CN116064747A - 用于变体检测的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明可用来提供检测DNA中的变体诸如SNP和插入/缺失的更有效和不太易错的方法。本发明还提供了用于进行便宜的多重测定的方法。

Description

用于变体检测的方法
本申请是申请号为2016800685006的中国专利申请(申请日：2016年11月25日，发明名称：用于变体检测的方法)的分案申请。
技术领域
本发明可用来提供一种检测DNA中的变体诸如单核苷酸多态性(SNP)、多核苷酸多肽性(MNP)和插入/缺失的更有效和不太易错的方法。本发明还提供了一种用于进行便宜的多色测定的方法，并且提供了用于在二维图中可视化多个等位基因结果的方法。
背景技术
RNA酶H2依赖的PCR(rhPCR)(参见美国专利申请公开号US 2009/0325169 A1，通过提及以其整体并入)和标准等位基因特异性PCR(ASPCR)均可用于突变检测。在ASPCR中，DNA聚合酶通过检测在引物的3’端或3’端附近的错配进行错配辨别。虽然ASPCR在错配检测中有时是成功的，但是由于野生型DNA聚合酶的低错配检测能力，辨别可能受限。
与ASPCR相反，rhPCR中的RNA酶H2酶的错配灵敏度允许灵敏地检测DNA突变和从反应中消除引物-二聚体人工生成物。然而，当试图用rhPCR检测DNA突变时，引物内部的错配的定位是重要的。错配的位置越接近可切割的RNA，可从RNA酶H2酶观察到辨别越多，并且所得rhPCR测定的辨别越大。鉴于最常见的野生型DNA聚合酶诸如Taq经常显示出低水平的错配检测，在RNA酶H2切割后不能仅依赖该聚合酶进行该辨别。结合标准rhPCR的每个循环所需要的重复询问，当利用这些聚合酶时，不希望将错配放置在除了与RNA恰好相反之外的任何位置。
发明内容
本公开提供了利用高辨别聚合酶(high discrimination polymerase)突变体或其它高错配辨别聚合酶的测定，以创造可利用位于RNA的5’的错配的新的测定设计。
本发明可用来提供一种检测DNA中的突变(诸如SNP和插入/缺失)的更有效和不太易错的方法。本发明还提供了一种用于进行便宜的多色测定的方法。
本发明的这些和其他优势以及另外的发明特征将从本文提供的本发明的描述中显而易见。
附图说明
图1为显示本发明中利用的两种引物设计的示意图。a)部分为封闭-可切割的引物，其被设计以使得当与模板杂交时感兴趣的SNP在RNA碱基的5’侧。RNA酶H2切割，留下3’询问碱基，通过高辨别力DNA聚合酶确定所述3’询问碱基为匹配或错配的。热循环允许该过程继续。b)部分示例说明RNA酶H2切割和SNP检测与a)相同，但是引物还包括5’“尾”结构域，其包括探针和通用正向引物的结合位点。在用RNA酶H2和该聚合酶辨别1-10个循环之后，高度浓缩的通用正向引物来主导扩增，当其扩增时降解探针。重复该循环25-50次，生成输出信号。该引物设计可为多重的，允许一管多色测定设计。
图2A和2B为来自实施例1描述的测定的终点荧光图。将FAM和HEX荧光值标绘在X和Y轴上。图2A为用野生型Taq聚合酶进行的rs351855的“通用”SNP测定。图2B为用突变体H784Q Taq聚合酶进行的rs351855的“通用”SNP测定，其证明了每个等位基因变体之间大大增强的辨别，如在突变体Taq的情况下由聚簇的更大分离所观察到的。在两种情况下，无模板对照(NTC)(正方形)在(0，0)坐标附近，如所希望的。等位基因1样品显示为圆形，等位基因2样品为菱形，并且杂合子为三角形。每个反应以一式三份进行。
图3A和3B为rs4655751的基因分型判定的等位基因辨别图。反应板在反应建立后即刻循环(A)或在循环前在台面上在室温保持48小时(B)。菱形：无模板对照(NTC)；正方形：等位基因1样品；圆形：等位基因2样品；三角形：杂合子。基因型是紧密群集在一起的并且具有良好的角度分离，这表示优异的等位基因特异性。将每个样品分配为正确的基因分型判定，并且48小时保持时期内观察到无性能变化。
图4A和4B示例说明来自基于TaqMan的测定与rhPCR的基因CCR2rs1799865的等位基因辨别图的并列比较。菱形：无模板对照(NTC)；正方形：等位基因1样品；圆形：等位基因2样品；三角形：杂合子。当显示一致结果时，与传统5’核酸酶基因分型测定(图4A)相比，rhPCR基因分型测定(图4B)实现了更高的荧光信号。
图5A和5B为三等位基因SNP(CYP2C8(rs72558195))的等位基因辨别图，其QuantStudioTM 7 Flex平台(Thermo Fisher)上使用rhPCR基因分型单管多重测定。在图5A中，菱形：无模板对照(NTC)；正方形：等位基因G(等位基因1)样品；圆形：等位基因A(等位基因2)样品；三角形：杂合子。在图5B中，菱形：无模板对照(NTC)；正方形：等位基因G(等位基因1)样品；圆形：等位基因C(等位基因3)样品；三角形：杂合子。
图6显示出CYP2C8 rs72558195的三等位基因的等位基因辨别360图，其使用rhPCR基因分型测定，在单个反应中复用3种等位基因特异性引物。
图7为示例说明rhPCR测定进行定量基因分型的能力的等位基因辨别图。
图8A和8B示例说明基因分型结果和本发明可以实现的等位基因的拷贝数变化的检测。使用不同拷贝数和不同参考基因型来测试gDNA样品。在图8A中，菱形：无模板对照(NTC)；正方形：等位基因G样品；圆形：等位基因C样品；和三角形：杂合子。所得数据与测试输入相关。
图9为多重rhPCR的示意图。
图10为所得Tape Station图像，其表示多重rhPCR方法在减少引物二聚体和增加所希望的扩增子产率中的有效性。
图11图示了rh引物在映射读段和中靶读段的百分比中的有效性。
具体实施方案
本发明涉及利用封闭-可切割的rhPCR引物(见美国专利申请公开号US 2009/0325169 A1，通过提及以其整体并入本文)和具有高水平错配辨别力的DNA聚合酶的单核苷酸多态性辨别的方法。在一个实施方案中，错配位于除RNA碱基对面之外的位置。在这些情况下，辨别大部分不是来自RNA酶H2，而是来自所述高辨别聚合酶。封闭-可切割的引物与RNA酶H2的使用起减少或消除引物二聚体的作用，并且提供一些增加量的SNP或插入/缺失(插入/缺失)辨别(图1a)。
为了本发明的目的，高辨别力被定义为超过野生型栖热水生菌(Taq)聚合酶的平均辨别力的任何量的辨别力。实例包括
Figure BDA0003867158270000041
DNA聚合酶(Wayne Bames)，和在美国专利申请公开号US 2015/0191707(通过提及以其整体并入本文)中所述的突变的聚合酶，诸如H784M、H784S、H784A和H784Q突变体。
在一个另外的实施方案中，将通用检测序列添加到封闭-可切割的引物的5’端。检测序列包括探针的结合位点，和通用扩增引物的结合位点。引物结合位点位于最后的寡核苷酸的5’端或附近，并且探针结合位点位于通用引物位点和SNP检测引物结构域之间的内部。在检测反应中使用超过一个这样的嵌合探针，其中采用不同探针结合位点，允许引物被复用(complexed)，并且进一步允许SNP或其他基因组特征的多色检测。封闭-可切割的rhPCR引物减少或消除引物二聚体。引物二聚体是在SNP检测测定中使用“通用”引物设计的主要问题，并且这限制它们的效用(图1b)。将通用扩增/检测结构域与以封闭-可切割的引物形式的SNP引物结构域组合克服了该困难。
以前，rhPCR SNP的最优选的实施方案采用封闭-可切割的引物，其具有位于单个RNA碱基(切割位点)对面的错配(SNP位点)。当其为许多SNP靶标工作时，有碱基匹配/错配配对，其中没有获得足以用于有力碱基判定(base calling)的辨别力。此外，由于用rhPCR观察到高水平的不同SNP辨别，终点检测可能困难，尤其是用杂合子靶DNA时。在推荐的方法中，RNA碱基在两个辨别引物中相同，消除了该问题。
在本发明的一个实施方案中，该方法涉及封闭-可切割的引物的使用，其中错配位于RNA的5’方向的1-2个碱基。在一个另外的实施方案中，该方法涉及使用封闭-可切割的引物，所述引物在RNA残基的3’方向具有三个或更多个DNA碱基，并且设计引物从而使错配紧接位于RNA的5’。
被RNA酶H2切割后，剩下的引物具有位于紧靠SNP位点的3’端的DNA残基，有效地产生ASPCR引物。在该构造中，高特异性DNA聚合酶可以辨别与模板链的匹配和错配(图1a和1b)。天然DNA聚合酶，诸如Taq DNA聚合酶，会在该引物构造中显示一定水平的辨别力，并且如果在高通量测定形式下达到的辨别水平不足以进行的有力SNP判定，则可使用具有提高的模板辨别力的聚合酶。在一个实施方案中，可使用突变的DNA聚合酶，诸如美国专利申请公开号US 2015/0191707(通过提及以其整体并入)中公开的那些，或设计或优化来提高模板辨别力的任何其它聚合酶。当使用具有增加的错配辨别力的聚合酶时，达到的匹配/错配辨别力的最终水平会与来自ASPCR引物聚合酶相互作用和来自rhPCR引物/RNA酶H2相互作用的贡献相加。此外，使用封闭-可切割的引物降低了引物二聚体形成的风险(其产生假阳性信号)使整个反应更有力，并且具有更高灵敏度和更高特异性。测定的每个组分的相对贡献可随着使用不同聚合酶、引物的3’端上的不同封闭基团和不同RNA酶H2酶而变化。
在另一个实施方案中，本发明可利用添加到引物的5’端的“尾”结构域，其含有通用正向引物结合位点序列和任选地通用探针序列。该尾不会与目标模板互补，并且当使用探针时，该尾会允许便宜的荧光信号检测，其可被复合以允许在qPCR中进行多色信号检测(图1b)。在一个实施方案中，1-10个循环的初始循环和辨别从RNA酶H2和DNA聚合酶发生。在该初始预循环后，高度浓缩的和非辨别性通用正向引物来主导扩增，在DNA扩增时降解探针并生成荧光信号。重复该循环25-50次，这允许有力检测。该测定设计有引物二聚体的问题的倾向，并且引物中的封闭-可切割的结构域的存在会抑制或消除这些问题。
在另一个实施方案中，正向引物任选地与反向引物一起使用，并且将尾结构域添加到正向和反向引物组之一或两者的5’端。尾结构域包含通用正向引物结合位点。引物可用来杂交和扩增靶标诸如感兴趣的基因组样品。引物会将通用引物位点添加到靶标中，并且扩增的进一步循环可使用通用引物进行，所述通用引物含有能够进一步处理样品的接头序列，诸如添加P5/P7流动细胞结合位点和在下一代测序的接头中有用的相关索引或条形码序列(见图9)。在一个另外的实施方案中，使用高保真聚合酶，其会进一步降低碱基错误掺入延伸产物中的比例，并增加本发明的方法的准确度。
在一个另外的实施方案中，以上详述的加尾引物可用来检测编辑事件用于基因组编辑技术。例如，CRISPR/Cas9为基因组编辑中的革命性策略，其能够在基因组DNA中生成靶向的双链断裂。通过CRISPR/Cas9实现DSB的方法-其为包含通过指导RNA靶向双链DNA的核酸内切酶的细菌免疫防御系统-广泛用于基因破坏、基因敲除、基因插入等。在哺乳动物细胞中，内切核酸酶活性之后是内源性修复过程，其导致野生型DNA中靶基因座处的相当频率的插入/缺失/置换，这给出了所得基因组编辑。
已经将RNA酶H-可切割的引物设计成侧翼编辑的位置，以1)生成具有通用尾的基因座特异性扩增子，和2)随后用用于下一代测序的索引P5/P7通用引物扩增。在中间试验中，该策略产生可靠的、基因座特异性的扩增，其以高通量和可再现的方式捕获了CRISPR/Cas9编辑事件。关键发现是通过这种基于NGS的方法的总体靶向编辑被确定为95％；然而，先前的酶促策略表明，来自相同样品的总体编辑在预期的靶位点处约为55％。此外，基于通过内部生物信息学工具的计算机分析(in silico)的预测，设计引物来扩增基因组编辑的脱靶位点。
汇集这些测定用于扩增单个基因组DNA样品，以捕获中靶以及＞100个潜在位点，用于通过与指导RNA的序列同源性介导的脱靶基因组编辑。来自该实验的结果会允许1)鉴定CRISPR/Cas9脱靶位点和提供用于比较多种策略以减少这些影响的测定，2)改善CRISPR/Cas9脱靶预测算法的设计，和3)改善引物组的设计。
如美国专利申请公开号US 2009/0325169(通过提及以其整体并入)所述，RNA酶H2可在含有一个或多个RNA碱基、在2’修饰的核苷酸诸如2’-氟核苷酸的位置处切割。引物还可含有核酸酶抗性连接，诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或甲基膦酸酯。
除非另有定义，如本文所使用的所有科技术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。在矛盾的情况下，本发明的文件，包括定义，会控制。优选的方法和材料在下面描述，尽管类似于或等同于本文所述的那些的方法和材料可用于本发明的实践或测试中。
如本文所使用的“互补”或“互补的”意指核酸，并且可意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(例如A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。
“荧光团”或“荧光标记”指具有约350-900nm之间的最大荧光发射的化合物。
如本文所使用的“杂交”指由于互补碱基配对由两个单链核酸形成的双螺旋结构。杂交可在完全互补的核酸链之间或在含有小区域的错配的“基本互补的”核酸链之间发生。“相同”序列是指完全相同的序列或相似度足以以相同方式起作用用于信号产生或杂交至互补核酸序列的序列。“引物二聚体”指两个寡核苷酸引物的杂交。如本文所使用的“严格杂交条件”意指在该条件下完全互补的核酸链的杂交为强烈优选的条件。在严格杂交条件下，诸如在核酸的复合混合物中，第一核酸序列(例如，引物)会与第二核酸序列(例如，靶序列)杂交。严格条件是序列依赖的，并且在不同情况中会是不同的。严格条件可选为在确定的离子强度pH下，比特异性序列的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm可为50％的与靶标互补的寡核苷酸在平衡状态(当靶序列过量存在时，在Tm，50％的探针在平衡状态被占用)与靶序列杂交的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)。严格条件可为这样的条件：其中在pH7.0至8.3下盐浓度小于约1.0 M钠离子诸如约0.01-1.0 M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(例如约10-50个核苷酸)至少为约30℃和对于长探针(例如大于约50个核苷酸)至少为约60℃。严格条件还可用添加去稳定剂(诸如甲酰胺)来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可为至少2至10倍背景杂交。示例性的严格杂交条件包括以下：50％甲酰胺，5xSSC，和1％SDS，在42℃孵育，或，5x SSC，1％SDS，在65℃孵育；在0.2x SSC和0.1％SDS中65℃洗涤。
如本文所使用的术语“核酸”、“寡核苷酸”或“多聚核苷酸”指至少两个核苷酸共价地连接在一起。单链的描绘还定义互补链的序列。因此，核酸还涵盖描绘的单链的互补链。核酸的许多变体可用于与给定核酸的目的相同的目的。因此，核酸还涵盖基本相同的核酸及其互补物。单链提供了可与靶序列在严格杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可为单链的或双链的，或可含有双链序列部分和单链序列部分。核酸可为DNA、基因组DNA和cDNA二者、RNA或杂交物，在所述杂交物中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，并且碱基的组合包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。可通过化学合成方法或通过重组方法获得核酸。一个特定的核酸序列可涵盖其保守修饰的变体(例如密码子置换)、等位基因、直向同源物、单核苷酸多态性(SNP)和互补序列以及明确指出的序列。
“聚合酶链反应(PCR)”指酶促反应，其中在体外从底物DNA合成并扩增DNA片段。反应通常涉及两个合成的寡核苷酸引物的使用(其与底物DNA中的被几百至几千个碱基对的短距离分离的核苷酸序列互补)和热稳定DNA聚合酶的使用。该链式反应包含10-40个循环的系列。在每个循环中，首先在高温下使底物DNA变性。在冷却下来之后，大量过量存在的合成引物与底物DNA杂交，以沿着互补核苷酸序列形成双链结构。然后引物-底物DNA复合物会用作被DNA聚合酶催化的DNA合成反应的起始位点，导致合成与底物DNA链互补的新的DNA链。每个另外的循环重复该合成过程，产生底物DNA的扩增产物。
如本文所使用的“引物”指能够在合适条件下充当用于DNA合成的起始点的寡核苷酸。合适条件包括发生寡核苷酸与模板核酸的杂交和发生靶序列的合成或扩增的那些条件，在适合的缓冲液中存在四种不同的核苷三磷酸和用于延伸的剂(例如DNA聚合酶)以及在合适温度下。
“探针”和“荧光生成探针”是同义的，并且指a)序列特异性寡核苷酸，其具有附接的荧光团和/或猝灭剂，和任选地小沟结合物；或b)DNA结合试剂，诸如但不限于
Figure BDA0003867158270000081
Green染料。
“猝灭剂”指分子或化合物的一部分，当结合至供体或接近供体时，其能够减少来自荧光供体的发射。猝灭可通过几个机制的任一个发生，所述机制包括荧光共振能量转移、光诱导电子转移、系统间交叉的顺磁增强、Dexter交换耦合，和激子耦合诸如形成深色复合物。
术语“RNA酶H PCR(rhPCR)”指利用“封闭的”寡核苷酸引物和RNA酶H酶的PCR反应。“封闭的”引物含有至少一个化学部分(诸如，但不限于核糖核酸残基)与引物或其它寡核苷酸结合，使得发生封闭的引物与模板核酸的杂交，而不会通过DNA聚合酶扩增该核酸。一旦封闭的引物与模板或靶核酸杂交，由在高温(例如50℃或更高)下被激活的RNA酶H酶切割而去除该化学部分。RNA酶H切割之后，可发生靶DNA的扩增。
在一个实施方案中，封闭的引物的3’端可包含rDDDDMx部分，其中相对于靶核酸序列，“r”为RNA残基，“D”为互补的DNA残基，“M”为错配的DNA残基，并且“x”为C3间隔。C3间隔为短的3-碳链，其附接于寡核苷酸的末端3’羟基，这进一步抑制在切割RNA残基前DNA聚合酶结合。
本文所述的方法可使用衍生自或获得自任何生物体的任何合适的RNA酶H酶进行。通常，RNA酶H依赖的PCR反应使用从超嗜热古细菌深海火球菌(P.a.)获得的或源自超嗜热古细菌深海火球菌(Pyrococcus abyssi)(P.a.)的RNA酶H酶(诸如RNA酶H2)进行。因此，在一个实施方案中，用于本文所述的方法的RNA酶H酶需要获得自或衍生自深海火球菌，优选从深海火球菌获得或衍生的RNA酶H2。
在其他实施方案中，用于本文所述的方法的RNA酶H酶可获得或衍生自其它物种，例如，激烈火球菌(Pyrococcus furiosis)、掘越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、小宝岛嗜热球菌(Thermococcus kodakarensis)或海栖热球菌(Thermococcus litoralis)。
实施例
以下实施例进一步示例说明本发明，但不应该被解释为以任何方式限制其范围。
实施例1：
该实施例证明了增强的rhPCR测定，其利用高度辨别性DNA聚合酶和RNA酶H2用于辨别。
为了证明这些新的测定设计的效用，针对rs113488022(人BRAF基因中的V600E突变)设计rh引物和标准等位基因特异性引物。在PCR和rhPCR中用野生型Taq聚合酶或H784Q突变体Taq聚合酶测试这些引物。在这些测定中使用的引物如表1所示(SEQ ID NO：1-7)。
表1：在实施例1所述的SNP辨别测定中采用的寡核苷酸的序列。
Figure BDA0003867158270000091
Figure BDA0003867158270000101
核酸序列以5’-3’方向显示。DNA为大写字母，RNA为小写字母。可能的错配的位置为下划线的。ZEN＝内部ZENTM猝灭剂(IDT，Coralville，IA)，FAM＝6-羧基荧光素，
Figure BDA0003867158270000102
(荧光猝灭剂，IDT，Coralville，IA)，并且x＝C3丙二醇间隔封闭物。
在这些测定中使用10μL反应体积。为了进行反应，5μL的2x Integrated DNATechnologies(IDT)(Coralville，IA)rhPCR基因分型预混合液(含有dNTP、H784Q突变体TaqDNA聚合酶或野生型Taq DNA聚合酶、稳定剂和MgCl2)与200nM(2pmol)的任一等位基因引物结合。再添加200nM(2pmol)的探针以及200nM(5pmol)的反向引物。另外，将2.5mU(5.25fmoI/0.53nM)的深海火球菌RNA酶H2和1000拷贝的合成gBlockTM(Integrated DNATechnologies，Coralville，IA)模板(1000拷贝等位基因1，500拷贝等位基因1+500拷贝等位基因2(杂合子)，或1000拷贝等位基因2(对于gBlockTM序列，见表2，SEQ ID NO：8-9))添加到反应混合物中。使该反应在Bio-RadTM CFX384TM实时系统上进行热循环。循环条件如下：953∶00-(950：10-650∶30)x 65个循环。每个反应以一式三份进行。
表2：用于实施例1测定的合成的gBlock模板
Figure BDA0003867158270000111
Figure BDA0003867158270000121
核酸序列以5’-3’方向显示。SNP的位置粗体和下划线显示。
实验的Cq结果示于表3。该数据显示出测定系统的错配辨别力用野生型Taq聚合酶时，使用rhPCR相对于使用ASPCR有所增加，并且辨别力通过使用H784Q Taq聚合酶而有所增强。
表3：所得Cq值
Figure BDA0003867158270000122
该表中的所有数字表示从CFX384TM仪器(Bio-RadTM，Hercules，CA)获得的Cq值。
实施例2
以下实施例证明了增强的rhPCR测定，其利用高度辨别性DNA聚合酶和RNA酶H2用于辨别。
为了证明该新的测定设计可起作用，针对rs113488022(人BRAF基因中的V600E突变)设计rh引物和标准等位基因特异性引物。在PCR和rhPCR中用H784Q突变体Taq聚合酶测试这些引物。在这些测定中使用的引物如表4所示(SEQ ID NO：1、4和10-12)。
表4：在实施例2所述的SNP辨别测定中采用的寡核苷酸的序列
Figure BDA0003867158270000131
核酸序列以5’-3’方向显示。DNA为大写字母，RNA为小写字母。可能的错配的位置为下划线的。ZEN＝内部ZENTM荧光猝灭剂(IDT，Coralville，IA)，FAM＝6-羧基荧光素，
Figure BDA0003867158270000132
(荧光猝灭剂)，并且x＝C3丙二醇间隔。
在这些测定中使用10μL反应体积。为了进行反应，5μL的2x Integrated DNATechnologies(IDT)(Coralville，IA)rhPCR基因分型预混合液(含有dNTP、H784Q突变体DNA聚合酶、稳定剂和MgCl2)与200nM(2pmol)的任一等位基因引物结合。再添加200nM(2pmol)的探针，以及200nM(5pmol)的反向引物。另外，将7.5mU(15.75fmol/1.58nM)、50mU(105fmol/10.5nM)或200mU(420fmol/42nM)的深海火球菌RNA酶H2和5e4拷贝的合成gBlockTM(Integrated DNA Technologies，Coralville，IA)模板(1e5拷贝等位基因1，5e4拷贝的等位基因1+5e4拷贝的等位基因2(杂合子)，或1e5拷贝的等位基因2(对于gBlockTM序列，见表2，SEQ ID NO：8-9))添加到反应混合物中。使该反应在Bio-RadTM CFX384TM实时系统上进行热循环。循环条件如下：953∶00-(950∶10-650∶30)x 65个循环。每个反应以一式三份进行。
实验的Cq结果示于表5。该数据显示出测定系统的错配辨别力用野生型Taq聚合酶时，使用rhPCR相对于使用ASPCR有所增加，并且辨别力通过使用H784Q Taq聚合酶而有所增强。
表5：所得Cq值
Figure BDA0003867158270000141
该表中的所有数字表示从CFX384TM仪器(Bio-RadTM，Hercules，CA)获得的Cq值。
ΔCq值显著高于用这些引物的Gen 1版本获得的ΔCq值，这表示该引物设计有优势，如以前在rhPCR中所见。
实施例3
以下实施例示例说明使用具有高错配辨别力的DNA聚合酶的通用测定的升高的可信性。
为了证明本公开的测定可以通用形式起作用，并且用具有高错配辨别力的聚合酶显著改善这些测定，针对rs351855(人FGFR4基因中的G338R突变)设计“通用”测定引物。该“通用”测定设计具有很多优势，包括多重(complex)等位基因特异性rh引物和获得多色读出的能力。在该测定中使用的引物如表6所示(SEQ ID NO：13-18)。
表6：在″通用″SNP辨别测定中使用的寡核苷酸的序列
Figure BDA0003867158270000142
Figure BDA0003867158270000151
核酸序列以5’-3’的方向显示。DNA为大写字母，RNA为小写字母。可能的错配的位置为下划线的。LNA残基标示为+。FAM＝6-羧基荧光素，HEX＝6-羧基-2′，4，4′，5′，7，7′-六氯荧光素，
Figure BDA0003867158270000152
(荧光猝灭剂)，并且x＝C3丙二醇间隔封闭物。
在这些测定中使用10μL反应体积。为了进行反应，5μL的2x Integrated DNATechnologies(IDT)(Coralville，IA)rhPCR基因分型预混合液(含有dNTP、突变体Taq DNA聚合酶或野生型Taq DNA聚合酶、稳定剂和MgCl2)与50nM(500fmol)的两个等位基因引物中的任一结合。再添加各250nM(2.5pmol)的两个探针，以及500nM(5pmol)的通用正向引物和500nM(5pmol)的反向引物。另外，将2.5mU(5.25fmol/0.53nM)的深海火球菌RNA酶H2和1000拷贝的合成gBlockTM(Integrated DNA Technologies，Coralville，IA)模板(1000拷贝的等位基因1，500拷贝的等位基因1+500拷贝的等位基因2(杂合子)，或1000拷贝的等位基因2(对于gBlockTM序列，见表7，SEQ ID NO：19-20))添加到反应混合物中。使该反应在Bio-RadTM CFX384TM实时系统上热循环。循环条件如下：953∶00-(950∶10-650∶30)x 65个循环。每个反应以一式三份进行。在完成总共50个循环后读取荧光。将荧光值标绘在FAM和HEX轴上，并且结果示于图2a和2b。
表7：用于实施例3的合成的gBlock模板
Figure BDA0003867158270000161
核酸序列以5’-3’方向显示。SNP的位置粗体和下划线显示。
结果示例说明纯合子之间的错配辨别使用两种聚合酶是足够的，尽管使用野生型Taq的所得数据证明了更加难以进行等位基因判定。然而，重要地，野生型Taq聚合酶不能有效将杂合子和纯合子区分开，并且将它们的等位基因1和2信号位置太近(图2a)。与之相反，来自利用突变体Taq聚合酶的测定中的杂合子的信号可以容易地与纯合子区分(图2b)。
当检查来自该实施例的Cq值(表8)时，可进一步理解突变体Taq的重要性。数据显示出H784Q Taq突变体不但引人注目地增加错配辨别力，而且NTC的Cq由野生型Taq的50几(50.7至56.1)降低到大于在该测定中测试的数字(＞65)。从该实验，显示出等位基因同一性可从Cq值以及终点荧光确定。
表8：实施例3所述的实验的Cq和ΔCq数据
Figure BDA0003867158270000171
该表中的所有数字表示从CFX384仪器(Bio-RadTM，Hercules，CA)获得的Cq和ΔCq值。
实施例4
以下实施例示例说明使用本发明的测定设计来检测罕见的等位基因变体。为了证明使用这些新的测定设计来检测罕见的等位基因变体的效用，针对rs113488022(人BRAF基因的V600E突变)利用先前描述的第二代rh引物(rdxxdm)(见表4；SEQ ID NO：1、4和10-12)。
在这些测定中使用10μL反应体积。为了进行反应，5μL的2x Integrated DNATechnologies(IDT)(Coralville，IA)rhPCR基因分型预混合液(含有dNTP、H784Q突变体或野生型Taq DNA聚合酶、稳定剂和MgCl2)与200nM(2pmol)的任一等位基因或非辨别性正向引物结合。再添加200nM(2pmol)的探针，以及200nM(5pmol)的反向引物。另外，将50mU(105fmol/10.5nM)的深海火球菌RNA酶H2和50,000拷贝的合成的gBlockTM(Integrated DNATechnologies，Coralville，IA)匹配模板，与0、50或500拷贝的相反等位基因结合(对于gBlockTM序列，见表6，SEQ ID NO：16-17)，添加到反应混合物中。使该反应在Bio-RadTMCFX384TM实时系统上进行热循环。循环条件如下：953∶00-(950∶10-650∶30)x 65个循环。每个反应以一式三份进行。
野生型聚合酶的数据示于表9，并且H784Q突变体Taq聚合酶的数据示于表10。用于罕见等位基因检测的该系统相对于“常规”rhPCR的优势之一是将单一量的RNA酶H2用于两个等位基因的能力。该优势把确定切割所需酶量的潜在要求减半。
表9：实施例4中描述的使用野生型Taq聚合酶的罕见等位基因实验的平均Cq和ΔCq值。
Figure BDA0003867158270000181
Figure BDA0003867158270000191
该表中的所有数字表示从CFX384仪器(Bio-RadTM，Hercules，CA)获得的Cq和ΔCq值。DNA为大写字母，RNA为小写字母。可能错配的位置为下划线的。x＝内部C3丙二醇间隔封闭物。
表10：实施例4中描述的使用H784Q突变体Taq聚合酶的罕见等位基因实验的平均Cq和ΔCq值。
Figure BDA0003867158270000192
该表中的所有数字表示从CFX384仪器(Bio-RadTM，Hercules，CA)获得的Cq和ΔCq值。DNA为大写字母，RNA为小写字母。可能错配的位置为下划线的。x＝内部C3丙二醇间隔封闭物。
该数据清楚地显示出H784Q DNA聚合酶允许在rs113488022的突变体A等位基因的50,000拷贝的背景DNA中检测50拷贝的靶标(1：1000辨别水平)，具有超过11个循环的ΔCq。虽然在该测定中对于T等位基因仅观察到略多于3个循环，但是这相对于野生型Taq聚合酶有显著改善，其没有显示出对于T等位基因的任何辨别，并且对于A等位基因仅3个循环的Δ。
实施例5
该实施例证明使用通用rhPCR基因分型测定和Integrated DNA Technologies(IDT)(Coralville，IA)rhPCR基因分型预混合液进行了成功的等位基因辨别，和反应组分的强大稳定性。为了证明测定设计和混合物组分的强大性质，针对rs4657751(位于人染色体1上的SNP)设计通用引物(见表11，SEQ ID NO：14、21-25)。
相同通用rhPCR基因分型反应建立在Bio-Rad CFX384 TouchTM实时PCR检测系统上的两个白色
Figure BDA0003867158270000201
384孔有缘的PCR板(Bio-Rad，Hercules，CA)中，最终体积为10μL。每个孔含有rhPCR测定引物(150nM的rs4657751等位基因特异性引物1(SEQ ID NO：23)，150nM的rs4657751等位基因特异性引物2(SEQ ID NO：24)，和500nM rs4657751基因座特异性引物(SEQ ID NO：25)。反应以以下浓度含有通用报告寡核苷酸：250nM的通用FAM探针(SEQ ID NO：14)，450nM的通用Yakima
Figure BDA0003867158270000202
(SEQ ID NO：22)探针，和1000nM的通用正向引物(SEQ ID NO：21)，和5μL的2x Integrated DNA Technologies(IDT)(Coralville，IA)rhPCR基因分型预混合液(含有dNTP，突变体H784Q Taq聚合酶(见Behlke，et al.U.S.2015/0191707)，化学修饰的深海火球菌RNA酶H2(见Walder et al.UA20130288245A1)，稳定剂，和MgCl2)。
含有rs4657751SNP的任一等位基因的
Figure BDA0003867158270000203
基因片段(Integrated DNATechnologies，Inc.，Coralville，IA)用作模板DNA的来源(见表12，SEQ ID NO：26和27)。每个孔含有表示三个可能基因型之一的模板：等位基因1纯合子(1000拷贝rs4657751等位基因1
Figure BDA0003867158270000204
模板(SEQ ID NO：26))，等位基因2纯合子(1000拷贝rs4657751等位基因2
Figure BDA0003867158270000205
模板(SEQ ID NO：27))，或杂合子(500拷贝的rs4657751等位基因1
Figure BDA0003867158270000206
模板(SEQ ID NO：26)和500拷贝的rs4657751等位基因2
Figure BDA0003867158270000207
模板(SEQ ID NO：27)的混合物)。将模板或用于无模板对照(NTC)反应的水添加到两个单独板的三个重复的孔中。反应经过以下循环方案：95℃持续10分钟，然后45个循环的95℃持续10分钟和60℃持续45秒。
表11：实施例5中使用的寡核苷酸的序列
Figure BDA0003867158270000208
Figure BDA0003867158270000211
核酸序列以5’-3’方向显示。DNA为大写字母，RNA为小写字母。可能的错配的位置为下划线的。LNA残基标示为+。FAM＝6-羧基荧光素，Yak＝Yakima Yellow(3-(5，6，4′，7′-四氯-5′-甲基-3′，6′-二新戊酰基荧光素-2-基))，
Figure BDA0003867158270000212
Figure BDA0003867158270000213
(荧光猝灭剂)，并且x＝C3丙二醇间隔块。
表12：实施例5中使用的合成的
Figure BDA0003867158270000214
模板。
Figure BDA0003867158270000215
Figure BDA0003867158270000221
核酸序列以5’-3’方向显示。DNA为大写字母。SNP的位置为下划线的。
一个反应板立刻进行循环(0小时台面保持)并且一个反应板在室温保持2天(48小时台面保持)，以证明反应随时间的稳定性。使用Bio-Rad CFX Manager 3.1软件(Bio-Rad，Hercules，CA)进行等位基因辨别分析。在每个孔中检测FAM和Yakima Yellow荧光团。对于两个荧光团，将基线循环设置为在第10个循环开始并在第25个循环结束。用每个孔在45个循环结束时的荧光信号(RFU)生成等位基因辨别图，并且用分析软件的自动判定特征确定基因型。立即运行(图3A)和48小时保持板(图3B)获得相同的性能，这证明反应组分的强大稳定性。将每个样品分配为正确的基因分型判定，并且具有相同基因型的样品是紧密集群在一起的。杂合子聚簇通过约45度角与两个纯合子聚簇中分离，这表示通用rhPCR基因分型测定和预混合液的优异的等位基因特异性。
实施例6
以下实施例比较了本发明的基因分型方法与传统5’核酸酶基因分型测定方法(TaqmanTM)的性能。
选择CCR2基因中的rs1799865SNP，并且设计并获得rhPCR基因分型引物以及rs17998655’核酸酶测定(Thermo-Fisher(Waltham，MA))。用于rs1799865rhPCR基因组SNP测定的序列示于表14(SEQ ID NO：14、21、22和28-30)。Thermo-Fisher 5’核酸酶引物/探针(TaqmanTM)序列没有公开，因此不包括在本文件中。
反应以10μL体积进行，所述体积含有10ng Coriell基因组DNA(Camden，NJ)，250nM的通用FAM探针(SEQ ID NO：14)，450nM的通用Yakima 
Figure BDA0003867158270000232
(SEQ ID NO：22)探针，1000nM的通用正向引物(SEQ ID NO：21)，150nM的两个等位基因特异性正向引物(SEQ IDNO：28和29)，500nM的反向引物(SEQ ID NO：30)，和5μL的2x Integrated DNATechnologies(IDT)(Coralville，IA)rhPCR基因分型预混合液(含有dNTP，突变体H784QTaq聚合酶(见Behlke，et al.U.S.2015/0191707)，化学修饰的深海火球菌RNA酶H2(见Walder et al.UA20130288245A1)，稳定剂，和MgCl2)。
使用以下循环条件在Life Technologies(Carlsbad，CA)QuantStudioTM 7Flex实时PCR仪上进行PCR：在95℃ 10分钟，然后50个循环的95℃持续10秒和60℃持续45秒。在45个循环后用QuantStudioTM实时PCR软件v1.3(Carlsbad，CA、)对每个板进行终点分析。
表14.在实施例6中用于rs1799865基因分型测定的寡核苷酸的序列。
Figure BDA0003867158270000231
Figure BDA0003867158270000241
核酸序列以5’-3’方向显示。DNA为大写字母，RNA为小写字母。LNA残基标示为+。可能的错配的位置为下划线的。FAM＝6-羧基荧光素，Yak＝Yakima Yellow(3-(5，6，4′，7′-四氯-5′-甲基-3′，6′-二新戊酰基荧光素-2-基))，
Figure BDA0003867158270000242
(荧光猝灭剂)，并且x＝C3丙二醇间隔封闭物。
图4A和图4B显示所得等位基因辨别图的并列比较。当显示一致结果时，与传统5’核酸酶基因分型测定(图4A)相比，rhPCR基因分型测定(图4B)实现了更高的荧光信号。rhPCR测定中更高的信号和最小的来自NTC的非特异性扩增允许更好的聚簇分离和精确的基因型判定。
实施例7
以下实施例示例说明本发明的方法，其允许检测和分析三等位基因SNP。rs72558195SNP存在于CYP2C8基因中，并且具有三个可能的基因型。选择该SNP用于使用rhPCR基因分型系进行分析。
询问三等位基因SNP的常规工作流程，如图5A和5B所示，涉及使用相同样品运行一对测试，手动判定，和比较成对测定结果，以获得真实的样品基因型。
为了证明所述系统可与通用rhPCR基因分型系统一起起作用，在LifeTechnologies(Carlsbad，CA)QuantStudioTM 7 Flex实时PCR上的白色
Figure BDA0003867158270000251
384孔有缘的PCR板(Bio-Rad，Hercules，CA)中以10μL最终体积建立反应。每个孔含有rhPCR测定引物(见表16，SEQ ID NO：14、21、22、31-33)。具体地，150nM的rs72558195G：A等位基因特异性引物1(SEQ ID NO：31)和150nM的rs72558195G：A等位基因特异性引物2(SEQ ID NO：32)，或150nM的rs72558195G：A等位基因特异性引物1(SEQ ID NO：31)和150nM的rs72558195G：C等位基因特异性引物3(SEQ ID NO：33)，以及500nM rs72558195基因座特异性引物(SEQ IDNO：34)包括在反应物中。
反应物含有以下浓度的通用报告寡核苷酸：250nM的通用FAM探针(SEQ ID NO：14)，450nM的通用Yakima
Figure BDA0003867158270000252
(SEQ ID NO：22)探针，和1000nM的通用正向引物(SEQ IDNO：21)，50nM ROX内部标准，和5μL的2x Integrated DNA Technologies(IDT)(Coralville，IA)rhPCR基因分型预混合液(含有dNTP，突变体H784Q Taq聚合酶(见Behlke，et al.U.S.2015/0191707)，化学修饰的深海火球菌RNA酶H2(见Walder etal.UA20130288245A1)，稳定剂和MgCl2)。
表16.实施例7中用于rs72558195基因分型测定的寡核苷酸的序列。
Figure BDA0003867158270000253
Figure BDA0003867158270000261
核酸序列以5’-3’方向显示。DNA为大写字母，RNA为小写字母。LNA残基标示为+。可能的错配的位置为下划线的。FAM＝6-羧基荧光素，Yak＝Yakima Yellow(3-(5，6，4′，7′-四氯-5′-甲基-3′，6′-二新戊酰基荧光素-2-基))，
Figure BDA0003867158270000262
(荧光猝灭剂)，并且x＝C3丙二醇间隔封闭物。
含有rs72558195SNP的等位基因的
Figure BDA0003867158270000263
基因片段(Integrated DNATechnologies，Inc.，Coralville，IA)用作模板DNA的来源(见表17，SEQ ID NO：35、36和37)。每个孔含有代表以下6个可能基因型之一的模板：等位基因1纯合子(1000拷贝的rs72558195等位基因1
Figure BDA0003867158270000264
模板(SEQ ID NO：35))，等位基因2纯合子(1000拷贝的rs72558195等位基因2
Figure BDA0003867158270000265
模板(SEQ ID NO：36))，等位基因3纯合子(1000拷贝的rs72558195等位基因3
Figure BDA0003867158270000266
模板(SEQ ID NO：37))，杂合子(500拷贝的rs72558195等位基因1
Figure BDA0003867158270000267
模板(SEQ ID NO：35)和500拷贝的rs72558195等位基因2
Figure BDA0003867158270000268
模板(SEQID NO：36)的混合物)，杂合子(500拷贝的rs72558195等位基因1
Figure BDA0003867158270000269
模板(SEQ ID NO：35)和500拷贝的rs72558195等位基因3
Figure BDA00038671582700002610
模板(SEQ ID NO：37)的混合物)。将模板或用于无模板对照(NTC)反应的水添加到两个单独板的三个重复孔中。反应经过以下循环方案：95℃持续10分钟，然后45个循环的95℃持续10秒的和60℃持续45秒。
表17.在实施例7中使用的
Figure BDA0003867158270000271
序列
Figure BDA0003867158270000272
Figure BDA0003867158270000281
核酸序列以5’-3’方向显示。DNA为大写字母。SNP的位置为下划线的。
结果示于图5A和5B。由此，清楚的是，通用rhPCR基因分型系统可用来表征多等位基因的基因型。
设计三等位基因AD 360图用于示例说明等位基因辨别。遍及来自相同孔的三种染料，将来自每种染料的最后PCR循环的荧光信号(ΔRn)标准化。使用下式计算从原点到数据点的角度和距离：
Figure BDA0003867158270000282
Figure BDA0003867158270000283
图5B显示出rs72558195的三等位基因的等位基因辨别360图，使用rhPCR基因分型测定，该测定使用在单个反应中复用3种等位基因特异性引物。通过收集来自所有测定的荧光信号，可在单个反应中检测6种基因型。从原点到数据点的距离表示染料的信号强度，并且数据集簇之间的宽角度分离表示多重测定的特异性。图中心的NTC表示无引物二聚体或无非特异性扩增。通过如先前实施例所使用的RNA酶H2和突变体Taq DNA聚合酶的选择性，实现多重测定的特异性。
360图可执行4等位基因、5等位基因或6等位基因的可视化。因此对于可具有多种碱基以及可能缺失的位置进行可视化是可能的。距离原点的距离对于每个计算保持不变，并且角度的公式会是：
四-等位基因的(4个等位基因)：角度＝tan-1(ΔRn染料1+ARn染料2)
五-等位基因的(5个等位基因)：
Figure BDA0003867158270000284
六-等位基因的(6个等位基因)：
Figure BDA0003867158270000291
实施例8
以下实施例示例说明本发明的方法提供定量SNP基因分型的能力，其允许确定不同等位基因的拷贝数。为了证明这点，针对rs1135840(人CYP2D6基因中的SNP)设计测定。该基因可以多拷贝存在，并且rs1135840 SNP的拷贝数似乎影响药物代谢(快速代谢药物异喹胍)。
为了证明该测定系统可检测等位基因配给量(allele ration)的小差异，创造了用于分析的标准曲线。合成两种gBlockTM(IDT，Coralville，IA)基因片段(等位基因1和等位基因2，代表rs1135840 SNP的两个等位基因的变体(G＞C))，然后以不同比例将其混合。反应以10μL体积进行，其含有以所示比例(10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9和0∶10)的总共1500拷贝的模板，250nM的通用FAM探针(SEQ ID NO：14)，450nM的通用Yakima
Figure BDA0003867158270000293
(SEQ ID NO：22)探针，1000nM的通用正向引物(SEQ ID NO：21)，150nM的两种等位基因特异性正向引物，150nM的反向引物，和5μL的2x Integrated DNA Technologies(IDT)(Coralville，IA)rhPCR基因分型预混合液(含有dNTP，突变体H784Q Taq聚合酶(见Behlke，et al.U.S.2015/0191707)，化学修饰的深海火球菌RNA酶H2(见Walder etal.UA20130288245A1)，稳定剂和MgCl2)。
使用以下循环条件在Life Technologies(Carlsbad，CA)QuantStudioTM 7 Flex实时PCR上进行PCR：在95℃10分钟，然后45个循环的95℃持续10秒和60℃持续45秒。使用由各自的公司提供的软件(Bio-Rad CFX Manager 3.1软件(Bio-Rad，Hercules，CA)和QuantStudioTM实时PCR软件v1.3(Carlsbad，CA))在45个循环后对每个板进行终点分析。
表18.在实施例8中使用的寡核苷酸序列。
Figure BDA0003867158270000292
Figure BDA0003867158270000301
核酸序列以5’-3’方向显示。DNA为大写字母，RNA为小写字母。LNA残基标示为+。可能的错配的位置为下划线的。FAM＝6-羧基荧光素，Yak＝Yakima Yellow(3-(5，6，4′，7′-四氯-5′-甲基-3′，6′-二新戊酰基荧光素-2-基))，
Figure BDA0003867158270000302
(荧光猝灭剂)，并且x＝C3丙二醇间隔块。
所得数据示于图7。每个样品混合物的范围(spread)足以确定每种模板的拷贝数。
在证明对等位基因定量进行分离所需要的量后，可以确定在实验样品中每个等位基因存在的拷贝数。为了测试这点，针对rs1135840设计的先前所述的测定用来测试具有不同CYP2D6拷贝数和不同rs1135840基因型的13个Coriell基因组DNA(Camden，NJ)样品。这些样品具有已知限定的拷贝数和rs1135840基因型，这可在用通用rhPCR基因分型混合物测试后核实。由此，可以将这些样品分类为任一等位基因的纯合子，或杂合子。
为了从数据计算拷贝数，对每个样品运行两个双重反应。反应以10μL体积进行，其含有3ng的以下基因组DNA之一：NA17123、NA17131、NA17132、NA17149、NA17104、NA17113、NA17144、NA17213、NA17221、NA17114、NA17235或NA17241。每个单独测定还含有50nM ROX标准化寡核苷酸，250nM的通用FAM探针(SEQ ID NO：14)，450nM的通用Yakima
Figure BDA0003867158270000313
(SEQID NO：22)探针，1000nM的通用正向引物(SEQ ID NO：21)，150nM的两个等位基因特异性正向引物(SEQ ID NO：38和39)，500nM的反向引物(SEQ ID NO：40)，和5μL的2x IntegratedDNA Technologies(IDT)(Coralville，IA)rhPCR基因分型预混合液(含有dNTP，突变体H784Q Taq聚合酶(见Behlke，et al.U.S.2015/0191707)，化学修饰的深海火球菌RNA酶H2(见Walder et al.UA20130288245A1)，稳定剂和MgCl2))。测定还含有用于对模板浓度进行标准化的单独RNA酶P测定(见表19，SEQ ID NO：41-43))。
表19.在实施例8中使用的RNA酶P测定序列。
Figure BDA0003867158270000311
核酸序列以5’-3’方向显示。DNA为大写字母。FAM＝6-羧基荧光素，Yak＝YakimaYellow(3-(5，6，4′，7′-四氯-5′-甲基-3，6-二二新戊酰基荧光素-2-基))，
Figure BDA0003867158270000312
(荧光猝灭剂)。
使用以下循环条件在Life Technologies(Carlsbad，CA)QuantStudioTM 7 Flex实时PCR仪上进行定量PCR：在95℃10分钟，然后45个循环的95℃持续10秒和60℃持续45秒。在45个循环后使用由该公司提供的QuantStudioTM实时PCR软件v1.3(Carlsbad，CA)软件对每个板进行终点分析。
通过以下方法确定拷贝数。对于显示为纯合子的每个样品，对每个样品计算ΔCq(RNA酶P Cq-rs1135840测定Cq)。对于显示为杂合子的样品，对两个等位基因计算ΔCq(RNA酶P Cq-rs1135840测定1 Cq和RNA酶P Cq-rs1135840测定2 Cq)。接着，对每个等位基因计算ΔΔCq(ΔCq-已知2个拷贝对照DNA样品的平均ΔCq)。该校正允许对SNP测定和RNA酶P测定之间的扩增差异进行标准化。最终，使用以下等式计算每个等位基因的拷贝数：
等位基因的拷贝数＝2*(2^(ΔΔCq))
所得终点数据示于图8A，并且计算的拷贝数示于图8B。图8A中确定的基因型(纯合子等位基因1、纯合子等位基因2或杂合子)均与已知基因型匹配，并且允许拷贝数的校正计算。建立的单独样品的参考拷贝数在每个结果下面显示。在每种情况下，通过该测定确定的拷贝数正确地确定了输入DNA的基因型和拷贝数。
实施例9
以下实施例证明不同rhPCR探针可用于多重rhPCR。
测定示意图在图9中提供。在第一轮PCR中，使用5’加尾的靶标特异性rh引物。5’尾当并入到扩增子中后含有与不同引物(封闭的或未封闭的)的结合位点用于第二轮PCR，以添加应用特异性序列。例如，如图9所描绘的，该系统可用于扩增用于下一代测序的富集物。在这种情况下，5’加尾的rhPCR引物含有读段1/读段2引物序列。第二轮PCR添加接头序列，诸如用于基于
Figure BDA0003867158270000321
的测序平台的P5/P7系列或其他接头，所述接头序列包括含有条形码/独特分子标识的序列。该方法允许将对于输入到任意NGS平台类型所需要的额外的序列添加到扩增子中。
如图10所示，使用IDT算法设计两个引物集合，包括：含有5’加尾的rh引物的96重集合的一个引物集合，和含有96种DNA“标准”5’加尾的PCR引物的一个引物集合。两个引物集合的区别仅在于rh引物含有内部可切割RNA碱基和3’端的封闭基团。一旦通过RNA酶H2切割去除封闭基团，引物序列变成相同的。
第一轮PCR反应含有10nM的每个封闭的靶标特异性引物、10ng的NA12878人基因组DNA(Coriell Institute for Medical Research，Camden，NJ)、200mU化学修饰的深海火球菌RNA酶H2(见Walder et al.UA20130288245A1)(IDT，Coralville，IA)和1X KAPA 2GHotStart Fast Ready MixTM(Kapa Biosystems，Wilmington，MA)，以上反应为96重。热循环曲线为在95℃10分钟，然后8个循环的95℃持续15秒和60℃持续4分钟，以及最后的99℃最后步骤持续15分钟。反应用2X AMPureTM XP珠子(Beckman Coulter，Brea，CA)清洁。简言之，将100μL AMPureTM SPRI珠子添加到每个PCR孔中，在室温孵育5分钟，并在室温在平板磁铁(DynaMagTM(Thermo-Fisher，(Watherham，MA)96-孔板侧面磁铁)上收集5分钟。将珠子用80％乙醇洗涤两次，并且允许在室温干燥3分钟。在22μL的pH 8.0的TE中洗脱样品。
第二轮PCR使用20μL的清洁的第一轮PCR产物、2μM的通用PCR-50F和PCR-47R引物(见表20，SEQ ID NO：44和45)和1X KAPA 2G HotStart Fast Ready MixTM(KAPABiosystems，Wilmington，MA)建立。反应循环：在98℃45秒，然后20个循环的98℃持续15秒、60℃持续30秒和72℃持续30秒。最后1分钟72℃处理步骤结束反应。再次使用0.8X AMPureTM珠子清洁样品。简言之，将40μL AMPureTM SPRI珠子添加到第二PCR孔，在室温孵育5分钟，并且在室温在平板磁铁(DynaMagTM(Thermo-Fisher，(Watherham，MA)96孔板侧面磁铁)上收集5分钟。将珠子用80％乙醇洗涤两次，并且允许在室温干燥3分钟。在22μL的pH 8.0的TE中洗脱样品，并且将20μL转移到新管中。
使用
Figure BDA0003867158270000332
High Sensitivity D1000TM Screen TapeTM在
Figure BDA0003867158270000336
2200TapeStationTM(Agilent
Figure BDA0003867158270000333
Santa Clara，CA)上分析2μL的样品。根据制造商的方案使用用于
Figure BDA0003867158270000334
平台的KAPA文库定量试剂盒(KAPA Biosystems，Wilmington，MA)进行定量。将重复样品汇集到10 pM的最终浓度，并且添加1％PhiX噬菌体测序对照。使用来自制造商的标准方案在
Figure BDA0003867158270000335
(San Diego，CA)MiSeqTM平台上用V2 300 cycle MiSeqTM试剂盒运行样品。
表20.在实施例9中使用的通用测定序列。
Figure BDA0003867158270000331
Figure BDA0003867158270000341
核酸序列以5’-3’方向显示。DNA为大写字母。
图10显示来自
Figure BDA0003867158270000342
Station的结果。引物二聚体产物为在DNA模板的存在下使用标准DNA引物产生的最显著的产物，仅含有少量的全长预期产物。在不存在模板的情况下，引物二聚体产物为反应的主要组分。在封闭的rhPCR引物的情况下，物质的绝大多数是所希望的PCR产物，几乎观察不到引物二聚体。在不存在模板的情况下，不存在引物二聚体，与在未封闭的DNA引物的无模板泳道中观察到的引物二聚体的压倒性丰度形成对比。产物对比引物二聚体条带的定量显示，对于未封闭的DNA引物，产物与引物二聚体的质量比为0.6。对于rhPCR引物的质量比为6.3。
图11总结了两个关键的测序指标。第一个是来自测序数据的映射的读段的百分比。rhPCR反应给出85％的映射到人基因组的读段的百分比，而未封闭的DNA引物给出小于20的映射的读段百分比。第二个指标，中靶读段的百分比，当使用rhPCR引物时接近95％，但是当在复用中使用未封闭的引物时小于85％。这些结果清楚地证明，复用中使用rhPCR的效用，其中可见增加量的所希望的物质，并且观察到不希望的副产物的大量减少。差异意指更少的不想要的测序读段，并且所希望的序列的覆盖深度更高。
本文所引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)通过提及并入本文，并入程度与如果单独并且具体地指出每个参考文献通过提及并入并且以其全文在本文中示出时的程度相同。
在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)，术语“一”(a)、″一个(an)″和“所述”以及类似的指示词的使用，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则被解释为覆盖单数形式和复数形式。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”除非另有说明，否者被解释为开放式术语(即，意指，“包括但不限于”)。本文中列举的数值范围除非本文另有说明，否则仅意图用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值被并入本说明书，如同它在本文中单独列举的一样。除非本文另有说明或与上下文另有明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以任何合适顺序进行。除非另有要求，否则本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅意图更好阐明本发明，并且不造成对本发明的范围的限制。说明书中的任何语言都不应该被解释为将任何未要求保护的元素表示为对于本发明的实践必不可少的。
在本文中描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的执行本发明的最佳实施方式。在阅读上述说明时，这些优选的实施方案的变化对本领域普通技术人员可能变得显而易见。本发明的发明人希望技术人员适当采用这样的变化，并且发明人意图将本发明以不同于本文具体描述的来实施。因此，如适用法律所允许的，本发明包括在此所附的权利要求中列举的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或与上下文另有明显矛盾，否则上述元素在其所有可能的变化中的任何组合都涵盖在本发明中。
综上所述，本申请包括但不限于以下各项：
1.一种用于rhPCR的封闭-可切割的引物，所述引物包含：
5’-A-B-C-D-E-3’
其中，
A为任选的，并且为不与靶标互补的尾延伸；
B为与靶标互补的序列结构域；
C为辨别结构域；
D为可切割的结构域，当与所述靶标杂交时所述可切割的结构域可被RNA酶H2切割；并且
E为封闭结构域，所述封闭结构域防止所述引物的延伸。
2.项1的引物，其中，D包含1-3个RNA碱基。
3.项1的引物，其中，D包含1个RNA碱基。
4.项1的引物，其中，所述可切割结构域包含以下部分中的一个或多个：DNA残基、脱碱基残基、修饰的核苷或修饰的磷酸核苷酸间连接。
5.项4的引物，其中，侧接所述切割位点的序列含有抗核酸酶切割的一个或多个核苷酸间连接。
6.项5的引物，其中，所述核酸酶抗性连接为硫代磷酸酯。
7.项2的引物，其中，所述RNA残基的至少一个的3′氧原子被氨基、巯基或亚甲基取代。
8.项1的引物，其中，所述封闭基团与所述引物的3′-末端核苷酸附接。
9.项1的引物，其中，A包含与通用正向引物相同的区域以及任选的探针结合结构域。
10.一种检测靶DNA序列中的变异的方法，所述方法包括：
(a)提供反应混合物，其包含(i)寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物具有位于封闭基团的5’并且位于变异位置的3’的切割结构域，所述封闭基团连接在寡核苷酸引物的3’端的末端或附近，其中所述封闭基团防止引物延伸和/或抑制所述引物用作DNA合成的模板，(ii)样品核酸，所述样品核酸可以具有或可以不具有所述靶序列，并且其中所述靶序列可以具有或可以不具有所述变异，(iii)切割酶和(iv)聚合酶；
(b)使所述引物和所述靶DNA序列杂交以形成双链的底物；
(c)如果所述引物在所述变异处是互补的，则在所述切割结构域内或邻近所述切割结构域的点处用所述切割酶切割所述杂交的引物，以从所述引物中去除所述封闭基团；和
(d)用所述聚合酶延伸所述引物。
11.项10的方法，其中，所述切割酶为热启动切割酶，所述热启动切割酶为热稳定的并且在较低温度下具有降低的活性。
12.项10的方法，其中，所述切割酶为化学修饰的热启动切割酶，所述热启动切割酶为热稳定的并且在较低温度下具有降低的活性。
13.项12的方法，其中，所述热启动切割酶为化学修饰的深海火球菌(Pyrococcusabyssi)RNA酶H2。
14.项10的方法，其中，所述切割酶为热启动切割酶，所述热启动切割酶通过在较低温度下与抗体相互作用而可逆地失活，并且为热稳定的并且在较低温度下具有降低的活性。
15.项10的方法，其中，所述切割结构域包含至少一个RNA碱基，并且，所述切割酶在与所述变异互补的位置和所述RNA碱基之间切割。
16.项10的方法，其中，所述切割结构域包含一个或多个2’-修饰的核苷，并且所述切割酶在与所述变异互补的位置和所述一个或多个修饰的核苷之间切割。
17.项16的方法，其中，所述一个或多个修饰的核苷为2’-氟核苷。
18.项10的方法，其中，所述聚合酶为高辨别力聚合酶。
19.项10的方法，其中，所述聚合酶为突变体H784Q Taq聚合酶。
20.项19的方法，其中，所述突变体H784Q Taq聚合酶经由化学、适配体或抗体修饰而可逆地失活。
21.项10的方法，其中，所述引物含有5’尾序列，所述5’尾序列包含通用引物序列和任选的通用探针序列，其中，所述尾与所述靶DNA序列为非互补的。
22.一种用于对目标样品进行基因分型的寡核苷酸结构，其中，所述结构从5’至3’包含：
(a)加尾部分，其与所述目标样品为非互补的，但是(从5’至3’)含有与通用正向引物相同的第一序列，和与对应于等位基因的报告探针序列相同的第二序列；
(b)与靶标互补的区域；
(c)等位基因特异性结构域；和
(d)含有封闭结构域的3’末端区域。
23.项22的结构，其中，当与所述目标样品杂交时，所述等位基因特异性结构域能够被RNA酶H酶切割。
24.项22的结构，其中，所述等位基因特异性结构域为5’-D-R-3’，其中，D为与感兴趣的SNP位置比对的DNA碱基，并且R为RNA碱基。
25.项22的结构，其中，所述寡核苷酸为约15-30个碱基长。
26.项22的结构，其中，所述封闭结构域包含0-5个DNA碱基。
27.项22的结构，其中，所述封闭结构域包含以下的至少两个：DNA、RNA、1，3-丙二醇、错配的DNA或RNA和标记部分。
28.项22的结构，其中，所述等位基因特异性结构域包含2’-氟类似物。
29.一种用于基因分型测定的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)项22中包含的第一等位基因寡核苷酸；
(b)项22中包含的第二等位基因寡核苷酸；
(c)基因座特异性反向引物；
(d)通用正向引物；
(e)聚合酶；
(f)对应于第一等位基因的第一探针；
(g)对应于第二等位基因的第二探针；和
(h)RNA酶H酶。
30.一种从等位基因扩增图可视化多个不同荧光信号的方法，所述方法包括：
(a)使用来自单个反应孔中的多种荧光染料信号的三种荧光信号，从来自Dye1和Dye2的荧光信号减去最低荧光Dye3；
(b)用以下等式计算数据与原点之间的距离以及与多个轴之一的角度：
Figure BDA0003867158270000381
Figure BDA0003867158270000382
和
(c)在有三个轴的圆形图上标绘所得到的距离，所述三个轴是每个染料或等位基因对应一个轴。
31.一种靶向富集的方法，其包含：
(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含(i)第一寡核苷酸引物，所述第一寡核苷酸引物具有不与靶序列互补的尾结构域，所述尾结构域包含第一通用引物序列；位于封闭基团的5’并且位于变异位置的3’的切割结构域，所述封闭基团连接在所述第一寡核苷酸引物3’端的末端处或附近，其中，所述封闭基团防止引物延伸和/或抑制所述第一引物用作DNA合成的模板，(ii)样品核酸，所述样品核酸可以具有或可以不具有所述靶序列，(iii)切割酶和(iv)聚合酶；
(b)使所述第一引物和所述靶DNA序列杂交以形成双链的底物；
(c)如果所述第一引物在所述变异处是互补的，则在所述切割结构域内或邻近所述切割结构域的点处用所述切割酶切割所述杂交的第一引物，以从所述第一引物中去除所述封闭基团；和
(d)用所述聚合酶延伸所述第一引物。
32.项31的方法，所述方法进一步包含反向的第二引物，以支持第一引物延伸产物的引发和延伸。
33.项32的方法，其中，所述第二引物还包含尾结构域，所述尾结构域包含第二通用引物序列。
34.项33的方法，其中，将步骤b-d进行1-10次。
35.项34的方法，其进一步包含从反应中去除未延伸的引物，并且使通用引物与延伸产物杂交以形成第二延伸产物。
36.项35的方法，其中，所述通用引物还包含加尾序列用于向所述第二延伸产物中添加接头序列。
37.项36的方法，其中在所述第二延伸产物上进行测序以确定所述靶的序列。
38.项10的方法，其中，所述靶DNA序列为已经用基因编辑酶处理的样品。
39.项10的方法，其中，所述靶DNA序列为已经用CRISPR酶处理的样品。
40.项10的方法，其中，所述靶DNA序列为已经用Cas9或Cpf1酶处理的样品。
41.项31的方法，其中，所述靶DNA序列为已经用基因编辑酶处理的样品。
42.项31的方法，其中，所述靶DNA序列为已经用CRISPR酶处理的样品。
43.项31的方法，其中，所述靶DNA序列为已经用Cas9或Cpf1酶处理的样品。
44.项31的方法，其中，所述切割酶为热启动切割酶，所述热启动切割酶为热稳定的并且在较低温度下具有降低的活性。
45.项31的方法，其中，所述切割酶为化学修饰的热启动切割酶，所述热启动切割酶为热稳定的并且在较低温度下具有降低的活性。
46.项45的方法，其中，所述热启动切割酶为化学修饰的深海火球菌RNA酶H2。
47.项31的方法，其中，所述切割酶为热启动切割酶，所述热启动切割酶通过在较低温度下与抗体相互作用而可逆地失活，并且为热稳定的并且在较低温度下具有降低的活性。
48.项31的方法，其中，所述切割结构域包含至少一个RNA碱基，并且所述切割酶在与所述变异互补的位置和所述RNA碱基之间切割。
49.项31的方法，其中，所述切割结构域包含一个或多个2’-修饰的核苷，并且所述切割酶在与所述变异互补的位置和所述一个或多个修饰的核苷之间切割。
50.项49的方法，其中，所述一个或多个修饰的核苷为2’-氟核苷。
51.项31的方法，其中，所述聚合酶为高辨别力聚合酶。
52.项31的方法，其中，所述聚合酶为突变体H784Q Taq聚合酶。
53.项52的方法，其中，所述突变体H784Q Taq聚合酶经由化学、适配体或抗体修饰而可逆地失活。

Claims (10)

1.一种用于rhPCR的封闭-可切割的引物，所述引物包含：
5’-A-B-C-D-E-3’
其中，
A为任选的，并且为不与靶标互补的尾延伸；
B为与靶标互补的序列结构域；
C为辨别结构域；
D为可切割的结构域，当与所述靶标杂交时所述可切割的结构域可被RNA酶H2切割；并且
E为封闭结构域，所述封闭结构域防止所述引物的延伸。
2.权利要求1的引物，其中，D包含1-3个RNA碱基。
3.权利要求1的引物，其中，D包含1个RNA碱基。
4.权利要求1的引物，其中，所述可切割结构域包含以下部分中的一个或多个：DNA残基、脱碱基残基、修饰的核苷或修饰的磷酸核苷酸间连接。
5.权利要求4的引物，其中，侧接所述切割位点的序列含有抗核酸酶切割的一个或多个核苷酸间连接。
6.权利要求5的引物，其中，所述核酸酶抗性连接为硫代磷酸酯。
7.权利要求2的引物，其中，所述RNA残基的至少一个的3′氧原子被氨基、巯基或亚甲基取代。
8.权利要求1的引物，其中，所述封闭基团与所述引物的3′-末端核苷酸附接。
9.权利要求1的引物，其中，A包含与通用正向引物相同的区域以及任选的探针结合结构域。
10.一种从等位基因扩增图可视化多个不同荧光信号的方法，所述方法包括：
(a)使用来自单个反应孔中的多种荧光染料信号的三种荧光信号，从来自Dye1和Dye2的荧光信号减去最低荧光Dye3；
(b)用以下等式计算数据与原点之间的距离以及与多个轴之一的角度：
Figure FDA0003867158260000021
Figure FDA0003867158260000022
和
(c)在有三个轴的圆形图上标绘所得到的距离，所述三个轴是每个染料或等位基因对应一个轴。
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