CN104975081A - 检测pkd1基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测PKD1基因突变方法,所述方法利用PKD1基因的序列信息设计9对PCR 标签引物,应用长链PCR技术靶向扩增PKD1基因, 同时在扩增产物加上标签,PCR产物纯化、混合后直接建单一SMRTBell文库,应用PacBio RSⅡ测序仪进行测序,通过生物信息学分析获得PKD1 基因突变信息。有益效果为通过设计了一组简化的引物,结合标签引物技术,实现了对多个DNA 样品PCR产物的分别标记,扩增的PCR产物不需要打断可以直接建库,建库不需要再进行PCR,使多个样本混合成一个文库通过PacBio RSⅡ测序文库构建环节同时处理,大大简化了实验操作。
Description
技术领域
本发明属于医学体外诊断技术,具体涉及常染色体显性多囊肾病致病基因PKD1突变检测的扩增引物组、试剂盒以及使用该引物组和试剂盒检测检测PKD1基因突变的方法。
背景技术
成人多囊肾病(polycystic kidney disease,PKD)是最常见的遗传性肾病,人群发病率约在1/400~1/1000,多为常染色体显性遗传,少部分为常染色体隐性遗传。常染色体显性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)主要表现为双肾多发性进行性囊泡,引起肾脏结构和功能损害,是终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)最常见的遗传病因,约占全部ESRD的10%,还可累及全身多个器官,如肝囊肿、高血压、颅内动脉瘤等。遗传学研究表明ADPKD主要由PKD1和PKD2基因突变引起,大约80%~85%患者的致病基因为PKD1,导致Ⅰ型多囊肾病,10%~15%患者的致病基因为PKD2,导致Ⅱ型多囊肾病。遗传性多囊肾病是以双肾形成多个进行性增大囊肿为主要特征的单基因遗传病,PKD1基因突变是造成成人多囊肾病的主要病因,且其患者较PKD2患者发病早、临床症状更严重。目前对ADPKD尚无特异的治疗措施,只有一些对症治疗和延缓多囊肾病向ESRD进展的干预措施。对患者进行基因检测有助于明确诊断、直系亲属预后判断,并为再次生育产前检测提供依据。PKD1位于人16q13.3,基因长52kb,含46个外显子,编码区长度12906bp,在16号染色体上存在6个同源的假基因,与PKD1外显子1至外显子33序列相比同源性高达97.7%。PKD1基因结构复杂,突变种类多,可能涉及整个基因,没有突变热点,且80%以上的致病突变都发生在基因的多拷贝区(外显子1~33),因此特异性检测PKD1基因突变较为困难。直到2001年,Rossetti等才联合LR-PCR、巢式PCR及单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)分析,第一次全面报道了高加索人PKD1基因突变的情况。随后有研究者建立了基于变性高效液相色谱技术的突变筛查方法,可以提高突变的检出率,但两种方法存在的影响因素较多,结果不够稳定,准确性较低。目前,对巢式PCR产物进行直接Sanger测序是常用的PKD基因诊断方法,虽然该方法更为准确,但测序工作量巨大、效率低,且存在PCR脱靶现象,限制了该方法的大规模临床应用。
在现有技术中为了解决检测PKD1基因突变效率低下的问题,研究者们作了大量的尝试。萧畔等(中国ADPKD患者PKD1基因突变位点检测,《山东医药》,2007年,第47卷第21期,1-2页)仅对PKD1基因的12、14、21外显子片段进行了扩增,该方法并不具备完全检测PKD1基因突变的效果。TW201339309A公开了一种检测PKD1基因突变的引物组和试剂盒,但其在扩增PKD1基因过程中所需要使用的引物组多达几十组,虽然较为准确,但方法过于繁琐,反应体系需要后续纯化,必须结合DHPLC进行后续处理,检测成本过高、效率低。张树忠等(应用变性高效液相色谱技术检测汉族人Ⅰ型多囊肾致病基因突变,《中华医学遗传学杂志》,2006年,第23卷第03期,283-288页)采用的方法与TW201339309A类似,也有类似的缺陷。
US7553644B2也公开了一种检测PKD1基因突变的方法,但该方法中扩增PKD1基因过程中所需要使用的引物组也过多,方法过于繁琐,检测效率低。CN104531883A公开了一种检测PKD1基因突变的试剂盒和检测方法,涉及一种含有5对引物的引物组,该检测方法中测序采用的是第二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术,该技术具有高通量、快速、准确和成本低的优点,可实现多样本、多个基因、多外显子的同时检测,但该方法采用的NGS技术具有GC含量偏好性,尤其是不能得到PKD1外显子1的有效数据。并且NGS技术具有读序短的特点,扩增的LR-PCR产物必须片段化得到短序列后方可进行建库,为提高通量每个样本需要独立建库,大大提升了检测成本。由于PKD1基因长度大以及方法自身的限制,最后该方法只检测到外显子1之外的PKD1基因的外显子和部分的内含子内含子,该范围并不能完全覆盖已报道的致病位点;因此CN104531883A的检测方法和引物序列组并不能全面地反映出所检测样品中的所有PKD1基因突变,该方法所得到的假阳性检测结果和漏检的可能较大。因此本领域仍然需要一种能高效、简便、准确地检测PKD1基因突变、并且所需引物组较少的方法。
第三代测序技术基于纳米孔采用单分子读取技术,有着更快的数据读取速度和巨大的应用潜能;在建库阶段不需要对DNA进行片段化处理,也不需要PCR扩增步骤,进一步降低了测序成本。第三代测序技术以太平洋生物技术公司(Pacific Biosciences)PacBio RSⅡ单分子实时(Single Molecular Real Time,SMRT)测序技术为代表,该单分子测序技术是一种完全新型的测序技术,具有读长超长、准确度高、GC偏向性小等特点,这一技术简称PacBio SMRT测序技术,可以在一天之内完成从样品制备到测序和读取序列的全过程,非常适合临床快速诊断的要求。PacBio SMRT测序解决了第二代测序几大困扰:变异检测假阳性高,稀有突变被淹没,建库阶段无需扩增可直接对单个分子进行测序,有效避免了建库扩增偏好性和GC偏好性,可轻松跨越GC含量异常(过高或过低)及高度序列重复的区域,实现序列覆盖的完整性和均一性,长读长(平均读长达10Kbp-14Kbp)特性可以直接对长片段进行测序,无需打断成小片段再进行测序。因此,PacBio SMRT测序技术可以对LR-PCR产物进行直接测序,而不需要片段化处理和再次PCR扩增,而且采用引物标签技术,不需要对每个样本单独建库,可以显著提高检测通量,降低单个样品的检测成本。目前还未有将将长链PCR(Long-range PCR,LR-PCR)技术和PacBio SMRT测序技术结合,并将其应用于单基因遗传病基因诊断的研究,更没有将PacBioSMRT应用于常染色体显性多囊肾病基因诊断领域的研究。
发明内容
本发明涉及一种检测PKD1基因突变方法,所述方法利用PKD1基因的序列信息设计9对PCR标签引物,应用长链PCR技术靶向扩增PKD1基因,同时在扩增产物加上标签,PCR产物纯化、混合后直接建单一SMRTBell文库,应用PacBio RSⅡ测序仪进行测序,通过生物信息学分析获得PKD1基因突变信息。
本发明提供了一种用于PCR特异性扩增检测PKD1基因突变的引物组,该组PCR引物共9对,所述一对PCR标签引物由标签和扩增待测目的序列的PCR引物组合而成,即在每一对PCR标签引物的5’端分别具有正向标签和反向标签。9对引物分别如下:用于扩增PKD1基因外显子1和内含子1的引物,其正向引物如SEQ ID NO:1所示,反向引物如SEQID NO:2所示;用于扩增PKD1基因内含子1到外显子8的引物,其正向引物如SEQ ID NO:3所示,反向引物如SEQ ID NO:4所示;用于扩增PKD1基因外显子7到外显子13的引物,其正向引物如SEQ ID NO:5所示,反向引物如SEQ ID NO:6所示;用于扩增PKD1基因内含子12到外显子15的引物,其正向引物如SEQ ID NO:7所示,反向引物如SEQ ID NO:8所示;用于扩增PKD1基因外显子15到内含子21的引物,其正向引物如SEQ ID NO:9所示,反向引物如SEQ ID NO:10所示;用于扩增PKD1基因内含子21到内含子26的引物,其正向引物如SEQ ID NO:11所示,反向引物如SEQ ID NO:12所示;用于扩增PKD1基因内含子26到内含子34的引物,其正向引物如SEQ ID NO:13所示,反向引物如SEQ ID NO:14所示;用于扩增PKD1基因内含子34到内含子41的引物,其正向引物如SEQ ID NO:15所示,反向引物如SEQ ID NO:16所示;用于扩增PKD1基因内含子39到外显子46的引物,其正向引物如SEQ ID NO:17所示,反向引物如SEQ ID NO:18所示。优选的PCR引物如表1所示,扩增片段1大小为2281bp,扩增片段2大小为4037bp,扩增片段3大小为3904bp,扩增片段4大小为4398bp,扩增片段5大小为4358bp,扩增片段6大小为3202bp,扩增片段7大小为3910bp,扩增片段8大小为2641bp,扩增片段9大小为2911bp,9个片段总共扩增29787bp的基因序列,覆盖PKD1基因57.3%(29.8kb/52kb)的区域。
本发明还提供了一种用于PCR特异性扩增检测PKD1基因突变的试剂盒,包含上述的引物组中的一对或多对引物。该试剂盒中还可以包含以下一种或多种试剂:用于从样品提取基因组DNA的试剂;利用所述引物进行长片段PCR反应的试剂;用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂;优选其中所述利用所述引物进行长片段PCR反应的试剂DNA聚合酶、缓冲液和dNTP混合物。上述试剂具体可以是10×GeneAmp HighFidelity PCR缓冲液;10mmol/LdNTP;5mol/L甜菜碱;5U/μl聚合酶混合物。在总体积为50μl的PCR反应体系中含有下述组分:每种PCR引物各1μl,引物的浓度为10μmol/L;10×GeneAmp High Fidelity PCR缓冲液5μl,10mmol/LdNTP 2μl,10μmol/L上、反向引物各1μl,5mol/L甜菜碱10μl,DMSO 2.5μl(对片段1扩增时使用5μl),5U/μl聚合酶混合物1μl,20μg/μl DNA模板5μl。
本发明的PCR引物组或试剂盒具有检测PKD1基因突变中的用途,以及在常染色体显性多囊肾病基因诊断中的用途。
本发明还提供了一种用于非诊断目的的体外检测PKD1基因突变的方法,包括以下步骤:(1)采集受检者标本,如外周血,提取基因组DNA;(2)应用基因组DNA作为模板,使用本发明的由9对引物组成的引物组,在适于扩增目的核酸的条件下,采用长链PCR技术对PKD1进行靶向扩增,其中每一对标签引物由正向标签引物和反向标签引物构成,其中正向标签引物和反向标签引物所包含的标签可以相同或者不同;同一DNA样品所用每对标签引物(共9对)使用相同的标签,不同DNA样品所用标签引物中的标签彼此不同,以区分不同DNA样品的扩增产物;(3)对扩增的9个长片段产物,进行纯化回收;(4)将纯化的9个PCR产物进行混合,得到1个受检者的PCR产物文库;(5)将多个受检者的PCR产物文库进行等量混合直接构建单一SMRTBell文库,在SMRT Cell上进行PacBio SMRT测序,获得长片段PCR产物的序列;(6)基于标签序列区分不同的基因组DNA样品,采用SMRT Portal软件通过识别序列结果中的标签序列,建立各个标签对应DNA样品测序结果的数据,通过生物信息学分析将单个样品测序获得的DNA序列片段比对到参考PKD1基因上,进行SNVs和Indels提取,排除多态性变异获得该标本PKD1基因突变信息。
本发明的检测PKD1基因突变的方法,优选包括下述步骤:
(1)从受检标本中提取基因组DNA;
(2)应用基因组DNA作为模板,选取靶基因并设计9对PCR标签引物,采用LR-PCR技术对靶基因进行靶向扩增,PCR反应体系包含0.5M甜菜碱,PCR反应条件采用2步法PCR;
(3)对扩增的9个长片段产物,进行纯化回收;
(4)将纯化的9个PCR产物进行混合,并进行定量,得到1个受检DNA样品(对应1个受检者)的PCR产物文库;
(5)对不同的受检者基因组DNA样品采用各自标签的PCR标签引物进行扩增,得到每个受检DNA样品各自的PCR产物文库;
(6)将多个受检者的PCR文库进行等量混合直接建单一SMRTBell文库,在SMRTCell进行PacBio SMRT测序;
(7)基于标签序列区分不同的基因组DNA样品,采用SMRT Portal软件通过识别序列结果中的标签序列,建立各个标签对应样品测序结果的数据,通过生物信息学分析将单个样品测序获得的DNA序列片段比对到参考靶基因上,进行SNVs和Indels提取,排除多态性变异获得该标本靶基因突变信息。
本发明所述第三代测序技术包括但不限于PacBio SMRT测序技术,也可以是其它单分子实时测序技术,例如Oxford Nanopore测序技术。
发明的有益效果
本发明首次实现了长链PCR(Long-range PCR,LR-PCR)技术和PacBio SMRT测序技术结合使用,并且首次将PacBio SMRT测序应用于常染色体显性多囊肾病基因诊断领域的研究。本发明通过设计了一组简化的引物,结合标签引物技术,实现了对多个DNA样品PCR产物的分别标记,扩增的PCR产物不需要打断可以直接建库,建库不需要再进行PCR,使多个样本混合成一个文库通过PacBio RSⅡ测序文库构建环节同时处理,大大简化了实验操作,最终每个样本的检测结果可以通过其独特的标签序列找回,实现多样本平行测序。达到了两种技术的无缝对接,为单基因遗传病基因诊断提供了新的技术方法。
此外,在本发明基于LR-PCR技术靶向扩增PKD1基因方法中,由于PKD1基因的9个LR-PCR扩增片段均为长片段(2kb-5kb),且各片段GC含量均大于60%,普通的PCR反应体系和条件很难成功,而在本发明的优化PCR反应体系和条件下,采用9个PCR反应可以扩增获得PKD1基因全部外显子序列及侧翼内含子序列,与其它目标区域捕获技术(如芯片捕获技术和Ampliseq技术)相比,该方法能有效避免假基因干扰,操作更为简单,成本较低,而且读长超长、准确度高、GC偏向性小,有助于提高致病突变的检出率。该方法提高了PKD1基因高GC含量区域的测序深度,尤其是外显子1的测序深度可以达到600×,而已有的方法都不能有效解决外显子1准确测序的问题。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案,而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1为基因长链PCR(LR-PCR)的扩增结果示意图。琼脂糖凝胶电泳示9个PKD1基因扩增片段,PCR产物为一系列片段大小2kb-5kb的单一条带,其中泳道M为分子量标记物(λ-EcoT14I/Bgl II digest,Takara公司),泳道1-9分别为LR-PCR扩增片段1-9的电泳结果。
图2为SMRTBell文库质检图。该图显示了片段大小的分布,说明SMRTBell文库质检合格。
图3为PKD1基因PacBio SMRT测序的覆盖深度和覆盖率图。显示所有外显子平均覆盖深度达到200×,所有外显子覆盖率为100%。
图4为PKD1基因PacBio SMRT测序的IGV视图。显示PKD1外显子1至外显子46间的区域,所有外显子和所测内含子覆盖率达到100%,并显示高的测序深度,且每个片段测序深度均匀性好。
图5A、图5B、图5C、图5D均为PacBio SMRT测序结果中PKD1突变检测为阳性结果的IGV视图。图5A为c.7103T>A突变的IGV视图;图5B为c.1615C>T突变的IGV视图;图5C为c.8311G>A突变的IGV视图;图5D为c.10277_10278insGTGA突变的IGV视图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。
在本发明的实施例中,采用了LR-PCR靶向扩增联合PacBio SMRT测序的检测方法,该方法以基因组DNA为模板,采用LR-PCR技术靶向扩增PKD1基因目标区域,采用引物标签技术使PCR产物携带样品信息,PCR产物纯化、混合后直接建单一SMRTBell文库,进行PacBio SMRT测序,对测序结果进行生物信息学分析,获得PKD1基因突变信息。
实施例1
基因组DNA提取
采集受检者外周血2ml,置于EDTA抗凝管中。取EDTA抗凝外周血标本0.2ml,按全血DNA提取试剂盒说明书提取DNA。DNA浓度及纯度用Qubit 2.0进行分析,提取的基因组DNA准备做下一步PCR模板用。本次研究共对6个基因DNA样品进行检测,其中4个基因DNA样品存在已知致病突变位点,2个为正常人基因组DNA。
实施例2
LR-PCR扩增
根据PKD1基因序列及其同源假基因序列,设计合成9对PKD1基因特异性引物,采用GeneAmp High Fidelity PCR System进行LR-PCR,共扩增9个大片段序列,分别为1、2、3、4、5、6、7、8和9,引物序列和扩增产物大小如表1所示。采用GeneAmp High FidelityPCR System,设定反应条件在Veriti 96-well Thermal Cycler PCR仪上进行LR-PCR。PCR反应总体积为50μl,包括10×GeneAmp High Fidelity PCR缓冲液5μl,10mmol/LdNTP 2μl,10μmol/L上、下游引物各1μl,5mol/L甜菜碱10μl,DMSO 2.5μl(对片段1扩增时使用5μl),5U/μl聚合酶混合物1μl,20μg/μl DNA模板5μl,超纯水补足至50μl。PCR循环参数:94℃变形3min,94℃10sec,68℃5min,共35个循环,其中第2对和第3对引物退火条件为72℃5min,最后72℃延伸10min。PCR反应在Veriti 96-well Thermal Cycler PCR仪(美国ABI公司)上完成。
表1,扩增PKD1基因的LR-PCR引物
注:F为正向引物(上游引物),R为反向引物(下游引物)。表中的PCR引物序列依次为:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18。
LR-PCR完成后,取5μlPCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。图1显示了9个扩增片段大小和理论值一致,并且目标条带很清晰,没有非特异性扩增,说明选择的LR-PCR反应体系和条件合适。
实施例3
基于引物标签技术的LR-PCR扩增
依据PacBio的标签应用指南(Guidelines for Using PacBio Barcodes for SMRTSequencing),在上述表1的基础上设计非对称标签引物,标签序列参照PacBio提供的16碱基标签(Barcode)序列,通过计算引物间相互作用和分析引物分子二级结构稳定性,设计了6套含Barcode的标签引物,每套9对引物。应用这6套含标签的引物,对6个DNA样品分别进行LR-PCR扩增。对于片段1、2、3这三个扩增反应,因产量较少,采用多管扩增,其它采用单管扩增。
实施例4
PCR产物片段处理
通过割胶纯化回收目标片段,琼脂糖凝胶电泳条件为60V,120min,胶浓度为0.8%,采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技公司)从凝胶中回收PCR产物,最后用30μl洗脱缓冲液洗脱DNA,采用Qubit 2.0荧光光度计进行定量,6个基因组总共54个LR-PCR扩增产物的浓度检测结果如下:
DNA浓度检测(Qubit 2.0)
将纯化的54个PCR产物按等摩尔比进行混合,并采用AgencourtAMPure XP磁珠(美国Beckman Coulter公司)浓缩富集,用Qubit 2.0荧光光度计进行定量。
实施例5
文库构建
文库构建采用PacBio DNA Template Prep Kit 2.0进行制备,具体操作步骤如下:
1.DNA Damage修复反应
1)将所需试剂置于冰上解冻
2)于LoBind离心管中加入下列试剂:
3)将混合体系吹打混匀
4)快速离心机离心
5)37℃孵育20min,然后置于4℃备用
2.末端修复反应
反应体系如下:
1)将混合体系吹打混匀
2)快速离心机离心
3)37℃孵育20min,然后置于4℃备用
3.DNA纯化
1)向上一步所得反应液中加入0.45x的AgencourtAMPurePB磁珠
2)充分混合磁珠和DNA混合溶液
3)快速离心1s收集磁珠
4)在VWR涡旋仪上2000rpm震荡10min,室温
5)快速离心1s收集磁珠
6)将离心管放在磁力架上收集磁珠,至溶液彻底澄清
7)在磁力架上小心吸出上清液转移至另一离心管中,注意不要碰到磁珠
8)用新鲜配制的70%酒精清洗磁珠
9)重复步骤8)
10)弃掉酒精,干燥磁珠
11)检查离心管内是否有残留液滴,若有则重复步骤10)
12)从磁力架上取下离心管,空气干燥30-60s
13)洗脱DNA
a,用30μl Elution Buffer洗脱DNA
b,2000rpm震荡1min彻底重悬磁珠
c,瞬离并将离心管重新置于磁力架上
d,弃掉磁珠
14)运用Qubit 2.0检测DNA浓度
15)运用Bioanalyzer进行定性和定量分析
16)经打断处理后的DNA可以4℃保存24h,或-20℃保存更长时间
4.连接接头(adapter)
通过此步骤,将平末端发夹连接到修复片段末端,反应体系如下:
混匀
混匀
1)将混合体系吹打混匀
2)快速离心机离心
3)25℃孵育15min
4)65℃孵育10min,灭活连接酶,4℃保存备用
5.加入核酸外切酶,孵育
加入核酸外切酶以去除未连接的片段产物,反应体系如下:
1)快速离心机离心
2)37℃孵育1h,4℃保存备用
6.纯化SMRTBell模板
纯化第一次:
1)向核酸外切酶处理过的连接反应液中加入0.45x的AMPure PB珠子
2)充分混合磁珠和DNA混合溶液
3)快速离心1s收集磁珠
4)在VWR涡旋仪上2000rpm震荡10min,室温
5)快速离心1s收集磁珠
6)将离心管放在磁力架上收集磁珠,至溶液彻底澄清
7)在磁力架上小心吸出上清液转移至另一离心管中,注意不要碰到磁珠
8)用新鲜配制的70%酒精清洗磁珠
9)重复步骤8)
10)弃掉酒精,干燥磁珠
11)检查离心管内是否有残留液滴,若有则重复步骤10)
12)从磁力架上取下离心管,空气干燥30-60s
13)用50μl Elution Buffer洗脱DNA,混合均匀后2000rpm离心1min
a,2000rpm震荡1min彻底重悬磁珠
b,瞬离并将离心管重新置于磁力架上
c,弃掉磁珠
14)洗脱后的DNA进入下一步纯化
纯化第二次:
1)向上一步所得反应液中加入22.5μl 0.45x的AMPure PB珠子
2)充分混合磁珠和DNA混合溶液
3)快速离心1s收集磁珠
4)在VWR涡旋仪上2000rpm震荡10min,室温
5)快速离心1s收集磁珠
6)将离心管放在磁力架上收集磁珠,至溶液彻底澄清
7)在磁力架上小心吸出上清液转移至另一离心管中,注意不要碰到磁珠
8)用新鲜配制的70%酒精清洗磁珠
9)重复步骤8)
10)弃掉酒精,干燥磁珠
11)检查离心管内是否有残留液滴,若有则重复步骤10)
12)从磁力架上取下离心管,空气干燥30-60s
13)用100μl Elution Buffer洗脱DNA,混合均匀后2000rpm离心1min
14)Qubit 2.0检测DNA浓度
纯化第三次:
1)向上一步所得反应液中加入45μl 0.45x的AMPure PB珠子
2)充分混合磁珠和DNA混合溶液
3)快速离心1s收集磁珠
4)在VWR涡旋仪上2000rpm震荡10min,室温
5)快速离心1s收集磁珠
6)将离心管放在磁力架上收集磁珠,至溶液彻底澄清
7)在磁力架上小心吸出上清液转移至另一离心管中,注意不要碰到磁珠
8)用新鲜配制的70%酒精清洗磁珠
9)重复步骤8)
10)弃掉酒精,干燥磁珠
11)检查离心管内是否有残留液滴,若有则重复步骤10)
12)从磁力架上取下离心管,空气干燥30-60s
13)用10μl Elution Buffer洗脱DNA,混合均匀后2000rpm离心1min
14)Qubit 2.0检测DNA浓度
15)运用BioAnalyzer进行定性和定量分析,图2为文库质检图,显示片段大小的分布,SMRTBell文库质检合格。
实施例6
引物退火和聚合酶结合
采用DNA/Polymerase Binding Kit 2.0进行SMRTBell模板的引物退火和聚合酶结合。引物80℃预处理后与模板混合,20℃孵育30min后4℃保存。聚合酶结合到SMRTBell模板反应条件为30℃孵育30min。
实施例7
PacBio SMRT测序
将模板-聚合酶复合物转移到96孔板中,采用P6-C4Chemistry试剂盒,加上测序试剂按照PacBio SMRT测序仪说明书进行测序操作。测序仪采用PacBio RS II单分子实时测序系统,其SMRT Cell含有15,000个纳米级的零模波导孔(zero-mode waveguides,ZMWs),每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序,并实时检测插入碱基的荧光信号。
实施例8
结果分析
产出的测序结果是一系列DNA读序(reads),采用SMRT Portal软件通过识别序列结果中的标签序列,建立各个标签对应样品测序结果的数据,同时过滤去除接头序列和低质量数据。通过BWA(Burrows-Wheeler Aligner)将测序读序比对到参照序列上,采用GATK进行SNVs和Indels提取,排除多态性变异后获得该样品PKD1基因突变信息。对比对BAM文件应用Integrative Genomics Viewer(IGV)软件进行比对读序的可视化分析。图3和图4为1例典型的PacBio SMRT测序检测结果。图3显示PKD1基因PacBio SMRT测序的覆盖深度和覆盖率,显示所有外显子平均覆盖深度达到200×,所有外显子覆盖率为100%,富含高GC的1号外显子测序深度达到600×。图4显示PKD1基因PacBio SMRT测序的IGV视图,显示PKD1外显子1至外显子46间的区域,所有外显子和所测内含子覆盖率达到100%,并显示高的测序深度,且每个片段测序深度均匀性好。
通过本发明检测了6例多囊肾患者,发现了4例PKD1突变检测阳性患者,图5显示这4例PKD1突变检测阳性结果,A为c.7103T>A突变;B为c.1615C>T突变;C为c.8311G>A突变;D为c.10277_10278insGTGA突变。得到的PKD1基因突变结果与Sanger测序的结果是一致的,说明本发明的方法是可行的。
Claims (9)
1.用于PCR特异性扩增检测PKD1基因突变的引物组,该组PCR引物共9对,分别如下:
用于扩增PKD1基因外显子1和内含子1的引物,其正向引物如SEQ ID NO:1所示,反向引物如SEQ ID NO:2所示;
用于扩增PKD1基因内含子1到外显子8的引物,其正向引物如SEQ ID NO:3所示,反向引物如SEQ ID NO:4所示;
用于扩增PKD1基因外显子7到外显子13的引物,其正向引物如SEQ ID NO:5所示,反向引物如SEQ ID NO:6所示;
用于扩增PKD1基因内含子12到外显子15的引物,其正向引物如SEQ ID NO:7所示,反向引物如SEQ ID NO:8所示;
用于扩增PKD1基因外显子15到内含子21的引物,其正向引物如SEQ ID NO:9所示,反向引物如SEQ ID NO:10所示;
用于扩增PKD1基因内含子21到内含子26的引物,其正向引物如SEQ ID NO:11所示,反向引物如SEQ ID NO:12所示;
用于扩增PKD1基因内含子26到内含子34的引物,其正向引物如SEQ ID NO:13所示,反向引物如SEQ ID NO:14所示;
用于扩增PKD1基因内含子34到内含子41的引物,其正向引物如SEQ ID NO:15所示,反向引物如SEQ ID NO:16所示;
用于扩增PKD1基因内含子39到外显子46的引物,其正向引物如SEQ ID NO:17所示,反向引物如SEQ ID NO:18所示。
2.用于PCR特异性扩增检测PKD1基因突变的试剂盒,包含权利要求1的引物组中的一对或多对引物。
3.权利要求2的试剂盒,还包含以下一种或多种试剂:
用于从样品提取基因组DNA的试剂;
利用所述引物进行长片段PCR反应的试剂;
用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂;优选其中所述利用所述引物进行长片段PCR反应的试剂DNA聚合酶、缓冲液和dNTP混合物。
4.权利要求3的试剂盒,包含下述试剂:
(1)PCR引物选自权利要求1的引物组中所包含的任何一对或多对引物;
(2)10×GeneAmp High Fidelity PCR缓冲液;
(3)10mmol/LdNTP;
(4)5mol/L甜菜碱;
(5)5U/μl聚合酶混合物。
5.根据权利要求4的试剂盒,特征在于:在总体积为50μl的PCR反应体系中含有下述组分:每种PCR引物各1μl,引物的浓度为10μmol/L;10×GeneAmp High Fidelity PCR缓冲液5μl,10mmol/LdNTP 2μl,10μmol/L上、反向引物各1μl,5mol/L甜菜碱10μl,DMSO 2.5μl(对片段1扩增时使用5μl),5U/μl聚合酶混合物1μl,20μg/μl DNA模板5μl。
6.权利要求1-5所述的PCR引物组或试剂盒在检测PKD1基因突变中的用途。
7.一种用于非诊断目的的体外检测PKD1基因突变的方法,包括以下步骤:
(1)采集受检者标本,如外周血,提取基因组DNA;
(2)应用基因组DNA作为模板,使用权利要求1的引物组,在适于扩增目的核酸的条件下,采用长链PCR技术对PKD1进行靶向扩增,其中每一对标签引物由正向标签引物和反向标签引物构成,其中正向标签引物和反向标签引物所包含的标签可以相同或者不同;同一DNA样品所用每对标签引物(共9对)使用相同的标签,不同DNA样品所用标签引物中的标签彼此不同,以区分不同DNA样品的扩增产物;
(3)对扩增的9个长片段产物,进行纯化回收;
(4)将纯化的9个PCR产物进行混合,得到1个受检者的PCR产物文库;
(5)将多个受检者的PCR产物文库进行等量混合直接构建单一SMRTBell文库,在SMRT Cell上进行PacBio SMRT测序,获得长片段PCR产物的序列;
(6)基于标签序列区分不同的基因组DNA样品,采用SMRT Portal软件通过识别序列结果中的标签序列,建立各个标签对应DNA样品测序结果的数据,通过生物信息学分析将单个样品测序获得的DNA序列片段比对到参考PKD1基因上,进行SNVs和Indels提取,排除多态性变异获得该标本PKD1基因突变信息。
8.权利要求7所述的检测PKD1基因突变的方法,特征在于:包括下述步骤:
(1)从受检标本中提取基因组DNA;
(2)应用基因组DNA作为模板,选取靶基因并设计9对PCR标签引物,采用LR-PCR技术对靶基因进行靶向扩增,PCR反应体系包含0.5M甜菜碱,PCR反应条件采用2步法PCR;
(3)对扩增的9个长片段产物,进行纯化回收;
(4)将纯化的9个PCR产物进行混合,并进行定量,得到1个受检DNA样品(对应1个受检者)的PCR产物文库;
(5)对不同的受检者基因组DNA样品采用各自标签的PCR标签引物进行扩增,得到每个受检DNA样品各自的PCR产物文库;
(6)将多个受检者的PCR文库进行等量混合直接建单一SMRTBell文库,在SMRTCell进行PacBio SMRT测序;
(7)基于标签序列区分不同的基因组DNA样品,采用SMRT Portal软件通过识别序列结果中的标签序列,建立各个标签对应样品测序结果的数据,通过生物信息学分析将单个样品测序获得的DNA序列片段比对到参考靶基因上,进行SNVs和Indels提取,排除多态性变异获得该标本靶基因突变信息。
9.权利要求1-5所述的PCR引物组或试剂盒在常染色体显性多囊肾病基因诊断中的用途。
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