CN103608466A

CN103608466A - 非侵入性产前亲子鉴定方法

Info

Publication number: CN103608466A
Application number: CN201180068305.0A
Authority: CN
Inventors: A·瑞安; S·斯古约恩松; M·班杰维齐; G·杰梅罗斯; M·希尔; J·班尼; M·罗比诺威特茨; Z·德姆科
Original assignee: Gene Security Network Inc
Current assignee: Natera Inc
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2011-12-22
Publication date: 2014-02-26
Anticipated expiration: 2031-12-22
Also published as: US20130261004A1; WO2012088456A2; AU2011348100A1; JP6328934B2; EP2656263B1; RU2013133413A; EP2656263A4; BR112013016193B1; US20190194743A1; EP2656263A2; ES2770342T3; CA2821906C; WO2012088456A3; US10774380B2; RU2620959C2; US20190256907A1; CA2821906A1; US20120122701A1; US10590482B2; AU2011348100B2

Abstract

本发明公开了用于非侵入性产前亲子鉴定的方法。本方法使用来自怀孕母亲血浆的基因测定结果，以及疑父的基因测定结果，和母亲的基因测定结果，来确定疑父是否是胎儿的生父。该方法是通过一种信息学的方式来实现的，所述信息学方式是基于一种能够将母亲血浆中发现的胎儿DNA的遗传指纹与疑父的遗传指纹进行对比的方法。

Description

非侵入性产前亲子鉴定方法

相关申请的交叉引用

本专利要求2010年12月22日提交的美国临时专利申请61/426,208的优先权；且本申请是2011年11月18日提交的美国发明专利申请13/300,235的部分后续申请，该申请要求了2011年6月23日提交的美国临时专利申请61/571,248的优先权；要求2011年10月3日提交的美国临时申请No.61/542,508的优先权；且本申请是2011年5月18日提交的美国发明专利申请No.13/110,685的部分后续申请，该申请要求了2010年5月18日提交的美国临时专利申请No.61/395,850的优先权；要求2010年6月21日提交的美国临时申请No.61/398,159的优先权；要求2011年2月9日提交的美国临时申请No.61/462,972的优先权；要求2011年3月2日提交的美国临时申请No.61/448,547的优先权；以及要求2011年4月12日提交的美国临时申请No.61/516,996的优先权。并且通过引用上述专利整体并入本文。

技术领域

本发明通常涉及非侵入性产前亲子鉴定的方法。

背景技术

不明确的亲子关系是一个重要问题，并且确定了大约有4％到10％范围否认儿童所认为的生父并非是其真正的生父。如果妇女怀孕，但不确定相关个体中谁是胎儿的生父，能够通过几种方法可以确定胎儿的生父。一种方法是等胎儿出生后，将胎儿的基因组基因遗传图谱与可能的生父人选的基因遗传图谱比较。然而，胎儿的母亲经常希望在产前确定胎儿的生父，另一种方法是在妊娠早期对绒毛膜绒毛取样，或者在妊娠中期做羊膜穿刺，在产前取得遗传资料做基因图谱比较。然而，这些方法是侵入性的，带有很大的流产风险。

近期发现胎儿的无细胞DNA(cfDNA)和完整胎儿细胞可进入母体参与血液循环，因此，分析这部分胎儿遗传物质，能够较早的进行非侵入性产前基因诊断(NIPGD或NPD)。使用胎儿细胞进行NIPGD的关键挑战在于，如何实现鉴定及从母亲血液中提取胎儿细胞。在母亲血液中胎儿细胞的浓度取决于怀孕阶段及胎儿情况。预计每毫升母亲血液中有约1到40个胎儿细胞，或每100,000个母亲有核细胞中有不到1个胎儿细胞。虽然很难将胎儿细胞富集至纯的任意量，但是现今技术已经可以从母亲血液中分离少量胎儿细胞。在这其中，比较高效的技术包括单克隆抗体技术，其他曾用于分离胎儿细胞的技术包括密度梯度离心法，成人红细胞选择性细胞溶解法及FACS。使用cfDNA进行NIPGD的关键挑战还在于，这些胎儿cfDNA与母亲cfDNA混在一起，因此需要说明母亲基因型信号成为cfDNA分析的阻碍。胎儿DNA分析曾使用依据特异于父亲遗传基因的杂交序列的所设计的引物进行PCR扩增实现。这些胎儿遗传物质资源为非侵入性产前诊断技术打开了大门。

一旦胎儿DNA被分离，不论是纯化的还是混合物，都可以被扩增。有很多种全基因组扩增方法：连接介导PCR(LM-PCR)，简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)，多重置换扩增(MDA)。有多种可用于定向扩增的方法，包括PCR，如分子反向探针(MIPs)的环形探针(circularizing probes)，及锁式探针。还有其他的很多优先富集胎儿DNA的方法，如颗粒离析及混合捕获探针。

在此情况下，使用DNA扩增仍存在不少困难，单个细胞DNA扩增，源于少量细胞或少量DNA的DNA扩增，使用PCR可能会完全失败。这常会归因于在扩增反应中的DNA的污染，细胞损失，其DNA或可得的DNA，其他的可能造成错误有，胎儿DNA扩增及微列阵分析，包括因为DNA聚合酶导致的转录错误，尤其是在PCR中核苷酸不正确的复制。还有由于因有缺陷的杂交造成的微列阵读取错误。其他问题还有由于杂合细胞中2个等位基因中的1个等位基因扩增失败导致的等位基因丢失(ADO)。

存在很多提供基因分型数据的技术，包括以下几种例子，TAQMAN是通过LIFE TECHNOLOGY生产及分布的独立基因分型技术。TAQMAN使用聚合酶链式反应(PCR)来扩增目的序列。AFFYMETRIX公司的500K ARRAYS及ILLUMINA公司INFINIUM是同时大量定位DNA特异性序列测定的基因分型分析系统。ILLUMINA公司的HISEQ和MISEQ，及LIFETECHNOLOGY公司的ION TORRENT和SOLID平台可对大量个体DNA序列直接测序。

发明概要

本发明是对孕期胎儿的非侵入性亲子鉴定方法。根据本发明的部分阐述，在一个实施方式中，确定怀孕的母亲孕育的胎儿的疑父是否是其生父的方法包括，从疑父身体中提取遗传物质，从怀孕母亲体内取得血液样本。对疑父的遗传物质在多个多态性位点做基因型测量，对从怀孕母亲体内获得的遗传物质在多个多态性位点做基因型测量。对从怀孕母亲体内取得的血液样本中的DNA混合样本做基因型测量，该DNA混合样本中含有胎儿DNA及其母亲DNA，判定时，在电脑上，用疑父的DNA基因型测量值，怀孕母亲的基因型测量值及DNA混合样本的基因型测量值，使用判定的该疑父是胎儿生父的概率，确定该疑父是否是胎儿的生父。

在一个实施方式中，多态性位点包括单核苷酸多态性。在一个实施方式中，DNA混合样本包括源于怀孕母亲血液样本的血浆成分中自由浮动的DNA。在一个实施方式中，DNA混合样本包括母亲全血或母亲血液中含有核细胞的一部分。在一个实施方式中，母亲血液中含有核细胞的部分已经胎儿源细胞富集。

在一个实施方式中，确定疑父是否是亲生父亲包括计算疑父和胎儿的检验统计量，其中检验统计量显示疑父和胎儿一定程度的遗传相似性，并且其中所述检验统计量是基于疑父DNA基因型测量值，DNA混合样本的基因型测量值，怀孕母亲的DNA基因型测量值。计算多个与胎儿遗传无亲属关系的个体的检验统计量的分布，其中每一个计算的检验统计量显示多个与胎儿无亲属关系的个体中的一个无亲属关系的个体与胎儿的基因相似性水平，其中，该检验统计量基于无亲属关系的个体的DNA基因型测量结果，DNA混合样本基因型测量结果，怀孕母亲的的DNA基因型测量结果。计算概率，针对疑父和胎儿进行计算的检验统计量是针对多个无亲属关系的个体和胎儿进行计算的检验统计量分布的一部分，并且使用作为对多个无亲属关系的个体和胎儿进行计算的检验统计量分布的一部分的针对疑父进行计算的检验统计量，来确定疑父是胎儿生父的概率通过。在一个实施方式中，确定疑父是否为胎儿生父也包括：当所述疑父是所述胎儿生父的概率高于一个阈值上限时，排除所述疑父与所述胎儿无亲属关系的系的假设，确任该疑父是所述胎儿生父，或者，当所述疑父是所述胎儿生父的概率低于一个阈值下限时，不排除所述疑父与所述胎儿无亲属关系的系的假设，确任该疑父不是所述胎儿生父，或当该似然性在所述阈值下限和阈值上限之间，或足够确认似然性不确定时，不能确任该疑父是否是所述胎儿生父。

在一个实施方式中，确定所述疑父是所述胎儿生父的概率包括：获取多个多态性位点的每一个位点的等位基因的群体频率，创建一个DNA混合样本中胎儿DNA可能组分的分区，该分区的范围是从胎儿组分下限到胎儿组分上线，根据母亲的DNA基因型测量结果，疑父的DNA基因型测量结果，DNA混合样本基因型测量结果，在该分区中的每一个可能胎儿组分，计算出该疑父是该胎儿生父的一个概率，通过结合计算的该分区中的每一个可能胎儿组分的该疑父是该胎儿生父的概率，计算出所述疑父是所述胎儿生父的概率。根据母亲的DNA基因型测量结果，DNA混合样本基因型测量结果，获取的等位基因群体频率，在该分区中的每一个可能胎儿组分，计算出该疑父不是该胎儿生父的一个概率，通过结合计算的该分区中的每一个可能胎儿组分的该疑父不是该胎儿生父的概率，计算出所述疑父不是所述胎儿生父的概率。

在一个实施方式中，疑父是胎儿生父的概率计算及疑父不是胎儿生父概率的计算可以还包括：使用平台响应模型，计算多个多态性位点的每一个位点观测到的序列数据的似然性，计算可能的胎儿组分的分区中一个或多个组分，计算母亲的多个等位基因比，疑父的多个等位基因比，以及胎儿的多个等位基因比，通过结合以下内容在每一个多态性位点观测到的序列数据的似然性，计算该疑父是该胎儿生父的似然性：该分区中所有胎儿组分，该组多态性位点中母亲等位基因比，该组多态性位点中疑父等位基因比，以及该组多态性位点中胎儿等位基因比；通过结合以下内容在每一个多态性位点观测到的序列数据的似然性，计算该疑父不是该胎儿生父的似然性，该分区中所有胎儿组分，该组多态性位点中母亲等位基因比，该组多态性位点中群体频率等位基因比，以及该组多态性位点中胎儿等位基因比。基于该疑父是生父的似然性来计算该疑父是生父的概率，以及基于该疑父不是生父的似然性来计算疑父不是生父的概率。

在一个实施方式中，根据疑父是胎儿生父的似然性，通过使用最大似然估计法或最大后验概率技术，计算疑父是胎儿生父的概率。在一个实施方式中，确认一个疑父是一个胎儿生父还可能包括：如果计算的该疑父是胎儿生父的概率明显高于计算的该疑父不是胎儿生父的概率，则确认该疑父是胎儿的生父，或者如果疑父不是胎儿的生父的计算概率明显高于疑父是胎儿生父的计算概率，则确定疑父不是胎儿的生父，。在一个实施方式中，多态性位点相当于具有高似然性二体生物的染色体。

在一个实施方式中，胎儿DNA可能的组分分区只包含一个胎儿组分，胎儿组分由下列技术所决定，定量PCR，数字PCR，定向PCR，环形探针，其他DNA扩增方法，由杂交探针捕获，其他的优先富集方法，SNP芯片，DNA微列阵，测序，其他测量多态性等位基因的技术，其他测量非多态性等位基因的技术，测量出现在该父亲基因组中但未出现在该母亲基因组中的多态性等位基因，测量出现在该父亲基因组中但未出现在该母亲基因组中的非多态性等位基因，测量特异于Y染色体的等位基因，对比父系遗传的等位基因和母系遗传的等位基因测得的数据，最大似然估计法，最大后验法及其组合。在一个实施方式中，权利要求1所述的方法，其中可能的胎儿组分分区只含有一个胎儿组分，并且胎儿组分是由权利要求26所述的方法确定的。

在一个实施方式中，该疑父的遗传物质是从选自以下物质组成的组中的一种组织中获得的：血液，体细胞组织，精子，头发，口腔样本，皮肤，其他法医样本及其组合。在一个实施方式中，置信度被计算机计算用于确定疑父是否是胎儿的生父。在一个实施方式中，DNA混合样本中胎儿DNA的部分被选自以下方法组成的组中的一种方法富集：尺寸筛选，通用的连接介导PCR，短期延长时间PCR，其他富集方法及其组合。

在一个实施方式中，获取怀孕母亲的遗传物质的基因型测量值包括，对从怀孕母亲那里获得的基本由母亲遗传物质组成的样本做基因型测量。在一个实施方式中，获取从怀孕母亲的遗传物质的基因型测量值包括，对含怀孕母亲的遗传物质的DNA混合样本做基因型测量，进而推导其基因型测量值。并且，使用这些从母亲遗传物质推导得到的的基因型测量值作为获得的基因型测量值。在一个实施方式中，方法还包括基于确定的亲子测定而做的临床决策。在一个实施方式中，该临床决策是终止妊娠。

在一个实施方式中，使用选自以下组中的方法或技术对遗传物质做基因型测量，包括：锁式探针，分子反向探针，其他环形探针，基因型微阵列，SNP基因型分析，芯片微阵列，微珠微阵列，其他SNP微阵列，其他基因分型方法，Sanger DNA测序，焦磷酸测序，高通量测序，使用环形探针定向测序，使用杂交探针捕获定向测序，可逆染料终止子测序，连接测序，杂交测序，其他DNA测序方法，其他高通量基因分型平台，荧光原位杂交法(FISH)，比较基因组杂交法(CGH)，CGH列阵，以及其倍增和组合。

在一个实施方式中，对事先扩增和/或优先富集的遗传物质进行基因型测量，使用选自以下组中的方法或技术做扩增和/或优先富集，包括：聚合酶链式反应(PCR)，连接介导PCR，简并寡核苷酸引物PCR，定向扩增PCR，mini-PCR，通用PCR扩增，多重置换扩增(MDA)，等位基因特异性PCR，等位基因特异性扩增技术，线性扩增法，在一种扩增方法之后的底物DNA连接，桥式扩增，锁式探针，环形探针，杂交探针捕获，及其组合。

在一个实施方式中，方法还包括生成含有确定的胎儿亲子关系的报告。在一个实施方式中，本发明包括使用在本文中描述的方法形成的揭示确定的胎儿亲子关系的报告。

在此公开的DNA组分测定方法，其目标个体DNA来源于含有目标个体DNA和至少一个其他个体DNA的DNA混合物。根据本文所示的方面，在一个实施方式中，在一个目标个体DNA来源于含有目标个体DNA和一个第二个体DNA的DNA混合物的情况下，DNA组分的测定方法包括测定DNA混合样本的多个多态性位点的基因型，获取该第二个体的该多个多态性位点基因型数据，使用DNA混合样本的基因型测量值，第二个体的基因型数据和概率估计技术，在计算机上确定混合样本中目标个体DNA组分。

在一个实施方式中，获取第二个体的基因型数据包括，对基本上由第二个体DNA组成的DNA进行基因型测量。在一个实施方式中，获取第二个体的基因型数据包括，从可能是由于来源于第二个体的遗传物质的DNA混合样本的基因型测量值推断基因型测量值，和使用由于来源于第二个体的遗传物质的DNA混合样本的基因型测量值推断的这些基因型测量值，作为获取的基因型测量值。

在一个实施方式中，推断相关个体的基因型数据还可能包括在位点上使用等位基因群体概率。在一个实施方式中，目标个体DNA组分是以DNA组分概率表示的。在一个实施方式中，混合样本基因型测量值包括对混合样本DNA测序获得基因型测量值。在一个实施方式中，混合样本中的DNA是预先在多数多态性位点优先富集的，以用来做混合样本DNA基因型测量。在一个实施方式中，所述多态性位点包括单核苷酸多态性。

在一个实施方式中，确定组分可能还包括，确定混合样本DNA中目标个体的多个DNA组分的概率，通过从该多个组分中选择最大概率的那个组分确定该组分。在一个实施方式中，确定该组分还包括，确定混合样本DNA中目标个体的多个DNA的组分，使用最大似然估计技术，来确定其最可能的组分，并且，通过选择确定的最可能的组分来确定该组分。

在一个实施方式中，该目标个体是怀孕母亲孕育的胎儿，该第二个体是该怀孕母亲。在一个实施方式中，方法还包括使用有关在多态性位点测量基因型数据的平台模型，使用与母亲基因型到子基因型相关的表格。在一个实施方式中，测定还使用测量胎儿父亲的DNA多个多态性位点的基因型测量值。在一个实施方式中，方法没有使用胎儿父亲的基因型数据。在一个实施方式中，方法没有使用Y染色体上的位点。在一个实施方式中，本发明还包括一个揭示确定的亲子关系的报告，亲子关系是使用在此文中描述的，确定母亲血浆中胎儿DNA组分的方法确定的。在一个实施方式中，本发明可能包括一个揭示胎儿倍性状态的报告，使用在此文中描述的，确定母亲血浆中胎儿DNA组分的方法来确定胎儿倍性状态。

附图说明

本发明公开的实施方式将参考附图进一步解释，其中相同的结构用相同的数字表示，附图中示出的不一定是按比例绘制，而是把重点放在举例说明本发明所揭示的实施例的原理上。

图1显示在母亲血浆中的测量的两个亲本背景等位基因强度的分布

图2显示200个无亲属关系的男性与生父的亲子相关性测定统计分布

图3显示2个200个无亲属关系的男性与生父的强度比的分布，每个图表对应于不同的输入通道

图4显示在3种情况下，胎儿基因型测量值和亲本基因型测量值之间的相关比的累积分布频率(cdf)曲线，

图5显示在3种情况下，胎儿基因型测量值和亲本基因型测量值之间的相关率柱状图

图6显示对比于一个理想化的统计数为800个无亲属关系的男性的高斯分布，35个样本的亲子鉴定统计柱状图

图7显示一个揭示排除亲子关系报告的实施例

图8显示一个揭示含有亲子关系报告的实施例

图9显示一个揭示不确定亲子关系报告的实施例

以上确定的图阐明目前公开的实施方式，如说明书中所述，其他实施例也涵盖于本发明中。这里揭示的内容提供了示例性的实施例，应了解其是作为示例性而非限制性的实施例。由本领域的技术人员所做的许多修改和实施例可以在本发明所揭示的实施例的原理和范围内实施。

具体实施方式

根据这里阐述的方面，这里提供了一种用于确定疑父是否是孕妇所怀胎儿的生理学父亲的方法。在一个实施方案中，所述方法包括从疑父那里获得遗传物质，并从孕妇中获得血液样本。在一个实施方案中，所述方法可以包括对疑父和孕妇进行遗传测量，并对孕妇血浆中发现的自由浮动的DNA(ffDNA，即，cfDNA)进行遗传测量。在一个实施方案中，所述方法包括获得胎儿母亲和疑父的单核苷酸多态性(SNPs)的遗传数据；对混合样本的单核苷酸多态性(SNPs)组进行遗传测量，所述混合样本包括来自目标个体的DNA和来自目标个体母亲的DNA。在一个实施方案中，所述方法可以包括在电脑上使用遗传测量结果确定疑父是母亲所怀的胎儿的生物学父亲的概率。在一个实施方案中，所述方法可以包括如果疑父是胎儿的生理学父亲时，使用孕妇和所宣称父亲的遗传数据确定胎儿/母亲DNA混合物遗传测量的可预计的等位基因分布。在一个实施方案中，所述方法可以包括如果疑父不是胎儿的生理学父亲时，使用孕妇的遗传数据和多个已知不是父亲的个体的遗传数据确定胎儿/母亲DNA混合物遗传数据的可预计的等位基因分布。在一个实施方案中，所述方法可以包括根据预计的等位基因分布和实际母亲血浆DNA测量结果计算疑父是胎儿的生理学父亲的概率。在一个实施方案中，本发明概括了一系列步骤将孕妇和所宣称父亲的遗传物质进行转化，并且以一种非侵入的方式产生并确定被孕育的胎儿的生理学父亲的正确的亲子一致性。在一个实施方案中，确定疑父是生理学父亲的似然性包括，当所述父亲被排除在使用多个没有血缘关系的个体产生的等位基因分布范围的似然性大于某个阈值时，声称或者确定疑父是生理学父亲。在一个实施方案中，确定疑父是生理学父亲的似然性包括，当所述父亲被排除在使用多个没有血缘关系的个体产生的等位基因分布范围的似然性小于某个阈值时，声称或者确定疑父不是生理学父亲。在一个实施方案中，通过最初假定疑父事实上就是胎儿的父亲来进行父子关系判断；如果疑父是不正确的，胎儿的基因型与预言不匹配，则最初假定被认为是错误的；但是，如果胎儿的基因型与所预计的匹配，则该假定被认为是正确的。因此，亲子鉴定考虑的是所观察到的ffDNA与通过疑父基因型预计出来的胎儿的基因型到底有多匹配。在一个实施方案中，通过进行电子或者物理报告开始确定父子关系。

在一个实施方案中，使用在母亲血液中发现的自由浮动的DNA(ffDNA)的遗传测量结果和来自母亲和疑父的基因型新型进行父子关系确定。可以使用多种平台，例如单核苷酸多态性(SNP)微阵列、非靶向的高通量测序或者靶向测序，进行通用的方法测定ffDNA。这里描述的方法解决了一个问题，即自由浮动的胎儿DNA在母亲血浆中以低的但是未知的浓度存在，并且很难测定到。所述亲子鉴定可以包括评价ffDNA测量结果以及疑父根据其基因型可能产生什么样的ffDNA。与测量平台无亲属关系的，该鉴定可能根据在多态性位点测得的基因型。在一些实施方案中，在每个多态性位点的可能的等位基因被概括为A和B，以及可选择的，C、D和/或E等等。

在一个实施方案中，本方法包括使用来自多个位点的等位基因测量数据。在一个实施方案中，所述位点是多态的。在一个实施方案中，所述位点中的一些或者大多数是多态的。在一个实施方案中，所述多态性位点是单核苷酸多态性(SNPs)。在一个实施方案中，所述位点中的一些或者大多数是杂合体。在一个实施方案中，不需要在鉴定之前确定那个位点是杂合体。

在一个实施方案中，这里公开的方法使用选择性的富集技术，这种技术保留存在于一组多态性位点的每个多态性位点上DNA原始样本中的相对等位基因频率。在一些实施方案中，所述扩增和/或选择性富集方法可以包括PCR技术，例如微PCR或者连接调节的PCR，通过杂交捕获的片段、或者回形探针，例如分子逆向探针。在一些实施方案中，用于扩增或者选择性富集的方法可以包括使用PCR引物或者其他探针，当与目标序列正确杂交时，核苷酸探针的3-引物端或者5-引物端被少量核苷酸从等位基因的多态性位点分离出来。在一个实施方案中，排除其中杂交区域被设计与多态性位点杂交的探针。这些实施方案与其他包括靶向扩增和/或选择性富集的方法有明显改善，原因在于本发明的实施方案更好的保留了每个多态性位点样本原始等位基因频率，无论所述样本是来自单个个体的纯基因组样本或者是来自多个个体的混合物。

在一个实施方案中，这里公开的方法使用高效非常多靶点PCR扩增DNA，随后进行高通量测序，确定每个目标位点的等位基因频率。允许多重靶点PCR以高效的形式进行的技术包括设计不可能彼此杂交的引物。通过建造潜在副作用、或者无意识的相互作用的热动力学模型，从至少500个潜在引物对、至少1,000个潜在引物对、至少5,000个潜在引物对、至少10,000个潜在引物对、至少20,000个潜在引物对、至少50,000个潜在引物对、或者至少100,000个潜在引物对之间，或者在引物和样本DNA之间选择PCR探针，然后使用该模型去除与其他设计不相容的设计或者与样本DNA不相容的设计。另一个允许多重靶点PCR技术以高效方式实施的技术是使用部分或者全套方式进行目标PCR。使用一种或者这些方式的结合能够在单个池中增加至少300个、至少300个、至少800个、至少1200个、至少4000或者至少1000个引物，得到扩增的DNA，所述DNA包括大多数在测序时会被标记在目标位点上的DNA。使用一种或者这些方式的结合能够在单个池中增加许多引物，得到扩增的DNA，所述DNA包括大于50％、大于80％、大于90％、大于95％、大于98％或者大于99％的在测序时会被标记在目标位点上的DNA。

在一个实施方案中，这里公开的方法包括使用最大似然率估计(MLE)方法确定观察到的等位基因测定分配是否表现出父子关系或者排除了父子关系。使用最大似然率估计方法与使用单假设舍选技术所不同，并且明显优于单假设舍选技术，其所确定的结果具有更高的准确度。这一方面是由于单假设舍选技术不包括备选的假设信息。另一方面是由于最大似然率方法能够确定每个样本最佳的分界阈。另一方面还由于通过使用最大似然率方法能够计算每个父子关系的置信度。对每个确定值进行置信度计算能够使医生了解那种声明更为准确，那种声明可能是错误的。在某些实施方案中，可以将多种其他的方法与最大似然率估计方法相结合提高倍数性声明的正确性。在一个实施方案中，这里公开的方法包括估计混合样本中胎儿DNA的百分率并据此估计计算父子关系声明(判断)和该父子关系声明的置信度。

在一个实施方案中，本发明包括计算表示第一个体和第二个体亲属关系程度的试验统计数值，得到第一个体在多个多态性位点上的遗传测量值，和DNA混合物在多个多态性位点上的遗传测量值，其中，所述DNA混合物包括来自第二个体的DNA和来自有亲属关系的个体的DNA。在一个实施方案中，第一个体是疑父，第二个体是孕育的胎儿，有亲属关系的个体是胎儿的母亲。可以对胎儿、母亲和其他与胎儿无亲属关系的个体计算试验统计数据，从而产生无亲属关系个体的度量分布。还可以对胎儿、母亲和疑父计算试验统计数值。使用单一假设抑制试验决定通过所宣称父亲的遗传数据计算所得的试验统计数值是否是通过无亲属关系的个体遗传数据计算所得的试验统计数值分布中的一部分。如果发现使用疑父的遗传数据计算的试验统计数值是使用无亲属关系的遗传数据计算出的试验统计数值分布中的一部分，则可以排除父子关系，也就是说，所宣称的夫妻可以断定与胎儿没有亲属关系。如果发现使用疑父的遗传数据计算的试验统计数值不属于使用无亲属关系的遗传数据计算出的试验统计数值分布中的一部分，则可以包括父子关系，也就是说，所宣称的夫妻可以断定与胎儿有亲属关系。

在一个实施方案中，亲子判断包括在两个可能的假设下确定测量的遗传数据的概率：假设疑父是胎儿的生理学父亲，和假设疑父不是胎儿的生理学父亲。然后根据书记计算每个概率的似然性，然后根据这两个假设各自的似然性确定亲子关系。所述判断可以利用来自母亲血浆的遗传测量值进行，可以利用来自疑父的遗传测量值进行，并且任选的，可以利用母亲的遗传数据。在一个实施方案中，所述母亲的遗传数据可以从使用母亲血浆获得的遗传测量值推算。在一个实施方案中，可以使用可能的胎儿百分比范围分布确定概率；所述胎儿百分比范围可以在0.01％到99.9％范围内的任意一点，并且筛目可以icon给10％增加到1％，从1％增加到0.1％，或者下降0.1％。在一个实施方案中，可能的胎儿百分比的分布式从2％到30％，并可能增加大约1％。在一个实施方案中，所述筛目可以是连续的，并且所述肯呢过下可以在该范围内事完整的，而不是结合的。在一个实施方案中，所述概率可以使用一个胎儿百分率确定，其中，所述胎儿百分率可以使用任何合适的方法确定。对于筛目中其他可能的胎儿百分率，可以根据两个假设计算数据的概率。对于疑父是生理学父亲的假设，所宣称父亲的基因型可以被用于计算概率，而对于疑父不是生理学父亲的假设，基于等位基因频率数据的其他人可以额外用于计算概率。在一个实施方案中，可以使用其父母或者平台模型计算给定假设的似然性。在一个实施方案中，可以将所有胎儿百分比的似然性相结合，所有母亲基因型的似然性相结合以及所有父亲基因型的似然性相结合。在一个实施方案中，父母基因型可能是概率性的(例如，在一个给定的单核苷酸多态性处，父母可能具有99％的机会含有基因型GT，0.5％的机会含有基因型GG，和0.5％的机会含有基因型TT；在另一个实施方案中，所述父母的基因型可能具有一个值(例如，在一个给定的单核苷酸多态性处，父母具有基因型GT)。在一些实施方案中，术语概率和似然性是可以互换的，照一般的说法；在其他的实施方案中，这两个术语不能互换并可以以统计学范畴的技术人员通常的理解来解释。

在本领域内已知的一些方法中，根据只能在父亲的基因型上发现的位点处得到的测量结果确定胎儿百组分，例如，只在Y-染色体上发现的位点或者只在猕猴-D基因上发现的位点。不幸的是，这种方法要求胎儿是男性(对于只能在Y染色体上发现的位点的情况)，或者可以在对DNA进行测量之前先识别出哪些基因或者基因组是只存在于父亲的基因型中而不存在于母亲的基因型中。另外，更为复杂的是，在亲子鉴定的过程中，不知道疑父是否是生理学父亲，因此，除了在Y染色体上的具体位点是可以预计的之外，不可能确定其他在父亲上存在而在母亲中不存在的位点。因此，在亲子鉴定过程中，目前来讲当胎儿是女性时，不可能确定胎儿的百分数，并且，当胎儿是男性时，只能通过Y染色体特异位点确定胎儿的百分比。在一个实施方案中，这里提供了一种用于确定包括母亲和胎儿DNA的DNA混合物中所存在的胎儿DNA的百分数的方法。在一个实施方案中，本方法使用常染色体的染色体遗传测量结果确定包括母亲和胎儿DNA的DNA混合物中所存在的胎儿DNA的百分数。在一个实施方案中，本方法不需要顾虑胎儿的性别就可以确定包括母亲和胎儿DNA的DNA混合物中所存在的胎儿DNA的百分数。在一个实施方案中，本方法不需要顾虑母亲和疑父可能具有什么样的基因，就可以确定包括母亲和胎儿DNA的DNA混合物中所存在的胎儿DNA的百分数。本方法不需要要求胎儿的性别是男性的，也不需要所识别的位置或者位点存在于父亲但不存在与母亲中。本方法不需要已知父亲的基因型。本方法不需要已知母亲的基因型，由于母亲的基因型可以通过母亲血浆中的DNA测量值推算获得，所述母亲的血浆包括胎儿和母亲DNA的混合物。

在一个实施方案中，可以使用二项式分布制作多态性位点的分布模型。在一个实施方案中，可以使用β-二项式分布制作多态的位点的分布模型。通过使用所述β-二项式分布制作的等位基因分布模型，本领域普通技术人员可以比使用其他分布更精确的定型可能的等位基因测量结果；从而更为准确的确定亲子关系。

在一个实施方案中，这里公开的方法通过将各个测量结果的概率相结合的方式考虑了数据会有很多噪音并包括错误的趋势。从附有概率性估计的测量数据中得到一组假设，使用最大似然率技术从这组假设中选择正确的假设，从而使不正确的测量结果更可能被抵消，并且在计算亲子关系时更多的使用正确的测量结果。更准确的说，本方法系统地减少了不正确的测量数据对亲子关系确定的影响。相对于所有数据被假定为同样正确的方法以及在计算确定亲子关系时随意排除外围数据的方法，这是一种进步。在一个实施方案中，根据单核苷酸多态性(SNP)质量和读数实际深度，通过预计的测量差异称量个体单核苷酸多态性(SNPs)；这能够增加统计结果的准确度，显著的增加父子关系声明的准确度，尤其在模棱两可的情况下。

这里描述的方法尤其对于样本中只有少量的DNA有效的情况，或者对于胎儿DNA的百分比比较低的情况特别有优势。这是由于当只有很少量的DNA有效时，会发生相对更高的等位基因丢码率和/或当胎儿和母亲DNA混合样本中胎儿DNA的百分比很低时，会发生相对更高的胎儿等位基因丢码率。高的等位基因丢码率意味着目标个体的大多数等位基因不能被测定，从而导致胎儿百分率计算值更不准确，因此确定的父子关系也不够准确。当混合物中胎儿DNA的分子百分率小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于8％、小于6％、小于4％、并且甚至小于3％时，这里描述的方法能够做出更准确的倍性测量值。

在一个实施方案中，可以在个体DNA中混合有有亲属关系的个体的DNA时所获得的测量值中确定个体的亲子关系。在一个实施方案中，DNA混合物是在母亲血浆中发现的自由浮动的DNA，其中可以包括来自母亲的具有已知基因型的DNA，并且其中可以与具有未知基因型的胎儿DNA相混合物。胎儿的父子关系可以因此通过参考实际测量值来确定，并且根据观察到的数据确定父子关系的似然性。在一些实施方案中，这里公开的方法被用于只有非常少量DNA存在的情况，例如，在法务情况，其中一个或者少量细胞(通常小于十个细胞、小于二十个细胞、小于40个细胞、小于100个细胞、或者等量的DNA)是有效的。在一些实施方案中，这里所公开的方法可以用于DNA被高度破碎的情况，例如在血浆中发现的ffDNA。在这些实施方案中，这里公开的方法可以从没有被其他DNA污染的少量的DNA中确定亲子关系，但是由于DNA的量非常少，很难确定亲子关系。可以从任意样本中获得作为本发明方法一部分的遗传测量结果，所述样本包括DNA或者RNA，例如但是不局限于：血、血浆、体液、尿、毛发、眼泪、唾液、组织、皮肤、指甲、裂殖细胞、胚胎、羊水、绒膜绒毛样本、粪便、胆汁、淋巴、子宫颈粘液、精液、或者其他细胞或者材料(包括核苷酸)。在一个实施方案中，这里公开的方法可以与核苷酸测定方法，例如测序、微阵列、qPCR、数字PCR或者其他用于测量核苷酸的方法一起运行。在一些实施方案中，这里公开的方法包括根据处理样本获得的DNA测量结果，在电脑上计算等位基因在多个多态性位点中的比率。在一些实施方案中，这里公开的方法包括根据处理样本获得的DNA测量结果以及其他本说明书中描述的改善相结合，在电脑上计算等位基因在多个多态性位点中的比率或者等位基因分布。

在本文的其他地方可以发现这些内容的进一步讨论。

非侵入性产前亲子鉴定(NPPT)

非侵入性产前亲子鉴定过程包括许多步骤。步骤中的一些可以包括：(1)从胎儿处获得遗传物质；(2)体外收集可能存在于混合样本中的胎儿遗传物质；(3)体外扩增所述遗传物质；(4)在体外优选富集遗传物质中的特异性位点；(5)体外测量遗传物质；并(6)在电脑上体外分析遗传数据。这里描述了减少实施这里所述的留个步骤以及其他相应步骤的方法。在这些方法中，至少一部分步骤不需要直接应用于人体。在一个实施方案中，这里的公开涉及应用于从人体重分离的治疗和诊断方法。在这些方法中，至少一部分步骤在电脑上实施。

本发明所公开的一些实施方案允许医生确定母亲所孕育的胎儿的遗传状态，具体的说，确定胎儿与其他个体的生物性关系，这种方法以一种非侵入性方式进行从而不会因为收集胎儿的遗传物质而威胁胎儿的健康，并且母亲也不需要经历侵入性方法。

现代技术的进步能够从遗传样本中测量大量遗传信息，使用例如，高通量测序和基因定型芯片等方法。这里公开的方法使医生能够更好的利用大量可用数据并对胎儿的遗传一致性做出更为准确的诊断。在一个实施方案中，基于方法的信息学可以以比其他本领域已知技术更准确的方式确定亲子关系。下面给出了许多实施方案的细节。不同的实施方案可以包括上述步骤的不同结合。不同步骤的不同实施方案的结合可以互换使用。

在一个实施方案中，从怀孕的母亲中抽取血液样本，分离母亲血液中的自由浮动DNA并用于确定胎儿的倍性状态，其中所述自由浮动DNA中包括来自母亲的DNA和来自胎儿的DNA的混合物。在一个实施方案中，这里公开的方法包括，以在富集过程中合理维持等位基因比例和/或等位基因分布一致性的方式，优先富集相应于多态性位点的DNA混合物中的DNA序列。在一个实施方案中，该方法包括使用整体基因组扩增技术(WGA)扩增分离的DNA。在一个实施方案中，这里所公开的方法包括基于扩增的目标PCR，从而使所得分子相对于目标位点具有更高的百分率。在一个实施方案中，这里提供的方法包括对DNA混合物测序，所述DNA混合物包括来自母亲的DNA和来自胎儿的DNA。在一个实施方案中，所述方法包括使用微阵列测量扩增的DNA，所述微阵列被设计用于测定核酸序列，例如单核苷酸多态性(SNP)阵列。在一个实施方案中，这里所公开的方法包括使用测量的等位基因分布确定母亲所怀的胎儿的亲子关系。在一个实施方案中，这里所公开的方法包括向医生报告亲子关系状态。在一个实施方案中，这里所公开的方法包括采取临床行动，例如，进行后续侵入性实验，例如绒膜绒毛取样或者羊水穿刺，为胎儿的出生进行准备，或者选择性的终止胎儿孕育。

本申请涉及2006年11月28日递交的美国实用新型申请序列号11/603,406(美国公开号：20070184467)；2008年3月17日递交的美国实用新型申请序列号12/076,348(美国公开号：20080243398)；2009年8月4日递交的PCT实用新型序列号PCT/US09/52730(PCT公开号：WO/2010/017214)；2010年9月30日递交的PCT实用新型序列号PCT/US10/050824(PCT公开号：WO/2011/041485)；2011年5月18日递交的美国实用新型申请序列号13/110,685和2011年11月18日递交的美国实用新型申请序列号13/300,235。本申请中使用的一些词汇在这些参考文件中也被用到。根据参考文献中发现的概念可以更好的理解这里描述的一些概念。

筛选包括自由浮动的胎儿DNA的母亲血液

这里描述的方法可以用于帮助确定一个胎儿、胎儿或者其他目标个体是否与另一个个体有遗传关系。在一些实施方案中，如果目标个体的遗传物质被发现存在一些来自另一个个体的遗传物质时，可以完成上述确定。在一个实施方案中，所述方法使用在母亲血液中发现的自由浮动的胎儿DNA，与来自父亲或者选择性的母亲的遗传样本一起，可用于帮助确定胎儿是否与疑父具有遗传关系。在一个实施方案中，所述胎儿可能来源于卵子供体的卵子，因此胎儿可能不与孕育胎儿的母亲有任何遗传学上的关系。在一个实施方案中，本方法适合用于目标DNA与非目标DNA以任意比例存在的情况：例如，目标DNA可以占所存在DNA的0.000001-99.999999％之间。在一个实施方案中，非目标的污染DNA可以来自多个个体：如果来自非目标个体的一些遗传数据或者所有遗传数据都是已知的，或者来自所述有亲属关系的遗传样本是有效的，那将会更为有利。在一个实施方案中，这里所公开的方法可用于决定来自含有胎儿DNA的母亲血液中的胎儿遗传数据，该方法还可以用于孕妇子宫中孕育多个胎儿的情况，或者在样本中存在其他污染DNA的情况，例如，从其已经出生的兄弟姐妹中获得的DNA。

本技术可以利用通过胎盘绒毛进入母亲循环的胎儿血液细胞的现象。通常，在这种方式中，只有很少量的胎儿细胞进入母亲循环(不足以产生检验胎儿-母亲出血的阳性Kleihauer-Betke试验结果)。可以通过多种确定具体DNA序列但不具有方法本身固有的侵入性风险的技术区分并分析胎儿细胞。该技术还可以使用通过排盘组织凋亡后DNA释放进入母亲循环中的自由浮动的胎儿DNA的现象，其中，所述被测定的胎盘组织包含与胎儿相同的基因型。在母亲血浆中发现的自由浮动的DNA所显示的含有胎儿DNA的比例高达30-40％胎儿DNA。

在一个实施方案中，从孕妇中抽血。研究表明母亲的血液中包含少量自由浮动的胎儿DNA，除了来自母亲的自由浮动DNA之外。另外，还可能含有有核的胎儿血细胞，其中包括来自胎儿的DNA，除了许多来自母亲的通常不含有核DNA的血细胞之外。本领域中已知很多方法可以用于分离胎儿DNA，或者建造富集胎儿DNA的部份。例如，据显示，色谱法能够建造富含胎儿DNA的某些部分。

一旦以一种相对非侵入性方式获得了含有一定量的胎儿DNA(或者是细胞性的，或者是自由浮动的)母亲血液样本、血浆样本或者其他流体(所述样本中具有相对于母亲DNA或者其原有比例更为富集的胎儿DNA比例)，技术人员可以对所述样本中发现的DNA进行基因定型。在一些实施方案中，用针抽取血液将血从静脉(例如，贵要静脉)中抽出。这里描述的方法可以用于确定胎儿的遗传数据。例如，该方法可以用于确定一个或者一个以上染色体的倍性状态，可以用于确定一个或者一组包括插入、删除和位移的单核苷酸多态性(SNPs)的一致性。该方法可以用于确定一种或者一种以上单倍体，包括来源于父母的一种或者一种以上遗传特征。该方法还可以用于确定胎儿和另一个个体之间的亲属关系程度。

请注意，该方法可以对任意核酸实施，所述核酸可以被用于任意基因定型方法和/或测序方法，例如ILLUMINAINFINIUM芯片平台、AFFYMETRIX基因芯片、ILLUMINA基因组分析器、或者LIFE TECHNOLGIES公司的SOLID系统，以及这里测得的遗传数据。包括从血浆中提取的自由浮动的DNA或者其扩增产物(例如整体基因组扩增技术、PCR)；从其他细胞型(例如来自全血中的人类淋巴细胞)的基因组DNA或其扩增产物。为了制备DNA，可以使用任何适用于这些平台的任意一种产生基因组DNA的提取或者纯化方法。该方法对RNA同样有效。在一个实施方案中，以最小化降解作用的方式存储样本(例如，在冰点之下，在-20c或者在较低的温度下)。

亲本支持

所公开发明的一些实施方案可与PARENTALSUPPORT^TM(PS)方法组合使用，其它的实施方案在以下专利申请中有所描述：美国申请号：11/603,406(美国公开号：20070184467)、美国申请号：12/076,348(美国公开号：20080243398)、美国申请13/110,685，PCT申请PCT/US09/52730(PCT公开号：WO/2010/017214)、PCT申请号：PCT/US10/050824(PCT公开号：WO/2011/041485)、PCT申请号：PCT/US2011/037018(PCT公开号：WO/2011/146632)，和PCT申请号：PCT/US2011/61506，这些申请通过引证全部并入本文。PARENTAL SUPPORT^TM是一种基于信息的方法，可以被用于分析遗传数据。在一些实施方案中，认为本文公开的方法是PARENTAL SUPPORT^TM方法的一部分。在一些实施方案中，PARENTAL SUPPORT^TM方法是具有高准确度的，从目标个体的一个或者少量细胞中，或者从包括来自目标个体的DNA和来自一个或者多个其他个体的DNA的DNA混合物中，用于测定目标个体遗传数据的，特别是用以测定疾病相关等位基因、其它所关注的等位基因、目标个体中一条或多条染色体的倍性状态和/或另一个个体与目标个体亲属关系程度的方法的集合。PARENTALSUPPORT^TM可指这些方法中的任何一种。PARENTALSUPPORT^TM是基于信息学的方法的一个实例。

PARENTAL SUPPORT^TM方法利用已知的亲本遗传数据，即母亲和/或父亲的单倍体型和/或二倍体遗传数据，以及减数分裂机制和目标DNA的不完整测量值，和可能的一个或多个相关个体的知识，与基于人群的交叉频率一起，在计算机上于硅片上以高度置信度重建多个等位基因上的基因型，和/或胚胎或任何目标细胞的亲本状态，和位于关键基因座的位置的目标DNA。PARENTAL SUPPORT^TM方法利用已知的亲本遗传数据，即母亲和/或父亲的单倍体型和/或二倍体遗传数据，以及减数分裂机制和目标DNA的不完整测量值，从而建立一些关于在不同的情况下可预计的遗传数据的假设，在根据观察到的遗传数据计算每种情况的似然性，因此确定那种情况最可能发生。在一些实施方案中，待检查的情况包括目标个体是否遗传了所关心的疾病相关单倍体、目标个体是否遗传了所关心的表型相关单倍体、目标个体是否具有一个或者一个以上非整倍体性染色体，和/或目标个体是否与所关心的另一个个体有亲属关系，以及有什么程度的亲属关系。PARENTAL SUPPORT^TM方法能够清除遗传数据的噪音.PARENTAL SUPPORT^TM尤其适用于只有少量的来自目标个体的遗传数据是可以使用的情况(例如，NPD或者NPPT)以及由于具有来自其他个体的污染DNA信息，直接测量的基因型具有背景噪音的情况。PARENTAL SUPPORT^TM方法能够在胚胎上重建高度准确有序的二倍体等位基因序列，和染色体片段的拷贝数，即使传统的无序二倍体测量以高比率的等位基因脱失、插入(drop-in)，变异扩增偏差和其它误差为特征。本方法可应用基本的基因模型和基本的测量误差模型。此遗传模型可测定每个SNP的等位基因概率和SNP之间的交换概率。如由InternationalHapMap Project所开发，可基于从亲本获得的数据在每个SNP对等位基因概率建立模型和基于从HapMap数据库获得的数据在SNP间对交换概率建立模型。给定适当的基本的基因模型和测量误差模型，可使用凭经验最大值(MAP)估计(为计算效率而做修改)来估计胚胎中每个SNP的正确有序的等位基因值。

定义

单核苷酸多态性(SNP)是指可在同一物种的两个成员的基因组间可存在差异的单核苷酸。本术语的应用不应意味着对每种变体发生的频率的任何限制。

序列是指DNA序列或基因序列。它可指个体的DNA分子或链的一级结构、物理结构。它可以指在DNA分子中发现的核酸序列，或者指DNA分子互补链上发现的核酸序列。他还可以指包含在DNA分子中作为其生物学(in silico)代表的信息

位置指的是个体DNA上尤其感兴趣的区域，这可以指SNP，可能插入或者删除的位点、或者可能发生相应的基因变异的位点。疾病相关SNP也可以被称为疾病相关位点。

多态性等位基因还可以被称为“多态性位点”，指的是一种等位基因或者位点，其中，所述基因型在同一种类的不同个体间存在变化。多态性等位基因的一些例子包括单核苷酸多态性、短串联重复、缺失、复制和逆位。

多态性位点指的是在不同个体间发生变化的多态性区域中发现的具体核苷。

等位基因是指占据特定基因位点的基因

遗传数据也叫做“基因数据”，指的是描述一个或者一个以上个体基因组的数据。它可以指整个基因组的一个或者一组位点、部分序列或者全部序列，部分染色体或者全部染色体。它是指一个或者一些核苷酸的一致性、或者一组连续的核苷酸、或者来自基因组不同位点的核苷酸，或其结合。遗传数据通常是典型的生物学词汇，但是，他还有可能被认为是以一定顺序排列的实际的核苷，从而化学的编码遗传数据。遗传数据可以被称为“在个体上″，“个体的”、“位于个体处”、“来自个体”或者“在个体上”。遗传数据也指对这些遗传物质进行测定的基因定型平台的输出结果。

遗传物质还叫做“遗传样本”，指的是来自一个或者多个个体的、包括DNA或者RNA的实际的物质，例如组织或者血液。

置信度是指所述SNP、等位基因、一组等位基因或倍体声称或者父子关系声称是正确的统计学似然性

非整倍性是指其中细胞中存在错误数量的染色体的状态。在人体细胞的情况中，它可指细胞不包含22对常染色体和一对性染色体的情况。在人生殖细胞的情况中，它可指细胞不包含23染色体中每一个的情况。对于单一染色体型，它可以指多于或者少于2个同源但是不同染色体拷贝的情况存在或者存在两个来源于相同父母的染色体拷贝。

染色体可以指单个染色体拷贝，指单个DNA分子，在正常细胞中存在46个；一个例子是母亲衍生出的染色体18′。染色体还可以指一种染色体类型，其中在正常人体细胞中有23个；一个实施例是18’。

单体性是指细胞只包括一个染色体类型的状态。

二体性是指细胞只包括两个染色体类型的状态。

单亲二体性指的是一种细胞包含两个染色体类型，并且两个染色体都来源于单亲的状态。

三体性是指细胞包括三染色体类型的状态。

遗传物质的状态或者简单的说“遗传状态”指的是DNA上一组单核苷酸多态性(SNPs)与遗传物质定相单倍体、或者与DNA序列的一致性，包括插入、删除、重复和突变。它还指一个或者一个以上染色体、染色体片段或者染色体片段组的倍性状态。

建立亲子关系或“确定亲子关系”指的是建立或者确定疑父是或者不是所孕育胎儿的生理学父亲，或者确定或者建立疑父是胎儿的生理学父亲的似然性。

亲子关系确定指的是确定所宣称父亲是或者不是胎儿的生理学父亲。亲子关系确定是建立亲子关系、声明亲子关系或者确定亲子关系的结果。

父子关系指的是个体生物学父亲的一致性。

包含亲子关系指的是建立所宣称父亲是胎儿的生理学父亲。

排除亲子关系指的是确定所宣称父亲不是胎儿的生理学父亲。

所宣称父亲指的是被调查与胎儿的父子关系的男性。

生理学父亲指的是其遗传物质被个体遗传的男性。

等位基因比率指的是样本或者个体中存在的各个等位基因在多态性位点的数值的比例。当所述样本被测序时，等位基因比例可以指在该位点绘制各个等位基因的序列读数的比例。当通过基于强度的测量方法测量样本时，等位基因比例可以参照通过所述测量方法估计的在该位点存在的等位基因数量的比值。

等位基因分布，或者“等位基因计算分布”指的是一组位点中每个微点存在的各个等位基因的相对数量。等位基因分布可以指个体、指样本、或者指对样本获得的一组测量结果。在测序过程中，等位基因分布指的是一组多态性位点中每个等位基因上对具体等位基因绘制的读数或者大概的读数。对等位基因测量结果进行概率处理，也就是说，对于给定的等位基因存在给定的序列读数的似然性是在0-1之间的组分，或者等位基因测量结果可以以二元方式处理，那就是说，任意给定的读数被认为是某一具体等位基因的0或者1个拷贝。

等位基因偏好指的是在杂合位点的等位基因测定比例与在DNA原始样本中存在的比例所不同。在特定位点的等位基因偏好程度等于在该位点观察到的等位基因比例，如测量所示，除以原始DNA样本中该位点的等位基因比率。等位基因偏好可以被定义为大约1，因此，如果计算所得的等位基因偏好程度为一个值X，X小于1，则等位基因偏好程度被重新表示为1/X。等位基因偏好可能是由于扩增偏好、纯化偏好、或者其他影响不同等位基因的现象造成的。

引物，也叫做“PCR探针”指的是单个DNA分子(DNA低聚物)或者DNA分子(DNA低聚物)的集合，其中，所述DNA分子是一致的或者基本一致的，并且其中，所述引物包括被设计能够与目标多态性位点杂交的区域，并且包括引物序列，所述引物序列被设计允许PCR扩增。引物还可以包括分子条码。引物可以包括与个体分子不同的随机区域。

杂交捕获探针指的是任意核酸序列，所述核酸序列可能被修饰，并且通过多种方法制备，例如PCR或者直接合成的方法，并且能够与样本中具体目标DNA序列的一个链互补。外源杂交捕获探针可以被加入到制备好的样本中，并通过deanture重新退火过程形成外源-内生片段的二重体。这些二重体可以通过多种方式从样本中分离。

序列读数指的是使用克隆测序方法测定的表现核苷酸碱基序列的数据。克隆测序可以产生表现单一原始DNA分子、克隆DNA分子或者原始DNA分子簇的序列数据。序列读数还可以与序列各个碱基位点的质量线有关，显示核苷酸已经被正确确定的概率。

绘制序列读数指的是对具体有机物的原始基因组序列确定序列读数位点的过程。序列读数来源的位置基于读数的核苷酸序列与基因组序列的相似度。

纯合的指的是在相应的染色体位点具有相似的等位基因。

杂合指的是在相应的染色体位点具有不同的等位基因。

杂合性比率指的是在给定位点具有杂合性等位基因的个体在人群中的比例。所述杂合性比率还可以指在个体给定位点或者DNA样本中可以预计的或者测定的等位基因比率。

单倍体型是多个基因座上等位基因的组合，其在相同染色体上共同传递。单倍体型可指少至两个基因座或整条染色体，这取决于发生在给定组的基因座间的重组事件的数目。单倍体型也可指单个染色单体上的一组统计相关的单核苷酸多态性(SNP)。

单倍体型数据也称为“定相数据”或“有序的遗传数据”，是指来自二倍体或多倍体基因组的单条染色体的数据，即，二倍体基因组中分离的染色体的母亲或亲本拷贝。

定相是指给定无序的二倍体(或多倍体)遗传数据，测定个体的单倍体型遗传数据的行为。它也指测定在个体中在一条染色体上发现的一组等位基因中的一个等位基因的两个基因中，哪个与两个同源染色体中的每一个有关的行为。

定相数据是指其中已测定单倍体型的遗传数据。

胎儿的(Fetal)指的是“胎儿的(of the fetus)”或者“在基因上与胎儿相似的胎盘区域”。在孕妇中，胎盘的某些部分与胎儿基因相类似，在母亲血液中发现的自由浮动的胎儿DNA可能来自于这部分胎盘，具有与胎儿所匹配的基因型。

来自胎儿的DNA指的是来自细胞一部分的DNA，其基因型基本上与胎儿的DNA相同。请注意，胎儿染色体一半的遗传信息来自于胎儿的母亲；在一些实施方案中，胎儿细胞中从母亲处遗传得到的染色体DNA被认为是“来自胎儿的”，而不是“来自母亲的”。

来自母亲的DNA指的是来自细胞一部分的DNA，其基因型基本上与母亲DNA相同。

胎儿可以指胚胎，裂殖细胞或者是胎儿。请注意，在这里所公开的实施方案中，这里所描述的概念对已经出生的胎儿、胎儿、胚胎或者其中的一组细胞同样有效。使用术语“胎儿”可以简单的指被称为被称为胎儿的个体是其父母的遗传后代。

父母指的是个体的亲生父母。一个个体典型地具有两个父母，一个父亲和一个母亲，尽管这可能对于例如遗传或者染色体嵌合现象来讲并不是必要的。

母亲指的是个体的生物学母亲，和/或这指的是通过怀孕而携带个体的女性。

亲本情况指的是目标个体两位父母中的一位或者两位的每两个相应染色体上给定的单核苷酸多态性(SNP)遗传状态。

母亲血浆是指从孕妇中获得的血液的血浆部分。

临床决定指的是任何采取或者不采取某一行动的决定，所述行动所带来的结果会影响个体的健康或者存活状态。在产前亲子鉴定过程中，临床决定指的是决定流产或者非流产胎儿。临床决定还能够指进行检查的决定，或者采取行动准备胎儿出生的决定。

诊断箱指的是一个机器或者一组机器的结合，所述机器被设计执行这里所公开的方法的一个或者多个方面。在一个实施方案中，所述诊断箱可以放置在病人监护点。在一个实施方案中，所述诊断箱可以在测序后执行目标扩增。在一个实施方案中，所述诊断箱可以单独发挥作用或者在医生的帮助下发挥作用。

基于信息学的方法或者“基于信息学的方案”指的是能够缓解统计压力从而理解大量数据的方法。在产前检查的过程中，这指的是被设计用于通过统计学推算最可能的状态来确定一个或者一个以上染色体倍性状态的方法、或者一个或者一个以上等位基因上等位基因状态的方法，而不是通过直接物理测量所述状态，该方法参考大量来自于，例如，分子阵列或者测序中的大量遗传数据。本发明所公开的一个实施方案中，所述基于信息学的技术可能是在本专利中所公开的技术。在这里所公开的一个实施方案中，这可能是PARENTAL SUPPORT^TM.

对应于一个或者多个位点的DNA的优选富集，或者在一个或者多个位点优选富集DNA指的是任何能够使富集后所述位点DNA混合物中的DNA分子百分比明显高于该位点富集前DNA混合物中DNA分子百分比的方法。这些方法可以包括相应位点DNA分子的选择性扩增。这些方法可以去掉不对应于该位点的DNA分子。

扩增指增加DNA核酸分子拷贝数的方法。

选择性扩增指的是一种增加特定DNA分子拷贝数的方法、或者增加对应于特定DNA区域的DNA分子拷贝数的方法。选择性扩增还指的是一种增加特定目标DNA分子拷贝数的方法、或者增加DNA目标区域的拷贝数多于增加DNA区域非目标分子拷贝数的方法。.选择性扩增可能是一种优先富集方法。

通用引物序列指的是一种DNA序列，这种DNA序列能够，例如，通过连接、PCR、或者连接调节的PCR方法附着到目标DNA分子群体上。一旦被增加到目标分子群体中，对通用引物序列具有特异性的引物可以通过单扩增引物对扩增目标群体。通用引物序列通常不与目标序列相关。

通用适体，或者“连接适体”或者“文库标记”是包括通用引物序列的DNA分子，可以与目标双链DNA分子群体的5-引物或者3-引物末端共价相连。适体的加入能够向目标群体的5-引物或者3-引物端提供通用引物序列，在此可以发生PCR扩增，扩增所有的目标群体分子，使用单对扩增引物。

靶向指的是一种在DNA混合物中，用于选择性的扩增或者相反的，优选富集对应于一组位点的DNA分子的方法。

假设涉及疑父是胎儿的生理学父亲的似然性，或者疑父不是胎儿的生物学父亲的似然性。

确定、建立和计算可以互换使用。

亲本情况

亲本情况是指对于目标的两个亲本中的每一个，两个相关染色体的每一个上给定等位基因的遗传状态。注意，在一个实施方案中，亲本情况是指目标的等位基因状态，相反，它指亲本的等位基因状态。给定SNP的亲本情况可由四个碱基对构成，两个父亲的和两个母亲的；它们彼此相同或不同。在此公开中，它可以写成“m₁m₂|f₁f₂”，其中m₁和m₂是两个母亲染色体上给定SNP的遗传状态，并且和f₁和f₂是是两个父亲染色体上给定SNP的遗传状态。在一些实施方案中，亲本情况可写成“f₁f₂|m₁m₂”。注意，下标“1”和“2”指第一和第二染色体的给定等位基因的基因型；也注意，选择哪条染色体标记为“1”和哪个标记为“2”是随意的。

注意，在本公开中，A和B在一般用于表示碱基对身份；A或B可等同地表示C(胞嘧啶)、G(鸟嘌呤)、A(腺嘌呤)或T(胸腺嘧啶)。比如，如果在给定的基于SNP的等位基因上，在一条染色体SNP上母亲基因型为T，并且在同源染色体SNP上为G，而且在两个同源染色体SNP上父亲的基因型在所述等位基因均为G，那么可以说目标个体的等位基因具有的亲本情况为AB|BB；在一些情况下，可以同样准确地说目标个体的等位基因具有的亲本情况为AB|AA。注意，在理论上，四种可能的等位基因的任何一种可存在于给定等位基因上，并且因此可能是，例如，在给定的等位基因上，母亲具有基因型为AT，且父亲具有基因型为GC。然而，经验数据表明在多数情况中，在给定等位基因上仅观察到四种可能碱基对中的两种。例如，当使用单串联重复时，可能获得超过两个、超过4个、甚至超过10个亲本情况。在本公开中，讨论假设在给定的等位基因上仅观察到两种可能的碱基，但本文公开的实施方案可经修改以考虑其中不支持这种假设的情况。

这里公开的实施方案的不同执行过程

这里所公开的是用于确定目标个体亲子关系的方法。所述目标个体可能是一种裂殖细胞、胚胎，或者是胎儿。在这里所公开的一些实施方案中，用于确定个体亲子关系的方法包括任意在本申请中描述的步骤或其结合。

在一些实施方案中，在确定胎儿亲子关系时所使用的遗传物质来源可以是胎儿细胞，比如，从母亲血液中分离的有核的胎儿红血球。本方法可以包括从怀孕的母亲体内获得血液样本。在本发明所公开的一些实施方案中，在确定胎儿亲子关系时使用的遗传物质可以是来自母亲血浆中的自由浮动的DNA，其中，所述自由浮动DNA可以由胎儿和母亲DNA混合物组成。

在一些实施方案中，胎儿的遗传物质来源可以是胎儿细胞，比如，从母亲血液中分离的有核的胎儿红血球。本方法可以包括从怀孕的母亲体内获得血液样本。本方法可以包括使用可视技术分离胎儿红血球，根据某些颜色的结合唯一地与有核红血球相关这一概念，以及相似颜色的结合与母亲血液中所存在的其他细胞无亲属关系的概念。与有核红血球有关的颜色结合可以包括核周围血红蛋白的红色，通过染色可以使该颜色更为清晰，并且核材料也可以被染色，例如，染成蓝色。从母亲血液中分离细胞并将其涂布在载玻片上，随后识别能够同时看到红色(来自血红蛋白)和蓝色(来自核材料)的位点，据此，本领域技术人员能够识别有核的红血球所在的位置。然后，使用显微操作设备提取有核的，使用基因定型和/或测序技术测定这些细胞上的遗传物质基因型。

在一个实施方案中，使用只会在胎儿血红蛋白存在时发出荧光但是在母亲血红蛋白存在时不发荧光的燃料对有核的红血球进行染色，并因此除去有核的红血球到底是来自于母亲还是胎儿的分歧。这里所公开的一些实施方案可以包括染色或者，相反的，标记核材料。这里所公开的一些实施方案可以具体地包括使用胎儿细胞特异性抗体标记胎儿核材料。

这里存在许多将胎儿细胞从母亲血液中分离出来的方法，或者将胎儿DNA从母亲血液中分离出来的方法，或者在存在母亲遗传物质的情况下富集胎儿遗传物质样本的方法。这里列举了一些方法，但这不是穷举。为了方便起见，这里列出了一些合适的方法：使用荧光标记的或者其他标记的抗体、空间排阻层析、磁力标记或者其他标记的亲和力标签、次生差异，比如母亲细胞和胎儿细胞之间在特定等位基因处有差异的甲基化、密度梯度离心后对CD45/14阴性细胞将进行CD45/14耗尽和CD71-阳性筛选、具有不同渗透压度的单倍或者双倍Percoll梯度，或者半乳糖特异性外源凝集素方法。

在一些实施方案中，制备、分离和/或纯化遗传物质样本。在一些实施方案中，离心样本分离各个层。在一些实施方案中，DNA的制备可以包括扩增、分离、色谱提纯、电泳纯化、过滤、液液分离、隔离、沉淀、优选富集、优选扩增、目标扩增或者本领域内已知的以及在这里描述的多种方法中的任意一种。

在一些实施方案中，这里所公开的犯法可以包括扩增DNA。DNA的扩增、将少量遗传物质转变成大量包括相似遗传数据的遗传物质的方法可以通过多种方法来完成，包括但不局限于聚合酶链式反应(PCR)。一个扩增DNA的方法是整体基因组扩增技术(WGA)。整体基因组扩增技术(WGA)可以使用许多方法：连接-调节的PCR(LM-PCR)、变性的低聚核苷酸引物PCR(DOP-PCR)、和多位移扩增(MDA)。在连接-调节的PCR(LM-PCR)中、短DNA序列检出适体与DNA的钝化端连接。这些适体包括通用扩增序列，通用扩增序列可以被用于使用PCR扩增DNA。在变性的低聚核苷酸引物PCR(DOP-PCR)中、在第一轮退火和PCR中使用包括通用扩增序列的随机引物。然后，PCR的第二轮进一步使用通用引物序列扩增序列。MDA使用Φ-29聚合酶，这种聚合酶是一种非常活跃的非特异性酶，能够复制DNA并已经被用于单细胞分析。多年来单细胞整体基因组扩增技术已经成功的被用于多种应用。还存在其他扩增样本DNA中的DNA的方法。DNA扩增技术将最初的DNA样本转化成具有类似序列组但是量更多的DNA样本。有时候，可能不需要扩增。.

在一些实施方案中，可以使用通用扩增技术扩增DNA，例如，整体基因组扩增技术(WGA)或者MDA。在一些实施方案中，DNA可以通过目标扩增技术扩增，例如，使用靶向PCR或者回形探针。在一些实施方案中，使用靶向扩增方法优选的富集DNA，或者通过使目标DNA从非目标DNA中完全或者部分分离的方法优选富集DNA，例如，通过杂交方法捕获。在一些实施方案中，可以通过使用通用扩增技术和优选富集方法的结合扩增DNA。在本申请的其他地方可以发现对这些方法中的一些更为全面的描述。

通过使用下列所述工具或者技术测定适当的遗传物质，并由此将目标个体和/或有亲属关系的个体的遗传数据从分子状态转化成电子状态：基因定型微阵列和高通量测序。一些高通量测序方法包括Sanger DNA测序、pyrosequencing、ILLUMINASOLEXA平台、ILLUMINA’s基因组分析器、或者APPLIEDBIOSYSTEM公司的454测序平台、HELlCOS的TRUE SINGLEMOLECULE SEQUENCING平台、HALCYON MOLECULAR的电子显微测序方法、或者其他测序方法。在处理过程中，所有这些方法实际上将存储在DNA样本中的遗传数据转化成通常存储在存储器中的遗传数据组。

有亲属关系的个体的遗传数据可以通过分析选自下列所组成的组的物质进行测定，所述物质包括但是不局限于：个体的大块二倍体组织、来自个体的一种或者一种以上的二倍体细胞、来自个体的一种或者一种以上单倍体细胞、来自目标个体的一种或者一种以上裂殖细胞、在个体中发现的细胞外遗传物质、来自个体的在母亲血液中发现的细胞外遗传物质、来自个体的在母亲血液中发现的细胞、来自有亲属关系的个体的胚子产生的一种或者一种以上胚胎、来自，例如，胚胎的一种或者一种以上裂殖细胞、在有亲属关系的个体中发现的细胞外遗传物质、已知来源于有亲属关系的个体的遗传物质、及其结合。

在一些实施方案中，计算疑父是胎儿的生理学父亲的似然性。在一些实施方案中，所述亲子鉴定可以用来做出临床决定。这种知识通常在存储器中被存储为物质的物理排列，可以被转化成一种报告。所述报告可以被使用，例如，临床决定可以使终止怀孕；或者，临床决定可以是继续怀孕。

在这里所公开的一个实施方案中，这里描述的任何方法可以被修饰，从而使不同的目标来自同一个目标个体，例如，从同一位孕妇中抽取多份血液。这样可以改善模型的准确度，这是由于多个遗传测量结果可以提供更多的数据，使用这些数据可以确定目标基因型。在一个实施方案中，一组目标遗传数据被用作报告的原始数据，而另一种被用作原始目标数据的二次检查。在一个实施方案中，分别来自目标个体的多组遗传数据被认为是并列的，并且因此，两组目标个体的遗传数据都可以用于确定胎儿的亲子关系。

在一个实施方案中，所述方法可能以亲子鉴定的目的是被使用。例如，在给出基于母亲单核苷酸多态性(SNP)-遗传信息、来自可能或者不可能是亲生父亲的男性的单核苷酸多态性(SNP)遗传信息、以及来自混合样本的测量的遗传信息的情况下，就有可能所述男性的遗传信息到底是不是所怀胎儿的亲生父亲。完成这个的一个简单的方式是查看当母亲是AA，可能的父亲是AB或者BB时的情况。这样的话，本领域技术人员可以预计父亲分布贡献一半(AA|AB)或者全部(AA|BB)的倍性。考虑可预计的ADO，可以很简单的确定所观察到的胎儿的单核苷酸多态性(SNPs)是否与可能的父亲相关。本发明的其他地方描述的进行亲子鉴定的其他方法。

在这里所公开的一个实施方案中，孕妇想确定一个男性是否是她所怀的胎儿的生物学父亲。她找到她的医生并给出其血液样本，并且她和她的丈夫给出其自身DNA样本。实验研究员基因定型亲代DNA，使用MDA方案扩增DNA，使用ILLUMINAINFINIUM芯片测定父母许多单核苷酸多态性(SNPs)的遗传数据。然后，研究院搅拌血液，取得血浆，使用空间排阻层析分离自由浮动的DNA样本。.作为选择，研究员使用一种或者一种以上荧光抗体，例如，对胎儿血红蛋白有特异性的荧光抗体分离有核的胎儿红血球。随后，研究员取得分离的或者富集的胎儿遗传物质并使用一种70-基低聚核苷酸文库对此遗传物质进行扩增，其中所述70-基低聚核苷酸文库被合理设计从而每个低聚核苷酸的两端与目标等位基因的每一边的侧链序列相对应。随着聚合酶、连接酶和适当试剂的加入，所述低聚核苷酸进行填补缺口的循环，捕获所需的等位基因。加入核酸外切酶，加热失活，然后直接使用产物作为模板进行PCR扩增。在ILLUMINA基因组分析器上对PCR产物测序。序列读数作为PARENTAL SUPPORT^TM方法的输出端，然后预计胎儿的倍性状态。该方法确定疑父是否是胎儿的生物学父亲，并计算该确定值的置信度为99.98％。这里所产生的报告公开了亲子关系确定值以及该确定值的置信度。

在另一个实施方案中，孕妇想确定一个男性是否是她所怀的胎儿的生物学父亲。产科医生从母亲和父亲体内抽取血液。将血液送给实验室，其中，所述技术人员离心来自母亲的样本，分离血浆和白细胞层。通过扩增的方式将白细胞层和父亲血液中的DNA转换，并将扩增的遗传物质中编码的遗传数据从细胞存储遗传数据转换成电存储遗传数据，通过在高通量测序仪上运行遗传物质测定父亲的基因型。使用5,000倍-半巢式目标PCR方法在一组位点优选富集血浆样本。将DNA片段混合物制备出适合于测序的DNA文库。然后使用一种高通量测序方法对DNA测序，例如使用ILLUMINA GAIIx基因组分析器。这种测序方法将DNA中分子编码的信息转化成计算机硬件中电子编码的信息。包括这里所公开的实施方案的基于信息学的技术(例如PARENTALSUPPORT^TM)可以被用于确定胎儿的亲子关系。这可以包括在电脑上计算富集样本的DNA测量结果中不同多态性位点的等位基因计数；并确定所述男性是胎儿生物学父亲的似然性。疑父是胎儿的生物学父亲的概率被确定是99.9999％，并计算该父子关系确定值的置信度被计算为99.99％。据此打印一份报告，或者将报告的电子版发送给孕妇的产科医生，产科医生向孕妇传达这一确定结果。这位女性、她的丈夫和医生可以坐下讨论这份报告。

在一个实施方案中，来自父亲或者母亲的原始遗传物质通过扩增被转化成序列相似但是数量更多的一定量的DNA。然后，通过一种基因定型方法，将核酸编码的遗传数据转化成可以在存储器上物理存储和/或电子存储的遗传测量结果，例如，如上所述的那些。这里详细描述了组成PARENTAL SUPPORTTM运算法则的有关运算法则或其相关部分，所述有关运算法则使用程序设计语言被转换为一种计算机程序。然后，通过在计算机硬件上执行计算机程序，而不是物理编码二进制数字和字节，使之以表现原始测量数据的方式排列，测量结果可以被转变成一种表现高置信度胎儿亲子关系确定值的形式。转化的细节取决于数据本身和用于执行这里所描述的方法的计算机语言和硬件系统。然后，将物理学构造用于表象高质量胎儿亲子关系确定值的数据转变成报告，发送给保健医师。这种转化可以使用打印机或者计算机显示器进行。所述报告可能是在纸上或者在其他适当的介质上的印刷本，或者是电子版的。对于电子版的报告，可以被传输，可以被物理存储在可以被保健医生容易接近的计算机的存储器中；还可以显示在屏幕上以便读取。对于屏幕显示而言，所述数据可以被转化成可读形式，通过转变显示设备上的像素。所述转化可以通过在磷光屏上物理加热电子来完成，通过改变能使屏幕上特定像素类的透明度发生物理变化的电荷来完成，所述屏幕位于发出或者吸收光子的底物之前。所述转化还可以通过在特定的像素类中，改变液晶分子纳米级定向的方式来完成，例如，将向列型转化为胆甾醇型液晶或者近晶态。所述转化还可以通过一种电流来完成，所述电流能够使一类特定的像素发射光子，所述像素由一系列发光二级管按照一种有意思的方式进行排列制成。所述转化可以通过其他用于显示信息的方式完成，例如，电脑屏幕或者其他输出设备或者信息传递途径。保健医生可以根据报告采取行动，因此，将报告中的数据转化成行动。所述行动可以是继续或者终止怀孕，而在这样情况下，所孕育的胎儿会变成死胎。另一方面，技术人员可以讲一组遗传测量结果转化成一份报告，帮助医生治疗怀孕的病人。

在一些实施方案中，这里描述的方法可以在怀孕初期使用，例如，早在怀孕四周、五周、六周、七周、八周、九周、十周、十一周和十二周时就可以使用。

这里所公开的任何实施方案都可以在数据电子电路中实施、在集成电路原件中实施，尤其是设计的ASICs(专用集成电路)、计算机硬设备、操作系统、软件或者其结合。这里所公开的实施方案中的一起可以在计算机程序产品中执行，所述计算机程序产品被概括在一种计算机可读存储装置中，通过可编程处理机执行；并且，这里所公开的实施方式的方法步骤可以通过能够执行指示程序的可编程处理机来完成，从而通过操控出入数据和产生结论来执行这里所公开的实施方案的功能。在一个或者一个以上计算机程序中可以有利的执行这里所公开的实施方案，所述计算机程序在一种可编程的系统中是可执行的和/或可解释的，所述可编程的系统包括至少一个专用的或者通用的可编程处理机，这些处理器与至少一个输入设备和至少一个输出设备耦合在一起从而接受数据和指令，并且将数据和指令发送到存储系统中。每个计算机程序可以以高级程序化的或者面向对象的程序设计语言来执行，或者如果需要的话，以集成语言或者机器语言来执行；并且，在任何一种情况下，所述语言可以是编辑语言或者是解释语言。可以以任何形式配置计算机程序，包括，作为独立程序、或者作为程序块、元件、子例行程序、或者其他适用于计算环境的元件。所述计算机程序可以被配置在一个电脑上被执行或者解释，或者被配置在同一位点的多个电脑上，或者被配置在分布于多个位点的相互之间通过一种通信网络互相联系的多个电脑上。

计算机可读存储介质，如这里所使用的，指的是物理存储器或者实体存储器(与信号相反)并且包括，但是不局限于，挥发性的或者不挥发性的、可移动的或者不可移动的介质，能够以任意方法或者技术执行，从而实体存储信息，例如，电脑可读指令、数据结构、程序模块或者其他数据。计算机可读存储介质包括，但是不局限于，随机存贮器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦可编程只读存储器(EPROM)、电可擦可编程只读存储器(EEPROM)、闪速存储器或者其他固态存储器技术；只读光盘存储器(CD-ROM)、数字光盘放象机(DVD)、或者其他光存储器；磁带盒、磁带、磁盘存储器或者其他磁存储器；或者任何其他可以用于实际存储所需信息或者数据或者指令的物理或者材料介质，以及其他可以被电脑或者处理器所访问的介质。

目标富集和测序

通过使用在多个目标位点富集DNA样本并在随后进行测序的技术，作为非侵入性产前等位基因确定或者倍性确定方法的一部分，能够实现很多预料不到的优势。在本发明所公开的一些实施方案中，所述方法包括使用基于信息学的方法测量遗传数据，例如，使用PARENTAL SUPPORT^TM方法(PS)。一些实施方案的最终结果是胚胎或者胎儿可采取行动的遗传数据。许多方法可以被用于测定个体或者有亲属关系的个体的遗传数据，作为所实施的方法的一部分。在一个实施方案中，这里公开了用于富集目标等位基因组浓度的方法，该方法包括一个或者一个以上的以下步骤：扩增目标遗传物质，加入位点特异性低聚核苷酸探针、连接特定DNA链、分离所需的DNA组、除去不需要的反应成分、通过杂交的方式测定某些序列，并通过DNA测序的方法测定DNA单链或者双链序列。在一些情况下，DNA链可以指目标遗传物质，在一些情况下，他们可以指引物，在一些情况下，他们可以指合成的序列或其结合。这些步骤可以以多种不同的顺序进行。由于分子生物学的高度可变性，通常不能明显确定那个方法，或者那些步骤的组合能够在各个位置更差的进行、更好的进行或者最好的进行。

例如，在目标扩增之前进行DNA的通用扩增步骤能够带来一些优势，例如，去掉管端缩径的风险并减少等位基因偏好。DNA可以与一种低聚核苷酸探针相混合，所述低聚核苷酸探针能够与目标序列的两个相邻区域杂交，一边一个。在杂交以后，探针的末端可以通过加入聚合酶(一种连接方式)和任何其他允许探针环化的试剂相连。在环化之后，加入核酸外切酶消化未环化的遗传物质，然后测定环化的探针。DNA可以与一种PCR引物相混合，所述低聚核苷酸探针能够与目标序列的两个相邻区域杂交，一边一个。在杂交以后，探针的末端可以通过加入聚合酶(一种连接方式)和任何其他允许PCR扩增完成的试剂相连。扩增的或者未扩增的DNA可以作为杂交捕获探针的目标，所述杂交捕获探针靶向一系列位点：杂交之后，所述探针可以被定为并从混合物中分离，提供富集目标序列的DNA混合物。

在一些实施方案中，可以以多重方式完成目标遗传物质的测定。能够并行运行的目标遗传序列的数目可以在1-10、十到一百、一百到一千、一千到一万、一万到十万、十万到一百万，或者一百万到一千万之间变化。请注意，本发明的现有技术以及公开了很多成功的多通道PCR反应，其中所涉及的反应池最高具有大约50-100个引物，没有更多了。现有技术中多通道PCR中每池的引物超过100个时，会导致明显的问题，带来不希望的副作用，例如形成引物二聚物。

在一些实施方案中，本发明方法可能用来对单个细胞、少量细胞、两个到五个细胞、六个到十个细胞、十个到二十个细胞、二十个到五十个细胞、五十个到一百个细胞、一百个到一千个细胞进行基因定型，或者对少量细胞外DNA，例如从一到十微微克、十到一百微微克、一个百微微克到一个毫微克、一到十毫微克、十到一百毫微克，或者一百毫微克到一微克的DNA进行基因定型。

通过使用靶向某些位点并在随后进行测序的技术，作为非侵入性产前等位基因确定或者倍性确定方法的一部分，能够实现很多预料不到的优势。用于靶向DNA的方法，例如优选富集的方法包括，使用回形探针、连接转化探针(LIPs、MIPs)、通过杂交方法捕获，例如SURESELECT、和目标PCR或者连接-调节的PCR扩增方法。

在一些实施方案中，在这里所公开的方法包括使用基于信息学的方法测量遗传数据，例如，使用PARENTAL SUPPORT^TM方法(PS)。PARENTAL SUPPORT^TM是一种基于信息学的方法，用于处理遗传数据，这里描述了该方法的许多方面。一些实施方案的最终结果是胚胎或者胎儿可采取行动的遗传数据，随后获得根据该可采取行动的数据的临床决定。PS方法背后的运算法则使用目标个体(通常是指胚胎或者胎儿)测量的遗传数据，以及相关个体的测量的遗传数据，并能增加已知目标个体遗传状态的准确度。在一个实施方案中，测量的遗传数据在产前遗传诊断确定亲子关系过程中被使用。许多方法可以被用于测定个体或者有亲属关系的个体的遗传数据，如上下文所述。不同的方法包括许多步骤，所述步骤通常包括：扩增遗传物质，加入低聚核苷酸探针、连接特定DNA链、分离所需的DNA组、除去不需要的反应成分、通过杂交的方式测定某些序列，并通过DNA测序的方法测定DNA单链或者双链序列。在一些情况下，DNA链可以指目标遗传物质，在一些情况下，他们可以指引物，在一些情况下，他们可以指合成的序列或其结合。这些步骤可以以多种不同的顺序进行。由于分子生物学的高度可变性，通常不能明显确定那个方法，或者那些步骤的组合能够在各个位置更差的进行、更好的进行或者最好的进行。

这里所公开的一些实施方案包括使用“连接的转化探针”(LIPs)，这在之前的文献中已经被描述过。LIP是一种基因术语，指的是包括涉及制造DNA环化分子的技术，其中，所述探针被设计与目标等位基因两个边上的DNA目标区域杂交，从而通过加入适当的聚合酶和/或连接酶，在适当的条件下，加入缓冲液及其他试剂，能够完成目标等位基因的DNA互补转化区域，产生一种能够捕获目标等位基因中所发现情报的DNA环形环。LIP还可以被叫做预环化的探针、预回形探针或者回形探针。LIP探针可以是一种直线型的DNA分子，长度在50-500个核苷酸之间，并且，在一个实施方案中，长度在70-100个核苷酸之间；在一些实施方案中，他可能比这里描述的更长或者更短。这里所公开的其他实施方案包括LIPs技术不同的体现，比如挂锁探针和分子逆向探针(MIPs)。

靶向具体测序位点的一个方法是合成探针，其中，所述探针的3′和5′末端在接近所述目标区域的两端的位点处退火目标DNA，从而使加入的DNA聚合酶和DNA连接酶以一种插入的方式延长3′末端，向与目标分子互补的单链探针中加入碱基(补充缺口)，随后与原始探针的新3′末端和5′末端连接，产生一种环状DNA分子，随后，所述环状DNA分子可以从背景DNA中分离出来。探针末端被设计成位于所关心的目标区域的侧面。本方法的一个方面通常叫做分子逆向探针(MIPs)，并且被用于与芯片技术相结合确定填入的序列性质。

连接-调节的PCR是通过扩增DNA混合物中的一个或者一些位点优选富集DNA样本的方法，所述方法包括：获得一组引物对，其中，每对中的每个引物包括一种目标特异性序列和一种非目标序列，其中，所述目标特异性序列被设计用于退火目标区域，一个退火多态性位点的上游，一个退火多态性位点的下游；上游引物3-末端的DNA的聚合作用填满该引物与下游引物5-末端之间的单链区域，该区域具有与目标分子互补的核酸；将最后聚合的上游引物碱基与相邻的下游引物5-末端相连接；并使用包含在上游引物5-末端和下游引物3-末端的非目标序列扩增唯一聚合并结合地分子。用于区分目标的引物对可以被混合入相同的反应中。所述非目标序列可以作为通用序列，从而所有已经成功聚合并结合地引物对可以与单对扩增引物一起扩增。

在一个实施方案中，DNA样本可以使用杂交捕获方式优选富集。通过杂交技术大批量捕获的实施例包括AGILENT公司的SURESELECT和ILLUMINA的TruSeq。在通过杂交捕获过程中，与所需的目标序列互补或者主要互补的低聚核苷酸组能够与DNA混合物杂交，然后与混合物物理分离。一旦所需序列与目标低聚核苷酸杂交，物理除去目标低聚核苷酸的作用是去除目标序列。一旦杂交的低聚核苷酸被去掉了，他们可以被加热到其解链温度之后并被扩增。一些物理去除目标低聚核苷酸的方法是通过共价键将目标低聚核苷酸与固体支持物相连接，例如，磁性小珠，或者碎片。物理去除目标低聚核苷酸的另一个方法是通过共价键将他们与一种分子部分相连接，所述分子部分与另一个分子部分具有很强的亲和力。这种分子对的一个实施例是生物素和链霉亲和素，比如SURESELECT中所使用的。因此，所述目标序列可以与生物素分子共价相连，之后杂交，带有链霉亲和素附着物的固体支持物可用于拆散与目标序列杂交的生物素化的低聚核苷酸。

在一些实施方案中，PCR可用于基因组的目标特异性位点。在血浆样本中，所述原始DNA是非常碎的(通常小于500bp，具有的平均长度小于200bp)。在PCR中，正反向引物必须对相同的片段退火，从而启动扩增。因此，如果所述片段很短的话，PCR实验必须放大相对短的区域。PCR实验可以产生大量进行，但是不同PCR实验之间的相互作用使其很难重复超过100个实验。许多复合分子方法可以被用于增加重复水平，但是每次反应还被局限在小于100，或者小于200，或者少于500个实验。具有大量DNA的样本在多重亚反应中可能被分裂，然后在测序之前重新结合。对于或者全部样本或者一些DNA分子的亚群被限制的样本，分裂样本会引入统计学噪音。在一个实施方案中，小的，或者有限量的DNA可以指数量少于10pg，在10-100pg之间，在100pg和1ng之间，在1-10ng之间，或者在10-100ng之间。注意，其他的方法涉及分裂成多个反应池因此造成引入随机噪音的显著问题，因此，本方法对于少量DNA特别有效，尽管如此，当所允许的样本存在大量DNA时，本方法还提供了最小化偏好的益处。在这些情况下，通用预扩增步骤可以被用于增加全部样本数量。理想的是，这种预扩增步骤不会显著的改变等位基因分布。

通常，为了对样本中多个目标(大于50、大于100、大于500、或者大于1,000)进目标测序，本领域技术人员可以将样本分成多个平行反应，用于扩增个体目标中的一个或者一小部分。这一过程以及在PCR多孔平板上进行，或者可以在商业上可获得的平台上完成，例如，FLUIDIGM ACCESS芯片(在微流态芯片中每个样本发生48个反应)或者RAIN DANCE技术公司的DROPLET PCR(对于上百或者上千的目标)。可惜的是，这些分开-和-库方法对于只具有极少量DNA的样本是存在问题的，这是由于这种情况下通常不具有足够的基因组拷贝数来保证每个小孔的基因组的每个区域都有一个拷贝。当靶向多态性位点时，这是一个非常严重的问题，并且，在多态性位点有相对比例的等位基因是必须的，这是由于通过分裂和入库引入的随机噪音会使存在于DNA原始样本中的等位基因比例测量值的准确度变差。这里描述的是一种能够有效并高效地扩增许多PCR反应的方法，很适合于只有极少数有效DNA的情况。在一个实施方案中，本方法可以用于分析单一细胞、体液、DNA混合物，例如在母亲血浆中发现的自由浮动的DNA、活组织、环境样本和/或法庭样本。

在一个实施方案中，所述目标测序可以包括一个、多个或者所有下列步骤。a)在DNA片段的两端产生并整体扩增具有适体的文库。b)在文库扩增之后将反应分成多份。c)对每个目标使用一个目标特异性“前进”引物和一个标记的特异性引物，对选定目标进行大约100-倍、大约1000-倍、或者大约10,000倍扩增。d)使用“反向”目标特异性引物以及一个(或以上)在第一轮时作为目标特异性正向引物的一部分引入的通用标记物具有特异性的引物对此产物进行第二次扩增。e)将产物分成几等份并在个体反应目标子区进行扩增(例如，50-500-倍，尽管这可能一直被用于下一过程)。f)平行子区反应的库产物。在所述扩增期间，引物中可以携带序列相容性标记物(部分或者全长)从而使产品可以被测序。

在一个实施方案中，通过放大原始细胞游离DNA(cfDNA)样本的全部或者一小部分，可以减少随后步骤中的潜在损失。可以使用各种方法来扩增样本中的全部遗传物质，增加下游方法中可使用的数量。在一个实施方案中，可以通过在与一个不同的适体、两个不同的适体、或者许多不同的适体连接之后再使用PCR方法来扩增连接-调节的PCR(LM-PCR)DNA片段。在一个实施方案中，使用多位移扩增(MDA)Φ-29聚合酶等温扩增所有的DNA。在变性的低聚核苷酸引物PCR(DOP-PCR)及其变体中，使用随机引物扩增原始材料DNA。每种方法都具有某些特点，例如对所有基因组所代表的区域均一的扩增，捕获效率和原始DNA的扩增、以及扩增表现都是片段长度的函数。

传统的PCR试验设计会对不同的胎儿分子带来极大的损失，但是通过设计非常短的PCR实验(术语叫微-PCR实验)可以极大的降低这种损失。母亲血浆中的胎儿cfDNA是非常破碎的，并且这些片段的尺寸以一种高斯型曲线的形式分布，其平均值大约为160bp，标准差大约15bp，最小尺寸大约100bp，最大尺寸是大约220bp。片段开始和结束位置关于目标多态性的分布，虽然不一定是随机的，但是在目标个体之间以及收集的目标之间差异很大，并且一个目标位点的多态性位点可能处于来源于该位点的各个片段的开始和结尾之间的任意位置。请注意，术语“微PCR”可能也同样指的是正常PCR，不存在任何附加限制或者约束。

在PCR过程中，扩增只会从包括正反引物位点的模板DNA片段开始。由于胎儿cfDNA片段是非常短的，两个引物位点都存在的似然性、胎儿片段的长度包括正反向引物位点的似然性是扩增子长度与片段长度的比值。在理想条件下，当扩增子的长度是45、50、55、60、65或者70bp时，实验分别能够成功的扩增大约72％、69％、66％、63％、59％、或者56％的有效模板片段分子。扩增子的长度是正反向引物位点的5-引物末端之间的距离长度。使用比本领域普通技术人员通常使用的更短的扩增子长度亏产生更为有效的多态性位点测量结果，只需要进行较短的序列阅读。在一个实施方案中，扩增子的实质部分应该小于100bp、小于90bp、小于80bp、小于70bp、小于65bp、小于60bp、小于55bp、小于50bp、或者小于45bp。

请注意，在现有技术中已知的方法中，较短的实验，例如在这里所描述的那些，通常应该被避免的，这是由于这种实验不是理想的，并且他们对于引物设计有很多约束，限制引物长度、退火特性、和正反向引物之间的距离。

多重PCR可能包括单轮PCR，其中，所有的目标被放大，或者可以包括一轮PCR随后进行一轮或者一轮以上巢式PCR。巢式PCR由随后的一轮或者几轮PCR扩增组成，使用一种或者一种以上新的引物，所述新引物能够通过至少一个碱基对内部结合上一轮的引物。巢式PCR通过只扩增来自上述产物的具有正确内部序列的扩增产物，从而在后来的反应中减少不合逻辑的扩增数目。减少不可逻辑的扩增目标能够改善获得的有效测量结果，尤其是测序过程中。巢式PCR通常必然会完全在上述引物结合位点内部设计引物，根据需要增加扩增所需的最小DNA片段长度。例如，比方说，母亲血浆cfDNA，其中DNA是非常破碎的，较大的实验尺寸减少了所获得的测量结果中不同cfDNA的数目。在一个实施方案中，为了改变这种作用，本领域普通技术人员可以使用部分巢式方法，其中，一个或者两个第二轮的引物在第一结合位点重叠，内部延长一定量的碱基，从而实现额外的专一性，同时最低限度的增加总实验规模。

在一个实施方案中，多重PCR实验池被设计用于扩增可能的杂合单核苷酸多态性(SNP)或者一种或者一种以上染色体上其他多态性位点或者非多态性位点，并且这些实验在第一反应中被应用从而扩增DNA。PCR试验的数目可以是在50到200个PCR试验之间、在200到1,000个PCR试验之间、在1,000到5,000个PCR试验之间、或者在5,000到20,000个PCR试验之间(分别是50到200-倍、200到1,000倍、1,000到5,000倍、5,000到20,000倍、超过20,000倍)。

在一个实施方案中，建立100-倍到500-倍、500-倍到1,000-倍、1,000-倍到2,000-倍、2,000-倍到5,000-倍、5,000-倍到10,000-倍、10,000-倍到20,000-倍、20,000-倍到50,000-倍、或者50,000-倍到100,000-倍的PCR实验池，从而正反向引物具有相对于需要的正反向序列的尾部，所述正反向序列是高通量测序工具(比如可以从ILLUMINA商业购得的HISEQ、GAIIX、或者MISEQ)所必须的。另外，包括的测序尾部5-引物是可以被用作随后PCR的引物位点的序列，从而向所述扩增子中增加核苷酸条码序列，使高通量测序工具中单通路中多个样本能多次测序。在一个实施方案中，建立10,000-倍PCR试验池，从而反向引物具有相应于所需要的反向序列的尾部，所述反向序列是高通量筛选工具所需要的。在使用10,000-倍实验扩增之后，使用另一个10,000-倍实验池进行随后的PCR扩增，所述另一个10,000-倍实验池包括针对全部目标的部分巢式正向引物(例如6-碱基巢式)和相对于第一轮中所包括的反向尾部的反向引物。在此之后是一轮仅有一个目标特异性引物和一种通用引物的部分巢式扩增，该扩增步骤限制了实验所需的尺寸，减少了样本噪音，但是极大的减少了不合理的扩增子数目。向所附着的连接适体中可以加入测序标记，和/或作为PCR探针的一部分，从而所述标记称为最后扩增子的一部分。

胎儿百分比影响测试的表现；当样本中具有较少的胎儿百分比时，测定正确的亲子关系变得更为困难。存在许多富集母亲血浆中发现的胎儿百分比的方法。通过前面描述的连接-调节的PCR(LM-PCR)方法以及有目的的除去长的母亲片段的方法可以增加胎儿百分比。在实施方案中，使用尺寸选择技术除去较长片段。在一个实施方案中，在目标位点多通路PCR扩增之前，可以进行一步额外的多通路PCR反应，从而选择性地去掉随后的多通路PCR所靶向的位点中存在的较长和较大的来自母亲的片段。设计额外的引物来退火距离多态性比预计存在于细胞游离胎儿DNA片段更远的位点。在对目标多态性位点进行多通路PCR之间，这些引物可以用于第一轮多通路PCR反应中。这些末端引物被一种分子或者部分标记，从而选择性的识别标记的DNA碎片。在一个实施方案中，这些DNA分子可以用生物素分子共价修饰，在一轮PCR循环之后，所述生物素分子能够除去包括这些引物的新形成的双链DNA。在第一轮中形成的双链DNA很可能是来自母亲的。这些杂交材料的除去可以通过使用磁性链霉亲和素小珠来完成。还有许多其他的标记方法可以起到同样的作用。在一个实施方案中，尺寸选择方法可以用于富集具有较短链DNA的样本，例如，小于大约800bp、小于大约500bp、或者小于大约300bp的样本。然后，短片段的扩增可以照常进行。

在一些实施方案中，所述目标DNA可以来源于单个细胞、来源于由目标基因组的一个拷贝所组成的DNA样本、来源于少量DNA、来源于混合来源的DNA(例如，怀孕血浆：胎儿和母亲的DNA；癌症病人血浆和肿瘤：健康DNA和癌症DNA的混合物，移植物，等等)、来自其他体液的DNA样本、来自细胞培养物的DNA样本、来自培养悬浮液的DNA样本、来自DNA法庭样本、来自DNA的古代样本(例如，包裹在琥珀中的昆虫)、来自其他的DNA样本，或其结合。

在一些实施方案中，这里描述的方法可以用于扩增和/或检验单核苷酸多态性(SNPs)、单串式重复(STRs)、拷贝数、核甙酸甲基化、mRNA水平、其他种类RNA的表达水平、其他遗传和/或次生特性。这里所描述的微-PCR方法可以与下一代测序一同使用；还可以与其他下游方法一同使用，例如微阵列、数字PCR技术、实时PCR、质谱分析等等。

在一些实施方案中，在这里描述的微-PCR扩增方法可以用做少数群体准确测量方法的一部分。使用峰形校准设备进行完全定量分析。通过深度测序对突变/次要的等位基因进行定量分析，并且以多通路方式运行。这可以用于对人类、动物、植物或者其他动物进行标准亲子鉴定和亲属关系或者先祖认定实验。这也可以被用作法庭测定。这还可以用于对任何种类的材料，例如，羊水和CVS、精液、妊娠产物(POC)进行快速基因定型和拷贝数分析(CN)。这还可以用于单细胞分析，例如，对来自胚胎的活组织测定样本进行基因定型。这还可以用于通过微-PCR进行目标测序从而进行快速胚胎分析(少于一天、一天或者两天的活组织切片)。

非常多重的PCR常常会使由没有价值的副反应(例如，引物二聚体的形成)产生的DNA产物的比例大大升高。在一个实施方案中，应该从引物文库中除掉可能产生没有价值的副反应的某些引物，从而获得一种引物文库，这种引物文库会产生更大比例的能够绘制基因组的扩增DNA。去掉问题引物的步骤能够出乎意料的提高随后的测序分析PCR多路水平，所述问题引物就是非常有可能形成二聚物的引物。在例如测序的系统中，二聚物或者其他有害产物会显著的降低性能特性，比已经完成的其他多通路高10倍、高50倍、或者高100倍。请注意，这与基于探针的测定方法，例如微阵列、TaqMan、PCR等等相矛盾，在这些测定方法中，过量的引物二聚物不会影响结果。请注意，本领域通常认为用于测序的多通路PCR在每个小孔中最多进行大约100个实验。

有很多方法可以用于选择引物使所得文库中含有最少量的非-绘制引物-二聚体或者其他引物有害产物。经验数据表明，小量的“坏”引物会产生大量非-测绘引物二聚物副反应。去掉“坏”引物能够增加绘制目标位点的序列百分比读数。一种识别“坏”引物的方法是查看通过目标扩增方法扩增的DNA测序数据；所观察到的具有最大出现率的引物二聚体应该被除去，从而产生一种引物文库，所述引物文库能够显著的减少不能够测绘基因无的DNA副产物。存在许多已知能够有效计算各种引物结合物结合能的程序，并且，去掉具有最高结合能的引物会产生一种引物文库，这种引物文库具有明显较少的产生不能够绘制基因组的副产物DNA的似然性。

请注意，还有其他的方法可以用于确定哪些PCR探针可以形成二聚体。在一个实施方案中，分析使用非最优化引物组扩增的DNA库，这可能已经足够确定问题引物。例如，通过测序进行分析，并且存在比例最大的二聚体被认定为最有可能形成的二聚体，因此应该被除掉。

为了选择目标位置，可以从设计所宣称的引物对开始，建造引物对之间可能的副相互作用的热动力学模型，然后使用模型去除与池中其他设计不兼容的设计。

在进行PCR时有很多可能的流程；这里所公开的方法中的一些典型工作流程在这里进行了描述。这里概括的步骤并不意味着排除其他可能的步骤，也不意味着这里描述的任何步骤是所述方法正常运转所必须的。.通过文献已知许多参数变化或者其他的修饰，并且在不影响本发明精华的前提下可以进行所述变化或者修饰。下面概括了一个具体的工作流程，其可以具有很多可能的变体。这些变体通常包括可能的次生PCR实验，例如，可以进行不同种类的巢式(步骤3)。重要的是需要注意，这些变化可以在不同时间进行，或者以与在这里明确描述的顺序所不同的顺序进行。

1.样本中的DNA可以具有连接适体，通常被叫做文库标记或者连接适体标记(LTs)、附着物，其中，所述连接适体包括一种通用模板序列，随后进行通用扩增方法。在一个实施方案中，可以使用一种标准程序完成这一方法，其中，所述标准程序被设计用于在破碎后建立测序文库。在一个实施方案中，所述DNA样本是平端，因此在3′末端加入A。可以加入或者连接具有T-悬垂物的Y-适体。在一些实施方案中，可以使用除了A或者T悬垂物之外的粘端。在一些实施方案中，可以加入其它适体，例如环式连接适体。在一些实施方案中，所述适体具有设计用于PCR扩增的标记。

2.特异性目标扩增(STA)：在一个反应中，可以多通路与扩增成百、成千、成万甚至成十万的目标。STA通常允许10—30个循环，同时，也可以允许5-40个循环、2—50个循环，甚至1—100个循环。引物含有引物，例如，用于简化工作流程或者避免大部分二聚物的测序。请注意，通常，携带相同标记物的引物二聚体不会被有效的扩增或者测序。在一些实施方案中，可以进行1—10个循环的PCR；在一些实施方案中，可以进行10—20个循环的PCR；在一些实施方案中，可以进行20-30个循环的PCR；在一些实施方案中，可以进行30-40个循环的PCR；在一些实施方案中，可以进行40个循环以上的PCR。所述扩增可以是一种线性扩增。PCR循环的数目可以被优化从而产生最佳阅读深度(DOR)曲线。不同的DOR曲线适用于不同的目的。在一些实施方案中，需要在所有的试验中具有更均匀的分布；如果在一些试验中所述DOR太小，则随机噪音太大使数据不那么有效，而如果读书深度太高，则每个额外读数的边缘有效性相对变小。

引物尾部可以改善来自普遍标记文库的片段DNA的测定。如果所述文库标记物和引物尾部包含一种同源序列，则可以改善杂交作用(例如，解链温度(TM)下降)，并且只要引物特异性序列的一部分位于样本DNA片段中，则引物可以延伸。在一些实施方案中，可以使用13个以上的目标特异性碱基对。在一些实施方案中，可以使用10—12个目标特异性碱基对。在一些实施方案中，可以使用8—9个目标特异性碱基对。在一些实施方案中，可以使用6—7个目标特异性碱基对。在一些实施方案中，STA可以在预先扩增的DNA上进行，例如，MDA、RCA、其他整体基因组扩增技术、或者适体调节的通用PCR。在一些实施方案中，STA可以在通过，例如，尺寸选择、目标捕获、直接降解导致的某些序列或者群体富集或者排除的样本上进行。

3.在一些实施方案中，可以进行次级多通路PCR或者引物扩增反应从而增加特异性并且减少不希望的产物。例如，全巢式、不完全巢式、半巢式、和／或较小试验池再次分成的平行反应也可以用于增加特异性。实验显示，与相同引物进行一个1,200倍反应所产生的DNA产物相比，将样本分装入三个400-倍反应中会产生具有更高特异性的DNA产物。同样，实验显示，与相同引物进行一个9,600倍反应所产生的DNA产物相比，将样本分装入四个2400-倍反应中会产生具有更高特异性的DNA产物。在一个实施方案中，可以使用同向或者反向的目标特异性引物和标记特异性引物。

4.在一些实施方案中，可以使用标记特异性引物和“通用扩增方法”来扩增STA反应产生的DNA样本(稀释、纯化或相反的)，也就是说，扩增预扩增并且标记的目标的一部分或者全部。引物可以包含其他的功能序列，例如，条形码，或者在高通量测序平台上测序所必须的全适体序列。

这些方法可以用于分析所有DNA样本，并且尤其适用于DNA样本特别小的情况，或者当DNA样本来源于超过一个个体时，例如，母亲血浆。这些方法可以用于DNA样本，例如单个或者少量细胞、基因组DNA、血浆DNA、扩增的血浆文库、扩增的凋亡上清液文库、或其他混合DNA样本。在一个实施方案中，这些方法可以用于单个个体存在不同遗传构成的细胞的情况，例如，患有癌症或者具有移植物。

在一些实施方案中，多通路PCR扩增可以包括使用不同类型的巢式方案，例如：不完全巢式、微PCR、完全巢式微-PCR、半巢式微-PCR、三重半-巢式微-PCR、单侧巢式微PCR、单侧微PCR或者反向半巢式微-PCR。

诊断箱

在一个实施方案中，这里公开一种诊断箱，这种诊断箱能够部分或者完全执行本发明所描述的方法。在一个实施方案中，所述诊断箱可以位于医生的办公室、医院的实验室或者任何能合理接近病人护理场所的适当位置。所述诊断箱也能够以全自动方式运行这里描述的方法，或者所述诊断箱可以要求一个或者一个以上的步骤完全由技师人工操作完成。在一个实施方案中，所述诊断箱可以分析母亲血浆中测量的遗传数据。在一个实施方案中，所述诊断箱可以与一些工具相连，所述工具能够将使用该诊断箱测定的遗传数据传递到一种外部计算设备中，从而该外部计算设备可以分析所述遗传数据，并且还可以产生一个报告。所述诊断箱可以包括能够将样本水溶液或者液态样本从一个容器传递到另一个容器的机器单位。其中可以包括许多试剂，这些试剂可以是固体或者液态的。还可以包括一种高通量测序仪。还可以包括电脑。

引物试剂盒

在一些实施方案中，可以配制一种试剂盒，其中包括设计用于完成这里所描述的方法的一系列引物。如这里所公开的，所述引物可以是外部正反向引物、内部正反向引物；他们可以是被设计与在引物设计章节所公开的试剂盒中其他引物具有较低的结合亲和力的引物；他们可以是相关章节描写的杂交捕获探针或者预环化探针，或者这些的结合。在一个实施方案中，可以配制一个试剂盒用于确定所孕育胎儿中目标染色体的倍性状态，设计该试剂盒用于这里所公开的方法，所述试剂盒包括一系列内部正向引物或者选择性的，一系列内部反向引物，并且选择性的，外部正向引物或者外部反向引物，其中，每个引物被设计与DNA区域杂交，所述DNA区域紧邻目标染色体或者选择性的、其他染色体中一个多态性位点的上游和／或下游。在一个实施方案中，所述引物试剂盒可以与本文其他地方描述的诊断箱结合使用。

最大似然估计

在本领域中已知许多方法可以用于测定是否存在表现型或者基因型，例如，染色体异常、医学情况或者亲子关系，涉及使用单假设舍选技术，其中，测量能够直接与病况有关的公式，并且，如果所述公式在给定阈的一边的话，则所述情况存在，而如果公式位于给定阈的另一端，则所述情况不存在。当从无效和可选择假设中进行确定时，单假设舍选技术只测定无效分布。在不考虑可选择的分布的情况下，技术人员不能根据观测数据估计每个假设的似然性，因此不能计算所得结果的置信度。因此，使用单假设舍选技术，可以得到是或者不是的答案但是不能估计具体情况的置信度。

在一些实施方案中，这里所公开的方法能够测定是否存在某种表现型或者基因型，例如，染色体异常、医学情况或者亲子关系，使用极大似然法。这种方法与单假设舍选技术相比具有明显的改善，这是由于本方法可以根据每个情况调整是否存在所述情况的阈值。该方法尤其涉及使用存在于在母亲血浆中发现的自由浮动的DNA的、来自胎儿和母亲DNA混合物的遗传数据，确定所孕育的胎儿的亲子关系的诊断技术。最大似然估计方法可以使用与每个假设有关的等位基因分布来估计各个假设情况下的数据似然性。因此，所述条件概率可以被转变成假设确定和置信度。同样地，最大后验估计方法使用与最大似然估计相同的条件概率，并且在选择最佳假设和确定值置信度的同时整合群体。

因此，使用极大似然估计(MLE)技术，或者非常相关的最大后然估计(MAP)技术能够实现两个优势，第一，会增加正确确定值的机会，并且也允许对每个确定值计算置信度。在一个实施方案中，使用最大似然估计或者最大后然估计，相对于具有最大概率的假设选择亲子关系。在一个实施方案中，这里公开的方法用于确定所孕育的胎儿的亲子关系，该方法涉及采用本领域已知的任何方法，包括使用单假设舍选技术并且再用公式表示出来，从而使用最大似然估计方法或者MAP方法。

用于确定亲子关系的方法

ffDNA一般以非常小的百分比存在于母亲的DNA中。在一个实施方案中，母亲具有已知的基因型或者母亲的基因型是可以测量或者推断的。通常，在母亲血浆中发现的胎儿DNA百分比在2—20％之间，虽然在不同的条件下所述百分比在大约0.01％到大约50％之间变化。在一个实施方案中，使用微阵列或者其他能够强化每个等位基因数据的技术测量母亲血浆。在一个实施方案中，对存在于母亲血浆中的DNA进行测序。在这种情况下，等位基因强度测定或者在具体等位基因上的序列读数是母亲和胎儿信号的总和。假定胎儿与母亲DNA的混合物比例是r比1，在一个位点处的等位基因相对数量由来自母亲的2等位基因和来自胎儿的2r等位基因组成。在一些实施方案中，所述位点包括单一核苷酸多态性。表1显示了信息性亲本内容选择的混合物中每个等位基因的相对数目。

表1：等位基因数量

请注意，上述四个选择是信息性的并不是指所有内容都是信息性的。可以使用任意内容的结合，并且其中存在大量可以在基因测量结果中发现的信息。

即使存在显著的来自胎儿的等位基因丢码率，在存在等位基因的信号和不存在等位基因的信号之间存在明显的区别。例如，在BB|BB和BB|AA对中考虑单核苷酸多态性(SNPs)的等位基因测量结果并且，在AA|AA和AA|BB对中考虑单核苷酸多态性(SNPs)的B等位基因的测量结果。在每个情况下，第一个内容中应该没有信号存在，第二个内容中应该有信号存在，其中，胎儿的等位基因没有丢失。然而，如果所述宣称父亲是不正确的，则在两个内容中有时都存在信号。因此，根据疑父正确与否，单核苷酸多态性(SNP)测量结果的分布应该是不同的。

在分布的高信号末端所述差异更为显著，这是由于这里更可能是胎儿DNA带来的单核苷酸多态性(SNPs)。通过将高百分比的单核苷酸多态性(SNP)测量结果分布值进行比较可以观察到所述差异。可能的百分比方法的例子是最接近的等级、在最接近的等级和重量百分比之间的线性插补。

例如，在所有染色体中，将X1定义为BB|BB中测量的A等位基因单核苷酸多态性(SNP)组，X2定义为BB|AA中测量的A等位基因单核苷酸多态性(SNP)。如果所声称的父亲是正确的，则X1的百分之99明显的小于X2的百分之99。如果疑父是不正确的，则这两个值99％的分布是密切相邻的。请注意，可以同样使用其他任意百分位，例如，百分之95、百分之90、百分之85或者百分之80.在一个实施方案中，对于具体的测量通路，X1可以被定义为没有信号的内容的测量结果，X2可以被定义为父亲和母亲的内容都是纯合体的测量结果，并且，只有父亲的等位基因提供信号(遗传给胎儿)。

定义p1为X1数据的第99个百分位(或者第95个或者90个等等的百分位)，p2为X2数据的第99个百分位(或者第95个或者90个等等的百分位)。定义实验统计量t为p1/p2。请注意能够显示数值差异的p1和p2的其他作用也可以被使用。根据样本中存在的胎儿DNA的量，t值会发生变化，其中，样本中存在的胎儿DNA的量是未知的。因此，不能事先计算分类阈。

使用下列方法可以将单个样本的实验统计数据t与来自许多已知不是父亲的个体基因型的分布相比。假定来自无亲属关系的个体的基因型是可以获得的。

1.对于每个无亲属关系的个体，假设这是父亲然后计算实验统计量t的值。

2.Tu是来自无亲属关系的男性的t测量值组。建立适合Tu的分布。这是关于具体样本的t分布，在零假设条件下。所述零假设是指“基因型不来自于胎儿的父亲”。Pu(t)的分布可以与一种已知分布(例如，高斯分布)的最大似然估计拟合或者是势差法拟合，使用kernal函数(例如，高斯型、箱式、三角式等等)进行kernal密度拟合，或者其他合适的分布拟合方法。

3.考虑疑父的基因型并计算相应的实验统计量Tc。

4.可以预计，与无亲属关系的个体相比，真正的父亲获得更小的t值。无亲属关系的父亲产生tc的概率或者更偏的值的概率是pu的累积密度函数，在tc处进行评价。然后，根据下式计算拒绝零假设的p值：

p = {&Integral;}_{0}^{t_{c}} P_{u} (t) dt

如果p值低于一个重要的阈值α，则关于疑父是无亲属关系的个体的假设被此α值驳回。如果p值大于α，则所述零假设不能被驳回，并且疑父可以与样本中存在的胎儿没有亲属关系。所述重要的阈值α定义了无亲属关系的个体被认定为正确的父亲的概率。例如，当α阈值为0.01时，百分之一的无亲属关系的个体可以被认定为正确的父亲。

可以考虑使用多种方法结合来自A和B等位基因通道的数据。例如，两个简单的方法要求来自所有通道的p值都低于一个阈值，或者要求来自任意通路的p值都小于此阈值。

在一些实施方案中，所述亲子鉴定方法假设胎儿DNA以足够量的浓度存在，从而能够区别具有或者不具有来自胎儿的信号的单核苷酸多态性(SNPs)。在缺乏足够的胎儿DNA浓度的情况下，本发明会报告“不正确的父亲”，这是由于可预计的父亲遗传的等位基因在母亲血浆中是不可测量的。在一个实施方案中，这里描述了一种在亲子鉴定之前证实存在足够的胎儿DNA的方法。通过计算实验统计量与胎儿DNA浓度的比值确定胎儿的存在量，但是不需要父亲的基因型。如果实验统计量大于所要求的阈值，则胎儿DNA的浓度足够进行亲子鉴定。

考虑单核苷酸多态性(SNPs)组(来自所有结合的染色体)，其中，母亲基因型是AA并且测定B通路。只有胎儿基因型包含B的单核苷酸多态性(SNPs)子集中能够预计获得信号，但是这种单核苷酸多态性(SNPs)在没有父亲基因型的情况下无法被识别，其中，父亲的基因型是不可用的。相反，考虑单核苷酸多态性(SNP)群体频率{fi}，其中fi是基于大样本群获得的单核苷酸多态性(SNP)i基因型中B样本平均数。请注意，当母亲基因型是AA时，大多数单核苷酸多态性(SNPs)的fi小于0.5，但是这些单核苷酸多态性(SNPs)上的fi分布扩大到几乎等于1.考虑两组单核苷酸多态性(SNPs)S₁和S₂，其中S₁＝{i：f_i＜T_L}并且S2＝{i：f_i＞T_H}.设置TL和TH阈从而S1中少量的单核苷酸多态性(SNPs)可以被预计含有B，并且S2中许多单核苷酸多态性(SNPs)被预计具有B，并且每组具有充分的群体。在一个实施方案中，运算公式中使用TL＝0.05和TH＝0.7，而其他TL和TH值也可以起到同样的或者更好的作用。使y_i称为SNP i的B通道测量值，Y₁＝{y_i：i□S₁}，并且Y₂＝{y_i：i□S₂}.Y1和Y2的分布会非常相似，由于在此两个分布中大多数单核苷酸多态性(SNPs)是没有信号的。但是，S2中的一些非常见单核苷酸多态性(SNPs)数目被预计含有胎儿信号并且在S1中很少的单核苷酸多态性(SNPs)被预计含有胎儿的信号。因此，Y2的尾部比Y1的尾部具有更高的强度。使p_t成为与1接近的百分比，例如，百分之99。当存在足够量的胎儿DNA时，Y2的pt百分比应该比Y1的pt明显的高。因此，实验统计量按照如下方式定义。

s＝百分比(Y₂；p_t)-百分比(Y₁；p_t)

在一个实施方案中，通过各种方法可以对实验统计量进行规范化，从而考虑阵列之间的扩增差异。在一个实施方案中，对每个染色体进行规范化。在一个实施方案中，对每个芯片基进行规范化。在一个实施方案中，对每个测序启动基进行规范化。

下列计算显示，根据单核苷酸多态性(SNPs)的邻近数值和敲出率，TL和TH阈值能够区别胎儿DNA的作用，尤其是在母亲样本中。表3显示了一些数据。

在一个实施方案中，本方法包括下列假定：

·从大群体数据组中计算群体频率，例如，超过500个个体，超过1000个个体、超过5000个个体或者超过20000个个体，并且，单核苷酸多态性(SNPs)数目来自母亲和父亲。

·当母亲是AA并且父亲是BB时，没有单核苷酸多态性(SNPs)(事实上，具有大约8％的母亲AA单核苷酸多态性(SNPs))。

·当父亲具有B时，一半的单核苷酸多态性(SNPs)导致胎儿是B。

·胎儿丢码率是百分之90。

·具有胎儿信号的测量结果比没有胎儿信号的测量结果要高。

表3显示了一些使用这里公开的方法和参数进行的具体亲子关系情况的数据。S1中百分之98的测量结果不能包括任意存在胎儿信号的单核苷酸多态性(SNPs)。S1中百分之98的测量结果被预计包括大约50个含有胎儿信号的单核苷酸多态性(SNPs)。二者之间的差异会反应胎儿信号的数值。

表3：关于亲子关系确定的数据

表4显示了由八个母亲血液样本在不同的怀孕阶段获得的结果。根据每个通路(A等位基因和B等位基因)测量的数据计算正确父亲的p-值。如果p-值要求小于0.01，然后两个样本被不正确的分类。如果只有一个通路通过阈值，则所有样本被正确分类。许多公式和阈值被用于证实或者排除亲子关系。例如，可以使用切断p-值为0.02、0.005、0.001或者0.00001；同样，可以要求一个或者两个通路的p值都低于给定的阈值，或者对于不同的通路p值可以具有两个不同的阈值。

表4：八个亲子鉴定中两个通路的P-值

表4显示正确父亲是无亲属关系的零假设的p值。每排对应不同的母亲血液样本和相应的父亲遗传样本。从200个无亲属关系的男性中获得遗传测量结果，并用作参照。图3中的曲线显示200个无亲属关系的男性的强度比例分布，并且星号表示亲生父亲的强度比率。本数据来自怀孕11周的母亲中所获得的血液。

图4显示了针对以下三种情况的胎儿遗传测量值和父母遗传测量值之间相关比例的累积分布频率(cdf)：(1)疑父和孕妇都是胎儿的亲生父母的情况(“正确的”，最右侧曲线)、(2)孕妇是胎儿的生物学母亲，但是疑父不是胎儿的生物学父亲的情况(“一个错误”、中间的曲线)和(3)孕妇和疑父都不是胎儿的亲生父母的情况(“两个错误”，最左边曲线)。所述cdf曲线是胚胎遗传数据之间的相关比，使用单个细胞上测量的数据进行计算，并且，当所假设父母的遗传数据是0、1、或者2时，所假定的父母是胎儿的遗传父母。请注意，“正确的”或者“两个错误”的标记是可逆的。图5显示了相同三个情况的直方图。请注意，所述直方图由超过1000个双亲中的一个或者两个是不正确的情况组成。在胎儿遗传数据之间测量所述直方图的相关比率，在单个细胞上测量，并且当所假定父母的遗传数据是0、1、或者2时，所假定父母实际上是胎儿的遗传学父母。

图6显示了35个使用本发明所属方法进行亲子关系测定的亲子关系结果。在从胎龄在9-40周之间的孕妇中收集样本对其进行测定。右方的红色曲线表示对800位无亲属关系的男性的亲子鉴定统计量的归一化高斯分布。在每个情况下，无亲属关系的男性的分布是不同的；为了方便目测，在这里使用了一种归一化分布。

蓝色条带代表正确父亲(怀疑的)的规范化的实验统计量。很明显，正确的父亲与无亲属关系的男性明显区分开来。请注意，规范化的实验统计量表示了未经处理过的近似标准偏差，因此，在图下部的“-5”表示与平均数具有大约5的标准偏差。因此，所有假设的正确父亲以及被证实是真正的父亲，具有至少99.9999％的显著性。.

在本发明的一个实施方案中，可以使用对父亲单倍体的认识来增加测试的准确性。例如，如果父亲的两个单倍体对于染色体给定的片段是已知的，则在此情况下对所存在的单核苷酸多态性(SNPs)的认识可以用于确定哪种单核苷酸多态性(SNPs)能够出现在含有敲出的情况下。例如，想象一组相连的三个单核苷酸多态性，也就是说，他们在同一个染色体上相互接近，并且其中母亲和父亲的内容是：AA｜AB，AA｜AB，AA｜BA.请注意，当父母的基因型被定相时，AB≠BA，由于这两个字母的第一个代表第一个单倍体上的等位基因，第二个字母代表第二个单倍体上的等位基因。现在，想象一下对于三个单核苷酸多态性(SNPs)，测定所有三个的B等位基因显著性水平；在这种情况下，疑父是正确父亲的几率比较低，这是由于两个父亲的单倍体是A、A、B和B、B、A，而在所有三个单核苷酸多态性(SNPs)上所测得的胎儿基因型对于B是阳性的，并且母亲只贡献了A。如果父亲基因型不是定相的，将不可能根据测量结果除去疑父。在一个实施方案中，可以根据给定的二倍体基因组DNA测量结果和从一个或者一个以上精液中获得的单倍体遗传测量结果来确定父亲单倍体的测量数据。使用一个以上精子可以以更高的准确度确定单倍体，并且在形成精液的减数分裂过程中，对每个染色体还可以发生很多交叉。在四个Rabinowitz的专利申请中可以发现用于完成父亲定相的方法，这些专利在本文其他地方被引用。

在一个实施方案中，专门使用单核苷酸多态性(SNP)测量结果进行亲子关系确定，并且没有使用来自单串式重复数据。在一个实施方案中，专门使用单核苷酸多态性(SNP)和STR测量结果进行亲子关系确定。可以使用单核苷酸多态性(SNP)微阵列测量单核苷酸多态性(SNP)数据，或者可以通过测序来测量。所述序列可以是未靶向的，或者可以是靶向的，例如通过使用能够靶向一组多态性位点的回形探针，或者使用杂交技术捕获的目标。在一些实施方案中，可以使用多种方法的结合调节遗传数据：例如，父亲的遗传数据可以在单核苷酸多态性(SNP)微阵列上进行测量，而从母亲血浆中分离出来的DNA可以被目标测序测量，其中，使用捕获杂交探针靶向所述单核苷酸多态性(SNP)微阵列上发现的相同的单核苷酸多态性(SNPs)。在一个实施方案中，下列数据类型的结合可以被用于确定疑父是否是胎儿的生物学父亲：单核苷酸多态性(SNP)数据、STR数据、交叉数据、微删除数据、插入数据、位移数据、或者其他的遗传数据。

在一个实施方案中，本方法包括产生一种报告，公开所建立的胎儿或其他目标个体的亲子关系。在一个实施方案中，本报告可以以实现亲子鉴定交流的目的进行。在一个实施方案中，本报告可以包括疑父是胎儿生物学父亲的概率。本报告的一些例子在内部进行了显示；图7是报告的例子，显示了排除亲子关系。图8是报告的例子，显示了包括亲子关系。图9是报告的例子，显示了未确定的结果。在一个实施方案中，本报告可以包括一种图表，所述图表包含与给定胎儿和母亲无亲属关系的亲子关系相关分布(以灰色曲线显示)，并且显示了用于疑父的度量标准(以三角形显示)。无亲属关系的男性的分布彼此不同；在这三个报告中，使用胎儿和无亲属关系的男性的实验统计量实际分布。在一个实施方案中，所述报告可以包含一种指示，表明疑父很可能是无亲属关系的个体分布的一部分(例如，图7)，因此疑父被确定不是胎儿的生物学父亲；当三角形位于父子关系排除区域时表明排除亲子关系。在一个实施方案中，所述包括还可以包括一种指示，表明疑父很可能不属于无亲属关系个体亲子关系度量分布的一部分(例如，图8)，并且疑父被证明是胎儿的生物学父亲；三角形位于父子关系包含区域表明包含父子关系。在一个实施方案中，所述报告还可以包含一种指示，表明测量结果不确定(例如，图9)；当三角形位于“不确定结果”区域时，表明关于胎儿亲子关系没有得出任何结论。

在本发明的一个实施方案中，确定疑父是否是胎儿的生物学父亲时不适用单串式重复(STRs)。在本发明的一个实施方案中，通过定相父亲基因型来增加亲子鉴定的准确度。在本发明的一个实施方案中，使用来自与父母有亲属关系的一个或者一个以上个体的遗传数据来定相父母中一个或者一个以上的基因型。在一个实施方案中，所述与父母有亲属关系的个体是父母的父亲、母亲、兄弟姐妹、儿子、女儿、兄弟、姐妹、阿姨、伯父、双胞胎、克隆物、父母的接合体、及其结合。

另一个亲子鉴定的方法

在一个实施方式中，母亲血浆和任选的其他遗传材料的，可通过测序测量，例如，使用高通量测序仪如ILLUMINA的HISEQ或MISEQ，或者LIFE TECHNOLOGIES的ION TORRENT。

如果有足够的自由浮动的胎儿DNA的浓度，母亲血液样本可以进行非侵入性的亲子鉴定测试。大体上，母亲血浆中胎儿DNA组分在大多数情况下，在约2％至20％之间，尽管它可能是低至0.01％，或高达40％，这部分取决于胎龄。已经表明，使用一个单一假设抑制方法，利用SNP芯片技术，这个范围足够进行亲子鉴定。高通量测序是一种更为精确的平台，它允许期望的母亲和胎儿的基因型组合测量响应于每个SNP的数学建模。在一个实施方式中，母亲血浆和任选的其他遗传材料，可通过测序被测量，例如ILLUMINA的HISEQ或MISEQ，或者LIFETECHNOLOGIES的ION TORRENT，然后可以使用概率和/或估计理论计算亲子包含或亲子排除的置信度。

在一个实施方式中，亲子鉴定的方法可能包括以下内容。对一个疑父，可以计算出来自于血浆中测序数据的概率，相对于两个不同的假设：(1)疑父是正确的(生物的)的父亲(HC)；和(2)疑父不是正确的(生物的)的父亲(Hw)。然后选择该认为具有较高的似然性或后验概率的假说。在一个实施方式中，这种方式可与平台模型相结合，其中所述的平台模型使在血浆中等位基因比率与测序的A和B等位基因观察到的数量相关。通过可利用的平台模型，有可能得出测序的A和B等位基因每个假设的每个SNP位置的概率似然性。

一种复杂情况是，在不同个体之间或随着时间的推移，在母亲血浆中胎儿组分可能会有所不同。在一个实施方式中，一个方法也许可以解释这种变化。有几种方法可以解决这种类型的变化。在一个实施方式中，该方法可以明确地判断胎儿组分；在另一个实施例中，方法可优先针对未知的量并对所有可能的值进行整合。一个实施例使用先验值，作为从0到某个阈值的均匀分布，例如40％。在理论上，任何一个先验值均可用。一个实施例计算各个不同的胎儿组分的似然度，无论是在连续的或有限的分区上，在该范围内分别集成或加和。

考虑含胎儿组分的母亲血浆，f及一个单个SNP，存在于血浆中的预期等位基因比率为r(基于产妇和胎儿的基因型)。在一个实施方式中，预期等位基因比率被定义为，在合并孕妇和胎儿的DNA中A等位基因的预期组分。对于母亲的基因型g_m和胎儿基因型g_c，预期的等位基因比率由式(1)给出，假设基因型也由等位基因比率表示。

r=fg_c+(1-f)g_m (1)

在SNP的观察包括在每一个出现的等位基因处映射读取的数目，n_a和n_b加和后成为读取深度d。假设质量控制措施已应用于映射概率，则映射和等位基因观测可以被认为是正确的。用于检测似然性的一种简单模型是一个二项分布，该二项分布假定一每个d读取值为独立地从具有等位基因比r的大库中得到。公式2描述了这一模型。

P (n_{a}, n_{b} | r) = P_{bino} (n_{a}; n_{a} + n_{b}, r) = (\begin{matrix} n_{a} + n_{b} \\ n_{a} \end{matrix}) r^{n_{a}} {(1 - r)}^{n_{b}} - - - (2)

当孕妇和胎儿的基因型都是A或B，血浆中预期的等位基因比率是0或1，并且不能很好地定义P_bino。另外，因为在实践中有时会出现意想不到的等位基因，因此这是不可取的。许多方法可以扩展二项式模型。在一个实施方式中，有可能使用校正后的等位基因比率允许存在少量意想不到的等位基因。在一个实施方式中，出现在每个SNP的等位基因比率可以使用定型数据建模，并且使用这个模型纠正预期等位基因比。当预期等位基因比不是0或1时，由于扩增偏置或其他现象，观测到的等位基因比不能收敛到预期等位基因比。可以以预期等位基因比为中心，等位基因比作一个beta分步建模。形成P(n_a,n_b｜r)的beta-二项分布，这比二项式具有更高的方差。

可以定义一个在单个SNP响应的通用平台模型，定义为F(a，b，g_c，g_m，f)(3)，或者由观测到的n_a＝a和n_b=b的概率给出孕妇和胎儿的基因型，其仍取决于通过公式1给出的胎儿组分。

F(a,b，g_c，g_m，f)=P(n_a=a，n_b=b｜g_c，g_m，f) (3)

应注意，通过调节函数g_c，g_m和f等，使用(1)中定义的r和(2)中例举的二项式，简化公式(3)是可行的。然后可以写为F的公式

F(a,b，g_c，g_m，f)=P(n_a=a，n_b=b｜g_c，g_m，f)=P(n_a=a，n_b=b｜r(g_c，g_m，f)) (4)

一般情况下，F函数形式可以是二项式分布，beta-二项分布，多元Póya分布，从训练数据估计的经验分布，或如上所讨论的类似功能的分布。在一个实施方式中，F函数的不同形式取决于在问题染色体上的拷贝数的假设。

胎儿组分的计算方法

确定存在于混合组分DNA中胎儿DNA组分可能是任何非侵入性产前亲子鉴定方法，倍体呼叫或等位基因呼叫的一个不可分割的一部分。在一些实施例中，混合样本中胎儿DNA组分是使用母亲的基因型数据，父亲的基因型数据，以及测定的含有孕妇和胎儿DNA的混合样本基因型数据确定的。在亲子鉴定的背景下，也在倍性呼叫情况下，在较小程度上，不知道父亲的身份，因此胎儿的亲生父亲的基因型数据可能无法使用。在这种情况下，不需要胎儿的亲生父亲的基因型就能测定胎儿组分的方法就显得重要了。通过此处所述的一些方法完成对胎儿组分的估计。不论亲生父亲的基因型可得或不可得，这些方法中描述的都是一种通用的可用方法。

对于一个特定的染色体，假设我们正在寻找N个SNP，我们有以下数据：

·一组NR血浆序列测量数据S＝(S₁，...，S_NR)。在一个实施方式中，我们还有为每个SNP的等位基因A和B的(A，B)计数，s可表示为s＝((a₁，b₁)，...，(a_N，b_N))，其中a_i是SNPi上的a数量，b_i是SNPi上的b数量，并且

∑_i＝1:N(a_i+b_i)＝NR

·父母数据由以下内容组成：

基因型信息：母亲G_m＝(G_m1，...，G_mN)，父亲G_f＝(G_f1，...，G_fN)，其中G_mi，G_fi∈(AA，AB，BB)；和/或

序列数据的测量值：NRM母亲测量值s_m＝(s_m1，...，s_mnr)，NRM父亲测量值S_f＝(S_f1，...，S_fnr)。如果我们有为每个SNP的(A，B)计数S_m＝((a_m1，b_m1)，...，(a_mN，b_mN))，S_f＝((a_f1，b_f1)，...，(a_fN，b_fN))，则可类似上述简化。

总的来说，母亲，父亲，胎儿的数据可以表示为D＝(G_m，G_f，S_m，S_f，S)。在一个实施方式中，来自父母双方的基因型数据可供使用；在一个实施方式中，只有来自父亲的基因型数据可供使用；在一个实施方式中，来自父母双方的基因型数据都不可使用；在一些实施例中，母亲的基因型数据可能从混合样本中的基因型测得数据推断，应注意，在一般情况下，父母数据是可取的并增加了算法的准确性，但不是必需的。

胎儿组分估算

是预期胎儿组分，由以下数据获得：

\hat{f} = E (cfr | D) = &Integral; f * P (f | D) df

在一个实施方式中，人们可以划分可能的胎儿组分区间到细间隔点的一组C，在每个点执行计算，上述方程简化为：

\hat{f} = E (f | D) = \underset{f &Element; C}{Σ} f * P (f | D)

P(f|D)是给定数据D的特定胎儿组分f的似然性，使用贝叶斯法则，人们可能会进一步得到：

P(f|D)～P(D|f)*P(f)

其中P(f)是特定胎儿组分的先验权重。在一个实施方式中，其可能来自未知的先验权重(均量)，并可能与在集合C中候选胎儿组分之间的间距成正比。

P(D|cfr)是由特定胎儿组分给定数据的似然似然性，由有关染色体特定的拷贝数假设下得出。在一个实施方式中，我们假设使用的染色体为二倍体。所有SNP位点上的数据的似然似然性由各个个体SNP的数据似然似然性得出。

P (D | f) = P (D | f, H) = \underset{i}{Π} P (D | f, H, i)

其中i表示一个特定的SNP，即SNPi

P (D | f, H, i) = \underset{g_{m}, g_{f}, g_{c}}{Σ} P (D | g_{m}, g_{f}, g_{c}, f, H, i) * P (g_{c} | g_{m}, g_{f}, H) * P (g_{m} | i) * P (g_{f} | i)

其中g_m是可能的真正母亲基因型，g_f是可能的真正父亲基因型，g_c是可能的胎儿基因型，并且g_m，g_f，g_c∈{AA，AB，BB}

P(g_m|i)是基于表示为pA_i的SNPi的已知群体频率在母亲基因型SNP i上g_m的一般先验概率，特别是：

p(AA|pA_i)＝(pA_i)²，p(AB|pA_i)＝2(pA_i)*(1-pA_i)，p(BB|pA_i)＝(1-pA_i)²，

同理，p(f|i)是父亲基因型概率。

令P(g_c|g_m，g_f，H)表示为该真实儿童基因型的概率＝c，给定父母m，f，我们可以很容易的计算得出假定假设H，例如，对一个二倍体：

parents P(c|m，f，disomy)

令P(D|g_m，g_f，g_c，H，i，f)为在SNPi给定数据D的概率，给出真正母亲基因型m，真正父亲基因型f，真正胎儿基因型c，拷贝数的假设H和胎儿组分f，可以分解成母亲、父亲和胎儿数据的概率如下：

对比在SNPi上母亲illumina基因型数据g_mi的概率与真正基因型g_m，假设illumina基因型正确，可以简化成：

P (G_{m} | g_{m}, i) = \{\begin{matrix} 1 & g_{mi} = g_{m} \\ 0 & g_{mi} &NotEqual; g_{m} \end{matrix}

在一个实施方式中，在S_mi＝(am_i，bm_i)的计数情况下，没有额外的噪音或偏差，SNPi上母亲序列数据的概率是解释为P(S_m|，i)＝P_X|m(am_i)的二项式概率，其中X|m～Binom(p_m(A)，am_i+bm_i)，其中(p_m(A)定义为：

m AA AB BB A B no

call

p(A) 1 0.5 0 1 0 0.5

类似的公式适用于父亲的概率。

应当注意，没有父母数据仍可能获得结果，尤其是在没有父亲数据的情况下。例如，如果没有可用的父亲基因型数据F，我们可以令P(G_f|g_f，i)＝1。如果没有可用的父亲序列数据S_f，我们可以令P(S_f|g_f，i)＝1。在一个实施方式中，来自染色体的信息是使用平均数，加权平均法或类似的功能经过汇总整理的。

另一个胎儿组分计算方法

这里介绍了另一种确定在混合DNA中胎儿DNA组分的方法，在一个实施方式中，为了亲子鉴定，倍性测定或为其他目的，一个版本的最大似然估计可以不使用父亲信息得到胎儿组分f。定义S₀为具有母亲基因型0(AA)的一组SNP，S_0.5为具有母亲基因型0.5(AB)的一组SNP，并且S₁为具有母亲基因型1(BB)的一组SNP。可能的胎儿基因型在S0时是0和0.5，得到的一组可能的等位基因比率

R_{0} (f) = {0, \frac{f}{2}} .

类以的，

R_{0} (f) = {0, \frac{f}{2}} .,

和

R_{1} (f) =

{1 - \frac{f}{2}, 1} .

可以使用集合S₀，S_0.5和S₁的所有或任何子集，得出胎儿组分估算。

定义N_a0和N_b0作为在SNP的S₀上由序列计数形成的向量，同理，N_a0.5和N_b0.5对应S_0.5，N_a1和N_b1对应S₁，使用所有母亲基因型组，f的最大似然估计定义为公式4。

\hat{f} = {\arg \max}_{f} P (N_{a 0}, N_{b 0} | f) P (N_{a 0.5}, N_{b 0.5} | f) P (N_{a 1}, N_{b 1} | f) - - - (4)

假设在每个SNP等位基因数是独立于SNP血浆等位基因比，该概率可以表示为每组SNP的结果：

P (N_{a 0}, N_{b 0} | f) = Π_{s &Element; S_{0}} P (n_{as}, n_{bs} | f)

P (N_{a 1}, N_{b 1} | f) = Π_{s &Element; S_{1}} P (n_{as}, n_{bs} | f) - - - (5)

其中n_as，n_bs是SNPss的计数。对f的信赖是源于该组可能的等位基因比率R₀(f)，R_0.5(f)和R₁(f)。可以通过受制于F的最大似然基因型估计SNP的概率P(n_as，n_bs|f)。在相当高的胎儿组分和读取深度，最大似然基因型的选择将高度可信。例如，在胎儿组分为10和读取深度为1000时，考虑到母亲有一个SNP基因型0。预期等位基因比率为0％和5％，在足够高的读取深度，这将很容易分辨。将估计的胎儿基因型代入方程5，得到用于胎儿组分估算的完整方程(6)。

\hat{f} = \arg \max_{f} [\begin{matrix} Π_{s &Element; S_{0}} (\max_{r_{s} &Element; R_{0} (f)} P (n_{as}, n_{bs} | r_{s})) Π_{s &Element; S_{0.5}} (\max_{r_{s} &Element; R_{0.5} (f)} P (n_{as}, n_{bs} | r_{s})) \\ Π_{s &Element; S_{1}} (\max_{r_{s} &Element; R_{1} (f)} P (n_{as}, n_{bs} | r_{s})) \end{matrix}]

胎儿组分必须在[0，1]的范围内，通过约束一维搜索，可以很容易地实现最优化。

另一种方法是每一个SNP基因型上将可能的基因型求和，在S₀上一个SNP，得到下面关于P(n_a，n_b|f)的表达式(7)。先验概率P(r)可以假设对R₀(f)均匀，或者以群体频率为基础。对组S_0.5和S₁的扩展是不重要的

P (n_{a}, n_{b} | f) = Σ_{r &Element; R_{0} (f)} P (n_{a}, n_{b} | r) P (r) - - - (7)

推导的概率

从两个假说的数据似然性可以计算出置信，这两个假说是：H_tf即疑父是生父，H_wf即疑父不是生父。我们的目标是为每一个假说计算P(H|D)，即假说给定数据的似然性，并推断哪一个假说更有可能。在一个实施方式中，可以通过使用贝叶斯法则实现，P(H|D)～P(D|H)*P(H)其中，P(H)是该假说的先验权重，并且P(D|H)是假说给定数据的似然性。

考虑P(D|H，f)，即对一个特定胎儿组分，假说给定数据的似然性。如果胎儿组分的分布可得，有可能得出：

P(D|H)＝∫P(D，f|H)df

并且

P(D|H)＝∫P(D|H，f)P(f|H)df

注意到P(f|H)是独立于所述假说即P(f|H)＝P(f)，因此胎儿组分是一样的，不管疑父是否是生父。任何合理的先验P(f)都可选择，例如，一个胎儿组分从0到50％的统一先验。在一个实施方式中，它可以使用只有一个胎儿组分

在这种情况下，

P (D | H) = P (D | H, \hat{f})

考虑到似然性P(D|H，f)，基于此响应模型，预估的胎儿组分，母亲的基因型，疑父的基因型，等位基因群体频率，血浆等位基因计数及SNP，可以得到每一个假说的似然性。设D表示如前定义的数据。

在一个实施方式中，假定每个SNP观察是独立的，受制于血浆等位基因比率，因此，亲子鉴定假设的似然性是在SNP上假设的结果。

P (D | H, f) = \underset{SNPsi}{Π} P (D | H, f, i)

下面的公式描述了如何获得单个SNP i的似然性和单个胎儿的组分f。公式8是任何假设H似然性的一般表达式。其可以被分解成具体情况下的H_tf和H_wf。注意到基因型g_m，g_tf，，g_df和g_c，取值在{AA，AB，BB}之间，相当于{0，0.5，1}，其中，AA＝0，AB＝0.5，BB＝1，同时，g_tf表示真正父亲的基因型，g_df表示由父亲数据推导出地基因型，同理H_tf，g_tf和g_df表示相应意义。

P(D|f，H，i)＝Σ_{gm，gtf，gdf，gc∈{0，0.5，1}}P(D|g_m，g_df，g_c，f，H，i)*P(g_c|g_m，g_tf，H)*P(g_m|i)*Pgtfi P（gdf/i) (8)

在假说H_tf，情况下，所述疑父是生父，并且胎儿基因型继承自母亲的基因型和疑父的基因型，上式可化简为：

P (D | f, H = H_{tf}, i)

= \underset{g_{m}, g_{tf}, g_{c} &Element; {0,0.5,1}}{Σ} P (D | g_{m}, g_{tf}, g_{c}, f, H = H_{tf}, i) * (g_{c} | g_{m}, g_{tf}, H = H_{tf})

* P (g_{m} | i) * P (g_{tf} | i)

进一步的，

P(g_c|g_m，g_tf，H＝H_tf)＝P(g_c|g_m，g_tf)

而且

P(D|g_m，g_tf，g_c，f，H＝H_tf，i)＝

在假说H_wf，情况下，所述疑父不是生父，我们可以使用每一个SNP上的群体频率得出估计的真实父亲基因型，因此，胎儿的基因型概率可以由已知的母亲基因型和群体频率确定，即数据对亲生父亲的基因型数据并不提供额外的信息，在这种情况下，上面的公式不能进一步化简，仍为

P (D | f, H = H_{wf}, i)

= \underset{g_{m}, g_{tf}, g_{df}, g_{c} &Element; {0,0.5,1}}{Σ} P (D | g_{m}, g_{df}, g_{c}, f, H = H_{wf}, i)

* P (g_{c} | g_{m}, g_{tf}, H = H_{wf}) * P (g_{m} | i) * P (g_{tf} | i) * P (g_{df} | i)

而且，

P(g_c|g_m，g_tf，H＝H_wf)＝P(g_c|g_m，g_tf)

其中，对g_tf的唯一信息是群体先验，并且

P(D|g_m，g_tf，g_c，f，H＝H_wf，i)＝

在以上两个似然性的表达式中，P(D|f，H，i)也即两个假说，相应模型P(s|g_m，g_df，g_c，f，H)是通用的。在文献中其它地方提到的具体的实例是在通用平台模型基础上讨论的。相应模型的一些例子包括二项分布，beta-二项式分布，多元Póya分布，从训练数据中估计的经验分布，或者具有以上讨论的类似功能。

在一些实施例中，正确的亲子置信C_p可以由P(D|H_tf)和P(D|H_wf)计算得出。在一个实施方式中，这种计算可以使用贝叶斯规则计算如下：

C_{p} = \frac{P (D | H_{tf}) P (H_{tf})}{P (D | H_{tf}) P (H_{tf}) + P (D | H_{wf}) P (H_{wf})}

或者一个更具体的情况下，作为两个似然性所有SNP的结论：

C_{p} = \frac{Π_{i} P (D | H_{tf}, G_{ms}, G_{tf}, f)}{Π_{s} P (n_{as}, n_{bs} | H_{t}, G_{ms}, G_{tf}, f) + Π_{s} P (n_{as}, n_{bs} | H_{f}, G_{ms}, G_{tf}, f)}

在另一个实施例中，置信可以由下式计算：

C_{p} = \frac{P (D | H_{tf})}{P (D | H_{tf}) + P (D | H_{wf})}

其他合理功能的似然性也是可行的。

实施例

实施例1

登记了21名孕龄在6到21周，具有确定的亲子关系的怀孕妇女。作为我们被IRB批准的研究计划的一部分，参与者自愿捐献血液，以及从IVF中心，OB办公室，和位于美国不同地点的，从母亲的血浆中分离的无细胞DNA(ffDNA)中分离出的普通人群中提取参与者，随同母亲和疑父的DNA一起，使用SNP芯片进行放大，测定。通过对比每一个疑父和一组超过5,000个无亲属关系的个体产生的参考分布，使用信息学方法，为21个确定的父亲和36,400个非父亲排除或确定亲子关系。在21个样本中，20个样本有充足的胎儿DNA用来返回结果。在20例确定的亲子关系中有20例是正确的(100％)。在36,382例排除亲子关系中有36,382例是正确的(100％)，因为中间遗传相似性，有18例无响应。实验没有发现错误。

人群是由为产检捐献血液的夫妇组成。妇女必须是单胎妊娠，处于孕初期或孕中期，并具有确定的亲子关系。使用无细胞采血管(STRECK)从妇女身上采集含有白血球防腐剂的血液样本，从父亲身上采集遗传样本，可以是血液(EDTA)或口腔样本。所有参与者签署知情同意书，并从在IRB认可的研究中登记的病人身上采集遗传样本。

母亲的血液使用离心法，分离出血沉棕黄层和血清，将母亲和疑父的血沉棕黄层中的基因组DNA和在母亲血清中的基因组DNA准备好，使用标准方案，在ILLUMINA INFINIUM CYT012SNP芯片上分析上述基因组DNA。简单地说，使用0IAGENCIRCULATING NUCLEIC ACID试剂盒分离血清DNA，根据厂商说明书，在45ul缓冲液中洗脱。20微升洗脱液在1x NEB4缓冲液，0.42mM dNTP及2.5U T4DNA聚合酶(NEW ENGLANDBIOLABS)的条件下进行钝结束反应，在20C培养30分钟，然后再在75C培养15分钟。3微升连接混合物(0.5ul10xNEB4，1ul10mM ATP，1ul T4聚核苷酸激酶(NEW ENGLANDBIOLABS)，0.5ul T4DNA连接酶(NEW ENGLAND BIOLABS))加入到样本中，将样本在16C培养24小时，然后在75C孵育15分钟，将样本与母亲和疑父基因组DNA一起转移到标准ILLUMINA INFINIUM中分析。总之，片段化和沉淀后，在37C对24ul DNA进行全基因组扩增20-24小时，沉淀物在杂交缓冲液中再悬浮，热变性，使用TECAN EVO将其转移到细胞色素氧化酶12SNP芯片中，芯片在48C至少孵育16小时，X-染色(INFINIUM II CHEMISTRY)，并在TECAN EVO中洗脱，最后扫描。使用BEADSTIDUO(ILLUMINA)提取阵列强度。

所公布的信息学方法产生一个胎儿与另一个体量化的基因相似性水平的检验统计量。估算出疑父和一组超过5,000个无亲属关系的个体的检验统计量。单假设抑制测试决定疑父的统计计算是否可以从无亲属关系的参照个体组成的分布中被排除，如果该疑父可以从无亲属关系的组中被排除，则产生亲子关系包含，否则，亲子关系被排除。在具有足够DNA的20例样本中，亲子测定结果是有20例准确的父亲，以及1820随机选择的不准确父亲

当疑父检验统计量的p-值在无亲属关系的个体分布中低于10^-4时，结论显示亲子关系包含。这意味着，理论上，10000的无亲属关系的个体中预计将有不超过1个对胎儿显示尽可能多的遗传相似性，当p-值在10^-4和0.02之间时，即得出“无结论”的结论。当血浆中胎儿DNA不足2％时，将会出现“不充分胎儿DNA”的结论。这组无亲属关系的个体用来生成各种各样种族背景个体组成的预期分布。然后，用多组不同种族的无亲属关系的个体，包括疑父的种族在内，重新估计该亲子关系包含或者亲子关系排除的准确性。用这种算法，不需要人工干预，这种包含和排除结果将自动生成。

总之，测试了具有确定亲子关系的21个孕妇外周血液样本品，21例中的20例得出结果，另一例无充足胎儿DNA用于分析，该例是样本是从孕周为8周的孕妇体内获取的。20例中有20个样本(100％)结果显示正确的亲子确认关系，每一例均具有小于10^-4的p-值，20例具有足够的胎儿组分的样本中，均相对于随机的一组1820非父亲进行测定，对全部36400个体亲子测定结果分析显示，36382个分析返回了结果。36382例中有36382(100％)具有大于10^-4的p-值，正确的显示亲子排除关系。36,400例中有18例(0.05％)，得出“无结论”的结论，其p-值在10^-4和0.02之间。没有出现不正确的亲子排除或亲子包含结论。

由于在IVF受精后，通过植入前遗传学诊断的可控受精，确认正确的亲子关系，21例中的9例具有确定的亲子关系。在DNA诊断中心(DNA Diagnostic Center，Fairfield，Ohio)的主导下，通过对胎儿/儿童基因组DNA进行独立的亲子测定，20例样本确认了亲子关系。

实施例2

在一个实施方式中，4个母亲血浆样本使用一个偏嵌套9600丛协议扩增制备，这些样本通过以下方法制备：将15到40mL孕妇外周血离心分离出血沉棕黄层和血浆，从血沉棕黄层制备母亲基因组DNA，从血液样本或唾液样中制备父亲DNA。按照厂商说明，使用QIAGEN CIRCULATING NUCLEIC ACID kit试剂盒分离出母亲血浆中的无细胞DNA，并在45uL TE缓冲液中洗脱。通用连接适配子添加到35uL纯化血浆每一个DNA分子的最后，和文库一起，使用适配子特异引物，循环扩增7次，使用AGENCOURT AMPURE微珠纯化文库并在50 ulwater中洗脱。

使用14.5nM引物浓度的9600定向特异性标记反向引物和500nM文库适配子特异性正向引物，3ul DNA STA循环扩增15次(95℃初始聚合酶活化10分钟，，进行15次以下的循环扩增，分别为95℃，30s；72℃10s；65℃1分钟；60℃8分钟；65℃3分钟及72℃30s；最后72℃延伸2分钟)。

偏嵌套PCR protocol还包含一个第二次扩增，使用浓度为1000 nM的反向标记，和浓度为16.6unM的9600定向特异性正向引物，将第一次的STAs产物稀释后做STA循环扩增15次((95℃初始聚合酶活化10分钟，进行15次以下的循环扩增，分别为95℃30s；65℃1分钟；60℃5分钟；65℃5分钟以及72℃30s；最后72℃延伸2分钟)

一份STA产物随后用标准PCR循环扩增10次，使用1uM标签特异性正向引物和条码反向引物，产生条码标记的序列文库，不同的文库用不同条码标记，离心柱纯化，然后每一个文库选取一份混合在一起。

用这种方法，9600个引物用于单井反应，这些引物依据1号，2号，13号，18号，21号，X和Y染色体的目的SNPs设计。随后用ILLUMINA GAIIX测序仪对扩增子测序，测序仪对每份样本大约产生390万次读取，约370万次读取(94％)绘出基因组，其中290万次读取(74％)绘出定向SNPs，平均水平为344次读取，中值为255.，这四份样本的胎儿组分分别为9.9％，18.9％，16.3％和21.2％。

相关母亲和父亲的基因组DNA样本使用半嵌套9600丛协议扩增并测序。与前次不同，在7.3nM的第一次STA中，这个半嵌套协议使用9600外正向引物和标签标记反向引物，但热循环条件和第二次STA组成，条码化PCR与偏嵌套协议是相同的。

使用在此公开的信息学方法分析序列数据，对于每一个孕育的胎儿，从参照组中的每10个无亲属关系的男性组成一组，被确定为不是胎儿的生父。

实施例3

在一个实施方式中，使用一个l200丛半嵌套协议扩增45组细胞，测序，在3个染色体上倍体测定。应注意到，这个实验意味着，模拟对孕妇外周血中获得的单胎细胞，或者从已有儿童获得的法医样本少量DNA进行的亲子确定条件。15个个体单细胞和30组3细胞置于45个单反应管中，共45个反应，每一个反应含有一个细胞系的细胞，不同的反应包含的细胞是从不同细胞系获得的。这些细胞置于5ul洗涤缓冲液中，加入5ulARCTURUS PICOPURE裂解缓冲液(APPLIED BIOSYSTEMS)裂解，并在56℃孵育20分钟，95℃孵育10分钟

使用引物浓度为50nM的1200定向特异性正向引物和标签标记的反向引物，单/3细胞的DNA经STA循环扩增25次(95℃初始聚合酶活化10分钟，进行25次以下的循环扩增：95℃30s；72℃10s；65℃1分钟；60℃8分钟；65℃3分钟和72℃30s；最后72℃延伸2分钟)。

半嵌套PCR包括三个平行第二阶段扩增，使用浓度为1000nM的反向标签特异性引物，及浓度为60nM的400个目标特异性嵌套正向引物，将第一次STAs产物的稀释液再STA循环扩增20次(95℃初始聚合酶活化10分钟，进行15次以下的循环扩增：95℃30s；65℃1分钟；60℃5分钟；65℃5分钟以及72℃30s；最后72℃延伸2分钟)。因此，在三个平行的400-丛反应中，第一次STA时，总共l200目标被扩增。

一份STA产物随后用标准PCR循环扩增15次，使用1uM标签特异性正向引物和条码反向引物，产生条码标记的序列文库，不同的文库用不同条码标记，离心柱纯化，然后每一个文库选取一份混合在一起。

用这种方法，1200个引物用于单井反应，这些引物依据1号，21号和X染色体的目的SNPs设计。随后用ILLUMINA GAIIX测序仪对扩增子测序，测序仪对每份样本大约产生390万次读取，约50-80万次读取(每份样本有74％到94％读取)绘出基因组。

从细胞系中获取的相关母亲和父亲的基因组DNA样本，使用同样的半嵌套l200丛分析池，，用较少的循环，同样的协议，和1200丛第二次STA分析，并测序。

使用在此公开的信息学方法分析序列数据，对于每一组45个细胞的目标个体，从参照组中的每10个无亲属关系的男性组成一组，被确定为不是目标个体的生父。

孕妇外周血中先前妊娠的儿童DNA

非侵入性亲子测定的一个难题是区分目前妊娠胎儿细胞和先前妊娠胎儿细胞。有人认为，一段时间以后，先前妊娠的遗传物质会消失，但是还没有决定性的证据予以证明。在本发明的一个实施例中，使用PARENTAL SUPPORT^TM(PS)方法，和对父亲基因组的认识，有可能确定在孕妇外周血中胎儿DNA的父系本源(即胎儿DNA遗传自父亲)。这个方法使用阶段性亲本遗传信息。使用祖父母的遗传数据(例如用祖父的精子测定的遗传数据)，其他已出生儿童，或流产的样本的遗传数据，从未定相的基因型信息中可能将亲本基因型定相。也可以通过基于单体型图定相法和父亲细胞单体型分析对未定相基因信息定相。当染色体紧密捆绑时，使用微流体技术，将不同染色体置于不同的孔中，在有丝分裂阶段，捕获细胞，可以成功地演示单体型分析。在另一个实施例中，使用分阶段的亲本单体型数据，测定来自父亲的一个以上的同系物。意味着血液中存在着的来自一个以上的儿童的遗传物质。通过关注于胎儿预期的染色体整倍体，人们可以排除胎儿患有三染色体的似然性，也可以确定胎儿DNA是否来源于目前的父亲，也可以使用其他方法，如三重测试来预测遗传异常。

除抽血外，可以存在其它方法，以获得胎儿遗传材料。孕妇外周血中胎儿的遗传物质，主要分为两类：(1)全胎儿细胞，比如，有核胎儿红血细胞或红细胞，以及(2)自由浮动的胎儿DNA。在全胎儿细胞情况下，有证据证明，胎儿细胞可以在孕妇外周血中保持相当长的一个时期，因此，可以从孕妇体内分离出含有以前妊娠的儿童或胎儿的DNA的细胞。也有证据证明，在几周内，自由浮动的胎儿DNA将会在系统内被清除。面临的挑战之一是，其遗传材料包含在所述细胞中，如何确定所述个体的身份，换句话说，确保测得的遗传材料不是以前怀孕的胎儿的遗传材料。在本发明的一个实施例中，对母亲遗传材料的认识可以被用来确保问题遗传物质是不是母亲遗传物质。有很多种方法可以达到这个目的，包括信息学方法，如本文件中或本文件引用的专利描述的PARENTAL SUPPORT^TM。

在本发明的一个实施例中，从怀孕母亲体内抽取的血液可以被分离成含有自由浮动的胎儿DNA的部分，和含有有核胎儿红血细胞的部分。可以随意的富集自由浮动的DNA，并且可以测定此DNA的基因型信息。从测定的此DNA的基因型信息，母本基因型的知识可以用于确定胎儿基因型的方面。这些方面可能包括倍性状态，和/或一组等位基因的身份。此外，使用本文件其他地方或其他引用的专利尤其是本文件中提到的专利所描述的方法，推测个体有核细胞起源上可能的胎儿基因分型。母本基因组的知识将允许人们确定任何给定的单一血液细胞是否遗传自母亲。上面描述的确定的胎儿基因型的方面将允许人们确定单个血细胞的基因是否来自于目前妊娠胎儿。本质上，本发明的这方面允许人们使用母亲的遗传知识，和其他相关人的遗传信息，例如父亲，和孕妇外周血中自由浮动的胎儿DNA测定的遗传信息一起，确定孕妇外周血中分离的有核细胞是否是(a)遗传自母亲，(b)遗传自当前妊娠的胎儿，或(c)遗传自以前妊娠的胎儿。

所有专利、专利申请和公开的参考文献在此并入作为参考，可以理解的是，几个公开的上述和其它特征和功能或其替代物可以组合为许多其他不同的系统或应用，本领域技术人员可能做出各种当前无法预料的替换、修改、变化或改进，它们也包含在以下的权利要求书中。

Claims

1.一种用于确定疑父是否是胎儿的生父的方法，其中所述胎儿是怀孕母亲正在孕育的胎儿，该方法包括：

由疑父获得的遗传物质；

由怀孕母亲获得的血液样本；

对由疑父获得的遗传物质在多个多态性位点进行基因型测定；

对由怀孕母亲获得的遗传物质在多个多态性位点进行基因型测定；

对由怀孕母亲的血液样本中得到的DNA混合样本进行基因型测量，其中该DNA混合样本中含有胎儿的DNA及其母亲的DNA；

在计算机上对疑父是孕妇所孕育的胎儿生父的概率进行确定，通过使用由疑父的DNA得到的基因型测量结果、由怀孕母亲得到的基因型测量结果，以及DNA混合样本的基因型测量结果；并且

通过确定的疑父是胎儿生父的概率来确定该疑父是否是胎儿的生父。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，该多态性位点包括单核苷酸多态性(SNPs)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，该DNA混合样本包括来自血液样本的血浆部分中自由浮动DNA的DNA,其中所述的血液样本来自怀孕母亲。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，该DNA混合样本包括母亲全血或者母亲血液中含有有核细胞的部分。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，该母亲血液中含有有核细胞的部分已经富集了胚胎细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其中测定包括包括：

计算疑父和胎儿的检验统计量，其中所述检验统计量显示疑父与胎儿遗传相似性的程度，并且其中所述检验统计量是基于疑父的DNA基因型测量结果、DNA混合样本基因型测量结果、以及怀孕母亲的DNA基因型测量结果；

计算多个与胎儿遗传无亲属关系的个体的检验统计量的分布，其中每个计算的检验统计量都显示了与胎儿无亲属关系的多个个体中的一个无亲属关系的个体与胎儿之间的基因相似性程度，其中该检验统计量基于无亲属关系个体的DNA基因型测量结果，DNA混合样本基因型测量结果，以及由怀孕母亲的DNA得到的基因型测量结果

计算疑父和胎儿进行计算的检验统计量是对多个无亲属关系的个体和胎儿进行计算的检验统计量分布的部分概率；并且

使用疑父和胎儿进行计算的检验统计量是针对多个无亲属关系的个体和胎儿进行计算的检验统计量分布的部分的概率，来测定疑父是胎儿生父的概率。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，确认一个疑父是否是所述胎儿的生父包括：

如果疑父是所述胎儿生父的概率高于一个阈值上限时，通过排除疑父与所述胎儿无亲属关系的的假设来确定疑父是胎儿生父；

如果疑父是所述胎儿生父的概率低于一个阈值下限时，通过不排除疑父与所述胎儿无亲属关系的的假设来确定疑父不是胎儿生父；

如果似然性在所述阈值下限和阈值上限之间，或者如果该似然性不确定具有足够高的置信度时，不能确定所述疑父是否是胎儿的生父。

8.根据权利要求1所述的方法，其中确定疑父是胎儿生父的概率包括：

获取多个多态性位点中每个位点的等位基因群体频率；

创建一个DNA混合样本中胎儿DNA可能组分的分区，该分区的范围是从胎儿组分的下限到胎儿组分的上线；

根据母亲DNA基因型测量结果，疑父DNA基因型测量结果，DNA混合样本基因型测量结果，针对在分区中每个可能胎儿组分计算疑父是胎儿生父的概率；

通过结合计算的该分区中的每一个可能胎儿组分的该疑父是该胎儿生父的概率，计算出所述疑父是所述胎儿生父的概率；

根据母亲的DNA基因型测量结果，DNA混合样本基因型测量结果，获取的等位基因群体频率，针对在分区中的每个可能胎儿组分计算疑父不是胎儿生父的概率；

通过结合所计算的该分区中每个可能胎儿组分的疑父不是胎儿生父的概率，来确定所述疑父不是所述胎儿生父的概率。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，对所述疑父是所述胎儿生父的概率进行计算和对所述疑父不是所述胎儿生父的概率进行计算包括：

针对每个多态性位点，对应用了平台响应模型的一个特定位点检测到的序列数据似然性、一个或多个可能胎儿组分分区中的组分，母亲的多个等位基因比，疑父的多个等位基因比，以及胎儿的多个等位基因比进行计算；

通过结合分区中所有胎儿组分，多态性位点集合中母亲等位基因比，多态性位点集合中疑父等位基因比，以及多态性位点集合中胎儿等位基因比的每个多态性位点所检测的序列数据的似然性，来计算疑父是胎儿生父的似然性；

通过结合分区中所有胎儿组分，多态性位点集合中母亲等位基因比，多态性位点集合中群体频率等位基因比，以及多态性位点集合中胎儿等位基因比的每个多态性位点所检测的序列数据的似然性，来计算疑父是胎儿生父的似然性；

根据疑父是生父的似然性来计算疑父是生父的概率；以及

根据疑父不是生父的似然性来计算疑父不是生父的概率。

10.根据权利要求8所述的方法，其中，根据疑父是生父的似然性来计算该疑父是生父的概率，是通过使用最大似然法或者最大后验技术来进行的。

11.根据权利要求8所述的方法，其中确定疑父是否是胎儿的生父包括：

如果所计算的疑父是胎儿生父的概率明显高于所计算的疑父不是胎儿生父的概率，那么确定疑父是胎儿的生父；或者

如果所计算的疑父不是胎儿生父的概率明显高于所计算的疑父是胎儿生父的概率，则确定疑父不是胎儿的生父。

12.根据权利要求8所述的方法，其中多态性位点对应于具有形成双体高似然性染色体。

13.根据权利要求8所述的方法，其中胎儿DNA的可能组分分区仅包括一个胎儿组分，并且所述胎儿组分是通过一种技术来确定的，其中所述的技术选自由定量PCR，数字PCR,定向PCR，环形探针，其他DNA扩增方法，杂交探针捕获技术，其他优先富集方法，SNP微阵列，DNA微列阵，测序法，其他测量多态性等位基因技术，其他测量非多态性等位基因技术，测量存在于父亲基因组中但不存在于母亲基因组中的多态性等位基因技术，测量存在于父亲基因组中但不存在于母亲基因组中的非多态性等位基因技术，测量Y染色体特有等位基因技术，将父系遗传等位基因测得量与母系遗传等位基因测得量进行比较的技术，最大似然法，最大后验技术，及其结合所组成的组中。

14.根据权利要求1所述的方法，其中可能的胎儿组分分区仅包括一个胎儿组分，并且其中所述胎儿组分是通过应用权利要求26所述的方法来进行确定的。

15.根据权利要求1所述的方法，其中疑父的遗传物质是从一种组织中获得的，其中所述的组织选自：血液，体细胞组织，精子，头发，口腔样本，皮肤，其他法医样本，及其组合。

16.根据权利要求1所述的方法，其中置信度被计算用于确定该疑父是否是胎儿的生父。

17.根据权利要求1所述的方法，其中DNA混合样本中的胎儿DNA组分已经通过使用选自由尺寸筛选、通用的连接介导PCR、短延长时间PCR、其他富集方法、及其组合所构成的组中的方法进行富集。

18.根据权利要求1所述的方法，其中获得怀孕母亲的遗传物质的基因型测量值包括在来自怀孕母亲的遗传物质样本上进行进行基因型测量，其中怀孕母亲基本上由母系遗传物质所组成。

19.根据权利要求1所述的方法，其中获得怀孕母亲的遗传物质的基因型测量值包括：

推断来自在DNA混合样本上进行基因型测量的基因型测量值可能是来自怀孕母亲的遗传物质；并且

使用这些基因型测量值作为获得的基因型测量值，其中所述基因型测量值推测是来自于母亲的遗传物质。

20.根据权利要求1所述的方法，进一步包括根据确定的亲子鉴定来做的临床决策。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述临床决策是用于终止妊娠。

22.根据权利要求1所述的方法，其中基因型测量是通过对遗传物质使用一种方法或者技术进行测量的，其中所述的方法或者技术选自由锁式探针，分子反向探针，其他环形探针，基因型微阵列，SNP基因型分析，芯片微阵列，微珠微阵列，其他SNP微阵列，其他基因分型方法，Sanger DNA测序，焦磷酸测序，高通量测序，使用环形探针定向测序，使用杂交探针捕获定向测序，可逆染料终止子测序，连接测序，杂交测序，其他DNA测序方法，其他高通量基因分型平台，荧光原位杂交法(FISH)，比较基因组杂交法(CGH)，CGH列阵，及其多个或其结合所组成的组中。

23.根据权利要求1所述的方法，其中对事先扩增和/或优先富集的遗传物质进行基因型测量，使用选自以下组中的方法或技术做扩增和/或优先富集，其中所述方法或技术选自由聚合酶链式反应(PCR)，连接介导PCR，简并寡核苷酸引物PCR，定向扩增PCR，mini-PCR，通用PCR扩增，多重置换扩增(MDA)，等位基因特异性PCR，等位基因特异性扩增技术，线性扩增法，在一种扩增方法之后的底物DNA连接，桥式扩增，锁式探针，环形探针，杂交探针捕获，及其结合所组成的组中。

24.根据权利要求1所述的方法，进一步包括生成包括确定胎儿亲子关系的报告。

25.一种报告，所述报告揭示了通过使用权利要求1所述的方法产生的确定的胎儿亲子关系。

26.一种用于检测DNA组分的方法，其中所述的DNA组分来自存在于DNA混合样本中的目标个体，其中所述DNA混合样本包括来自目标个体的DNA和来自第二个体的DNA，该方法包括：

测定来自DNA混合样本的多个多态性位点的基因型测量值；

获取来自第二个体的多个多态性位点基因型数据；和

通过使用DNA混合样本的基因型测量值、第二个体的基因型数据和概率估计技术，在计算机上确定混合样本中目标个体DNA组分。

27.根据权利要求26所述的方法，其中获得来自第二个体的基因型数据包括对基本上由第二个体DNA组成的DNA进行基因型测量。

28.根据权利要求26所述的方法，其中获得来自第二个体的基因型数据包括：

推断来自DNA混合样本的基因型测量值的基因型测量值可能是来自第二个体的遗传物质；以及

使用这些基因型测量值作为获取的基因型测量值，其中所述基因型测量值由来源于第二个体的遗传物质的DNA混合样本的基因型测量值推断的。

29.根据权利要求28所述的方法，其中推断相关个体的基因型数据进一步包括使用在位点上的等位基因群体概率。

30.根据权利要求26所述的方法，其中目标个体确定的DNA组分表现为DNA组分的概率。

31.根据权利要求26所述的方法，其中混合样本得到的基因型测量值包括对混合样本DNA测序获得的基因型测量值。

32.根据权利要求26所述的方法，其中在进行混合样本DNA基因型测量前，预先将混合样本中DNA在多个多态性位点优选的富集。

33.根据权利要求26所述的方法，其中，多态性位点包括单核苷酸多态性。

34.根据权利要求26所述的方法，其中确定所述组分进一步包括：

确定来自目标个体的多个DNA组分的概率，其中所述目标个体存在于DNA混合样本中；

通过对多个具有最大概率的组分进行选择来确定所述组分。

35.根据权利要求26所述的方法，其中对所述组分进行确定进一步包括：

确定来自目标个体的多个DNA组分的概率，其中所述目标个体存在于DNA混合样本；

应用最大似然技术来确定其最可能的组分；以及

通过选择确定为最可能的组分来确定所述组分。

36.根据权利要求26所述的方法，其中所述目标个体是怀孕母亲孕育的胎儿，并且所述第二个体是怀孕母亲。

37.根据权利要求36所述的方法，还包括：

使用一种平台模型，其中所述平台模型与在多态性位点测量的基因型数据有关；和

使用一种表格，其中所述表格是母亲基因型与子基因型相对应的。

38.根据权利要求36所述的方法，其中该测定方法还通过对来自测量胎儿父亲的DNA测量的多态性位点的基因型测量值。

39.根据权利要求36所述的方法，其中该方法没有使用来自胎儿父亲的基因型数据。

40.根据权利要求26所述的方法，其中该方法没有使用Y染色体上的位点。

41.一种报告，该报告用于揭示通过使用权利要求36所述的方法所检测的确定的胎儿亲子关系。

42.一种报告，该报告用于揭示通过使用权利要求36所述的方法所检测的胎儿倍性状态。