CN102115788A

CN102115788A - 一种snp复合检测体系和检测方法

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Publication number: CN102115788A
Application number: CN2010105779080A
Authority: CN
Inventors: 李彩霞; 胡兰; 葛芸英
Original assignee: Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Current assignee: Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Priority date: 2010-12-02
Filing date: 2010-12-02
Publication date: 2011-07-06
Anticipated expiration: 2030-12-02
Also published as: CN102115788B

Abstract

本发明提供一种SNP复合检测体系和检测方法，该SNP复合检测体系包括一组适合法医学应用的48个SNP位点，扩增引物组、微测序引物组以及通用芯片，可用于进行个体识别、ABO基因分型和性别判定。本发明还提供了一种利用所述SNP复合检测体系进行个体识别、ABO基因分型和性别鉴定的SNP复合检测方法，通过对待检测样本的DNA进行包含48个SNP位点的核苷酸片段的扩增，通过微测序引物进行引物延伸反应，再使用通用芯片对扩增产物进行基于SNP位点的分型，提高了对于痕量、降解检材DNA的分析能力，扩大了犯罪现场的检材范围，为公安机关刑事执法和行政执法提供有力的技术支撑。

Description

一种SNP复合检测体系和检测方法

技术领域

本发明涉及一种基于基因分型的个体检测体系和方法，尤其涉及一种用于基于SNP位点分型的SNP复合检测体系和检测方法。

背景技术

随着各方面对司法诉讼活动的科学性、客观性以及准确性要求的不断提高，物证鉴定领域不断发展，要求更为精确的分析手段来对案件中检材的个体来源进行确定，DNA分析由于其检验结果精确，成为物证鉴定领域的重要技术手段。

目前法医DNA实验室常采用复合PCR-STR分型技术对未知个体来源的检材进行基于STR位点的分型以达到确定检材个体来源的目的，该复合PCR-STR分型技术可检测的DNA片段主要分布在300-400bp之间，但在实际案件中常会遇到因各种因素(包括高温、潮湿、暴晒、微生物等)发生降解的检材，主要表现为，检材中的DNA分子受损，片段断裂、丢失，分子变小等，使用复合PCR-STR分型技术对这些检材进行检测时，经常出现“优势扩增”或“无效扩增”，导致片段较大的STR基因座无法有效分型。虽然通过改进DNA提取方法，提高模板DNA的浓度和纯度，优化PCR扩增条件等在一定程度上提高降解检材的扩增效率，但仍不能获得良好的确定检材个体来源的分型结果，难以满足案件分析的需要。

SNP是目前为止人类基因组中分布最广泛、存在数量最多的DNA多态型，每300个碱基对出现一次，NCBI数据库中dbSNP Build 131版中人类SNP的数目为23,652,081，SNP广泛存在于非编码区和编码区，比STR要高出几个数量级，大约90％的人类遗传变异是单核苷酸多态性。SNP突变率低，相比STR更加稳定可靠，另外SNP片段短，更易进行PCR扩增，并且产物的长度不到100bp，这与300-400bp的STR相比能够更好的适用于降解的DNA样本，而且SNP引物结合位点间的距离较近，在法医鉴定中有利于对高度降解的DNA进行分析。

如何从上述众多SNP位点中选择出一组SNP位点构建一种检测体系可对痕量、降解检材的DNA同时进行个体识别、ABO基因分型以及性别鉴定，以达到确定检材个体来源的目的，扩大犯罪现场的检材范围，为公安机关刑事执法和行政执法、保障社会公共安全提供有力的技术支撑，成为有待解决的问题。

发明内容

本发明提供一种SNP复合检测体系，通过确定48个SNP位点，扩增引物组以及微测序引物组，可对未知个体来源的，痕量、降解检材的DNA同时进行个体识别、ABO基因分型以及性别鉴定，以确定所述痕量、降解检材的个体来源。

本发明还提供了一种利用所述SNP复合检测体系进行个体识别、ABO基因分型和性别鉴定的SNP复合检测的方法，通过该方法可对痕量、降解检材DNA进行准确的个体识别、ABO基因分型和性别鉴定。

本发明提供SNP复合检测体系，包括48个SNP位点，扩增引物组、微测序引物组以及通用芯片；

所述扩增引物组中包括与所述48个SNP位点一一对应的48对扩增引物，每对扩增引物能扩增待检测DNA上包括其相应的SNP位点的突变型或野生型碱基在内的核苷酸序列；

所述微测序引物组中包括与所述48个SNP位点一一对应的48条微测序引物，每条微测序引物的5’端连有标签序列能与通用芯片上的标签序列互补，3’端包括与待检测DNA上其相应的SNP位点之前的核苷酸序列互补的序列；

所述48个SNP位点为：rs8176747、rs10488710、rs2272998、rs689512、rs445251、rs5746846、rs9606186、rs3744163、rs722290、rs521861、rs1821380、rs2269355、rs7520386、rs10773760、rs13218440、rs560681、rs221956、rs4530059、rs338882、rs430046、rs13182883、rs9951171、rs1109037、rs1736442、rs159606、rs321198、rs4606077、rs1336071、rs1294331、rs3780962、rs9905977、rs1058083、rs740598、rs8176720、rs8176719、amelogenin、rs8078417、rs2342747、rs10092491、rs6444724、rs1498553、rs12997453、rs7041158、rs214955、rs6955448、rs993934、rs1523537、rs1053878。

在本发明的一个实施例中，在所述SNP复合检测体系中，所述扩增引物组优选为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.96的核苷酸序列；所述微测序引物组优选为序列表中SEQ ID No.97至SEQ ID No.144的核苷酸序列；所述微测序引物5’端连有的标签序列分别为序列表中SEQ ID No.97至SEQ IDNo.144的各条核苷酸序列的自5’末端的第1至20位的脱氧核苷酸；所述通用芯片为：微测序反应通用芯片、固相微测序反应芯片或连接酶反应通用芯片。

本发明所选择的48个SNP位点，在不同人群间等位基因频率差别小(Fst平均值＜0.06)；位点杂合度高(≥0.4)；且遗传标记处于连锁平衡状态。HapMap数据库中，详细描述了这些包括突变形式、在DNA上存在的位置，以及在同一群体内部和不同群体间的分布状况。

试验证明，利用所筛选的48个SNP位点，可以实现同时进行个体识别、ABO基因分型以及性别鉴定，具体地，针对ABO基因分型，其中的rs8176719(261delG)、rs8176720(297A＞G)、rs1053878(467C＞T)、rs8176747(803G＞C)4个SNP位点，可以对A1、A2、B、O1和O2等位基因进行分型检测，进而完成A1A1、A1A2、A1O1、A1O2、A2A2、A2O1、A2O2、A1B、A2B、BB、BO1、BO2、O1O1、O1O2和O2O2等15种ABO基因型组合的分型工作，性别鉴定位点选自amelogenin基因；利用本发明提出的48个SNP位点实施对未知来源检材的检测，可一次完成对未知来源检材的个体识别、ABO基因分型以及性别鉴定，提高了检测的效率。

本发明提供的48个SNP位点信息如表1所示：

表1

本发明提供的优选的扩增引物组序列和延伸引物组序列，通过Autoprimer在线软件进行设计。所述48对扩增引物及其相对应的SNP位点如表2所示，PCRU代表上游引物，PCRL代表下游引物；

表2

用于引物延伸反应的微测序引物序列如表3所示，SNPU代表微测序引物序列，所述下划线部分的序列为微测序引物5’端连有的标签序列。

表3

本发明不限定具体使用的通用芯片类型，可以是制造的，也可以购买的，只要其上固定有和微测序引物的标签序列连续匹配的互补标签序列即可，可以根据所要检测的样本的个数选择合适通量的芯片进行检测，例如：微测序反应通用芯片、固相微测序反应芯片、连接酶反应通用芯片等。

本发明进一步提供了一种利用本发明所述的SNP复合检测体系进行个体识别、ABO基因分型和性别鉴定的SNP复合检测方法，包括：

1)提取待检测样本的DNA作为模板；

2)使用所述扩增引物组对步骤1提取的DNA模板进行多重PCR扩增反应；

3)然后将步骤2得到的产物使用所述微测序引物组进行引物延伸反应，所述引物延伸反应中ddNTP为荧光标记的ddNTP；

4)将步骤3的产物和通用芯片进行杂交，根据芯片杂交结果进行个体识别、ABO基因分型和性别鉴定。

所述多重PCR扩增反应在一管中进行或分多管进行；所述多重PCR扩增反应的模板可以为提取自全血、组织等检材的DNA；

所述多重PCR扩增反应的循环参数为：95℃，15min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，1min sec；40个循环；4℃保存。

所述引物延伸反应的循环参数为：96℃，3min；94℃，20sec；40℃，11sec；46个循环；4℃保存。

所述杂交的条件为：在密封的盒子中，温箱内42℃杂交，时间为2～2.5小时。

为验证本发明的SNP复合检测体系的可实施性和应用效果，本案发明人用上述SNP复合体系按照本发明提供的SNP复合检测方法的步骤对200份汉族无关个体DNA检材、不同种属动物检材以及案件检材进行了检测，证明本发明的SNP复合检测体系具有较高的准确性、组织同一性和种属特异性，并且，该SNP复合检测体系的最小DNA检出量为1.25ng，尤其对于常规STR检测不理想的降解检材DNA，该SNP复合检测体系仍可以获得较好的检测效果。

另外，利用该体系对200份汉族无关个体进行检测，所有位点都通过了Hardy-Weinberg平衡检验，累积偶合率为6.24×10^-20，累积非父排除率为0.99982，累积识别率大于0.9999999999。实际案例检材检验结果表明，该体系可以成功用于亲权鉴定案例。

综上，本发明提供的SNP复合检测体系和方法的优点是：(1)高通量，可以同时进行多个样本和多个SNP位点的检测；(2)通过微测序反应进行SNP分型，结果准确；(3)数据分析自动化、简便，杂交芯片扫描之后，可直接以excel表的形式给出最终的SNP分型结果；(4)可以实现同时进行个体识别、ABO基因分型和性别鉴定；尤其对于痕量、降解检材仍能获得良好的分型结果。

附图说明

图1A是200份汉族无关个体DNA样本中随机挑选出的10个样本杂交芯片的双色荧光CCD扫描图像，其中，从上往下第一排是C/G组，后三排是G/A组；从左往右依次为样本1～样本10；

图1B是图1A中单个杂交孔在SNPware杂交板上的排布方式示意图，4个顶角为质控点，左上为杂合子，右上、左下分别为2个等位基因的纯合子，这3个点为阳性对照(POS)，右下角为阴性对照(NEG)；

图1C为图1A经SNPadmin和Get Genos软件分析扫描图像后，位点rs689512(C/G组)的QCreview结果，其中，横坐标代表蓝荧光信号强度(B)与蓝、绿荧光信号强度之和(B+G)的比值，纵坐标代表蓝、绿荧光信号强度之和(B+G)的Log值，所检测的样本可分为3个群，左侧的群为基因型CC纯合子，中间的群为CG杂合子，右侧的群为GG纯合子。

图2为DNA样本使用DNase I来处理，处理时间分别为0分钟、2分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟后DNA样本的电泳图谱。

具体实施方式

下述实施例中200份汉族无关个体检材由北京市公安局法医中心提供；组织同一性样本：一具尸体的心、肝、脾、肺、肾组织样本，由北京市公安局法医中心提供；种属特异性样本：猴、猪、鸡、牛、山羊、兔、鼠、狗、猫的肌肉组织，由中科院动物研究所提供；

确定亲权关系的20例三联体家系静脉血DNA，分别由北京市公安局法医中心和中国政法大学司法鉴定中心提供；

案例检材：公安部物证鉴定中心日常检案中收集的19份检材DNA，其中包括10份正常检材和9份特殊检材。

所用方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂耗材和仪器如下表所示：

(1)DNA提取试剂

磁珠DNA提取试剂公安部物证鉴定中心

DNA Mini M48DNA提取试剂盒 QIAGEN公司

(2)SNP复合检测体系相关试剂

HotStarTaq DNA Polymerase QIAGEN公司

dNTP混合物 Takara公司

Exonuclease I USB公司

Shrimp Alkaline Phosphatase USB公司

SNPware extension dilution buffer 贝克曼公司

20×延伸Mix(荧光ddNTP) 贝克曼公司

DNA polymerase 贝克曼公司

SNPware杂交板贝克曼公司

20×SNPware Wash Buffer 1 贝克曼公司

无尘纸金佰利公司

杂交缓冲液贝克曼公司

64×SNPware Wash Buffer 2 贝克曼公司

(3)仪器

AB 9700型DNA扩增仪 AB公司

涡漩震荡器 Scientific Industries公司

Biofuge台式离心机 Heraeus公司

超纯水器 Millpore公司

电热恒温培养箱山东潍坊医疗器械厂

SNPstream图像分析系统贝克曼公司

实施例1、对本发明的SNP复合检测体系的验证

一、本发明的SNP复合检测体系准确性验证

利用本发明的SNP复合检测体系，根据本发明提供的用于个体识别、ABO基因分型和性别鉴定的SNP复合检测的方法对200份汉族无关个体检材进行检测来验证本发明的SNP复合检测体系的准确性。

所述SNP复合检测体系包括48个SNP位点，扩增引物组、微测序引物组以及通用芯片；

所述微测序引物组中包括与所述48个SNP位点一一对应的48条微测序引物，每条微测序引物的5’端连有标签序列能与所述通用芯片的标签序列互补，3’端包括与待检测DNA上其相应的SNP位点之前的核苷酸序列互补的序列；

利用所述SNP复合检测体系进行个体识别、ABO基因分型和性别鉴定的SNP复合检测的方法，包括：1)提取待检测样本的DNA作为模板；2)使用所述扩增引物组对提取的DNA模板进行多重PCR扩增反应；3)将上述扩增得到的产物使用所述微测序引物组进行引物延伸反应，所述引物延伸反应中ddNTP为荧光标记的ddNTP；4)将引物延伸反应的产物和通用芯片进行杂交，根据芯片杂交结果进行个体识别、ABO基因分型和性别鉴定。

1、提取待检测样本的DNA作为模板

使用DNA Mini M48磁珠DNA提取试剂盒提取200份汉族无关个体样本的静脉血DNA。提取步骤按照试剂盒说明书进行。

2、对提取的DNA模板进行多重PCR扩增反应

2.1、引物池配置

扩增引物池的配置，其中所述扩增引物组中包括与所述48个SNP位点一一对应的48对扩增引物，每对扩增引物能扩增待检测DNA上包括其相应的SNP位点的突变型或野生型碱基在内的核苷酸序列；

本实施例中，优选的，所述48个SNP位点的扩增引物组为序列表中SEQID No.1至SEQ ID No.96的核苷酸序列；本发明提供的各种引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；将待检测DNA按各SNP位点的突变类型不同分为A、B、C、D四组扩增体系进行扩增，A组为C/G型，B、C、D三组为G/A型，每组扩增体系包括待检测检材的DNA和PCR mix，其中PCR mix包括：针对12个SNP位点的12对扩增引物组成的扩增引物池，dNTP，PCR Buffer(缓冲液)，MgCl₂，HotStar Taq，以及ddH₂O(去离子水)。

具体的，A组针对rs8176747、rs10488710、rs2272998、rs689512、rs445251、rs5746846、rs9606186、rs3744163、rs722290、rs521861、rs1821380、rs2269355，12个SNP位点，使用的扩增引物为SEQ ID No.1至SEQ ID No.24的核苷酸序列，其扩增时的对应关系如表2中所示；B组针对rs7520386、rs10773760、rs13218440、rs560681、rs221956、rs4530059、rs338882、rs430046、rs13182883、rs9951171、rs1109037、rs1736442，12个SNP位点，使用的扩增引物为SEQ ID No.25至SEQ ID No.48的核苷酸序列，其扩增时的对应关系如表2中所示；C组针对rs159606、rs321198、rs4606077、rs1336071、rs1294331、rs3780962、rs9905977、rs1058083、rs740598、rs8176720、rs8176719、amelogenin，12个SNP位点，使用的扩增引物为SEQ ID No.49至SEQ ID No.72的核苷酸序列，其扩增时的对应关系如表2中所示；D组针对rs8078417、rs2342747、rs10092491、rs6444724、rs1498553、rs 12997453、rs7041158、rs214955、rs6955448、rs993934、rs1523537、rs 1053878，12个SNP位点，使用的扩增引物为SEQ ID No.73至SEQ IDNo.96的核苷酸序列，其扩增时的对应关系如表2中所示；

分别配置每组扩增体系中使用的扩增引物池：将每组扩增体系中使用的12对引物分别用去离子水稀释到240μM，各取5μL加入到一个新的离心管中，作为12重的扩增引物池，其中每条引物的终浓度为10μM。

2.2、多重PCR反应

本实施例使用具有96孔PCR板的AB 9700型DNA扩增仪进行多重PCR反应。

(1)配置PCR mix

试剂名称	配置量(μL)
		PCR扩增引物池(10μM)	0.75
dNTP(2.5mM)	4.5
		10×PCR Bufferr(含15mM的Mg²⁺)	15
MgCl₂(25mM)	12
		HotStar Taq(5U/μL)	3
ddH₂O	54.75
		总计	90

按上表中的比例分别配置四组扩增体系各自的PCR mix，每组扩增体系的PCR mix混匀后，取3μL加入到96孔PCR板的4个反应孔中，再分别在上述4个反应孔的3μL的PCR mix中加入2μL待检测的DNA模板(5μL反应体系)。封膜后，3000rcf离心1分钟。每个96孔PCR板可同时进行24个个体的DNA扩增。

(2)扩增程序

2.3、PCR产物纯化

(1)按照下表的体系，配制Clean-up试剂

试剂名称	24份样本配置量(μL)
		Exo I(10unit/μL)	6
SAP(1unit/μL)	30
		10×SAP Buffer	9
ddH2O	45

总计

90

(2)将PCR反应后的96孔PCR板3000rcf离心1分钟，再加入配好的Clean-up试剂，每孔3μL(每孔终体系为8μL)。封膜后，3000rcf离心1分钟，运行下表所示的程序。

步骤	温度	时间
			1	37℃	30min
2	96℃	10min
			3	4℃	∞

注：纯化好的96孔PCR板可以在-20℃条件下存放。

3、对DNA扩增产物进行引物延伸反应

3.1微测序引物池的配置

本实施例中所述微测序引物组中包括与所述48个SNP位点一一对应的48条微测序引物，每条微测序引物的5’端连有标签序列能与所述通用芯片的标签序列互补，3’端包括与待检测DNA上其相应的SNP位点之前的核苷酸序列互补的序列；

对应上述A、B、C、D四组扩增体系，四组扩增体系的产物分别用4组微测序引物池进行引物延伸反应，其中A组扩增体系的产物对应的微测序引物优选为SEQ ID No.97至SEQ ID No.108的核苷酸序列；B组扩增体系的产物对应的微测序引物为SEQ ID No.109至SEQ ID No.120的核苷酸序列；C组扩增体系的产物对应的微测序引物为SEQ ID No.121至SEQ ID No.132的核苷酸序列；D组扩增体系的产物对应的微测序引物为SEQ ID No.133至SEQ ID No.144的核苷酸序列；

分别配置各组微测序引物池：将各组扩增体系对应的12条微测序引物分别用去离子水稀释到120μM，各取10μL加入到一个新的离心管中，作为微测序引物池，每条微测序引物终浓度为10μM

3.2引物延伸反应

(1)解冻纯化好的96孔PCR板(含有步骤2扩增好的DNA)和Extension Dilution Buffer(延伸buffer)按照下表所示体系配制引物延伸反应混合物。

试剂名称	配置量(μL)
		Extension Dilution Buffer	112.5
Extension Primer Mix	0.9
		20×Extension Mix	6
ddH₂O	90
		DNA polymerase	0.6
总计	210

注：20×Extension Mix为带荧光ddNTP，分别为：A/G、C/G、A/T、A/C、C/T和G/T，按实验需求配置不同组合。Extension Primer Mix为微测序引物池。本发明共四组位点，一组C/G型，三组G/A型，蓝绿双色荧光标记。

按上表中的比例分别配置含有不同微测序引物的4组引物延伸反应混合物，其中分别为各组对应的12条微测序引物。将上述4管引物延伸反应混合物分别加入96孔PCR板的4个反应孔中，具体为：

将解冻后的96孔PCR板3000rcf离心1分钟，向每个孔中加入7μL配制好的引物延伸反应混合物(每孔终体系为15μL)，封膜，3000rcf离心1分钟，运行下表所示的程序。

注：引物延伸反应结束后的DNA产物可以在-20℃条件下存放。

4、将引物延伸反应产物与微测序反应通用芯片进行杂交，根据芯片杂交结果进行个体识别、ABO基因分型和性别鉴定。

本实施例使用的通用芯片为固定有能与序列表中SEQ ID No.97至SEQID No.144的各条核苷酸序列的自5’末端的第1至20位的脱氧核苷酸互补的标签序列的微测序反应通用芯片；所述微测序反应通用芯片购自美国贝克曼公司，为具有384孔的SNPware杂交板，每个孔中固定12条标签序列和4个质控探针，每个孔可以检测一份样本中的12个SNP位点，故一份样本检测48个位点需要4个孔。

4.1清洗杂交板

(1)按照下表配置1×SNPware Wash Buffer 1(SNP-板清洗缓冲液1)

试剂名称	用量(μL)
		20×SNPware Wash Buffer 1	105
ddH₂O	1995
		总计	2100

注：384孔SNPware杂交板每孔加25μL的1×SNPware Wash Buffer 1，可一次吸取50μL的1×SNPware Wash Buffer1，加入到相邻2个杂交孔中。

(2)清洗384孔SNPware杂交板，吸取25μL的1×SNPware Wash Buffer1，加入到384孔SNPware杂交板上的对应孔中。

(3)将384孔SNPware杂交板翻过来放在无尘纸上，放入离心机的托盘内进行离心，300rcf离心1分钟，使384孔SNPware杂交板每个孔中的清洗液全部脱离。重复步骤2，一共清洗3次。

4.2、将引物延伸反应的产物与微测序反应通用芯片进行杂交

(1)按照下表配置杂交液

试剂名称	配置量(μL)
		Hybridization solution(杂交溶液)	226.8
Hybridization additive(杂交添加物)	13.2
		总计	240

(2)向96孔PCR板每孔加入8μL按上表中比例配好的杂交液，3000rcf离心1分钟，使其混合均匀(每孔终体系为23μL)。吸取10ul加入到384孔SNPware杂交板上对应的孔内，每个SNPware 384孔杂交板可加入4个96孔板的DNA产物。

注：加杂交液的时候，用枪头反复吹打使之混匀。

(3)将加入混合液的384孔SNPware杂交板放入一个密封的盒子中，放在温箱内42℃杂交，时间为2小时±15分钟(注：盒内预先放几张湿润的无尘纸巾(用双蒸水湿润)，保证孵育过程中盒内湿度，防止杂交板内试剂被蒸干)。

4.3、杂交后清洗及扫描

(1)按照下表配置杂交后洗液1×SNPware Wash Buffer 2

	用量(μL)24孔×25μL×3次
		64×SNPware Wash Buffer 2	32.9
ddH₂O	2067.1
		总计	2100

(2)杂交完成以后，再次清洗384孔SNPware杂交板，每次吸取25μL1×SNPware Wash Buffer 2，加入到384孔SNPware杂交板上的每个孔中。

(3)将384孔SNPware杂交板翻过来放在无尘纸上，一起放在离心机的托盘内进行离心，300rcf离心1分钟，使384孔SNPware杂交板上每个孔中的清洗液全部脱离。重复步骤2，一共清洗3次。

(4)清洗完毕后，用无尘纸蘸取少量无水甲醇擦拭384孔SNPware杂交板背面玻片，使其清晰无痕迹。

(5)将384孔SNPware杂交板置入SNPstream图像分析系统，双色荧光CCD扫描获得图像，图像经SNPadmin和GetGenos软件分析获得数据。

5、杂交结果和测序结果分析

200份样本(DNA模板量2-5ng)理论上应该检出9600个基因型(48位点×200份样本)，通过本发明的SNP复合检测体系共检测出9600个基因型，检出率为100％。为了验证分型结果的准确性，从上述200份样本中随机挑选10份样本，对各样本的48个SNP位点，在PCR扩增产物电泳检测后，进行测序(由北京迈奥德恩生物科技有限公司完成)，并和本发明的SNP复合检测体系检测出的结果进行比较；以下对这10份样本使用本发明的SNP复合检测体系获得的分型数据，以及和测序结果的一致性进行说明。

使用本发明的SNP复合检测体系，获得的10份样本的杂交芯片扫描结果如图1A所示，10份样本的双色荧光CCD扫描图像；其余样本的扫描图像与这10个样本图像的显示形式类似。

图1B为图1A中单个杂交孔在SNPware杂交板上的排布方式示意图，4个顶角为质控点，左上为杂合子，右上、左下分别为2个等位基因的纯合子，这3个点为阳性对照(POS)，右下角为阴性对照(NEG)；

因为微测序延伸反应引物中止于待检测DNA上的SNP位点的前一个碱基，微测序延伸反应引物结合到模板上，与SNP位点匹配的ddNTP向前延伸一个碱基；延伸产物5′端连接的标签序列与微测序反应通用芯片上固定的标签序列互补杂交，通过标签序列的位置和荧光颜色进行SNP位点分型；杂交信号如果是蓝色或绿色则是纯合子，如果是黄色则是杂合子。

图1C为图1A经SNPadmin和GetGenos软件分析扫描图像后，位点rs689512(C/G组)的QCreview结果，所检测的样本可分为3个群(Cluster)，左侧的群为基因型CC纯合子，中间的群为GG纯合子，右侧的群为CG杂合子。表4为10个样本使用本发明的SNP复合检测体系对48个SNP位点的分型结果以及和测序结果进行的比较：

表4

由表4可见，共检测了480个基因型，所有的SNP复合检测体系分型结果与测序结果一致性达到100％，此结果证实本发明的SNP复合检测体系技术具有很高的特异性和准确度。

二、本发明的SNP复合检测体系的性别鉴定准确性验证

我们选择了人类amelogenin基因上的一个SNP位点进行性别鉴定，amelogenin-X在该位点的碱基是C，amelogenin-Y在该位点的碱基是T，所以女性样本该位点的分型是GG，男性样本该位点的分型是GA。本研究检测的200份汉族无关个体样本中，男性和女性样本各100份，通过本发明提供的所述SNP复合检测体系得到的分型结果与样本来源个体的性别完全一致。另外，为了进一步验证结果的准确性，我们从上述男性和女性样本中各随机抽取了12份样本，使用公安部物证鉴定中心日常检案的DNATyper 15STR复合扩增试剂盒进行检验，所有样本的性别与本发明提供的SNP复合检测体系的分型结果一致。如表5所示：

表5

三、本发明的SNP复合检测体系的ABO基因分型与血清型的一致性验证

针对ABO基因分型，我们选择了rs8176719(261delG)、rs8176720(297A＞G)、rs1053878(467C＞T)、rs8176747(803G＞C)四个SNP基因座，其中前两个SNP位于ABO基因的第6外显子上，后两个SNP位于ABO基因的第7外显子上。通过检测这四个SNP位点的检测可以实现对A1、A2、B、O1和O2等位基因的分型，进而完成A1A1、A1A2、A1O1、A1O2、A2A2、A2O1、A2O2、A1B、A2B、BB、BO1、BO2、O1O1、O1O2和O2O2等15种ABO基因型组合的分型检测，五种ABO等位基因的碱基变化情况和基因频率，如表6所示。

表6

前述检测的200份汉族无关个体的DNA样品均经过了ABO血清学分型，使用本发明的SNP复合检测体系所得的ABO基因型与血清学分型结果一致性，如表7所示。

表7

共检出5种等位基因：A1(A0101)、A2(A0102)、B、O1、O2(0303)，基因频率分别是2.65％、20.20％、24.50％、51.66％、0.99％。共发现10种基因型组合：A1A2(1.50％)、A2A2(4.50％)、A1O1(1.00％)、A2O1(19.50％)、BB(4.50％)、BO1(26.00％)、O1O1(27.00％)、O1O2(3.00％)、A1B(3.00％)、A2B(10.00％)，未检测到A1A1、A1O2、A2O2、BO2和O2O2等基因型组合。

经Hardy-Weinberg平衡吻合度检验，χ²＝9.3110，df＝7，p＞0.05，表明该人群是符合Hardy-Weinberg平衡的随机婚配群体，由此得到的基因频率是可靠的。

四、本发明的SNP复合检测体系的稳定性验证

从上述200份汉族无关个体样本中选取8份，使用本发明的SNP复合检测体系本实施例中第一部分所述方法和步骤对每份样本重复检测3次，表8是重复性测试统计结果，8份样本的所有48个SNP位点3次重复实验的分型结果均一致，说明本发明的SNP复合检测体系具有很好的稳定性。8份DNA样本3次重复检测结果，如表8所示：

表8

五、本发明的SNP复合检测体系的灵敏度验证

从上述200份汉族无关个体样本中选取5份，将原始浓度为5ng/μL的5份DNA模板按：5ng，2.5ng，1.25ng，0.625ng的梯度进行稀释，在相同的扩增体系、扩增参数条件、杂交参数条件下使用本发明的SNP复合检测体系进行检测。结果见表9，DNA的量为1.25ng或更高时本发明的SNP复合检测体系的检出率为100％，当模板量为0.625ng时，出现漏检的位点，5份样本的检出率为88.75％。该体系的最小DNA检出量为1.25ng。

表9

六、本发明的SNP复合检测体系的组织同一性验证

用本发明的SNP复合检测体系分别一具尸体的心、肝、脾、肺、肾组织样本进行检测，使用

DNA Mini M48DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书中的步骤从各组织中提取DNA，按照本实施例中第一部分所述的方法和步骤利用本发明的SNP复合检测体系进行检测，检测结果如表10所示。

表10

可以看出，同一个体的取自不同组织的所有样本DNA分型结果一致，证明本发明的SNP复合检测体系具有良好的组织同一性。

七、本发明的SNP复合检测体系的种属特异性验证

使用本发明的SNP复合检测体系复合检测体系检测猴、猪、鸡、牛、山羊、兔、鼠、狗、猫的DNA样本，其中使用DNA Mini M48DNA提取试剂盒从各动物肌肉组织中提取DNA，按照本实施例中第一部分所述的方法和步骤利用本发明的SNP复合检测体系进行检测，均未检测出任何位点，表明本发明的SNP复合检测体系具有良好的种属特异性。

八、本发明的SNP复合检测体系的对降解DNA检验的能力验证

将来自200个汉族无关个体中的1个个体的DNA样本用DNase I来处理，处理时间分别为0分钟、2分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟，处理后电泳图谱见图2，然后应用本发明的SNP复合检测体系和美国AB公司Identifiler试剂盒(PCR Amplification Kit)对已处理的样本分别进行检验。当实验样本经DNase I处理20分钟时，Identifiler试剂盒检验失败，本发明的SNP复合检测体系仍能成功检验出45个SNP基因座。结果如表11所示。

表11

九、本发明的SNP复合检测体系的群体遗传学数据

利用本发明的SNP复合检测体系共检测了200名汉族无关个体，对各位点的多态性及基因频率、基因型频率等进行统计分析，结果如表12所示，所有的48个SNP位点的基因型数据都通过了Hardy-Weinberg平衡检验，非连锁平衡的检测。整个体系的累积偶合率为6.24×10^-20，累积非父排除率为0.99982，累积个体识别率大于0.9999999999，可用于法医学个体识别和亲权鉴定。

表12

实施例2、使用本发明的SNP复合检测体系对亲权鉴定案件检材进行检测

通过对已确定亲缘关系的20例三联体家系(父-母-子)静脉血DNA使用本发明的SNP复合检测体系进行检测的方法和步骤与实施例1第一部分一致，亲子鉴定结果与常规使用Identifiler试剂盒(PCR AmplificationKit)进行STR分型检验所得结果一致，未发现背离孟德尔遗传规律的分型结果，所有位点均复合孟德尔遗传规律。

实施例3、使用本发明的SNP复合检测体系对个体识别案件正常检材进行检测

对公安部物证鉴定中心日常检案中收集的5例个体识别案件中的10份正常检材(现场血样5份、嫌疑人血样5份)使用本发明的SNP复合检测体系进行检验，检测的方法和步骤与实施例1第一部分一致，同时对现场血样和嫌疑人血样使用Identifiler试剂盒(

PCR Amplification Kit)进行STR分型检测。结果显示，现场检材与嫌疑人样本经STR分型检测获得同一认定或排除结果，对于正常检材使用本发明的SNP复合检测体系也可以获得相同的结果。

实施例4、使用本发明的SNP复合检测体系对个体识别案件中的特殊检材进行检测

本实施例共收集了9份特殊检材DNA(骨头、高度腐败的肌肉、脱落细胞等各3份)，使用本发明的SNP复合检测体系进行检测，检测的方法和步骤与实施例1第一部分一致，同时使用Identifiler试剂盒(

PCRAmplification Kit)进行STR分型检测，结果显示，基于STR分型检测的Identifiler试剂盒仅检出检材上1～6个基因座，用本发明的SNP复合检测体系，90％以上SNP位点均能明确分型，上述特殊检材使用本发明的SNP复合检测体系和Identifiler试剂盒检测的检测结果，如表13所示，表明本发明的SNP复合检测体系相比于现有的基于STR分型检测的Identifiler试剂盒对于降解检材的检验具有更好的效果。

表13