔｕｂｅをあけ、スワブの頭部が試料調製緩衝溶液中に完全に浸されるまで、スワブを挿入した。
４．スワブを緩衝液中で１０〜１５秒間撹拌し（激しく、ただし管の内容物がこぼれないように注意して）、細菌を放出させた。
５．スワブを捨て、Ｐｒｅｐ Ｔｕｂｅをしっかり閉じた。
６．Ｐｒｅｐ Ｔｕｂｅを遠心分離機に入れ、１０，０００〜１２，０００ｇで５分間、室温にて遠心分離した。
７．遠心分離ステップ中、Ｄｒｉ−Ｌｙｓｅ管を、１ｍｌの溶菌緩衝液を添加することにより再水和した。Ｄｒｉ−Ｌｙｓｅ Ｔｕｂｅを閉じ、５秒間ボルテックスして、溶菌液を再構成した。
８．Ｐｒｅｐ Ｔｕｂｅを遠心分離機から取り出し、管を反転することによって上清を注いだ。
９．管の底部に付着したペレットに触れることなく、ペレットを上方向に向けて管を水平な位置に保持しつつ、２００μｌのマイクロピペットで穏やかに吸引することにより、残存する緩衝液を除去した。
１０．９０μｌの溶菌液を、それぞれのペレットを含むＰｒｅｐ Ｔｕｂｅに添加した。
１１．ペレットをピペットにより管の底部から引き離した。
１２．Ｐｒｅｐ Ｔｕｂｅを３７℃にて１０分間加熱ブロック中でインキュベートし、９９℃で５分間加熱し、そして加熱ブロックから取り出した。
１３．試料を１分間、最大速度で遠心分離した。
１４．それぞれの試料を含むＰｒｅｐ Ｔｕｂｅに１０μｌのＲＮａｓｅＨ２溶液混合物を添加した。
１５．各Ｐｒｅｐ Ｔｕｂｅ中の２５μｌの溶液を次いで実施例１で前述されているｑＰＣＲ反応混合物を含むＰＣＲ反応管中に移し、そして多重ｑＰＣＲ反応を実施例１で記載されているようにして実施した。

第２の試料タイプの調製（「直接試料」）
１０μｌの希釈細菌コロニー（約３００ｃｆｕに等しい）を除去し、９０μｌの液体を含む再水和されたＤｒｉ−Ｌｙｓｅ Ｔｕｂｅ中に直接ピペットで移した。管を次いで３７℃で１０分間、加熱ブロック中でインキュベートし、９９℃で５分間加熱し、そして加熱ブロックから取り出した。１０μｌのＲＮａｓｅＨ２混合物を添加し、その後、２５μｌの結果として得られた溶液を次いで実施例１で前述されたｑＰＣＲ反応混合物を含むＰＣＲ反応管に移した。多重ｑＰＣＲ反応を実施例１で記載されているようにして実施した。

結果
実施例１で記載したのと同じ反応混合物およびホットスタートプライマーを用いて、この場合は、広範の精製（Ｄｅｔｅｃｔ−Ｒｅａｄｙ（商標）ＭＲＳＡ Ｌｙｓｉｓ Ｋｉｔを使用）をすることなく実施例１で試験した２つのＭＲＳＡ菌株のそれぞれから得られた２種のＤＮＡ試料を標的として、ＭＲＳＡを検出するための多重ｑＰＣＲアッセイを実施した。試料の第１のタイプ（「スパイクされた鼻試料」）を臨床的鼻試料スワブ上にスパイクし、一方、第２の（「直接試料」）はスパイクしなかった。

ＭＲＳＡ株＃２について、４つのプローブは全て鼻および直接試料のどちらの場合も正のシグナルを生成したが；スパイクされた鼻試料は、体系的により高いサイクル数を示し、このことは増幅の遅延を示す（図２Ａ）。これは、ＭＲＳＡ株＃１の場合のＩＣ、ｍｅｃＡおよびＯｒｆＸについても当てはまった。しかし、ＭＲＳＡ株＃１のｎｕｃ遺伝子の増幅は、スパイクされた鼻試料において完全に阻害された（図２Ｂ）。２連の試料は、高い再現性を示した。この阻害を克服するために２０を越える方法を試み、その大部分は阻害に対して影響を及ぼさなかった、および／またはアッセイ感度に対して悪影響を及ぼした（データは不掲載）。

これらの結果は、スパイクされた鼻試料が、完全なプライマー−標的マッチの場合にはＰＣＲ反応の最適性能を妨害する成分を含み、プライマー−標的ミスマッチが存在する場合は、反応を完全に阻害することを示す。

実施例３： ホットスタートプライマーおよびレギュラープライマーのネスト化組み合わせは、鼻腔用綿棒試料によるｑＰＣＲの阻害を克服する
実験法
プライマー
実施例３で用いられる非ホットスタート順方向及び逆方向プライマーを表３に示し、以下で記載する。

実験プロトコル
２種の広範に精製されていないＤＮＡ試料を、実施例２に記載されているようにして、この場合はＭＲＳＡ株＃３を用いて調製した。ＭＲＳＡを検出するための多重ｑＰＣＲアッセイを、以下のようにしていくつかの異なる反応混合物を用いて実施した：
混合物＃３−１：実施例１〜２で記載されているのと同じ反応混合物であって、ホットスタートプライマーのみを含むもの。
混合物＃３−２：先の混合物においてと同じプローブおよび１３のホットスタートプライマーの、ｎｕｃ、ｏｒｆＸおよびｍｅｃＡ（配列番号１８〜２８）の１１のさらなるレギュラー（非ホットスタート）非修飾オリゴヌクレオチドプライマー（それぞれ、その対応するホットスタートプライマーのモル量の１０％で存在する）との混合物であって、ネスト化プライマー設計を形成する。各レギュラープライマーの配列は、対応するホットスタートプライマーよりも若干長く、ホットスタートプライマーにより標的とされる領域の１〜７０塩基外側の領域に対して相補性であった。内部標準アッセイはホットスタートプライマーのみを使用した。
混合物＃３−３：ｏｒｆＸ、ｎｕｃ、およびｍｅｃＡの非ホットスタートネスト化プライマーのみを通常の濃度の１０％（混合物＃２中のレギュラープライマーと同じ濃度の１００％）；ＩＣのホットスタートプライマーのみ。

結果
スパイクされた鼻試料および直接試料を、実施例２で記載されているようにして、、この場合はＭＲＳＡ株＃３を用いて、広範に精製されていないＤＮＡから調製した。ＭＲＳＡ株＃３を選択した。なぜなら、ｎｕｃを標的とするアッセイおよびｍｅｃＡを標的とするアッセイの両方についてのホットスタートプライマーを用いるｑＰＣＲ反応は、株＃３を含む臨床鼻腔用綿棒試料に適用された場合に、実質的に損なわれることが見出されたからである。多重ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイは、この実施例の方法のセクションで記載した３つの混合物を用いて実施した。２連の試料は、高い再現性を示した。

混合物＃３−１について、先の実施例においてと同様に、ＩＣおよびＯｒｆＸは、実施例２におけるＭＲＳＡ株＃１および＃２で見られた結果と同様に、スパイクされた鼻試料および直接試料のどちらの場合も効率的に増幅された。ｍｅｃＡおよびｎｕｃでの結果は、試料の種類によって変化した。直接試料では、これらの領域は効率的に増幅され（不掲載）、一方、スパイクされた鼻試料では、ｍｅｃＡおよびｎｕｃの増幅は、それぞれかなり阻害され、完全に阻害された（図３Ａ）。これらの結果は、臨床材料のＰＣＲ阻害効果がホットスタートプライマーのみを用いるアッセイでより顕著であり、プライマー標的ハイブリダイゼーションの程度に応じてその大きさが様々であることを裏付ける。この実験では、たとえば、阻害効果はｏｒｆＸの場合は最小であり、ｍｅｃＡについてはさらに実質的であり、そしてｎｕｃ遺伝子標的アッセイについてはほぼ完全であった。混合物＃３−１の負の対照も示す；この対照は、競合するチャンネルからの比較的低い競合のために、内部標準チャンネルに対して高いシグナルを示した。

混合物＃３−２については、それに反して（図３Ａでも示す）、スパイクされた鼻試料において３つの実験チャンネル全てに関して強固な増幅が観察された。これらの結果は、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物の利用が、１０％の非ホットスタートプライマーしか含んでいなくても、臨床材料のＰＣＲ阻害効果を主に克服するブースター効果を提供することを示す。

混合物＃３−３について、３つの増幅は全て、スパイクされた鼻試料において、各ＤＮＡ標的が検出される範囲で成功した（図３Ｂ）。しかし、これらの結果をホットスタート−プライマーおよびネスト化レギュラープライマーの混合物（混合物＃３−２；図３Ａ）と比較すると、混合物＃３−２は、ＰＣＲ阻害が存在する場合でも、実質的により強力な増幅したことがわかる。後者の場合、非ホットスタートプライマーによる増幅は平坦域に達し、ホットスタートプライマーはその時点から順方向へさらなる増幅をおこない続けた。混合物＃３−３の負の対照も示す。

したがって、ホットスタートプライマーおよびレギュラープライマーのネスト化組み合わせ（混合物＃３−２）は、臨床材料の存在下（混合物＃３−１）で観察されるホットスタートプライマーＰＣＲの阻害を克服し、さらに、減少したハイブリダイゼーションを示す標的のみについてのホットスタートプライマーと非阻害標的のみについての非ホットスタートプライマーとの組み合わせ（混合物＃３−３）の使用よりも優れていた。

実施例４：ホットスタートプライマーを使用するｑＰＣＲ反応は、レギュラープライマーを用いた平行増幅により阻害される
この実験は、実施例３について記載したように、スパイク後に広範の精製に付されていないスパイクされた鼻試料および直接試料のいずれかとして存在する精製されたＭＲＳＡ株＃３ＤＮＡ試料も使用した。この場合、ＩＣおよびＯｒｆＸを標的とするアッセイにホットスタートプライマーのみを使用し（すなわち、臨床用スワブ試料由来のＰＣＲ阻害の存在下でさえも、強いＰＣＲ増幅を達成することが先に示されたもの）；一方、実施例１〜２で用いられるホットスタートプライマーに使用したものと同じ配列を有する通常の修飾されていないプライマーを、ｎｕｃおよびｍｅｃＡに利用した（臨床用スワブ試料の存在下で広範なＰＣＲ阻害を示したもの）。スパイクされた鼻試料を２連で実施し、負の対照試料を含めた。さらなる対照反応も実施し、全ての反応についてホットスタートプライマーを単独で使用した。

ホットスタートプライマー単独を含む対照反応において、以前に観察されたように、ｏｒｆＸおよびＩＣは増幅され、一方、ｎｕｃおよびｍｅｃＡの検出は阻害された（図４Ｂ）。レギュラープライマー（ｎｕｃおよびｍｅｃＡ）を用いる増幅は、うまく機能することが判明し；ｍｅｃＡは、特に先の実施例よりも強い増幅を示した（図４Ａ）。この実施例で用いられるスパイクされた鼻試料は、別の調査で、ｍｅｃＡ遺伝子のさらに強い増幅の原因である可能性が高いメチシリン耐性表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）の鼻保因を有することがわかっている個体由来であることが判明した。ｏｒｆＸおよびＩＣは両試料で増幅されたが、スパイクされた鼻試料の増幅は、ホットスタートのみの対照反応との比較により示されるように、他のチャンネルでレギュラープライマーを使用することにより若干遅延した（図４Ｃ）。２連の試料は、高い再現性を示した。

ｍｅｃＡおよびＯｒｆＸの阻害を減少させようとして、ｎｕｃおよびｍｅｃＡを標的とするレギュラープライマーの濃度を減少させた。この方法はＩＣの増幅をはっきりとは改善しなかった（データは不掲載）。

したがって、ホットスタートプライマーのみを使用する増幅は、レギュラープライマーのみを利用する他の増幅の存在下で、多重アッセイに関連して阻害される可能性が高い。特定の理論または作用機構により拘束されることを望まないが、この場合のホットスタート増幅の阻害は、反応管中のｄＮＴＰなどのリソースについての競合のためである可能性が高い。

実施例５：ホットスタートおよびレギュラープライマーの混合物の使用は、多重ｑＰＣＲで競合する増幅の阻害を防止する
プライマー
実施例５で使用した非ホットスタート（レギュラー）順方向及び逆方向プライマーを表４に示し、以下で記載する。

この実験では、３つの異なるプライマーミックスを、ｏｒｆＸ、ｎｕｃおよびｍｅｃＡ遺伝子を標的とするアッセイのそれぞれについて使用した：
混合物＃５−１は、ホットスタートおよび非ホットスタート（レギュラー）プライマーの混合物を含んでいた。各ホットスタートプライマーに関して、ホットスタートプライマーと同じ配列を有するが、いずれかの末端でさらなる相補性塩基が付加されたレギュラープライマーが含まれて、表５に示すような優先的結合が得られた。実施例１および２で記載されるプライマーの濃度は、８０％のホットスタートプライマーおよび２０％のレギュラープライマーを含む以外は、アッセイ混合物においてと同じであった。混合物＃５−２は、ホットスタートプライマーを含まず、混合物＃５−１におけるレギュラープライマーの両と同じ量のレギュラープライマーを含む対照混合物であった。

混合物＃５−３は、実施例１および２で前述した濃度レベルでホットスタートプライマーのみを含んでいた。

実施例４においてと同様に、ＩＣの増幅用の全ての混合物においてホットスタートプライマーのみを使用した。広範に精製されていないＤＮＡを、実施例３について記載されているように、ＭＲＳＡ株＃３の鼻試料上にスパイクされた細菌および直接試料から調製した。鼻試料を２連で実施し、負の対照試料を含めた。

正の増幅は、ホットスタートプライマーおよびレギュラープライマーの混合物を用いる試料において４つのチャンネル全てで明らかであった（図５、混合物＃１）。これらの結果は、全反応についてのホットスタートプライマー単独の使用（混合物＃３）、またはる反応についてのホットスタートプライマーのみの使用および他の反応についてのレギュラープライマーのみの使用（実施例４）よりも優れた著しい改善であった。この実施例は、したがって、阻害剤を含む可能性が高い臨床材料に対する多重ｑＰＣＲ反応、および／またはプライマー−標的ミスマッチの場合のように、いくつかの増幅は弱いプライマー−標的ハイブリダイゼーションを示すことが予想され、他の増幅が強いプライマー−標的ハイブリダイゼーションを示すことが予想される反応を実施するための有効な方法を示す。加えて、この実施例は、ホットスタートプライマー単独を使用するＰＣＲ反応が阻害される場合（図５、ｎｕｃ遺伝子標的、混合物＃３）、対応するレギュラープライマーを含めることにより、ホットスタートプライマーが標的を増幅することを可能にするブーストを提供することを証明する（図５、ｎｕｃ遺伝子標的、混合物＃２を混合物＃１と比較）。特定の理論または作用機構により拘束されることを望まないが、ｎｕｃおよびｍｅｃＡ増幅のブースト効果と、この場合のｏｒｆＸおよびＩＣ増幅の保存された有効性との間の改善されたバランスが、ホットスタートと非ホットスタートプライマーとの間の標的配列の結合競合による可能性が高い。

実施例６：先の実施例で用いられるプライマーの濃度を変えることにより得られる優れた結果
以下のように（表５）、ｏｒｆＸおよびＩＣを標的とするアッセイのプライマーの濃度が先の実施例と同じであり、ｎｕｃおよびｍｅｃＡプライマー濃度を調節して、多重アッセイ反応混合物における４つの別個のアッセイの性能を最適化するように調節して、先の実施例の実験を繰り返した：

ｏｒｆＸ／ＳＣＣｍｅｃ領域を、の７つのホットスタートプライマー各０．５ｍＭマイクロモル濃度（０．５ｍＭ）を用いて増幅した。ｎｕｃ遺伝子領域を、２つのホットスタートプライマー各０．１０５ｍＭおよび２つの非ホットスタートプライマー（各０．１７５ｍＭ）を用いて増幅した。ｍｅｃＡ遺伝子領域を、２つのホットスタートプライマー各０．１０５ｍＭおよび２つの非ホットスタートプライマー各０．２４５ｍＭを用いて増幅した。内部標準を、２つのホットスタートプライマー各０．１５ｍＭを用いて増幅した。容易に定量化可能な増幅が４つのチャンネル全てで得られた（図６）。

この実施例及び先の実施例は、したがって、阻害剤を含む可能性がある臨床材料に関する多重ｑＰＣＲ反応を実施するためのべつの有効な方法を提供し、この場合、プライマー−標的ミスマッチの場合と同様に、弱いプライマー−標的ハイブリダイゼーションを示す増幅もあれば、強いプライマー−標的ハイブリダイゼーションを示す増幅もある。ホットスタートプライマーおよびレギュラープライマーの混合物を、ミスマッチまたは他の弱いプライマー−標的ハイブリダイゼーションが存在する可能性がある増幅に使用し、ホットスタートプライマーのみを、プライマー−標的ハイブリダイゼーションが存在する可能性がある増幅に利用する。

実施例７：ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーを使用し、臨床便試料中にスパイクされた細菌培養物から抽出されたＤＮＡを標的とする多重ｑＰＣＲアッセイ
細菌標的
クロストリジウム・ディフィシル株：ＡＴＣＣ４３５９８（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｏ１５７）株：ＡＴＣＣ７００７２８（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）
ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）株：ＢＡＡ１５５６（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）

臨床便試料
凍結した残存する負の臨床便試料をＨａｄａｓｓａｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ （イスラエル国エルサレム）から入手する。

試料調製
１．単分散溶液を緩衝溶液中菌株から次のようにして調製する：
ａ．１つのコロニーを細菌学的ループで取り、緩衝液中で振とうする。
ｂ．連続希釈を実施して、適切な濃度にする。
２．滅菌ピペットチップで、細菌の溶液のアリコートを除去し、便試料からの臨床用スワブ上にスパイクする。
３．上清を次いでＰｒｅｐ Ｔｕｂｅ中にピペットで移し、これを閉鎖し、遠心分離して、粒子状物質のレベルを減少させる。
４．上清をデカントし、残留緩衝液を除去する。
５．ペレットを溶菌緩衝液中に溶解させる。
６．Ｐｒｅｐ管を加熱ブロック上でインキュベートし、次いで遠心分離する。
７．ＲＮａｓｅＨ２溶液混合物を各Ｐｒｅｐ Ｔｕｂｅに添加する。
８．各Ｐｒｅｐ Ｔｕｂｅ中の溶液のアリコートを次いでｑＰＣＲ反応混合物を含むＰＣＲ反応管中に移す。

ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマー
各プライマーの２つのバージョンを設計する。第１のバージョンは、先の実施例で記載したリボプライマー構造を用いるホットスタートプライマーである。第２のバージョンは、添加されたＲＮＡ塩基、４つの相補性塩基、および３’末端でブロッキング基を含まない非ホットスタート修飾されていないプライマー構造である。

プローブ
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ． Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ｔｃｄＢ（配列番号４０）、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ｅａｅ（配列番号４１）、およびスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ｔｕｆ（配列番号４２）に対して相補性である３つの二重標識された分子ビーコンプローブ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ、カリフォルニア州ナヴァト）をそれぞれ使用する（表６）。

順方向プライマー
表７〜８に示すような３セットのリボ−および非修飾順方向プライマーをそれぞれ使用する；Ｔｃｄ Ｂ（配列番号４３および４９）、ｅａｅ（配列番号４５および５１）、ならびにｔｕｆ（配列番号４７および５３）に対して相補性。

逆方向プライマー
表７〜８に示すような３セットのリボ−および非修飾逆方向プライマーをそれぞれ使用する：Ｔｃｄ Ｂ（配列番号４４および５０）、ｅａｅ（配列番号４６および５２）、ならびにｔｕｆ（配列番号４８および５４）に対して相補性。

実施例７で使用する順方向および逆方向ホットスタートプライマー。「−■」はブロッキング基を表す。

ＲＮａｓｅＨ２混合物
ピロコッカス・アビシ ＲＮａｓｅＨ２エンドヌクレアーゼをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．から入手する。

ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ
Ｔａｑ Ｐｏｌ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、Ｔｒｉｓ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＢＳＡおよびスクロースを含むＰＣＲ反応混合物を使用する。

ｑＰＣＲアッセイ
３つの異なるアッセイ混合物（それぞれ、３つの分子ビーコンプローブ、ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ、および異なるプライマーセットを含む）を調製する。第１のアッセイ混合物中のプライマーは６つの「リボプライマー」ホットスタートプライマーである。第２のアッセイ混合物中のプライマーは６つの非ホットスタートプライマーである。第３のアッセイ混合物は、６つのホットスタートプライマーおよび６つの非ホットスタートプライマーの混合物を含む。

手順
アッセイ混合物のそれぞれを用いて多重ｑＰＣＲ反応を実施する。負の対照試料を実施に含め、ＴＥ中第３の多重アッセイ混合物を含み、テンプレートＤＮＡを含まない。

Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ製のＲｏｔｏｒＧｅｎｅ ６０００ Ｓｙｓｔｅｍ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置を用いて増幅および検出反応を実施する：
１．９５℃にて３分で、ＤＮＡを変性させる。
２．増幅サイクルはそれぞれ以下の３つのステップからなる：（ａ）９５℃で２０秒；（ｂ）５６℃で６０秒；（ｃ）７２℃で３０秒（ステップ（ｂ）の最後で、３つの蛍光染料のそれぞれについて読み取る）。

結果
毒性クロストリジウム・ディフィシル、病原性大腸菌およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓを検出するための多重ｑＰＣＲアッセイを実施する。各多重アッセイは、同じ３つの異なる配列：（ａ）毒性クロストリジウム・ディフィシルと関連するｔｃｄ Ｂ遺伝子；（ｂ）病原性大腸菌と関連するｅａｅ遺伝子、ならびに（ｃ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的ｔｕｆ遺伝子を検出するために設計される。ホットスタートプライマーおよび修飾されていないプライマーの混合物の使用は、あるホットスタートＰＣＲ反応を阻害することが判明している臨床材料においてでさえも、すべての標的の効率的な増幅を可能にする。

実施例８：種々の臨床材料中にスパイクされた培養試料から抽出された非精製ＤＮＡを標的とするホットスタートプライマーを用いる多重ｑＰＣＲアッセイ材料および実験法
実験法
実施例１に類似したホットスタートプライマーのみを含む反応混合物を用い、そして先の実施例と同じｑＰＣＴプロトコルまたは類似のプロトコルを用いて、多重ｑＰＣＲアッセイを実施して、ＭＲＳＡ株＃３から抽出されたＤＮＡを検出する。一試料をプロトコル８−１にしたがって調製し、以下の方法のうちの１つを用いてｑＰＣＲ分析のために調製した試料と比較する：
ＭＲＳＡ株を、臨床用スワブ上に咽喉培養試料からスパイクし、そしてプロトコル８−２にしたがって試料を調製する。
ＭＲＳＡ株を、臨床用スワブ上に、便試料からスパイクし、そして試料を緩衝溶液中で希釈し、低速で遠心分離して、試料中の粒子状物質のレベルを減少させ、そしてプロトコル８−２にしたがって試料を調製する。
ＭＲＳＡ株を、臨床用スワブ上に、膣分泌物、脳脊髄液、尿、リンパ液、涙、唾液、乳、羊水、または気道、腸管もしくは泌尿生殖器の外分泌物の試料からスパイクし、そして試料を緩衝溶液中で希釈し、低速で遠心分離して、試料中の粒子状物質のレベルを減少させ、そしてプロトコル８−２にしたがって調製する。
ＭＲＳＡ株を喀痰試料から臨床用スワブ上にスパイクし、そして試料を緩衝溶液中で希釈し、低速で遠心分離して、試料中の粒子状物質のレベルを減少させ、そしてプロトコル８−２にしたがって試料を調製する。
ＭＲＳＡ株を、全血、血漿、血清試料を含む溶液中にスパイクし、試料を緩衝溶液中で希釈し、低速（全血の場合）で遠心分離して、試料中の粒子状物質のレベルを減少させる。次いで、１０μｌの希釈細菌コロニーを臨床用スワブ上にスパイクする代わりに、１０μｌの希釈細菌コロニーを、血液試料を含む試験管中に直接スパイクする以外は、プロトコル８−２にしたがって、試料を調製する。
ＭＲＳＡ株を、均質化された鼠径部皮膚試料または他の組織試料を含む溶液中にスパイクする。ＤＮＡを次いで抽出し、Ｄ−Ｔａｉｌキット（Ｓｙｎｔｅｚｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．、イスラエル国エルサレム）などの、組織試料からＤＮＡを抽出するための市販のキットを用いて試料を調製する。

プロトコル８−１：直接的細菌性ＤＮＡ試料の調製
希釈された細菌コロニーの試料を取り出し、溶菌緩衝液を含む試験管中にピペットで移す。試験管を次に加熱ブロック中でインキュベートする。ＲＮａｓｅＨ２混合物を添加し、次いで結果として得られる溶液のアリコートを次いで、ｑＰＣＲ反応混合物を含むＰＣＲ反応管中に移す。

プロトコル８−２：臨床用スワブ上にスパイクされた細菌ＤＮＡ試料の調製
臨床用スワブ上にスパイクされた細菌ＤＮＡ試料を先の実施例で記載されているようにして調製する。

結果
ＭＲＳＡ株＃３由来のスパイクされた鼻試料について実施例３で見られるように、ｏｒｆＸ領域および内部標準を標的とするアッセイはＰＣＲ増幅を示す。しかし、ｎｕｃおよびｍｅｃＡ遺伝子を標的とするアッセイはＰＣＲ阻害を示す。これらの結果はＰＣＲ阻害因子が多くの臨床材料中に存在することを示す。さらに、これらのＰＣＲ阻害因子は、本明細書中で例示されるｎｕｃおよびｍｅｃＡアッセイなどの弱いプライマー−標的ハイブリダイゼーションを示すホットスタートプライマーのみのアッセイの性能に悪影響を及ぼすが、本明細書中で例示されるｏｒｆＸおよび内部標準標的アッセイなどの強力なプライマー−標的ハイブリダイゼーションを示すホットスタートプライマー−のみのアッセイには及ぼさないことが示されている。

実施例９：ホットスタートプライマーと通常のプライマーとの組み合わせは臨床材料によるｑＰＣＲの阻害を克服する
この場合は、ＯｒｆＸ領域およびＩＣのためだけのホットスタートプライマーならびにｎｕｃおよびｍｅｃＡ遺伝子のホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物を使用して、先の実施例の実験を繰り返す。このプライマー混合物の使用により、あるホットスタートＰＣＲ反応を阻害することが示された臨床材料においても、４つの標的すべての効率的な増幅が可能になる。

Claims (20)

1. ａ）第１標的ポリヌクレオチド配列を増幅するためのプライマーの第１セット；
   ｂ）第２標的ポリヌクレオチド配列を増幅するためのプライマーの第２セット；および
   ｃ）活性化酵素
   を含むＰＣＲ反応混合物であって、
   前記第１標的ポリヌクレオチド配列の少なくとも１端とハイブリダイズするプライマーがホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物であり、前記非ホットスタートプライマーを用いて前記第１標的ポリヌクレオチド配列を増幅する反応生成物が前記ホットスタートプライマーを用いる増幅の基質であり；そして
   前記ホットスタートプライマーが、前記活性化酵素の作用により逆転される不活性化化学修飾を含み、前記ホットスタートプライマーは、前記ホットスタートプライマーが相補配列と高温でハイブリダイズする場合に前記活性化酵素の基質になる、ＰＣＲ反応混合物。
2. 前記非ホットスタートプライマーにより認識される配列が、前記ホットスタートプライマーにより認識される配列の側面に位置する、請求項１記載のＰＣＲ反応混合物。
3. 前記非ホットスタートプライマーにより認識される配列が、前記ホットスタートプライマーにより認識される配列と重なり合うか、または同一である、請求項１記載のＰＣＲ反応混合物。
4. 前記第１標的ポリヌクレオチド配列の一端だけとハイブリダイズするプライマーがホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの前記混合物である、請求項１記載のＰＣＲ反応混合物。
5. 前記第１標的ポリヌクレオチド配列の両端とハイブリダイズするプライマーがホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの前記混合物である、請求項１記載のＰＣＲ反応混合物。
6. 前記ホットスタートプライマーの前記非ホットスタートプライマーに対する比が１：９〜１９：１（両端を含む）である、請求項１記載のＰＣＲ反応混合物。
7. 前記不活性化化学修飾が３’ブロッキング基である、請求項１記載のＰＣＲ反応混合物。
8. 前記活性化酵素が熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈ酵素である、請求項１記載のＰＣＲ反応混合物。
9. 前記第２標的ポリヌクレオチド配列の少なくとも１つの末端とハイブリダイズするプライマーが、請求項１で定義されるホットスタートプライマーと、非ホットスタートプライマーとの混合物であり、前記非ホットスタートプライマーを用いて前記第２標的ポリヌクレオチド配列を増幅させる反応生成物が、前記ホットスタートプライマーを用いる増幅の基質である、請求項１記載のＰＣＲ反応混合物。
10. 第３標的ポリヌクレオチド配列を増幅するためのプライマーの第３セットをさらに含む、請求項１記載のＰＣＲ反応混合物。
11. リアルタイムＰＣＲに好適なプローブを更に含む、請求項１記載のＰＣＲ反応混合物。
12. 請求項１記載のＰＣＲ反応混合物およびその使用説明書を含むキット。
13. 試験試料において標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法であって、請求項１１記載のＰＣＲ反応混合物を用いて前記試験試料由来の核酸に関してリアルタイムＰＣＲを実施するステップ；前記標的ポリヌクレオチド配列の増幅により生成したシグナルを測定するステップ；および前記シグナルを標準試料と比較するステップを含み、
    前記シグナルが前記標準試料以下であるならば、前記標的ポリヌクレオチド配列が前記試験試料中に存在する、方法。
14. 試験試料において第１標的ポリヌクレオチド配列および第２標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法であって、前記試料の核酸が臨床材料から誘導され、広範に精製されていない方法であり：
    （ａ）ＰＣＲ反応混合物を用いて前記試験試料から核酸を増幅するステップ；および
    （ｂ）増幅されたＰＣＲ産物を検出するステップ
    を含み、前記ＰＣＲ反応混合物が：ｉ）前記第１標的ポリヌクレオチド配列を増幅できる、少なくとも１つの順方向プライマーおよび少なくとも１つ逆方向プライマーを含むプライマーの第１セット；ならびにｉｉ）前記第２標的ポリヌクレオチド配列を増幅できる、少なくとも１つの順方向プライマーおよび少なくとも１つ逆方向プライマーを含むプライマーの第２セットを含み、プライマーの前記第１セットの前記順方向プライマーおよび前記逆方向プライマーのうちの少なくとも１つが、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの混合物として提供される、方法。
15. 前記非ホットスタートプライマーにより認識される配列が、前記ホットスタートプライマーにより認識される配列の側面に位置する、請求項１４記載の方法。
16. 前記非ホットスタートプライマーにより認識される配列が、前記ホットスタートプライマーにより認識される配列と重なるか、または同一である、請求項１４記載の方法。
17. 前記第１標的ポリヌクレオチド配列の一端だけとハイブリダイズするプライマーが、ホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの前記混合物である、請求項１４記載の方法。
18. 前記第１標的ポリヌクレオチド配列の両端にハイブリダイズするプライマーがホットスタートプライマーおよび非ホットスタートプライマーの前記混合物である、請求項１４記載の方法。
19. 前記ホットスタートプライマーの前記非ホットスタートプライマーに対する比が１：９〜１９：１（両端を含む）である、請求項１４記載の方法。
20. ＰＣＲ反応混合物がリアルタイムＰＣＲに好適なプローブを更に含む、請求項１４記載の方法。