CN102721815A

CN102721815A - 幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN102721815A
Application number: CN2012101129839A
Authority: CN
Inventors: 金守光; 杨洪江
Original assignee: TIANJIN TIANFOLUO BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: TIANJIN TIANFOLUO BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2012-04-18
Filing date: 2012-04-18
Publication date: 2012-10-10

Abstract

本发明涉及一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒及其检测方法，试剂盒包括微孔板、酶标二抗、阴性血清对照、阳性血清对照、底物、终止液和洗液，其中微孔板包被纯化的重组幽门螺旋杆菌毒素蛋白所述底物为含有1％m/m ³，3’，5，5’-四甲基联苯胺和30％v/v过氧化氢的溶液，所述重组幽门螺旋杆菌毒素蛋白为细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A和尿素酶亚基B。本发明使用纯化的6种幽门螺杆菌重组毒力蛋白作为抗原，抗原本身具有高度保守性和特异性，且与患者的症状相关，因此，本试剂盒具有特异性高、区分幽门螺旋杆菌临床菌株毒力强弱、以及具有半定量检测的特点。

Description

幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及酶联免疫吸附和幽门螺旋杆菌临床诊断领域，尤其是一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，Hp)在1983年由澳大利亚医生发现，呈螺旋状，为革兰氏阴性菌，定殖于人胃部。幽门螺旋杆菌感染是引起人类消化道疾病的重要原因，能够导致慢性胃炎、严重萎缩性胃炎、消化道溃疡和胃癌相关。西方国家30-50％的人群感染过幽门螺旋杆菌，我国幽门螺旋杆菌感染率高达70-90％，随着年龄增长，感染率有增加的趋势。感染人群中的10％患者会出现临床症状，包括胃炎、胃十二指肠溃疡等，若不接受抗菌素治疗，感染可持续终生，其中部分患者可能导致胃癌。

目前检测幽门螺旋杆菌感染的方法较多，包括检测患者血清中的幽门螺旋杆菌抗体、粪便中幽门螺旋杆菌的抗原、尿素呼气试验、定量PCR方法、细菌培养方法和病理学检测方法等，其中检测患者血清中的幽门螺旋杆菌抗体，包括酶联免疫吸附试验、免疫印记和胶体金等方法，具有特异性高，能够定量分析的特点。但是试验中涉及的幽门螺杆菌抗原，为部分纯化的幽门螺旋杆菌全抗原，特异性、稳定性等方面，不能完全满足检测要求。

本发明涉及幽门螺旋杆菌临床诊断试剂盒和检测方法，涉及抗原为幽门螺旋杆菌鞭毛蛋白、空泡毒素、细胞毒素相关蛋白和尿素酶等。鞭毛蛋白是幽门螺旋杆菌鞭毛的主要组成蛋白，是细菌运动的动力，鞭毛蛋白本身可以抵御酸性环境，对鞭毛具有保护作用，运动能力较强的菌株其致病性较高。空泡毒素VacA能够分泌到细菌外部，对胃上皮细胞造成损伤，产生空泡性病变，另外能够改变细胞膜的离子通透性，导致细胞整体病变。所有幽门螺旋杆菌存在VacA编码基因，但是只有约50％的菌株表达VacA蛋白。细胞毒素相关蛋白(CagA)分子量为128kD，存在于60-70％的幽门螺旋杆菌菌株中，具有CagA为I型菌株，具有较强致病性，CagA阴性为II型菌株，致病性较弱，在胃炎患者中中，CagA抗体阳性率为70-75％，在十二指肠溃疡患者中，CagA抗体阳性率几乎为100％。尿素酶产生高浓度氨，导致细胞空泡病变。本发明使用上述6种纯化的重组毒力蛋白为抗原，采用酶联免疫吸附技术，测定标本中相应的抗体。

发明内容

本发明的目的是提供一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒及其检测方法，主要包括细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A和尿素酶亚基B的纯化重组蛋白作为抗原包被微孔板，检测标本中抗体的种类和数量。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒，试剂盒包括微孔板、酶标二抗、阴性血清对照、阳性血清对照、底物、终止液和洗液，其中微孔板包被纯化的重组幽门螺旋杆菌毒素蛋白，所述底物为含有1％m/m 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺和30％v/v过氧化氢的溶液，所述重组幽门螺旋杆菌毒素蛋白为细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A和尿素酶亚基B。

而且，所述微孔板为透明聚苯乙烯微孔板，微孔底部为平底。

而且，所述纯化的重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗原单独包被微孔，或混合包被微孔。

而且，所述终止液为硫酸、盐酸、氢氧化钠或乙二胺四乙酸钠等。

而且，所述洗液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液或三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液。

而且，所述酶标二抗为鼠或兔抗人辣根过氧化物酶HRP标记的抗体。

一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒的检测方法，步骤为：将血清或血浆标本加入微孔中孵育，与包被的幽门螺旋杆菌毒力蛋白反应，标本中可能存在的抗体与相应的毒力蛋白结合，洗板后，加入酶标二抗，孵育后再洗板，孵育后洗板，加入底物显色，反应结束时加入终止液，利用酶标仪进行读数，检测标本中抗体的种类和数量。

本发明的有益效果和优点是：

本发明使用纯化的6种幽门螺杆菌重组毒力蛋白作为抗原，抗原本身具有高度保守性和特异性，且与患者的症状相关，因此，本试剂盒具有特异性高、区分幽门螺旋杆菌临床菌株毒力强弱、以及具有半定量检测的特点。

附图说明

图1为本发明重组质粒的限制性内切酶图谱。使用的限制性内切酶分别为BamHI和SalI，图谱中1.3kb和2.5kb的条带来自基因表达的辅助质粒pREP4，vector为克隆基因的载体，大小为3.4kb，三角形代表克隆的基因片段，大小与预期相同，其中ureB基因的部分片段与载体片段连接在一起，大小与预期也相同；

图2为本发明幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因的PCR扩增产物分析，其中，1 cagA，2vacA，3 ureA，4 ureB，5 flaA，6 flaB；

图3重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白表达与纯化结果分析，其中1 CagA，2 VacA，3 FlaA，4FlaB，5 UreA，6 UreB。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明为制备幽门螺旋杆菌重要毒力蛋白抗体检测试剂盒及其检测方法。试剂盒包括微孔板、细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A、尿素酶亚基B、鼠或兔抗人辣根过氧化物酶HRP标记的抗体(酶标二抗)、阴性血清对照、阳性血清对照、底物、终止液、洗液和稀释液。微孔板包被上述6种幽门螺旋杆菌毒力蛋白，可以分别包被，也可以混合包被。

检测时，血清或血浆标本与包被的幽门螺旋杆菌毒力蛋白反应，标本中可能存在的抗体与相应的毒力蛋白结合，洗板后，加入酶标二抗，再洗涤，加入底物显色，反应结束时加入终止液，利用酶标仪进行读数，确定标本中相应抗体是否存在。所述底物为含有1％m/m3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)和30％v/v过氧化氢的溶液，所述终止液为硫酸、盐酸、氢氧化钠或乙二胺四乙酸钠等，所述洗液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液或三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液。

具体制备方法和检测方法如下：

一、幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒的制备

1、抗原包被微孔板

微孔板材质为聚苯乙烯，微孔为透明平底。配置重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白溶液，溶液浓度为2-10μg/mL，使用磷酸盐缓冲液(10mmol/L磷酸盐缓冲液pH 7.4、150mmol/L氯化钠和0.1％叠氮化钠)或是碳酸钠缓冲液(pH 9.4)，每孔加入100μL蛋白质溶液，4-37℃孵育数小时或过夜。

2、封闭

除去包被液，加入洗板液(10mmol/L磷酸盐缓冲液pH 7.4、150mmol/L氯化钠和0.05％吐温20)洗板3次，或用洗板机完成。每孔加入100μL封闭液(10mmol/L磷酸盐缓冲液pH7.4、150mmol/L氯化钠和5％牛血清白蛋白BSA)，37℃孵育30min。

3、平板包装

去除封闭液，用洗板液洗板3次，平板干燥后装入塑料袋或其它袋中，放入干燥剂封口保存。

4、分装酶标二抗、阴性血清对照和阳性血清对照等。

其中酶标二抗为市售，阴性血清为混合多份幽门螺旋杆菌阴性的健康人血清获得，阳性血清为混合多份幽门螺旋杆菌阳性的患者血清获得。

二、幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒的检测方法

1、稀释标本

用稀释液(10mmol/L磷酸盐缓冲液pH 7.4、150mmol/L氯化钠和0.05％吐温20)稀释待测的血浆或血清1到200倍，混匀。

2、加样

用移液器分别取100μL液体，包括空白(稀释液)、阴性对照、阳性对照和稀释的标本等，置于已经包被好重组毒力蛋白的微孔板中，设置2-3个重复孔，盖好后37℃孵育30min。整个操作过程应该在10min内完成，避免误差的出现。

3、洗板

洗板3次，每次用350μL洗板液，弃掉洗涤液，在干净吸水纸上轻轻敲打微孔板几次，去除残余洗涤液。如果标本较多，可以利用洗板机完成洗板过程。

4、酶标二抗标记

用8通道移液器取100μL稀释100倍的二抗加入微孔板中，盖好后37℃温育30min。

5、洗板

6、加入底物

用8通道移液器分别取100μL1％底物液3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液和10μL0.3％过氧化氢加入孔中，开始计时，在室温(20-25℃)温育30min，避免直接光照。

7、终止反应

用8通道移液器取100μL终止液(100mmol/L硫酸)加入孔中，终止反应等待测定。

8、测定结果

在终止反应30min内，利用酶标仪测定结果，吸收波长为450nm。

9、结果的计算

计算阳性对照和患者标本的平均吸光度值A，减去空白孔的平均吸光度值。按照下列公式计算酶联免疫单位(enzyme immunounits，EIU)：

10、结果的解释

结果的判定标准为：阴性＜30EIU，阳性≥30EIU

计算值小于30EIU显示阴性结果，或者没有检测到幽门螺旋杆菌抗体，或者抗体水平低于检测的极限。

计算值大于30EIU显示检测到幽门螺旋杆菌抗体，结果为阳性。为了保证检测的准确性，

试剂盒提供的阴性对照和阳性对照应该在每次实验都要检测，并且应该获得预期的检测值。测量结果大于临界值，不代表存在抗体的数量。

对于那些样品值接近临界值的患者，需要在一定时间内采取第2份样品。

分别收集患者血清或血浆标本370份，检测幽门螺旋杆菌IgG抗体，与其它试剂盒对比分析结果显示，阳性符合率为95.4％，阴性符合率为99.0％。如表所示

细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A、尿素酶亚基B、6种幽门螺旋杆菌毒力蛋白的制备方法如下：

一、幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因的扩增与克隆

(1)利用BHI培养基液体培养幽门螺旋杆菌，10000g离心5min收集细菌细胞；

(2)利用TE缓冲液重悬细胞，加入0.1％SDS破壁，然后加入10μg/mL蛋白酶K，37℃过夜消化，用苯酚氯仿抽提若干次至无白色膜状物存在，氯仿抽提一次，加入2.5倍体积95％乙醇沉淀染色体DNA，10000g离心10min弃上清，用70％乙醇洗涤一次，沉淀干燥后加入TE缓冲液重悬成为染色体DNA溶液；

(3)扩增幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因。

扩增体系包括1μL提取的幽门螺旋杆菌染色体DNA为模板(0.1μg)、4μL设计的扩增引物(20pmol/L)、10μL缓冲液(10×)、8μL dNTPs(2.5mmol/L)、1μL Taq DNA聚合酶(2.5u)和76μL ddH₂O。在PCR仪上进行扩增，扩增参数为：

1个循环：95℃预变性5min

35个循环：

95℃变性1min

56℃复性1min

72℃延伸2min

1个循环：72℃保温10min。

6种幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因大小不同，设计的引物保证特异性的同时，引物加入了不同的限制性内切酶位点，保证扩增的基因能够亚克隆到表达载体质粒上，并且毒力蛋白编码基因与载体质粒上的组氨酸编码序列连接中不产生移码突变。6种毒力蛋白编码基因PCR扩增所用引物序列如表1所示。

表1、扩增幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因的引物

PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，不同的毒力蛋白编码基因的大小与预期的产物完全相同，扩增结果如图2所示，PCR扩增成功，扩增产物可以用于下一步克隆实验。

(4)利用TA克隆的方法，将毒力蛋白编码基因的扩增产物分别克隆到TOPO TA

Kits试剂盒或T-EASAY试剂盒的质粒载体上。

连接体系包括1μL连接载体pCR2.1TOPO或

-T Easy、5μL连接缓冲液、1μL扩增产物、1μL连接酶和2μL水，37oC连接0.5h，连接产物转化大肠杆菌。

首先制备大肠杆菌化学感受态细胞，挑取大肠杆菌XL1-Gold单个菌落于液体LB培养基中，37℃过夜培养。转接过夜培养物至200mL LB培养基中，接种量为1％，继续培养对数期(OD₆₀₀约0.5)，将培养液转入离心管中冰浴，至完全冷却；将培养液于4℃、3500rpm离心10min。菌体沉淀用10mL 0.1mol/L氯化镁溶液重悬冰浴5min，然后于4℃、3500rpm离心10min；10mL 0.1mol/L氯化钙溶液重悬沉淀冰浴30min，而后4℃、3500rpm离心10min；用2mL混合溶液(0.1mol/L氯化钙/15％甘油保存)重悬沉淀，混匀后以200μL/管(离心管预先冰浴10min)分装，最终于-70℃保存；

其次进行转化，取上述5μL PCR产物的连接产物和200μL大肠杆菌XL1-Gold感受态细胞混匀，冰浴30min，42℃热激30s，而后于冰上静置2min。加入200μL LB液体培养基，于37℃振荡培养20min后，取100μL涂于蓝白筛选培养基(Amp 100μg/mL、X-GAL 40μg/mL和IPTG 1mmol/L)的平板上，37℃过夜培养。

最后进行转化子鉴定，用无菌牙签挑取白色菌落，于LB液体培养基(Amp 100μg/mL)中扩增培养后，取1mL菌液保存，剩余培养液用于质粒的提取和酶切鉴定。

(5)含有毒力蛋白编码基因的质粒，经过限制性内切酶酶切，制备含有毒力蛋白编码基因的DNA片段，进一步亚克隆到经过同样限制性内切酶酶切的表达载体pQE30上。

转化子经过提取质粒，用限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳后，挑选重组质粒，即包括载体本身和PCR片段的质粒，经过上述分析确定正确后，进一步进行DNA序列分析，确定载体质粒与插入DNA片段连接正确，正确的克隆用于蛋白表达的实验。凝胶电泳见图1。

二、重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白的表达与纯化

(1)挑取正确转化子的单菌落，接种于含有抗菌素的LB液体培养基中，37℃，250rpm/min振荡培养过夜。将过夜培养物按照10％转接至含有抗菌素的LB液体培养基中，37℃，250rpm/min振荡培养至OD₆₀₀＝0.4-0.5。取1ml菌液离心收集菌体，-20℃冻存备用；

(2)加入诱导剂IPTG终浓度为1mM，28℃，200rpm/min振荡培养6～8小时。取1ml菌液离心收集菌体，-20℃冻存备用；

(3)将诱导前后菌体沉淀分别加入100μL的2×SDS上样缓冲液，煮沸加热10min，利用SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析，考马斯亮蓝染色3小时后，脱色观察结果；

(4)选取诱导成功的细菌克隆，扩大培养规模，收集菌体沉淀，准备做下一步纯化；

(5)将菌体沉淀溶于适量裂解液中，室温下搅拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。10000g 4℃离心30min，收集上清液；

(6)将Ni-NTA Agarose充填柱子，并连接于Bio-rad低压液相层析系统，用5倍柱体积的裂解液平衡Ni-NTA Agarose，调节A₂₈₀值至零线；

(7)将上清液上样到Ni-NTA Agarose柱子中，并用lysis buffer冲洗至A₂₈₀值低于0.01。分别用5～10倍柱体积的清洗液1和清洗液2(Wash buffer 1 and 2市售产品)清洗柱子，直至洗脱液A₂₈₀值低于0.01；

(8)用洗脱液(Elution buffer)洗脱重组蛋白质，在A₂₈₀值监测下，收集出现峰线后含有重组蛋白的所有洗脱液；

利用聚丙烯先凝胶电泳SDS-PAGE分析产物的纯度和数量，结果如图3所示，在SDS-PAGE图谱上，呈现为6种重组毒力蛋白的条带，基本不存在其它条带。

Claims

1.一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于：试剂盒包括微孔板、酶标二抗、阴性血清对照、阳性血清对照、底物、终止液和洗液，其中微孔板包被纯化的重组幽门螺旋杆菌毒素蛋白，所述底物为含有1％m/m 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺和30％v/v过氧化氢的溶液，所述重组幽门螺旋杆菌毒素蛋白为细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A和尿素酶亚基B。

2.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于：所述微孔板为透明聚苯乙烯微孔板，微孔底部为平底。

3.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于：所述纯化的重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗原单独包被微孔，或混合包被微孔。

4.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于：所述终止液为硫酸、盐酸、氢氧化钠或乙二胺四乙酸钠等。

5.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于：所述洗液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液或三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液。

6.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒，其特征在于：所述酶标二抗为鼠或兔抗人辣根过氧化物酶HRP标记的抗体。

7.一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白抗体检测试剂盒的检测方法，其特征在于：步骤为：将血清或血浆标本加入微孔中孵育，与包被的幽门螺旋杆菌毒力蛋白反应，标本中可能存在的抗体与相应的毒力蛋白结合，洗板后，加入酶标二抗，孵育后再洗板，孵育后洗板，加入底物显色，反应结束时加入终止液，利用酶标仪进行读数，检测标本中抗体的种类和数量。