JP2022141858A - バリアント検出のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
た、ブロックされた切断可能なプライマーの使用を含む。さらなる実施形態では、該方法は、RNA残基の3’に3個以上のDNA塩基を有するブロックされた切断可能なプライマーの使用を含み、プライマーは、ミスマッチがRNAのすぐ5’に配置されるように設計される。
精度を高めることになる。
合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用、および耐熱性DNAポリメラーゼの使用が含まれる。連鎖反応は、一続きの10から40サイクルからなる。各サイクルにおいて、基質DNAは、最初に高温で変性される。冷却後に、大過剰で存在する合成プライマーを、基質DNAとハイブリダイズさせ、相補的ヌクレオチド配列に沿って二本鎖構造を形成させる。プライマー-基質DNA複合体は、次いで、DNAポリメラーゼによって触媒されるDNA合成反応のための開始部位としての役割を果たすことになり、結果として、基質DNA鎖に相補的な新しいDNA鎖の合成をもたらす。合成方法は、基質DNAの増幅産物を生成する、それぞれの追加のサイクルと共に繰り返される。
し、好ましくは、RNアーゼH2は、Pyrococcus abyssiから得られるまたはそれに由来する。他の実施形態では、本明細書に記載の方法において用いられるRNアーゼH酵素は、他の種、例えば、Pyrococcus furiosis、Pyrococcus horikoshii、Thermococcus kodakarensis、またはThermococcus litoralisから得ることができるまたはそれらに由来する。
サイクリング条件は、以下の通りであった:953:00-(950:10-650:30)×65サイクル。各反応を三連で行った。
標)CFX384(商標)リアルタイムシステム上で熱サイクルにかけた。サイクリング条件は、以下の通りであった:953:00-(950:10-600:30)×3サイクル-(950:10-650:30)×65サイクル。各反応を三連で行った。合計50サイクルが完了した後に、蛍光読み取りを行った。蛍光値をFAMおよびHEX軸上にプロットし、結果を図2aおよび2bに示している。
リメラーゼを利用したアッセイにおけるヘテロ接合体からのシグナルは、簡単にホモ接合体と識別可能である(図2b)。
0nM(5pmol)のリバースプライマーも添加した。さらに、50mU(105fmol/10.5nM)のP.a. RNアーゼH2および50,000コピーの合成gBlock(商標)(Integrated DNA Technologies、Coralville、IA)マッチテンプレートを、0、50、または500コピーのいずれかの逆アレルと組み合わせて(gBlock(商標)配列については、表6、配列番号16~17を参照されたい)反応混合物に添加した。この反応物を、Bio-Rad(商標)CFX384(商標)リアルタイムシステム上で熱サイクルにかけた。サイクリング条件は、以下の通りであった:953:00-(950:10-600:30)×65サイクル。各反応を三連で行った。
ノタイピングコールに帰属され、同じ遺伝子型のサンプルは、一緒に密にクラスター化された。ヘテロ接合体クラスターは、約45度の角度で両方のホモ接合型クラスターから分離され、ユニバーサルrhPCRジェノタイピングアッセイおよびマスターミックスの優れたアレル特異性を示す。
解析用に選択した。
な遺伝子型のうちの1つであるテンプレートを含んでいた:アレル1ホモ接合体(rs72558195アレル1 gBlock(登録商標)テンプレート(配列番号35)1000コピー)、アレル2ホモ接合体(rs72558195アレル2 gBlock(登録商標)テンプレート(配列番号36)1000コピー)、アレル3ホモ接合体(rs72558195アレル2 gBlock(登録商標)テンプレート(配列番号37)1000コピー)、ヘテロ接合体(rs72558195アレル1 gBlock(登録商標)テンプレート(配列番号35)500コピーおよびrs72558195アレル2 gBlock(登録商標)テンプレート(配列番号36)500コピーの混合物)、ヘテロ接合体(rs72558195アレル1 gBlock(登録商標)テンプレート(配列番号35)500コピーおよびrs72558195アレル3 gBlock(登録商標)テンプレート(配列番号37)500コピーの混合物)。テンプレート、またはテンプレートなしの対照(NTC)反応のための水を、2枚の別個のプレートの三連の重複したウェル内に添加した。反応物に以下のサイクリングプロトコールを行った:95℃10分間、その後、45サイクルの95℃10秒間および60℃45秒間。
ユニバーサルFAMプローブ(配列番号14)250nM、ユニバーサルYakima Yellow(登録商標)(配列番号22)プローブ450nM、ユニバーサルフォワードプライマー(配列番号21)1000nM、2種のアレル特異的フォワードプライマー150nM、リバースプライマー500nM、および2×Integrated DNA
Technologies(IDT)(Coralville、IA)rhPCRジェノタイピングマスターミックス5μL(dNTP、変異型H784Q Taqポリメラーゼ(Behlkeら、U.S.2015/0191707を参照されたい)、化学的に改変されたPyrococcus abyssiのRNアーゼH2(Walderら、UA20130288245A1を参照されたい)、安定剤、およびMgCl2を含む)を含む、10μLの容積で反応を行わせた。
3ngを含む、10μLの容積で反応を行わせた。各個のアッセイには、ROX標準化オリゴ50nM、ユニバーサルFAMプローブ(配列番号14)250nM、ユニバーサルYakima Yellow(登録商標)(配列番号22)プローブ450nM、ユニバーサルフォワードプライマー(配列番号21)1000nM、2種のアレル特異的フォワードプライマー(配列番号38および39)150nM、リバースプライマー(配列番号40)500nM、および2×Integrated DNA Technologies(IDT)(Coralville、IA)rhPCRジェノタイピングマスターミックス5μL(dNTP、変異型H784Q Taqポリメラーゼ(Behlkeら、U.S.2015/0191707を参照されたい)、化学的に改変されたPyrococcus abyssiのRNアーゼH2(Walderら、UA20130288245A1を参照されたい)、安定剤、およびMgCl2を含む)も含まれていた。アッセイには、テンプレート濃度の標準化のために別のRNアーゼPアッセイ(表17、配列番号41~43を参照されたい)も含まれていた。
イ1 CqおよびRNアーゼP Cq-rs1135840アッセイ2 Cq)。次に、ΔΔCq(ΔCq-既知の2コピー対照DNAサンプルについての平均ΔCq)をそれぞれのアレルについて算出した。この補正は、SNPアッセイとRNアーゼPアッセイとの間の増幅差異に対する標準化を可能にした。最後に、以下の式を使用してそれぞれのアレルについてのコピー数を算出した:
アレルのコピー数=2*(2^(ΔΔCq))
6ウェルプレートサイドマグネット)上で室温で5分間収集した。ビーズを80%エタノールで2回洗浄し、室温で3分間乾燥させた。サンプルをpH8.0のTE 22μL中に溶出した。
Library Quantification Kit(KAPA Biosystems、Wilmington、MA)を使用して定量を行った。重複したサンプルを10pMの最終濃度にプールして、1%のPhiXバクテリオファージシークエンシング対照を添加した。製造業者からの標準プロトコールを使用して、Illumina(登録商標)(San Diego、CA)MiSeq(商標)プラットフォーム上でV2 300 cycle MiSeq(商標)キットを用いてサンプルを操作した。
のテンプレートなしのレーンにおいて認められる圧倒的な存在量のプライマーダイマーとは対照的である。産物対プライマーダイマーバンドの定量化により、ブロックされていないDNAプライマーについての産物対プライマーダイマーの質量比は0.6であったことが示される。rhPCRプライマーについての質量比は、6.3であった。
Claims (53)
- rhPCRのためのブロックされた切断可能なプライマーであって、
5’-A-B-C-D-E-3’
[式中、
Aは、存在しても存在していなくてもよく、標的と相補的ではないテール伸長部であり;
Bは、標的と相補的である配列ドメインであり;
Cは、識別ドメインであり;
Dは、標的とハイブリダイズしたときにRNアーゼH2によって切断可能である、切断可能なドメインであり;
Eは、プライマーの伸長を阻止するブロッキングドメインである]
を含む前記プライマー。 - Dは1~3個のRNA塩基で構成されている、請求項1に記載のプライマー。
- Dは1個のRNA塩基で構成されている、請求項1に記載のプライマー。
- 切断ドメインは、以下の部分:DNA残基、無塩基残基、改変されたヌクレオシド、または改変されたヌクレオチド間リン酸結合のうちの1つまたはそれ以上を含む、請求項1に記載のプライマー。
- 配列に隣接する切断部位は、ヌクレアーゼ切断に耐性の1つまたはそれ以上のヌクレオシド間結合を含む、請求項4に記載のプライマー。
- ヌクレアーゼ耐性結合はホスホロチオエートである、請求項5に記載のプライマー。
- RNA残基のうちの少なくとも1個の3’酸素原子は、アミノ基、チオール基、またはメチレン基で置換されている、請求項2に記載のプライマー。
- ブロッキング基は、プライマーの3’末端ヌクレオチドに結合される、請求項1に記載のプライマー。
- Aは、ユニバーサルフォワードプライマーおよび場合によりプローブ結合ドメインと同一である領域で構成されている、請求項1に記載のプライマー。
- 標的DNA配列におけるバリエーションを検出する方法であって、
(a)反応混合物を提供するステップであって、該反応混合物は、(i)ブロッキング基の5’およびバリエーションの部位の3’に位置する切断ドメインを有するオリゴヌクレオチドプライマーであって、該ブロッキング基は、オリゴヌクレオチドプライマーの3’端の末端またはその近くに結合されており、プライマー伸長を阻止するおよび/またはプライマーがDNA合成のためのテンプレートとして働くのを阻害する、オリゴヌクレオチドプライマーと、(ii)標的配列を有していてもよいしまたは有していなくてもよい核酸サンプルであって、該標的配列は、バリエーションを有していてもよいしまたは有していなくてもよい、核酸サンプルと、(iii)切断酵素と、(iv)ポリメラーゼとを含む、ステップ;
(b)プライマーを標的DNA配列にハイブリダイズさせて二本鎖基質を形成させるステップ;
(c)プライマーがバリエーションにおいて相補的である場合に、ハイブリダイズしたプライマーを、切断ドメイン内のまたはそれに隣接した位置で切断酵素で切断して、ブロッ
キング基をプライマーから除去するステップ;および
(d)プライマーをポリメラーゼで伸長させるステップ
を含む前記方法。 - 切断酵素は、耐熱性であり、より低い温度で低下した活性を有するホットスタート切断酵素である、請求項10に記載の方法。
- 切断酵素は、耐熱性であり、より低い温度で低下した活性を有する化学的に改変されたホットスタート切断酵素である、請求項10に記載の方法。
- ホットスタート切断酵素は、化学的に改変されたPyrococcus abyssiのRNアーゼH2である、請求項12に記載の方法。
- 切断酵素は、耐熱性であり、より低い温度で低下した活性を有する、より低い温度で抗体との相互作用を通して可逆的に不活化されるホットスタート切断酵素である、請求項10に記載の方法。
- 切断ドメインは、少なくとも1個のRNA塩基で構成されており、切断酵素は、バリエーションに相補的な部位と該RNA塩基との間を切断する、請求項10に記載の方法。
- 切断ドメインは、1個またはそれ以上の2’改変ヌクレオシドで構成されており、切断酵素は、バリエーションに相補的な部位と1個またはそれ以上の該改変ヌクレオシドとの間を切断する、請求項10に記載の方法。
- 1個またはそれ以上の改変ヌクレオシドは、2’-フルオロヌクレオシドである、請求項16に記載の方法。
- ポリメラーゼは、高識別ポリメラーゼである、請求項10に記載の方法。
- ポリメラーゼは、変異型H784Q Taqポリメラーゼである、請求項10に記載の方法。
- 変異型H784Q Taqポリメラーゼは、化学改変、アプタマー改変または抗体改変を介して可逆的に不活化される、請求項19に記載の方法。
- プライマーは、ユニバーサルプライマー配列および場合によりユニバーサルプローブ配列を含む5’テール配列を含み、該テールは、標的DNA配列と非相補的である、請求項10に記載の方法。
- 標的サンプルをジェノタイピングするためのオリゴヌクレオチド組成物であって、5’から3’に:
(a)標的サンプルと非相補的であるが、ユニバーサルフォワードプライマーと同一な第1の配列とアレルに対応するレポータープローブ配列と同一な第2の配列とを(5’から3’に)含む、テール部分と;
(b)標的と相補的な領域と;
(c)アレル特異的ドメインと;
(d)ブロッキングドメインを含む3’末端領域と
を含む前記組成物。 - アレル特異的ドメインは、標的サンプルとハイブリダイズしたときにRNアーゼH酵素
によって切断することができる、請求項22に記載の組成物。 - アレル特異的ドメインは、5’-D-R-3’であり、式中、Dは、目的のSNP部位に位置合わせされるDNA塩基であり、Rは、RNA塩基である、請求項22に記載の組成物。
- オリゴヌクレオチドは、約15~30塩基長である、請求項22に記載の組成物。
- ブロッキングドメインは、0~5個のDNA塩基で構成されている、請求項22に記載の組成物。
- ブロッキングドメインは、DNA、RNA、1,3-プロパンジオール、ミスマッチしたDNAまたはRNA、および標識部分のうちの少なくとも2つで構成されている、請求項22に記載の組成物。
- アレル特異的ドメインは、2’-フルオロアナログで構成されている、請求項22に記載の組成物。
- ジェノタイピングアッセイのためのキットであって、
(a)請求項22に記載の通りに構成される第1のアレルオリゴヌクレオチドと;
(b)請求項22に記載の通りに構成される第2のアレルオリゴヌクレオチドと;
(c)座位特異的リバースプライマーと;
(d)ユニバーサルフォワードプライマーと;
(e)ポリメラーゼと;
(f)第1のアレルに対応する第1のプローブと;
(g)第2のアレルに対応する第2のプローブと;
(h)RNアーゼH酵素と
を含む前記キット。 - 標的濃縮の方法であって、
(a)反応混合物を提供するステップであって、該反応混合物は、(i)標的配列と相補的でないテールドメインと、ブロッキング基の5’およびバリエーションの部位の3’に位置する切断ドメインとを有する第1のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該テー
ルドメインは、第1のユニバーサルプライマー配列を含み、該ブロッキング基は、第1のオリゴヌクレオチドプライマーの3’端の末端またはその近くに結合されており、プライマー伸長を阻止するおよび/または第1のプライマーがDNA合成のためのテンプレートとして働くのを阻害する、第1のオリゴヌクレオチドプライマーと、(ii)標的配列を有するまたは有さない核酸サンプルと、(iii)切断酵素と、(iv)ポリメラーゼとを含む反応混合物を提供するステップ;
(b)第1のプライマーを標的DNA配列にハイブリダイズさせて二本鎖基質を形成させるステップ;
(c)第1のプライマーが標的と相補的である場合に、ハイブリダイズした第1のプライマーを、切断ドメイン内のまたはそれに隣接した位置で切断酵素で切断して、ブロッキング基を第1のプライマーから除去するステップ;および
(d)第1のプライマーをポリメラーゼで伸長させるステップ
を含む前記方法。 - 方法は、第1のプライマー伸長産物のプライミングおよび伸長を支持するためのリバース方向の第2のプライマーをさらに含む、請求項31に記載の方法。
- 第2のプライマーは、第2のユニバーサルプライマー配列を含むテールドメインをさらに含む、請求項32に記載の方法。
- 工程b~dは、1~10回実行される、請求項33に記載の方法。
- 未伸長プライマーを反応物から除去することと、ユニバーサルプライマーを伸長産物にハイブリダイズさせて第2の伸長産物を形成することとをさらに含む、請求項34に記載の方法。
- ユニバーサルプライマーは、アダプター配列を第2の伸長産物に付加するためのテール付きの配列をさらに含む、請求項35に記載の方法。
- シークエンシングは、標的の配列を決定するために第2の伸長産物上で行われる、請求項36に記載の方法。
- 標的DNA配列は、遺伝子編集酵素で処理されたサンプルである、請求項10に記載の方法。
- 標的DNA配列は、CRISPR酵素で処理されたサンプルである、請求項10に記載の方法。
- 標的DNA配列は、Cas9またはCpf1酵素で処理されたサンプルである、請求項10に記載の方法。
- 標的DNA配列は、遺伝子編集酵素で処理されたサンプルである、請求項31に記載の方法。
- 標的DNA配列は、CRISPR酵素で処理されたサンプルである、請求項31に記載の方法。
- 標的DNA配列は、Cas9またはCpf1酵素で処理されたサンプルである、請求項31に記載の方法。
- 切断酵素は、耐熱性であり、より低い温度で低下した活性を有するホットスタート切断酵素である、請求項31に記載の方法。
- 切断酵素は、耐熱性であり、より低い温度で低下した活性を有する化学的に改変されたホットスタート切断酵素である、請求項31に記載の方法。
- ホットスタート切断酵素は、化学的に改変されたPyrococcus abyssiのRNアーゼH2である、請求項45に記載の方法。
- 切断酵素は、耐熱性であり、より低い温度で低下した活性を有する、より低い温度で抗体との相互作用を通して可逆的に不活化されるホットスタート切断酵素である、請求項31に記載の方法。
- 切断ドメインは、少なくとも1個のRNA塩基で構成されており、切断酵素は、バリエーションに相補的な部位と該RNA塩基との間を切断する、請求項31に記載の方法。
- 切断ドメインは、1個またはそれ以上の2’改変ヌクレオシドで構成されており、切断酵素は、バリエーションに相補的な部位と1個またはそれ以上の該改変ヌクレオシドとの間を切断する、請求項31に記載の方法。
- 1個またはそれ以上の改変ヌクレオシドは、2’-フルオロヌクレオシドである、請求項49に記載の方法。
- ポリメラーゼは、高識別ポリメラーゼである、請求項31に記載の方法。
- ポリメラーゼは、変異型H784Q Taqポリメラーゼである、請求項31に記載の方法。
- 変異型H784Q Taqポリメラーゼは、化学改変、アプタマー改変または抗体改変を介して可逆的に不活化される、請求項52に記載の方法。
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