BR112013016193B1 - método ex vivo para determinar se um suposto pai é o pai biológico de um feto que está em gestação em uma gestante e relatório - Google Patents

Abstract

método ex vivo para determinar se um suposto pai é o pai biológico de um feto que está em gestação em uma gestante e relatório a presente invenção refere-se a métodos para testagem de paternidade pré-natal não invasivos são descritos aqui. o método usa medições genéticas feitas no plasma tirado de uma gestante, juntamente com medições genéticas do suposto pai e medições genéticas da mãe para determinar se ou o suposto pai é ou não o pai biológico do feto. isto é obtido por meio de um método informatizado que pode comparar a caracterização de perfil genético do dna fetal encontrado no plasma materno com a caracterização de perfil genético do suposto pai.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: MÉTODO EX VIVO PARA DETERMINAR SE UM SUPOSTO PAI É O PAI BIOLÓGICO DE UM FETO QUE ESTÁ EM GESTAÇÃO EM UMA GESTANTE E RELATÓRIO.

PEDIDOS RELACIONADOS [001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos Estados Unidos N° de Série 61/426.208, depositado em 22 de Dezembro de 2010 e o presente pedido é uma continuação em parte do Pedido de Utilidade dos Estados Unidos N° de Série 13/300.235, depositado em 18 de Novembro de 2011, o qual reivindica o benefício do Pedido Provisório dos Estados Unidos N° de Série 61/571, 248, depositado em 23 de Junho de 2011, Pedido Provisório dos Estados Unidos N° de Série 61/542.508, depositado 03 de Outubro de 2011 e é uma continuação em parte do Pedido de Utilidade dos Estados Unidos N° de Série 13/110.685, depositado em 18 de Maio de 2011, o qual reivindica o benefício do Pedido de Utilidade dos Estados Unidos N° de Série 61/395.850, depositado em 18 de Maio de 2010; Pedido Provisório dos Estados Unidos N° de Série 61/398.159, depositado em 21 de Junho de 2010; Pedido Provisório dos Estados Unidos N° de Série 61/462.972, depositado em 9 de Fevereiro de 2011, Pedido Provisório dos Estados Unidos N° de Série 61/448.547, depositado em 2 de Março de 2011; e Pedido Provisório dos Estados Unidos N° de Série 61/516.996, depositado em 12 de Abril de 2011 e a totalidade de todos estes Pedidos são aqui incorporadas por referência quanto aos ensinamentos dos mesmos. CAMPO [002] A presente invenção refere-se, de modo geral, a métodos para testagem de paternidade pré-natal não invasivos.

ANTECEDENTES [003] Parentesco incerto é um problema significativo e as

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2/116 estimativas variam entre 4% e 10% das crianças que acreditam que seu pai biológico seja um homem que não é seu pai biológico real. Em casos onde uma mulher está grávida, mas indivíduos relevantes não têm certeza de quem é o pai biológico, há várias opções para determinar o pai biológico correto do feto. Um método é esperar até o nascimento e realizar caracterização de perfil genético na criança e comparar a caracterização de perfil genético do genoma da criança com aquele do suposto pai. No entanto, a mãe sempre quer saber a identidade do pai biológico de seu feto pré-natalmente. Outro método consiste em realizar amostragem de vilosidade coriônica no primeiro trimestre ou amniocentese no segundo trimestre e usar o material genético retirado para realizar caracterização de perfil genético prénatalmente. No entanto, estes métodos são invasivos e apresentam um risco significativo de aborto.

[004] Recentemente, descobriu-se que DNA fetal isento de células (cfDNA) e células fetais intactas podem entrar na circulação sanguínea materna. Consequentemente, análise deste material genético fetal pode permitir Diagnóstico Genético Pré-Natal Não Invasivo Precoce (Non-lnvasive Prenatal Genetic Diagnosis - NIPGD ou NPD). Um dos principais desafios em realização de NIPGD em células fetais é a tarefa de identificação e extração de células fetais ou ácidos nucleicos de sangue da mãe. A concentração de células fetais no sangue materno depende da fase da gravidez e da condição do feto, mas estima-se que varie de 1-40 células fetais em cada mililitro de sangue materno ou menos de uma célula fetal por 100.000 células nucleadas maternas. Técnicas atuais são capazes de isolar pequenas quantidades de células fetais a partir de sangue materno, embora seja difícil enriquecer as células fetais até pureza em qualquer quantidade. A técnica mais eficaz neste contexto envolve o uso de anticorpos monoclonais, mas outras técnicas usadas para isolar células fetais

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3/116 incluem centrifugação de densidade, lise seletiva de eritrócitos adultos e FACS. Um desafio chave em realização de NIPGD sobre cfDNAfetal é que ele está, tipicamente, misturado com cfDNA materno e, assim, a análise de cfDNA é dificultada pela necessidade de considerar o sinal genotípico materno. Análise do DNA fetal foi demonstrada usando amplificação por PCR usando iniciadores que são concebidos para hibridizar com sequências que são específicas para os genes paternalmente herdados. Estas fontes de material genético fetal abrem a porta para técnicas diagnosticas pré-natal não invasivas.

[005] Uma vez que o DNA fetal tenha sido isolado, quer em estado puro ou em mistura, ele pode ser amplificado. Há uma série de métodos disponíveis para amplificação de todo o genoma (Whole Genome Amplification - WGA): PCR ligação-mediada (LigationMediated PCR - LM-PCR), PCR com iniciadores de oligonucleotídeo degenerativa (Degenerate Oligonucleotide Primer PCR - DOP-PCR) e amplificação por deslocamento múltiplo (Multiple Displacement Amplification - MDA). Há uma série de métodos disponíveis para amplificação objetivada, incluindo PCR e sondas de circularização, tais como MOLECULAR INVERSION PROBES (MIPs) e sondas PADLOCK. Há outros métodos que podem ser usados, de preferência para enriquecer DNA fetal, tal como separação por tamanho e sondas de captura híbridas.

[006] Há inúmeras dificuldades no uso de amplificação de DNA nestes contextos. Amplificação de DNA de uma única célula, DNA a partir de um pequeno número de células ou a partir de pequenas quantidades de DNA por PCR pode falhar completamente. Isso é, muitas vezes, em virtude de contaminação do DNA, perda da célula, seu DNA ou acessibilidade do DNA durante a reação de amplificação. Outras fontes de erro que podem surgir em medição do DNA fetal por amplificação e análise de microarranjo incluem erros de transcrição

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4/116 introduzidos pela DNA polimerase quando um dado nucleotídeo é incorretamente copiado durante PCR e erros de leitura em virtude de hibridização imperfeita sobre o arranjo. Outro problema é Allele DropOut (ADO), definido como a incapacidade de amplificar um dos dois alelos em uma célula heterozigótica.

[007] Há muitas técnicas as quais fornecem dados de genotipagem. Alguns exemplos incluem o seguinte. TAQMAN é uma tecnologia de genotipagem única produzida e distribuída pela LIFE TECHNOLOGY. TAQMAN usa reação em cadeia de polimerase (polymerase chain reaction - PCR) para amplificar sequências de interesse. 500K ARRAYS da AFFYMETRIX e o sistema INFINIUM da ILLUMINA são arranjos de genotipagem que detectam a presença de sequências de DNA específicas em um grande número de locais simultaneamente. HISEQe MISEQda ILLUMINAe ION TORRENTea plataforma SOLID da LIFE TECHNOLOGY permitem o sequenciamento direto de um grande número de sequências de DNA individuais.

SUMÁRIO [008] São descritos aqui métodos para determinação da paternidade de um feto em gestação de uma maneira não invasiva. De acordo com os aspectos ilustrados aqui, em uma modalidade, um método para estabelecer se um suposto pai é o pai biológico de um feto que está em gestação uma gestante inclui obtenção de material genético do suposto pai, obtenção de uma amostra de sangue da gestante, realização de medições genotípicas, em uma pluralidade de loci polimórficos, no material genético do suposto pai, obtenção de medições genotípicas, na pluralidade de loci polimórficos, a partir do material genético da gestante, realização de medições genotípicas em uma amostra de DNA mista originária da amostra de sangue da mulher grávida, onde a amostra de DNA mista compreende DNA fetal

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5/116 e DNA materno, determinação, em um computador, da probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico do feto em gestação da gestante usando as medições genotípicas feitas a partir do DNA do suposto pai, as medições genotípicas obtidas a partir da gestante e as medidas genotípicas feitas na amostra de DNA mista e estabelecer se o suposto pai é o pai biológico do feto usando a probabilidade determinada de que o suposto pai é o pai biológico do feto.

[009] Em uma modalidade, os loci polimórficos constituem polimorfismos de um único nucleotídeo. Em uma modalidade, a amostra de DNA mista compreende DNA que era de DNA de flutuação livre em uma fração plasmática da amostra de sangue da mulher grávida. Em uma modalidade, a amostra de DNA mista compreende sangue materno íntegro ou uma fração de sangue materno contendo células nucleadas. Em uma modalidade, a fração de sangue materno contendo células nucleadas foi enriquecida para células de origem fetal.

[0010] Em uma modalidade, a determinação se o suposto pai é o pai biológico inclui cálculo de uma estatística de teste para o suposto pai e o feto, em que a estatística de teste indica um grau de similaridade genética entre o suposto pai e o feto e em que a estatística de teste se baseia nas medições genotípicas feitas a partir de DNA do suposto pai, nas medições genotípicas feitas a partir da amostra de DNA mista e nas medições genotípicas obtidas a partir de DNA da gestante, cálculo de uma distribuição de uma estatística de teste para uma pluralidade de indivíduos sem parentesco genético com o feto, onde cada estatística de teste calculada indica um grau de similaridade genética entre um indivíduo sem parentesco da pluralidade de indivíduos que sem parentesco com o feto e o feto, em que a estatística de teste se baseia em medições genotípicas feitas a partir de DNA do indivíduo sem parentesco, medições genotípicas

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6/116 feitas a partir da amostra de DNA mista e medições genotípicas obtidas a partir de DNA da gestante, cálculo da probabilidade de que a estatística de teste calculada para o suposto pai e o feto seja parte da distribuição da estatística de teste calculada para a pluralidade de indivíduos sem parentesco e o feto e determinação da probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico do feto usando a probabilidade de que a estatística de teste calculada para o suposto pai seja parte da distribuição da estatística de teste calculada para a pluralidade de indivíduos sem parentesco e o feto. Em uma modalidade, estabelecer se um suposto pai é o pai biológico do feto também inclui estabelecer que o suposto pai é o pai biológico do feto ao rejeitar a hipótese de que o suposto pai não tenha parentesco com o feto se a probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico do feto está acima de um limite máximo ou estabelecer que o suposto pai não é o pai biológico do feto ao não rejeitar a hipótese de que o suposto pai não tem parentesco com o feto se a probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico do feto está abaixo de um limite mínimo ou não estabelecer se um suposto pai é o pai biológico do feto se a probabilidade está entre o limite mínimo e o limite máximo ou se a probabilidade não foi determinada com confiança suficientemente alta.

[0011] Em uma modalidade, determinação da probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico do feto inclui obtenção de frequências populacionais de alelos para cada locus da pluralidade de loci polimórficos, criação de uma divisão de possíveis frações de DNA fetal no amostra de DNA mista que variam de um limite mínimo de fração fetal a um limite máximo de fração fetal, cálculo da probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico do feto dadas as medidas genotípicas obtidas a partir do DNA da mãe, as medições genotípicas feitas a partir de DNA do suposto pai, as medições genotípicas feitas a partir da amostra de DNA mista, para cada uma

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7/116 das possíveis frações fetais na divisão, determinação da probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico do feto por meio de combinação das probabilidades calculadas de que o suposto é o pai biológico pai do feto para cada uma das possíveis frações fetais na divisão, cálculo de uma probabilidade de que o suposto pai não é o pai biológico do feto dadas as medições genotípicas feitas a partir de DNA da mãe, as medições genotípicas feitas a partir da amostra de DNA mista, as frequências populacionais de alelos obtidas para cada uma das possíveis frações fetais na divisão e determinação da probabilidade de que o suposto pai não é o pai biológico do feto por meio de combinação das probabilidades calculadas de que o suposto pai não é o pai biológico do feto para cada uma das possíveis frações fetais na divisão.

[0012] Em uma modalidade, cálculo da probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico do feto e cálculo da probabilidade de que o suposto pai não é o pai biológico do feto pode também incluir cálculo, para cada uma da pluralidade de loci polimórficos, de uma probabilidade de dados de sequências observados em um locus específico usando um modelo de resposta de plataforma, uma ou uma pluralidade de frações na possível divisão frações fetal, uma pluralidade de proporções de alelos para a mãe, uma pluralidade de proporções de alelos para o suposto pai e uma pluralidade de proporções de alelos para o feto, cálculo de uma probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico por meio de combinação da probabilidade dos dados de sequência observados em cada locus polimórfico sobre todas as frações fetais na divisão, sobre as proporções de alelos da mãe no conjunto de locus polimórficos, sobre as supostas proporções de alelos paternos no conjunto de locus polimórficos e sobre as proporções de alelos fetais no conjunto de locus polimórficos, cálculo da probabilidade de que o suposto pai não

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8/116 é o pai biológico por meio de combinação da probabilidade dos dados de sequência observados em cada locus polimórfico sobre todas as frações fetais na divisão, sobre as proporções de alelos da mãe no conjunto de loci polimórficos, sobre as frequências populacionais para o conjunto de loci polimórficos e sobre as proporções de alelos fetais no conjunto de loci polimórficos, cálculo de uma probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico com base na probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico e cálculo da probabilidade de que o suposto pai não é o pai biológico com base na probabilidade de que o suposto pai não é o pai biológico.

[0013] Em uma modalidade, cálculo da probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico com base na probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico é realizado usando uma estimativa de probabilidade máxima ou uma técnica maximum a posteriori. Em uma modalidade, estabelecer se um suposto pai é o pai biológico de um feto também pode incluir estabelecer que o suposto pai é o pai biológico se a probabilidade que calculou que o suposto pai é o pai biológico do feto é significativamente maior do que a probabilidade calculada de que o suposto pai não é o pai biológico ou estabelecer que o suposto pai não é o pai biológico do feto se a probabilidade que calculou que o suposto pai é o pai biológico é significativamente maior do que a probabilidade calculada de que o suposto pai não é o pai biológico. Em uma modalidade, os loci polimórficos correspondem a cromossomos que têm uma alta probabilidade de ser dissômicos.

[0014] Em uma modalidade, a divisão de possíveis frações de DNA fetal contém apenas uma fração feral e onde a fração fetal é determinada por uma técnica tirada da lista que consiste em PCR quantitativa, PCR digital, PCR objetivada, sondas de circularização, outros métodos de amplificação de DNA, captura por sondas de hibridização, outros métodos de enriquecimento preferencial,

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9/116 microarranjos de SNP, microarranjos de DNA, sequenciamento, outras técnicas para medição de alelos polimórficos, outras técnicas para medição de alelos não polimórficos, medição de alelos polimórficos que estão presentes no genoma paterno, mas não estão presentes no genoma da mãe, medição de alelos não polimórficos que estão presentes no genoma paterno mas não estão presentes no genoma da mãe, medição dos alelos que são específicos para o cromossomo Y, comparação da quantidade medida de alelos patemalmente herdaram para a quantidade medida de alelos matemalmente herdados, estimativas de probabilidade máxima, técnicas maximum a posteriori e combinações does mesmos. Em uma modalidade, o método de acordo com a reivindicação 1, em que a divisão de possíveis frações fetais contém apenas uma fração fetal e onde a fração fetal é determinada usando o método de acordo com a reivindicação 26.

[0015] Em uma modalidade, o material genético do suposto pai é obtido a partir de tecido selecionado do grupo que consiste em: sangue, tecido somático, esperma, cabelo, amostra bucal, pele, outras amostras forenses e combinações das mesmas. Em uma modalidade, a confiança é computada para a determinação estabelecida se o suposto pai é o pai biológico do feto. Em uma modalidade, a fração de DNA fetal na amostra de DNA mista foi enriquecida por meio de um método selecionado do grupo que consiste em: seleção de tamanho, ligação universal mediada por PCR, PCR com tempos de extensão curtos, outros métodos de enriquecimento e combinações dos mesmos.

[0016] Em uma modalidade, obtenção de medições genotípicas a partir do material genético da gestante pode incluir fazer medições genotípicas sobre uma amostra de material genético da gestante que consiste essencialmente em material genético materno. Em uma modalidade, a obtenção de medições genotípicas a partir do material

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10/116 genético da gestante pode incluir inferir quais medições genotípicas das medições genotípicas feitas sobre a amostra de DNA mista provavelmente são atribuíveis ao material genético da gestante e uso daquelas medições genotípicas que foram inferidas como sendo atribuíveis ao material genético da mãe como as medições genotípicas obtidas. Em uma modalidade, o método pode também incluir uma decisão clínica com base na determinação de paternidade estabelecida. Em uma modalidade, a decisão clínica é interromper uma gravidez.

[0017] Em uma modalidade, medições genotípicas podem ser feitas medindo o material genético usando uma técnica ou tecnologia selecionada do grupo que consiste em sondas PADLOCK, sondas de inversão molecular, outras sondas de circularização, microarranjos de genotipagem, ensaios de genotipagem de SNP, microarranjos com base em chips, microarranjos com bases glóbulo, outros microarranjos de SNP, outros métodos de genotipagem, sequenciamento de DNA de Sanger, piro-sequenciamento, sequenciamento de alto rendimento, sequenciamento objetivado usando sondas de circularização, sequenciamento objetivado usando captura por sondas de hibridização, sequenciamento Dye Terminator reversível, sequenciamento por ligação, sequenciamento por hibridização, outros métodos de sequenciamento de DNA, outras plataformas de genotipagem de alto rendimento, hibridização fluorescente in situ (Fluorescent In Situ Hybridization - FISH), hibridização genômica comparativa (Comparative Genomic Hybridization - CGH), CGH de arranjo e múltiplos ou combinações dos mesmos.

[0018] Em uma modalidade, medições genotípicas podem ser feitas sobre material genético que é amplificado e/ou preferencialmente enriquecido antes de ser medido usando uma técnica ou tecnologia que é selecionada do grupo que consiste em:

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Reação em Cadeia de Polimerase (Polymerase Chain Reaction PCR), ligação mediada por PCR, PCR com iniciador de oligonucleotídeo degenerativa, amplificação objetivada, mini-PCR, amplificação por PCR universal, amplificação por deslocamento múltiplo (Multiple Displacement Amplification - MDA), PCR aleloespecífica, técnicas de amplificação alelo-específica, métodos de amplificação linear, ligação de DNA substrato seguido por um outro método de amplificação, amplificação de ponte, sondas PADLOCK, sondas de circularização, captura por sondas de hibridização e combinações dos mesmos.

[0019] Em uma modalidade, o método pode também incluir a geração de um relatório compreendendo a paternidade estabelecida do feto. Em uma modalidade, a invenção pode compreender um relatório que divulga a paternidade estabelecida do feto gerada usando um método descrito aqui.

[0020] São descritos aqui métodos para determinação da fração de DNA proveniente de um indivíduo alvo que está presente em uma mistura de DNA que contém o DNA alvo do indivíduo e também o DNA de pelo menos um outro indivíduo. De acordo com aspectos ilustrados aqui, em uma modalidade, um método para determinação de uma fração de DNA de um indivíduo alvo presente em uma amostra de DNA mista que compreende o DNA do indivíduo e o DNA alvo de um segundo indivíduo pode incluir realização de medições genotípicas de uma pluralidade de loci polimórficos a partir da amostra de DNA mista, obtenção de dados genotípicos na pluralidade de loci polimórficos a partir do segundo indivíduo e determinação, por um computador, da fração de DNA do indivíduo alvo presente na amostra mista usando as medições genotípicas da amostra de DNA mista, os dados genotípicos do segundo indivíduo e técnicas de estimativa de probabilidades.

[0021] Em uma modalidade, obtenção de dados genotípicos do

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12/116 segundo indivíduo inclui fazer medições genéticas a partir de DNA que consiste essencialmente em DNA do segundo indivíduo. Em uma modalidade, a obtenção de dados genotípicos do segundo indivíduo pode incluir inferir quais medições genotípicas das medições genotípicas feitas na amostra de DNA mista provavelmente são atribuíveis ao material genético do segundo indivíduo e uso daquelas medidas genotípicas que foram inferidas como sendo atribuíveis ao material genético do segundo indivíduo como as medições genotípicas obtidas.

[0022] Em uma modalidade, inferência dos dados genotípicos do indivíduo com parentesco pode também incluir o uso de frequências populacionais de alelos nos loci. Em uma modalidade, a fração de DNA determinada a partir de um indivíduo alvo é expressa como uma probabilidade de frações de DNA. Em uma modalidade, as medições genotípicas feitas na amostra mista compreendem medições genotípicas feitas por sequenciamento de DNA na amostra mista. Em uma modalidade, o DNA da amostra mista é preferencialmente enriquecido na pluralidade de loci polimórficos antes de fazer medições genotípicas da amostra de DNA mista. Em uma modalidade, os loci polimórficos compreendem polimorfismos de um único nucleotídeo.

[0023] Em uma modalidade, determinação da fração pode também incluir determinação de uma probabilidade de uma pluralidade de frações de DNA do indivíduo alvo presente na amostra de DNA mista, determinação da fração selecionando a fração, a partir da pluralidade de frações, com maior probabilidade. Em uma modalidade, determinação da fração pode também incluir determinação de uma probabilidade de uma pluralidade de frações de DNA do indivíduo alvo presente na amostra de DNA mista usando uma técnica de estimativa de probabilidade máxima para determinar a fração mais provável e

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13/116 determinação da fração selecionando a fração que foi determinada como sendo a mais provável.

[0024] Em uma modalidade, o indivíduo alvo é um feto que está em gestação em uma gestante e o segundo indivíduo é a gestante. Em uma modalidade, o método pode também incluir o uso de um modelo de plataforma que relacione dados genotípicos medidos aos loci polimórficos e uso de uma tabela que relaciona genótipos maternos aos genótipos da criança. Em uma modalidade, a determinação também usa medições genotípicas em uma pluralidade de loci polimórficos medidas sobre o DNA do pai do feto. Em uma modalidade, o método não faz uso de dados genotípicos do pai do feto. Em uma modalidade, o método não faz uso de loci no cromossomo Y. Em uma modalidade, a invenção pode compreender um relatório que divulga uma paternidade estabelecida do feto determinada usando um método descrito aqui para determinação da fração de DNA fetal presente no plasma materno. Em uma modalidade, a invenção pode compreender um relatório que divulga um estado de ploidia do feto determinada usando um método descrito aqui para determinação da fração de DNA fetal presente no plasma materno.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0025] As modalidades presentemente divulgadas serão ainda explicadas com referência aos desenhos anexos, em que estruturas similares são designadas por numerais similares ao longo das várias vistas. Os desenhos apresentados não estão necessariamente em escala, com ênfase sendo antes colocada, em geral, à ilustração dos princípios das modalidades presentemente descritas.

[0026] A Figura 1 mostra a distribuição de intensidades de alelo de dois contextos parentais conforme medido no plasma materno.

[0027] A Figura 2 mostra a distribuição de estatística de teste

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14/116 relacionada à paternidade para 200 homens independentes e o pai biológico.

[0028] A Figura 3 mostra duas distribuições de proporções de intensidade para 200 homens independentes e o pai biológico. Cada gráfico corresponde a diferentes canais de entrada.

[0029] A Figura 4 mostra as curvas de frequência de distribuição cumulativa (Cumulative Distribution Frequency - cdf) para a proporção de correlação entre as medições genotípicas fetais e as medições genotípicas dos pais para três casos.

[0030] A Figura 5 mostra histogramas da proporção de correlação entre as medições genotípicas fetais e as medições genotípicas dos pais para três casos.

[0031] A Figura 6 mostra um histograma da estatística de teste de paternidade para 35 amostras quando comparado com uma distribuição Gaussiana idealizada da estatística de teste para 800 homens sem parentesco.

[0032] A Figura 7 mostra um exemplo de um relatório que descreve uma exclusão de paternidade.

[0033] A Figura 8 mostra um exemplo de um relatório que descreve uma inclusão de paternidade.

[0034] A Figura 9 mostra um exemplo de um relatório que descreve um resultado indeterminado.

[0035] Embora os desenhos identificados acima apresentem modalidades presentemente descritas, outras modalidades também são consideradas, conforme observado na discussão. A presente descrição apresenta modalidades ilustrativas a título de representação e não de limitação. Numerosas outras modificações e modalidades podem ser concebidas por aqueles versados na técnica as quais caem no âmbito e espírito dos princípios das modalidades presentemente descritas.

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DESCRIÇÃO DETALHADA [0036] De acordo com aspectos ilustrados aqui, é fornecido um método para determinar se um suposto pai é ou não o pai biológico de um feto que está em gestação em uma gestante. Em uma modalidade, o método inclui obtenção de material genético do suposto pai e obtenção de uma amostra de sangue da mulher grávida. Em uma modalidade, o método pode incluir fazer medições genotípicas do suposto pai e da gestante e fazer medições genotípicas no DNA em flutuação livre (ffDNA, isto é, cfDNA) encontrado no plasma da gestante. Em uma modalidade, o método inclui obtenção de dados genotípicos para um conjunto de SNPs da mãe e suposto pai do feto; fazer medições genotípicas para o conjunto de SNPs em uma amostra de DNA mista que compreende DNA alvo do indivíduo e também DNA da mãe do indivíduo alvo. Em uma modalidade, o método pode incluir uso das medições genotípicas para determinar, com um computador, a probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico do feto em gestação na gestante. Em uma modalidade, o método pode incluir uso dos dados genotípicos da gestante e do suposto pai para determinar uma distribuição alélica esperada para as medições genotípicas da mistura de DNA fetal/matemo se o suposto pai era o pai biológico do feto. Em uma modalidade, o método pode incluir o uso dos dados genotípicos da gestante e dados genotípicos de uma pluralidade de indivíduos que se sabe não ser o pai para determinar uma distribuição alélica esperada para as medições genotípicas da mistura de DNA fetal/matemo se o suposto pai não é o pai biológico do feto. Em uma modalidade, o método pode envolver cálculo das probabilidades de que o suposto pai é o pai biológico do feto dadas as distribuições alélicas esperadas e as medições reais de DNA no plasma materno. Em uma modalidade, a série de etapas descritas no método resulta em transformação do material genético da gestante e do suposto pai

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16/116 para produzir e determinar a identidade correta do pai biológico de um feto em gestação e pré-natalmente e de uma forma não invasiva. Em uma modalidade, determinação da probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico inclui atribuição ou estabelecimento do suposto pai como o pai biológico se a probabilidade de que o pai é excluído da distribuição de alelos criada usando a pluralidade de indivíduos sem parentesco está acima de um limite. Em uma modalidade, determinação da probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico inclui atribuição do suposto pai de que ele não é o pai biológico se a probabilidade de que o suposto pai é excluído da distribuição de alelos criada usando a pluralidade de indivíduos sem parentesco está abaixo do limite. Em uma modalidade, a determinação de paternidade é feita inicialmente assumindo que o suposto pai é de fato o pai da criança; se o suposto pai está incorreto, os genótipos da criança não corresponderão a estas previsões e a suposição inicial é considerada errada; no entanto, se os genótipos de criança correspondem às previsões, então, a suposição é considerada correta. Assim, o teste de paternidade considera quão bem o ffDNA observado corresponde aos genótipos da criança previstos pelos genótipos do suposto pai. Em uma modalidade, um relatório eletrônico ou físico pode ser gerado indicando a determinação de paternidade.

[0037] Em uma modalidade, a determinação de paternidade é feita através de medições genéticas de DNA flutuante (ffDNA) encontrado no sangue materno e as informações de genótipo da mãe e do suposto pai. O método geral poderia ser aplicado à medições de ffDNA usando uma variedade de plataformas, tais como microarranjos de SNP, sequenciamento de alto rendimento não objetivado ou sequenciamento objetivado. Os métodos discutidos aqui se dirigem ao fato de que o DNA fetal em flutuação livre é encontrado no plasma materno em baixas concentrações ainda desconhecidas e é difícil de

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17/116 detectar. O teste de paternidade pode compreender avaliação das medições ffDNA e qual a probabilidade dele ter sido gerado pelo suposto pai com base em seus genótipos. Independentemente da plataforma de medição, o ensaio pode se basear nos genótipos medidos em localizações polimórficas. Em algumas modalidades, os possíveis alelos em cada locus polimórfico podem ser generalizados para A e B e opcionalmente C, D e/ou E, etc.

[0038] Em uma modalidade, este método envolve o uso de dados de medição de alelo a partir de uma pluralidade de loci. Em uma modalidade, os loci são polimórficos. Em uma modalidade, alguns ou mais loci são polimórficos. Em uma modalidade, os loci polimórficos são polimorfismos de um único nucleotídeo (Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs). Em uma modalidade, alguns ou a maioria dos loci polimórficos são heterozigotos. Em uma modalidade, não é necessário determinar quais loci são heterozigotos antes de testagem. [0039] Em uma modalidade, um método descrito aqui usa técnicas de enriquecimento seletivo que preservam as frequências relativas de alelos que estão presentes na amostra original de DNA em cada locus polimórfico a partir de um conjunto de loci polimórficos. Em algumas modalidades, a amplificação e/ou técnica de enriquecimento seletivo pode envolver técnicas de PCR, tais como mini-PCR ou ligação mediada por PCR, captura de fragmento por hibridização ou sondas de circularização, tais como Sondas de Inversão Molecular. Em algumas modalidades, métodos para amplificação ou enriquecimento seletivo podem envolver o uso de iniciadores de PCR ou outras sondas onde, quando de hibridização correta à sequência alvo, a extremidade 3' ou extremidade 5' de uma sonda de nucleotídeos é separada do sítio polimórfico do alelo por um pequeno número de nucleotídeos. Em uma modalidade, as sondas nas quais a região de hibridização é concebida para hibridizar com um sítio polimórfico são

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18/116 excluídas. Estas modalidades são aprimoramentos em relação a outros métodos que envolvem amplificação objetivada e/ou enriquecimento seletivo pelo fato de que eles preservam melhor as frequências de alelos originais da amostra em cada locus polimórfico, quer a amostra seja genômica pura de um único indivíduo ou mistura de indivíduos.

[0040] Em uma modalidade, um método descrito aqui usa PCR objetivada multiplex altamente eficiente para amplificar fragmentos de DNA, seguido por sequenciamento de alto rendimento para determinar as frequências de alelos em cada locus alvo. Uma técnica que permite que PCR multiplex objetivada seja realizada de uma maneira altamente eficiente envolve concepção de iniciadores que não são susceptíveis de hibridização uns com os outros. As sondas de PCR podem ser selecionadas criando um modelo termodinâmico de interações potencialmente adversas ou interações não desejadas entre pelo menos 500, pelo menos 1000, pelo menos 5000, pelo menos 10.000, pelo menos 20.000, pelo menos 50.000 ou pelo menos 100.000 pares de iniciadores potenciais ou entre os iniciadores e DNA da amostra e, então, uso do modelo para eliminar designs que são incompatíveis com os outros designs no grupo ou com o DNA da amostra. Outra técnica que permite que PCR multiplex objetivada seja realizada de uma maneira altamente eficiente é uso de uma abordagem de agrupamento parcial ou total à PCR objetivada. Uso de um ou uma combinação destes métodos permite formação multiplex de pelo menos 300, pelo menos 800, pelo menos 1200, pelo menos 4000 ou pelo menos 10.000 iniciadores em um único grupo com o DNA amplificado resultante compreendendo uma maioria das moléculas de DNA que, quando sequenciado, será mapeado aos loci objetivados. Uso de um ou uma combinação destes métodos permite a formação multiplex de um grande número de iniciadores em um único

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19/116 grupo com o DNA amplificado resultante compreendendo mais de 50%, mais de 80%, mais de 90%, mais de 95%, mais de 98% ou mais de 99% de moléculas de DNA que mapeiam aos loci objetivados.

[0041] Em uma modalidade, um método descrito aqui envolve determinar se a distribuição de medições de alelos observadas é indicativa de uma inclusão ou exclusão de paternidade usando uma técnica de estimativa de probabilidade máxima (Maximum Likelihood Estimation - MLE). O uso de uma técnica de estimativa de probabilidade máxima é diferente de e um aprimoramento significativo em relação a métodos que usam a técnica de rejeição de hipótese única pelo fato de que as determinações resultantes serão feitas com muito precisão significativamente maior. Uma razão é que as técnicas de rejeição de hipótese única de não contêm informações sobre a hipótese alternativa. Outra razão é que a técnica de probabilidade máxima permite a determinação dos limiares de corte ótimos para cada amostra individual. Outra razão é que o uso de uma técnica de probabilidade máxima permite o cálculo da confiança para cada determinação de paternidade. A capacidade de fazer um cálculo de confiança para cada determinação permite que um médico saiba quais atribuições são precisas e quais estão mais propensas a estarem erradas. Em algumas modalidades, uma grande variedade de métodos podem ser combinados com uma técnica de estimativa de probabilidade máxima para melhorar a precisão das atribuições de ploidia. Em uma modalidade, um método descrito aqui envolve a estimativa da fração de DNA fetal na amostra mista e uso da estimativa para calcular tanto a atribuição de paternidade (determinação) quanto a confiança da atribuição de paternidade.

[0042] Em uma modalidade, o método envolve o cálculo de uma estatística de teste que é indicativa do grau de parentesco entre um primeiro e um segundo indivíduo dadas as medições genotípicas em

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20/116 uma pluralidade de loci polimórficos para o primeiro indivíduo e as medições genotípicas em uma pluralidade de loci polimórficos para uma mistura de DNA, onde a mistura de DNA compreende DNA do segundo indivíduo e um indivíduo com parentesco. Em uma modalidade, o primeiro indivíduo é um suposto pai, o segundo indivíduo é um feto em gestação e o indivíduo com parentesco é a mãe do feto. A estatística de teste pode ser calculada para o feto, a mãe e uma pluralidade de indivíduos que se sabe não ter parentesco com o feto, assim, gerando uma distribuição da métrica de indivíduos sem parentesco. A estatística de teste também pode ser calculada para o feto, a mãe e o suposto pai. Um teste de rejeição de hipótese única pode ser usado para determinar se a estatística de teste calculada usando dados genotípicos do suposto pai é parte da distribuição de estatísticas de teste calculadas usando os dados genotípicos dos indivíduos sem parentesco. Se é descoberto que a estatística de teste calculada usando dados genotípicos do suposto pai é parte da distribuição de estatísticas de teste calculadas usando os dados genotípicos dos indivíduos sem parentesco, então, a paternidade pode ser excluída, isto é, o suposto pai pode ser determinado a não tendo parentesco com o feto. Se é descoberto que a estatística de teste calculada usando dados genotípicos do suposto pai não é parte da distribuição de estatística de teste calculada usando os dados genotípicos dos indivíduos sem parentesco, então, a paternidade pode ser incluída, isto é, o suposto pai pode ser determinado como tendo parentesco com o feto.

[0043] Em uma modalidade, a determinação de paternidade envolve a determinação da probabilidade dos dados genotípicos medidos fornecerem duas hipóteses possíveis: a hipótese de que o suposto pai é o pai biológico do feto e a hipótese de que o suposto pai não é o pai biológico do feto. Uma probabilidade pode, então, ser

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21/116 calculada para cada uma das hipóteses com base nos dados e a paternidade pode ser estabelecida com base na probabilidade de cada uma das duas hipóteses. A determinação pode usar medições genéticas feitas no plasma materno, medições feitas genéticas feitas sobre o DNA do suposto pai e opcionalmente dados genotípicos maternos. Em uma modalidade, os dados genotípicos maternos podem ser inferidos a partir das medições genotípicas realizadas no plasma materno. Em uma modalidade, a probabilidade pode ser determinada usando uma divisão de faixa de possíveis frações fetais; a faixa de frações fetais pode ser qualquer coisa a partir de 0,01% a 99,9% e a malha pode ter incrementos variando de 10% a 1%, de 1% a 0,1% e menor do que 0,1%. Em uma modalidade, a divisão de possíveis frações fetais pode ser de 2% a 30% e os incrementos são cerca de 1%. Em uma modalidade, a malha pode ser contínua e as probabilidades pode ser intergradas sobre as faixas em vez de combinadas. Em uma modalidade, a probabilidade pode ser determinada usando apenas uma fração fetal, onde a fração fetal pode ser determinada usando qualquer método apropriado. Para cada fração fetal possível na malha, pode-se calcular a probabilidade dos dados indicarem duas hipóteses. Para a hipótese de que o suposto pai é o pai biológico, os genótipos do suposto pai podem ser usados no cálculo da probabilidade enquanto que, para a hipótese de que o suposto pai não é o pai biológico, dados de frequência populacionais de alelos podem ser adicionalmente usados no cálculo da probabilidade. Em uma modalidade, pode-se usar os contextos parentais e um modelo de plataforma no cálculo da probabilidade de dados com base na hipótese. Em uma modalidade, as probabilidades podem ser combinadas sobre todas as frações fetais na divisão, todos os genótipos da mãe e todos os genótipos pai. Em uma modalidade, os genótipos dos pais podem ser probabilísticos (por exemplo, em um

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22/116 determinado SNP, um pai pode ter o genótipo GT com 99% de chances, GG com 0,5% de chances e TT com 0,5% de chances; em outra modalidade, os genótipos dos pais podem ser com base em um valor (por exemplo, em um determinado SNP, um dos pais tem o genótipo GT). Em algumas modalidades, os termos probabilidade e chance podem ser usados altemadamente, conforme na linguagem comum; em outras modalidades, os dois termos podem não ser usados altemadamente e podem ser lidos conforme aqueles versados na técnica de estatística entenderíam.

[0044] Em alguns métodos conhecidos na técnica, a fração fetal é determinada usando medições feitas em loci que se encontram exclusivamente no genótipo paterno, por exemplo, loci que são encontrados exclusivamente sobre o cromossomo Y ou o gene Rhesus-D. Infelizmente, estes métodos requerem que o feto seja do sexo masculino (no caso onde os loci são encontrados exclusivamente sobre o cromossomo Y) ou um gene ou conjunto de genes pode ser identificado antes das medições do DNA onde estes genes estão presentes no genótipo paterno e não estão presentes no genótipo materno. Uma complicação adicional é que, no contexto de testagem de paternidade, não se sabe se o suposto pai é ou não o pai biológico e, portanto, com a exceção dos loci específicos para o cromossomo Y, não é possível determinar quais loci podem estar presentes no pai e não na mãe. Portanto, no contexto de testagem de paternidade, não é realmente possível determinar a fração fetal quando o feto é do sexo feminino e, quando o feto é do sexo masculino, a fração fetal só pode ser determinada usando loci específicos para o cromossomo Y. Em uma modalidade, é descrito aqui um método para determinação da fração de DNA fetal que está presente na mistura de DNA compreendendo DNA materno e fetal. Em uma modalidade, o método pode determinar a fração fetal de DNA fetal que está presente na

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23/116 mistura de DNA compreendendo DNA materno e fetal usando medições genotípicas de cromossomos autossômicos. Em uma modalidade, o método pode determinar a fração fetal de DNA fetal que está presente na mistura de DNA compreendendo o DNA materno e fetal, independentemente do sexo do feto. Em uma modalidade, o método pode determinar a fração fetal do DNA fetal que está presente na mistura de DNA compreendendo o DNA materno e fetal, independentemente do quais genes a mãe e o suposto pai possam ter. O presente método não requer que o feto seja do sexo masculino ou que seja identificado um locus ou loci que estão presentes no pai e não na mãe. O presente método não requer que o genótipo paterno seja conhecido. O presente método não requer que o genótipo da mãe seja conhecido, uma vez que ele pode ser inferido a partir das medições feitas sobre o DNA no plasma materno, o qual compreende uma mistura tanto de DNA fetal quanto materno.

[0045] Em uma modalidade, a distribuição de loci polimórficos pode ser modelada usando uma distribuição binomial. Em uma modalidade, a distribuição de loci polimórficos pode ser modelada usando uma distribuição beta-binomial. Usando a distribuição betabinomial como um modelo para a distribuição de alelo, pode-se modelar mais precisamente prováveis medições alélicas do que quando se usa outras distribuições; isto pode resultar em determinações de paternidade mais precisas.

[0046] Em uma modalidade, um método descrito aqui leva em conta a tendência de que os dados tenham interferência e contenham erros ao anexando uma probabilidade a cada medição. O uso de técnicas de probabilidade máxima para escolher a hipótese correta do conjunto de hipóteses que foram feitas usando os dados de medição com estimativas probabilística anexas torna mais provável que medições incorretas sejam descontadas e as medições corretas serão

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24/116 usadas nos cálculos que levam à determinação de paternidade. Para ser mais preciso, este método reduz sistematicamente a influência de dados incorretamente medidos na determinação de paternidade. Este é um aprimoramento em relação a métodos onde todos os dados são assumidos como igualmente corretos ou métodos onde dados periféricos são arbitrariamente excluídos dos cálculos que levam a uma determinação de paternidade. Em uma modalidade, SN Ps individuais são ponderados pela variância de medição esperada com base na qualidade de SNP e profundidade observada de leitura; isto pode resultar em um aumento na precisão da estatística resultante, resultando em um aumento da precisão das atribuições de paternidade significativamente, especialmente em casos limítrofes.

[0047] Os métodos descritos aqui são particularmente vantajosos quando usados em amostras onde uma pequena quantidade de DNA está disponível ou onde o percentual de DNA fetal é baixo. Isto é em virtude da taxa de abandono de alelo correspondentemente maior que pode ocorrer quando apenas uma pequena quantidade de DNA está disponível e/ou uma taxa de abandono de alelo fetal correspondentemente maior quando o percentual de DNA fetal está acessível em uma amostra mista de DNA fetal e materno. Uma alta taxa de abandono de alelo, significando que um grande percentual dos alelos não foi medido para o indivíduo alvo, resulta em cálculos de fração fetal imprecisos e determinações de paternidade imprecisa. Os métodos descritos aqui permitem que uma determinação precisa de ploidia seja feita quando o percentual de moléculas de DNA que são fetais na mistura é menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, menos de 8 %, menos de 6%, menos de 4% e mesmo menos do que 3%.

[0048] Em uma modalidade, é possível determinar a paternidade de um indivíduo com base em medições quando o DNA do indivíduo

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25/116 está misturado com o DNA de um indivíduo com parentesco. Em uma modalidade, a mistura de DNA é o DNA livre flutuante encontrado no plasma materno, o qual pode incluir o DNA da mãe, com o genótipo conhecido e o qual pode estar misturado com o DNA do feto, com genótipo desconhecido. A paternidade do feto pode ser determinada ao observar as medições reais e determinar a probabilidade de paternidade com base nos dados observados. Em algumas modalidades, um método descrito aqui pode ser usado em situações onde há uma quantidade muito pequena de DNA presente, tal como em situações forenses, onde uma ou poucas células estão disponíveis (tipicamente menos de dez células, menos de vinte células, menos de 40 células, menos de 100 células ou uma quantidade equivalente de DNA). Em algumas modalidades, um método descrito aqui pode ser usado em situações onde o DNA está altamente fragmentado, tal como ffDNA encontrado no plasma. Nestas modalidades, um método descrito aqui serve para fazer atribuições de paternidade a partir de uma pequena quantidade de DNA que não está contaminado por outro DNA, mas onde a atribuição de paternidade é muito difícil em virtude da pequena quantidade de DNA. As medições genéticas usadas como parte destes métodos podem ser feitas em qualquer amostra de DNA ou RNA, por exemplo, porém sem limitações: sangue, plasma, fluidos corporais, urina, cabelo, lágrimas, saliva, tecido, pele, unhas, blastômeros, embriões, líquido amniótico, amostras de vilosidade coriônica, fezes, bile, linfa, muco cervical, sêmen ou outras células ou materiais compreendendo ácidos nucleicos. Em uma modalidade, um método descrito aqui pode ser realizado com métodos de detecção de ácidos nucleicos, tais como sequenciamento, microarranjos, qPCR, PCR digital ou outros métodos usados para medir ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, um método descrito aqui envolve o cálculo, por um computador, das proporções de alelo no pluralidade de loci

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26/116 polimórficos a partir das medições feitas no DNA das amostras processadas. Em algumas modalidades, um método descrito aqui envolve o cálculo, por um computador, das proporções de alelo ou distribuições alélicas de uma pluralidade de loci polimórficos a partir das medições feitas no DNA das amostras processadas junto com qualquer combinação de outros aprimoramentos descritos na presente descrição.

[0049] Discussão adicional destes pontos pode ser encontrada em outras partes deste documento.

Testaaem de Paternidade Pré-Natal Não Invasiva (Non-lnvasive Prenatal Paternitv Testing - NPPT) [0050] O processo de testagem de paternidade pré-natal não invasivo envolve uma série de etapas. Algumas das etapas podem incluir: (1) obtenção do material genético do feto; (2) enriquecimento do material genético do feto que possa estar em uma amostra mista ex vivo; (3) amplificação do material genético ex vivo; (4) enriquecimento preferencial de loci específicos do material genético ex vivo; (5) medição do material genético ex vivo; e (6) a análise dos dados genotípicos em um computador e ex vivo. Métodos para a prática destas etapas e seis outras relevantes são descritos aqui. Pelo menos algumas das etapas do processo não são diretamente aplicadas sobre o corpo. Em uma modalidade, a presente descrição refere-se a métodos de tratamento e diagnóstico aplicados a tecidos e outros materiais biológicos isolados e separados do corpo. Pelo menos algumas das etapas do método são executadas em um computador.

[0051] Algumas modalidades da presente descrição permitem que um médico determine o estado genético de um feto, especificamente sua relação biológica com outro indivíduo, que está em gestação em uma mãe de um modo não invasivo, de modo que a saúde do bebê não seja posta em risco pela coleta do material genético do feto e a

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27/116 mãe não seja submetida a um procedimento invasivo.

[0052] Avanços tecnológicos modernos resultaram na capacidade de medir grandes quantidades de informação genética a partir de uma amostra genética usando métodos tais como sequenciamento de alto rendimento e arranjos de genotipagem. Os métodos descritos aqui permitem que um médico tire maior partido das grandes quantidades de dados disponíveis e faça um diagnóstico mais preciso da identidade genética fetal. Em uma modalidade, um método informatizado pode resultar em determinações de paternidade de maior precisão do que métodos atualmente conhecidos na técnica. Detalhes de uma série de modalidades são fornecidos abaixo. Diferentes modalidades podem envolver diferentes combinações das etapas mencionadas acima. Várias combinações das diferentes modalidades das diferentes etapas podem ser usadas altemadamente.

[0053] Em uma modalidade, uma amostra de sangue foi tirada de uma gestante e o DNA em flutuação livre no plasma do sangue da mãe, o qual contém uma mistura de DNA de origem materna e DNA de origem fetal, é isolado e usado para determinar o estado de ploidia do feto. Em uma modalidade, um método descrito aqui envolve enriquecimento preferencial destas sequências de DNA em uma mistura de DNA que corresponde a alelos polimórficos de uma forma que as proporções de alelos e/ou distribuições alélicas permanecem razoavelmente consistentes quando de enriquecimento. Em uma modalidade, o método envolve amplificação do DNA isolado usando amplificação de genoma inteiro (Whole Genome Amplification - WGA). Em uma modalidade, um método descrito aqui envolve a amplificação com base em PCR objetivada, de modo que um percentual elevado das moléculas resultantes corresponda aos loci objetivados. Em uma modalidade, um método descrito aqui envolve sequenciamento de uma mistura de DNA que contém tanto DNA de origem materna

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28/116 quanto DNA de origem fetal. Em uma modalidade, o método envolve medição do DNA amplificado usando um microarranjo desenvolvido para detectar sequências de ácidos nucleicos, tal como um arranjo de SNP. Em uma modalidade, um método descrito aqui envolve o uso de distribuições alélicas medidas para determinar a paternidade de um feto que está em gestação em uma mãe. Em uma modalidade, um método descrito aqui envolve reportar o estado de paternidade determinado a um médico. Em uma modalidade, um método descrito aqui envolve tomar uma ação clínica, por exemplo, realizar testagem de acompanhamento invasiva, tal como biópsia de vilosidade coriônica ou amniocentese, preparando para o nascimento de uma criança ou um aborto eletiva de um feto.

[0054] O presente pedido referência ao Pedido de Utilidade Norte Americano N° de Série 11/603.406, depositado em 28 de Novembro de 2006 (Publicação Norte Americana N°: 20070184467); Pedido de Utilidade Norte Americana N° de Série 12/076.348, depositado em 17 de Fevereiro de 2008 (Publicação Norte Americana N°: 20080243398); Pedido de Utilidade PCT N° de Série PCT/US09/52730, depositado em 4 de Agosto de 2009 (Publicação PCT N°: WO/2010/017214); Pedido de Utilidade PCT N° de Série PCT/US10/050824, depositado em 30 de Setembro de 2010 (Publicação PCT N°: WO/2011/041485), Pedido de Utilidade Norte Americano N° de Série 13/110.685, depositado em 18 de Maio de 2011 e Pedido de Utilidade Norte Americano N° de Série 13/300.235, depositado em 18 de Novembro de 2011. Alguns do vocabulário usado nesta apresentação podem ter seus antecedentes nestas referências. Alguns dos termos descritos aqui podem ser melhor entendidos à luz dos conceitos encontrados nestas referências. Triagem de Sangue Materno Compreendendo DNA Fetal em Flutuação Livre [0055] Os métodos descritos aqui podem ser usados para ajudar a

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29/116 determinar se uma criança, feto ou outro indivíduo alvo é geneticamente relacionado a outro indivíduo. Em algumas modalidade, isto pode ser feito em casos onde o material genético do indivíduo alvo é encontrado na presença de uma quantidade de material genético de outro indivíduo. Em uma modalidade, o método pode ser usado para ajudar a determinar se um feto é geneticamente relacionado a um suposto pai usando o DNA fetal em flutuação livre encontrado no sangue materno junto com uma amostra genética paterna e opcionalmente da mãe. Em uma modalidade, o feto pode ter se originado de um óvulo ou um doador de óvulo, de modo que o feto não é geneticamente relacionado com a mãe na qual o feto está em gestação. Em uma modalidade, o método pode ser aplicado em casos onde a quantidade de DNA alvo está em qualquer proporção com o DNA não alvo; por exemplo, o DNA alvo pode compor qualquer coisa entre 0,000001 e 99,999999% do DNA presente. Em uma modalidade, o DNA não alvo contam! nante pode ser de uma pluralidade de indivíduos; ele vantajoso onde dados genéticos de alguns ou todos os indivíduos não alvo relevantes são conhecidos ou onde as amostras genéticas de tais indivíduos com parentesco estão disponíveis. Em uma modalidade, um método descrito aqui pode ser usado para determinar os dados genotípicos do feto a partir de sangue materno que contém o DNA fetal. Eles também podem ser usados no caso de existirem vários fetos no útero de uma gestante ou onde outro DNA contaminante pode estar presente na amostra, por exemplo, de outros já irmãos nascidos.

[0056] Esta técnica pode fazer uso do fenômeno de células sanguíneas fetais que obtêm acesso à circulação materna através das vilosidades placentárias. Normalmente, apenas um número muito pequeno de células fetais entram na circulação materna desta maneira (não o suficiente para produzir um ensaio de Kleihauer-Betke positivo

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30/116 para hemorragia materno-fetal). As células fetais podem ser classificadas e analisadas por meio de uma variedade de técnicas para procurar sequências de DNA específicas, mas sem os riscos que os procedimentos invasivos têm inerentemente. Esta técnica também pode fazer uso do fenômeno de DNA feral em flutuação livre que obtém acesso à circulação materna por liberação de DNA após apoptose de tecido placentário, onde o tecido placentário em questão contém DNA do mesmo genótipo que o feto. Foi mostrado que o DNA em flutuação livre encontrado no plasma materno contém DNA fetal em proporções tão altas quanto 30-40% de DNA fetal.

[0057] Em uma modalidade, sangue pode ser coletado de uma gestante. Pesquisa mostrou que o sangue materno podem conter uma pequena quantidade de DNA fetal em flutuação livre, além de DNA em flutuação livre de origem materna. Além disso, também podem haver células sanguíneas fetais nucleadas compreendendo DNA de origem fetal, além de várias células sanguíneas de origem materna as quais, tipicamente, não contêm DNA nuclear. Há muitos métodos conhecidos na técnica para isolar o DNA fetal ou criar frações enriquecidas em DNA fetal. Por exemplo, foi mostrado que cromatografia cria determinadas frações que são ricas em DNA fetal.

[0058] Uma vez que a amostra de sangue materno, plasma ou outro fluido, tirada de uma forma relativamente não invasiva e que contém uma quantidade de DNA fetal, quer celular ou em flutuação livre, seja enriquecida quanto à sua proporção para o DNA materno ou sua proporção original, está em mãos, pode-se realizar genotipagem do DNA encontrado na referida amostra. Em algumas modalidades, o sangue pode ser coletado com uma agulha para tirar sangue de uma veia, por exemplo, a veia basílica. O método descrito aqui pode ser usado para determinar dados genotípicos do feto. Por exemplo, ele pode ser usado para determinar o estado de ploidia em um ou mais

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31/116 cromossomos, pode ser usado para determinar a identidade de um ou de um conjunto de SNPs, incluindo inserções, deleções e translocações. Ele pode ser usado para determinar um ou mais haplotipos, incluindo o pai de origem de uma ou mais características genotípicas. Ele também pode ser usado para determinar o grau de parentesco entre o feto e outro indivíduo.

[0059] Note que este método funcionará com quaisquer ácidos nucléicos que podem ser usados para quaisquer métodos de genotipagem e/ou sequenciamento, tais como a plataforma ILLUMINA INFINIUM ARRAY, AFFYMETRIX GENECHIP, ILLUMINA GENOME ANALYZER ou SOLID SYSTEM da LIFE TECHNOLGIES, juntamente com os dados genotípicos medido pelos mesmos. Isto inclui DNA extraído em flutuação livre a partir do plasma ou amplificações (por exemplo, amplificação de genoma inteiro, PCR) do mesmo; DNA genômico de outros tipos de células (por exemplo, linfócitos humanos de sangue integral) ou amplificações das mesmas. Para preparo do DNA, qualquer método de extração ou purificação que gera DNA genômico adequado para uma destas plataformas funcionará bem. Este método poderia funcionar igualmente bem com amostras de RN A. Em uma modalidade, armazenamento das amostras pode ser feito de uma forma que minimize degradação (por exemplo, abaixo de zero, a cerca de -20 ° C ou em uma temperatura menor).

PARENTAL SUPPORT® [0060] Algumas modalidades podem ser usadas em combinação com o método PARENTAL SUPPORT® (PS), modalidades do qual são descritas no Pedido Norte Americano N° 11/603.406 (Publicação Norte Americana N°: 20070184467), Pedido Norte Americano N° 12/076.348 (Publicação Norte Americana N°: 20080243398), Pedido Norte Americano N° 13/110.685, Pedido PCT PCT/US09/52730 (Publicação PCT N°: WO/2010/017214), Pedido PCT N° PCT/US10/050824

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32/116 (Publicação PCT N°: WO/2011/041485), Pedido PCT N° PCT/US2011/037018 (Publicação PCT N°: WO/2011/146632) e Pedido PCT N° PCT/US2011/61506, os quais são aqui incorporadas por referência na íntegra. PARENTAL SUPPORT® é uma abordagem informatizada que pode ser usada para analisar dados genéticos. Em algumas modalidades, os métodos descritos aqui podem ser considerados como parte do método PARENTAL SUPPORT™. Em algumas modalidades, o método PARENTAL SUPPORT ™ é um conjunto de métodos que podem ser usados para determinar dados genéticos de um alvo individual, com alta precisão, de um ou um pequeno número de células daquele indivíduo ou uma mistura de DNA que consiste em DNA do indivíduo alvo e DNA de um ou uma pluralidade de outros indivíduos, especificamente para determinar alelos relacionados à doenças, outros alelos de interesse, o estado de ploidia de um ou uma pluralidade de cromossomos alvo no indivíduo e/ou a extensão de relação de outro indivíduo com o indivíduo alvo. PARENTAL SUPPORT ® pode se referir a qualquer um destes métodos. PARENTAL SUPPORT ® é um exemplo de um método informatizado.

[0061] O método PARENTAL SUPPORT ® faz uso de dados genéticos dos pais conhecidos, isto é, dados haplotípicos e/ou genéticos diplóides da mãe e/ou do pai, juntamente com o conhecimento do mecanismo de meiose e medição imperfeita do DNA alvo e possivelmente um ou mais indivíduos com parentesco, juntamente com frequências de corte com base populacional de forma reconstruir, in silico, o genótipo em uma pluralidade de alelos e/ou o estado de paternidade de um embrião ou qualquer (quaisquer) célula(s) alvo e DNA alvo na localização de loci principais com um alto grau de confiança. O método PARENTAL SUPPORT® faz uso de dados conhecidos dos pais genéticos, ou seja, dados haplotípicos e/ou

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33/116 genéticos diplóides da mãe e/ou do pai, juntamente com conhecimento do mecanismo de meiose e medição imperfeita do DNA alvo, para criar hipóteses sobre quais dados genéticos podem ser esperados para diferentes situações para calcular a probabilidade de cada uma das situações fornecidas nos dados genéticos observados, deste modo, determinando qual a situação é mais provável. Em algumas modalidades, a situação é questão pode incluir se o indivíduo alvo herdou um haplotipo ligado à doença de interesse, se o indivíduo alvo herdou um haplotipo ligado a fenótipo de interesse, se o indivíduo alvo tem um ou mais cromossomos aneuplóides e/ou se o indivíduo alvo está relacionado a um indivíduo de interesse e qual pode ser o grau de parentesco. O método PARENTAL SUPPORT® permite a limpeza de dados genéticos de interferência. O PARENTAL SUPPORT®pode ser particularmente relevante onde apenas uma pequena fração do material genético disponível é do indivíduo alvo (por exemplo, NPD ou NPPT) e onde medições diretas dos genótipos têm, inerentemente, interferências em virtude do sinal de DNA contaminante de outro indivíduo. O método PARENTAL SUPPORT® é capaz de reconstruir sequências alélicas diplóides ordenadas em alta precisão sobre o embrião, juntamente com o número de cópias de segmentos cromossômicos, mesmo embora a medições diplóides não ordenadas convencionais possam ser caracterizadas por altas taxas de abandono de alelos, evasões, tendências de amplificação variável e outros erros. O método pode usar tanto um modelo genético subjacente quanto um modelo subjacente de erro de medição. O modelo genético pode determinar as probabilidades de alelos em cada SNP e cruzamento de probabilidades entre SNPs. Probabilidades de alelos podem ser modeladas em cada SNP com base em dados obtidos dos pais e cruzar o modelo de probabilidades entre SNPs com base em dados obtidos a partir do banco de dados HapMap, desenvolvido pelo

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Intemational HapMap Project. Dado o modelo genético subjacente adequado e modelo de erro de medição, estimativa maximum a posteríorí (MAP) pode ser usada, com modificações para eficiência computacional, para estimar os valores de alelos ordenados corretos para cada SNP no embrião.

Definições [0062] Polimorfismo de um Único Nucleotídeo (Single Nucleotide Polymorphism - SNP) refere-se a um nucleotídeo que pode ser diferente entre os genomas de dois membros da mesma espécie. O uso do termo não implica em qualquer limite para a frequência com a qual cada variante ocorre.

[0063] Sequência refere-se a uma sequência de DNA ou uma sequência genética. Ela pode referir-se à estrutura física primária da molécula ou fita de DNA em um indivíduo. Ela pode referir-se à sequência de nucleotídeos encontradas nessa molécula de DNA ou à fita complementar da molécula de DNA. Ela pode referir-se à informação contida na molécula de DNA como sua representação in silico.

[0064] Locus refere-se a uma determinada região de interesse sobre o DNA de um indivíduo, a qual pode referir-se a um SNP, o local de uma possível inserção ou deleção ou o local de alguma outra variação genética relevante. SN Ps relacionados à doença também pode referir-se a loci ligados à doença.

[0065] Alelo Polimórfico, também locus polimórfica, refere-se a um alelo ou locus onde o genótipo varia entre os indivíduos de uma determinada espécie. Alguns exemplos de alelos polimórficos incluem polimorfismos de um único nucleotídeo, repetições aleatórias curtas, deleções, duplicações e inversões.

[0066] Sítio Polimórfico refere-se a nucleotídeos específicos encontrados em uma região polimórfica que varia entre os indivíduos.

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35/116 [0067] Alelo refere-se a genes que ocupam um locus em particular.

[0068] Dados Genéticos, também Dados Genotípicos, refere-se a dados que descrevem aspectos do genoma de um ou mais indivíduos. Eles podem referir-se a um ou um conjunto de loci, sequências parciais ou inteiras, cromossomos parcial ou inteiros ou ao genoma inteiro. Eles podem referir-se à identidade de um ou uma pluralidade de nucleotídeos; eles podem referir-se a um conjunto de nucleotídeos sequenciais ou nucleotídeos de diferentes localizações no genoma ou uma combinação dos mesmos. Dados genotípicos são, tipicamente, in silico, no entanto, também é possível considerar nucleotídeos físicos de uma sequência como dados genéticos quimicamente codificados. Dados genotípicos podem ser ditos como estando sobre, de, em, a partir de ou no indivíduo(s). Dados genotípicos podem referir-se à medições resultantes de uma plataforma de genotipagem onde essas medições são feitas em material genético.

[0069] Material Genético, também Amostra Genética, refere-se à matéria física, tal como tecido ou sangue, de um ou mais indivíduos compreendendo DNA ou RNA.

[0070] Confiança refere-se à probabilidade estatística de que o SNP atribuído, alelo, conjunto de alelos, atribuição de ploidia ou atribuição de paternidade está correto.

[0071] Aneuploidia refere-se ao estado onde o número errado de cromossomos está presente em uma célula. No caso de uma célula humana somática, ela pode referir-se ao caso onde uma célula não contem 22 pares de cromossomos autossômicos e um par de cromossomos sexuais. No caso de um gameta humano, ela pode referir-se ao caso onde uma célula não contém um de cada um dos 23 cromossomos. No caso de um único tipo de cromossomo, ela pode

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36/116 referir-se ao caso onde mais ou menos de dois homólogos, mas não cópias cromossômicas idênticas, estão presentes ou onde há duas cópias presentes do cromossomo que se originam do mesmo pai. [0072] Cromossomo pode referir-se a uma única cópia cromossômica, ou seja, uma única molécula de DNA, da qual existem 46 em uma célula somática normal; um exemplo é o cromossomo 18 de origem materna. Cromossomo também pode referir-se a um tipo de cromossomo, do qual existem 23 em uma célula somática humana normal; um exemplo é cromossomo 18.

[0073] Monossomia refere-se ao estado onde uma célula contém apenas um de um tipo de cromossomo.

[0074] Dissomia refere-se ao estado onde uma célula contém dois de um tipo de cromossomo.

[0075] Dissomia Uniparental refere-se ao estado onde uma célula contém dois de um tipo de cromossomo e onde ambos os cromossomos são originários de um dos pais.

[0076] Trissomia refere-se ao estado onde uma célula contém três de um tipo de cromossomo.

[0077] O Estado do Material Genético ou simplesmente Estado Genético pode referir-se à identidade de um conjunto de SNPs sobre o DNA, aos haplotipos eliminados no material genético ou à sequência do DNA, incluindo deleções, inserções, repetições e mutações. Ele também pode referir-se ao estado de ploidia de um ou mais cromossomos, segmentos cromossômicos ou conjunto de segmentos cromossômicos.

[0078] Estabelecimento da Paternidade ou Determinação da Paternidade refere-se ao estabelecimento ou determinação se um suposto pai é ou não é o pai biológico de um feto em gestação ou determinação ou estabelecimento da probabilidade de que um suposto pai é o pai biológico do feto.

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37/116 [0079] Determinação de Paternidade refere-se à determinação se o suposto pai é ou não o pai biológico do feto. Uma determinação de paternidade é o resultado de estabelecimento, atribuição ou determinação da paternidade.

[0080] Paternidade refere-se à identidade do pai biológico de um indivíduo.

[0081] Inclusão de Paternidade refere-se ao estabelecimento de que um suposto pai é o pai biológico de um feto.

[0082] Exclusão de Paternidade refere-se ao estabelecimento de que um suposto pai não é o pai biológico de um feto.

[0083] Suposto Pai refere-se a um homem cuja relação paterna com um feto está em questão.

[0084] Pai Biológico de um indivíduo refere-se ao homem cujo material genético foi herdado pelo indivíduo.

[0085] Proporção Alélica refere-se à proporção entre a quantidade de cada alelo em um locus polimórfico que está presente em uma amostra ou em um indivíduo. Quando a amostra é medida por sequenciamento, a proporção alélica pode referir-se à proporção de sequência lida que mapeia a cada alelo no locus. Quando a amostra é medida por meio de um método de medição com base em intensidade, a proporção de alelo pode referir-se à proporção entre as quantidades de cada alelo presente neste locus, conforme estimado pelo método de medição.

[0086] Distribuição Alélica ou Distribuição de Contagem Alelo refere-se à quantidade relativa de cada alelo que está presente para cada locus em um conjunto de loci. Uma distribuição alélica pode referir-se a um indivíduo, a uma amostra ou a um conjunto de medições feitas sobre uma amostra. No contexto de sequenciamento, distribuição alélica refere-se ao número ou número provável de leituras que mapeiam a um alelo em particular para cada alelo de um conjunto

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38/116 de loci polimórficos. As medições de alelos podem ser tratadas probabilisticamente, isto é, a probabilidade de que um determinado alelo esteja presente para proporcionar uma leitura de sequência é uma fração entre 0 e 1 ou podem ser tratadas de uma forma binária, isto é, qualquer determinada leitura é considerada como sendo exatamente zero ou uma cópia de um alelo em particular.

[0087] Tendência Alélica refere-se ao grau ao qual a proporção medida de alelos em um locus heterozigótico é diferente da proporção que estava presente na amostra de DNA original. O grau de tendência alélica em um locus particular é igual à proporção alélica observada neste locus, conforme medido, dividido pela proporção de alelos na amostra de DNA original neste locus. Tendência alélica pode ser definida como sendo maior do que um de modo que, se o cálculo do grau de tendência alélica retoma para um valor x que é menor do que 1, então, o grau de tendência alélica pode ser restabelecido como 1/x. Tendência alélica pode ser em virtude de tendência de amplificação, tendência de purificação ou algum outro fenômeno que afeta diferentes alelos diferentemente.

[0088] Iniciador, também Sonda de PCR refere-se a uma única molécula de DNA (um oligômero de DNA) ou um conjunto de moléculas de DNA (oligômeros de DNA) onde as moléculas de DNA são idênticas ou quase e onde o iniciador contém uma região que é concebida para hibridizar com um locus polimórfico alvo e podem conter uma sequência de iniciação concebida para permitir amplificação por PCR. Um iniciador pode também conter um código de barras molecular. Um iniciador pode conter uma região aleatória que é diferente para cada molécula individual.

[0089] Sonda de Captura Híbrida refere-se à qualquer sequência de ácido nucleico, possivelmente modificada, que é gerada por meio de vários métodos, tais como PCR ou síntese direta, e se destina a ser

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39/116 complementar a uma fita de uma sequência de DNA alvo específica em uma amostra. As sondas de captura híbridas exógenas podem ser adicionadas a uma amostra previamente preparada e hibridizadas através de um processo de desnaturação-reanelamento para formar duplas de fragmentos exógenos/endógenos. Estas duplas podem, então, ser fisicamente separadas da amostra através de vários meios. [0090] Leitura de Sequência refere-se a dados que representam uma sequência de bases de nucleotídeos que foram medidas usando um método de sequenciamento clonal. Sequenciamento clonal pode produzir dados de sequência que representam um único clone ou clones ou agrupamentos da molécula de DNA original. Uma leitura de sequência também pode ter associado o escore de qualidade em cada posição da sequência que indica a probabilidade de que um nucleotídeo tenha sido atribuído corretamente.

[0091] Mapeamento de uma Leitura de Sequência é o processo de determinação da localização de uma leitura de sequência de origem na sequência genômica de um organismo em particular. A localização de origem das leituras de sequência é com base na similaridade da sequência de nucleotídeos da leitura e sequência genômica.

[0092] Homozigoto refere-se a ter alelos similares nos loci cromossômicos correspondentes.

[0093] Heterozigoto refere-se a ter alelos diferentes nos loci cromossômicos correspondentes.

[0094] Taxa de Heterozigosidade refere-se à taxa de indivíduos na população tendo alelos heterozigotos em um determinado locus. A taxa de heterozigosidade pode também referir-se à proporção esperada ou medida entre alelos em determinado locus em um indivíduo ou em uma amostra de DNA.

[0095] Haplotipo refere-se a uma combinação de alelos em múltiplos loci que são normalmente herdados juntos sobre o mesmo

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40/116 cromossomo. O haplotipo pode referir-se apenas a dois loci ou a um cromossomo inteiro, dependendo do número de eventos de recombinação que tenham ocorrido entre um determinado conjunto de loci. Haplotipo pode também referir-se a um conjunto de polimorfismos de um único nucleotídeo (Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs) em uma única cromátide que estão estatisticamente associados.

[0096] Dados haplotípicos, também Dados Eliminados ou Dados Genéticos Ordenados, refere-se a dados de um único cromossomo em um genoma diplóide ou poliplóide, ou seja, quer a cópia materna ou paterna segregada de um cromossomo em um genoma diplóide.

[0097] Eliminação refere-se ao ato de determinação dos dados genéticos haplotípicos de um indivíduo com base em dados genéticos diplóides (ou poliplóides) desordenados. Ela pode referir-se ao ato de determinar qual dos dois genes em um alelo, para um conjunto de alelos encontrados sobre um cromossomo, estão associados com cada um dos dois cromossomos homólogos em um indivíduo.

[0098] Dados Eliminados refere-se a dados genéticos onde um ou mais haplotipos foram determinados.

[0099] Fetal refere-se a do feto ou da região da placenta que é geneticamente similar ao feto. Em uma mulher grávida, uma parte da placenta é geneticamente similar ao feto e o DNA fetal em flutuação livre encontrado no sangue materno pode ter se originado da parte da placenta com um genótipo que coincide com o feto.

[00100] DNA de Origem Fetal refere-se ao DNA que era originalmente parte de uma célula cujo genótipo era essencialmente equivalente àquele do feto. Deverá ser notado que a informação genética em metade dos cromossomos de um feto é herdada da mãe do feto; em algumas modalidades, o DNA destes cromossomos herdados maternalmente que se originam de uma célula fetal é

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41/116 considerado como sendo de origem fetal e não de origem materna. [00101] DNA de Origem Materna refere-se ao DNA que era originalmente parte de uma célula cujo genótipo era essencialmente equivalente àquele da mãe.

[00102] Criança pode referir-se a um embrião, um blastômero ou um feto. Deverá ser notado que, nas modalidades presentemente descritas, os conceitos descritos se aplicam igualmente a indivíduos que são de uma criança recém-nascida, um feto, um embrião ou um conjunto de células resultantes do mesmo. O uso do termo criança pode ser simplesmente destinado a denotar que o indivíduo referido como a criança tem a descendência genética dos pais.

[00103] Parental refere-se à mãe ou pai genético de um indivíduo. Um indivíduo tem, em geral, dois pais, uma mãe e um pai, embora este possa não ser necessariamente o caso, tal como em quimerismo genético ou cromossômico.

[00104] Mãe pode referir-se à mãe biológica de um indivíduo e/ou pode referir-se às mulher que está trazendo o indivíduo que ela gesta.

[00105] Contexto Parental refere-se ao estado genético de um determinado SNP sobre cada um dos dois cromossomos relevantes para um ou ambos os pais do alvo.

[00106] Plasma Materno refere-se à porção plasmática do sangue de uma mulher que está grávida.

[00107] Decisão Clínica refere-se à qualquer decisão de tomar ou não tomar uma ação que tem um resultado que afeta a saúde ou sobrevivência de um indivíduo. No contexto de testagem de paternidade pré-natal, uma decisão clínica pode referir-se a uma decisão de abortar ou não abortar um feto. A decisão clínica também pode referir-se à decisão de realizar mais testes ou tomar medidas para se preparar para o nascimento de uma criança.

[00108] Caixa de Diagnóstico refere-se a um ou uma combinação

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42/116 de máquinas destinadas a realizar uma ou uma pluralidade de aspectos dos métodos descritos aqui. Em uma modalidade, a caixa de diagnóstico pode ser colocada em um ponto de atendimento ao paciente. Em uma modalidade, a caixa de diagnóstico pode realizar amplificação objetivada, seguido por sequenciamento. Em uma modalidade, a caixa de diagnóstico pode funcionar sozinha ou com o auxílio de um técnico.

[00109] Método Informatizado ou Abordagem Informatizada refere-se a um método que depende fortemente de estatística para dar sentido a uma grande quantidade de dados. No contexto de diagnóstico pré-natal, ele refere-se a um método concebido para determinar o estado de ploidia em um ou mais cromossomos ou o estado alélico em um ou mais alelos ao inferir estatisticamente o estado mais provável, em vez de medir o estado físico de maneira direta com base em uma grande quantidade de dados genéticos, por exemplo, a partir de um arranjo molecular ou sequenciamento. Em uma modalidade da presente descrição, a técnica informatizada pode ser uma descrita nesta patente. Em uma modalidade da presente descrição, ela pode ser PARENTAL SUPPORT®.

[00110] Enriquecimento Preferencial de DNA que corresponde a um ou a uma pluralidade de loci ou enriquecimento preferencial de DNA em um ou uma pluralidade de loci refere-se a qualquer método que resulta no percentual de moléculas de DNA em uma mistura de DNA pós-enriquecimento que corresponde aos loci que é maior do que o percentual de moléculas de DNA na mistura de DNA préenriquecimento que correspondem aos loci. O método pode envolver amplificação seletiva de moléculas de DNA que correspondem aos loci. O método pode envolver remoção de moléculas de DNA que não correspondem aos loci.

[00111] Amplificação refere-se a um método que aumenta o número

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43/116 de cópias de uma molécula de DNA.

[00112] Amplificação Seletiva pode referir-se a um método que aumenta o número de cópias de uma determinada molécula de DNA ou moléculas de DNA que correspondem a uma região de DNA em particular. Ela também pode referir-se a um método que aumenta o número de cópias de uma determinada molécula de DNA alvo ou região de DNA alvo aumenta mais do que as moléculas ou regiões de DNA não alvo. Amplificação seletiva pode ser um método de enriquecimento preferencial.

[00113] Sequência de Produção Universal refere-se a uma sequência de DNA que pode ser acrescentada a uma população de moléculas de DNA alvo, por exemplo, por meio de ligação, por PCR ou ligação mediada por PCR. Uma vez adicionada à população de moléculas alvo, iniciadores específicos para as sequências de produção universal podem ser usados para amplificar a população alvo usando um único par de iniciadores de amplificação. Sequências de produção universais normalmente não estão relacionadas às sequências alvo.

[00114] Adaptadores Universais ou Adaptadores de Ligação ou Tags de Biblioteca são moléculas de DNA contendo uma sequência de produção universal que pode ser covalentemente ligada às extremidades 5' e 3' de uma população de moléculas de DNA fita dupla alvo. A adição dos adaptadores permite sequências de produção universal às extremidades 5' e 3' da população alvo a partir das quais a amplificação por PCR pode ocorrer, amplificando todas as moléculas a partir da população alvo usando um único par de iniciadores de amplificação.

[00115] Objetivação refere-se a um método usado para amplificar seletivamente ou de outro modo enriquecer preferencialmente aquelas moléculas de DNA que correspondem a um conjunto de loci em uma

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44/116 mistura de DNA.

[00116] H/póterefere-se-se à possibilidade de que o suposto pai é o pai biológico do feto ou de que o suposto pai não é o pai biológico do feto.

[00117] Determinação, estabelecimento e cálculo podem ser usados altemadamente.

Contextos Parentais [00118] O contexto parental refere-se ao estado genético de um determinado alelo sobre cada um dos dois cromossomos relevantes para um ou ambos os pais do alvo. Deverá ser notado que, em uma modalidade, o contexto parental não refere-se ao estado alélico do alvo; antes, ele refere-se ao estado alélico dos pais. O contexto parental para um determinado SNP pode consistir em quatro pares de bases, dois paternos e dois matemos; eles podem ser iguais ou diferentes uns dos outros. Ele é geralmente escrito como mim2|fif2, onde mi e nr)2 são o estado genético de um determinado SNP nos dois cromossomos matemos e fi e f₂ são o estado genético de um determinado SNP nos dois cromossomos paternos. Em algumas modalidades, o contexto parental pode ser escrito como fif2|mim2. Note que os subscritos 1 e 2 referem-se ao genótipo, em determinado alelo, dos primeiro e segundo cromossomos; note também que a escolha de qual cromossomo é marcado como 1 e qual é marcado como 2 pode ser arbitrária.

[00119] Note-se que, na presente descrição, A e B são, muitas vezes, usados para representar genericamente identidades de pares de base; A ou B poderíam igualmente representar C (citosina), G (guanina), A (adenina) ou T (timina). Por exemplo, se, em um determinado alelo com base em SNP, o genótipo da mãe era T neste SNP sobre um cromossomo e G neste SNP no cromossomo homólogo e o genótipo paterno neste alelo é G neste SNP sobre ambos os

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45/116 cromossomos homólogos, pode-se dizer que o alelo do indivíduo alvo tem o contexto parental de AB|BB; mas também poderia ser dito que o alelo tem o contexto parental de AB|AA. Note que, em teoria, qualquer um dos quatro possíveis nucleotídeos poderia ocorrer em um determinado alelo e, assim, é possível, por exemplo, que a mãe tenha um genótipo de AT e o pai tenha um genótipo de GC em um determinado alelo. No entanto, dados empíricos indicam que, na maioria dos casos, apenas dois dos quatro pares de bases possíveis são observados em um determinado alelo. É possível, por exemplo, quando se usa repetições aleatórias únicas, ter mais de dois contextos parentais, mais de quatro e até mais de dez. Na presente descrição, a discussão assume que apenas dois possíveis pares de base serão observados em um determinado alelo, embora as modalidades descritas aqui possam ser modificadas para levar em conta os casos onde tal pressuposição não se sustenta.

[00120] Um contexto parental pode referir-se a um conjunto ou subconjunto de SNPs alvo que têm o mesmo contexto parental. Por exemplo, se fosse para medir 1000 alelos em um determinado cromossomo sobre um alvo individual, então, o contexto AA|BB poderia referir-se ao conjunto de todos os alelos no grupo de 1.000 alelos onde o genótipo da mãe do alvo era homozigótico e o genótipo do pai do alvo é homozigótico, mas onde o genótipo materno e o genótipo paterno são diferentes nesse locus. Se os dados paternos não são eliminados e, portanto, AB = BA, então, há nove possíveis contextos parentais: AA|AA, AA|AB, AA|BB, AB|AA, AB|AB, AB|BB, BB|AA, BB|AB e BB|BB. Se os dados paternos são eliminados e, portanto, AB Ψ BA, então, há dezesseis diferentes contextos parentais possíveis: AA|AA, AA|AB, AA|BA, AA|BB, AB|AA, AB|AB, AB|BA, AB|BB, BA|AA, BA|AB, BA|BA, BA|BB, BB|AA, BB|AB, BB|BA e BBjBB. Cada alelo de SNP em um cromossomo, excluindo alguns

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SNPs sobre os cromossomos sexuais, tem um destes contextos parentais. O conjunto de SNPs em que o contexto parental para um progenitor é heterozigótico pode ser referido como o contexto heterozigótico.

Diferentes implementações das modalidades Atualmente divulgadas [00121] Método são aqui divulgados para determinar a paternidade de uma pessoa alvo. O indivíduo pode ser um alvo de blastômeros, um embrião ou um feto. Em algumas modalidades da presente descrição, um método para determinar a paternidade de um indivíduo pode incluir qualquer uma das etapas descritos neste documento e as combinações dos mesmos:

[00122] Em algumas modalidades a fonte de material genético a ser usado na determinação da paternidade do feto podem ser células fetais, tais como glóbulos vermelhos nucleados fetais, isoladas a partir do sangue materno. O método pode envolver a obtenção de uma amostra de sangue da gestante. Em algumas modalidades da presente descrição, o material genético a ser usado na determinação da paternidade do feto pode libertar o DNA flutuante a partir de plasma materno, em que o DNA de em flutuação livre pode ser constituído por uma mistura de DNA fetal e materna.

[00123] Em algumas modalidades, a fonte do material genético do feto podem ser células fetais, tais como glóbulos vermelhos nucleados fetais, isolados a partir do sangue materno. O método pode envolvera obtenção de uma amostra de sangue da gestante. O método pode incluir o isolamento de uma célula sanguínea vermelho fetal usando técnicas visuais, com base na ideia de que uma determinada combinação de cores são exclusivamente associada a glóbulos vermelhos nucleados e uma combinação similar de cores não está associada a qualquer outra célula presente no materna sangue. A

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47/116 combinação de cores associada com os glóbulos vermelhos nucleados podem incluir a cor vermelha da hemoglobina em torno do núcleo, o que a cor pode ser tornada mais distinta por coloração e a cor do material nuclear, que podem ser coradas, por exemplo, azul. Ao isolar as células de sangue materno e espalhá-los por cima de uma lâmina e depois a identificação dos pontos nos quais se vê tanto vermelho (a partir da hemoglobina) e azul (a partir do material nuclear), uma pode ser capaz de identificar a localização de glóbulos vermelhos nucleados células. Pode-se, então, extrair os glóbulos vermelhos nucleados, usando um micromanipulador, usar a genotipagem e/ou técnicas de sequenciamento para medir aspectos do genótipo do material genético nas células.

[00124] Em uma modalidade, pode-se corar o glóbulo vermelho nucleado com uma fieira que apenas fluoresce na presença de hemoglobina fetal, hemoglobina não materna e assim eliminar a ambiguidade entre se um glóbulo vermelho nucleado é derivado da mãe ou o feto. Algumas modalidades da presente descrição pode envolver a coloração ou de outra forma marcar o material nuclear. Algumas modalidades da presente descrição podem envolver especificamente marcação de material nuclear fetais, usando anticorpos específicos de células fetais.

[00125] Existem muitas outras formas de isolar células fetais a partir do sangue materno ou DNA fetal a partir de sangue materno ou para enriquecer amostras de material genético fetal na presença de material genético materno. Alguns destes métodos são listados aqui, mas isto não pretende ser uma lista exaustiva. Algumas técnicas apropriadas estão listados aqui por conveniência: usando anticorpos fluorescentes ou não marcados, cromatografia de exclusão de tamanho, etiquetas de afinidade magneticamente ou não rotulados, as diferenças epigenéticas, como a metilação diferencial entre as células maternas e

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48/116 fetais de alelos específicos, centrifugação em gradiente de densidade sucedido por CD45/14 exaustão e seleção CD71 positivo a partir de células-negativa CD45/14, gradientes de Percoll individuais ou duplos com diferentes osmolalidades ou método específico lectina galactose. [00126] Em algumas modalidades, a amostra genética, podem ser preparados, isolados e/ou purificados. Em algumas modalidades, a amostra pode ser centrifugada para separar várias camadas. Em algumas modalidades da preparação do DNA pode envolver a amplificação, separação, a purificação por cromatografia, a purificação poreletroforese, filtração, separação de líquido-líquido, o isolamento, a precipitação, o enriquecimento preferencial, a amplificação preferencial, a amplificação alvo ou qualquer um de uma série de outras técnicas ou conhecida na arte ou aqui descrita.

[00127] Em algumas modalidades, o método da presente descrição pode envolver amplificação de DNA. A amplificação do DNA, um processo que transforma uma pequena quantidade de material genético para uma maior quantidade de material genético que compreende um conjunto similar de dados genéticos, pode ser feito por uma variedade de métodos, incluindo, mas não se limitando a reação em cadeia da polimerase (PCR). Um método de amplificação de DNA é a amplificação do genoma inteiro (WGA). Há um número de métodos disponíveis para WGA: ligação mediada por PCR (LM-PCR), oligonucleotídeo degenerado de iniciadores de PCR (DOP-PCR), amplificação por deslocamento e múltipla (MDA). Em LM-PCR, sequências de DNA curtas chamadas adaptadores são ligados a extremidades lisas de DNA. Esses adaptadores conter sequências de amplificação universais, os quais são usados para amplificar o DNA por PCR. Em DOP-PCR, iniciadores aleatórios que também contenham sequências de amplificação universais são usados em uma primeira rodada de recozimento e PCR. Em seguida, uma segunda

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49/116 ronda de PCR usados para amplificar as sequências mais com as sequências iniciadoras universais. MDA usa o fi-polimerase de 29, que é uma enzima altamente processadora e não específica de DNA que se replica e tem sido usado para a análise de uma única célula. Amplificação do genoma inteiro de uma única célula tem sido usada com sucesso para uma variedade de aplicações para um número de anos. Há outros métodos de amplificação de DNA a partir de uma amostra de DNA. A amplificação de DNA transforma a amostra inicial de DNA em uma amostra de DNA, que é similar no conjunto de sequências, mas de muito maiores quantidades. Em alguns casos, pode não ser necessária a amplificação.

[00128] Em algumas modalidades, o DNA pode ser amplificado usando uma amplificação universais, tais como WGA ou MDA. Em algumas modalidades, o DNA pode ser amplificado por amplificação específica, por exemplo, usando PCR dirigida ou sondas de circularização. Em algumas modalidades, o DNA pode ser preferencialmente enriquecida usando um método de amplificação do alvo ou um método que resulta na separação total ou parcial de DNA desejado a partir indesejada, tais como captura por hibridização abordagens. Em algumas modalidades, o DNA pode ser amplificado usando uma combinação de um método de amplificação universal e um método de enriquecimento preferencial. Uma descrição mais detalhada de alguns desses métodos podem ser encontrados em outras partes deste documento.

[00129] Os dados genéticos do indivíduo alvo e/ou do indivíduo aparentados,podem ser transformadas de um estado molecular para um estado eletrônico medindo o material genético apropriado o uso de ferramentas ou técnicas e feita a partir de um grupo incluindo, mas não limitados a: microarranjos genotipagem e sequenciamento de alto rendimento. Alguns alto rendimento sequenciamento métodos incluem

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Sanger sequenciamento de DNA, piro-sequenciamento, a plataforma Solexa ILLUMINA GENOME ANALYZER ou 454 plataforma de sequenciamento é aplicado BIOSYSTEM, TRUE única molécula de Helicos SEQUENCIAMENTO plataforma, microscópio eletrônico de Halcyon MOLECULAR método ou qualquer outro método de sequenciamento de sequenciamento. Todos estes métodos de transformar-se fisicamente os dados genéticos armazenados em uma amostra de DNA para um conjunto de dados genéticos, que está tipicamente armazenados em um dispositivo de memória em rota para ser processado.

[00130] Os dados genéticos de um indivíduo em causa pode ser medido por análise de substâncias feita a partir de um grupo incluindo, mas não limitados a: tecido do indivíduo grandes quantidades diplóide, uma ou mais células diplóides do indivíduo, um ou mais células haplóides do indivíduo, um ou mais blastômeros a partir do material genético alvo individual, extra-celular encontrado no material genético particular, extra-celular do indivíduo encontrado no sangue materno, a partir de células do indivíduo encontrado no sangue materno, de um ou mais embriões criados a partir de uma gameta do indivíduo aparentados, um ou mais blastômeros feita a partir de um tal embrião, o material genético extra-celular encontrado no material aparentado com o indivíduo, genética conhecida para ter originado a partir do indivíduo aparentados e combinações dos mesmos.

[00131] Em algumas modalidades, a probabilidade de que um suposto pai é o pai biológico de um feto podem ser calculados. Em algumas modalidades, a determinação de paternidade podem ser usados para tomar uma decisão clínica. Este conhecimento, tipicamente armazenado como uma disposição física do matéria em um dispositivo de memória, pode então ser transformado em um relatório. O relatório pode então ser posta em prática. Por exemplo, a

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51/116 decisão clínica pode ser a de interromper a gravidez, altemadamente, a decisão clínica pode ser a de continuar a gravidez.

[00132] Em uma modalidade da presente descrição, qualquer um dos métodos descritos aqui podem ser modificados para permitir a múltiplos alvos para vir de alvo mesmo indivíduo, por exemplo, sangue múltipla extrai da mesma gestante. Isto pode melhorar a precisão do modelo, conforme medições múltiplas genéticos podem fornecer mais dados com os quais o genótipo alvo pode ser determinada. Em uma modalidade, um único conjunto de dados genéticos serviu como alvo os dados primários, que foi relatado e o outro serve como dados para verificar novamente os dados genéticos alvo primários. Em uma modalidade, uma pluralidade de conjuntos de dados genéticos, cada um medido a partir de material genético tirado a partir do indivíduo alvo, são consideradas em paralelo e, assim, ambos os conjuntos de dados genéticos alvo servir para ajudar a determinar a paternidade do feto.

[00133] Em uma modalidade, o método pode ser usado para a finalidade de teste de paternidade. Por exemplo, dada a informação genotípica com base SNP da mãe e de um homem que pode ou não ser o pai genético e a informação genotípica medido a partir da amostra mista, é possível determinar se a informação genotípica do macho de fato representa que o pai genético real do feto em gestação. Uma maneira simples de fazer isso é simplesmente olhar para os contextos em que a mãe é AA e o possível pai é AB ou BB. Nestes casos, pode-se esperar para ver a contribuição metade pai (AA | AB) ou todos (AA | BB) do tempo, respectivamente. Tendo em conta a expectativa de ADO, é simples determinar se ou não os SNPs fetal que são observados estão coraparentados com os da possível pai. Outros métodos para fazer uma determinação de paternidade são descritos noutro local neste documento.

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52/116 [00134] Em uma modalidade da presente descrição, uma gestante gostaria de determinar se um homem é o pai biológico do seu feto. Ela vai para o seu médico e dá uma amostra de seu sangue e ela e seu marido dá amostras de seu próprio DNA a partir de esfregaços da bochecha. Genótipos um pesquisador do laboratório de DNA parental usando o protocolo MDA para amplificar o DNA parental e IIlumina Infinium matrizes para medir os dados genéticos dos pais em um grande número de SNPs. O pesquisador gira então para baixo o sangue, converte o plasma e isolados de uma amostra de DNA em flutuação livre usando cromatografia de exclusão de tamanho. Altemativamente, o investigador usa um ou mais anticorpos fluorescentes, tal como aquele que é específico para a hemoglobina fetal para isolar um glóbulo vermelho nucleado fetal. O pesquisador então converte o material genético fetal isolado ou enriquecido e amplifica-o usando uma biblioteca de 70-mer oligonucleotídeos adequadamente concebido de tal modo que duas extremidades de cada um dos oligonucleotídeos corresponderam às sequências flanqueadoras em ambos os lados de um alelo alvo. Depois da adição de uma polimerase, ligase e os reagentes adequados, os oligonucleotídeos foram submetidos a circularização o preenchimento de lacunas, capturando o alelo desejado. A exonuclease foi adicionado, inativado pelo calor e os produtos foram usados diretamente como um molde para a amplificação por PCR. Os produtos de PCR foram sequenciados em um analisador GENOME ILLUMINA. A sequência lê foram usados como entrada para o método PARENTAL SUPPORT™, que então previsto o estado de ploidia do feto. O método determina que o suposto pai não é o pai biológico do feto e calcula a confiança na determinação de 99,98%. Um relatório é gerado divulgando tanto a determinação da paternidade e a confiança da determinação.

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53/116 [00135] Em outra modalidade a mulher que está grávida quer saber se um homem é o pai biológico de seu feto. O obstetra tem uma coleta de sangue da mãe e do pai. O sangue é enviado para um laboratório, onde um centrifugadores técnico da amostra materna para isolar o plasma e a cobertura amarelada. O DNA na cobertura amarelada e a amostra de sangue paterno são transformadas com a amplificação e os dados genéticos codificados no material genético amplificado é ainda transformado a partir de dados armazenados em genética molecular dados genéticos armazenados eletronicamente, executando o material genético em um sequenciador de alto rendimento para medir os genótipos parentais. A amostra de plasma é preferencialmente enriquecida em um conjunto de loci usando um método hemi-agrupada PCR alvo 5,000 complexa. A mistura de fragmentos de DNA é preparada em uma biblioteca de DNA adequada para sequenciamento. O DNA é então sequenciado usando um método de sequenciamento de alto rendimento, por exemplo, ILLUMINAGAIIxGENOME ANALYZER. A sequenciamento transforma a informação que é codificada molecularmente no DNA em que a informação é codificada eletronicamente no hardware do computador. Uma técnica baseada em informática, que inclui as modalidades presentemente divulgadas, tais como PARENTAL SUPPORT®, podem ser usadas para determinar a paternidade do feto. Isto pode implicar o cálculo, por um computador, o alelo contagens na pluralidade de loci polimórficos a partir das medições feitas no DNA da amostra enriquecida e determinação da probabilidade de que o homem é o pai biológico do seu feto. A probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico do feto é determinado a ser de 99,9999%, e a confiança da determinação de paternidade é calculado em 99,99%. Um relatório é impresso ou enviado eletronicamente a obstetra da gestante, que transmite a determinação para a mulher. A mulher, o marido e o

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54/116 médico sentar e discutir o relatório.

[00136] Em uma modalidade, o material genético em bruto da mãe, o pai e é transformada por meio de amplificação a uma quantidade de DNA que é similar em sequência, mas em maior quantidade. Em seguida, por meio de um método de genotipagem, os dados genotípicos que são codificados pelos ácidos nucleicos que se transforma em medições genéticas que podem ser armazenados fisicamente e/ou eletronicamente em um dispositivo de memória, tais como aqueles descritos acima. Os algoritmos relevantes que a composição do algoritmo PARENTAL SUPPORT®, partes relevantes que são discutidos em detalhe aqui, são traduzidos em um programa de computador, usando uma linguagem de programação. Então, através da execução de um programa de computador no hardware do computador, em vez de serem bits e bytes codificadas fisicamente, dispostos em um padrão que representa dados de medição primas, tomam-se transformado em um padrão que representa uma determinação da confiança elevada a paternidade do feto. Os detalhes desta transformação dependerá dos dados em si e a linguagem de computador e sistema de hardware usado para executar o método descrito aqui. Em seguida, os dados que são fisicamente configurado para representar uma determinação de paternidade a alta qualidade do feto é transformado em um relatório que pode ser enviado para um profissional de cuidados de saúde. Esta transformação pode ser feita através de uma impressora ou um monitor de computador. O relatório pode ser uma cópia impressa, em papel ou outro meio adequado ou então ele pode ser eletrônico. No caso de um relatório eletrônico, que pode ser transmitida, isto pode ser fisicamente armazenados em um dispositivo de memória de um local no computador acessível pelo profissional de cuidados de saúde, mas também pode ser exibida na tela de um modo que possa ser lido. No caso de uma tela, os dados

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55/116 podem ser transformados para um formato legível por causar a transformação física de pixels do dispositivo de exibição. A transformação pode ser conseguida por meio de queima fisicamente elétrons para uma tela de fósforo, por meio de uma alteração de carga elétrica que muda fisicamente a transparência de um conjunto específico de pixels em um ecrã que pode encontrar-se em frente de um substrato, que emite ou absorve fótons. Esta transformação pode ser conseguida por meio da alteração da orientação das moléculas de nanoescala em um cristal líquido, por exemplo, a partir de nemático ou esmético fase colestérica, para um conjunto específico de pixels. Esta transformação pode ser conseguida por meio de uma corrente elétrica fótons causando a ser emitidos a partir de um conjunto específico de pixels feitos a partir de uma pluralidade de diodos emissores de luz dispostos em um padrão significativo. Esta transformação pode ser conseguida por qualquer outro meio usado para exibir a informação, tal como um ecrã de computador ou qualquer outro dispositivo de saída ou de transmissão de informações de forma. O profissional de saúde pode, então, agir sobre o relatório, de modo que os dados no relatório é transformada em uma ação. A ação pode ser a de continuar ou interromper a gravidez, caso em que um feto em gestação se transforma em feto sem vida. Como alternativa, pode-se transformar um conjunto de medidas genotípicas em um relatório que ajuda a um médico tratar o paciente grávida.

[00137] Em algumas modalidades, os métodos descritos aqui podem ser usados com uma idade gestacional muito cedo, por exemplo, tão cedo quanto de quatro semanas, a partir de cinco semanas tão cedo quanto de seis semanas, tão cedo quanto sete semanas, tão cedo quanto oito semanas tão cedo quanto nove semanas, tão cedo quanto 10 semanas, tão cedo quanto 11 semanas e, tão cedo quanto 12 semanas.

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56/116 [00138] Qualquer das modalidades aqui divulgados podem ser implementadas em um circuito eletrônico digital, circuitos integrados, especialmente concebido ASICs (circuitos integrados de aplicações específicas), hardware, firmware, software ou em combinações dos mesmos. Aparelho de uma das modalidades presentemente divulgadas podem ser implementados em um produto de programa de computador tangivelmente incorporado em um dispositivo de armazenamento legível por máquina para execução por um processador programável; método e as etapas de modalidades presentemente descritos podem ser realizados por um processador programável a execução de um programa de instruções para executar as funções das modalidades presentemente divulgadas pela operação em dados de entrada e geração de saída. As modalidades presentemente divulgadas podem ser implementadas vantajosamente em um ou mais programas de computadores que são executáveis e/ou interpretável em um sistema programável incluindo pelo menos um processador programável, que pode ser de uso geral ou especial, acoplado para receber dados e instruções a partir de e transmissão de dados e instruções para um sistema de armazenamento, pelo menos, um dispositivo de entrada e pelo menos um dispositivo de saída. Cada programa de computador pode ser implementado em uma linguagem processual ou orientada a objetos de programação de alto nível ou em linguagem de máquina de montagem ou, se desejado, e, em qualquer caso, a linguagem pode ser uma linguagem compilada ou interpretada. Um programa de computador pode ser implementado em qualquer forma, incluindo como um programa individual ou como um módulo, componente sub-rotina ou de outra unidade apropriada para o uso em um ambiente de computação. Um programa de computador pode ser implantado a serem executados ou interpretados em um computador ou em vários computadores em um site ou distribuídos em vários

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57/116 locais e interligados por uma rede de comunicação.

[00139] Meios de armazenamento de leitura por computador, tal como aqui usado, refere-se ao armazenamento físico ou tangíveis (em oposição aos sinais) e inclui, sem limitação, meios voláteis e nãovoláteis, removível e não removível implementado de qualquer método ou tecnologia para o armazenamento de informação, tais tangível como instruções legíveis por computador, estruturas de dados, módulos de programas ou outros dados. Meios de armazenamento de leitura por computador inclui, mas não está limitado a, RAM, ROM, EPROM, EEPROM, memória flash ou outra tecnologia de memória de estado sólido, de CD-ROM, um DVD ou outro tipo de armazenamento óptico, magnético, cassetes de fita magnética, armazenamento em disco magnético ou outros dispositivos de armazenamento magnéticos ou qualquer outro meio físico ou material que pode ser usado para armazenar a informação de forma tangível ou dados ou instruções e que pode ser acedido por um computador ou processador desejado. Enriquecimento e Sequenciamento Objetivado [00140] O uso de uma técnica para enriquecer uma amostra de DNA para um conjunto de loci alvo seguidos por sequenciamento como parte de um método não invasivo para a chamada pré-natal alelo ou ploidia chamada pode conferir um certo número de vantagens inesperadas. Em algumas modalidades da presente descrição, o método envolve a medição dos dados genéticos para o uso com um método informatizados, como PARENTAL SUPPORT® (PS). O resultado final de algumas das modalidades são os dados genéticos acionáveis de um embrião ou um feto. Existem muitos métodos que podem ser usados para medir os dados genéticos do indivíduo e/ou indivíduos com parentesco como parte de métodos consagrados. Em uma modalidade, um método para o enriquecimento da concentração de um conjunto de alelos alvo está descrito aqui, o método

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58/116 compreendendo uma ou mais das seguintes etapas: a amplificação do material genético alvo, a adição de loci de sondas oligonucleotídicas específicas, a ligadura de cadeias de DNA específicas, isolamento de conjuntos de DNA desejado, a remoção de componentes indesejados de uma reação, a detecção de certas sequências de DNA por hibridização e a detecção da sequência de um ou de uma pluralidade de filamentos de DNA por métodos de sequenciamento de DNA. Em alguns casos, as cadeias de DNA alvo pode referir-se a material genético, em alguns casos, pode referir-se os iniciadores, em alguns casos, pode referir-se a sequências de síntese ou combinações dos mesmos. Estas etapas podem ser realizadas em um certo número de diferentes ordens. Dada a natureza altamente variável de biologia molecular, que, geralmente, não é óbvio que os métodos e quais combinações de etapas, vai executar mal, bem ou melhor em várias situações.

[00141] Por exemplo, um etapa de amplificação universal de DNA antes da amplificação alvo podem conferir diversas vantagens, tais como a eliminar o risco de gargalos e redução de vieses alélica. O DNA pode ser misturada uma sonda oligonucleotídica que pode hibridizar com ambas as regiões vizinhas da sequência alvo, uma de cada lado. Após a hibridização, as extremidades da sonda pode ser ligado através da adição de uma polimerase, um meio de ligação e quaisquer reagentes necessários para permitir que a circularização da sonda. Após circularização, uma exonuclease pode ser adicionado ao material genético para digerir não circularizado, seguido de detecção da sonda circularizado. O DNA pode ser misturada com iniciadores de PCR que podem hibridizar com as duas regiões vizinhas da sequência alvo, uma de cada lado. Após a hibridização, as extremidades da sonda pode ser ligado através da adição de uma polimerase, um meio de ligação e quaisquer reagentes necessários para completar a

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59/116 amplificação por PCR. O DNA amplificado ou não amplificado pode ser alvo de sondas de captura híbrida que visam um conjunto de loci, após a hibridização, a sonda pode ser identificada e separada a partir da mistura para proporcionar uma mistura de DNA, que é enriquecido em sequências alvo.

[00142] Em algumas modalidades a detecção do material genético alvo pode ser feito de uma forma multiplex. O número de sequências alvo genéticas que podem ser executados em paralelo pode variar de um a dez, dez a cem, 100-1000, 1000-10000, 10000-100000, 1000001.000.000 ou de 1 a 10 milhões. Note que a técnica anterior inclui a descrição de reações de PCR bem sucedidas envolvendo multiplex pools de até cerca de 50 ou 100 iniciadores e não mais. As tentativas anteriores para multiplexar mais de 100 iniciadores por pool resultaram em problemas significativos com as reações secundárias indesejáveis, tais como a formação de dímeros de iniciadores.

[00143] Em algumas modalidades, este método pode ser usado para a genotipagem de uma única célula, um pequeno número de células, 2-5 células, de seis a dez células, as células de dez a vinte, vinte a cinquenta celular, cinquenta a cem células, cem a mil células ou uma pequena quantidade de DNA extracelular, por exemplo, de um a dez picogramas, 10-100 picogramas, a partir de uma centena de picogramas a nanogramas um, de um a dez nanogramas, 10-100 nanogramas ou a partir de cem nanogramas para um micrograma.

[00144] O uso de um método para atingir determinados loci seguidos por sequenciamento como parte de um método para a chamada alelo ou ploidia chamada pode conferir um certo número de vantagens inesperadas. Alguns métodos pelos quais o DNA pode ser alvo ou preferencialmente enriquecido, incluem o uso de sondas de circularização, sondas ligadas invertidas (lábios, MIPs), a captura por métodos de hibridização como SureSelet e direcionados PCR ou

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60/116 estratégias de amplificação ligadura mediadas PCR.

[00145] Em algumas modalidades, um método do presente revelação envolve a medição de dados genéticos paro uso com um método informatizados, como PARENTAL SUPPORT® (PS). PARENTAL SUPPORT® é uma abordagem baseada informática para manipulação de dados genéticos, aspectos dos quais são descritos a seguir. O resultado final de algumas das modalidades são os dados genéticos acionáveis de um embrião ou um feto seguido por uma decisão clínica com base nos dados acionáveis. Os algoritmos de trás do método PS tomar os dados genéticos de medição do alvo individual, muitas vezes um embrião ou um feto, os dados genéticos e medidos a partir de indivíduos com parentesco e são capazes de aumentar a precisão com que a condição genética do indivíduo alvo é conhecida. Em uma modalidade, os dados genéticos de medição é usado no contexto da realização de determinações de paternidade durante o diagnóstico genético pré-natal. Existem muitos métodos que podem ser usados para medir os dados genéticos do indivíduo e/ou os indivíduos com parentesco nos contextos acima mencionados. Os diferentes métodos de compreender um certo número de etapas, os etapas que envolvem muitas vezes a amplificação do material genético, a adição de sondas oligonucleotídeos, a ligadura de filamentos de DNA determinadas, o isolamento de conjuntos de DNA desejado, a remoção de componentes indesejados de uma reação, a detecção de certas sequências de DNA por hibridização, detecção da sequência de um ou de uma pluralidade de filamentos de DNA por métodos de sequenciamento de DNA. Em alguns casos, as cadeias de DNA alvo pode referir-se a material genético, em alguns casos, pode referir-se os iniciadores, em alguns casos, pode referir-se a sequências de síntese ou combinações dos mesmos. Estas etapas podem ser realizadas em um certo número de diferentes ordens. Dada

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61/116 a natureza altamente variável de biologia molecular, que, geralmente, não é óbvio que os métodos e quais combinações de etapas, vai executar mal, bem ou melhor em várias situações.

[00146] Algumas modalidades da presente descrição envolvem o uso de sondas invertido Linked (GPI), que foram previamente descritos na literatura. GPI é um termo genérico pretende englobar tecnologias que envolvem a criação de uma molécula circular de DNA, em que as sondas são concebidas para hibridizar com a região alvo de DNA de ambos os lados de um alelo alvo, de tal modo que a adição de polimerases apropriadas e/ou ligases e as condições apropriadas, amortecedores e outros reagentes, irá completar a Região invertido complementar de DNA em todo o alelo alvo para criar um loop circular de DNA, que capta as informações encontradas no alelo alvejado. GPI também podem ser chamados sondas pré-circularizado, sondas précircularidas ou sondas de circularização. A sonda lábios podem ser uma molécula de DNA linear entre 50 e 500 nucleotídeos de comprimento e em uma modalidade entre 70 e 100 nucleotídeos de comprimento, em algumas modalidades, pode ser mais longo ou mais curto do que o descrito aqui. Outras modalidades da presente descrição envolvem diferentes encarnações, da tecnologia de bordos, tais como sondas PADLOCKe Inversão Molecular Probes (MIPs).

[00147] Um método para atingir locais específicos para a sequenciamento é sintetizar sondas em que as extremidades 3 'e 5' das sondas se ligam ao DNA alvo em locais adjacentes a e de ambos os lados da região de destino, de um modo invertido, de tal modo que a adição da polimerase de DNA e ligase de DNA resulta na extensão da extremidade 3 ', a adição de bases a sonda de cadeia simples que sejam complementares à molécula alvo (gap-encher), seguido por ligação da nova extremidade 3' para a extremidade 5 'do sonda original tendo como resultado uma molécula de DNA circular, que

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62/116 pode ser subsequentemente isolado a partir de DNA de fundo. As extremidades da sonda são projetados para flanquear a região alvo de interesse. Um aspecto desta abordagem é vulgarmente chamado MIPS e tem sido usado em conjugação com as tecnologias da mãe para determinar a natureza da sequência preenchidos [00148] A ligação mediada por PCR é um método de PCR usada para enriquecer, preferencialmente uma amostra de DNA por amplificação de uma ou de uma pluralidade de loci de uma mistura de DNA, o método compreendendo: a obtenção de um conjunto de pares de iniciadores, em que cada iniciador do par contém um destino sequência específica e uma sequência não alvo, em que a sequência alvo específica foi concebido para hibridizar com uma região alvo, um a montante e um a jusante do sítio polimórfico; polimerização do DNA a partir da extremidade 3-prima de iniciador a montante para a encher o região de cadeia simples entre ela e a extremidade 5-prime do iniciador a jusante com os nucleotídeos complementares da molécula alvo; ligadura da última base polimerizada do iniciador a montante da base de 5-prime adjacente a jusante do iniciador e amplificação de apenas polimerizado e ligou-se, usando as moléculas de sequências não alvo contido na extremidade 5-prime do iniciador a montante e a extremidade 3 primo do iniciador a jusante. Os pares de iniciadores para alvos distintos podem ser misturados na mesma reação. As sequências não alvo servir como sequências universais de tal modo que todos os pares de iniciadores que foram polimerizados com êxito e ligado pode ser amplificado com um único par de iniciadores de amplificação.

[00149] Em uma modalidade, uma amostra de DNA pode ser preferencialmente enriquecidas usando um método de captura por hibridização. Alguns exemplos de captura comercial de tecnologias de hibridização incluem SureSelet da Agilent e TRUSEQ de ILLUMINA.

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Na captura por hibridização de um conjunto de oligonucleotídeos que é complementar ou quase complementares às sequências alvo desejadas é deixada a hibridizar para uma mistura de DNA e depois fisicamente separadas a partir da mistura. Uma vez que as sequências desejadas tiverem hibridizado com os oligonucleotídeos de segmentação, o efeito de remover fisicamente os oligonucleotídeos objetivo é também remover as sequências-alvo. Uma vez que os oligos hibridizados são removidos, eles podem ser aquecida acima da sua temperatura de fusão e que pode ser amplificado. Algumas formas de remover fisicamente os oligonucleotídeos alvo é por ligação covalente ligando os oligos alvo a um suporte sólido, por exemplo, uma esfera magnética ou um chip. Uma outra maneira de remover fisicamente os oligonucleotídeos de direcionamento é fixá-las por ligação covalente a uma porção molecular com uma forte afinidade para outra porção molecular. Um exemplo de um par molecular tal é a biotina e estreptavidina, tal como é usado na SureSelet. Assim que as sequências alvo podem ser ligadas covalentemente a uma molécula de biotina, e, após hibridização, com um suporte sólido estreptavidina aposta pode ser usado para puxar para baixo os oligonucleotídeos biotinilados, a que se hibridizam com as sequências alvo.

[00150] Em algumas modalidades, a PCR pode ser usado para atingir localizações específicas do genoma. Nas amostras de plasma, o DNA original é altamente fragmentado (tipicamente menos de 500 pb, com um comprimento médio de menos de 200 pb). Na PCR, ambos os iniciadores para a frente e reverso deve fundir com o mesmo fragmento, para permitir a amplificação. Portanto, se os fragmentos são curtos, os ensaios de PCR deve amplificar regiões relativamente curtas bem. Ensaio de PCR podem ser gerados em grandes números, no entanto, as interações entre diferentes ensaios de PCR toma difícil multiplex-los para além de cerca de cem ensaios. Várias abordagens

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64/116 moleculares complexas pode ser usada para aumentar o nível de multiplex, mas ainda pode ser limitada a menos de 100, talvez, 200, 500 ou possivelmente por ensaios de reação. As amostras com grandes quantidades de DNA pode ser dividido entre os sub-reações múltiplas e então recombinados antes de sequenciamento. Para as amostras onde quer a amostra global ou alguma subpopulação de moléculas de DNA é limitada, dividindo a amostra não introduzir ruído estatístico. Em uma modalidade, uma quantidade pequena ou limitada de DNA pode referir-se a uma quantidade inferior a 10 pg, entre 10 e 100 pg, entre 100 pg e 1 ng, entre 1 e 10 ng ou entre 10 e 100 ng. Observe que, embora este método é particularmente útil em pequenas quantidades de DNA, onde outros métodos que envolvem a divisão em vários pools pode causar problemas significativos aparentados ao ruído estocástico introduzida, este método ainda oferece a vantagem de minimizar o preconceito quando é executado em amostras de qualquer quantidade de DNA. Nestas situações, um etapa de préamplificação universal pode ser usado para aumentar o volume global da amostra. Idealmente, este etapa de pré-amplificação não deve alterar significativamente as distribuições alélicas.

[00151] Em geral, para realizar alvo sequenciamento de múltiplos alvos (n) de uma amostra (maior do que 50, maior do que 100, maiores do que 500 ou mais de 1000), pode-se dividir a amostra em um certo número de reações paralelas que amplificam um ou um menor número de alvos individuais. Este foi realizado em placas de vários pools PCRou pode ser feito em plataformas comerciais como a matriz de Acesso Fluidigm (48 reações por amostra em chips microfluídicos) ou DROP PCR por Rain Dance TECHNOLOGY(100s a alguns milhares de alvos). Infelizmente, estes métodos de separação e-pool são problemáticas para as amostras com uma quantidade limitada de DNA, como há muitas vezes não é suficiente cópias do

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65/116 genoma para assegurar que existe uma cópia de cada uma das regiões do genoma em cada pool. Isto é um problema especialmente grave quando loci polimórficos são segmentados e são necessárias as proporções relativas dos alelos em loci polimórficos, como o ruído introduzido pelo estocástica divisão e partilha causará medições muito precisas de mal as proporções dos alelos que foram presente na amostra original do DNA. Descrito aqui é um método eficaz e eficiente para amplificar muitas reações de PCR que se aplica aos casos em que apenas uma quantidade limitada de DNA está disponível. Em uma modalidade, o método pode ser aplicado para a análise de células individuais, fluidos corporais, as misturas de DNA, tais como o DNA em flutuação livre no plasma materno, biópsias, ambiental e/ou amostras forenses.

[00152] Em uma modalidade, a sequência alvo pode envolver um, uma pluralidade ou todos os seguintes etapas, a) Gerar e universalmente amplificar uma biblioteca de sequências de adaptador em ambas as extremidades dos fragmentos de DNA. b) Divida em múltiplas reações após a amplificação da biblioteca, c) Realizar cerca de 100-plex, cerca de 1000-plex ou cerca de amplificação 10.000 complexo de alvos selecionados, usando um alvo específico cartilha Forward per-alvo e um primer específico tag. d) Realizar uma segunda amplificação deste produto usando Reverse iniciadores específicos alvo e um (ou mais) de iniciadores específicos para uma marca universal, que foi introduzido como parte da meta de iniciadores específicos para a frente na primeira rodada, e) Divida o produto em várias alíquotas e ampliar subpools de alvos nas reações individuais (por exemplo, 50 a 500-plex, embora isso pode ser usado por todo o caminho até singleplex. f) Pool produtos de reações subpools paralelas. Durante estas amplificações iniciadores podem realizar sequenciamento Tag compatíveis (comprimento total ou parcial) de tal

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66/116 modo que os produtos podem ser sequenciados.

[00153] Em uma modalidade, é possível mitigar as perdas potenciais nos etapas subsequentes, amplificando a totalidade ou uma fração do DNA da amostra livre de células originais (cfDNA). Vários métodos estão disponíveis para amplificar todo o material genético em uma amostra, aumentar a quantidade disponível para processos a jusante. Em uma modalidade, a ligadura mediadas LM-PCR (PCR) de fragmentos de DNA são amplificadas por PCR após a ligação de qualquer um, dois adaptadores distintos adaptadores distintos ou diversos adaptadores distintos. Em uma modalidade, amplificação por deslocamento de múltipla (MDA) Phi-29 polimerase é usada para amplificar todo o DNA isotermicamente. Em DOP-PCR e variações, iniciação aleatória é usada para amplificar o DNA material original. Cada método tem certas características, tais como a uniformidade da amplificação em todas as regiões do genoma representados, a eficiência de captura e de amplificação de DNA original e o desempenho de amplificação, em função do comprimento do fragmento.

[00154] Resultados do ensaio de PCR de concepção tradicional em perdas significativas de moléculas distintas fetais, mas as perdas podem ser reduzidos através da concepção de ensaios de PCR muito curtos, os ensaios denominados mini-PCR. CfDNA fetais no sangue materno é altamente fragmentado e os tamanhos dos fragmentos são distribuídos em aproximadamente uma forma Gaussiana com uma média de cerca de 160 pb, um desvio padrão de cerca de 15 pb, um tamanho mínimo de cerca de 100 bp e um tamanho máximo de cerca de 220 bp. A distribuição das posições inicial e final dos fragmentos em relação aos polimorfismos específicas, embora não necessariamente aleatória, variam amplamente entre os alvos individuais e entre todos os alvos em bloco e o sítio polimórfico de um

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67/116 determinado locus alvo pode ocupar qualquer posição, desde o início até ao fim entre os vários fragmentos provenientes desse local. Note que o termo mini-PCR pode igualmente referir a PCR normal, sem restrições ou limitações adicionais.

[00155] Durante a PCR, amplificação só ocorrerá a partir de fragmentos de DNA molde compreendendo locais de iniciadores tanto para a frente e reverso. Porque fragmentos cfDNA fetais são curtos, a probabilidade de ambos os locais de primer, estando presente a probabilidade de um fragmento fetal de comprimento L que compreende tanto a frente e locais de iniciadores reversos é a proporção entre o comprimento do produto de amplificação para o comprimento do fragmento. Sob condições ideais, os ensaios em que o produto amplificado é de 45, 50, 55, 60, 65 ou 70 pb amplificará com sucesso a partir de cerca de 72%, 69%, 66%, 63%, 59% ou 56%, respectivamente, de moléculas de fragmentos de modelos disponíveis. O comprimento do produto amplificado é a distância entre as extremidades 5-prime dos locais de iniciação para a frente e reverso. Amplicon comprimento que é mais curto do que normalmente usado por aqueles conhecidos na técnica pode resultar em medições mais eficientes dos loci polimórficos desejados por requerendo apenas pequena sequência lê. Em uma modalidade, uma fração substancial dos produtos de amplificação deve ser inferior a 100 pb, inferior a 90 pb, inferior a 80 pb, inferior a 70 pb, inferior a 65 pb, inferior a 60 pb, inferior a 55 pb, inferior a 50 pb ou inferior a 45 pb.

[00156] Note que nos métodos conhecidos na técnica anterior, os ensaios de curta, tais como aquelas aqui descritas são geralmente evitadas, porque não são necessários e que impõem restrição considerável sobre o desenho de iniciadores limitando comprimento do iniciador, recozimento características e a distância entre o iniciador direto e reverso.

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68/116 [00157] Multiplex PCR pode envolver uma única ronda de PCR, em que todos os alvos são amplificados ou pode envolver uma ronda de PCR, seguida por um ou mais ciclos de PCR aninhado ou alguma variante de PCR aninhada. O PCR é constituído por uma ronda subsequente ou rondas de amplificação por PCR usando um ou mais dos novos iniciadores que se ligam internamente, pelo menos, um par de bases, para os iniciadores usados na ronda anterior. O PCR reduz o número de alvos de amplificação espúrios por amplificação, em reações subsequentes, apenas os produtos de amplificação a partir do anterior que tem a sequência correta interno. Reduzindo alvos de amplificação espúrios aumenta o número de medições úteis que podem ser obtidas, especialmente na sequenciamento. O PCR geralmente implica conceber iniciadores completamente internos para os locais de ligação de iniciadores anteriores, necessariamente aumentar o tamanho do segmento de DNA mínima necessária para a amplificação. Para as amostras, tais como cfDNAplasma materno, em que o DNA é altamente fragmentada, quanto maior o tamanho do ensaio reduz o número de moléculas distintas cfDNA a partir do qual pode fazer uma medição obtidos. Em uma modalidade, para compensar este efeito, pode-se usar uma abordagem de assentamento parcial em que um ou ambos os segundos iniciadores redondas sobrepor os primeiros locais de ligação que se prolongam internamente um certo número de bases para alcançar especificidade adicional enquanto minimamente crescente no tamanho total do ensaio.

[00158] Em uma modalidade, um conjunto de ensaios de PCR multiplex foram concebidos para amplificar o SNP potencialmente heterozigótica ou outros loci polimórficos ou não polimórfica em um ou mais cromossomos e esses ensaios são usados em uma única reação de amplificação de DNA. O número de ensaios de PCR pode ser entre

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69/116 e 200 ensaios de PCR, entre 200 e 1000 PCR, entre 1000 e 5000 PCR ou de entre 5.000 e 20.000 ensaios de PCR (50 a 200-Plex, 200 a 1000-Plex, 1.000 a 5000-plex, 5.000 a 20.000 complexa, mais de 20.000 complexo respectivamente).

[00159] Em uma modalidade, um 100-plex a 500 complexo, 500plex para 1000-plex, 1000-plex para 2000-plex, 2000-plex para 5000plex, 5000-plex para 10.000 complexo, de 10.000 a 20.000 complexa plex, 20.000-plex a 50.000-plex ou 50.000-plex a 100.000-plex PCR pool ensaio é criado de tal forma que iniciadores direto e reverso têm caudas correspondente ao exigido para a frente e sequências reversas exigido por um instrumento de alta taxa de transferência de sequenciamento, como o HiSeq, GAIIX ou disponíveis a partir MISEQ ILLUMINA. Além disso, incluíram-5 primordial para as caudas de sequenciamento é uma sequência adicional que pode ser usado como um local de iniciação de uma PCR subsequente para adicionar sequências de nucleotídeos do código de barras para os amplicons, permitindo multiplex sequenciamento de várias amostras de uma única faixa de alto rendimento sequenciamento instrumento. Em uma modalidade, um complexo de 10.000 pool ensaio de PCR é criado de tal modo que os iniciadores reversos têm caudas correspondentes às sequências invertidas necessárias exigidas por um instrumento de sequenciamento de alto rendimento. Após a amplificação com o primeiro ensaio de 10.000-Plex, uma subsequente amplificação por RCP pode ser realizada usando um outro conjunto de 10.000 plex Tendo iniciadores forward parcialmente aninhada (por exemplo, 6bases aninhados) para todos os alvos e um iniciador inverso correspondente à cauda sequenciamento inversa incluída no primeiro round. Esta ronda de amplificação subsequente parcialmente aninhada com apenas um iniciador específico alvo e um iniciador universal, limita o tamanho necessário do ensaio, reduzindo o ruído de

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70/116 amostragem, mas reduz grandemente o número de produtos de amplificação espúrios. Os marcadores de sequenciamento pode ser adicionado a adaptadores de ligação anexas e/ou como parte de sondas de PCR, de tal modo que a marcação é parte do produto de amplificação final.

[00160] Fração fetal afeta o desempenho do ensaio, é mais difícil determinar a paternidade correta em amostras com uma fração menor fetal. Há um certo número de maneiras de enriquecer a fração do DNA fetal no plasma materno. Fração fetal pode ser aumentada pelo método descrito anteriormente LM-PCR já foi discutido, assim como por uma remoção específica de fragmentos matemos longos. Na modalidade, os fragmentos mais longos são removidos usando técnicas de seleção de tamanho. Em uma modalidade, antes da amplificação por PCR multiplex nos loci alvo, uma reação de PCR multiplex adicional pode ser realizada para remover seletivamente os fragmentos de comprimento e, em grande parte materna correspondentes aos loci alvo na subsequente PCR multiplex. Os iniciadores foram concebidos para emparelhar um local a uma distância maior do que o polimorfismo é esperado estar presente entre os fragmentos de DNA isentos de células fetais. Estes iniciadores podem ser usados em um ciclo de uma reação de PCR multiplex antes da PCR multiplex dos loci polimórficos alvo. Estes iniciadores distais são marcados com uma molécula ou porção que pode permitir o reconhecimento seletivo das partes marcadas de DNA. Em uma modalidade, estas moléculas de DNA pode ser covalentemente modificada com uma molécula de biotina, que permite a remoção do DNA de cadeia dupla recentemente formada compreendendo estes iniciadores depois de um ciclo de PCR. DNA de cadeia dupla formada durante a primeira rodada é provável materna na origem. A remoção do material híbrido pode ser usado pelo realizar de esferas de

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71/116 estreptavidina magnéticas. Existem outros métodos de marcação que podem funcionar igualmente bem. Em uma modalidade, os métodos de seleção de tamanho podem ser usadas para enriquecer a amostra de DNA de cadeias mais curtas, por exemplo, os com menos de cerca de 800 pb, inferior a cerca de 500 bp ou menos do que cerca de 300 pb. Amplificação de fragmentos curtos pode então proceder como de costume.

[00161] Em algumas modalidades, o DNA alvo pode ter origem a partir de células individuais, a partir de amostras de DNA que consiste em menos do que uma cópia do genoma-alvo, a partir de pequenas quantidades de DNA, a partir de DNA de origem mista (por exemplo, gravidez no plasma: DNA de placenta e materna; cancro plasma do doente e os tumores: mistura entre o DNA saudável e cancro, transplante, etc), a partir de outros fluidos do corpo, a partir de culturas de células, a partir de sobrenadantes de cultura, a partir de amostras forenses de DNA, a partir de amostras antigas de DNA (por exemplo, os insetos presos em âmbar), a partir de outra As amostras de DNA e combinações dos mesmos.

[00162] Em algumas modalidades, os métodos descritos aqui podem ser usados para amplificar e/ou detectar SN Ps, repetições simples em tandem (STR), número de cópia, metilação de nucleotídeos, os níveis de mRNA, outros tipos de níveis de expressão de ARN, outras características genéticas e/ou epigenético. Os métodos de mini-PCR descritos aqui podem ser usados juntamente com sequenciamento da próxima geração, que pode ser usado com outros métodos a jusante, tais como microarranjos, contando por PCR digital, PCR em tempo real, a análise de espectrometria de massa, etc [00163] Em algumas modalidade, os métodos de amplificação de mini-PCR descritos aqui podem ser usados como parte de um método para a quantificação exata das populações minoritários. Ele pode ser

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72/116 usado para a quantificação absoluta de pico usando calibradores. Ele pode ser usado para a mutação/menor quantificação alelo através do sequenciamento muito profundo e pode ser executado de uma forma altamente multiplex. Ele pode ser usado para testes de paternidade padrão e identidade de parentes ou ancestrais, em humanos, animais, plantas ou outras criaturas. Ele pode ser usado para testes forenses. Ele pode ser usado para genotipagem rápida e análise do número de cópias (CN), em qualquer tipo de material, por exemplo, líquido amniótico e CVS, esperma, produto da concepção (POC). Ele pode ser usado para a análise de uma única célula, tais como genotipagem de amostras submetidos a biópsia a partir de embriões. Ele pode ser usado para análise rápida de embriões (em menos do que um, um ou dois dias da biópsia) por sequenciamento alvejado usando min-PCR. [00164] PCR multiplex pode muitas vezes resultar na produção de uma proporção muito elevada do produto de DNA resultante de reações secundárias não produtivas, tais como a formação de dímero de primer. Em uma modalidade, os iniciadores específicos que são mais propensos a causar reações secundárias não produtivas pode ser removido da biblioteca de iniciador para dar uma biblioteca de iniciador que irá resultar em uma maior proporção de DNA amplificado que mapeia para o genoma. A etapa de remoção de iniciadores problemáticos, isto é, aquelas que são iniciadores particularmente susceptíveis de dímeros firmes tem inesperadamente habilitado níveis extremamente elevados de formação multiplex de PCR para posterior análise por sequenciamento. Em sistemas tais como sequenciamento, em que o desempenho se degrada significativamente pela dímeros de iniciadores e/ou outros produtos de prejuízo, maior do que 10, maior do que 50 e maior do que 100 vezes maior do que a outra multiplex de formação multiplex descrito tenha sido alcançado. Note que este se opõe a investigar métodos de detecção com bases, por exemplo,

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73/116 microarranjos, TaqMan, PCR, etc, onde um excesso de dímeros de iniciadores não afetará o resultado sensivelmente. De referir ainda que a crença geral na técnica é que a PCR para sequenciamento de formação multiplex está limitada a cerca de 100 ensaios no mesmo pool.

[00165] Há um certo número de maneiras de escolher os iniciadores para uma biblioteca em que a quantidade de não mapeamento de dímeros de iniciadores ou outros produtos de iniciadores Prejuízo são minimizados. Os dados empíricos indicam que um pequeno número de iniciadores 'ruins' são responsáveis por uma grande quantidade de iniciadores reações colaterais dímero não mapeamento. A remoção desses iniciadores maus podem aumentar o percentual de sequência lê esse mapa para loci alvo. Uma maneira de identificar os iniciadores maus é olhar para os dados de sequenciamento de DNA que foi amplificado por amplificação específica; esses dímeros de iniciadores que são vistos com maior frequência pode ser removida para dar uma biblioteca cartilha que é significativamente menos propensos a resultar em DNA produto secundário que não é mapeado para o genoma. Há também programas disponíveis publicamente que podem calcular a energia de ligação de várias combinações de iniciadores e remover aqueles com a maior energia de ligação também dará uma biblioteca cartilha que é significativamente menos propensos a resultar em DNA produto lado que não é mapeado para o genoma.

[00166] Note que há outros métodos para a determinação de quais as sondas de PCR são susceptíveis de formar dímeros. Em uma modalidade, a análise de um conjunto de DNA que foi amplificada usando um conjunto não otimizada de iniciadores pode ser suficiente para determinar os iniciadores problemáticos. Por exemplo, a análise pode ser feita usando sequenciamento e esses dímeros que estão

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74/116 presentes em maior número sejam determinados como aqueles que mais provavelmente para formar dímeros e pode ser removido.

[00167] Para selecionar os locais de destino, pode-se começar com um grupo de supostos projetos par de iniciadores e criar um modelo termodinâmico de interações potencialmente adversos entre os pares de iniciadores, e, então, usar o modelo para eliminar os projetos que são incompatíveis com os outros projetos na pool.

[00168] Existem muitos fluxos de trabalho que são possíveis quando a realização de PCR, alguns fluxos típicos para os métodos descritos aqui são descritos. As etapas descritos neste documento não se destinam a excluir outros etapas possíveis e não significa que qualquer um dos etapas descritos aqui são necessárias para que o método funcione adequadamente. Um grande número de variações de parâmetros ou outras modificações são conhecidas na literatura e podem ser feitas sem que afete a essência da invenção. Um fluxo de trabalho específico generalizada é dada abaixo, seguido por um número de variantes possíveis. As variantes referem-se tipicamente a possíveis reações PCR secundárias, por exemplo, diferentes tipos de assentamento que pode ser realizado (etapa 3). É importante observar que as variantes podem ser feitas em tempos diferentes ou em diferentes ordens de explicitamente descritos aqui.

1. O DNA na amostra pode ter adaptadores de ligação, muitas vezes referidas como as etiquetas ou rótulos de bibliotecas do adaptador de ligação (LTs), anexa, em que os adaptadores de ligação contêm uma sequência de iniciação universal, seguida por uma amplificação universal. Em uma modalidade, isto pode ser feito usando um protocolo padrão concebido para criar bibliotecas de sequenciamento após fragmentação. Em uma modalidade, a amostra de DNA pode ser rombas, e, então, um A pode ser adicionado na extremidade 3 A Y-adaptador com uma T-overhang podem ser

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75/116 adicionados e ligados. Em algumas modalidades, outros extremos coesivos pode ser usado além de um ressalto A ou T. Em algumas modalidades, outros adaptadores podem ser adicionados, por exemplo enrolada adaptadores de ligação. Em algumas modalidades, os adaptadores podem ter marcação concebida para amplificação por PCR.

2. Amplificação específica para o alvo (STA): Préamplificação de centenas de milhares a dezenas de milhares e mesmo centenas de milhares de alvos podem ser multiplex em uma reação. STA é tipicamente executado de 10 a 30 ciclos, ainda que possa ser executado de 5 a 40 ciclos, de 2 a 50 ciclos e mesmo de 1 a 100 ciclos. Os iniciadores podem ser atados, por exemplo, para um fluxo de trabalho de simples ou de sequenciamento para evitar uma grande proporção de dímeros. Note que tipicamente, dímeros de ambos os iniciadores que transportam a mesma etiqueta não será amplificado de forma eficiente ou sequenciado. Em algumas modalidades, entre 1 e 10 ciclos de PCR pode ser realizada, em algumas modalidades entre 10 e 20 ciclos de PCR pode ser realizada, em algumas modalidades entre 20 e 30 ciclos de PCR pode ser realizada, em algumas modalidades entre 30 e 40 ciclos de PCR pode ser realizada, em algumas modalidades mais de 40 ciclos de PCR pode ser realizada. A amplificação pode ser uma amplificação linear. O número de ciclos de PCR pode ser otimizada para resultar em uma profundidade ótima de leitura perfil (DOR). DOR perfis diferentes podem ser desejáveis para diferentes fins. Em algumas modalidades, uma distribuição mais uniforme de todos os ensaios entre leituras é desejável, se o DOR é demasiado pequeno para alguns ensaios, o ruído estocástica pode ser demasiado elevado para que os dados sejam também úteis, enquanto que, se a profundidade de leitura é demasiado elevado , a utilidade marginal de cada leitura adicional é relativamente pequena.

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76/116 [00169] Iniciador pode melhorar a detecção de DNA fragmentado a partir de bibliotecas universalmente marcadas. Se a etiqueta de biblioteca e o iniciador-caudas contêm uma sequência homóloga, a hibridização pode ser melhorado (por exemplo, a temperatura de fusão (TM) é reduzido) e os iniciadores podem ser estendidos, se apenas uma porção da sequência alvo primário está no fragmento de DNA da amostra . Em algumas modalidades, podem ser usadas 13 ou mais pares de bases para um alvo específico. Em algumas modalidades, podem ser usados 10 a 12 pares de bases para um alvo específico. Em algumas modalidades, podem ser usadas 8-9 pares de bases para um alvo específico. Em algumas modalidades, podem ser usadas 6 a 7 pares de bases para um alvo específico. Em algumas modalidades, a STA pode ser realizada em DNA pré-amplificado, por exemplo, MDA, RCA, outros amplificação do genoma inteiro ou adaptador mediadas PCR universal. Em algumas modalidades, a STA podem ser realizados em amostras que são enriquecidas ou esgotados de determinadas sequências e as populações, por exemplo, seleção por tamanho, a captura de alvo, dirigido degradação.

3. Em algumas modalidades, é possível realizar a PCR multiplex secundárias ou reações de extensão do primer para aumentar a especificidade e reduzir produtos indesejáveis. Por exemplo, cheio de assentamento, semi-assentamento, hemiassentamento e/ou a subdivisão em reações paralelas de pools de ensaio menores são todas as técnicas que podem ser usadas para aumentar a especificidade. Experimentos têm mostrado que a divisão de uma amostra em três reações 400 complexos resultou em DNA produto com maior especificidade de uma reação 1200-plex com exatamente os mesmos iniciadores. Similarmente, as experiências têm mostrado que a divisão de uma amostra em quatro reações de 2.400 complexos resultou em produto de DNA com uma maior especificidade

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77/116 do que uma reação de 9600-Plex com exatamente os mesmos iniciadores. Em uma modalidade, é possível usar os iniciadores específicos de alvo e marcação da mesma direcionalidade e opostas.

4. Em algumas modalidades, é possível amplificar uma amostra de DNA (diluição, purificado ou de outro modo), produzida por uma reação STA usando iniciadores específicos de marcação e de amplificação universal ou seja, para amplificar muitos ou todos os préamplificado e alvos marcados. Os iniciadores podem conter sequências funcionais adicionais, por exemplo, códigos de barras ou uma sequência adaptador completo necessário para o sequenciamento em uma plataforma de sequenciamento de alto rendimento.

[00170] Estes métodos podem ser usados para análise de qualquer amostra de DNA e são especialmente úteis quando a amostra de DNA é particularmente pequeno ou quando é uma amostra de DNA, onde o DNA mais do que se origina a partir de um indivíduo, tal como no caso de plasma materno. Estes métodos podem ser usados em amostras de DNA, tais como um único ou pequeno número de células, o DNA genômico, DNA de plasma, plasma bibliotecas amplificadas, amplificados bibliotecas sobrenadante apoptóticos ou outras amostras de DNA mista. Em uma modalidade, estes métodos podem ser usados no caso em que as células de diferente constituição genética pode estar presente em um indivíduo, tais como o cancro ou com transplantes.

[00171] Em algumas modalidades, a amplificação por PCR multiplex, pode envolver o uso de vários tipos de protocolo de assentamento, por exemplo, mini-semi-nested-PCR, totalmente encaixados mini-PCR, heminested mini-PCR, triplamente mini-heminested-PCR unilateral aninhada mini-PCR, de um lado ou de mini-PCR inversa semi-nested mini-PCR.

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Caixa de Diagnóstico [00172] Em uma modalidade, a presente descrição inclui uma caixa de diagnóstico, que é capaz de, em parte ou completamente realização aspectos dos métodos descritos na presente descrição. Em uma modalidade, a caixa de diagnóstico pode estar localizada no consultório de um médico, um laboratório do hospital ou em qualquer local apropriado razoavelmente proximal ao ponto de atendimento ao paciente. A caixa pode ser capaz de executar os aspectos do método de uma forma totalmente automatizada ou a caixa pode necessitar de uma ou de um número de etapas a serem completados manualmente por um técnico. Em uma modalidade, a caixa pode ser capaz de analisar os dados genotípicos medidos no plasma materno. Em uma modalidade, a caixa pode ser ligada a meios para transmitir os dados genotípicos medidos usando a caixa de diagnóstico para uma instalação de cálculo externo, que pode, então, analisar os dados genotípicos e possivelmente também gerar um relatório. A caixa de diagnóstico podem incluir uma unidade robótico que é capaz de transferir as amostras aquosas ou líquido a partir de um recipiente para outro. Ela pode compreender um certo número de reagentes, tanto sólidos e líquidos. Ela pode compreender um sequenciador de elevado débito. Ela pode compreender um computador.

Kit de Iniciador [00173] Em algumas modalidades, um kit pode ser formulado o qual compreende uma pluralidade de iniciadores desenhados para atingir os métodos descritos na presente descrição. Os iniciadores podem ser exteriores à frente e reverso iniciadores, para a frente interior e iniciadores reversos como descritos aqui, eles podem ser iniciadores que foram concebidos para ter uma baixa afinidade de ligação a outros iniciadores do kit como descrito na secção de desenho de iniciadores, podiam ser sondas de captura de híbridos ou sondas pré-circularizado

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79/116 como descrito nas secções relevantes ou alguma combinação destes. Em uma modalidade, um kit pode ser formulada para a determinação de um estado de ploidia de um cromossomo alvo em um feto em gestação concebido para ser usado com os métodos descritos aqui, o kit compreende uma pluralidade de iniciadores internos para a frente e, opcionalmente, uma pluralidade de iniciadores inversos interiores e os iniciadores para a frente opcionalmente exteriores e iniciadores reversos exteriores, onde cada um dos iniciadores é concebido para hibridizar com a região do DNA imediatamente a montante e/ou a jusante de um dos sítios polimórficos do cromossomo alvo e cromossomos opcionalmente adicionais. Em uma modalidade, o kit iniciador pode ser usado em combinação com a caixa de diagnóstico descrito noutro local neste documento.

Estimativas de Probabilidade Máxima [00174] Muitos métodos conhecidos na arte para a detecção da presença ou ausência de um fenótipo ou o genótipo, por exemplo, uma anomalia cromossômica, uma condição médica ou uma relação de paternidade envolvem o uso de um único teste de rejeição da hipótese, se uma métrica que está diretamente para ralted ou coraparentado com a condição é medida e se a métrica é de um lado de um determinado limiar, a condição é determinada a estar presente, enquanto que se a métrica de recai sobre o outro lado do limiar, a condição é determinada a estar ausente. Um teste de rejeição de um único hipótese só olha para a distribuição nula quando se decidir entre as hipóteses nula e alternativa. Sem levar em conta a distribuição alternativo, não se pode estimar a probabilidade de cada hipótese dado os dados observados e, portanto, não é possível calcular a confiança na chamada. Assim, com um teste de rejeição de um único hipótese, obtém-se uma resposta sim ou não, sem uma estimativa da confiança associado ao caso específico.

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80/116 [00175] Em algumas modalidades, o método descrito aqui é capaz de detectar a presença ou ausência de genótipo ou fenótipo, por exemplo, uma anomalia cromossômica, uma patologia ou de uma relação de paternidade, usando um método de probabilidade máxima. Esta é um aprimoramento substancial em relação ao método de usar uma única técnica de rejeição da hipótese de que o limiar para chamar a ausência ou a presença da doença pode ser modificada conforme apropriado para cada caso. Isto é particularmente relevante para as técnicas de diagnóstico que visam determinar a paternidade de um feto em gestação a partir de dados genéticos disponíveis a partir da mistura de DNA fetal e materna presente no DNA em flutuação livre encontrada no plasma materno. O método de estimativa de probabilidade máxima podem usar as distribuições de alelos associados a cada hipótese para estimar a probabilidade de os dados condicionados em cada hipótese. Estas probabilidades condicionais podem então ser convertidos para uma chamada hipótese e confiança. Da mesma forma, um método de máxima estimativa posteriori usa as mesmas probabilidades condicionais como a estimativa de probabilidade máxima, mas também incorpora priores população ao escolher a melhor hipótese e determinar confiança.

[00176] Portanto, o uso de uma técnica estimativa de probabilidade máxima (MLE) ou intimamente aparentado com o máximo de uma técnica posteriori (MAP) dão duas vantagens, em primeiro lugar, aumenta a possibilidade de uma chamada correta e também permite uma confiança de ser calculados para cada chamar. Em uma modalidade, a seleção da paternidade chamada correspondente à hipótese com a maior probabilidade é realizada usando estimativas de probabilidade máxima ou uma estimativa a posteriori máximas. Em uma modalidade, é descrito um método para determinar a paternidade de um feto em gestação que envolve tomar qualquer método

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81/116 atualmente conhecidos na arte que usa uma única técnica de rejeição da hipótese de reformular os tais que usa uma técnica de MLE ou PAM

Um Método para Determinação de Paternidade [00177] O ffDNA está tipicamente presente na fração de baixo em uma mistura com o DNA materno. Em algumas modalidades, a mãe conheceu genótipo ou o genótipo materno pode ser medida ou inferida. Tipicamente, a fração de DNA fetal no plasma materno é entre 2 e 20%, embora em diferentes condições esta percentual pode variar entre cerca de 0,01% a cerca de 50%. Em uma modalidade, uma técnica de microarranjo ou outro que dá dados de intensidade em uma base por alelo pode ser usado para medir o plasma materno. Em uma modalidade, a sequenciamento pode ser usada para medir o DNA contido no plasma materno. Nestes casos, a medição da intensidade do alelo ou sequência ler contagem em um alelo particular é uma soma dos sinais materna e fetal. Assumindo-se que a proporção da mistura de criança ao DNA matriz é r a 1, o número relativo de alelos no locus consiste em dois alelos da mãe e alelos 2r da criança. Em alguns personificação, os loci compreendem polimorfismos de nucleotídeo único. A Tabela 1 mostra o número relativo de cada alelo na mistura para uma seleção de contextos mãe informativos.

Tabela 1: Número de alelos por contexto	B em mistura
Contexto parental	A em mistura
AA|AA	2 + 2r	0
AA|BB	2 + r	r
AB|AA	1 + 2r	1
AA|AB	2+2rou 2 + r	0 ou r
BB|AA	r	2 + r
BB|BB	0	2 + 2r

[00178] Note que a escolha dos quatro contextos descritos acima

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82/116 como sendo informativo não pretende ser inclusiva de todos os contextos que podem ser informativa. Qualquer combinação de contextos podem ser usados e não há uma quantidade significativa de informação que pode ser encontrado nas medições genotípicas de qualquer contexto.

[00179] Mesmo na presença de taxa de abandono alelo significativa da criança, pode haver uma nítida distinção entre o sinal quando um alelo está presente e em que um alelo do sinal não está presente. Por exemplo, considere as medições A alélicas de SNPs em pares contexto BB | BB e BB | AA e as medidas de alelos B de SNPs em contexto de pares AA | AA e AA | BB. Em cada caso, não deve haver nenhum sinal presente no primeiro contexto e não deve haver sinal presente no segundo sentido, onde os alelos da criança não eliminada. No entanto, se o suposto pai estiver incorreta, haverá algumas vezes o sinal presente em ambos os contextos. Assim, a distribuição de medições SNP deve ser diferente, dependendo se o suposto pai está correta ou não.

[00180] A diferença será tipicamente mais observável na extremidade alta do sinal da distribuição, pois estes serão os SNPs onde há uma maior probabilidade de ter contribuições de DNA por parte da criança. Esta diferença pode ser observada por comparação elevados valores percentuais das distribuições das medições SNP. Exemplos de possíveis métodos de percentis é posição mais próxima, a interpolação linear entre fileiras mais próximas e percentual ponderado.

[00181] Por exemplo, defina X1 como o conjunto de um alelo medições SNP no contexto BB | BB e X2 como o conjunto de medidas do alelo A em contexto BB | AA, de todos os cromossomos. Se o suposto pai estiver correta, então o valor do percentil 99 do X1 será significativamente menor do que o valor do percentil 99 de X2. Se o

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83/116 suposto pai está incorreta, os valores do percentil 99 das duas distribuições será mais próximos. Observe que qualquer percentual pode ser usado igualmente bem, por exemplo, o percentil 95, percentil 90, percentil 80 ou percentil 85. Em uma modalidade, para um canal de medição em particular, X1 pode ser definida como as medições a partir do contexto, com nenhum sinal e X2 pode ser definida como as medições a partir do contexto em que a mãe e pai são ambos homozigóticos e apenas os alelos pai proporcionar um sinal (herdado pela criança).

[00182] Definir p1 como a 99 (ou, 90 95, etc) percentil dos dados X1 e P2 como a 99 (ou, 90 95, etc) percentil dos dados X2. Definir a estatística de teste t como P1/P2. Note que as outras funções de P1 e P2, que demonstram a diferença em valores podem ser usados igualmente bem. O valor de t pode variar dependendo da quantidade de DNA criança está presente na amostra, o que não é conhecido. Portanto, os limiares de classificação para t não pode ser calculado a priori.

[00183] A estatística do teste t para uma única amostra pode ser comparada com uma distribuição gerada a partir dos genótipos de muitos indivíduos que se sabe não ser o pai, usando o seguinte procedimento. Assuma que o genótipo de um conjunto grande de indivíduos não aparentados estão disponíveis.

1. Para cada indivíduo independentes, assumir que ele é o pai e calcular o valor da estatística de teste t.

2. Vamos Tu ser o conjunto de medidas t dos homens não aparentados. Montar uma distribuição de Tu. Esta é a distribuição de t para a amostra em particular, sob a hipótese nula. A hipótese nula é genótipos não vêm do pai da criança presente na amostra. A distribuição Pu (t) poderia ser aa ajuste máxima verossimilhança ou método dos momentos caber a uma distribuição conhecida, por

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84/116 exemplo, uma distribuição de Gauss, um ajuste densidade kemal usando uma função de kemel, por exemplo, Gaussian, caixa, triângulo, etc ou qualquer outro método adequado de distribuição apropriado.

3. Considere os genótipos do suposto pai e calcular o correspondente teste estatístico tc.

4. O verdadeiro pai deve resultar em um menor valor de t que um indivíduo independente. A probabilidade de um pai tc produção independente ou de um valor mais periférica é a função densidade acumulada de Pu avaliada em tc. Assim, o valor-p p para rejeitar a hipótese nula é dada pelo seguinte:

p=í ^Ρ“<?>

[00184] Se p for inferior a um limiar de significado α então a hipótese de que o pai é suposto que um indivíduo não aparentado pode ser rejeitada com α significado. Se p é maior do que α então a hipótese nula não pode ser rejeitada e o suposto pai pode não estar relacionada com a criança está presente na amostra. O limite de significância α define a probabilidade de que um indivíduo não aparentado poderia ser classificado como o pai correto. Por exemplo, com um limiar de α igual a 0,01, um por cento dos indivíduos não aparentados podiam ser identificados como o pai correta.

[00185] Vários métodos podem ser usados para a combinação dos dados dos canais de alelos A e B. Por exemplo, dois métodos simples que exigem que o valor p de todos os canais de estar abaixo de um limiar ou para exigir que o valor p de um canal seja inferior ao limiar.

[00186] Em algumas modalidades, o método de teste de paternidade assume que o DNA criança está presente em uma concentração suficiente para distinguir entre os SNPs que tem ou não tem sinal da criança. Na ausência de concentração de DNA criança sufficiente, este método pode reportar pai incorreto porque esperados alelos patemalmente hereditárias não são medidos no

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85/116 plasma materno. Em uma modalidade, é descrito um método que pode confirmar a presença de DNA criança suficiente antes de aplicar o teste de paternidade. A confirmação da presença da criança é baseada em um cálculo de estatística de teste, que é proporcional à concentração de DNA da criança, mas não necessita de genótipos pai. Se a estatística de teste está acima do limiar requerido, então, a concentração de DNA para a criança é suficiente realizar o teste de paternidade.

[00187] Considere o conjunto de SNPs (a partir de todos os cromossomos combinadas) onde o genótipo mãe é AA e o canal B é medido. Um sinal é esperado apenas no subconjunto de SNPs em que o genótipo contém uma criança B, mas estes SNPs não pode ser identificado, a priori, sem os genótipos pai, que não estão disponíveis. Em vez disso, considere as populações frequências SNP {fi}, onde fi é a média da amostra número de Bs no genótipo do SNP i, com base em uma grande amostra populacional. Note que mais de SNPs em que a matriz é o genótipo AA terá fi inferior a 0,5, mas a distribuição de música na estes SNPs estende quase até uma. Considere dois conjuntos de SNPs, S1 e S2, onde S1 = {i: fi <TL} e S2 = {i: fi> TH}. Os limiares TL e TH são definidos de modo que muito poucos SNPs em S1 deverão ter um B e muitos SNPs em S2 deverão ter um B e cada conjunto tem população suficiente. Em uma modalidade, o algoritmo usa TL = 0,05 e TH = 0,7, enquanto que os outros valores de TL e TH podem funcionar igualmente bem ou melhor. Deixe-yi ser a medida B canal de SNP i, Y1 = {yi: i ε S1} e Y2 = {yi: i ε S2}. As distribuições de Y1 e Y2 será muito similar, pois a maioria SNPs em ambas as distribuições não terá sinal. No entanto, espera-se um número nãotrivial de SNPs em S2 para ter sinal de criança e muito poucos SNPs em S1 deverão ter sinal criança. Portanto, a cauda de Y2 deve estender-se a maior intensidade do que a cauda de Y1. Vamos pt ser

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86/116 um percentual próximo de 1, por exemplo, o percentil 99. Na presença de DNA criança suficiente, o percentil de pt Y2 deve ser significativamente maior do que o percentil pinta de Y1. Assim, a estatística de teste s pode ser definido como se segue.

s = percentil (Y2; pt) - percentil (Y< pt) [00188] Em uma modalidade, o teste estatístico pode ser normalizada por uma variedade de métodos para tentar dar conta de diferenças de amplificação entre matrizes. Em uma modalidade, a normalização pode ser feito em uma base por cromossomo. Em uma modalidade, a normalização pode ser feito em uma base por matriz. Em uma modalidade, a normalização pode ser feito em uma base limitada por sequenciamento.

[00189] O cálculo a seguir mostra como os limites de TL e TH são capazes de distinguir o efeito do DNA da criança, em particular amostra materna, com base em números aproximados de SNPs e as taxas de abandono. A Tabela 3 mostra alguns dados [00190] Em uma modalidade, o método envolve os seguintes pressupostos:

[00191] Frequências Populacionais são calculados a partir de um grande conjunto de dados da população, por exemplo, mais de 500 indivíduos, mais de 1.000 pessoas, mais de 5.000 pessoas ou mais de 20000 pessoas e o número de SNPs em cada contexto trata de um exemplo mãe e pai.

[00192] Não há SNPs onde a mãe é AA e o pai é BB (na realidade, estes são cerca de 8 por cento da mãe AA SNPs) [00193] Metade dos SNPs onde o pai tem resultado B em criança B. [00194] Taxa de abandono infantil é de 90 porcento.

[00195] Medidas com sinal criança será maior do que as medições sem sinal de criança [00196] A Tabela 3 mostra alguns dados de um caso de

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87/116 paternidade em particular usando o método descrito com os parâmetros acima referidos. Não se espera que a medição do percentil 98 a partir de S1 para incluir qualquer sinal com SNPs criança presente. A medição do percentil 98 da S2 deverá incluir cerca de 50 SNPs com sinal criança presente. A diferença entre os dois deve refletira quantidade de sinal criança.

Tabela 3: Dados relativos à determinação de paternidade r· ^num· de , . num. de _r ,

Con- Defi- fi medio no num. de . . fraçao de . _í . _ SNPs no . _í „ SNPs sinal . _í junto mçao . _x conjunto SNPs pai B . conjunto conjunto da criança fi < 0,05 13300 0,012 171 9 0,0007

5₂ fi > 0,7 3000 0,79 2370 119 0,039 [00197] A Figura 1 mostra a distribuição dos dados de intensidade de alelos para contextos AA | AA e AA | BB a partir de uma amostra de plasma materno recolhido às 38 semanas. O alelo B é medido. Note que o AA | BB distribuição estende-se significativamente mais elevada do que o AA | AA distribuição, mostrando que o alelo B (que só está presente no genoma da criança) está presente na AA | contexto BB, mas não o AA | contexto AA. Figura 2 vem da mesma amostra de plasma materno como Figura 1 e mostra a distribuição da estatística de teste t para o alelo B, usando os genótipos de 200 indivíduos não aparentados. Duas distribuições são mostradas (as duas curvas): o limite de probabilidade Gaussiana forma e uma distribuição do kemel. O valor de tc para o pai biológico é marcado com uma estrela. O valorp é inferior a 10-7 para a hipótese nula de que o suposto pai não tem relação com a criança.

[00198] A Tabela 4 apresenta os resultados de oito amostras de sangue materno em diferentes fases da gravidez. Um valor de p é calculado com base nos dados medidos a partir de cada canal (alelo A e B alelo) para o pai correta. Se ambos os valores de p canal são obrigados a estar abaixo de 0,01, então, duas amostras são

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88/116 classificadas incorretamente. Se apenas um canal é necessário para passar o limiar, então todas as amostras sejam corretamente classificados. Qualquer número de métricas e limites podem ser usados para confirmar ou excluir a paternidade. Por exemplo, pode-se usar um corte de valor p de 0,02, 0,005, 0,001 ou 0,00001, similarmente, pode exigir que um ou ambos os canais valores p são inferiores a um determinado limite ou se podería ter dois limites diferentes para os diferentes valores de p canal.

Tabela 4: Valores de p para os dois canais de oito determinações de paternidade.

Semanas de gestação	p-valor (Y)	p-valor (X)
11	2,3x10'7	<10'7
16	0,013	<10'7
17	<10'7	<10'7
17	<10'7	0,0002
20	<10'7	<10'7
28	0,14	0,0048
38	<10'7	<10'7
38	<10'7	<10'7

[00199] A Tabela 4 mostra os valores de P para a hipótese nula de que o pai correto é um indivíduo independente. Cada linha corresponde a uma amostra de sangue materno diferente, sendo a amostra genética paterna correspondente. Medições genéticas feitas em 200 machos independentes foram usadas como controlo. A curva da Figura 3 mostra a distribuição das taxas de intensidade de 200 para os machos não aparentados e a estrela representa a razão de intensidade para o pai biológico. Estes dados poderão ser tomadas a partir de um caso em que o sangue foi colhido de uma mãe que tinha 11 semanas de gravidez.

[00200] A Figura 4 mostra a frequência de distribuição (ED) curvas

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89/116 cumulativas para o coeficiente de correlação entre as medidas genotípicas fetais e as medidas genotípicas dos pais para três casos: (1) onde tanto a gestante e o suposto pai são os pais biológicos do feto ( correto, a curva mais à direita), (2) onde a gestante é a mãe biológica do feto, mas o suposto pai não é o pai biológico do feto ( errado , a curva do meio) e (3) em que nem a gestante, nem o suposto pai são os pais biológicos do feto (errado, curva à esquerda). As curvas são cdf o coeficiente de correlação entre os dados genotípicos do embrião, calculados a partir dos dados medidos em uma única célula e os dados genotípicos dos progenitores assumidos quando zero, um ou dois dos pais assumidos são realmente os pais genéticos do feto. Note que os rótulos de correto e dois errado são invertidos. A Figura 5 mostra histogramas para os mesmos três casos. Note que este histograma é composto de mais de 1000 casos em que um ou ambos os pais estão incorretas. O histograma da taxa medida de correlação entre os dados genotípicos do feto, medidos em uma única célula e os dados genotípicos dos progenitores presumida quando zero, um ou dois dos pais assumidos são realmente os pais genéticos do feto.

[00201] Trinta e cinco paternidade resultados são mostrados na Figura 6, usando o método de imediato para o teste de paternidade. Eles foram executados em amostras coletadas de mulheres grávidas com idade gestacional variando de 9 a 40 semanas. A curva vermelha à direita representa a distribuição de Gauss normalizada do teste estatístico de paternidade para 800 homens alheios. A distribuição de machos não aparentados é diferente para cada caso, uma distribuição normalizada é usada aqui para efeitos de visualização.

[00202] As barras azuis representam a estatística de teste normalizado para o pai correto (suspeita). É evidente que os padres corretos são claramente separados dos machos independentes. Note

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90/116 que a estatística de teste normalizado grosseiramente aproxima desvios-padrão, por isso, -5 no gráfico abaixo é de cerca de 5 desvios-padrão da média. Assim, todos os pais corretos assumidos nesta coorte foram confirmados como os pais corretos com significância de pelo menos 99,9999%.

[00203] Em uma modalidade da invenção, o conhecimento dos haplotipos parentais pode ser usado para aumentar a precisão do teste. Por exemplo, se os dois haplotipos do pai são conhecidos para um dado segmento de um cromossomo, então o conhecimento de que os SNPs estão presentes nos casos em que não existe qualquer queda para fora pode ser usado para determinar quais os SNPs deve ser esperado para os casos em que pode haver abandono. Por exemplo, imagine um jogo de três SNPs que são vinculados, ou seja, eles estão localizados próximos um do outro no mesmo cromossomo e onde os contextos da mãe e do suposto pai são: AA | AB, AA | AB, AA | BA . Note que quando o genótipo de um pai é eliminado, então, AB Ψ BA, uma vez que a primeira das duas letras representa os alelos no primeiro haplotipo e a segunda letra representa os alelos no segundo haplotipo. Agora imagine que, para aqueles três SNPs, um nível significativo do alelo B é medido para todos os três, neste caso, a chance de que o suposto pai é o pai correto é baixa, porque os dois haplotipos pai são A, A, B e B, B, A, enquanto o genótipo fetal medida é positiva para B em todos os três SNPs, e a mãe só poderia ter contribuído um A. Se o genótipo do pai não foi extinto, não seria possível excluir este suposto pai dado este conjunto de medições. Em uma modalidade, essa determinação dos haplotipos pai pode ser determinada tendo em conta as medições de DNA genômico diplóide, juntamente com as medições feitas haplóides genéticos em uma ou mais de esperma. O uso de mais de um esperma pode permitir a determinação de haplotipos com mais precisão, bem como o número

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91/116 de reticulações pode ter ocorrido, para cada um dos cromossomos, juntamente com os seus lugares, durante a meiose, que formou o esperma. Um método para alcançar este paterno eliminação pode ser encontrada em maior detalhe nos quatro Rabinowitz pedidos de patentes mencionados no presente documento.

[00204] Em uma modalidade, a determinação é feita exclusivamente de paternidade usando medições do SNP e não existem dados de repetições em cadeia simples é usada. Em uma modalidade, a determinação é feita exclusivamente de paternidade usando tanto o SNP e as medições STR. Os dados de SNP pode ser medido usando microarranjos de SNP ou pode ser medido através de sequenciamento. A sequenciamento pode ser irrelevantes ou pode ser orientada, por exemplo, usando sondas de circularização que são destinados a um conjunto de loci polimórficos ou pode ser orientada usando técnicas de hibridização de captura. Em algumas modalidades, os dados genéticos podem ser medidos por uma combinação de métodos, por exemplo, os dados genéticos parentais pode ser medido com um SNP de microarranjo, enquanto o DNA isolado a partir de soro materno pode ser medido usando sequenciamento de captura de alvo, onde as sondas de hibridização são usados para atingir o mesmo SNPs como são encontradas no SNP microarranjos. Em uma modalidade de uma combinação dos seguintes tipos de dados podem ser usados para determinar se ou não o suposto pai é o pai biológico do feto: dados de SNP, STR de dados, dados de passagem, os dados microdeleção, dados de inserção de dados, de translocação ou outros Os dados genéticos.

[00205] Em uma modalidade, o método pode compreender a geração de um relatório revelando a paternidade estabelecida do feto ou outro indivíduo alvo. Em uma modalidade, o relatório pode ser gerado com a finalidade de comunicar a determinação de paternidade.

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Em uma modalidade, o relatório pode incluir uma probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico do feto. Alguns exemplos de um tal relatório são mostrados dentro e a figura 7 é um exemplo de um relatório revelando uma exclusão de paternidade, a Figura 8 é um exemplo de um relatório revelando uma inclusão de paternidade e A Figura 9 é um exemplo de um relatório indicando um resultado indeterminado. Em uma modalidade, o relatório pode compreender um gráfico que contém uma distribuição de uma paternidade relacionada métrica para uma pluralidade de indivíduos não aparentados no que diz respeito a uma dada feto e a mãe (mostrado como uma curva de cinzento) e uma indicação da métrica para o suposto pai ( mostrado como um triângulo). A distribuição de machos não aparentados é diferente para cada caso, mas, nestes três relatórios, uma distribuição efetiva da estatística de teste para o feto e os machos não aparentados é usado aqui. Em uma modalidade, o relatório também pode conter uma indicação de que o suposto pai é mais provável que seja parte da distribuição de indivíduos não aparentados (por exemplo, Figura 7), e, por conseguinte, o suposto pai é estabelecida a não ser o pai biológico do feto; o fato de o triângulo é na região do gráfico de exclusão de paternidade indica que esta é uma exclusão de paternidade. Em uma modalidade, o relatório também pode conter uma indicação de que o suposto pai é mais provável que não seja parte de distribuição da paternidade métrica para indivíduos não aparentados (por exemplo, a Figura 8) e o suposto pai é estabelecido para ser o pai biológico o feto, o fato de o triângulo é na região do gráfico de inclusão a paternidade indica que esta é uma inclusão de paternidade. Em uma modalidade, o relatório também pode conter uma indicação de que as medições são indeterminadas (por exemplo, a Figura 9), o fato de o triângulo está no resultado indeterminado região do gráfico indica que nenhuma conclusão foi feita em relação

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93/116 ao estabelecimento da paternidade do feto.

[00206] Em uma modalidade da invenção, a determinação se o suposto pai é ou não o pai biológico do feto é feita sem o uso de repetições em série simples (STR). Em uma modalidade da invenção, a exatidão da determinação da paternidade é aumentada através da eliminação dos genótipos parentais. Em uma modalidade da invenção, os genótipos de um ou mais dos pais são progressivamente com o uso do material genético de um ou mais do indivíduo em relação este progenitor. Em uma modalidade, o indivíduo aparentado com o pai é o pai pais, mãe, irmão, filho, filha, irmão, irmã, tia, tio, gêmeo, clone, um gameta do pai e combinações dos mesmos.

Outro Método Para Determinação de Paternidade [00207] Em uma modalidade, o plasma materno e opcionalmente outro material genético pode ser medido através de sequenciamento, por exemplo, usando sequenciadores de alto rendimento, tais como o HISEQ ou MISEQ da ILLUMINA ou ο ION TORRENT da LIFE TECHNOLOGIES.

[00208] Testes de paternidade não invasivos podem ser realizados em uma amostra de sangue materno se há uma concentração suficiente de DNA fetal em flutuação livre. Em geral, a fração de DNA fetal no plasma materno, na maioria dos casos, estará entre cerca de 2 por cento a 20 por cento, embora ela possa ser tão baixa quanto 0,01% ou tão alta quanto 40% dependendo, em parte, da idade gestacional. Já foi demonstrado que está faixa de fração fetal é suficiente para testagem de paternidade por meio de um método de rejeição de hipótese única usando microarranjos de SNP. Sequenciamento de alto rendimento é de longe a plataforma mais precisa que permite modelagem matemática da resposta de medição esperada em cada SNP para combinações de genótipos de mãe e filho. Em uma modalidade, o plasma materno e, opcionalmente, outro

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94/116 material genético, pode ser medido através de sequenciamento, por exemplo, usando sequenciadores de alto rendimento, tais como o HISEQ ou MISEQ da ILLUMINA ou ο ION TORRENT da LIFE TECHNOLOGIES. Confianças sobre inclusões ou exclusões de paternidade podem ser calculadas usando teorias de probabilidade e/ou estimativa.

[00209] Em uma modalidade, o método para testagem de paternidade pode incluir o seguinte. Para um suposto pai, pode-se calcular a probabilidade dos dados de sequenciamento, derivados do plasma, com relação às duas hipóteses distintas: (1) o suposto pai é o pai (biológico) correto (Hc) e (2) o suposto pai não é o pai (biológico) correto (Hw). A hipótese que tem a maior probabilidade ou a posteriori é, então, escolhida. Em uma modalidade, esta abordagem pode ser combinada com um modelo de plataforma o qual relaciona a proporção alelo no plasma com o número observado de alelos A e e B sequenciados. Com o modelo de plataforma disponível, é possível derivar chances probabilísticas dos alelos A e B sequenciados para cada localização de SNP para cada hipótese.

[00210] Uma complicação é que a quantidade de fração fetal no plasma materno pode variar entre os indivíduos e com o tempo. Em uma modalidade, o método pode ser responsável por esta variabilidade. Há várias maneiras de lidar com este tipo de variabilidade. Em uma modalidade, o método pode estimar expressamente a fração fetal; em outra modalidade, o método pode colocar um prior sobre a quantidade desconhecida e integrá-lo sobre todos os possíveis valores. Uma modalidade usa um prior que é como uma distribuição uniforme de 0 a algum limiar, por exemplo, 40%. Qualquer prior pode funcionar em teoria. Uma modalidade calcula probabilidades de várias frações da criança, quer no espaço contínuo ou sobre uma divisão finita e integra ou soma sobre a faixa,

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95/116 respectivamente.

[00211] Considere o plasma materno com a fração fetal, f, e um único SNP onde a proporção de alelo esperada presente no plasma é r (com base nos genótipos materno e fetal). Em uma modalidade, a proporção de alelo esperada é definida como a fração esperada de alelos A no DNA materno e fetal combinado. Para o genótipo materno g_m e genótipo da criança g_c, a proporção de alelo esperada é fornecida pela equação 1, assumindo que os genótipos estão representados como proporções de alelos também.

r=fg_c + (1 -f)g_m (1) [00212] A observação no SNP compreende o número de leituras mapeadas com cada alelo presente, n_a e nb, a qual soma a profundidade de leitura d. Assumindo que medidas de controle de qualidade foram aplicadas às probabilidades de mapeamento, de modo que os mapeamentos e observações de alelos possam ser considerados corretos. Um modelo simples para a probabilidade de observação é uma distribuição binomial a qual assume que cada uma das leituras d é extraída de forma independente a partir de um grande pool que tem uma proporção de alelo r. A equação 2 descreve este modelo.

P(n_a, n_b\r) = p_bino(n_a; n_a + n_b, r) = ^b)rⁿ°(i - r)ⁿ> (2) [00213] Quando os genótipos materno e fetal são todos A ou todos B, a proporção de esperado no plasma será 0 ou 1 e pbino não será bem definido. Adicionalmente, isto não é desejável porque alelos inesperadas são, algumas vezes, observados na prática. O modelo binomial pode ser estendido em uma série de formas. Em uma modalidade, é possível usar uma proporção de alelo corrigida ^F = 1/(n_a + nb) para permitir que uma pequena quantidade de alelo inesperado seja contabilizada. Em uma modalidade, é possível usar os dados de treino para modelar a taxa do alelo inesperado que aparece sobre

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96/116 cada SNP e usar este modelo para corrigir a proporção de alelo esperada. Quando a proporção de alelo esperada não é 0 ou 1, a proporção de alelo observada pode não convergir para a proporção de alelo esperada em virtude de tendências de amplificação ou outros fenômenos. A proporção de alelo pode, então, ser modelada como uma beta distribuição centralizada na proporção de alelo esperada, levando a uma distribuição beta-binomial para P(n_a,nb|r), a qual tem maior variância do que a binomial.

[00214] Um modelo de plataforma geral para a resposta em um único SNP pode ser definido como F(a, b, g_c, g_m, f) (3) ou a probabilidade de observar n_a = a e nb = b com base nos genótipos materno e fetal, o qual também depende da fração fetal através da equação 1.

F(a,b, g_c, g_m, f) = P(n_a = a, n_b = b|g_c, g_m, f) (3) [00215] Note que pode ser possível simplificar a fórmula (3) por meio de condicionamento sobre uma função de g_c, g_m e f, por exemplo, usando r conforme definido em (1) e no exemplo binomial em (2). A equação para F poderia, então, ser escrita:

F(a,b, g_c, g_m, f) = P(n_a = a, n_b = b|g_c, g_m, f) = P(n_a = a, n_b = b|r(g_c, g_m, f)) (4) [00216] Em geral, a forma funcional de F pode ser uma distribuição binomial, distribuição beta-binomial, distribuição Póya multivariada, uma distribuição empírica estimada a partir de dados de treino ou funções similares, conforme discutido acima. Em uma modalidade, a forma funcional de F assume diversas formas, dependendo da hipótese para o número de cópias do cromossomo em questão.

Um Método Para Cálculo da Fração Fetal [00217] A determinação da fração de DNA fetal que está presente na fração mista de DNA pode ser uma parte integrante de um método não invasivo para determinar a paternidade pré-natal, atribuição de ploidia ou atribuição de alelo. Em algumas modalidades, a fração fetal da amostra mista pode ser determinada com base nos dados

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97/116 genotípicos da mãe, nos dados genotípicos do pai e nos dados genotípicos medidos a partir da amostra mista que contém tanto DNA materno quanto fetal. No contexto de testagem de paternidade e também, em menor grau, no caso de atribuição de ploidia, a identidade do pai não é conhecida e, portanto, dados genotípicos do pai biológico de um feto podem não estar disponíveis. Nestes casos, é importante dispor de um método para determinação da fração fetal que não requer o genótipo do pai biológico do feto. São descritos aqui vários métodos que permitem realizar estimativa da fração fetal. Esses métodos são descritos de um modo geral, de modo que eles são apropriados quando o genótipo do pai biológico está disponível e quando não está.

[00218] Para um cromossomo em particular, suponha que nós estamos olhando para N SNPs, para os quais temos os seguintes dados:

• Um conjunto de NR medições de sequência plasmática S=(Si,...,Snr). Em uma modalidade, onde temos (A, B) contagens para os alelos A e B para cada SNP, s pode ser escrito como s=((ai,bi),...,(3n, bN)),onde a, é a contagem sobre o SNP i, b, é o £ (ai + bi}=NR número b no SNP i, e • Dados paternos que consistem em:

o Informação de Genótipo: mãe G_m=(G_mi,...,GmN), pai Gf=(Gfi,..., Gín), onde Gmi, Ga ^e (ΑΑ,ΑΒ, BB); e/ou o Medições de dados de sequência: NRM medições para a mãe Sm⁼(Sm1 , ,Smnr ), NRF medições para o pai Sf=(Sfi,...,Sfnr). Similar à simplificação acima, se nós temos (A,B) contagens sobre cada SNP Sm^—((am1,bml),· -,(amN, bmlSl)), Sf— ((afl,bfl),...,(afN, bfN)) [00219] Coletivamente, dados da mãe, da criança e do pai podem ser denotados como D=(G_m,Gf,S_m,Sf,S). Em uma modalidade, dados

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98/116 genotípicos de ambos os pais estão disponíveis; em uma modalidade, apenas dados genotípicos da mãe estão disponíveis; em uma modalidade, apenas dados genotípicos do pai estão disponíveis; em uma modalidade, dados genotípicos de nenhum dos progenitores estão disponíveis. Em algumas modalidade, os dados genotípicos matemos podem ser inferidos a partir dos dados genotípicos medidos na amostra mista. Note que, em geral, os dados da mãe são desejáveis e aumentam a precisão do algoritmo, mas não são necessários.

[00220] Estimativa de fração da criança fé a fração da criança esperada com base nos dados:

f-E(cfrlD)- Jf*P(f|D)df [00221] Em uma modalidade, pode-se dividir o intervalo de possíveis frações da criança em um conjunto C de pontos finamente espaçados e realizar os cálculos em cada ponto os quais reduzem a equação acima para:

f = E(f|D) = ^f *P(f|D) feC [00222] P(f|D) é probabilidade de uma fração da criança f com base nos dados D. Pode-se ainda derivar usando a regra de Bayes:

PtflD)~P(D|f) *P(f) [00223] onde P(f) é o peso prior da fração da criança em particular. Em uma modalidade, este pode ser derivado de prior não informados (uniforme) e pode ser proporcional ao espaçamento entre as frações da criança candidatas no conjunto C.

[00224] P(D|cfr)é a probabilidade de determinados dados, com base na fração da criança em particular, derivada sob as suposições de número de cópias em particular sobre os cromossomos relevantes. Em uma modalidade, pode-se assumir a dissomia sobre os cromossomos usados. A probabilidade dos dados sobre todos os

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SNPs é o produto das probabilidades de dados sobre os SNPs individuais.

P(DIO= i

[00225] onde i denota um determinado SNP, por SNP i, temos:

Σ ^pC^D\s_m,Sf>9cJ>H,t) * P(g_c\g_m,g_fíH) * P(g_m|í) * P(^|í) m>S c [00226] onde g_m são possíveis genótipos verdadeiros da mãe, gt são possíveis genótipos verdadeiros do pai, g_c são possíveis genótipos verdadeiros da criança e g_m, gt, g_c ^fc {AA, AB, BB}.

[00227] P(g_m|i) é a probabilidade prior geral do genótipo da mãe g_m sobre o SNP i, com base na frequência populacional conhecida no SNP i, denotado pA,. Em particular:

píAAlpA/) = (ρ>ΐρ³ _j = 2(pã_;) · (1 — , pÇBBtpAj) = (1 - pA^³ [00228] Mesmo para p(f|i), probabilidade de genótipo do pai.

[00229] Digamos que denota a probabilidade de obtenção do genótipo verdadeiro da criança = c, dado os pais m, f e assumindo a hipótese H, a qual podemos facilmente calcular. Por exemplo, para uma dissomia:

Parentais	P(c|m,f,dissomia)
M	F	AA	AB	BB
AA	AA	1	0	0
AB	AA	0,5	0,5	0
BB	AA	0	1	0
AA	AB	0,5	0,5	0
AB	AB	0,25	0,5	0,25
BB	AB	0	0,5	0,5
AA	BB	0	1	0
AB	BB	0	0,5	0,5
BB	BB	0	0	1

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100/116 [00230] Digamos que ^p®lgm-spg^^H' lú be sej_{a a} probabilidade de determinados dados D no SNP i, com base no genótipo verdadeiro da mãe m, genótipo verdadeiro do pai f, genótipo verdadeiro do filho c, a hipótese H para o número de cópias e fração da criança f. Ela pode ser dividida em probabilidade de dados do pai, mãe e filho como segue:

[00231] A probabilidade dos dados de genótipo da mãe no lllumina

Sm· no SNP i em relação ao genótipo verdadeiro g_m, assumindo que os genótipos no lllumina estão corretos, é simplesmente:

ômi Btn [00232] Em uma modalidade, a probabilidade de dados de sequência da mãe no SNP i, no caso de contagens S_mi=(ami,bmi), sem interferência extra ou tendências envolvidas, é a probabilidade binomial definida como: P(S_m|,i)=Px|m(ami), onde X|m~Binorn(p_m(A), ami+bm,) com Pm^definido como:

m	AA	AB	BB	A	B	Sem atribuição
P(A)	1	0,5	0	1	0	0,5

[00233] Uma equação similar se aplica para probabilidades paternas.

[00234] Note que é possível obter uma resposta sem os dados dos pais, especialmente sem os dados paternos. Por exemplo, se nenhum dado de genótipo paterno F está disponível, pode-se usar PíG_flg_fí O = i. Se nenhum dado de sequência St paterno está disponível, pode-se usar P(Sf|gf,i)=1. Em uma modalidade, informação de diferentes cromossomos é agregada usando médias, média ponderada ou uma função similar.

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Outro Método de Cálculo da Fração Fetal [00235] Outro método para a determinação da fração de DNA fetal em uma mistura de DNA é descrito aqui. Em uma modalidade, uma versão de uma estimativa de probabilidade máxima da fração fetal f para um teste de paternidade, teste de ploidia ou outras finalidades pode ser obtida sem o uso da informação paterna. Definir So como o conjunto de SNPs com o genótipo da mãe 0 (AA), So,5 como o conjunto de SNPs com o genótipo da mãe 0,5 (AB) e Si como o conjunto de SNPs com genótipo materno 1 (BB). Os possíveis genótipos fetais sobre So são 0 e 0,5, o que resulta em um conjunto de possíveis f_ proporções de alelos Ro(f) = {0,2}. Similarmente, Ro,s = {0,5-f,0,5,0,5+f} f_ e Ri(f) = {1-2, 1}. Todos ou qualquer subconjunto dos conjuntos de So, So,5 e Si pode ser usado para obter uma estimativa de fração da criança.

[00236] Definir N_ao e Nbo como os vetores formados pelas contagens de sequência para os SNPs em So, N_ao,5 e Nbo.s similarmente para So,5 e N_ai e Nbi similarmente para Si. A estimativa de probabilidade máxima ide f, usando todos os conjuntos de genótipo matemos, é definida pela equação 4.

7= arg maxf P(N_a0, N_b0|f) P(N_aO.5,Nbo.₅|f)P(N_ai, N_bi |f) (4) [00237] Assumindo que as contagens dos alelos para cada SNP são independentemente condicionadas sobre a proporção de alelo de SNPs no plasma, as probabilidades podem ser expressas como produtos sobre os SNPs em cada conjunto:

P(N_ao, Nbo|f)-P(n_as, nbs|f)

Π³

P(N_ai, N_bi|f) = s6Si P(n_as, n_bs|f) (5) [00238] onde n_as, nbs são as contagens sobre SNPs s.

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102/116 [00239] A dependência de f é através dos conjuntos de possíveis proporções de alelos Ro(f), Ro,s(f) e Ri(f). A probabilidade de SNP P(n_as, nbs|f) pode ser aproximada assumindo o genótipo de probabilidade máxima condicionado sobre f. Em fração fetal razoavelmente elevada e profundidade de leitura, a seleção do genótipo de probabilidade máxima será de alta confiança. Por exemplo, na fração fetal de 10 por cento e profundidade de leitura de 1.000, considere um SNP onde a mãe tem genótipo 0. As proporções esperadas de alelos são 0 e 5 por cento, o que será facilmente distinguível em profundidade de leitura suficientemente alta. Substituição do genótipo da criança estimado na equação 5 resulta na equação (6) completa para a estimativa da fração fetal.

f= argmaxf

Π C^À^p(“ ^{ín6j,i)) ]} ®Π *'>.:>) ) [00240] A fração fetal deve estar na faixa de [0,1] e, assim, a otimização pode ser facilmente implementada buscando uma dimensão restrita.

[00241] Outro método seria a soma sobre os possíveis genótipos para cada SNP que resulta na expressão (7) a seguir, para P(n_a, nt>|f) para um SNP em So. A probabilidade prior P(r) poderia ser assumida uniforme sobre Ro(f) ou poderia ser baseada em frequências populacionais. A extensão para grupos So,5 e Si é trivial.

P(n_a, n_b|f) = (7)

Derivação de Probabilidades [00242] A confiança pode ser calculada a partir das probabilidades de dados das duas hipóteses Htf, ou seja, o suposto pai é o pai biológico e FU, ou seja, o suposto pai, não é o pai biológico. O objetivo é calcular P(D|H), isto é, a probabilidade de dados com base na hipótese para cada hipótese e inferir a hipótese que é mais provável.

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Em uma modalidade, isto pode ser feito usando a regra de Bayes: p(hid)~p(dih)* píh), onde P(H) é o peso prior da hipótese e onde P(D|H) é a probabilidade de dados com base na hipótese.

[00243] Considere P(D|H,f), ou seja, a probabilidade de dados com base na hipótese para uma determinada fração da criança. Se uma distribuição sobre a fração da criança estiver disponível, é possível derivar:

P(D|H) = Jp(D,f|H)df [00244] e, ainda:

P(D|H) - Jp(D |H, f)P(flH)df [00245] Note que P(f|H) é independente da hipótese, isto é, P(f|H) = P(f), uma vez que a fração da criança é a mesma a despeito do fato se o suposto pai é o pai biológico ou não e qualquer razoável prior P(f) pode ser escolhida, por exemplo, um prior uniforme de 0 a 50% da fração da criança. Em uma modalidade, é possível usar apenas uma fração da criança. Neste caso,

P(D|H) = PfDL.O [00246] Considere a probabilidade P(D|H,f). A probabilidade de cada hipótese é determinada com base no modelo de resposta, na fração fetal estimada, nos genótipos maternos, nos genótipos do suposto pai, nas frequências populacionais de alelos, nas contagens de alelos no plasma e SNPs. Digamos que D representa os dados, conforme definido antes.

[00247] Em uma modalidade, assume-se que a observação de cada SNP é independentemente condicionada sobre a proporção de alelo no plasma, assim, a probabilidade de uma hipótese de paternidade é o produto das probabilidades dos SNPs:

P(D[H,f) = Ρ(Ο)Η,ί,ϊ)

SNPs i

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104/116 [00248] As equações a seguir descrevem como se pode derivar a probabilidade para um único SNP i e uma única fração f da criança. A Equação 8 é uma expressão geral para a probabilidade de qualquer hipótese H a qual, então, será dividida em casos específicos de Htf e Hwf. Note que os genótipos, g_m, gtf, gdf, assumirão valores em {AA, AB, BB} que se traduzem em {0, 0,5, 1}, onde AA = 0, AB = 0,5, BB = 1. Também, gtf denota os genótipos do pai verdadeiro e g_df denota os genótipos representados pelos dados fornecidos para o pai. Neste caso, Htf, gtf e g_df são equivalentes.

P(DIA«,Í) = £ P(O\_S„._3áf._Sc,f.HA)’P(g_c\8_m-9^>P(S_m\i)'P(Stf\i)'P(3df\i') (8) [00249] No caso da hipótese Htf, o suposto pai é o pai biológico e os genótipos fetais são herdadas dos genótipos matemos e genótipos do suposto pai. A equação acima é simplificada para:

p(d|/,w = - £ p(O\s„,g„.g_e.f_tíi = n_t{.i}-p{g₍\g_n.gt_f.n = ΉΜΟ [00250] Ainda,

P(9c\9m‘9tf-H = ^Htf) = PM9m'9tf) [00251] e

P(s_m|g_m,i)P(G_m|g_ni,i)P(s_f|g_tf,i)P(G_f|g_tf_/i)P(s|g_niJg_of_íi) (9) [00252] No caso de Hwf, o suposto pai não é o pai biológico. Uma estimativa dos verdadeiros genótipos paternos pode ser gerada usando as frequências populacionais em cada SNP. Assim, as probabilidades de genótipos da criança podem ser determinadas pelos genótipos conhecidos da mãe e as frequências populacionais, ou seja, os dados não fornecem informações adicionais sobre os genótipos do pai biológico. Neste caso, a equação acima não simplifica mais e permanece como:

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P(p\f,H = H_wf,l) = Σ ^p(P\9m.9df'Sc'f'H = H_Wf'i) 3τη·9(/·3ά/·3ί:^{0,ί),5,1} * P(9c\9_m'9tf'H = H_wf) * K<J_m|0 * P(íJt/|i) * P(9df IO [00253] Ainda,

P(3_c\9m-9tf'H = H_Wf) = P(âc\9m’9tf) [00254] onde a única informação sobre gtf são os priores da população e:

^p{b\9mi 9tf>9c> f ’ 9 ⁼ H_Wf! í) ⁼

P(Smlgm, Í)P(Gmlgm< >)P(Sflgdf< íWflgdf- í)P(sIgm> gc·^f-0 0°) [00255] Em ambas as expressões de probabilidades, P(D|f,H,i), ou seja, para ambas as hipóteses, o modelo de resposta, P(s|g_m,gdf,gc,f,H) é generalizado. Exemplos específicos são mencionados em outras partes no documento nas discussões sobre modelos de plataforma em geral. Alguns exemplos para o modelo de resposta incluem distribuição binomial, distribuição beta-binomial, distribuição Póya multivariada, uma distribuição empírica estimada a partir de dados de treino ou funções similares, conforme discutido acima.

[00256] Em algumas modalidades, a confiança C_p sobre a paternidade correta pode ser calculada a partir das probabilidades P(D|Htf) e P(D|Hwf). Em uma modalidade, este cálculo pode ser feito usando a regra de Bayes, como segue:

_{c =}______________ ^P + P(D\H_wf)P(H_wf) [00257] ou escrito para um caso mais específico, tal como um produto sobre SNPs das duas probabilidades:

, Tljjs | í/j, G_ms, + 11$ P(n_asr ⁿbs Gyns, G_tf,f) [00258] Em outra modalidade, a confiança pode ser calculada como segue:

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106/116 ^p P(D|H_t/) + P(D|H_w/) [00259] Outras funções razoáveis das probabilidades são também possíveis.

Seção Experimental

Experimento 1 [00260] Vinte e uma gestantes com a paternidade confirmada e idade gestacional entre 6 e 21 semanas foram inscritas. Os participantes doaram sangue voluntariamente como parte de nosso programa de pesquisa IRB aprovado e foram retirados de centros de fertilização in vitro, escritórios de OB e da população em geral em diferentes localidades nos Estados Unidos. DNA sem células (ffDNA) isolado do plasma materno, juntamente com DNA da mãe e do suposto pai, foram amplificados e medidos usando um arranjo de SNP. Um método informatizado descrito aqui foi usado para excluir ou incluir a paternidade para 21 pais corretos e 36.400 pais incorretos ao comparar cada suposto pai contra uma distribuição de referência gerada a partir de um conjunto de mais de 5.000 indivíduos sem parentesco. 20 das 21 amostras tinham DNA fetal suficiente para retornar resultados. Vinte de vinte (100%) inclusões de paternidade estavam corretas. 36.382 de 36.382 exclusões de paternidade estavam corretas (100%), com 18 sem atribuições em virtude de similaridade genética intermediária. Não houve atribuições errôneas.

[00261] A população era composta por casais que doaram seu sangue para pesquisa pré-natal. As mulheres tinham de ter gestações únicas, quer no primeiro ou segundo trimestre, e paternidade confirmada. Amostras de sangue foram coletadas de mulheres usando tubos para sangue CELL-FREE (STRECK) contendo conservante de células sanguíneas brancas e amostras genéticas foram coletadas do pai, quer como uma amostra de sangue (EDTA) ou bucal. Consentimento informado foi obtido de todos os participantes e as

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107/116 amostras genéticas foram coletadas de pacientes atendidos em um estudo IRB aprovado.

[00262] Sangue materno foi centrifugado para isolar a camada leucoplaquetária e o soro. O DNA genômico na camada leucoplaquetária materna e do suposto pai e o DNA no soro materno foram preparados para análise e passados sobre arranjos de SNP ILLUMINA INFINIUM CYTO12 usando protocolos padrão. Resumidamente, o DNA foi isolado usando o kit QIAGEN CIRCULATING NUCLEIC ACID e eluído em 45 _μΙ de tampão de acordo com as instruções do fabricante. Vinte microlitros de eluato foram usados em uma reação de término às cegas em 1x tampão NEB 4, dNTP a 0,42 mM e 2,5 U de DNA polimerase T4 (NEW ENGLAND BIOLABS) e incubados a 20 °C durante 30 min, então, 75 °C durante 15 min. Três microlitros de mistura de ligação (0,5 μΙ de 10x NEB 4, 1 _μΙ de ATP a 10 mM, 1 _μΙ de PNK T4 (NEW ENGLAND BIOLABS), 0,5 _μΙ de DNA-ligase T4 (NEW ENGLAND BIOLABS)) foram adicionados e as amostras incubadas a 16 °C durante 24 horas, então, 75 °C durante 15 min. A amostra foi transferida para o ensaio padrão ILLUMINA INFINIUM juntamente como DNAgenômico materno e do suposto pai. Em resumo, 24 μΙ de DNA tiveram o genoma inteiro amplificado a 37 °C durante 20-24 horas, seguido por fragmentação e precipitação. O precipitado foi, então, ressuspenso em tampão de hibridização, termicamente desnaturado e transferido para arranjos de SNP Cyto12 usando um TECAN EVO. Os arranjos foram incubados a 48 °C durante pelo menos 16 horas, X-Corados(INFINIUM II CHEMISTRY)e lavados no TECAN EVO e finalmente digitalizados. Intensidades de arranjo foram extraídas usando BEADSTIDUO (ILLUMINA).

[00263] O método informatizado descrito gerou uma estatística de teste que mede o grau de similaridade genética entre o feto e outro indivíduo. Esta estatística de teste foi calculada tanto para o suposto

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108/116 pai quanto para conjunto de mais de 5.000 indivíduos sem parentesco. Um teste de rejeição de hipótese única, então, determinou se a estatística calculada para o suposto pai podería ser excluída da distribuição formada por indivíduos de referência sem parentesco. Se o suposto pai pôde ser rejeitado do conjunto sem parentesco, então, inclusão de paternidade resultava; caso contrário, a paternidade era excluída. Para as 20 amostras com DNA suficiente, o teste de paternidade foi realizado contra 20 pais corretos e para 1820 pais incorretos aleatoriamente selecionados.

[00264] A inclusão de paternidade foi atribuída quando o p-valor da estatística de teste do suposto pai na distribuição de indivíduos sem parentesco era inferior a 10'⁴. Isto significa que, em teoria, espera-se que não mais de um em 10.000 indivíduos sem parentesco mostre tanta similaridade genética ao feto. Uma sem atribuição era atribuída quando o p-valor está entre 10'⁴ e 0,02. Uma atribuição de DNA fetal insuficiente era feita quando o DNA fetal correspondia a menos de 2% do DNA plasmático. O conjunto de indivíduos sem parentesco usados para gerar a distribuição esperada era composta de indivíduos de uma ampla variedade de origens raciais e a determinação de inclusão ou exclusão de paternidade foi recalculada para conjuntos de indivíduos sem parentesco de diferentes raças, incluindo a raça indicada para o suposto pai. Os resultados de inclusão e exclusão foram gerados automaticamente pelo algoritmo e não foi necessária intervenção humana.

[00265] Em conclusão, vinte e uma amostras de sangue materno com paternidade conhecida foram testadas. Vinte das 21 amostras retornaram resultados, enquanto que uma tinha DNA fetal insuficiente para análise; esta amostra foi retirada de uma mulher com idade gestacional de 8 semanas. Vinte de vinte (100%) resultados tiveram a paternidade correta confirmada, cada um com um p-valor < 10'⁴. Cada

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109/116 uma das 20 amostras com fração fetal suficiente foi testada contra um conjunto aleatório de 1.820 pais incorretos para um total de 36.400 testes de paternidade individuais. 36.382 destas análises retornaram um resultado; 36.382 de 36.382 (100%) tiveram corretamente a paternidade excluída, com um p-valor de mais de 10'⁴ e 18 de 36.400 (0,05%) foram atribuídas com sem atribuição, com um p-valor compreendido entre 10'⁴ e 0,02. Não houve exclusões ou inclusões de paternidade incorretas.

[00266] Nove das 21 amostras confirmaram a paternidade em virtude de controle de fertilização durante IVF com paternidade correta confirmada após a fertilização através de diagnóstico genético préimplantação. Doze amostras tinham paternidade confirmada por meio de testes de paternidade independentes de DNA genômico fetal/criança realizados pelo DNA Diagnostic Center, Fairfield, Ohio. Experimento 2 [00267] Em um experimento, quatro amostras de plasma materno foram preparadas e amplificadas através de um protocolo 9.600-plex hemi-agrupado. As amostras foram preparadas da seguinte maneira: entre 15 e 40 mL de sangue materno foram centrifugados para isolara camada leucoplaquetária e o plasma. O DNA genômico materno foi preparado a partir da camada leucoplaquetária e DNA paterno foi preparado a partir de uma amostra de sangue ou amostra de saliva. DNA sem células no plasma materno foi isolado usando o kit QIAGEN CIRCULATING NUCLEIC ACID e eluído em 45 _μΙ de tampão TE de acordo com as instruções do fabricante. Adaptadores de ligação universal foram anexados ao final de cada molécula de 35 μΐ de DNA plasmático purificado e bibliotecas foram amplificadas durante 7 ciclos usando iniciadores específicos ao adaptador. As bibliotecas foram purificadas com glóbulos AGENCOURT AMPURE e eluídas em 50 μΙ de água.

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110/116 [00268] 3 μΙ do DNA foram amplificados com 15 ciclos de STA (95°C durante 10 minutos para ativação inicial de polimerase, seguido por 15 ciclos de 95°C durante 30 s; 72 °C durante 10 s, 65°C durante 1 min, 60°C durante 8 min, 65°C durante 3 minutos e 72°C durante 30 s e uma extensão final a 72°C durante 2 min) usando uma concentração de iniciador de 14,5 nM de 9600 iniciadores reversos marcados específicos para o alvo e um iniciador direto específico para o adaptador de biblioteca a 500 nm.

[00269] O protocolo de PCR hemi-agrupada envolveu uma segunda amplificação de uma diluição dos produtos da primeira STA durante 15 ciclos de STA (95°C durante 10 minutos para ativação inicial de polimerase, seguido por 15 ciclos de 95°C durante 30 s, 65 °C durante 1 min; 60 °C durante 5 min, 65°C durante 5 min e 72°C durante 30 s e uma extensão final a 72°C durante 2 min) usando uma concentração de tag reversa de 1000 nM e uma concentração de 16,6 nM para cada um dos 9600 iniciadores diretos específicos para o alvo.

[00270] Uma alíquota dos produtos de STA foi, então, amplificada por meio de PCR padrão durante 10 ciclos com 1 μΜ de iniciadores reverso com código de barras e direto específicos para o marcador para gerar bibliotecas de sequenciamento com códigos de barras. Uma alíquota de cada biblioteca foi misturada com diferentes bibliotecas com códigos de barras e purificadas usando uma coluna de centrifugação.

[00271] Desta forma, 9600 iniciadores foram usados nas reações em uma única cavidade; os iniciadores foram concebidos para objetivar SNPs encontrados sobre os cromossomos 1, 2,13,18, 21, X e Y. Os amplicons foram, então, sequenciados usando um sequenciador ILLUMINA GAIIX. Por exemplo, aproximadamente 3,9 milhões de leituras foram geradas pelo sequenciador, com 3,7 milhões de leituras mapeando ao genoma (94%) e, destas, 2,900 milhões de

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111/116 leituras (74%) mapeadas para SNPs alvo com uma profundidade média de leitura de 344 e uma profundidade mediana de leitura de 255. Descobriu-se que a fração fetal para as quatro amostras era de 9,9%, 18,9%, 16,3% e 21,2%.

[00272] Amostras de DNA genômico materno e paterno relevantes foram amplificadas usando um protocolo de 9600-plex semiagrupado e sequenciadas. O protocolo semiagrupado é diferente pelo fato de que ele aplica 9.600 iniciadores diretos externos e iniciadores reversos marcados a 7,3 nM na primeira STA. Condições de termociclização e composição da segunda STA e a PCR com código de barras foram as mesmas conforme para o protocolo hemi-agrupado.

[00273] Os dados de sequenciamento foram analisados usando os métodos informatizados descritos aqui e cada um de um conjunto de dez homens sem parentesco de um conjunto de referência foram determinados como não sendo o pai biológico de cada um dos fetos em gestação.

Experimento 3 [00274] Em um experimento, 45 conjuntos de células foram amplificados usando um protocolo de 1200-Plex semiagrupado, sequenciados e determinações de ploidia foram feitas sobre três cromossomos. Note que este experimento é usado para simular as condições de realização de testagem de paternidade em células fetais únicas obtidas de sangue materno, amostras forenses ou onde uma pequena quantidade de DNA da criança está presente. 15 células individuais únicas e 30 conjuntos de três células foram colocados em 45 tubos de reação individuais para um total de 45 reações, onde cada reação continha células de apenas uma linhagem de células, mas as diferentes reações continham células de diferentes linhagens de células. As células foram preparadas em 5 μΙ de tampão de lavagem e submetidas à lise mediante a adição de 5 μΙ de tampão de lise

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ARCTURUS PICOPURE (APPLIED BIOSYSTEMS) e incubação a 56°C durante 20 min, 95°C durante 10 min.

[00275] O DNA das células únicas/três células foi amplificado com 25 ciclos de STA (95°C durante 10 minutos para ativação inicial de polimerase, então, 25 ciclos de 95°C durante 30 s; ’ 72 C durante 10 s, 65°C durante 1 min e 60°C durante 8 min; 65°C durante 3 min e 72°C durante 30 s e uma extensão final a 72°C durante 2 min) usando uma concentração de iniciador de 1200 iniciadores reversos marcados e direto específicos para o alvo.

[00276] Um protocolo de PCR semi-agrupada envolvia três segunda amplificação paralela de uma diluição dos primeiros produtos de STA durante 20 ciclos de STA (95°C durante 10 minutos para ativação inicial de polimerase, seguido por 15 ciclos de 95°C durante 30 s, 65 C durante ’ 1 min, 60°C durante 5 min, 65°C durante 5 min e 72°C durante 30 s e uma extensão final a 72°C durante 2 min) usando uma concentração de iniciador reverso específico para o alvo de 1000 nM e uma concentração de 60 nM para cada um dos 400 iniciadores diretos agrupados específicos para o alvo. Nas três reações 400-Plex paralelas, um total de 1200 alvos amplificados na primeira STA foi, assim, amplificado.

[00277] Uma alíquota dos produtos de STA foi, então, amplificada por meio de PCR padrão durante 15 ciclos com 1 μΜ de iniciadores reverso com código de barras e direto específicos para o alvo para gerar bibliotecas de sequenciamento com códigos de barras. Uma alíquota de cada biblioteca foi misturada com diferentes bibliotecas com códigos de barras e purificada usando uma coluna de centrifugação.

[00278] Desta forma, 1200 iniciadores foram usados nas reações com células únicas; os iniciadores foram concebidos para objetivar SNPs encontrados sobre os cromossomos 1, 21 e X. Os amplicons

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113/116 foram, então, sequenciados usando um sequenciador ILLUMINA GAIIX. Por exemplo, cerca de 3,9 milhões de leituras foram geradas pelo sequenciador, com 500.000 a 800.000 milhões de leituras mapeando ao genoma (74% a 94% de todas as leituras por amostra).

[00279] As amostras de DNA genômico materno e paterno relevantes de linhagens de células foram analisadas usando o mesmo pool de ensaio 1200-plex semiagrupado com um protocolo similar com menos ciclos e 1200-Plex da segunda STAe sequenciadas.

[00280] Os dados de sequenciamento foram analisados usando os métodos informatizados descritos aqui e cada um de um conjunto de dez homens sem parentesco de um conjunto de referência foram determinados como não sendo o pai biológico do indivíduo alvo para cada uma das 45 células.

DNA de Crianças de Gestações Anteriores em Sangue Materno [00281] Uma dificuldade para testagem de paternidade pré-natal não invasiva é diferenciar células fetais da gravidez atual de células fetais de gestações anteriores. Alguns acreditam que o material genético de gestações anteriores é eliminado após algum tempo, mas evidências conclusivas não foram mostradas. Em uma modalidade da presente descrição, é possível determinar o DNA fetal presente no sangue materno de origem paterna (isto é, DNA que o feto herdou do pai) usando o método PARENTAL SUPPORT® (PS)e o conhecimento do genoma paterno. Este método pode utilizar a informação genética paterna eliminada. É possível eliminar o genótipo paterno da informação genotípica não eliminada usando dados genéticos dos avós (tais como dados genéticos medidos a partir do esperma do avô) ou dados genéticos de outros filhos ou uma amostra de um aborto espontâneo. Também, se poderia eliminar a informação genética não eliminada por meio de uma eliminação com base em HapMap ou uma haplotipagem de células paternas. Haplotipagem de sucesso é

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114/116 demonstrado quando as células param na fase de mitose, quando os cromossomos são feixes apertados e usando microfluídica para colocar cromossomos separados em pools distintos. Em outra modalidade, é possível usar os dados haplotípicos paternos eliminados para detectar a presença de mais de um homólogo do pai, o que implica que o material genético de mais de uma criança está presente no sangue. Concentrando-se sobre cromossomos que se espera que sejam euplóides no feto, pode-se descartar a possibilidade de que o feto sofra de uma trissomia. Além disso, é possível determinar se o DNA do feto não é do pai atual, caso no qual se pode usar outros métodos, tal como o teste triplo, para prever anormalidades genéticas.

[00282] Pode haver outras fontes de material genético fetal disponíveis via outros métodos que não uma coleta de sangue. No caso do material genético fetal disponível no sangue materno, existem duas categorias principais: (1) células fetais inteiras, por exemplo, em células sanguíneas vermelhas nucleadas ou eritroblastos fetais e (2) DNA fetal em flutuação livre. No caso de células fetais inteiras, há alguma evidência de que células fetais podem persistir no sangue materno durante um período prolongado de tempo, de modo que é possível isolar uma célula de uma gestante que contém o DNA de uma criança ou um feto de uma gravidez anterior. Também há evidências de que o DNA fetal em flutuação livre é eliminado do sistema em uma questão de semanas. Um desafio é como determinar a identidade do indivíduo cujo material genético está contido na célula, ou seja, assegurar que o material genético medido não é de um feto de uma gravidez anterior. Em uma modalidade da presente descrição, o conhecimento do material genético materno pode ser usado para assegurar que o material genético em questão não é material genético materno. Há uma série de métodos para atingir esta finalidade,

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115/116 incluindo métodos informatizados, tal como PARENTAL SUPPORT®, conforme descrito aqui ou em qualquer uma das patentes citadas neste documento.

[00283] Em uma modalidade da presente descrição, o sangue coletado de uma gestante pode ser separado em uma fração compreendendo DNA fetal em flutuação livre e uma fração compreendendo células sanguíneas vermelhas nucleadas. O DNA em flutuação livre pode, opcionalmente, ser enriquecido e a informação genotípica do DNA pode ser medida. Com base nas informações genotípicas medidas a partir do DNA em flutuação livre, o conhecimento do genótipo materno pode ser usado para determinar aspectos do genótipo fetal. Estes aspectos podem se referirão estado de ploidia e/ou um conjunto de identidades de alelos. Então, células nucleadas individuais que são presumível ou possivelmente de origem fetal podem sofrer genotipagem usando métodos descritos neste documento e outras patentes relacionadas, especialmente aquelas mencionadas no presente documento. O conhecimento do genoma materno permitiría determinar se qualquer determinada célula sanguínea única é ou não geneticamente materna. E os aspectos do genótipo fetal que foi determinados conforme descrito acima permitiría determinar se a célula sanguínea única é geneticamente derivada do feto que está atualmente em gestação. Em essência, este aspecto da presente descrição permite usar o conhecimento genético da mãe e possivelmente a informação genética de outros indivíduos com parentesco, tal como o pai, juntamente com a informação genética medida a partir do DNA em flutuação livre encontrado no sangue materno para determinar se uma célula nucleada isolada encontrada no sangue materno é (a) geneticamente materna, (b) geneticamente do feto atualmente em gestação ou (c) geneticamente de um feto de uma gravidez anterior.

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116/116 [00284] Todas as patentes, pedidos de patente e referências publicadas citados aqui são aqui incorporados por referência na íntegra. Será apreciado que várias das características e funções descritas acima e outras ou alternativas das mesmas podem, desejavelmente, ser combinadas em muitos outros sistemas ou aplicações diferentes. Várias alternativas, modificações, variações ou aperfeiçoamentos presentemente imprevistos podem ser subsequentemente feitos por aqueles versados na técnica, os quais também se destinam a ser abrangidos pelas reivindicações a seguir.

Claims (26)

1. Método ex vivo para determinar se um suposto pai é o pai biológico de um feto que está em gestação em uma gestante, caracterizado pelo fato de que compreende:

fazer medições genotípicas em uma pluralidade de locus polimórficos sobre material genético do suposto pai, em que a pluralidade de loci polimórficos compreende polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs);

fazer medições genotípicas na pluralidade de loci polimórficos em uma amostra de DNA mista proveniente de uma amostra de sangue de uma gestante, em que a amostra de DNA mista compreende DNA fetal e DNA materno;

determinação, em um computador, da probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico do feto usando as medidas genotípicas feitas sobre o material genético do suposto pai e a amostra de DNA mista, e estabelecimento se o suposto pai é o pai biológico do feto usando a probabilidade determinada de que o suposto pai é o pai biológico do feto.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende obtenção de medições genotípicas na pluralidade de loci polimórficos a partir de material genético a partir da mãe, em que a probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico do feto é determinada usando as medições genotípicas feitas sobre o material genético da mãe, o material genético do suposto pai e a amostra de DNA mista.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra de DNA mista compreende (i) DNA em flutuação livre de uma fração plasmática da amostra de sangue da mãe, (ii) sangue materno íntegro, ou (iii) uma fração de sangue

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2/9 materno contendo células nucleadas.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a fração de células nucleadas contendo sangue materno foi enriquecida para células de origem fetal.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a determinação compreende:

cálculo de uma estatística de teste para o suposto pai, em que a estatística de teste para o suposto pai indica um grau de similaridade genética entre o suposto pai e o feto, e em que a estatística de teste para o suposto pai é com base nas medições genotípicas feitas sobre o material genético do suposto pai, o material genético da mãe, e a amostra de DNA mista;

cálculo de uma pluralidade de estatísticas de teste para uma pluralidade de indivíduos que não têm parentesco com o feto, em que cada estatística de teste para um indivíduo sem parentesco indica um grau de similaridade genética entre o indivíduo sem parentesco e o feto, e em que a estatística de teste para o indivíduo sem parentesco se baseia em medições genotípicas feitas sobre material genético do indivíduo sem parentesco, o material genético da mãe, e a amostra de DNA mista;

cálculo de uma probabilidade de que a estatística de teste para o suposto pai é parte da distribuição da estatística de teste para a pluralidade de indivíduos sem parentesco; e determinação da probabilidade de que se o suposto pai seja o pai biológico do feto usando a probabilidade de que a estatística de teste para o suposto pai é parte da distribuição da estatística de teste para a pluralidade de indivíduos sem parentesco.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o estabelecimento se o suposto pai é o pai biológico do feto compreende ainda:

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3/9 estabelecer se o suposto pai é o pai biológico do feto ao rejeitar a hipótese de que o suposto pai não tem parentesco com o feto, se a probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico do feto está acima de um limite máximo, ou estabelecer se o suposto pai não é o pai biológico do feto ao não rejeitar a hipótese de que o suposto pai não tem parentesco com o feto, se a probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico do feto está abaixo de um limite mínimo, ou não estabelecer se um suposto pai é o pai biológico do feto, se a probabilidade está entre o limite mínimo e o limite máximo ou se a probabilidade não é determinada com confiança suficientemente alta.

7. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a determinação da probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico do feto compreende:

obtenção de frequências de alelo populacionais em cada locus da pluralidade de loci polimórficos;

criação de uma divisão de possíveis frações de DNA fetal na amostra de DNA mista que variam de um limite mínimo de fração fetal a um limite máximo de uma fração fetal;

cálculo de uma probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico do feto com base nas medições genotípicas feitas sobre o material genético da mãe, o material genético do suposto pai e a amostra de DNA mista para cada uma das possíveis frações fetais na divisão;

determinação da probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico do feto por meio de combinação das probabilidades calculadas de que o suposto pai é o pai biológico do feto para cada uma das eventuais frações fetais na divisão;

cálculo de uma probabilidade de que o suposto pai não é o pai biológico do feto com base nas medições genotípicas feitas sobre

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4/9 o material genético da mãe, o material genético do suposto pai e a amostra de DNA mista e fornecidas nas frequências populacionais de alelos obtidas para cada uma das possíveis frações fetais na divisão; e determinação da probabilidade de que o suposto pai não é o pai biológico do feto por meio de combinação das probabilidades calculadas de que o suposto pai não é o pai biológico do feto para cada uma das eventuais frações fetais na divisão.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o cálculo da probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico do feto e cálculo da probabilidade de que o suposto pai não é o pai biológico do feto compreendem ainda:

cálculo, para cada uma da pluralidade de loci polimórficos, da probabilidade de dados de sequência observados em um locus em particular usando um modelo de resposta de plataforma, uma ou uma pluralidade de frações na possível divisão de frações fetais, uma pluralidade de proporções de alelos para a mãe, uma pluralidade de proporções de alelos para o suposto pai e uma pluralidade de proporções de alelos para o feto;

cálculo de uma probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico por meio de combinação da probabilidade dos dados de sequência observados em cada locus polimórfico sobre todas as possíveis frações fetais na divisão, sobre as proporções de alelos da mãe no conjunto de locus polimórficos, sobre as proporções de alelos do suposto pai no conjunto de loci polimórficos e sobre as proporções de alelo fetal no conjunto de loci polimórficos;

cálculo de uma probabilidade de que o suposto pai não é o pai biológico através de combinação da probabilidade dos dados de sequência observados em cada locus polimórfico sobre todas as possíveis frações fetais na divisão, sobre as proporções de alelos da mãe no conjunto de locus polimórficos, sobre as frequências

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5/9 populacionais para o conjunto de loci polimórficos e sobre as proporções de alelos fetais no conjunto de locus polimórficos;

cálculo de uma probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico com base na probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico; e cálculo de uma probabilidade de que o suposto pai não é o pai biológico com base na probabilidade de que o suposto pai não é o pai biológico.

9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o cálculo da probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico com base na probabilidade de que o suposto pai é o pai biológico é realizado usando uma estimativa de probabilidade máxima ou uma técnica de maximum a posteriori.

10. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o estabelecimento se o suposto pai é o pai biológico de um feto compreende ainda:

estabelecer que o suposto pai é o pai biológico se a probabilidade calculada de que o suposto pai é o pai biológico do feto é significativamente maior do que a probabilidade calculada de que o suposto pai não é o pai biológico; ou estabelecer que o suposto pai não é o pai biológico do feto se a probabilidade calculada de que o suposto pai não é o pai biológico é significativamente maior do que a probabilidade calculada de que o suposto pai é o pai biológico.

11. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que os loci polimórficos correspondem a cromossomos que têm uma alta probabilidade de serem disômicos.

12. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a divisão de possíveis frações de DNA fetal contém apenas uma fração fetal e em que a fração fetal é determinada por

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6/9 meio de uma técnica selecionada do grupo que consiste em PCR quantitativa, PCR digital, PCR objetivada, sondas de circularização, outros métodos de amplificação de DNA, sondas de captura por hibridização, outros métodos de enriquecimento preferencial, microarranjos de SNP, microarranjos de DNA, sequenciamento, outras técnicas para medição alelos polimórficos, outras técnicas para medição de alelos não polimórficos, medição de alelos polimórficos que estão presentes no genoma do pai mas não estão presentes no genoma da mãe, medição de alelos não polimórficos que estão presentes no genoma do pai mas não estão presentes no genoma da mãe, medição de alelos que são específicos para o cromossomo Y, comparação do valor medido de alelos herdados do pai para a quantidade medida de alelos herdados da mãe, estimativas de probabilidade máxima, técnicas de maximum a posteriori e combinações dos mesmos.

13. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a divisão de possíveis frações fetais contém apenas uma fração fetal.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o material genético do suposto pai é obtido a partir de um tecido selecionado do grupo que consiste em sangue, tecido somático, espermatozóide, cabelo, amostra bucal, pele, outras amostras forenses e combinações dos mesmos.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que uma confiança é calculada para a determinação estabelecida se o suposto pai é o pai biológico do feto.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a fração de DNA

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7/9 fetal na amostra mista de DNA foi enriquecida usando um método selecionado do grupo consistindo de seleção de tamanho, ligação universal mediada por PCR, PCR com tempos de extensão curtos, e combinações dos mesmos.

17. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que obtenção de medições genotípicas do material genético da mãe compreende fazer medições genotípicas sobre uma amostra de material genético da mãe que consiste essencialmente em material genético materno.

18. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que obtenção de medições genotípicas do material genético da mãe compreende:

inferir quais medições genotípicas das medições genotípicas feitas na amostra de DNA mista provavelmente são atribuíveis ao material genético da mãe; e uso daquelas medições genotípicas que foram inferidas como sendo atribuíveis ao material genético da mãe como as medições genotípicas obtidas.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda tomar uma ação clínica baseada na determinação de paternidade estabelecida, em que a ação clínica é o término de uma gravidez.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a realização de medições genotípicas é feita usando uma técnica ou tecnologia selecionada do grupo que consiste em sondas PADLOCK, sondas de circularização de inversão molecular, outras sondas de circularização, microarranjos de genotipagem, ensaios de genotipagem de SNP, microarranjos com base em chips, microarranjos com bases glóbulo,

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8/9 outros microarranjos de SNP, outros métodos de genotipagem, sequenciamento de DNA de Sanger, piro-sequenciamento, sequenciamento de alto rendimento, sequenciamento objetivado usando sondas de circularização, sequenciamento objetivado usando captura por sondas de hibridização, sequenciamento Dye Terminator reversível, sequenciamento por ligação, sequenciamento por hibridização, outros métodos de sequenciamento de DNA, outras plataformas de genotipagem de alto rendimento, hibridização fluorescente in situ (Fluorescent In Situ Hybridization - FISH), hibridização genômica comparativa (Comparative Genomic Hybridization - CGH), CGH de arranjo e múltiplos ou combinações dos mesmos.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a realização de medições genotípicas é feita sobre material genético que é amplificado e/ou preferencialmente enriquecido antes de ser medido usando uma técnica ou tecnologia que é selecionada do grupo que consiste em: Reação em Cadeia de Polimerase (Polymerase Chain Reaction PCR), ligação mediada por PCR, PCR com iniciador de oligonucleotídeo degenerativa, amplificação objetivada, mini-PCR, amplificação por PCR universal, amplificação por deslocamento múltiplo (Multiple Displacement Amplification - MDA), PCR aleloespecífica, técnicas de amplificação alelo-específica, métodos de amplificação linear, ligação de DNA substrato seguido por um outro método de amplificação, amplificação de ponte, sondas PADLOCK, sondas de circularização, captura por sondas de hibridização e combinações dos mesmos.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que compreende gerar um relatório compreendendo a paternidade estabelecida do feto.

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9/9

23. Relatório, caracterizado pelo fato de que descreve a paternidade estabelecida do feto gerado usando o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22.

24. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a amostra mista de DNA compreende DNA livre flutuante da amostra de sangue da mãe.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 24, caracterizado pelo fato de que compreende ainda estimar a fração fetal de DNA na amostra mista e usar a estimativa para estabelecer se o suposto pai é o pai biológico do feto.

26. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a utilização da estimativa da fração fetal para calcular a confiança de se o suposto pai é o pai biológico do feto.