CN108048575B - 一种用于产前无创亲子鉴定的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于产前无创亲子鉴定的试剂盒，其包括用于检测86个SNP位点的引物组中的部分或全部。本发明的试剂盒利用最多仅86个SNP位点即可实现产前无创亲子鉴定，使用本发明的试剂盒和检测方法可进行高灵敏度、高通量、低成本，仅需5M数据即可获得平均2万乘深度的序列，在出生前检测亲缘关系，做到无创、早期检查，并且准确度超过99.99％，亲缘关系非常近的家系中也能很好的区分。
Description
技术领域
本发明涉及亲缘关系鉴定领域，更特别地，涉及一种用于产前无创亲子鉴定的试剂盒及方法。
背景技术
亲权鉴定是指通过检测与分析一系列多态性遗传标记来判定父母与子女之间是否存在生物学亲缘关系。现代亲权鉴定的方法采用DNA分析，主要是应用第二代遗传标记——短串联重复序列(STR)分型技术，即通过对DNA样品进行15-20个STRs的检测、分型和统计而达到计算出亲权概率的目的，若有3个及以上STR位点不同，可排除亲子关系。然而，在近20年的应用中，人们发现STR分型技术中由于不同等位基因的序列长度相似，区分和判型具有一定的困难，一般每个PCR反应的判型错误率可达1％-5％(Bonin et al.2004；Weller et al.2004)，判型错误会直接影响亲子鉴定的准确性和可重复性。
单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上，特定核苷酸位置上存在两种或两种以上不同的碱基，引起DNA系列的多态性，其中任何一种等位基因在群体中的频率不小于1％，已成为继限制性酶切片段长度多态(RFLP)和STR多态标记后的第三代分子遗传标记。在遗传制图、连锁性分析、疾病基因定位和物种多态性研究等诸多领域中，SNP已经逐渐取代STR，成为首选的遗传标记。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是第三代遗传学标记，这种遗传标记是由于单碱基突变使特定核苷酸位置上出现两种碱基，其中最少的一种在群体中的频率不少于1％。SNP的分布密集，如果以1％的频率计算，在人基因组中就有300万个以上的SNP遗传标记，这可能达到了人类基因组多态位点数目的极限，因此被认为是应用前景最好的遗传标记物。在医学遗传学、群体遗传学和药物基因组学中有广泛的应用。在法医物证检验中，也由于SNP的含量丰富、遗传稳定，而引起了高度重视。
1997年，Lo等人研究证实，在孕妇的血浆中含有胎儿游离DNA(cell-free fetalDNA，cffDNA)，为无创胎儿亲子鉴定技术提供了依据。胎儿游离DNA特点：A.含量低，每毫升血浆中游离DNA为纳克(10-9g)级，其中胎儿游离DNA仅占血浆游离DNA总量的5％-30％；B.片断化,胎儿游离DNA片断被降解，大小从75bp-250bp不等，平均为166bp。C.半衰期短,分娩后母体静脉血中胎儿游离DNA在2小时左右快速降解小时。
现在的无创胎儿亲子鉴定技术选取SNP位点进行检测，使用液相交捕获的方法富集几千到上万个SNP位点，通过高通量测序进行基因分型，最后根据孟德尔遗传规律判断父母与子女之间是否存在亲子关系，该方法最终筛选过滤后的有效位点非常少，准确度也存在一定的问题，所以需要庞大的位点去做评估，该方法建库成本跟测序成本都非常高、信息分析上也是个挑战。
对于有效SNP位点的选择可省去不必要的试剂和人工，去除杂乱的信息分析背景噪音。因此，需要一种新的用于无创亲子鉴定的试剂盒和检测方法，使用有效少量的SNP位点即可提供用于判断的信息。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种用于产前无创亲子鉴定的试剂盒，其包括用于检测86个SNP位点中的部分或全部的引物组，所述86个SNP位点为：rs1005323、rs12467794、rs2726588、rs10078204、rs12471813、rs27419、rs10133452、rs12895416、rs2774504、rs1015665、rs1292067、rs2917539、rs1018078、rs12959775、rs3018843、rs1036963、rs13026592、rs347001、rs10438055、rs13437093、rs4131354、rs10745266、rs1360864、rs4383040、rs10756626、rs1531500、rs4681878、rs10807347、rs1559497、rs4740053、rs10823547、rs1565691、rs4798343、rs10863776、rs1608962、rs4915564、rs11139320、rs1652603、rs6054870、rs11151684、rs17131659、rs631948、rs11224705、rs1824965、rs6446700、rs11238130、rs1996872、rs6472054、rs11973256、rs2000546、rs6554565、rs12319069、rs2026522、rs6800661、rs12440533、rs221899、rs6810046、rs12457304、rs224045、rs6901432、rs7208337、rs2324562、rs7046039、rs7212373、rs264949、rs7169403、rs7237823、rs2666504、rs9289628、rs744536、rs8079416、rs9310661、rs7448547、rs8086877、rs9469597、rs7593080、rs846212、rs947098、rs7624209、rs853805、rs984176、rs7968494、rs864674、rs7310727、rs6957316、rs4667590。
在一个优选实施方案中，所述引物组的序列如SEQ ID NO:1-172所示，其中SEQ IDNO:2n-1与SEQ ID NO:2n构成一对引物。
在一个优选实施方案中，所述试剂盒还包括用于富集DNA的试剂组，所述用于富集DNA的试剂组包括接头和通用扩增引物。
在一个优选实施方案中，所述接头的序列为SEQ ID NO:173和174，或者SEQ IDNO:175和176，或其组合。
在一个优选实施方案中，所述通用扩增引物的序列为SEQ ID NO:177和178，或者SEQ ID NO:179和180，或其组合。
在一个优选实施方案中，所述试剂盒还包括环化连接辅助序列Helper。
在一个优选实施方案中，所述接头的序列为SEQ ID NO:173和174，所述环化连接辅助序列Helper的序列如SEQ ID NO:181所示；或者所述接头的序列为SEQ ID NO:175和176，所述环化连接辅助序列Helper的序列如SEQ ID NO:182所示。
在一个优选实施方案中，所述试剂盒还包括用于Barcode PCR扩增的试剂组，所述用于Barcode PCR扩增的试剂组包括第二通用引物和index。
在一个优选实施方案中，所述第二通用引物的序列如SEQ ID NO:183所示，所述index的序列为SEQ ID NO:184-195。
本发明还提供了一种用于产前无创亲子鉴定的方法，包括使用上述试剂盒进行检测，并将检测结果进行高通量分析。
本发明的试剂盒利用仅86个SNP位点即可实现产前无创亲子鉴定，使用本发明的试剂盒和检测方法可进行高灵敏度、高通量、低成本，仅需5M数据即可获得平均2万乘深度的序列，在出生前检测亲缘关系，做到无创、早期检查，并且准确度超过99.99％，亲缘关系非常近的家系中也能很好的区分。
附图说明
图1为Caliper检测Gel图；
图2为Caliper检测片段分布图；
图3为CPI分布图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.文库制备
1)DNA提取
从孕妇外周血提取游离DNA，并提取疑似父亲的基因组DNA，将疑似父亲的基因组DNA取200ng，使用超声波或酶切打断至180bp左右。
2)末端修复
使用T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶和Klenow片段对上述DNA片段进行末端修复，50μl修复体系如下：10×T4PNK Buffer 5μl，dNTP Mix 1μl，T4DNA聚合酶1μl、T4PNK 1μl和Klenow片段0.5μl，DNA 10ng，余下的用水补足；于20℃金属浴中孵育30min，分离DNA，溶于42μl水中，用于末端加A。
3)末端加A
使用Klenow 3’-5’exo-片段进行末端加A，50μl加A体系为：DNA 42μl，10×BlueBuffer 5μl，dATP 1.5μl，Klenow 3’-5’exo-片段1.5μl；于37℃金属浴中孵育30min，分离DNA，溶于20μl水中，用于接头连接。
4)接头连接
使用T4DNA连接酶进行连接，50μl连接体系为：DNA 19μl，2X连接酶buffer 25μl，T4DNA连接酶2μl，接头(10μM)4μl；于20℃金属浴中孵育20min，分离DNA，溶于40μl水中，用于PCR富集。接头序列为GATGTGACCGATTGGCNNNNNNTCTGCAGTAGACCATGGT和GCACTCGTACAGTCGATCGTCCATCTGTTCACAGCT(SEQ ID NO:173和174),或者GCTGTGAACGTATGGACNNNNNNTCTGCTGATTCGATGCT和GCTCTCATACATGTCGACCGTCAATCGCTCAGAGTT(SEQ ID NO:175和176)。
5)PCR富集
使用通用引物，通过PCR富集DNA，50μl扩增体系为：DNA 37μl，10×Pfx buffer 5μl，硫酸镁1μl，dNTP 2μl，Pfx DNA聚合酶1μl，引物(10μM)每条各2μl；于PCR仪中进行扩增，程序如下：94℃，2min；10cycs(94℃，10s；60℃，30s；72℃，30s)；72℃，5min，4℃，∝；分离扩增产物，溶于45μl水中，用于环化。通用引物对序列为AGCATCGAATCAAGCAGA和GCAACTCGTACAGTCGATC(SEQ ID NO:177和178)，或者AGGATGGTGATCTCTGCAGA和GCTCATCATACAGTCGACC(SEQ ID NO:179和180)。
6)环化
使用Taq DNA连接酶和Helper进行环化，50μl环化体系为：DNA 44.5μl，10×TaqDNA连接酶buffer 2.5μl，环化连接辅助序列Helper(10μM)1μl，Taq DNA连接酶2μl；于PCR仪中进行连接环化，程序如下：94℃，2min；45℃，60min；94℃，10s；45℃，5min，4℃，∝。反应结束后，加入Exonuclease I和Exonuclease III各1ul，震荡混匀，稍加离心于管底，于PCR仪中37℃孵育45min，设置热盖为50℃。分离环化产物，溶于40μl水中。Helper的序列为GCTCTCATACAGTTCGTCTGCTGATTCGATGCT或GATCGACATGTACGAGTGCAGCATCGAATTCAGCAGA(SEQ IDNO:181和182)
7)特异性PCR扩增
使用多重引物(SEQ ID NO:1-172，表1)进行扩增，50μl扩增体系为：DNA 38μl，10×Pfx buffer 5μl，硫酸镁1μl，dNTP(25mM)1μl，Pfx DNA聚合酶1μl，正向多重引物混合物(10μM)和反向多重引物混合物(10μM)各2μl。于PCR仪中进行扩增，程序如下：94℃，2min；15cycs(94℃，10s；60℃，30s；72℃，30s)；72℃，5min，4℃，∝。分离扩增产物，溶于40μl水中。
表1用于特性PCR扩增的多重引物
8)Barcode PCR扩增
使用第二通用引物P1和index引物(表2)进行Barcode PCR扩增，50μl扩增体系为：DNA 38μl，10×Pfx buffer 5μl，硫酸镁1μl，dNTP(25mM)1μl，Pfx DNA聚合酶1μl，第二通用引物P1(10μM)和index(10μM)各2μl。于PCR仪中进行扩增，程序如下：94℃，2min；25cycs(94℃，10s；60℃，30s；72℃，30s)；72℃，5min，4℃，∝。分离扩增产物，溶于40μl水中。至此，完成文库构建，文库质检合格后进行上机测序。
表2第二通用引物P1和index引物的序列
9)文库质检
提前将
dsDNA HS Standard#1，
dsDNA HS Standard#2于室温平衡，配制Qubit浓度测量试剂按如下配制：
dsDNA HS Buffer，199*(N+2.5)μl，
dsDNA HS Reagent N+2.5μl，N为需要测量的样本数，文库浓度参考范围约10-100ng/μl。
Caliper检测的目的条带，在384孔板中加入2μl文库，补水至20μl，按caliper操作流程进行检测，血浆游离DNA文库片段有两个主峰，分别为390bp和620bp左右，gDNA样本为smear条带，如图1和2。
2.高通量测序与分析
使用illumina测序仪及测序试剂，用PE250进行测序，测序数据下机后，使用Illumina bcl2fastq软件生成常见测序数据FASTQ文件，并根据标签序列(index)拆分出不同样本的数据。根据双端测序结果(PE)进行序列拼接，得到同一分子完整序列，统计测序数据数量、质量。使用Blat软件根据接头序列提取出特异性引物序列，获取不同标记分子，使用BWA软件把特异性序列比对到基因组上，统计不同分子标记的分子数量。根据不同分子标记数量和质量判断各位点基因型，即血浆样本和父本基因型。
根据血浆样本基因型以及基因型频率，在杂合基因型次要等位基因频率(MAF)不超过5％时，推断母本基因型为纯合子。根据母本、血浆样本基因型计算游离DNA(cffDNA)中胎儿DNA含量。选取母本、父本基因型均为纯合的位点，统计每个有效位点血浆样本中支持不同等位基因的有效序列数量，假设观测到的不同序列数量符合四项式分布，结合全概率公式和孟德尔遗传定律，计算出综合父权指数(CPI)。当父权指数小于0.0001时认为排除亲子关系，当父权指数大于10000时支持亲子关系。下图中显示lg(CPI)>4(即CPI>10000)(图3)，表明支持亲子关系判定。同时使用大量无关作为假设父，使用设计位点的基因型计算CPI。通过比较大量无关个体的CPI与待检男子的CPI，进一步确认或者否定亲子关系。
发明人在实践中验证了五个家系，结果如表3所示，准确率超过99.99％，亲缘关系非常近的家系中也能很好的区分。
表3验证的五个家系的概况
| 生物父亲权概率 | 近亲亲权概率 | 其他 | |
| 家系1 | 99.9996115 | <1e-07 | <1e-07 |
| 家系2 | 99.9998513 | <1e-07 | <1e-07 |
| 家系3 | 99.9994969 | 0.0000063 | <1e-07 |
| 家系4 | 99.9992842 | 0.0000024 | <1e-07 |
| 家系5 | 99.9994712 | <1e-07 | <1e-07 |
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南优品司生物科技有限公司
<120> 一种用于产前无创亲子鉴定的试剂盒及方法
<160> 195
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ccctccacct ccaaatatgt ttac 24
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ggggttcatg ttttactacc gaatgt 26
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
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ctgttcaaca ccacaatacc acat 24
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gtacttgggt tgtaagctgg gattt 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
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attggtgagg taggaatatg gagg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
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ggcctcaatc agagatgtcc attc 24
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ggtcttcaag atgcagctgc tc 22
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ggtcttcaag atgcagctgc tc 22
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
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acataagagc tcttgaattg ctgac 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
gaagatagcc tagtggatgg ctgtg 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
gatgtatgag agacacattc agggt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
gagtcctagt gaatagaaag gagaaacc 28
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
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ggcagccagc aaaggcag 18
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gcccaaacta gtctggtcca gtgg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gtgagcaaca gctatgtgct gg 22
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gtgggaggtt ctggattgcc t 21
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tcagagccag atgtgatgaa tgg 23
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gaaggacaca gcactgtggg gt 22
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ctaaacatcc ctttgccaaa tttac 25
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
gacagcaaag gttatcaaca aaatgg 26
<210> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
aaacaggagg aaaatcttag ggtg 24
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
gtgtttcaca gcttaaacct tccca 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
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cgtctcacta agcacttatc ccagg 25
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
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gagagttaac acgactgctg gaggtt 26
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ggctcagggt ttcacaggct 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
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gggggaccca gctatgctgt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gggagaaaaa caaaggagga tca 23
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gcctatctgc tccttgatga catagag 27
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
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accaatcatg gaccaattac agg 23
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
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gataggcagt ttcaaggcca acc 23
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
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cacccactct catcccttga taga 24
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 32
ggagatcaca cggagagaaa atgct 25
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ggactgtggg gaagtttcag tagg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gccatggaat atgagtatag ctgagc 26
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tagccctgcc acttccttac tg 22
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ggtgttgcac tgagctgtgc cta 23
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actaatcttt ctccaaatgc aaggt 25
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tcagtccaac tccagctgca ga 22
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ggctggagac cagacacagg actt 24
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ggtggtcagt ctttgggaga act 23
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gggaaaacca tgctaaatta tgaagg 26
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gttttatgcc cagcttgtca ctag 24
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gaagtgattg aagatgatgc cca 23
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gctacatatt gagcggtttc agg 23
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gcacacctgc cataaatttt tttaac 26
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<213> 人工序列()
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tcacaaaatt ggtcaaattg gagac 25
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<213> 人工序列()
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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tggcacacca ctgatgatac tacg 24
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<213> 人工序列()
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ggaacagact ggtgaaaggt agacca 26
<210> 57
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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atctgttaca attgagggac ctcc 24
<210> 58
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gtgctccact ctggtgggtg ag 22
<210> 59
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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agcactaatc actcagacag tgagtg 26
<210> 60
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 60
ggtctctccc ctactcaaaa ccctt 25
<210> 61
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 61
cctttctgct acgaatttgt cca 23
<210> 62
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 62
gggactcaat gaaggaaaag aagctg 26
<210> 63
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gagaagctgc agcattccag ac 22
<210> 64
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gctggccaat accccttatc ctg 23
<210> 65
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ccagccagga ctcagaccaa c 21
<210> 66
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<212> DNA
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ggtaccctgg gtgacgcagg 20
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<212> DNA
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gcacaggagt gagagggtgc a 21
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<212> DNA
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ggctttcctg acttgatttt tgcat 25
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ctgaaaaggg ttggggaagg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gttctaatgg gactatcaag cactgt 26
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gcaaaggcca agaggtgtga 20
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gcactgtgtg ctctatctgg actcct 26
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 73
tcatccacag aacgctgttg aa 22
<210> 74
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gaggacaaaa ctgcaaggag aaatg 25
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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cagcagaaat cagggagcgg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ggctggtgtt aggctcctgg atat 24
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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acacttgggt atatgaaaga tattgc 26
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<213> 人工序列()
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gttgagttaa ctctttcttt cacca 25
<210> 79
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<213> 人工序列()
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cctttctaac tcctttttct agattcc 27
<210> 80
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<213> 人工序列()
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ggaccttgct gaaactgata cct 23
<210> 81
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 81
aagcttacag tcaggtggac gaga 24
<210> 82
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 82
gatgtgggca ggggctgtg 19
<210> 83
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 83
gatactgtag tcttgtcaaa gccca 25
<210> 84
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gtcacctaga gtccaaacag gaaac 25
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ctgcctgtac atgcctgatt tca 23
<210> 86
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gaggtctgtg ccaaccagct ga 22
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gcccaggtta ccactagtac taacat 26
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
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gggctccaca aatctttccc tttatc 26
<210> 89
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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actgctcctc tttgctctgc at 22
<210> 90
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 90
gcattctggg tggaaggtta aatg 24
<210> 91
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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cttcacctca gggagctcaa att 23
<210> 92
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gaaccattca agtccacaac ctgc 24
<210> 93
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 93
ttctgttatc acaaacctgc atttg 25
<210> 94
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 94
gaatgcacca gattcatgaa aagc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 95
ccaattacag ggatgtacat gtgct 25
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 96
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ggaccaatct taactttttc atatctc 27
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 98
ggtcctctat gttagaacaa ggggat 26
<210> 99
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
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ctggttttcc tgccaccaat ac 22
<210> 100
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 100
gagttatggc aaaggtctag gtgtga 26
<210> 101
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 101
gtgtgactgt agtgttgcag cttta 25
<210> 102
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 102
gcacacagtg aatgaagccc gtta 24
<210> 103
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 103
tcaaccactg ttcctgactc tcat 24
<210> 104
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
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ggagaaactg atggagcggt acca 24
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gcaaccttcc ctcctatgga ga 22
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gtgctttcta gagtcagtct gggac 25
<210> 107
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gaattatcta agcccaaaat ggga 24
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
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ccaattctag ccaatgaggt acaag 25
<210> 110
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
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gggttaacac gcccattcct aaac 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
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ctcagagccc tagctcacca at 22
<210> 112
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ggagacagaa ccaaggacca tatcc 25
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
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gcagaacctc ccatgctttc t 21
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
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gcagagtaca cacatggggc tcag 24
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 115
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ttggcctagg tgaggggagc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gaagtcttgc tttccttcta ggagac 26
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ttgttagggt tactgagtcc aatca 25
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gaatgaacat ctgaattgtc ctcatc 26
<210> 121
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<213> 人工序列()
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ctccaaaatt ctgatggagt agctt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ggggtggatt tcaggactct gc 22
<210> 123
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 123
tgtaaagtca aaacactttg tgcat 25
<210> 124
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 124
gagttaaaag aaaatcccaa gggtaa 26
<210> 125
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 125
ctgagctgtg ttttcagctg gat 23
<210> 126
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 126
gagctgacac cttgattgca gc 22
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 127
aggtgcttaa gtaatgagga tgctg 25
<210> 128
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
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gttacatcta gttgggtact gcaaag 26
<210> 129
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
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ttcacaacac agatttgact tccac 25
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gcgcactgtc acaggtgatc aac 23
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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cctggtgtca gttttgacaa attg 24
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 132
gggggaaaca cctttaccat tct 23
<210> 133
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
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gagacctgca aataccaaag attca 25
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
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gcattttaga atccatgttt ccaact 26
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<211> 20
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<213> 人工序列()
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gtccacagcc caggatcaca 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
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gtttcacaga gggagggtga gg 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
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gcgctttttc atgtagatgg ttg 23
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
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ggactaaaaa ccaagaatac ttccg 25
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gaacagtctc ttctccacca agc 23
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
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gccaggtccc agaagccaca t 21
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
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atacatgttg cagtgatgtt ttgg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gcaacataat gcaatgatta atgacg 26
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<212> DNA
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cacacagcaa gtgagtgaat gagt 24
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
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ggaggttcca ggccagatag c 21
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<211> 23
<212> DNA
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tttccctggt tcacttcaat cag 23
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<212> DNA
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gagaagagaa tggggaagtt gagac 25
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gggggttggt aaagaaaata atcta 25
<210> 148
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
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gcccactttc tgttatgctt ttttat 26
<210> 149
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
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aacctgcaga tccattcctt atct 24
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<212> DNA
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gtttgccact tctggattcc ctt 23
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gaataactat tcaatccaaa ggcac 25
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gttctaatct tctttgtctg gcttgt 26
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<211> 23
<212> DNA
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tctaatggac ttgtttctgg gga 23
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<212> DNA
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gagaaatagg actgtctagg ctggc 25
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<212> DNA
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cccagcacga ggtgcagtg 19
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gtgggggtgc agggcaag 18
<210> 157
<211> 25
<212> DNA
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ttctgataag tatcctgccg tattc 25
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ggaacatgtt acctcagagg ggtg 24
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<212> DNA
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cctggaataa aatctcctaa ggact 25
<210> 160
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gggaaaagca gcttttcaaa taggat 26
<210> 161
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ctagaagggg gtcagatggc 20
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<212> DNA
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gagcctcttc atgagcaccc ac 22
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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taacttgaaa tcagggattt tttatt 26
<210> 164
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gttagccatt atgagcattt gaagta 26
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<213> 人工序列()
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caaccctgcc ctctggga 18
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gggcactaaa attataggca agagga 26
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<213> 人工序列()
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cccaaaatgt ttacttaact gtttgt 26
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 168
gggggtagac taaatggaga ttctgc 26
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ccagtctatt ctgttaactc ctgcc 25
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gtggagaaaa ggtgaggtta attaag 26
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 171
gggagtgcta ttgatagatg ctgg 24
<210> 172
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 172
gttggatctg ggtatgacag ctct 24
<210> 173
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 173
gatgtgaccg attggcnnnn nntctgcaga gaccatggt 39
<210> 174
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列()
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gcactcgtac agtcgatcgt ccatcgttca cagct 35
<210> 175
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
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gctgtgaacg atggacnnnn nntctgctga ttcgatgct 39
<210> 176
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 176
gctctcatac agtcgaccgt caatcgctca gagtt 35
<210> 177
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 177
agcatcgaat cagcaga 17
<210> 178
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 178
gcactcgtac agtcgatc 18
<210> 179
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 179
aggatggtgt ctctgcaga 19
<210> 180
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 180
gctctcatac agtcgacc 18
<210> 181
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 181
gctctcatac agtcgtctgc tgattcgatg ct 32
<210> 182
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 182
gatcgactgt acgagtgcag catcgaatca gcaga 35
<210> 183
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 183
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac 60
ag 62
<210> 184
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 184
caagcagaag acggcatacg agattgtgtc actagtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 185
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 185
caagcagaag acggcatacg agattatcga tgctgtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 186
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 186
caagcagaag acggcatacg agattagagt ctgtgtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 187
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 187
caagcagaag acggcatacg agatcatgca tcatgtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 188
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 188
caagcagaag acggcatacg agattgatca gtcagtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 189
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 189
caagcagaag acggcatacg agatcgtcta tgatgtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 190
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 190
caagcagaag acggcatacg agatgtgata ctgagtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 191
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 191
caagcagaag acggcatacg agatctagat ctgagtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 192
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 192
caagcagaag acggcatacg agattatcag tctggtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 193
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 193
caagcagaag acggcatacg agattcagat gctagtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 194
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 194
caagcagaag acggcatacg agattatgta cgtggtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
<210> 195
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 195
caagcagaag acggcatacg agatctatac agtggtctcg tgggctcgga gatgtgtata 60
agagacag 68
Claims (10)
1.一种用于产前无创亲子鉴定的试剂盒，其特征在于，由检测86个SNP位点的引物组组成，所述86个SNP位点为：rs1005323、rs12467794、rs2726588、rs10078204、rs12471813、rs27419、rs10133452、rs12895416、rs2774504、rs1015665、rs1292067、rs2917539、rs1018078、rs12959775、rs3018843、rs1036963、rs13026592、rs347001、rs10438055、rs13437093、rs4131354、rs10745266、rs1360864、rs4383040、rs10756626、rs1531500、rs4681878、rs10807347、rs1559497、rs4740053、rs10823547、rs1565691、rs4798343、rs10863776、rs1608962、rs4915564、rs11139320、rs1652603、rs6054870、rs11151684、rs17131659、rs631948、rs11224705、rs1824965、rs6446700、rs11238130、rs1996872、rs6472054、rs11973256、rs2000546、rs6554565、rs12319069、rs2026522、rs6800661、rs12440533、rs221899、rs6810046、rs12457304、rs224045、rs6901432、rs7208337、rs2324562、rs7046039、rs7212373、rs264949、rs7169403、rs7237823、rs2666504、rs9289628、rs744536、rs8079416、rs9310661、rs7448547、rs8086877、rs9469597、rs7593080、rs846212、rs947098、rs7624209、rs853805、rs984176、rs7968494、rs864674、rs7310727、rs6957316、rs4667590。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组的序列如SEQ ID NO:1-172所示，其中SEQ ID NO:2n-1与SEQ ID NO:2n构成一对引物。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于富集DNA的试剂组，所述用于富集DNA的试剂组包括接头和通用扩增引物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述接头的序列为SEQ ID NO:173和174，或者SEQ ID NO:175和176，或其组合。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述通用扩增引物的序列为SEQ ID NO:177和178，或者SEQ ID NO:179和180，或其组合。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括环化连接辅助序列Helper。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述接头的序列为SEQ ID NO:173和174，所述环化连接辅助序列Helper的序列如SEQ ID NO:181所示；或者所述接头的序列为SEQ ID NO:175和176，所述环化连接辅助序列Helper的序列如SEQ ID NO:182所示。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于BarcodePCR扩增的试剂组，所述用于BarcodePCR扩增的试剂组包括第二通用引物和index。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述第二通用引物的序列如SEQ ID NO:183所示，所述index的序列为SEQ ID NO:184-195。
10.一种用于产前无创亲子鉴定的方法，其特征在于，包括使用权利要求1-9中任一项所述的试剂盒进行检测，并将检测结果进行高通量分析的步骤。
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