CN109234375A - 一种针对叶酸代谢基因进行基因分型的方法 - Google Patents

一种针对叶酸代谢基因进行基因分型的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种针对叶酸代谢基因进行基因分型的方法，属于分子生物学技术领域。具体是运用RNase H2和Taq DNA聚合酶双相酶系统技术对叶酸代谢相关基因位点进行分型检测。本发明提供的试剂盒的敏感度高，检测快速，稳定性好，封闭式检测，减少了后期污染的可能性。

Description

一种针对叶酸代谢基因进行基因分型的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，属于体外诊断试剂领域中SNP多态性检测方法，具体涉及一种针对叶酸代谢基因进行基因分型的方法。
背景技术
中国是世界上出生缺陷的高发国家之一，每年的出生缺陷儿数量约占全世界的20％。我国常见的出生缺陷有神经管畸形、先天性心脏病、唇腭裂、尿道下裂等。据中国疾病预防控制中心统计资料显示，每年有80万-120万名出生缺陷儿，平均每30秒就有一名缺陷儿出生。其中，除20％-30％患儿经早期诊断和治疗可以获得较好生活质量外，30％-40％患儿在出生后死亡，约40％将成为终身残疾,这意味着每年将有40万家庭被卷入终生痛苦的漩涡中。
出生缺陷的发生原因十分复杂，有些还不为人类所认识，但主要是遗传因素、环境因素或二者的共同作用。我国是全球神经管畸形高发国家，最常见的就是脊柱裂儿和无脑儿，近年来大量研究已经证实，叶酸缺乏是导致新生儿出生缺陷的主要原因。导致机体缺乏叶酸有两个方面的原因：一是叶酸摄入量不足，二是由于遗传(基因)缺陷导致机体对叶酸的利用能力低下(叶酸代谢通路障碍)。
叶酸属B族维生素，是合成核酸所必须的元素，是细胞生长和组织修复所必需的物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。叶酸的临床功能除了预防胎儿神经管缺陷外，还能降低孕妇妊娠高血压、自发性流产和胎儿宫内发育迟缓、早产以及新生儿低出生体重等发病率。
科学研究发现，叶酸利用能力受遗传结构(基因)影响，如果与叶酸代谢相关的酶活性偏低(即相关基因功能异常)，这一人群如按常量(400微克/天)补充叶酸，机体叶酸水平也会不足。遗传体质的差异导致了机体对叶酸利用能力的差异，因此，叶酸增补应因人而异，增补过多或过少都不利于胎儿健康和孕妇健康。随着生命科学技术的发展，叶酸利用能力基因检测与风险评估于2008年即已被中国疾病预防控制中心妇幼保健中心列为临床应用指南(参见《妇幼保健医疗临床遗传检测项目资料汇编》第六卷临床应用指南之二十一《叶酸利用能力》)。这一崭新的生命科学技术成果近两年来已在国内部分妇幼保健院(四川省内如德阳市妇幼保健院)取得较大成效，为个体化(差异化)增补叶酸、预防新生儿出生缺陷提供了更高水平的科学手段和临床依据。
但是，在妇幼保健院的应用中发现一个普遍存在的问题，即50％以上的孕妇是在无意中怀孕的，增补叶酸的时间往往滞后至少2～3个月(怀孕前三个月即应开始增补叶酸)，错过了补充叶酸的关键时期，不利于预防胎儿神经管缺陷。因此，应该提倡叶酸增补从新婚开始(在发达国家，新婚期即开始了叶酸的增补)。
男性增补叶酸对优生有着同等重要的意义。科学研究进一步表明，叶酸摄入不足，男性机体叶酸水平偏低，主要会导致两方面的不良后果：一是精子密度低、活性下降、勃起功能减弱，二是精液中携带的染色体数量异常(过多或过少，即精子中出现“非整倍体”)，引起唐氏综合症或流产。
综上所述，通过最先进的科学手段检测每对新婚夫妇对叶酸的利用能力，不仅可以实现个性化增补叶酸，还可以增强新婚夫妇增补叶酸的意识和依从性，从而更有效地降低新生儿出生缺陷风险。
科学研究证实，与叶酸代谢密切相关的基因是5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)。研究发现，MTHFR 677位点的多态性是影响该酶活性的一个重要因素，导致酶活性和热稳定性下降。若以个体携带677CC基因型时其MTHFR活性为100％，携带CT基因型的活性则为CC的71％，基因型为TT型的只有34％。另外，研究还发现，MTHFR 1298位点的多态性也是影响该酶的活性的一个重要因素，携带MTHFR 1298C等基因的酶活性为野生型1298A的68％左右，因而阻碍了叶酸代谢，引起一系列疾病发病风险增加。
甲硫氨酸是蛋白质合成和一碳代谢的必须氨基酸，它的合成是由甲硫氨酸合酶(MTR编码)催化的，而甲硫氨酸合酶因为辅助因子维生素B12被氧化而最终失活。MTRR编码的甲硫氨酸合成酶还原酶能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。MTRR突变是造成叶酸/甲基维生素缺乏症的主要病因。主要突变型有122M(A66G)等。
MTHFR和MTRR等基因变异引起的相应的酶活性降低可阻抑同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸，导致低叶酸血症和高同型半胱氨酸血症，从而增加新生儿出生缺陷风险或自发性流产等风险。
目前基因分型检测方法已经层出不穷，最主流的还是测序和PCR法。RNase H2是一种专一识别RNA-DNA杂合体的酶，并能特异识别单个RNA碱基与DNA模板互补的位点。专利号201410330456.4开发了一种PCR-反向点杂交法来进行叶酸代谢相关基因的分型检测，本专利利用RNase H2和PCR技术相结合开发一种新型的叶酸代谢相关基因的检测，目前还没有查到该方法运用到叶酸代谢相关基因的检测中。
发明内容
本发明运用了双相酶系统RNase H2和DNA聚合酶技术，自主设计相关基因分型的引物和探针序列，进一步提供了一种针对叶酸代谢基因进行基因分型的方法，可以更灵敏方便地对样本进行检测。
本发明提供了一种针对叶酸代谢基因进行基因分型的方法，包括以下步骤：
(1)样本提取：提取血液或是唾液中的基因组DNA；
(2)PCR扩增检测：以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用以下试剂盒进行PCR扩增：
所述试剂盒包括包含MTHFR 677位点多态性的序列SEQ ID NO.1、包含MTHFR 1298位点多态性的序列SEQ ID NO.2和包含MTRR 66位点多态性的序列SEQ ID NO.3的核酸序列；检测MTHFR 677位点、MTHFR 1298位点以及MTRR 66位点的核酸序列SEQ ID NO.4～SEQID NO.12的引物组合；针对MTHFR 677位点、MTHFR 1298位点以及MTRR 66位点的序列SEQID NO.13～SEQ ID NO.15的探针，所述序列SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.15的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；包括RNase H2和热启动Taq DNA聚合酶的酶混合液，所述RNase H2酶与Taq DNA聚合酶浓度比为1:50～1:500；以及PCR缓冲液、dNTPs；
(3)基因型判定：根据各荧光通道的信号值来判断是否有扩增，有扩增就代表该荧光通道对应的检测位点为阳性，没有扩增，就说明该通道对应的检测位点不存在于基因组中，分型时就排除该位点。
优选的，所述试剂盒包括如下试剂：
(1)PCR反应预混液1：主要成分包括：PCR缓冲液、4×dNTPs、SEQ ID NO.13～SEQID NO.15所示探针序列及人源性内标探针、由SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10以及SEQ ID NO.11混合而成的引物组、内标引物；
(2)PCR反应预混液2：主要成分包括：PCR缓冲液、4×dNTPs、SEQ ID NO.13～SEQID NO.15所示探针序列及人源性内标探针、由SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10以及SEQ ID NO.12混合而成的引物组、内标引物；
(3)酶混合液：主要成分包括：RNase H2和热启动Taq DNA聚合酶，所述RNase H2酶与Taq DNA聚合酶浓度比为1:50～1:500；
(4)阴性质控品：去离子水溶液；
(5)阳性质控品1：为MTHFR 677位点为C碱基的核酸序列、MTHFR 1298位点为A碱基的核酸序列以及MTRR 66位点为A碱基的核酸序列三种混合而成；
(6)阳性质控品2：为MTHFR 677位点为T碱基的核酸序列、MTHFR 1298位点为C碱基的核酸序列以及MTRR 66位点为G碱基的核酸序列三种混合而成；
其中，PCR扩增检测过程包括：每个样本做两个反应孔，将PCR反应预混液1和PCR反应预混液2分别加入不同的反应孔中，然后加入相同的模板和酶混合液，每个样本做一个阴性对照孔和一个阳性对照孔，PCR反应预混液1中加入阳性质控品1作为阳性对照，PCR反应预混液2中加入阳性质控品2作为阳性对照，PCR反应预混液1中加入阴性质控品作为阴性对照，PCR反应预混液2中加入阴性质控品作为阴性对照；PCR扩增反应条件为：95℃预变性5分钟，然后95℃变性10秒，60℃退火延伸31秒，共35循环，收集荧光在退火延伸阶段。
更加优选的，所述酶混合液中，RNase H2酶与Taq DNA聚合酶浓度比为1:200。
更加优选的，所述SEQ ID NO.13探针5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述SEQ ID NO.14探针5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述SEQ ID NO.15探针5’端标记有ROX荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1。
更加优选的，所述引物序列SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12的3'端连接有间隔臂。
本发明的有益效果是：本发明开发了一种针对叶酸代谢基因进行基因分型的方法，运用了双相酶系统RNase H2和DNA聚合酶技术，设计能够对MTHFR基因677位点C/T、1298位点A/C、MTRR基因66位点A/G进行有效分型的引物探针，平衡所有引物探针之间的Tm值，实现了一管法同时检测三个位点的多态性，采用荧光PCR，封闭式检测，减少了后期污染的可能性，另外，相比PCR反向点杂交法，检测效率上也有明显提高。
附图说明
图1所示为MTHFR 677位点为C碱基时的扩增曲线；
图2所示为MTHFR 1298位点为A碱基时的扩增曲线；
图3所示为MTRR 66位点为A碱基时的扩增曲线；
图4所示为MTHFR 677位点为C、1298位点为A碱基时的扩增曲线；
图5所示为MTHFR 677位点为C、1298位点为A、MTRR 66位点为A碱基时的扩增曲线；
图6所示为MTHFR 677位点为T碱基时的扩增曲线；
图7所示为MTHFR 1298位点为C碱基时的扩增曲线；
图8所示为MTRR 66位点为G碱基时的扩增曲线；
图9所示为MTHFR 677位点为T、1298位点为C碱基时的扩增曲线；
图10所示为MTHFR 677位点为T、1298位点为C、MTRR 66位点为G碱基时的扩增曲线；
图11所示为MTHFR 677位点为C、1298位点为A、MTRR 66位点为G碱基的样本的扩增曲线；
图12所示为MTHFR 677位点为C、1298位点为A、MTRR 66位点为G碱基的样本的扩增曲线。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明提供的一种针对叶酸代谢基因进行基因分型的方法予以进一步说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
实施例一
本实施例设计了叶酸代谢基因分型引物探针，以MTHFR基因677位点的SEQ IDNO.1所示序列为模板设计针对677位点C/T的多态性检测的特异性引物，以MTHFR基因1298位点的SEQ ID NO.2所示序列为模板设计针对1298位点A/C的多态性检测的特异性引物，以MTRR基因66位点的SEQ ID NO.3所示序列为模板设计针对677位点A/G的多态性检测的特异性引物。具体序列如下：
5'-CTCCTGACTGTCATCCCTATTG-3'，序列如SEQ ID NO.4所示；
5'-AAGCTGCGTGATGATGAAATCGgCTCC-x，序列如SEQ ID NO.5所示；
5'-AAGCTGCGTGATGATGAAATCGaCTCC-x，序列如SEQ ID NO.6所示；
5'-ATGTCCACAGCATGGAGG-3'，序列如SEQ ID NO.7所示；
5'-GAGGAGCTGACCAGTGAAGaAAGT-x，序列如SEQ ID NO.8所示；
5'-GAGGAGCTGACCAGTGAAGcAAGT-x，序列如SEQ ID NO.9所示；
5'-GCCTTGAAGTGATGAGGAG-3'，序列如SEQ ID NO.10所示；
5'-CCATGTACCACAGCTTGCTCACAuATTTC-x，序列如SEQ ID NO.11所示；
5'-CCATGTACCACAGCTTGCTCACAcATTTC-x，序列如SEQ ID NO.12所示；
FAM-ACACCTTCTCCTTCAAGTGCTTCAG-BHQ1，序列如SEQ ID NO.13所示；
VIC-ACCTCTCGGGAGAACCAAACC-BHQ1，序列如SEQ ID NO.14所示；
ROX-ATGGCCTTTGCCTGTCCCTG-BHQ1，序列如SEQ ID NO.15所示；
上述引物与普通引物不同的是，本发明专利由于采用的是双酶系统扩增法，即RNase H2和Taq DNA聚合酶双酶系统，因此，在普通引物的基础上有所改变，即在引物的3'端SNP位置是一个RNA碱基代替了DNA碱基，这样RNase H2才能发挥作用。考虑到一管法同时检测三个位点的多态性，因此，设计引物探针时要平衡所有引物探针之间的Tm值，尽量保持一致才能均衡扩增，本发明专利经过对序列的分析和引物探针的优化设计，最终筛选出了本发明专利所示的一组能够对MTHFR基因677位点C/T、1298位点A/C、MTRR基因66位点A/G进行有效分型的引物探针。为了保证检测系统的可靠性，本发明专利还引入了内源性的对照引物和探针，内对照引物探针取自通用的大众熟悉的内对照系统，本发明不再详述。
需要说明的是，本发明采用的探针是共用探针系统，即同一个SNP位点的检测只用一个探针。
实施例二
本实施例制备了一种叶酸代谢基因分型试剂盒。
由于SNP位点采用的是同一个探针不同特异性引物，因此，同一个SNP位点不能在同一个反应孔中进行检测，否则区分不开。所以本发明将这三个SNP位点的检测分成两组，每组只检测每一个SNP位点的一个多态性，试剂盒具体设计如下：
PCR反应预混液1：将SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.10以及SEQ ID NO.11所示的引物组合在一起，其中，SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7、SEQID NO.10引物浓度为0.25μM；SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11引物浓度为0.1μM。探针SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.15所示序列组合在一起，探针浓度均为0.1μM。及加入通用人源性内标探针、内标引物、dNTPs以及PCR缓冲液等配制而成；
PCR反应预混液2：将SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQID NO.10以及SEQ ID NO.12所示的引物组合在一起，其中，SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7、SEQID NO.10引物浓度为0.25μM；SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12引物浓度为0.1μM。探针SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.15所示序列组合在一起，探针浓度均为0.1μM。及加入通用人源性内标探针、内标引物、dNTPs以及PCR缓冲液等配制而成；
所述通用人源性内标探针序列为：5’-GCAAGGTGAACGTGGATGAAG-3’，探针5’端标记有Cy5荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1，浓度为0.1μM。
所述内标引物序列为：5’-CTGAGGAGAAGTCTGCCGTTAC-3’和SEQ ID NO.8：5’-CACATGCCCAGTTTCTATT GG-3’，浓度均为0.1μM。
酶混合液成分：主要成分由RNase H2和热启动Taq DNA聚合酶混合而成，所述RNase H2酶与Taq DNA聚合酶浓度比为1:200；所述Taq DNA聚合酶浓度为0.4U。
阴性质控品：即去离子水溶液；
阳性质控品1：为MTHFR 677位点为C碱基的核酸序列、MTHFR 1298位点为A碱基的核酸序列以及MTRR 66位点为A碱基的核酸序列三种混合而成；
阳性质控品2：为MTHFR 677位点为T碱基的核酸序列、MTHFR 1298位点为C碱基的核酸序列以及MTRR 66位点为G碱基的核酸序列三种混合而成；
由上述六种试剂按照不同规格包装成不同大小的试剂盒。
实施例三
本实施例采用实施例二制备得到的叶酸代谢基因分型试剂盒检测样本，具体检测步骤如下。
(1)提取基因组DNA模板：采用通用试剂盒提取血液或是唾液中的基因组DNA。
(2)PCR扩增检测：以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用本发明提供的试剂盒进行相应的扩增检测。
每个标本做两个反应孔，将PCR反应预混液1和PCR反应预混液21μl分别取加入不同的反应孔中，然后加入2μl相同的模板和2μl酶混合液，同时做一个阴性对照孔和一个阳性对照孔，PCR反应预混液1中加入阳性质控品1作为该反应体系的阳性对照，PCR反应预混液2中加入阳性质控品2作为该反应体系的阳性对照，PCR反应预混液1中加入阴性质控品作为该反应体系的阴性对照，PCR反应预混液2中加入阴性质控品作为该反应体系的阴性对照。
PCR反应条件为95℃预变性5分钟，然后95℃变性10秒，60℃退火延伸31秒，共35循环，收集荧光在退火延伸阶段。
(3)基因型判定：根据各荧光通道的信号值来判断是否有扩增，有扩增就代表该荧光通道对应的检测位点为阳性，没有扩增，就说明该通道对应的检测位点不存在于基因组中，分型时就排除该位点。
图1所示为MTHFR 677位点为C碱基样本的扩增曲线；图2所示为MTHFR1298位点为A碱基样本的扩增曲线；图3所示为MTRR 66位点为A碱基样本的扩增曲线；图4所示为MTHFR677位点为C、1298位点为A碱基样本的扩增曲线；图5所示为MTHFR 677位点为C、1298位点为A、MTRR 66位点为A碱基样本的扩增曲线；图6所示为MTHFR 677位点为T碱基样本的扩增曲线；图7所示为MTHFR 1298位点为C碱基样本的扩增曲线；图8所示为MTRR 66位点为G碱基样本的扩增曲线；图9所示为MTHFR 677位点为T、1298位点为C碱基样本的扩增曲线；图10所示为MTHFR 677位点为T、1298位点为C、MTRR 66位点为G碱基样本的扩增曲线。
将叶酸代谢基因分型试剂盒用于某唾液样本的检测，采用通用试剂盒提取唾液样本中的基因组DNA，按上述方法步骤进行检测，检测所得扩增曲线如附图11和附图12所示，图11和图12显示该样本MTHFR 677位点为C、1298位点为A、MTRR 66位点为G，试剂盒检测结果与测序结果一致。
进一步的，对两百人的血液样本及唾液样本提取的基因组DNA采用试剂盒进行基因分型，分型成功率达到100％，且分型结果与随机挑选出来的100个样本的测序结果相符率达100％。本发明提供的针对叶酸代谢基因进行基因分型的方法能够快速、准确的针对叶酸代谢基因进行检测，且检测准确度和检测效率高，对于临床上大规模人群体内的叶酸水平筛查和居民每日叶酸的摄入量的补充具有重要的指导意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种针对叶酸代谢基因进行基因分型的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)样本提取：提取血液或是唾液中的基因组DNA；
(2)PCR扩增检测：以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用以下试剂盒进行PCR扩增：
所述试剂盒包括包含MTHFR 677位点多态性的序列SEQ ID NO.1、包含MTHFR 1298位点多态性的序列SEQ ID NO.2和包含MTRR 66位点多态性的序列SEQ ID NO.3的核酸序列；检测MTHFR 677位点、MTHFR 1298位点以及MTRR 66位点的核酸序列SEQ ID NO.4～SEQ IDNO.12的引物组合；针对MTHFR 677位点、MTHFR 1298位点以及MTRR 66位点的序列SEQ IDNO.13～SEQ ID NO.15的探针，所述序列SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.15的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；包括RNase H2和热启动Taq DNA聚合酶的酶混合液，所述RNaseH2酶与Taq DNA聚合酶浓度比为1:50～1:500；以及PCR缓冲液、dNTPs；
(3)基因型判定：根据各荧光通道的信号值来判断是否有扩增，有扩增就代表该荧光通道对应的检测位点为阳性，没有扩增，就说明该通道对应的检测位点不存在于基因组中，分型时就排除该位点。
2.如权利要求1所述的针对叶酸代谢基因进行基因分型的方法，其特征在于：所述试剂盒包括如下试剂：
(1)PCR反应预混液1：主要成分包括：PCR缓冲液、4×dNTPs、SEQ ID NO.13～SEQ IDNO.15所示探针序列及人源性内标探针、由SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQID NO.8、SEQ ID NO.10以及SEQ ID NO.11混合而成的引物组、内标引物；
(2)PCR反应预混液2：主要成分包括：PCR缓冲液、4×dNTPs、SEQ ID NO.13～SEQ IDNO.15所示探针序列及人源性内标探针、由SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQID NO.9、SEQ ID NO.10以及SEQ ID NO.12混合而成的引物组、内标引物；
(3)酶混合液：主要成分包括：RNase H2和热启动Taq DNA聚合酶，所述RNase H2酶与Taq DNA聚合酶浓度比为1:50～1:500；
(4)阴性质控品：去离子水溶液；
(5)阳性质控品1：为MTHFR 677位点为C碱基的核酸序列、MTHFR 1298位点为A碱基的核酸序列以及MTRR 66位点为A碱基的核酸序列三种混合而成；
(6)阳性质控品2：为MTHFR 677位点为T碱基的核酸序列、MTHFR 1298位点为C碱基的核酸序列以及MTRR 66位点为G碱基的核酸序列三种混合而成；
其中，PCR扩增检测过程包括：每个样本做两个反应孔，将PCR反应预混液1和PCR反应预混液2分别加入不同的反应孔中，然后加入相同的模板和酶混合液，每个样本做一个阴性对照孔和一个阳性对照孔，PCR反应预混液1中加入阳性质控品1作为阳性对照，PCR反应预混液2中加入阳性质控品2作为阳性对照，PCR反应预混液1中加入阴性质控品作为阴性对照，PCR反应预混液2中加入阴性质控品作为阴性对照；PCR扩增反应条件为：95℃预变性5分钟，然后95℃变性10秒，60℃退火延伸31秒，共35循环，收集荧光在退火延伸阶段。
3.如权利要求2所述的针对叶酸代谢基因进行基因分型的方法，其特征在于：所述酶混合液中，RNase H2酶与Taq DNA聚合酶浓度比为1:200。
4.如权利要求2所述的针对叶酸代谢基因进行基因分型的方法，其特征在于：所述SEQID NO.13探针5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述SEQ ID NO.14探针5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1；所述SEQ ID NO.15探针5’端标记有ROX荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1。
5.如权利要求2所述的针对叶酸代谢基因进行基因分型的方法，其特征在于：所述引物序列SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12的3'端连接有间隔臂。
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