CN112029842A - 一种基于高通量测序进行abo血型基因分型的试剂盒和方法 - Google Patents

一种基于高通量测序进行abo血型基因分型的试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于多重PCR捕获的高通量测序进行ABO血型基因分型的方法及适用于该方法的试剂盒，属于血型基因分型领域。所述方法包括：获取受试者个体的DNA样本；S2，利用由分别具有SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.248所示核苷酸序列的引物组成的引物组合对所述DNA样本进行PCR扩增，捕获目的区域片段，获得DNA文库；S3，通过带有测序接头的PCR扩增引物，进一步扩增DNA文库；S4，将DNA文库在Illumina平台进行高通量测序，得到测序数据；测序数据进行前处理后，进行ABO血型基因分型。利用本发明，可以获得覆盖ABO基因全长90.92%区域，包括ABO基因全部7个外显子区域的测序数据，可以更加精准地完成ABO血型基因分型。

Description

一种基于高通量测序进行ABO血型基因分型的试剂盒和方法
技术领域
本发明属于血型基因分型领域，具体地，涉及一种基于多重PCR捕获的高通量测序进行ABO血型分型的试剂盒和方法。
背景技术
作为人类最具临床重要性的血型系统，ABO血型不合会引发急性溶血性输血反应和新生儿溶血病，严重时会危及患者生命。因此，ABO血型的准确鉴定，是保证临床输血安全的首要要求。但是，常规的血清学方法检测ABO血型会受到诸多因素如疾病、亚型、自身抗体、不规则抗体以及假、弱凝集的影响，有时会无法准确定型。
近年来，随着基因组学的快速发展和“精准医学”概念的提出，以血型基因碱基序列为基础的血型基因分型技术得以建立。目前临床较为常用的ABO血型基因分型技术主要是序列特异性引物PCR(PCR-SSP)技术。基于PCR-SSP技术的分子分型虽然具有很高的灵敏度和特异性，可以进行已知亚型的鉴定，但是无法用来发现新的突变。
测序技术可以精确获取一个目的片段的核苷酸序列，可以鉴定未知突变，是基因检测的金标准，使得血型分析达到了更精细的水平，为保证输血治疗的安全有效做出了重大贡献。自2011年，高通量测序技术(又称二代测序技术，NGS)首次应用于红细胞血型基因分型，通过测序CDS区域对RhD血型进行鉴定。接下来几年时间里，针对血型基因的NGS分型技术开发进入研究者的视野。但是，针对ABO基因测序的大部分研究都主要集中于第6、7外显子，最多分析CDS区域，少有研究内含子或上下游区域，原因之一是绝大部分影响蛋白功能的变异位点都位于蛋白编码区域有关。但是，ABO基因全长24830bp，第6、7外显子的长度仅仅是全基因的十分之一，那么，其二者之外的片段在抗原的表达中发挥什么样的作用呢？有些对于内含子区域的研究证实了某些内含子区域的突变对ABO抗原的表达存在影响。仅仅对于第6、7外显子进行测序研究，不足以保证ABO血型基因分型的准确性。
此外，制约ABO全基因测序的另外一个重要因素是，ABO基因的1-5外显子GC含量极高，难于设计特异性的扩增引物，即使能够设计引物，这些区域的引物的扩增效率也可能非常低下。也有研究通过探针捕获的方法来捕获ABO全长基因，虽然不存在引物设计的问题，但在文库扩增步骤中，GC含量或低复杂度区域的扩增仍然受到影响。并且，Ion torrentPGM测序平台对于高GC含量区域的测序质量较差，不适合应用于ABO基因检测，这更加限制了ABO全基因测序的开发和应用。直到2019年，William J.Lane在MedSeq Project中利用全外显子捕获测序方法对12个血型系统的38种血红细胞抗原和22种血小板抗原进行鉴定，但是这种方法的成本极高、数据分析复杂、周期长，极难普及。
相比较而言，基因捕获测序的主要优势在于可针对特定区域进行测序，有效降低了测序成本，提高了测序深度，能够更精确地发现特定区域遗传变异信息，是精准医学的基础之一。目前常用的基因捕获方法包括杂交捕获和多重PCR扩增。其中，杂交捕获的特点是能够对外显子组甚至更大的目标区域进行捕获，但操作流程复杂，需要依赖较多专门的仪器设备；多重PCR捕获则操作简单灵活，对仪器要求最小化，能在数小时内完成目标序列富集和文库构建，适用于相对较小的目标序列捕获。
发明内容
为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明通过建立适配于Illumina测序平台的多重PCR捕获测序技术，实现对ABO全基因的高通量测序。一方面用于筛查引起ABO正反定不符的SNP，以便于深入研究其表达调控机制；另一方面作为对现有的SSP和一代测序的技术升级，建立利用二代测序进行ABO血型分型的技术体系。为此，
本发明第一方面提供一种适用于基于多重PCR捕获的高通量测序进行ABO血型基因分型的试剂盒，所述试剂盒包括由分别具有SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.248所示核苷酸序列的引物组成的引物组合。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括测序接头Index Barcode、多重PCR Master Mix、纯化磁珠和阳性对照样本。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括DNA提取试剂。
本发明第二方面提供一种基于多重PCR捕获的高通量测序进行ABO血型基因分型的方法，包括以下步骤：
S1，获取受试者个体的DNA样本；
S2，利用由分别具有SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.248所示核苷酸序列的引物组成的引物组合对所述DNA样本进行PCR扩增，富集目的区域片段，获得DNA文库；
S3，通过带有测序接头的PCR扩增引物，进一步扩增DNA文库；
S4，将DNA文库在Illumina测序平台进行高通量测序，得到测序数据；
S5，测序数据进行前处理后，利用下述步骤进行ABO血型基因分型：
S51，利用比对软件，将测序序列比对到人类参考基因组上，
S52，分析样本中存在的变异类型，利用注释软件，为变异位点增加注释信息，
S53，分析比对结果和注释结果，获得样本变异位点的单倍型，
S54，将样本变异位点的单倍型结果与ABO血型系统数据库进行比对，得到ABO血型分型。
在本发明的一些实施方案中，在所述步骤S2和S3之间，进一步包括利用磁珠对DNA文库进行纯化的步骤。
在本发明的一些实施方案中，在步骤S3和S4之间，进一步包括利用磁珠两步纯化方法对扩增后的DNA文库进行纯化的步骤。
在本发明的一些实施方案中，在步骤S3之前，进一步包括对文库进行凝胶电泳质检的步骤，如果凝胶主条带在400bp左右，表明质检合格。
在本发明的一些实施方案中，步骤S5中所述前处理，是指对测序数据进行质检和过滤，去除低质量测序数据，并处理接头序列数据。
在本发明的一些具体实施方案中，数据质控标准为：
1)去除含有adaptor的reads；
2)去除N的比例大于3％的reads；
3)去除低质量reads(质量值Q<＝3的碱基数占整个read的50％以上)的reads。
在本发明的一些实施方案中，所述比对软件是BWA软件。
在本发明的一些实施方案中，所述注释软件为annovar软件。
在本发明的一些实施方案中，所述ABO血型系统数据库包括dbRBC和ISBT数据库中的ABO血型数据，以及现有的其他ABO血型数据。
在本发明的一些实施方案中，若S54得到的ABO血型基因分型结果不唯一，进一步包括分析所述ABO血型候选分型的人群频率步骤，得出最有可能的ABO血型基因分型结果
在本发明中，所述高通量测序由选自包括但不限于Illumina Miseq、Xten和Novaseq高通量测序平台中的一种完成。
本发明的有益效果
本发明相对于现有技术，具有以下有益技术效果：
利用本发明，目标是获得覆盖ABO基因全长90.92％区域，包括全部7个外显子区域的测序数据，以便更加精准地完成ABO血型基因分型。但是，在实际检测中发现，利用本发明的试剂盒，扩增捕获分析结果优于预期，目标区域覆盖度≥98％，特异性≥95％，均一性≥90％，灵敏度≥1％SNV。
本发明的方法相对于探针捕获方法，成本较低，步骤相对简单。
利用本发明，在A、B、O三种血型上，100％(50/50)的样本能够准确分型。亚型比对结果显示，98％(49/50)样本亚型分型结果与一代测序分型结果完全一致，唯一一例不一致的是由于该样本是微嵌合体，一代测序未能得出明确分型结果。
利用本发明，可以发现ABO新型变异位点。
附图说明
图1示出引物设计流程图。
图2示出生物信息分析流程图。
图3示出ABO分型流程图。
图4示出16号样本测序结果中A101的四个特征性位点之c.526C的IGV可视化图。
图5示出16号样本测序结果中A101的四个特征性位点之c.703G的IGV可视化图。
图6示出16号样本测序结果中A101的四个特征性位点之c.796C的IGV可视化图。
图7示出16号样本测序结果中A101的四个特征性位点之c.803G的IGV可视化图。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
实施例ABO血型基因测序分析
1.材料与方法
1.1样本信息
共计50例DNA样本，其中30例ABO正反定不符样本(编号1-30)，20例ABO正反定相符样本(编号31-50)，所有样本均包含正定型、反定型、PCR-SSP以及Sanger测序的结果。具体样本信息和编号如表1所示。
表1样本信息表
Figure BDA0002659357390000061
Figure BDA0002659357390000071
Figure BDA0002659357390000081
备注：“/”表示条带比对不上，结果不明确。
1.2引物设计
捕获目标为ABO基因全长区域，从ensembl网站查询人类ABO基因，得到ABO基因位点信息(chr9:136125788-136150617)，ABO全长约为24,830bp，参考基因组版本为hg19。利用图1所示的引物设计流程进行引物设计。经发明人审核校对和引物测试调整后，最后筛选得到124对引物，可以覆盖ABO基因全长90.92％区域，包含全部外显子区域。更详细引物序列信息见表2。
表2引物序列
Figure BDA0002659357390000082
Figure BDA0002659357390000091
Figure BDA0002659357390000101
Figure BDA0002659357390000111
Figure BDA0002659357390000121
Figure BDA0002659357390000131
Figure BDA0002659357390000141
Figure BDA0002659357390000151
Figure BDA0002659357390000161
Figure BDA0002659357390000171
Figure BDA0002659357390000181
1.3 NGS测序
1.3.1.测序文库构建(panel:ABOv2.0)
·PCR扩增：通过特异性的引物，将目的区域片段扩增出来，富集目的区域片段；
·磁珠纯化：通过磁珠纯化方法，去除非扩增片段，提高目的区域的扩增片段的纯度；
·文库扩增：通过带有测序接头的PCR扩增引物，成倍扩增DNA文库，使得文库浓度满足测序需求；
·文库纯化：利用磁珠两步纯化方法分选纯化扩增后的DNA文库；
·上机测序：纯化后的DNA文库质检合格定量后，即可上机测序(Illumina测序平台)，得到测序数据；
1.3.2质检标准：
文库扩增后，需对文库进行凝胶电泳质检，凝胶电泳主带在400bp左右。
1.4测序数据分析
通过生物信息分析软件，对测序数据进行质检和变异分析，分析流程图如图2所示，具体分析步骤包括：
·原始数据质检：检测原始测序数据质量；
·数据过滤：过滤低质量测序数据，处理接头序列数据；
·比对：将测序序列比对到人类参考基因组上；
·捕获分析：分析数据的均一性、特异性、覆盖度、测序深度等；
·变异分析：利用变异分析软件，分析样本中存在的indel,snv等变异类型；
·变异结果注释：通过注释软件，为变异位点增加注释信息；
·ABO血型分型分析：通过分型程序”ABO_Typer”，得到样本ABO血型分型结果；
·质检标准：原始数据Q20>90％,Q30>90％，均一性>90％,特异性>90％,覆盖度>90％，测序深度>1000×。
1.5基因分型
分析流程中的基因分型模块采用程序ABO_Typer.py进行ABO基因的分型分析。
该程序以annovar软件注释后的文件和BWA软件的比对结果文件作为输入文件，通过分别解析两个文件信息，可以得出样本的变异位点的单倍型结果(部分位点由于扩增子间在基因组上位置差距太远，未能得出明确的单倍型分型结果，程序会自动输出候选的所有可能单倍型结果)，变异位点的单倍型分析结果与ABO血型系统数据库(数据库内容主要收集于dbRBC，ISBT数据库，少量收集于文献资料)进行比对分析，将得到候选的ABO基因单倍型分型结果，该部分结果可能存在一对或一对以上的单倍型分型结果，因二代测序读长短，无法直接准确的得出唯一的单倍型分型结果，程序通过分析候选分型的人群频率，得出最有可能的分型结果，最后输出一对唯一的单倍型分型结果(由于数据库局限性或因候选血型人群频率一致或接近而无法分型的情况，这种情况程序将只输出候选的分型结果，需要人工进行核对检查)。ABO基因分型流程图如图3所示。
2.结果
2.1捕获分析结果
通过将测序序列比对到人类参考基因组上(hg19版本)，统计各个区域测序序列覆盖情况，最后统计得出目标区域的覆盖度、均一性，同时也统计引物扩增片段的特异性以及数据的有效性等。50例样本的扩增捕获分析结果良好，平均测序深度为4667×，所有样本测序深度均远大于1000×，平均特异性和均一性均大于90％，>20×覆盖度大于98％，可以满足ABO分型要求。
扩增子捕获分析结果见表3。
表3扩增子捕获分析结果
Figure BDA0002659357390000201
Figure BDA0002659357390000211
Figure BDA0002659357390000221
2.2鉴定结果对比
本实施例中，共计50份DNA样本，全部样本在做二代测序分型前已做传统的血清学检测(正定型、反定型)、PCR-SSP以及Sanger测序检测。在A、B、O三种血型上，对比结果显示，100％(50/50)的样本能够准确分型。更细致的亚型比对结果，98％(49/50)样本亚型分型结果与一代测序分型结果完全一致。具体对比结果如表1所示。
2.3不一致结果分析
如表4比对结果所示，仅有1例样本(16号样本)一代测序未能得出明确分型结果，但是二代测序发现该样本与A101有关的四个位点c.526C，c.703G，c.796C，c.803G突变丰度都在6-7％之间(图4-7)，疑为微嵌合体，鉴定结果为A101(6-7％)/B101。这种现象之前有类似的研究也报道过。这可能与胎儿与母体之间的细胞交换、器官移植等相关，具体的原因需要进一步研究证实。
2.4新型变异位点
本实施例共发现291个变异位点，其中25个变异位点位于外显子区域或剪切区域，可能对基因功能影响较大。目前暂未逐一检查外显子和剪切区域外的其他变异位点，仅对外显子区域和剪切区域的变异位点进行检查解读。25个外显子或剪切区域位点中，其中五个位点为新型变异位点，目前在数据库以及其他文献中暂未有报道这5个变异位点，分别为位于7号外显子的c.773A>C(～5％)、c.917T>C，位于3号外显子的c.140_143delTGGA，位于2号外显子的c.39delA，以及位于剪切位点的c.28+1G>A，这5个变异位点在1000G人群频率数据库中均没有报道，见表4。
其中位于7号外显子的c.773A>C变异在三个样本中发现，但是该变异位点在3个样本中的突变丰度都比较低，都只有5％左右，具体的原因暂不明确。
通过直接的基于reads解析变异方法，c.917T>C变异位点与B101单倍型的变异位点关联，猜测该位点可能为B亚型中的一种新型基因型。其余4个新型变异位点因为与已知分型变异位点之间在基因组上的位置间隔太远，并不能直接得出准确的单倍型，需要进一步的实验才能得到准确的单倍型。其中，包含c.773A>C变异的3个样本都包括O02单倍型，所以，该变异位点可能与O型中的一种新型基因型相关。
进一步的实验包括nanopore三代测序长读长测序实验，特异性引物扩增测序实验以及更进一步的血清学检测，通过这些实验，可以进一步的确定新型变异位点的单倍型以及其抗原表达情况。
表4新型变异位点详情
Figure BDA0002659357390000241
综上所述，发明人建立的二代测序技术对于50例标本进行ABO全基因测序分型所得结果与传统的血清学鉴定方法和PCR-SSP、Sanger测序分型技术所得结果相符。
本发明采用自行设计的一套引物，基于PCR扩增捕获的方法，利用高通量二代测序技术来捕获ABO全长基因，引物设计预测可以覆盖至少90.92％的区域；而在实际的样本检测中，当测序深度足够时(>1000×)，>20×覆盖度大于98％，均一性和特异性均大于90％，均得到了唯一的分型结果，可以满足ABO基因分型要求。与现有技术对比，本发明的捕获ABO全长基因的效果更好、更优，且该技术的实验成本和步骤相比于探针捕获方法更为简便易行，更适用于大量样本的快速检测。
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种适用于基于多重PCR捕获的高通量测序进行ABO血型基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括由分别具有SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 248所示核苷酸序列的引物组成的引物组合。
2.一种基于多重PCR捕获的高通量测序进行ABO血型基因分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，获取受试者个体的DNA样本；
S2，利用由分别具有SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 248所示核苷酸序列的引物组成的引物组合对所述DNA样本进行PCR扩增，捕获目的区域片段，获得DNA文库；
S3，通过带有测序接头的PCR扩增引物，进一步扩增DNA文库；
S4，将DNA文库在Illumina平台进行高通量测序，得到测序数据；
S5，测序数据进行前处理后，利用下述步骤进行ABO血型基因分型：
S51，利用比对软件，将测序序列比对到人类参考基因组上，
S52，分析样本中存在的变异类型，利用注释软件，为变异位点增加注释信息，
S53，分析比对结果和注释结果，获得样本变异位点的单倍型，
S54，将样本变异位点的单倍型结果与ABO血型系统数据库进行比对，得到ABO血型分型。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤S2和S3之间，进一步包括利用磁珠对DNA文库进行纯化的步骤。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤S3和S4之间，进一步包括利用磁珠两步纯化方法对扩增后的DNA文库进行纯化的步骤。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤S3之前，进一步包括对文库进行凝胶电泳质检的步骤，如果凝胶主条带在400bp左右，表明质检合格。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S5中所述前处理，是指对测序数据进行质检和过滤，去除低质量测序数据，并处理接头序列数据。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述比对软件是BWA软件。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述注释软件为annovar软件。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述ABO血型系统数据库包括dbRBC和ISBT数据库中的ABO血型数据，以及现有的其他ABO血型数据。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，若S54得到的ABO血型基因分型结果不唯一，进一步包括分析所述ABO血型候选分型的人群频率步骤，得出最有可能的ABO血型基因分型结果。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112908413A (zh) * 2021-03-22 2021-06-04 深圳市血液中心(深圳市输血医学研究所) 一种基于abo基因的血型分型方法
CN113584222A (zh) * 2021-06-23 2021-11-02 华中科技大学同济医学院附属同济医院 用于检测covid-19易感性的分子标记、试剂盒及应用
CN114457169A (zh) * 2022-03-07 2022-05-10 南京鼓楼医院 一种基于高通量测序的RhD基因型检测方法
CN115725711A (zh) * 2022-08-16 2023-03-03 深圳市血液中心(深圳市输血医学研究所) 冰冻全血中血型抗原编码基因的扩增引物组及扩增方法和基因分型方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006032897A2 (en) * 2004-09-22 2006-03-30 University Of The West Of England, Bristol Rhd and abo genotyping by multiplex pcr
CN101921834A (zh) * 2010-05-17 2010-12-22 浙江省血液中心 一种abo血型基因分型的pcr-sbt方法及试剂
CN102115788A (zh) * 2010-12-02 2011-07-06 公安部物证鉴定中心 一种snp复合检测体系和检测方法
CN103374609A (zh) * 2012-04-12 2013-10-30 广州益善生物技术有限公司 Abo基因突变检测特异性引物和液相芯片
CN108103204A (zh) * 2017-12-15 2018-06-01 东莞博奥木华基因科技有限公司 基于多重PCR及二代测序的Rh血型分型方法及装置
CN108624663A (zh) * 2017-03-23 2018-10-09 上海市血液中心 一种人类红细胞abo血型抗原多重pcr分型方法及试剂盒
CN110387438A (zh) * 2019-07-08 2019-10-29 广东省公共卫生研究院 用于肠道病毒高通量测序的多重引物、试剂盒和方法
CN110400602A (zh) * 2018-04-23 2019-11-01 深圳华大生命科学研究院 一种基于测序数据的abo血型系统分型方法及其应用
CN111020061A (zh) * 2019-12-31 2020-04-17 广州迈景基因医学科技有限公司 基于高通量测序检测hpv的多重pcr引物组、试剂盒及其方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109554448B (zh) * 2018-12-27 2019-08-30 浙江省血液中心 一种人类红细胞血型系统abo抗原的多重pcr-sbt基因分型方法及试剂

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006032897A2 (en) * 2004-09-22 2006-03-30 University Of The West Of England, Bristol Rhd and abo genotyping by multiplex pcr
CN101921834A (zh) * 2010-05-17 2010-12-22 浙江省血液中心 一种abo血型基因分型的pcr-sbt方法及试剂
CN102115788A (zh) * 2010-12-02 2011-07-06 公安部物证鉴定中心 一种snp复合检测体系和检测方法
CN103374609A (zh) * 2012-04-12 2013-10-30 广州益善生物技术有限公司 Abo基因突变检测特异性引物和液相芯片
CN108624663A (zh) * 2017-03-23 2018-10-09 上海市血液中心 一种人类红细胞abo血型抗原多重pcr分型方法及试剂盒
CN108103204A (zh) * 2017-12-15 2018-06-01 东莞博奥木华基因科技有限公司 基于多重PCR及二代测序的Rh血型分型方法及装置
CN110400602A (zh) * 2018-04-23 2019-11-01 深圳华大生命科学研究院 一种基于测序数据的abo血型系统分型方法及其应用
CN110387438A (zh) * 2019-07-08 2019-10-29 广东省公共卫生研究院 用于肠道病毒高通量测序的多重引物、试剂盒和方法
CN111020061A (zh) * 2019-12-31 2020-04-17 广州迈景基因医学科技有限公司 基于高通量测序检测hpv的多重pcr引物组、试剂盒及其方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112908413A (zh) * 2021-03-22 2021-06-04 深圳市血液中心(深圳市输血医学研究所) 一种基于abo基因的血型分型方法
NL2030603A (en) * 2021-03-22 2022-09-28 Shenzhen Blood Center Shenzhen Inst Of Transfusion Medicine Blood group typing method based on abo gene
CN113584222A (zh) * 2021-06-23 2021-11-02 华中科技大学同济医学院附属同济医院 用于检测covid-19易感性的分子标记、试剂盒及应用
CN114457169A (zh) * 2022-03-07 2022-05-10 南京鼓楼医院 一种基于高通量测序的RhD基因型检测方法
CN115725711A (zh) * 2022-08-16 2023-03-03 深圳市血液中心(深圳市输血医学研究所) 冰冻全血中血型抗原编码基因的扩增引物组及扩增方法和基因分型方法

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