CN113699261B

CN113699261B - 鉴定幽门螺杆菌的特异性分子靶标、检测引物和快速检测方法

Info

Publication number: CN113699261B
Application number: CN202111255238.5A
Authority: CN
Inventors: 李滢; 吴清平; 庞锐; 商燕燕; 谢新强; 陈慧贞; 薛亮; 陈谋通; 杨润时; 王涓; 丁郁; 张菊梅; 陈惠元
Original assignee: Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences; Guangdong Huankai Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2021-10-27
Filing date: 2021-10-27
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2041-10-27
Also published as: CN113699261A

Abstract

本发明公开了鉴定幽门螺杆菌的特异性分子靶标、检测引物和快速检测方法。所述的用于检测幽门螺杆菌的分子靶标，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所提及的分子靶标及检测方案特异性明显优于目前临床通用的Clayton方案，检测效能与Kim提出的高通量测序检测方案类似，但较Kim方案具有可定量、操作简便快捷、检测费用低廉的优点。

Description

鉴定幽门螺杆菌的特异性分子靶标、检测引物和快速检测方法

技术领域

本发明属于幽门螺杆菌检测领域，具体涉及鉴定幽门螺杆菌的特异性分子靶标、检测引物和快速检测方法。

背景技术

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，HP）是一种微需氧的革兰氏阴性细菌，与人类胃肠道疾病有关。据统计，大部分消化道溃疡及消化道出血与该菌感染有关，且全球约90%的胃癌发病与HP感染密切相关，可见HP感染严重威胁人类的健康、造成了巨大的经济与社会损失。因此亟需一种精准高效的HP检测方案用于对临床上HP感染的检测，这将有利于提高感染高危人群的识别，对防控HP相关疾病有重要的意义。

HP是一种在体外生长缓慢、对培养基营养成分及培养环境要求都极为严苛的细菌，是学界公认的难培养微生物。为绕开HP培养学的技术瓶颈、解决庞大的临床检测需求，科学家们研发了各类不依赖于培养学方法的HP检测方案，其中以上世纪90年代英国学者Clayton发明的检测方案最为广泛应用。由于当时学界普遍认为HP是唯一一种能通过分泌脲酶适应胃部高酸环境的微生物，因此Clayton团队根据HP的脲酶合成基因ureA设计了检测引物，采用聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）方法了解胃内是否存在ureA基因，从而判定胃粘膜是否存在HP（C Clayton, et al. 1991）。后续研究者们又以脲酶为检测目标设计了抗原-抗体检测、¹⁴碳尿素呼气测试等方案，实现了无需培养即可检出HP。

随着新一代测序技术及培养组学技术的发展，科学家们逐渐认识到胃部存在除HP外的多种其他微生物。发明人在前期工作中通过扩增子测序、宏基因组测序及培养组学手段证实，胃内存在丰富多样的微生物，其中仅细菌的种类就分布于15个门、29个纲、55个目、112个科及189个属中。发明人在前期工作中也发现胃内的很多微生物同样具有合成脲酶的功能，包括链球菌、芽孢杆菌、葡萄球菌等。由于目前常用的HP检测方案以胃内微生物脲酶合成基因是否阳性作为判别有无HP存在的标准，胃内其它具脲酶合成能力的微生物将会引起检测的假阳性，导致HP感染的误诊。

为解决目前非培养法带来的HP检测假阳性的问题，韩国学者Kim等在2015年提出了采用基于高通量测序的方法进行HP感染的诊断方案：采用高通量测序仪对胃部粘膜微生态进行扩增子测序，若HP的相对丰度高于1%则认为被检测者存在HP感染（Jaeyeon Kim, etal. 2015）。发明人在前期研究中采集了一批因¹⁴C呼气试验阳性诊断为HP相关性胃炎患者的胃粘膜样品，同时采用Clayton及Kim的方法进行HP检测，结果发现Clayton的检测方案存在假阳性的问题（如图4所示）。但由于高通量测序存在实验操作繁复、检测费用高昂的问题，目前Kim提出的HP检测方案在临床上难以得到推广。因此，目前亟需一种简便、精准的HP检测方案以满足临床对于HP感染的诊治需求。

发明内容

为解决这一问题，本发明人采用扩增子测序、宏基因组测序联合培养组学的方法探明了胃内存在的主要细菌种属，并联合其他中心的检测数据，绘制了胃部微生态组成谱图。基于胃部微生态组成的主要微生物组群的基因组数据库，发明人采用泛基因组分析手段，挖掘具有鉴别HP与其它胃内微生物作用的分子靶标，设计并优化了根据这一靶标的定性及定量检测方案。

本发明根据原核生物泛基因组自动化分析软件（Pan-Genomics AnalysisPipeline，PGAP）中的MP方案获得HP的核心基因组信息。比对其它胃内存在的微生物基因组信息，提取HP特有基因的蛋白序列，后通过Blast分析比对NCBI数据库中非冗余蛋白数据库，去除能比对至其它物种基因的蛋白序列，获得HP的特异性分子靶标，包括核苷酸序列SEQ ID NO.1及氨基酸序列SEQ ID NO.2提供的分子序列，用于识别样本中是否存在HP。

本发明的第一个目的是提供一组用于检测幽门螺杆菌（HP）的分子靶标，所述分子靶标包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列及SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供一组用于检测上述分子靶标的引物组及其扩增产物，应用所述如SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4所示引物对含HP的样本进行PCR扩增，可获得特异的299bp大小的产物，其序列如SEQ ID NO.5所示。

可通过上述引物，利用PCR扩增技术实现快速检测HP。

本发明的第三个目的是提供一种检测幽门螺杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组。

优选地，所述试剂盒还包括：2×PCR Mix、模板DNA和水。

本发明的第四个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗方法的检测幽门螺杆菌的PCR检测方法，包括以下步骤：

使用上述引物组对待检测样本进行PCR扩增，若扩增产物在299bp位置出现单一条带，则判定样品中含有HP，若未出现目标大小的条带，则判定样本中不含有HP。

优选地，所述PCR反应，其反应体系是：2×PCR Mix 12.5μL、10 μmol/L引物各1 μL、模板DNA 1μL、ddH₂0 9.5μL，反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s、56.5℃退火30s、72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

本发明的第四个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗方法的对样品幽门螺杆菌进行定量的qPCR检测方法，包括以下步骤：

使用上述引物组对待检测样本进行qPCR扩增，对扩增结果进行分析读取样本中的幽门螺杆菌含量。

优选地，所述qPCR，其扩增体系为：2× SYBR Green Premix 反应液5 μL，待测模板DNA 1uL，10 μmol/L引物各0.5 μL，水3μL；qPCR反应程序两步法PCR反应程序：95℃预热30s；两步法扩增95℃ 5s、60℃退火30s，共进行40个循环。

本发明的有益效果：

经验证，本发明所提及的分子靶标及检测方案特异性明显优于目前临床通用的Clayton方案，检测效能与Kim提出的高通量测序检测方案类似，但较Kim方案具有可定量、操作简便快捷、检测费用低廉的优点。

因此，本发明公开了用于鉴别幽门螺杆菌的特异性检测靶标及相关的检测方法，与现有技术相比，本发明的检测方法具有检测时间短、操作简便、准确度高、费用低廉且无需经过微生物培养等试验即可在样本中检测HP的存在，具有高度实用性；本发明的特异检测靶标具有单一的特异性，检测结果特异，结果判断简单；本发明既可定性、又可定量判断样本中幽门螺杆菌的存在，应用范围广。

附图说明

图1是根据不同方法构建的胃部微生态分析。

图2是本发明及Clayton方案对40株幽门螺杆菌的检出情况。

图3是本发明及Clayton方案对80株胃部非HP菌株的检出情况。

图4是本发明、Clayton方案及Kim方案对40份胃炎患者胃部HP的检出情况。

图5是本发明对含不同幽门螺杆菌菌落数样品的检测灵敏度评价。

具体实施方案

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1 胃部菌群微生态系统分析

（1）基于扩增子测序的胃部微生态系统分析

①胃部微生物DNA扩增子测序：取体积约3mm×3mm×1mm的胃粘膜样品，采用QIAamp PowerFecal DNA Kit（Qiagen，Germany）进行粘膜总微生物DNA提取。提取后的胃部微生物DNA使用341F 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′及806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′作为扩增引物，UCP Multiplex PCR Kit（Qiagen）进行16S rRNA基因V3-V4区扩增，扩增后采用QIAseq Ultralow Input Library Kit进行文库构建。文库采用High Sensitivity DNAKit（Agilent，USA）及Qubit 1× dsDNA HS Assay Kit（Thermo-Fisher，USA）进行定量及混合，混合文库采用1.0N的NaOH进行变性，后以14pM作为上机目标浓度，用HT1进行文库稀释。采用MiSeq Reagent Kit v3（Illumina，USA）测序试剂盒在Miseq平台（Illumina）上进行测序。下机数据采用Miseq Reporter（Illumina）进行数据拆分。

②胃部微生态扩增子数据的生物信息学分析：将下机数据导入CLC workbench（Qiagen）分析平台，采用Microbial Genomics Module进行扩增子数据分析，流程如下：对低质量及嵌合体数据进行过滤后，测序数据比对Greengenes数据库（v13.8），获得胃部微生物组成的OTU列表。采用权重基因共表达网络分析（weighted gene co-expression networkanalysis, WGCNA）对胃部微生态进行核心菌群分析以及微生物互作网络构建（附图1 A）。

（2）基于宏基因组测序的胃部微生态系统分析

①胃部微生物DNA宏基因组测序：按前述方法提取胃粘膜总微生物DNA提取，提取后的胃部微生物DNA使用QIAseq FX DNA Library Kit（Qiagen）进行二代测序文库构建，包括模板DNA的片段化、末端修复、接头连接、片段筛选及文库扩增与纯化等步骤。二代宏基因组文库采用High Sensitivity DNA Kit（Agilent，USA）及Qubit 1× dsDNA HS Assay Kit（Thermo-Fisher，USA）进行定量及混合，混合文库采用1.0N的NaOH进行变性，后以1.3pM作为上机目标浓度，用HT1进行文库稀释。稀释后文库采用Nextseq 500/550 High OutputKit v2.5（Illumina）测序试剂盒在Nextseq 550平台（Illumina）上进行测序。下机数据采用bcl2fastq软件进行数据拆分。

②胃部微生态宏基因组数据的生物信息学分析：将下机数据导入CLC workbench（Qiagen）分析平台，采用Microbial Genomics Module进行扩增子数据分析，流程如下：对低质量及嵌合体数据进行过滤后，比对人类基因组参考数据库，去除人源宿主片段。去宿主片段采用de novo策略进行组装，组装后数据比对NCBI原核生物数据库，获得胃部微生物组成的OTU列表。采用WGCNA分析对胃部微生态进行核心菌群分析以及微生物互作网络构建（附图1 B）。

图1中的A. 基于扩增子测序的50例慢性胃炎患者胃部菌群生态测序结果：采用扩增子测序及WGCNA分析解构慢性胃炎患者胃部菌群共发生关系，微生物在胃内丰度的高低以圆圈直径大小表示，若两种微生物间存在共发生关系，则用“→”进行关联。B. 基于宏基因组测序的6例胃部疾病患者胃部菌群生态测序结果：采用宏基因组测序及WGCNA分析解构慢性胃炎及胃癌患者胃部菌群共发生关系，微生物在胃内丰度的高低以圆圈直径大小表示，若两种微生物间存在共发生关系，则用“—”进行关联。C. 基于宏基因组学的10例慢性胃炎患者胃部微生态重要菌株分离：采用多种培养基及培养条件在10例慢性胃炎患者胃部分离获得116株菌，分布于18个属47个种，根据每个种代表性菌株的16S rRNA基因序列进行Neighbor-Joining建立进化树。

（3）基于宏基因组学的胃部微生态中重要微生物分离

采集患者胃粘膜样本，在无菌条件下进行研磨，研磨获得的碎片组织分别涂布于含哥伦比亚血平板、MRS平板及NA平板（Huankai Microbial， China）上，每种平板涂布3块。涂布后每种平板分别放于下述三种培养环境中：37℃普通恒温培养箱、37℃厌氧工作站、37℃微需养培养箱。在培养的24、48、72、96小时观察平板，若平板上出现单菌落，挑取该菌落在同样培养基及同样培养环境下进行纯化。纯化2次后，采用细菌DNA提取试剂盒（Mabio，CHINA）对菌株进行细菌DNA提取，后采用PCR方法检测分离菌株的16S rRNA基因序列以确定菌株的种属。PCR引物为上游引物序列为27F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’；下游引物序列为1492R：5’-CTAC GGC TAC CTT GTT ACG A-3’。PCR反应条件为：预变性95°C 5min；95°C 30 s，56°C 30 s，72°C 1min 30s共35个循环，72°C退火延伸10 min。对PCR产物进行切胶回收，后进行一代测序（由苏州金唯智生物科技有限公司完成）。获得16S rRNA基因序列后比对NCBI数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov），以同源度最高的微生物种属为待测菌株的种属。本研究从10例慢性胃炎患者胃粘膜中分离获得116株菌，分布于18个属47个种，这些菌株在分类学的进化关系如附图1 C所示。

实施例2 幽门螺杆菌特异性新检测靶标的挖掘

根据实施例1中构建的胃部微生态网络，选取精确至种水平的32属190种微生物作为胃部的核心微生物。根据NCBI中GenBank数据库及发明人团队前期建立的幽门螺杆菌全基因组数据库，进行比较基因组学分析，挖掘在胃部微生态环境中幽门螺杆菌特有的靶标序列。将所分析的644个微生物基因组完成图序列采用Prokka软件注释后，采用泛基因组分析软件Roary将相似度≥85%的功能基因聚类为同一基因簇，并生成所分析的全部基因组的矩阵列表。认为矩阵列表中所有幽门螺杆菌共有的基因而其它种属微生物均没有的基因为具有特异识别幽门螺杆菌功能的靶标序列。提取具有识别靶标潜能的相应基因的核苷酸序列，比对NCBI非冗余蛋白数据库，去除在其它物种存在的序列，剩下的则为幽门螺杆菌的特异性分子靶标，所述分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示（具体为：GTGAATTACTTTTTAAAAGCCCCTATTTTAGGATTTGAGCATATCCATGAAGTGCGTTTGGAAAAAATTGATTCCTTATTCAGCCGATTAATTGGCCAAACCCATTCCCCCATGGCGTTGGATATGGTATTAGTGAATCCTTATTGTTTGAGAGAATACAGCTTTGTGATACCCAAATACATAGAATTACTGCTAGAATTAGATTCTCGTTCCAAAGTTGAGGTGTATTGCGTGGTCGTGTTGCAAAAAAATTTAGAAGATTCTATGGTTAATTTCTTAGCCCCTTTGGTGTTTAATTCCAAAAATGGCTTTGGTGCTCAAGTGGCGCTTTCTATGATGGATTATCCGGATTTTGGCTTTAGAGATCCTTTAAAAAGCTTTGTGATTCAAGAAAGAGAACGAGCTTAA），其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示（具体为MNYFLKAPILGFEHIHEVRLEKIDSLFSRLIGQTNSPMALDMVLVNPYCLREYSFVIPKYIELLLELDSHSKVEVYCVVVLQKNLEDSMVNFLAPLVFNSKNGFGAQIALSMMDYPDFGFRDPLKSFVIQERERA）。

实施例3幽门螺杆菌特异性新检测靶标快速检测方法的建立

（1）本实施例提供了一种检测幽门螺杆菌的方法，具体操作如下：

根据实施例2获得的HP特异性检测靶标，设计引物SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，获得快速检测方法，包括以下步骤：

表1 HP特异性PCR检测引物序列

PCR检测体系及扩增程序：

PCR检测所需的DNA模板制备方法采用实施例1中的组织微生物DNA提取方案执行。HP的PCR反应体系配置如下：

2×PCR Mix 12.5μL

SEQ.ID No.3（10μmol/L） 1μL

SEQ.ID No.4（10μmol/L） 1μL

模板DNA（2.5ng/μL） 1μL

ddH₂0 9.5μL

以下为PCR反应条件如下：

PCR结束后取5μL PCR产物进行1.5%琼脂糖电泳。若电泳结果显示扩增产物在299bp处出现单一扩增条带，则说明样本中含有幽门螺杆菌；若没有出现相应的单一扩增条带，则样本中不含有HP。

（2）幽门螺杆菌特异性新检测靶标快速检测方法的特异性评价

①新检测方案对幽门螺杆菌的检测敏感性评价

采用本发明的方案对40株HP分离株进行检测，并对比Clayton的检测方案，结果如附图2所示。Clayton方案检测所用引物序列为5’-GCC AAT GGT AAA TTA GTT-3’；下游引物序列为5’-CTC CTT AAT TGT TTT TAC-3’； PCR反应条件为：预变性95°C 5 min；95°C 30s，55°C 30 s，72°C 30s共35个循环，72°C退火延伸10 min；PCR结束后若在经琼脂糖电泳检测若在411bp形成特异性条带，则判定样本中含有幽门螺杆菌。结果提示本发明的方案与Clayton灵敏性相当，均能特异检出HP。

图2是采用本发明提供的PCR扩增方案及Clayton提出的方案对40株HP分离株DNA进行检测，发现本发明检测在299bp处均形成特异性扩增条带，而Clayton方案菌株在411bp处均形成特异性扩增条带。

②新检测方案对胃内其它微生物的检测特异性评价

对比Clayton的检测方案，采用本发明的方案对80株胃内分离的非HP菌株进行检测，结果如附图3所示（图3是采用本发明提供的检测方案及Clayton提出的方案对80株胃部非HP菌株DNA进行检测，发现本发明检测均无在299bp处形成特异性条带，而Clayton方案在较多出现非特异扩增条带，并在6、16、23、30、35、39、46、51、61、65、66及78号菌株在411bp处均形成特异扩增条带）。结果提示本发明对所有胃内非HP菌株检测均显示阴性，而Clayton方案对多数胃内菌株会形成非特异条带，而对于部分菌株会在411bp处形成特异条带，造成假阳性的判读，如表2所示。

表2 两种检测方案对胃内其它菌株的检测结果

编号	菌株种属	Clayton方案结果	本发明结果
				1	<i>Lactobacillus gasseri</i>	-	-
2	<i>Janibacter anophelis</i>	-	-
				3	<i>Rothia dentocariosa</i>	-	-
4	<i>Rothia aeria</i>	-	-
				5	<i>Neisseria perflava</i>	-	-
6	<i>Lactobacillus fermentum</i>	+	-
				7	<i>Staphylococcus warneri</i>	-	-
8	<i>Lactobacillus aginalis</i>	-	-
				9	<i>Rothia aeria</i>	-	-
10	<i>Staphylococcus hominis</i>	-	-
				11	<i>Rothia dentocariosa</i>	-	-
12	<i>Streptococcus parasanguinis</i>	-	-
				13	<i>Aeromonas caviae</i>	-	-
14	<i>Rothia mucilaginosa</i>	-	-
				15	<i>Gemella sanguinis</i>	-	-
16	<i>Rothia mucilaginosa</i>	+	-
				17	<i>Actinomyces oris</i>	-	-
18	<i>Granulicatella adiacens</i>	-	-
				19	<i>Rothia aeria</i>	-	-
20	<i>Streptococcus salivarius</i>	-	-
				21	<i>Neisseria oralis</i>	-	-
22	<i>Staphylococcus auricularis</i>	-	-
				23	<i>Rothia mucilaginosa</i>	+	-
24	<i>Staphylococcus auricularis</i>	-	-
				25	<i>Bacillus stratosphericus</i>	-	-
26	<i>Rothia mucilaginosa</i>	-	-
				27	<i>Streptococcus oralis</i>	-	-
28	<i>Rothia dentocariosa</i>	-	-
				29	<i>Staphylococcus aureus</i>	-	-
30	<i>Staphylococcus hominis</i>	+	-
				31	<i>Streptococcus gwangjuense</i>	-	-
32	<i>Bacillus subtilis</i>	-	-
				33	<i>Streptococcus anginosus</i>	-	-
34	<i>Streptococcus salivarius</i>	-	-
				35	<i>Streptococcus salivarius</i>	+	-
36	<i>Streptococcus pseudopneumoniae</i>	-	-
				37	<i>Schaalia odontolytica</i>	-	-
38	<i>Neisseria perflava</i>	-	-
				39	<i>Rothia mucilaginosa</i>	+	-
40	<i>Streptococcus oralis</i>	-	-
				41	<i>Schaalia odontolytica</i>	-	-
42	<i>Rothia dentocariosa</i>	-	-
				43	<i>Lactobacillus plantarum</i>	-	-
44	<i>Staphylococcus epidermidis</i>	-	-
				45	<i>Bacillus nealsonii</i>	-	-
46	<i>Corynebacterium durum</i>	+	-
				47	<i>Schaalia odontolytica</i>	-	-
48	<i>Bacillus altitudinis</i>	-	-
				49	<i>Streptococcus sanguinis</i>	-	-
50	<i>Staphylococcus auricularis</i>	-	-
				51	<i>Streptococcus pseudopneumoniae</i>	+	-
52	<i>Lactobacillus gasseri</i>	-	-
				53	<i>Streptococcus mitis</i>	-	-
54	<i>Rothia dentocariosa</i>	-	-
				55	<i>Gemella morbillorum</i>	-	-
56	<i>Shigella dysenteriae</i>	-	-
				57	<i>Bacillus tequilensis</i>	-	-
58	<i>Moraxella osloensis</i>	-	-
				59	<i>Shigella dysenteriae</i>	-	-
60	<i>Neisseria cinerea</i>	-	-
				61	<i>Bacillus aryabhattai</i>	+	-
62	<i>Shigella flexneri</i>	-	-
				63	<i>Streptococcus sanguinis</i>	-	-
64	<i>Staphylococcus epidermidis</i>	-	-
				65	<i>Streptococcus salivarius</i>	+	-
66	<i>Bacillus aryabhattai</i>	+	-
				67	<i>Bacillus stratosphericus</i>	-	-
68	<i>Sphingomonas pseudosanguinis</i>	-	-
				69	<i>Sphingomonas pseudosanguinis</i>	-	-
70	<i>Lactobacillus vaginalis</i>	-	-
				71	<i>Campylobacter jejuni</i>	-	-
72	<i>Gemella haemolysans</i>	-	-
				73	<i>Lactobacillus salivarius</i>	-	-
74	<i>Neisseria perflava</i>	-	-
				75	<i>Bacillus subtilis</i>	-	-
76	<i>Streptococcus koreensis</i>	-	-
				77	<i>Rothia mucilaginosa</i>	-	-
78	<i>Streptococcus salivarius</i>	+	-
				79	<i>Campylobacter jejuni</i>	-	-
80	<i>Methanoregula boonei</i>	-	-

实施例4 实际样本中的快速HP检测方案

采用实施例3中的快速HP新检测方案对40例疑似HP感染的患者胃粘膜样本进行检测，结果如附图4所示（采用本发明提供的PCR检测方案、Clayton方案及Kim方案对40株胃炎患者胃部HP的检出情况：采用本发明方案检测在40份样品中有7份样本在299bp处出现特异性扩增条带，分别为3、6、16、24、27、29、37号样品；采用Clayton方案检测在40份样品中有11份样本在411bp处出现特异性扩增条带，分别为3、6、16、18、20、24、27、29、31、32、37号样品；Kim方案在40份样品中检出7份HP相对丰度高于1%，分别为3、6、16、24、27、29、37号样品。结果提示对于胃炎患者是否罹患HP感染的检测，本发明的检测效果与采用高通量测序的Kim方案相当，而Clayton方案则出现假阳性情况）。样本DNA提取方法同实施例1，样本的检测方案同实施例3。利用本发明的特异性分子靶标及引物进行检测，发现40例样本中有7例HP检测阳性，其结果同高通量测序结果完全一致，而传统检测方案提示40例样本中有11例HP检测阳性，其中4例经高通量测序证实无HP感染。通过本实施例说明本发明幽门螺杆菌的特异性靶标以及检测引物较目前通用的方案具有更高的HP检测特异性。

表3 三种检测方案对慢性胃炎患者胃粘膜HP的检测情况

患者编号	Kim方案HP相对丰度(%)	Clayton方案结果	本发明结果
				1	0	-	-
2	0	-	-
				3	6.48	+	+
4	0	-	-
				5	0	-	-
6	9.51	+	+
				7	0	-	-
8	0.89	-	-
				9	0.35	-	-
10	0	-	-
				11	0	-	-
12	0	-	-
				13	0	-	-
14	0	-	-
				15	0.69	-	-
16	9.26	+	+
				17	0	-	-
18	0	+	-
				19	0.38	-	-
20	0	+	-
				21	0	-	-
22	0	-	-
				23	0	-	-
24	10	+	+
				25	0.1	-	-
26	0.32	-	-
				27	9.98	+	+
28	0.44	-	-
				29	9.91	+	+
30	0	-	-
				31	0	+	-
32	0	+	-
				33	0	-	-
34	0	-	-
				35	0	-	-
36	0	-	-
				37	9.97	+	+
38	0	-	-
				39	0	-	-
40	0	-	-

实施例5 幽门螺杆菌特异性新检测靶标的定量检测方法

（1）本实施例提供了一种对样本中幽门螺杆菌进行定量检测的方法，采用SEQ.IDNo.3、及SEQ.ID No.4作为qPCR扩增反应的引物，具体操作如下：

①模板DNA制备：按实施例1方法提取含HP样本中的微生物DNA，作为待检测模板；

②qPCR检测体系及扩增程序：

qPCR检测所需的DNA模板制备方法采用实施例1中的组织微生物DNA提取方案执行。HP的qPCR反应体系配置如下：

2×SYBR Green Premix 5μL

SEQ.ID No.3（10μmol/L） 0.5μL

SEQ.ID No.4（10μmol/L） 0.5μL

模板DNA 1μL

ddH₂0 3μL

以下为qPCR扩增程序：

③qPCR结果读取：

利用Roche LightCycler^®96荧光定量扩增仪上对体系进行扩增检测，利用软件LightCycler^®96 SW 1.1读取扩增结果。在空白对照不存在荧光信号前提下，如果产生荧光信号，说明样品中含有HP；如果不产生荧光信号，则样品中不含有HP。

（2）新检测方案对幽门螺杆菌检测灵敏度评价

应用生理盐水将浓度为1×10⁹CFU/mL的HP ATCC43504按照10倍梯度进行稀释，得浓度为10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹CFU/mL的菌株纯培养物，按照实施例1的方法进行DNA的提取，按上述qPCR方案进行样本HP定量检测，每个浓度样品分别进行三次平行实验。

绘制标准曲线：以样品中HP浓度的对数为横坐标，以相应的qPCR的实时Ct值为纵坐标，拟合所得曲线即为HP定量检测的标准曲线。标准曲线如附图5B所示，引物对样本中HP的检测限为1×10³ CFU/mL（图5A），所述幽门螺杆菌的拟合标准曲线为y = -2.044x +35.36，相关系数R²为0.9813。

图5是采用本发明提供的qPCR检测方案对含不同幽门螺杆菌菌落数样品进行定量检测：A.结果提示当样本中菌落浓度≥1×10³CFU/mL时，样本可检测出荧光信号，B.本发明对含不同幽门螺杆菌菌落样本的定量检测效果良好，标准曲线的拟合度高。

（3）实际样本中幽门螺杆菌qPCR定量检测

胃镜下采集慢性胃炎患者A胃部0.3cm×0.3cm胃粘膜样品，按实施例1的方案进行胃部微生物DNA提取，后按实施例5（1）进行qPCR检测。检测样本的Ct值为26.37±0.33，根据标准曲线计算可知该样品中含HP量为1×10^4.40CFU/mL。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

广东环凯生物科技有限公司

<120> 鉴定幽门螺杆菌的特异性分子靶标、检测引物和快速检测方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 408

<212> DNA

<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<400> 1

gtgaattact ttttaaaagc ccctatttta ggatttgagc atatccatga agtgcgtttg 60

gaaaaaattg attccttatt cagccgatta attggccaaa cccattcccc catggcgttg 120

gatatggtat tagtgaatcc ttattgtttg agagaataca gctttgtgat acccaaatac 180

atagaattac tgctagaatt agattctcgt tccaaagttg aggtgtattg cgtggtcgtg 240

ttgcaaaaaa atttagaaga ttctatggtt aatttcttag cccctttggt gtttaattcc 300

aaaaatggct ttggtgctca agtggcgctt tctatgatgg attatccgga ttttggcttt 360

agagatcctt taaaaagctt tgtgattcaa gaaagagaac gagcttaa 408

<210> 2

<211> 135

<212> PRT

<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<400> 2

Met Asn Tyr Phe Leu Lys Ala Pro Ile Leu Gly Phe Glu His Ile His

1 5 10 15

Glu Val Arg Leu Glu Lys Ile Asp Ser Leu Phe Ser Arg Leu Ile Gly

20 25 30

Gln Thr Asn Ser Pro Met Ala Leu Asp Met Val Leu Val Asn Pro Tyr

35 40 45

Cys Leu Arg Glu Tyr Ser Phe Val Ile Pro Lys Tyr Ile Glu Leu Leu

50 55 60

Leu Glu Leu Asp Ser His Ser Lys Val Glu Val Tyr Cys Val Val Val

65 70 75 80

Leu Gln Lys Asn Leu Glu Asp Ser Met Val Asn Phe Leu Ala Pro Leu

85 90 95

Val Phe Asn Ser Lys Asn Gly Phe Gly Ala Gln Ile Ala Leu Ser Met

100 105 110

Met Asp Tyr Pro Asp Phe Gly Phe Arg Asp Pro Leu Lys Ser Phe Val

115 120 125

Ile Gln Glu Arg Glu Arg Ala

130 135

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgagcatat ccatgaagtg cg 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agaaagcgcc acttgagcac 20

<210> 5

<211> 299

<212> DNA

<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)

<400> 5

ttgagcatat ccatgaagtg cgtttggaaa aaattgattc cttattcagc cgattaattg 60

gccaaaccca ttcccccatg gcgttggata tggtattagt gaatccttat tgtttgagag 120

aatacagctt tgtgataccc aaatacatag aattactgct agaattagat tctcgttcca 180

aagttgaggt gtattgcgtg gtcgtgttgc aaaaaaattt agaagattct atggttaatt 240

tcttagcccc tttggtgttt aattccaaaa atggctttgg tgctcaagtg gcgctttct 299

Claims

1.检测分子靶标的试剂在制备用于检测幽门螺杆菌的试剂盒中的应用，所述的分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2. 检测分子靶标的引物组在制备用于检测幽门螺杆菌的试剂盒中的应用，所述的检测分子靶标的引物组，包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

3.一种非疾病的诊断和治疗方法的检测幽门螺杆菌的PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

使用引物组对待检测样本进行PCR扩增，若扩增产物在299bp位置出现单一条带，则判定样品中含有幽门螺杆菌，若未出现目标大小的条带，则判定样本中不含有幽门螺杆菌；

所述的引物组包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

4. 根据权利要求3所述的PCR检测方法，其特征在于，PCR反应体系是：2×PCR Mix12.5μL、10μmol/L引物各1μL、模板DNA 1μL、ddH₂0 9.5μL，反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s、56.5℃退火30s、72℃延伸30s，共进行35个循环；72℃延伸10min。

5.一种非疾病的诊断和治疗方法的对样品幽门螺杆菌进行定量的qPCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

使用引物组对待检测样本进行qPCR扩增，对扩增结果进行分析读取样本中的幽门螺杆菌含量；

所述的引物组包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

6. 根据权利要求5所述的qPCR检测方法，其特征在于，所述qPCR的扩增体系为：2×SYBR Green Premix 反应液5μL，待测模板DNA 1μL，10 μmol/L引物各0.5μL，水3μL；qPCR反应程序：95℃预热30s、95℃ 5s、60℃退火30s，共进行40个循环。