CN111455023A - 适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、引物及测序方法 - Google Patents
适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、引物及测序方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、引物及基于该建库方法的全长扩增子测序方法。本发明针对全长扩增子测序需要进行PCR的特性，结合PacBio测序平台的哑铃型文库接头结构，设计了具有通用结合序列的扩增子引物、具有与通用结合序列匹配的哑铃型引物，并基于这两种特殊结构的引物提出一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，通过该方法建库，仅需在进行常规扩增后增加2个循环的环形引物扩增，即可实现测序接头的添加，同时，通过损伤修复酶的作用，使PCR产物成为适用于PacBio测序平台的标准文库。该方法将原有的PacBio标准建库流程优化为仅需一步扩增与修复，极大的简化了全长扩增子的文库构建流程，显著降低了测序成本。
Description
技术领域
本发明涉及高通量测序文库构建技术领域，更具体地，涉及一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、引物及基于该建库方法的全长扩增子测序方法。
背景技术
扩增子为DNA或RNA扩增后的一段核苷酸序列，比如通过PCR扩增得到的某个基因的扩增片段。更简单地说，扩增子是经过人工扩增的DNA片段或RNA片段的扩增产物。扩增子测序是一种高靶向性方法，用于分析特定基因组区域中的基因变异。
扩增子测序主要包括16S rDNA测序、18S rDNA测序、ITS测序及目标区域扩增子测序等。16S/18S rDNA包含可变区和保守区，原核微生物的16S rDNA基因长度约为1500bp，真核微生物18S rDNA基因长度约为1500-2000bp。保守区在菌种间差异不大，可反映物种间的亲缘关系，高变区具有属或种的特异性，根据物种亲缘关系不同而有一定的差异。因此16S/18S rDNA成为了国际公认的微生物系统发育和分类鉴定的指标。ITSl是位于真核生物的18S rRNA和5.8SrRNA之间的内转录区域，ITS2位于真核生物的5.8S rRNA和28S rRNA之间的内转录区域。由于进化相对于18S rRNA、5.8S rRNA和28SrRNA迅速而具多态性，因而适合于等级水平较低的系统学研宄。根据保守区序列设计引物，将其扩增出来进行测序，通过测序数据与相应数据库的比对，即可确定微生物在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的真菌种类，是目前非常常见的分析真菌方法。
传统16S/18S扩增子测序仅针对16S/18S rDNA的单个或连续的两到三个可变区进行测序与分析，而基于三代测序平台PacBio的全长16S/18S扩增子测序可轻松读取微生物16S/18S rDNA全长序列，突破了二代测序读长较短的局限性，提高了菌株在种水平的分辨能力，真正精确到“种”的分类鉴定。全长扩增子测序获得全部变异区域序列信息不仅能提高物种鉴定的分辨率，还能提高样本中微生物组成鉴定的精确度，从而更加真实的还原样本中微生物的群落结构。
微生物核糖体小亚基SSU rRNA可变区的测序分析方法被广泛应用于环境微生物多样的研究，16S rRNA基因、18S rRNA基因和ITS基因也是进行系统发育和分类研究时最常用的分子标记物。近年来，随着高通量测序技术及数据分析方法的不断进步，大量基于扩增子测序技术的研究在微生物生态学中得到了迅速的发展。但限于Illumina平台的短片段测序长度的限制，基于该平台对部分高变区的测序分析很难将物种精确鉴定到属以下的分类水平。
基于PacBio SMRT单分子测序技术的超长读长优势，开发了覆盖全长核糖体小亚基16S rRNA基因、18S rRNA基因和ITS基因的高通量测序分析技术，解决了Illumina平台短读长的只能针对部分可变区进行分析的技术难题，在最优成本的基础上，实现了菌群分类的精准鉴定。与此同时，基于CCS Reads的原始错误矫正，可获取精确度在99％以上的全长序列。16SrDNA是编码细菌核糖体小亚基的DNA序列，分子大小约1540bp，由9个可变区和10个保守区交叉排列组成。保守区能反映物种间亲缘关系，可变区在不同菌种间存在差异。根据保守区序列设计引物，将可变区扩增出来进行测序，通过测序数据与相应数据库的比对，即可确定微生物在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的细菌种类。研宄表明，V4靶基因区域(约300bp)对微生物进行分类较为准确。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、引物及基于该建库方法的全长扩增子测序方法，本发明的建库方法将原有的PacBio标准建库流程优化为仅需一步扩增与修复，极大的简化了全长扩增子的文库构建流程，提升了工作效率，降低了测序成本。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一个目的是提出一种用于PacBio平台的全长扩增子文库构建的引物，包括针对单个待测样本设计的：
(1)上游引物，所述上游引物包括按照5’至3’的方向依次排列的F端通用结合序列、上游标签序列、F端通用引物；
(2)下游引物，所述下游引物包括按照5’至3’的方向依次排列的R端通用结合序列、下游标签序列、R端通用引物；
(3)哑铃型引物，所述哑铃型引物包括3’端的单链结合序列和5’端哑铃型颈环结构的接头序列，所述单链结合序列与R端通用结合序列反向互补；所述哑铃型颈环结构的接头序列与PacBio测序仪适配；
所述F端通用结合序列与R端通用结合序列反向互补；上游标签序列与下游标签序列反向互补；F端通用引物与扩增子的目的片段F端结合，R端通用引物与扩增子的目的片段R端结合。
进一步地，所述上游标签序列、下游标签序列用于区分不同的扩增子样本，每个标签为10～30bp的特异核苷酸序列。
本发明的第二个目的是提出一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，包括以下步骤：
(1)以上述任一项的上游引物、下游引物分别扩增对应样本全长目标片段；各个样本对应引物的标签序列各不相同；各个样本对应引物的F端通用结合序列相同、R端通用结合序列相同，各个样本对应引物的F端通用引物相同、R端通用引物相同；
(2)将步骤(1)获取的若干个样本的扩增产物混样；
(3)混合扩增产物以上述任一项的哑铃型引物进行环形引物扩增获得测序接头连接产物；环形引物扩增反应所使用的聚合酶具有5’→3’聚合酶活性而不具有5’→3’外切酶活性；
(4)测序接头连接产物损伤修复获得获得适用于PacBio测序平台的全长扩增子文库。
进一步地，步骤(2)中若干个样本的扩增产物等摩尔混样。
进一步地，步骤(2)中混合扩增产物总量大于或等于1μg。
进一步地，环形引物扩增反应所使用的聚合酶为DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段。
进一步地，所述方法还包括文库质检以确定文库大小。
本发明的三个目的是提出一种适用于PacBio平台的全长扩增子测序方法，包括采用上述任一项所述的建库方法进行全长扩增子建库，然后采用高通量PacBio测序平台进行测序的建库方法进行全长扩增子建库，然后采用高通量PacBio测序平台进行测序。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明针对全长扩增子测序需要进行PCR的特性，结合PacBio测序平台的哑铃型文库接头结构，设计了具有通用结合序列的扩增子引物、具有与通用结合序列匹配的哑铃型引物，并基于这两种特殊结构的引物提出一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法。通过该方法建库，仅需在进行常规扩增后增加2个循环的环形引物扩增，即可实现测序接头的添加，同时，通过损伤修复酶的作用，使PCR产物成为适用于PacBio测序平台的标准文库。该方法将原有的PacBio标准建库流程优化为仅需一步扩增与修复，极大的简化了全长扩增子的文库构建流程。
(2)本发明的建库方法仅需要3个小时即可完成文库的构建，原官方流程建库需要10个小时左右，极大的提高了建库效率。
(3)本发明的建库方法成本在100元以内即可实现文库的构建，使用官方流程进行建库，成本在1000元以上，极大的节约成本。
附图说明
图1为适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法流程图。
图2为全长扩增子通用引物结构示意图。
图3为本专利哑铃型引物结构示意图。
图4为构建的适用于PacBio平台的16S全长扩增子文库检测结果示意图。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
全长扩增子测序主要包括针对细菌样本的16S全长测序、针对真菌样本的18S全长测序、针对真核生物的ITS全长测序及目标区域扩增子测序等。本发明的建库方法针对全长扩增子测序需要进行PCR的特性，结合PacBio测序平台的哑铃型文库接头结构，设计了具有通用结合序列的扩增子引物、具有与通用结合序列匹配的哑铃型引物，并基于这两种特殊结构的引物提出一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，通过该方法建库，仅需在进行常规扩增后增加2个循环的环形引物扩增，即可实现测序接头的添加，同时，通过损伤修复酶的作用，使PCR产物成为适用于PacBio测序平台的标准文库。其技术流程如图1所示。
针对单个样本，本专利的全长扩增子引物包括上、下游引物和哑铃型引物，每条上、下游引物包括按照5’至3’的方向依次排列的通用结合序列、标签序列、通用引物，其结构示意图见图2。其中5’端的通用结合序列提供哑铃型引物扩增时的结合位点，上游通用结合序列与下游通用结合序列反向互补；中间部分的barcode标签序列，用于区分不同的扩增子样本，该标签序列为10～30bp的特异核苷酸序列，针对多个样本混样时，需确保每个样本对应的标签序列是唯一无重复的，同一对引物的标签序列反向互补；3’端的通用引物序列可以与扩增子的目的片段结合，扩增获得全长扩增子的目的片段。
本专利的哑铃型测序接头包括3’端的单链结合序列和5’端哑铃型颈环结构的接头序列，其结构见图3。其中单链结合序列提供哑铃型引物扩增时的结合位点；所述哑铃型颈环结构的接头序列与PacBio测序仪适配。
实施例1：
针对全长16S全长测序，一个实施例的具体操作流程如下：
一、扩增各个样本全长目标片段
1、人工合成带barcode标签序列与通用结合序列的PCR通用引物
针对8个全长16S的DNA样本(来源于土壤样本)，共合成了16条PCR引物，它们的DNA序列如下：
SEQ ID No.1，27F-1-T：aagcagtggtatcaacgcgtacatatgcgtctgtgrgttygatymtggctcag
SEQ ID No.2，27F-2-T：aagcagtggtatcaacgcgagactagagatagtggrgttygatymtggctcag
SEQ ID No.3，27F-3-T：aagcagtggtatcaacgctacgcgtgtacgcagagrgttygatymtggctcag
SEQ ID No.4，27F-4-T：aagcagtggtatcaacgctgtcactcatctgagtgrgttygatymtggctcag
SEQ ID No.5，27F-5-T：aagcagtggtatcaacgcgcacatacacgctcacgrgttygatymtggctcag
SEQ ID No.6，27F-6-T：aagcagtggtatcaacgcgctcgtcgcgcgcacagrgttygatymtggctcag
SEQ ID No.7，27F-7-T：aagcagtggtatcaacgcacagtgcgctgtctatgrgttygatymtggctcag
SEQ ID No.8，27F-8-T：aagcagtggtatcaacgctcacactctagagcgagrgttygatymtggctcag
SEQ ID No.9，1492R-1-T：gcgttgataccactgcttacagacgcatatgtacrgytaccttgttacgactt
SEQ ID No.10，1492R-2-T：gcgttgataccactgcttcactatctctagtctcrgytaccttgttacgactt
SEQ ID No.11，1492R-3-T：gcgttgataccactgctttctgcgtacacgcgtargytaccttgttacgactt
SEQ ID No.12，1492R-4-T：gcgttgataccactgcttactcagatgagtgacargytaccttgttacgactt
SEQ ID No.13，1492R-5-T：gcgttgataccactgcttgtgagcgtgtatgtgcrgytaccttgttacgactt
SEQ ID No.14，1492R-6-T：gcgttgataccactgctttgtgcgcgcgacgagcrgytaccttgttacgactt
SEQ ID No.15，1492R-7-T：gcgttgataccactgcttatagacagcgcactgtrgytaccttgttacgactt
SEQ ID No.16，1492R-8-T：gcgttgataccactgctttcgctctagagtgtgargytaccttgttacgactt
其中，引物的前18bp为通用结合序列，本次实施例F端使用的为aagcagtggtatcaacgc，R端使用的为gcgttgataccactgctt，F端与R端反向互补，该序列可以替换为其余的通用结合引物；位于27F命名的引物的末端19bp碱基为全长16S扩增的F端通用引物，序列为grgttygatymtggctcag，位于1492R命名的引物的末端19bp碱基为全长16S扩增的R端通用引物，序列为rgytaccttgttacgactt；中间的16bp为barcode标签序列。
设计好的引物可以在引物合成公司进行合成，如上海生工等。
2、PCR扩增各个样本全长目标片段
使用本专利设计的引物分别对各个样本全长扩增子进行扩增。每个样本使用一对相同编号引物，如样本1使用27F-1-T与1492R-1-T引物。反应体系如表1所示：
表1
按照表1的反应体系将试剂充分混匀，瞬时离心，按照如下的PCR条件进行PCR扩增；
反应完成后，按照AMPure磁珠的使用说明进行磁珠纯化，最后使用11μL洗脱缓冲液，洗脱。
取1μL纯化产物，使用无核酸酶水稀释10倍，取2μL稀释液进行Qubit定量，确定PCR产物的浓度与总量；取1μL稀释液进行安捷伦2100检测，确定片段的大小分布。
二、8个样本的扩增产物混样
1、根据Qubit定量结果与安捷伦2100检测结果，按照期望的数据产出进行等比例的混样(按照每个样本要求的数据产出比例混样，如A要求2G，B要求1G，混样时A与B就按照2:1的摩尔数比例混样，一般要求每个样本数据产出一样，取等摩尔数的扩增产物进行混样)，要求混样后的总量在1ug以上。
2、涡旋混匀，瞬时离心，获得混样的全长扩增子样本。本实施例满足混样的各样本均带有不同的barcode标签序列的要求。
三、哑铃型扩增引物的两轮扩增
本步骤进行扩增的聚合酶要求具有5’→3’聚合酶活性，使DNA只能沿着5’→3’方向合成；同时要求该聚合酶没有5’→3’外切酶活性，确保聚合酶合成至哑铃型引物的双链处即终止，不会进行外切或链置换。本实施例中以DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段为本步骤扩增反应的聚合酶。
两轮哑铃型引物扩增反应体系如表2：
表2
16S全长扩增子使用的哑铃型引物SMRT-Primer序列如SEQ ID No.17：
5’-atctctctcaacaacaacaacggaggaggaggaaaagagagagataagcagtggtatcaacgc-3’
其中，前45bp为与PacBio测序平台适配的接头序列，添加后可以直接进行后续的测序，后18bp为通用结合引物的F端序列(aagcagtggtatcaacgc)，其结果见图3。
按表2所示反应体系将各试剂混匀，瞬时离心，按照如下的PCR条件进行PCR扩增；
反应完成后，按照AMPure磁珠的使用说明进行磁珠纯化，最后使用50μL洗脱缓冲液洗脱，获得的PCR产物两端已经添加上了哑铃型的环状结构。
四、损伤修复获得适用于PacBio测序平台的全长扩增子文库
通过PCR获得的哑铃型文库在连接处存在单链缺口，需要使用损伤修复酶进行进一步修复，获得完整的双链结构。同时，PCR扩增与酶反应存在一定的效率问题，需要使用外切酶III和外切酶VII将结构不完整的文库消化掉。具体实施例的操作流程如下：
1、损伤修复
表3损伤修复反应体系
按表3所示反应体系将各试剂混匀，瞬时离心，20℃孵育30min，置于冰上。2、外切酶消化
表4外切酶消化反应体系
按表4所示反应体系将各试剂混匀，瞬时离心，37℃孵育60min，置于冰上。
3、反应完成后，按照AMPure磁珠的使用说明进行磁珠纯化，最后使用20μL洗脱缓冲液洗脱，获得的适用于PacBio测序平台的哑铃型的环状文库。
五、文库质检与上机测序
取1μL文库进行Qubit定量，获得文库浓度，文库浓度为9ng/uL；取3μL文库进行凝胶电泳检测，确定文库大小，电泳检测大小在1.7k左右。16S全长扩增子实施例的文库进行凝胶电泳分析，结果如图4所示，从图中可以看出，PCR扩增出来的DNA目的条带长度与目的基因的大小一致，文库大小也与目的基因大小相符，说明制备的文库合格。
由实施例获得的16S全长扩增子文库在PacBio Sequel II测序平台上进行混合测序，每个样本获得了5000条以上的环形一致性序列，说明文库质量合格且可获得符合测序要求的数据。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于原核微生物的16S rDNA全长扩增子的建库及测序，还包括真核微生物18SrDNA全长扩增子的建库及测序、真核生物的ITS建库及测序、目标区域扩增子建库及测序，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉菲沙基因信息有限公司
<120> 适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、引物及测序方法
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<400> 17
atctctctca acaacaacaa cggaggagga ggaaaagaga gagataagca gtggtatcaa 60
cgc 63
Claims (8)
1.一种用于PacBio平台的全长扩增子文库构建的引物，其特征在于，包括针对单个待测样本设计的：
(1)上游引物，所述上游引物包括按照5’至3’的方向依次排列的F端通用结合序列、上游标签序列、F端通用引物；
(2)下游引物，所述下游引物包括按照5’至3’的方向依次排列的R端通用结合序列、下游标签序列、R端通用引物；
(3)哑铃型引物，所述哑铃型引物包括3’端的单链结合序列和5’端哑铃型颈环结构的接头序列，所述单链结合序列与R端通用结合序列反向互补；所述哑铃型颈环结构的接头序列与PacBio测序仪适配；
所述F端通用结合序列与R端通用结合序列反向互补；上游标签序列与下游标签序列反向互补；F端通用引物与扩增子的目的片段F端结合，R端通用引物与扩增子的目的片段R端结合。
2.根据权利要求1所述的一种用于PacBio平台的全长扩增子文库构建的引物，其特征在于，所述上游标签序列、下游标签序列用于区分不同的扩增子样本，每个标签为10～30bp的特异核苷酸序列。
3.一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以权利要求1-2任一项的上游引物、下游引物分别扩增对应样本全长目标片段；各个样本对应引物的标签序列各不相同；各个样本对应引物的F端通用结合序列相同、R端通用结合序列相同，各个样本对应引物的F端通用引物相同、R端通用引物相同；
(2)将步骤(1)获取的若干个样本的扩增产物混样；
(3)混合扩增产物以权利要求1-2任一项的哑铃型引物进行环形引物扩增获得测序接头连接产物；环形引物扩增反应所使用的聚合酶具有5’→3’聚合酶活性而不具有5’→3’外切酶活性；
(4)测序接头连接产物损伤修复获得获得适用于PacBio测序平台的全长扩增子文库。
4.根据权利要求3所述的一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，其特征在于，步骤(2)中若干个样本的扩增产物等摩尔混样。
5.根据权利要求3所述的一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，其特征在于，步骤(2)中混合扩增产物总量大于或等于1μg。
6.根据权利要求3所述的一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，其特征在于，环形引物扩增反应所使用的聚合酶为DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段。
7.根据权利要求3所述的一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，其特征在于，所述方法还包括文库质检以确定文库大小。
8.一种适用于PacBio平台的全长扩增子测序方法，其特征在于，包括采用权利要求3-7任一项所述的建库方法进行全长扩增子建库，然后采用高通量PacBio测序平台进行测序。
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