CN117487943B - 一种基因片段在鉴定副干酪乳酪杆菌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基因片段在鉴定副干酪乳酪杆菌中的应用。本发明提供了一种基因片段在鉴定副干酪乳酪杆菌中的应用，所述基因片段具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本发明提供的引物对和鉴定方法，克服了现有方法中16S rDNA序列同源性进行分析分辨率不足的弊端，充分利用了副干酪乳酪杆菌物种的特有保守基因序列，建立了一种简单、快速的鉴定方法，无需复杂的仪器，适合在产业大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基因片段在鉴定副干酪乳酪杆菌中的应用。
背景技术
副干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）是一种革兰氏阳性、不运动、无芽孢、兼性厌氧、同型发酵乳酸菌，广泛存在于人体胃肠道及发酵的乳制品等食品中。益生菌的菌种分类学地位可结合形态学观察、生理生化特征分析和分子生物学技术等多相鉴定技术体系进行确定。其中分子鉴定技术主要包括：16S rRNA基因或/和持家基因测序分析、全基因组测序（WGS，Whole Genome Sequencing）平均核苷酸一致性（ANI）分析、特异性PCR技术等。其中，采用16S rRNA对原核微生物进行鉴定应用最为广泛，但该技术对于副干酪乳酪杆菌、布氏迟缓乳杆菌、干酪乳酪杆菌等亲缘关系较近的菌种鉴定分辨率有限，只能鉴定至“属水平”，“种水平”鉴定需进一步结合持家基因序列进行分析。基于全基因组测序数据解析的平均核苷酸一致性ANI分析和数字化DNA-DNA杂交技术可有效用于益生菌“种水平”的精准鉴定，但检测成本较高且周期较长。
基于菌种特异性基因片段设计引物开发的特异性PCR技术，可实现混合产品中目标菌种的靶向鉴定检测，具有操作方便、成本低廉、快速灵敏等优势，在菌种靶向鉴定和生产过程一致性控制中有广阔应用前景。中国专利申请CN116926214A公开了一种基于聚合酶螺旋扩增技术的副干酪乳酪杆菌检测引物、试剂盒及方法。本发明通过选择目标菌株pheS基因的特异性序列的保守区域，设计了具有高特异性的一套引物，建立了针对pheS基因聚合酶螺旋扩增的反应体系。中国专利申请CN113999925A公开了一种引物组合及其用于检测乳制品中副干酪乳杆菌的应用，该引物组合是基于gyrB基因，通过建立副干酪乳杆菌属的系统发育树，分析副干酪乳杆菌菌种特征，设计特异性引物组合；将所设计引物组合应用于实时荧光定量环介导等温扩增(qLAMP)技术，实现对乳制品中副干酪乳杆菌的检测。
目前本领域需要更多基于PCR的副干酪乳酪杆菌的菌种靶向鉴定方法。
发明内容
为了实现上述技术目的，本发明提供了如下技术方案：
在一个方面，本发明提供了一种基因片段在鉴定副干酪乳酪杆菌中的应用，所述基因片段具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 1：
atgtcaatttctcgcgaacaggaatttaaaacaactttaacaaagactgattttctagcgattctcaatcagtttgattttgagccgggcttcagtcaaatgaatacctattacgatacaccgactggcgccgtcaaaaaggcaggcctaggcttgcgcattcgtcagtttaaagatcgtgcggaacaaaccttaaaagttcctaataagaatcaacatcgtgatttggaagaaattaccgatccgctgacttcagttgaagcccgctccttgattgaccaagggcaacttaaaaccggtcaagtcacaacggcactagcagcccgtgaaattgaccccgcagcggttcatccgcaaacccaagcaaaaacgacccgcagtgtagcgcatcttaaagcaggtttgttgacactcgatcagactttttacatggacaacacctctgattttgagttggaaatggagtaccatgacctgccacaagctcaagttttctacgatactttgttgcaccaattcaacattgaaaaacggccggttatcaacaaagttcagcgcgcattcatgcatgtgcacgattcacaagctgattaa。
在另一个方面，本发明提供了一种基因片段在制备鉴定副干酪乳酪杆菌的引物中的应用，所述基因片段具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
在又一个方面，本发明提供了一种用于鉴定副干酪乳酪杆菌的引物对，所述引物对包括：
核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示的下游引物。
在一些实施方案中，所述引物对还可以包括第二引物对：核苷酸序列如SEQ IDNO: 8所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO: 9所示的下游引物。
所述引物对可扩增如SEQ ID NO: 1所示的基因片段。
在又一个方面，本发明提供了一种扩增核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的基因片段的引物对，所述引物对包括：
核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示的下游引物。
在一些实施方案中，所述引物对还可以包括第二引物对：核苷酸序列如SEQ IDNO: 8所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO: 9所示的下游引物。
在又一个方面，一种用于鉴定副干酪乳酪杆菌的检测试剂，所述检测试剂包含前述引物对。
在一些实施方案中，所述检测试剂还包含至少以下一种：
dNTPs；DNA聚合酶，优选高保真酶；反应溶剂，例如无菌水、蒸馏水等；缓冲液。
在又一个方面，本发明提供了一种用于鉴定副干酪乳酪杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括前述任一引物对或前述任一检测试剂。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含以下至少一种：
扩增模板、阳性质控品或阴性质控品。
在又一个方面，本发明提供了前述任一引物对、检测试剂或试剂盒在鉴定副干酪乳酪杆菌中的应用。
在又一个方面，本发明提供了前述任一引物对、检测试剂或试剂盒在确定核苷酸序列如SEQ ID NO: 1的基因片段中的应用。
在又一个方面，本发明提供扩增核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的基因片段的引物对在鉴定副干酪乳酪杆菌中的应用。
在一些实施方案中，所述引物对包括，但不限于：
核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示的下游引物。
在一些实施方案中，所述引物对还可以包括：核苷酸序列如SEQ ID NO: 8所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO: 9所示的下游引物。
在又一个方面，本发明提供了一种用于非诊断目的的鉴定副干酪乳酪杆菌的方法，所述方法包括：
1）释放待测样本的核酸；
2）采用前述任一引物对、检测试剂或试剂盒进行PCR扩增，得到扩增产物；
3）对所述扩增产物进行电泳检测，判读结果。
在一些实施方案中，所述待测样本不来自有生命的人体或动物体。
在一些实施方案中，步骤3）中所述判读结果包括：
（1）在凝胶成像设备下观察扩增产物的条带大小，
若在380-400 bp处出现条带，则待测样品包含副干酪乳酪杆菌、或待测样品为副干酪乳酪杆菌；
若扩增后无条带、在380-400 bp处无条带，则待测样品不包含副干酪乳酪杆菌、或待测样品不属于副干酪乳酪杆菌；或
（2）采用一代、二代或三代测序确定扩增产物的片段长度；
若所述扩增产物的片段长度为394 bp，则待测样品包含副干酪乳酪杆菌、或待测样品为副干酪乳酪杆菌；
若所述扩增产物的片段长度不为394 bp，则待测样品不包含副干酪乳酪杆菌、或待测样品不属于副干酪乳酪杆菌。
在一些实施方案中，步骤3）中所述判读结果包括：
在凝胶成像设备下观察扩增产物的条带大小，
若在380 bp、381 bp、382 bp、383 bp、384 bp、385 bp、386 bp、387 bp、388 bp、389 bp、390 bp、391 bp、392 bp、393 bp、394 bp、395 bp、396 bp、397 bp、398 bp、399 bp、400 bp处出现条带，则待测样品包含副干酪乳酪杆菌、或待测样品为副干酪乳酪杆菌；
若扩增后无条带、在380 bp、381 bp、382 bp、383 bp、384 bp、385 bp、386 bp、387bp、388 bp、389 bp、390 bp、391 bp、392 bp、393 bp、394 bp、395 bp、396 bp、397 bp、398bp、399 bp、400 bp无条带，则待测样品不包含副干酪乳酪杆菌、或待测样品不属于副干酪乳酪杆菌。
在一些优选的实施方案中，步骤3）中所述判读结果包括：
在凝胶成像设备下观察扩增产物的条带大小，
若在394 bp处出现条带，则待测样品包含副干酪乳酪杆菌、或待测样品为副干酪乳酪杆菌；
若扩增后无条带、在394 bp处无条带，则待测样品不包含副干酪乳酪杆菌、或待测样品不属于副干酪乳酪杆菌。
本发明首次发现了编码保守蛋白（CYTH domain-containing protein）的基因片段在鉴定副干酪乳酪杆菌中的应用，并据此设计了一系列引物对，所述引物对副干酪乳酪杆菌“种”水平上扩增效率高且具有良好的特异性和包容性。本发明提供的引物对和鉴定方法，克服了现有方法中16S rDNA序列同源性进行分析分辨率不足的弊端，充分利用了副干酪乳酪杆菌物种的特有保守基因序列，建立了一种简单、快速的鉴定方法，无需复杂的仪器，适合在产业大规模推广应用。
本发明的副干酪乳酪杆菌207-27公开于CN115998777A，其保藏编号为GDMCC No.60960。具体生物保藏信息可参见CN115998777A。
附图说明
图1为第一引物对：引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3包容性扩增验证电泳图。其中M为DNA Marker，1为207-27，2为CICC 6263T，3为CICC 6264T，4为CICC 6110，5为CICC22165，6为CICC 20241，7为CICC 20296，8为CICC 22829，9为CICC 22830，10为CICC 20245，11为CICC 24825，12为CICC 24700，13为CICC 6138，14为CICC 6028，15为CICC 6227，16为CICC 20266，17为CICC 22709，18为CICC 23466，19为CICC 10042R，20为CICC 10043R，21为CICC 10044R，22为CICC 10045R，23为CICC 10047R，24为CICC 10048R，25为CICC 10151R，CK为空白。
图2为第二引物对：引物SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9包容性扩增验证电泳图。其中M为DNA Marker，1为207-27，2为CICC 6263T，3为CICC 6264T，4为CICC 6110，5为CICC22165，6为CICC 20241，7为CICC 20296，8为CICC 22829，9为CICC 22830，10为CICC 20245，11为CICC 24825，12为CICC 24700，13为CICC 6138，14为CICC 6028，15为CICC 6227，16为CICC 20266，17为CICC 22709，18为CICC 23466，19为CICC 10042R，20为CICC 10043R，21为CICC 10044R，22为CICC 10045R，23为CICC 10047R，24为CICC 10048R，25为CICC 10151R，CK为空白。
图3为第一引物对：引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3排他性扩增验证电泳图。其中M为DNA Marker，1为CICC 6117T，2为CICC 6224T，3为CICC 6081T，4为JCM 1185T，5为CICC6103T，6为CGMCC 1.2625T，7为CICC 24878T，8为CICC 24208T，9为CICC 6252T，10为CGMCC1.3402T，11为CICC 24209T，12为CICC 6132T，13为CICC 6240T，14为CGMCC 1.1881T，15为JCM1096T，16为CICC 6245T，17为CICC 6070T，18为CICC 6250T，19为CICC 24210T，20为CICC6071T，21为CICC 6079T，22为CICC 6186T，23为CICC 6069T，24为CICC 6222T，25为CGMCC1.1936T，26为CGMCC 1.3992T，27为CGMCC 1.2231T，28为CGMCC 1.2230T，29为CGMCC1.2138T，30为CGMCC 1.2503T，31为CGMCC 1.2696T，32为CGMCC 1.2695T，33为CGMCC1.2009T，34为CCUG 33636T，35为JCM 2418T，36为CCUG 15605T，CK为空白。
图4为第二引物对：引物SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9排他性扩增验证电泳图。其中M为DNA Marker，1为CICC 6117T，2为CICC 6224T，3为CICC 6081T，4为JCM 1185T，5为CICC6103T，6为CGMCC 1.2625T，7为CICC 24878T，8为CICC 24208T，9为CICC 6252T，10为CGMCC1.3402T，11为CICC 24209T，12为CICC 6132T，13为CICC 6240T，14为CGMCC 1.1881T，15为JCM1096T，16为CICC 6245T，17为CICC 6070T，18为CICC 6250T，19为CICC 24210T，20为CICC6071T，21为CICC 6079T，22为CICC 6186T，23为CICC 6069T，24为CICC 6222T，25为CGMCC1.1936T，26为CGMCC 1.3992T，27为CGMCC 1.2231T，28为CGMCC 1.2230T，29为CGMCC1.2138T，30为CGMCC 1.2503T，31为CGMCC 1.2696T，32为CGMCC 1.2695T，33为CGMCC1.2009T，34为CCUG 33636T，35为JCM 2418T，36为CCUG 15605T，CK为空白。
具体实施方式
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
实施例1 用于鉴定副干酪乳酪杆菌的基因片段筛选
以副干酪乳酪杆菌207-27基因组在内的253个副干酪乳酪杆菌基因组（如表1所示）进行副干酪乳酪杆菌物种的泛基因组分析，挖掘副干酪乳酪杆菌物种的核心基因，初步筛选了369个基因。进一步研究发现，一条编码保守蛋白（CYTH domain-containingprotein）的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
该基因在乳酪杆菌属上广泛存在，与该属的同源序列之间覆盖率均为100%左右，相似度均大于70%。其中，该基因与副干酪乳酪杆菌同源序列之间相似度均大于98%，而与属内其它物种，如鼠李糖乳酪杆菌、干酪乳酪杆菌及其它乳酪杆菌的同源序列的相似度仅在72%-74%之间，与副干酪乳酪杆菌可以有效区分。同时，未在其它属上检测到该基因的同源序列。因此，该核苷酸序列的同源序列只存在于乳酪杆菌属中，在副干酪乳酪杆菌上保守且普遍存在，与其它乳酪杆菌属序列同源性相对较低，是副干酪乳酪杆菌特有的保守基因，适用于副干酪乳酪杆菌“种”水平上的鉴定。
表1
实施例2 用于鉴定副干酪乳酪杆菌的引物对设计
本发明针对核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的基因片段，设计包含SNP位点的引物，并对引物进行综合评估，最终筛选出4对特异性引物，设计了如表2所示的引物。
表2
在细菌基因组范围内验证4对引物的特异性，允许每条引物有4个以内的碱基错配，扩增片段长度不超过2000 bp，筛选在副干酪乳酪杆菌上具有良好特异性的引物，结果如表2所示。SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5以及SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7在数据库中其它细菌上检测到了非特异性扩增的结果，如表3所示，其中匹配片段与引物序列相同则标记为“.”，不同则标记了差异的碱基；SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3以及SEQ ID NO: 8和SEQID NO: 9经验证，无其它物种的非特异性扩增，用于后续的实物验证。
表3
实施例3 用于鉴定副干酪乳酪杆菌的引物对的特异性以及包容性验证
为了全面评估第一引物对：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3以及第二引物对：SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:9所示的两对引物在副干酪乳酪杆菌上的特异性，发明人选取25株副干酪乳酪杆菌作为实验验证菌株进行引物的包容性验证。
选取非副干酪乳酪杆菌的36个物种的模式菌株作为实验验证菌株进行引物的排他性验证，包含同属不同种2株（干酪乳酪杆菌CICC 6117T、鼠李糖乳酪杆菌CICC 6224T）以及其它科物种34株。所有61株实验验证菌株如表4所示，提取基因组DNA后使用对引物组进行PCR扩增验证。
表4
使用细菌基因组DNA提取试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司，B518225-0050）提取实验菌株的基因组DNA。
PCR反应体系为50 μL总体积：DNA模板2 μL，引物（10 μmol/L）1 μL×2，2×PCRTaqmix（生工生物工程（上海）股份有限公司，B110006-0001） 25 μL，ddH2O 21 μL；PCR扩增条件为94℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，30个循环；72 ℃ 10 min。将扩增产物进行凝胶电泳。
包容性验证结果显示，25株副干酪乳酪杆菌在相应位置（引物SEQ ID NO: 2和SEQID NO: 3扩增产物为394 bp或引物SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9扩增产物为361 bp）均有明亮的条带，两对引物包容性都良好，可以有效扩增副干酪乳酪杆菌（图1-图2）。
排他性验证结果显示，引物SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3在36株非副干酪乳酪杆菌和阴性对照均无条带，特异性良好（图3）。而引物SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9在多个非副干酪乳酪杆菌上有杂带，且部分杂带与目的条带位置相近，特异性较差（图4）。
以上结果表明，引物SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3在副干酪乳酪杆菌“种”水平上扩增效率高且具有良好的特异性。因此，优选引物SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3用于副干酪乳酪杆菌的物种鉴定。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (7)
1. 一种用于鉴定副干酪乳酪杆菌的引物对，其特征在于，所述引物对包括：核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示的下游引物。
2.一种用于鉴定副干酪乳酪杆菌的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包含权利要求1所述的引物对。
3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包含至少以下一种：
dNTPs、DNA聚合酶、反应溶剂或缓冲液。
4.一种用于鉴定副干酪乳酪杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物对，或权利要求2-3中任一所述的检测试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含以下至少一种：
扩增模板、阳性质控品或阴性质控品。
6.根据权利要求1所述的引物对、权利要求2-3中任一所述的检测试剂或权利要求4-5中任一所述的试剂盒在鉴定副干酪乳酪杆菌中的应用。
7.一种用于非诊断目的鉴定副干酪乳酪杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括：
1）释放待测样本的核酸；
2）采用权利要求1所述的引物对、权利要求2-3中任一所述的检测试剂或权利要求4-5中任一所述的试剂盒进行PCR扩增，得到扩增产物；
3）对所述扩增产物进行电泳检测，判读结果；
步骤3）中所述判读结果包括：
（1）在凝胶成像设备下观察扩增产物的条带大小，
若在380-400 bp处出现条带，则待测样品包含副干酪乳酪杆菌、或待测样品为副干酪乳酪杆菌；
若扩增后无条带、在380-400 bp处无条带，则待测样品不包含副干酪乳酪杆菌、或待测样品不属于副干酪乳酪杆菌；或
（2）采用一代、二代或三代测序确定扩增产物的片段长度；
若所述扩增产物的片段长度为394 bp，则待测样品包含副干酪乳酪杆菌、或待测样品为副干酪乳酪杆菌；
若所述扩增产物的片段长度不为394 bp，则待测样品不包含副干酪乳酪杆菌、或待测样品不属于副干酪乳酪杆菌。
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