CN107012226A - 一种基于高通量测序的snp位点的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于高通量测序的SNP位点的检测试剂盒，其用于检测273个SNP位点(234个位于常染色体上、9个位于Y染色体上、30个位于X染色体上)，该检测试剂盒包含由273个SNP位点的引物对组成的引物组合物，该引物组合物的序列如SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：546所示；本发明还提供一种采用上述试剂盒的检测方法及上述试剂盒在三联体亲子鉴定、二联体亲子鉴定、祖孙鉴定、同胞鉴定以及个体识别司法鉴定领域中的应用。本发明利用了高通量测序技术对SNP位点进行并行测序，在读取位点信息的同时可以获取侧翼序列变异信息；单次测序可以获取多达384个样本在273个SNP位点的序列信息，节约DNA样本量及检测时间；片段文库集中于200bp以下，适用于法医学降解检材。
Description
技术领域
本发明属于法医遗传学领域，涉及检测人类基因组中具有良好法医学应用价值的SNP遗传标记，具体涉及一种基于高通量并行测序技术的273个SNP位点的检测试剂盒及其应用和检测方法。
背景技术
基于毛细管电泳技术(Capillary Electrophoresis,CE)的PCR-STR复合荧光扩增检测是目前采用的主要技术手段。其中，STR基因座由于多态性高、检测技术均一等优点被认为是法医DNA鉴定中通用性最高的遗传标记。目前，法医学DNA数据库大部分均围绕STR基因座展开。但是，随着STR基因座在法医DNA分析中的广泛应用，其缺陷也日益受到学界关注。如STR基因座的高突变率不利于亲权鉴定的结果解释；PCR扩增子较长不易实现对降解检材的DNA分型；STR基因座的数量有限不利于复杂亲缘关系的鉴定等；CE技术中目前可供选择的荧光素数量有限，无法实现大量STR基因座的并行检测。
SNP(Single Nucleotide Polymorphism,单核苷酸多态性)作为第三代遗传标记，应用于法医学实践的优越性已越发显著。与STR(自发突变率为10-3～10-5)相比，SNP具有相对较低的自发突变率(10-8)；而单个的SNP位点扩增产物可以控制在200bp以下，容易实现多个位点的复合扩增，并有利于降解检材的分型；二等位基因的特性也使其分型结果的分析简便易行，更加容易完成向自动化的转变。然而SNP分型采用的技术平台无论是Minisequencing(核心是单碱基延伸)、连接反应还是质谱分析，均最多只能完成几十个遗传标记的并行检测，获取有效信息的能力受限。
高通量并行测序技术(Massively Parallel Sequencing,MPS)，为解决这一科学问题提供了方法学上的前景：与传统的CE技术相比，MPS技术可以对多达几千个SNP进行并行检测，节约检测样本量及检测时间；与Barcode技术相结合，可以对多样本并行检测；文库构建时依赖PCR技术，但无需电泳及荧光标记，可将引物设计的尽可能短，进一步提高降解检材的分型成功率；对序列内部碱基的深度读取，可提高法医学混合样本的分析能力。美国Thermo Fisher Scientific公司在Ion Torrent PGMTM测序平台已推出两款商业化SNP检测试剂盒，一是用于个体识别的“Precision ID Identity Panel”，试剂盒中共含有124个SNP位点，主要针对欧洲人群，部分位点在中国人群中多态性差；另一个是用于族源信息推断的“Precision ID Ancestry Panel”，不适用于个体识别和亲缘鉴定。美国Illumina公司在Miseq平台上推出可同时检测STR和SNP遗传标记的检测试剂盒ForenSeq DNA Signature，其中含有95个用于个体识别的SNP位点，24个用于表型鉴定的位点，56个先祖SNP位点。上述SNP位点的筛选基于欧洲人群，在中国人群中检测效能受限，同样无法满足法医学个体识别和亲缘鉴定的需求。另外，以往针对法医学SNP位点的研究及相关专利申请，均集中于最多几十个SNP的检测体系构建，且集中针对一类染色体进行标记的检测(常染色体，X染色体或者Y染色体)。
因此，建立一套针对中国人群并覆盖人类全基因组的高多态性SNP检测体系，用于满足个体识别及亲权鉴定的需求，并为复杂疑难案件的解决提供更多的技术检测手段具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种基于高通量测序平台的可同时检测273个覆盖人类基因组SNP遗传标记的检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一方面，本发明提供一种基于高通量测序的SNP位点的检测试剂盒，该检测试剂盒用于检测273个SNP位点，其中所述273个SNP位点中的234个位于常染色体上、9个位于Y染色体上、30个位于X染色体上。
为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
优选地，所述273个SNP位点信息如表1所示。
优选地，该检测试剂盒包含由273个SNP位点的引物对的引物组合物，所述引物组合物的序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：546所示。该SNP位点的扩增引物序列如表2所示。
表1：本试剂盒中所包含的SNP位点信息
表2：本试剂盒中273个SNP位点的扩增引物序列
优选地，该检测试剂盒还包括自行编写的BED文件，所述BED文件用于SNP位点的结果分析；该BED文件可用于高通量测序仪测序软件(或插件)使用，或采用自行编写插件进行273个SNP位点的分型。该BED文件如下：
另一方面，本发明提供一种上述SNP位点的检测试剂盒在三联体亲子鉴定、二联体亲子鉴定、祖孙鉴定、同胞鉴定以及个体识别司法鉴定领域中的应用。
最后，本发明还提供一种上述SNP位点的检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
步骤1)取样本DNA于PCR扩增体系中，采用聚合酶链式反应进行文库的构建；
步骤2)对步骤1)中构建的文库进行纯化和定量；
步骤3)对步骤2)定量后的文库进行接头和测序引物的连接；
步骤4)对步骤3)制备的文库在高通量测序平台完成测序；
步骤5)采集测序信号，采用自行编写的BED文件对步骤4)获取的测序文件进行质控及结果分析。
为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
优选地，所述样本DNA采集于血液(斑)、唾液(斑)、精液(斑)、毛发、组织等人类生物检材；或者，可选的，所述样本DNA为标准品，如女性标准品DNA 9947A，男性标准品9948等。
优选地，所述步骤1)中PCR扩增体系包括PCR反应缓冲液、如SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：546所示序列的引物组合物、Taq聚合酶以及去离子水。
优选地，所述步骤1)中聚合酶链式反应的扩增程序为：95℃预变性11min；94℃30s，60℃60s，70℃60s，22个循环；60℃延伸30min。
优选地，所述步骤2)中的纯化采用Ampure磁珠完成，所述步骤2)中的定量可采用Qubit或qPCR方式。
优选地，所述步骤4)中的高通量测序平台包括Ion Torrent或者Miseq。
优选地，所述步骤5)中的结果分析为针对FASTA格式测序信息采用自行编写插件进行273个SNP位点的结果分型。
本发明所述试剂盒包含的273个SNP位点分别位于常染色体(234个)、Y染色体(9个)、X染色体(30个)，在中国主要人群中均具有良好的遗传多态性和个体识别能力，其中常染色体SNP位点在各染色体上平均分配，位点之间的平均物理距离约为10Mb。灵敏度检测显示，10-1ng DNA进行文库构建时，分型成功率为100％。试剂盒中含有的234个常染色体SNP位点组成的检测系统用于个体识别的累积个体识别率为1-1.49E-62，用于二联体亲权鉴定的累积非父排除率为1-2.98E-12，用于三联体亲权鉴定的累积非父排除率为1-3.51E-23，非常适合在法医学个体识别和亲缘鉴定中应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
(一)试剂盒中SNP位点的选择原则
(1)筛选SNP数据库：HapMap(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)、1000Genomes(http://www.1000genomes.org/home)、dbSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)、SNPforID 52-plex在线数据库(http://spsmart.cesga.es/snpforid.php)；司法鉴定技术规范《法医SNP分型与应用规范SF/Z JD0105003-2015》、已发表的关于亚洲或者中国汉族人群的SNP研究文献；
(2)根据HapMap数据库(#28，Phases 2&3)筛选在北京汉族人群(CHB)中MAF>0.3，位于内含子区域的常染色体SNP位点；要求SNP符合Hardy-Weinberg平衡定量；与数据库中其它10个人群(ASW、CEU、CHD、GIH、JPT、LWK、MEX、MKK、TSI和YRI)的遗传差异小(Fst<0.06)；
(3)候选SNP位点间物理距离>5Mb；与目前中国市场已有商业化试剂盒中包含的STR基因座之间物理距离>5Mb；位点不落在拷贝数变异区域(CopyNumber Variants,CNV)；位点侧翼序列(±120bp)的GC含量在30-60％之间；侧翼序列(±15bp)不含有多聚碱基及插入缺失遗传标记(Insertion/Deletion,Indel)。
(二)文库构建
各SNP位点的文库构建引物序列见表2。文库的构建采用聚合酶链式反应，反应体系为20μL。文库构建条件：95℃预变性11min；94℃30s，60℃60s，70℃60s，22个循环；60℃延伸30min。
(三)测序及数据分析
构建文库完成纯化和定量后，连接接头及测序引物，根据检测样本量选择在高通量测序平台(美国Thermo Fisher Scientific公司的Ion Torrent或者美国Illumina公司的Miseq)完成测序；
采用自行编写的BED文件进行质控及结果分析。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种基于高通量测序技术对人类基因组273个SNP位点进行并行检测的试剂盒，包括文库构建、测序质控及结果分析等。本发明利用了高通量测序技术对SNP位点进行并行测序，在读取位点信息的同时可以获取侧翼序列变异信息；单次测序可以获取多达384个样本在273个SNP位点的序列信息，节约DNA样本量及检测时间；片段文库集中于200bp以下，适用于法医学降解检材。
附图说明
图1为编写插件对高通量测序SNP位点的分析结果。
具体实施方式
本发明所述的SNP位点的检测试剂盒的主要成分包括：PCR扩增体系和样本DNA(可为标准品DNA 9947A、标准品DNA 9948)，PCR扩增体系具体包括2.5×PCR反应缓冲液Ⅱ(ris-HCL、KCL、MgCl2、dNTP)、5×引物组合物(273个SNP位点的文库构建引物对，序列为SEQID NO：1-SEQ ID NO：546所示)、Taq聚合酶(具有热稳定性的DNA聚合酶)以及去离子水。文库构建体系包含5μL 2.5×PCR反应缓冲液Ⅱ、2μL 5×引物组合物，2U Taq聚合酶，10ng-1ng的样本DNA(可为1μL标准品DNA 9947A(10ng/μL)或1μL标准品DNA 9948(10ng/μL))以及11μL去离子水。其中，273个SNP位点的位点信息如上述表1所示，273个SNP位点的扩增引物序列如上述表2所示。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例为标准品DNA9948的分型结果。
其检测方法如下：
步骤1)取1μL标准品DNA9948(10ng/μL)进行文库构建，PCR体系为20μL，其中含5μL2.5×PCR反应缓冲液Ⅱ，2μL 5×引物混合物，1μL Taq聚合酶(2U)，1μL标准品DNA 9948及11μL去离子水。文库构建PCR条件：95℃预变性11min；94℃30s，60℃60s，70℃60s，22个循环；60℃延伸30min。
步骤2)对步骤1)构建的文库进行纯化和定量。纯化采用Ampure磁珠完成，定量可采用Qubit或qPCR方式。本次采用qPCR完成文库定量。
步骤3)对步骤2)定量后文库进行接头和测序引物的连接。
步骤4)对步骤3)制备的文库在高通量测序平台(美国Thermo Fisher Scientific公司的Ion Torrent或美国Illumina公司的Miseq)完成测序。
步骤5)采集测序信号，采用自行编写的BED文件对步骤4)获取的测序文件进行质控及结果分析；其具体为针对FASTA格式测序信息采用自行编写插件进行273个SNP位点的结果分型。分析插件包含SNP测序质控，其结果如图1所示。标准品DNA 9948分型结果见下表，可用于其它实验室参考。
实施例2
本实施例为本发明所述的SNP位点的检测试剂盒在三联体亲缘鉴定疑似突变现象中的应用。
一例三联体亲缘检测案件，涉及生母-孩子(女)-可疑父。采用实施例1所述的检测方法操作。
基于CE技术的STR检测结果：采用常规PCR-CE检测试剂盒Goldeye 20A(北京基点认知生物有限公司)对19个常染色体STR基因座进行检测，发现生母与孩子在19个STR基因座上完全符合孟德尔遗传定律，可疑父与孩子在2个STR基因座(vWA和FGA)发生一步突变。通过计算，累积亲权指数CPI为378.361，根据三联体亲子鉴定标准，无法判断可疑父与孩子之间存在亲子关系。补充检测其他3个辅助STR检测商业化试剂盒(Goldeye 18NC检测试剂盒、AGCU 21+1检测试剂盒、Investigator HDplex检测试剂盒)对28个新增常染色体STR基因座进行分型检测，结果发现新增STR基因座D3S4529基因座发生一步突变。即共检测47个STR基因座中发现3个STR基因座(vWA、FGA、D3S4529)发生一步突变。
基于MPS技术的SNP检测结果：采用该试剂盒对上述涉案样本进行及高通量测序检测，结果表明，三个样本在234个常染色体SNP位点的分型结果均符合孟德尔遗传定律，孩子(女)与可疑父在30个X-SNP位点的结果符合X染色体遗传标记遗传定律，结果见下表。
实施例3
本实施例为本发明所述的SNP位点的检测试剂盒在50名无关个体中的法医学检测效能。
采用实施例1所述的检测方法对50名无关个体血液样本进行检测。50名个体为志愿者。
结果：
(1)50名个体在234个常染色体SNP位点及30个X-SNP位点均得到完整分型，其中25名男性个体在9个Y-SNP位点得到完整分型。
(2)根据50名无关个体在273个SNP位点的频率数据，发现234个常染色体SNP位点相互独立，用于个体识别的累积个体识别率为1-1.49E-62，用于二联体亲权鉴定的累积非父排除率为1-2.98E-12，用于三联体亲权鉴定的累积非父排除率为1-3.51E-23，可以满足实际工作需求。30个X-SNP位点的检测数据显示，在女性群体中的累积个体识别率为1-1.13738E-12，在男性群体中的累积个体识别率为1-6.23849E-09。9个Y-SNP在25名男性个体中共发现6种单倍型。以上X-SNP和Y-SNP位点的遗传信息可以亲缘关系的判断提供更丰富的信息。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 司法部司法鉴定科学技术研究所
<120> 一种基于高通量测序的SNP位点的检测试剂盒及其检测方法
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<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列
<400> 42
gccagtgcga gatgaaagtc tt 22
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
tgttctgagt tcctatccct gaattct 27
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
cgagaggcca gtatggttca ga 22
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
gggttgcact aggctagaca at 22
<210> 46
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
attttcagca tcattctgtt tgccaa 26
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
agaagtagca tctaaacaca tggtttacaa 30
<210> 48
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gggaaaacct tctccaactc atactaaa 28
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
agtccaaaaa tgttcatata tcacagcaga 30
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gttcccatca tggaacttac caaca 25
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
gagcaggtcc atgctcttct tt 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
accctcccat agtgttcctg tt 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
ggatcgacag gatggagact ca 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
ggatgaacaa gaagatttta tgtcccaca 29
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
ttgctttgta aggcaataga gcaaa 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
gggctaaaat ttgaatgaca tttcttcact 30
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
cttgttgtta cagaggcaag acaac 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
caaatctttg gtggaagccc aat 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
tctcattgtt cctaacccat tttcctc 27
<210> 60
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
ccatgaattg tttcaaatgc tttgtgaaat 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
gaggaagatt caacctcaga cttga 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
tgcttagcca gctgcttaag tt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
accaaagatc ctaagtctga tcaattgtt 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
acattttagg gcagaagact gtgaaatat 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
tgattaaaga cccaggatca aaatctcc 28
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
aatcaatgca ttagatagcc ttcagaagt 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
ccaacaagac atttgtgtag actctg 26
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
cacacaaaac ccaattatgg gtttct 26
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
gtgccatgta caattattat gaaagctgta tt 32
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
ttgatagaaa tctgccttct acctataagt 30
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
cccagggagt tcctgataac ga 22
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
gtcttggtct ttgctattgg aaatcctata 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
cctctgatgc tatttcagta ctgca 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
gccaagaaag agatctaggt tgct 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
cctttcaaac cctgatagat atgatcct 28
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
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cctgtctaat aacgaagcat gaaaacac 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
gcaagaggta gctgccattt tg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
cacatcacca gctaacctct tctc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
caaagttaaa caatacttgt aacccagcaa 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
attcattcac catttgatag ccatttgg 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
ccttcagaac ctttgagatc tgattct 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
ctgtaggttt ccagctcacc at 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
acctatagcc ctcttaaatt tagctaagga 30
<210> 84
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
gtgccatttt taaatggcat taatttcaca 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
ggcacaatgt tcaatttgtt catattcct 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
tatgaactgc caaggagtga taatgac 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
ttttgagaag tatctgttca tgtattttgc tg 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
gatcgttgtc ccagctgct 19
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<213> 人工序列
<400> 89
tctttgtacc aaactgccca cat 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgtgccctca cagttaaagc tt 22
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<213> 人工序列
<400> 91
ggaacttctg agcataagag cct 23
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
cctgttgctt tctctgacat tatcttttac 30
<210> 93
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
ctcaaggcag gaacataagc ca 22
<210> 94
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
tgcccaaata ccaattattt accagtagtt 30
<210> 95
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
gttcttagaa atctagctcc atctggttg 29
<210> 96
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
gttcgaatgt gtacaaatga agtcagaag 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
cctttactca aagctgcaag aagaag 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
attcttgtgt cttaaaaccc atgattttct 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
aacctttgga tgttgttctg gcta 24
<210> 100
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 100
cacttcctac tccgtagtaa atgagag 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 101
atttatgttc agttctcaat actgccaga 29
<210> 102
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
tgccaaatgt atccttacct ttaagactt 29
<210> 103
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 103
tagaaactgg agagaacttt ggaaagc 27
<210> 104
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 104
actcaggtgg gcagtaagat aca 23
<210> 105
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 105
catttacaaa tggcaacttc tgataaagga 30
<210> 106
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 106
gcaaaaacac agagtgcatt atctcttaga 30
<210> 107
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 107
agatctgaat tccacattgt ggtctt 26
<210> 108
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 108
ctaaaagaca gcaaagacaa gatgttgt 28
<210> 109
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 109
aaaattgcta cactgcttcc atttttac 28
<210> 110
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 110
tttgattttg aacttccaaa acaattagca 30
<210> 111
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 111
gtacgaagca cttgaattgc ttaca 25
<210> 112
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 112
tctataaggc aaggatgaac aggtct 26
<210> 113
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 113
catgactaac tgtcatcaca ctgtga 26
<210> 114
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 114
gtggagtgtg cctctaggaa ag 22
<210> 115
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 115
gggtgttcgg gattcttagg aa 22
<210> 116
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 116
ccaatcagtt aaccagtctt gttgttttt 29
<210> 117
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 117
ttcaataacc tgtcacacac acctt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 118
tactctgtgt gctggtcttt gtc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 119
tttttgccat gcacatgcta tagt 24
<210> 120
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 120
tttacgtagt ttttactcca atgtgccta 29
<210> 121
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 121
ctatgctgca gacatttcta aaaagtcaa 29
<210> 122
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 122
agaaaatcca ggttggtgtt aatatttgc 29
<210> 123
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 123
tctattctgt gctgtatcct gtagct 26
<210> 124
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 124
tgaagatgtg aagattcaag gtgca 25
<210> 125
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 125
gccaaattta tcccagggaa ggaa 24
<210> 126
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 126
ctcaaagcac caggcatttg ac 22
<210> 127
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 127
ctagatgcga tgggtgccat ta 22
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 128
aattgatatt tgttgggttt tgtctggat 29
<210> 129
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 129
gggtttttga agactttcgt aagaatgc 28
<210> 130
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 130
tccacgaaag ttcttctcct atgga 25
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 131
ccaatatcct atagcagtga gtctttcaa 29
<210> 132
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 132
actgcaccat ttttcaacac tacttc 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgttattttt ggttgtgagc acaaaca 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tatgatccac attgtatggt ttttaggca 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gattcaaagc atggttctga catcac 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gccaatatgg aattcctcct attttcaaaa 30
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 137
gtaggaaata ttccctgctt tccttct 27
<210> 138
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 138
gtactctgct ctaggaagag tttctagtat 30
<210> 139
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 139
gtttgctgaa ggtaagagag caga 24
<210> 140
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 140
gggagacaga acgcttgtaa attag 25
<210> 141
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 141
tctatatggg agaattctat gcagccat 28
<210> 142
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 142
cataatcctg tcatcttaag gcaaggt 27
<210> 143
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 143
ccaaagagga ccatggctac cta 23
<210> 144
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 144
ctcacgattg caaaagctta atagtaatca 30
<210> 145
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 145
acctctaatg cttatgtctt tctaaaagct 30
<210> 146
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 146
atgatttcta caggtgtgag aataacaca 29
<210> 147
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 147
aaactcaaat gctcaagata agccaac 27
<210> 148
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 148
ggtgtcgcag atggtttcat ga 22
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 149
actatgaggt gtgtctctct tttgtg 26
<210> 150
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 150
gtctgctcat gtttgtgccc ta 22
<210> 151
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 151
gcccatctac ccaagcattg ta 22
<210> 152
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 152
gggttagtaa tcctgtggca aaatgaa 27
<210> 153
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 153
tgatgatggt gattaatgag cattgagt 28
<210> 154
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 154
gctagtggct accaaattgt acataga 27
<210> 155
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 155
agggaccaag tcaagagctc t 21
<210> 156
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 156
ctggcgtctg tcttctctct c 21
<210> 157
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 157
atgcatttct aaactctaaa acaaacattt ga 32
<210> 158
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 158
tctacttatt aatttgtgga ataaactgaa ggc 33
<210> 159
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 159
ttttccctga atctcttgag tctttttct 29
<210> 160
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 160
agagacatga ggcattttca tggag 25
<210> 161
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 161
gggtgtgaag gtcctttagt tttcc 25
<210> 162
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 162
ctctttgctt gagagatttg gacac 25
<210> 163
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 163
gaggattgag aaagaaaaat acttccctca 30
<210> 164
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 164
tttttcaggg ctggttttaa cctg 24
<210> 165
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 165
cggtgtccct gtctgtttca at 22
<210> 166
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 166
gtgatgtggt atttgatgtc atccatc 27
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 167
tggaagtaga ttagagattg ctgggaa 27
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 168
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 170
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<213> 人工序列
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tttgataatc caaaaggagt gttgtatcca 30
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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gtgaggtaag tgcacattct aagaact 27
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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accactttcc tttgctagaa caca 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctcaactcca aggcagacac caa 23
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<213> 人工序列
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gatttgcatc ccagtgaaag cac 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aagaacatgt aacctccctt agggta 26
<210> 226
<211> 28
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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tttcgaggat atcatgtttt ctggct 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tttaagtccc tggattagtt gaaattaccc 30
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caactggtcc tttgggaagg aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gctgggccag aaacacactt aa 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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gcaatggtga gaggttgatg gt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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tttggaacac aactcccagg tt 22
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<213> 人工序列
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acggctatgt tgcaagattt aatagatga 29
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tctttgagat tgtggttatt ttctccaact 30
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<213> 人工序列
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cctaagagac tgtttcctga gtaaacatta 30
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<213> 人工序列
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taaccatttg agaatatggg cacatgt 27
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cagactctct gtgtgtggct tt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 244
agcttcgctt tgctactctt caaa 24
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<213> 人工序列
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cacagctagt aaggaacgaa cca 23
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<213> 人工序列
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ccagatgttg tcacactgaa caag 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acctgcgaaa tcccaaaatg c 21
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attttacaat gatgctgaat tttgtctctg tt 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agttttaatt tcccagcaaa aacttctttt 30
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ccattcagta agctaggagg acaa 24
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<213> 人工序列
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tcagagcaca cacacattcg aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cctcaaaaac aaagaaacat gggatga 27
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cattgatcct tccaaaccct ctgt 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaacaaaact gcacttgtac ccaattta 28
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<213> 人工序列
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tgcccattga cctcactgtt tt 22
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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taagtctaaa gggtataaag ctgagacagt 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gtgccttgcc tagaactctc tt 22
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<213> 人工序列
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acatttgtat tttatcccgt aggcatga 28
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ggtcctcatg catgagcaga ag 22
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<213> 人工序列
<400> 264
cctgagcagt ggttcaagga ag 22
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<213> 人工序列
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gcagaaatga cagcactctg agt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 266
agaatccaag tggacattgc ca 22
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<213> 人工序列
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ttaggtcagc accaggccca at 22
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agcttgaaag atttaaatcg gcaattaagg 30
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cccatcagga agctggaaat atgg 24
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<213> 人工序列
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actttagaaa tgccttctca ggtaatgg 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tccgggatgt cccgtcttat ta 22
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<213> 人工序列
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aggaaggtac ctggaggtga t 21
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<213> 人工序列
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gggactttga ctattaaatg aacatggtaa 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccctcaccat ttgtaaatgc cataaa 26
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agggtaacat ggagaaagtc tggtta 26
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ttactactgt tttctctcag ctgcaattaa 30
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<213> 人工序列
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accagtatta cattaattta atgaggctta cc 32
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<213> 人工序列
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tgctgtggtt gtacagcctt tt 22
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<213> 人工序列
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cagtcttgat atttgttctt tctgcatgtg 30
<210> 284
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<213> 人工序列
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tccagttatt gctagggttt ttgttcataa 30
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ccctcatttc agtggcttaa tgtg 24
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ggactctgag gctctagaga gac 23
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ggtctgtggg ctctcctaag at 22
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 289
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccctggctac acctaccagt t 21
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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gacctactgc acgtggatga ta 22
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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gactctgcat agtcgcagat ct 22
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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ctgccttggg caatatatca cca 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 411
ggattgagag cgcttgtctg aa 22
<210> 412
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 412
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<210> 413
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 413
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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aagccttgat tttgttcagg gaacta 26
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cagaggaaat agccattaat tctggtca 28
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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acctactcat tgtggaagag ttatgattc 29
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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catggtctct ttgggtgaaa gact 24
<210> 534
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 534
agagcataag tggctaactt ctaaatatgg 30
<210> 535
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 535
tcatgtatct gatccctggt tcaca 25
<210> 536
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 536
ccctcttaag tctttctggc ctt 23
<210> 537
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 537
gaggccagcg aaatgatgac ta 22
<210> 538
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 538
gaatccacta gagaaagcta cataggatg 29
<210> 539
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 539
atttaaatgt gaagcatcag taaggtcct 29
<210> 540
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 540
gttatgacag gctagcaccc aaa 23
<210> 541
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 541
accaaaaagt gtgggataca gtga 24
<210> 542
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 542
gttttcttct tctagctttg ggtttagttt 30
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 543
caaggaattc gctgcagcat at 22
<210> 544
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 544
cataatgaag taagcgctac cttacttaca 30
<210> 545
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 545
aaaaagatca ggagtcatta tatcagacaa a 31
<210> 546
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 546
tatatgtcag gtgctccagg gtt 23
Claims (8)
1.一种基于高通量测序的SNP位点的检测试剂盒，其特征在于，包含由273个SNP位点的引物对组成的引物组合物，所述引物组合物的序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：546所示；其中，所述273个SNP位点中的234个位于常染色体上、9个位于Y染色体上、30个位于X染色体上。
2.根据权利要求1所述的SNP位点的检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒还包括自行编写的BED文件，所述BED文件用于SNP位点的结果分析。
3.一种如权利要求1-2中任一项所述的SNP位点的检测试剂盒在三联体亲子鉴定、二联体亲子鉴定、祖孙鉴定、同胞鉴定以及个体识别司法鉴定领域中的应用。
4.一种使用权利要求1～2中任一项所述的SNP位点的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1)取样本DNA于PCR扩增体系中，采用聚合酶链式反应进行文库的构建；
步骤2)对步骤1)中构建的文库进行纯化和定量；
步骤3)对步骤2)定量后的文库进行接头和测序引物的连接；
步骤4)对步骤3)制备的文库在高通量测序平台完成测序；
步骤5)采集测序信号，采用自行编写的BED文件对步骤4)获取的测序文件进行质控及结果分析。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中PCR扩增体系包括PCR反应缓冲液、如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：546所示序列的引物组合物、Taq聚合酶以及去离子水。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中聚合酶链式反应的扩增程序为：95℃预变性11min；94℃30s，60℃60s，70℃60s，22个循环；60℃延伸30min。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中的纯化采用Ampure磁珠完成，所述步骤2)中的定量采用Qubit或qPCR方式。
8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤4)中的高通量测序平台包括Ion Torrent或者Miseq。
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