CN116375823B - 携带幽门螺杆菌毒力因子的b细胞表位靶标抗原及其表达载体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了携带幽门螺杆菌Hp毒力因子CagA和VacA的B细胞表位靶标抗原（TBEA）及其分别在鸡伤寒沙门氏菌SadA类型和YaiU类型的T5SS展呈表达及其检测Hp凝集抗体中的应用。本发明的特异性TBEA分别来自CagA和VacA，分别利用两种类型的T5SS展呈表达。通过间接凝集试验，验证菌体表面能展呈两种TBEAs，两种TBEAs精准识别和结合针对Hp抗体，形成TBEA‑抗体复合物聚合体，肉眼清晰可见，从而实现特异、敏感、快速的Hp凝集抗体检测。本发明能够特异性检测特异性凝集抗体，且该敏感性显著高于基于蛋白质抗原的传统血清学检测技术，且能定量检测特异性凝集抗体效价。
Description
技术领域
本发明属于生物医学和免疫诊断检测技术领域，具体涉及携带幽门螺杆菌毒力因子的B细胞表位靶标抗原及其表达载体和应用。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori，Hp)是一种微需氧的革兰氏阴性菌，是导致人类多种胃肠疾病的主要病因，通过尿素酶利用系统、靶向壁细胞降低胃酸等机制得以在胃内极低pH环境下生存，通过消化道口-口、粪-口等传播途径感染，已有报道感染世界范围内超过50％人群，可导致慢性胃炎、消化性溃疡、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，甚至胃癌。由于临床大多数患者为无症状带菌状态，未得到应有的重视，从而可能导致病情发展和胃癌等严重疾病的发生，目前，幽门螺杆菌列为I类致癌物，根除该菌也已被列为预防胃癌的主要策略。另外，鉴于目前幽门螺杆菌感染缺少疫苗有效防控且该菌多重耐药性问题日益严重，临床上对其根除效果不佳。因此，精准的检测技术是预防感染幽门螺杆菌以及评估干预治疗是否根除此菌的关键，也是评估感染后治疗效果的重要手段。
幽门螺杆菌的检测方法主要包括尿素呼气试验、快速尿素酶试验、粪便抗原检测、血清学检查、内镜检查、组织学病理检查、聚合酶链式反应以及细菌培养，上述方法在临床上皆存在一定的局限性，如尿素呼气试验、快速尿素酶试验、粪便抗原检测、血清学检查等方法中，结果判定中设定临界值(通常为一定群体数量的阈值平均值)对特定个体存在不确定性，尿素呼气试验、快速尿素酶试验、粪便抗原检测也受到使用药物的干扰影响以及技术人员操作差异影响等，而聚合酶链式反应以及细菌培养的样品来源局限和取样不易。目前，对于幽门螺杆菌检测的“金标准”尚无统一定论。近年来，越来越多的医学指南建议使用尿素呼气试验作为诊断幽门螺杆菌的首要非侵入性检测手段，但结果判定中设定临界值的平均值对特定个体确实存在不确定性，研究表明临界值在一定群体的个体数量上影响检测的特异性，而如何明晰选择合适的临界值没有标准，事实上，临界阈值对个体而言各不一致。基于幽门螺杆菌多种蛋白质抗原的血清学检测目前通常认为不适用于幽门螺杆菌感染的早期诊断，亦不作为评估根除治疗是否成功的技术手段，因为在基于蛋白质抗原的经典的血清学检测方法中，人体感染幽门螺杆菌数周后血中才会出现特异性抗体，若早期产生的抗体未达到检测阈值的一些个体，则会出现假阴性结果，而根除幽门螺杆菌后血清中抗体，其蛋白质抗原检测的抗体效价能够维持6个月以上，易造成假阳性，基于蛋白质抗原的抗体血清学检查通常也不能用于干预治疗后的复查。PCR检测虽具有较高的灵敏度，细菌培养一般被认为是检测幽门螺杆菌感染的“金标准”，但该方法的敏感性较低，考虑到PCR检测和细菌培养的样品来源局限和取样不易，且易受标本质量、运输条件及时间、环境及技术人员操作差异的影响。
因此，有待研发一种特异敏感、快速方便和成本低廉的H.pylori感染的早期精准诊断、检测监测和疫苗接种效力评估方法。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了基于携带幽门螺杆菌毒力因子的B细胞表位靶标抗原，所述毒力因子包括CagA和VacA。本发明能进行特异敏感、快速方便和成本低廉的进行H.pylori感染的早期精准诊断和疫苗接种效力评估。
本发明还要解决的技术问题是提供了编码所述靶标抗原的核酸或基因。
本发明还要解决的技术问题是提供了表达盒、重组表达载体、重组菌株、凝集抗体检测系统。
本发明还要解决的技术问题是提供了重组表达载体、凝集抗体检测系统或重组菌株的构建方法。
本发明还要解决的技术问题是提供了靶标抗原、编码所述靶标抗原的核酸或基因、表达盒、重组载体、重组菌株或凝集抗体检测系统在制备检测幽门螺杆菌抗体的试剂或试剂盒中的应用
本发明还要解决的技术问题是提供了结合幽门螺杆菌毒力因子CagA的B细胞表位靶标抗原的凝集抗体。
本发明最后要解决的技术问题是提供了检测幽门螺杆菌凝集抗体的试剂或试剂盒。
技术方案：为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供了携带幽门螺杆菌毒力因子CagA的B细胞表位靶标抗原，所述靶标抗原的氨基酸序列为GDNGGPEARHD，将该靶标抗原命名为Hp-CagA-TBEA-GD11。
本发明内容还包括编码所述的靶标抗原的核酸或基因，其核酸或基因的DNA序列为GGGGATAATGGTGGTCCTGAAGCTAGGCATGAT。
本发明内容还包括表达盒、重组表达载体、重组菌株，包含所述的核酸或基因。
作为优选，所述重组表达载体为pBR-SadA-Hp-CagA-TBEA。
本发明内容还包括一种凝集抗体检测系统，所述凝集抗体检测系统包括所述的表达盒、重组表达载体或重组菌株。
其中，所述重组表达载体是将所述靶标抗原的核酸或基因插入鸡伤寒沙门氏菌SadA类型的V型分泌系统(Type V secretion system，T5SS)的基因序列中，构建得到的重组表达载体。
其中，所述重组菌株包括将重组表达载体导入载体菌中即得。
本发明内容还包括所述的重组表达载体、所述的凝集抗体检测系统或所述的重组菌株的构建方法，包括以下步骤：
(1)携带幽门螺杆菌毒力因子CagA的B细胞表位靶标抗原DNA序列的获得；所述DNA序列为GGGGATAATGGTGGTCCTGAAGCTAGGCATGAT；
(2)将步骤(1)得到的DNA序列插鸡伤寒沙门氏菌SadA类型的V型分泌系统的基因序列中，构建重组表达载体；或/和；
(3)将步骤(2)得到的重组表达载体通过电转化的方式导入载体菌中即得重组菌株。
作为优选地，将所述表达载体pBR-SadA-Hp-CagA-TBEA通过电转化的方式导入载体菌中，通过间接凝集试验验证载体菌表达鸡伤寒沙门氏菌SadA类型的V型分泌系统，其菌体表面能够成功展示表达Hp-CagA-TBEA。
本发明内容还包括靶标抗原、编码所述的靶标抗原的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体、重组菌株或凝集抗体检测系统在制备检测幽门螺杆菌抗体的试剂或试剂盒中的应用。
本发明内容还包括结合幽门螺杆菌毒力因子CagA的B细胞表位靶标抗原的凝集抗体，所述凝集抗体特异性结合所述的B细胞表位靶标抗原。
本发明内容还包括一种检测幽门螺杆菌凝集抗体的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括所述的B细胞表位靶标抗原、所述的表达盒、重组载体、重组菌株或所述的凝集抗体检测系统。
在本发明中，幽门螺杆菌的全基因组编码多种毒力因子，其中cagA基因编码的蛋白作为幽门螺杆菌的主要毒力因子，决定其致病性。高致病性幽门螺杆菌菌株含有一个约40kb的致病岛(cag PAI)，其携带30多个基因，编码功能性的IV型分泌系统(TypeIVsecretion system，T4SS)。T4SS为类似注射器的输送装置，由一个菌毛状结构和和跨膜的胞外部分组成，将CagA输送到宿主靶细胞。CagA为主要效应蛋白，与宿主细胞受体整合素β1结合进入上皮细胞内，与多种蛋白发生相互作用并扰乱细胞正常的信号转导通路，例如丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPK)通路，使上皮细胞发生一系列功能紊乱，导致细胞病变。
VacA作为H pylori毒力因子，也是其启动感染的主要致病因素，vacA基因编码140kDa蛋白的前体，通过自身转运蛋白机制切割N端和C端，产生一个88kDa的成熟分泌毒素，即空泡细胞毒素(VacA)。88kDa的成熟毒素分子通过外膜转移，然后可以作为可溶性蛋白质释放到细胞外或在细菌表面，之后被切割呈两个结构域：p33、p55，p55在介导VacA与宿主细胞结合中重要作用。VacA分子具有多种功能，如空泡化宿主细胞、靶向线粒体诱导细胞凋亡、抑制T细胞活化增殖等，从而定植于胃上皮细胞。
因此，另一方面，本发明还提供了携带幽门螺杆菌毒力因子VacA的B细胞表位靶标抗原，所述靶标抗原的氨基酸序列为ANVEARYYYGD，将其靶标抗原命名为Hp-VacA-TBEA-AD11。
本发明内容还包括编码所述的靶标抗原的核酸或基因，所述核酸或基因的DNA序列为GCTAATGTGGAAGCGCGCTATTATTATGGAGAC。
本发明内容还包括表达盒、重组表达载体、重组菌株，包含所述的核酸或基因。
本发明内容还包括一种凝集抗体检测系统，所述凝集抗体检测系统包括所述的表达盒、重组表达载体或重组菌株。
其中，所述重组表达载体是将所述靶标抗原的核酸或基因插入鸡伤寒沙门氏菌YaiU类型的V型分泌系统的基因序列中，构建得到的重组表达载体。
作为优选，所述的重组表达载体为pBR-YaiU-Hp-VacA-TBEA。
其中，所述重组菌株包括将重组表达载体导入载体菌中即得。
本发明所述的重组表达载体、所述的凝集抗体检测系统或所述的重组菌株的构建方法，包括以下步骤：
(1)携带幽门螺杆菌毒力因子VacA的B细胞表位靶标抗原DNA序列的获得；所述DNA序列为GCTAATGTGGAAGCGCGCTATTATTATGGAGAC；
(2)将步骤(1)得到的DNA序列插鸡伤寒沙门氏菌YaiU类型的V型分泌系统的基因序列中，构建重组表达载体；或/和；
(3)将步骤(2)得到的重组表达载体通过电转化的方式导入载体菌中即得重组菌株。
作为优选地，将所述重组表达载体pBR-YaiU-Hp-VacA-TBEA导入载体菌中，通过间接凝集试验验证载体菌表达鸡伤寒沙门氏菌YaiU类型的V型分泌系统，其菌体表面能成功展示表达Hp-VacA-TBEA。
本发明内容还包括所述的幽门螺杆菌毒力因子B细胞表位靶标抗原、编码所述的靶标抗原的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体、重组菌株或凝集抗体检测系统在制备检测幽门螺杆菌抗体的试剂或试剂盒中的应用。
本发明内容还包括结合幽门螺杆菌毒力因子VacA的B细胞表位靶标抗原的凝集抗体，所述凝集抗体特异性结合所述的B细胞表位靶标抗原。
本发明内容还包括一种检测幽门螺杆菌凝集抗体的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括所述的B细胞表位靶标抗原、所述的表达盒、重组载体、重组菌株或所述的凝集抗体检测系统。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优势：
1、本发明通过SadA类型的V型分泌系统展呈表达靶标抗原而不是完整蛋白质抗原，并在载体菌表面表达放大靶标抗原数量，大大地提高抗体检测的特异性和敏感性；同时利用靶标抗原(CagA-TBEA)替代完整的蛋白质抗原(CagA-蛋白质)，而事实上CagA-TBEA正是结合和识别特异性凝集抗体的抗原表位，这一靶向抗原抗体特异识别反应，去除了蛋白质抗原中由于存在非靶标抗原而导致的多种背景反应，有效地保障了本检测方法的专一特异性。基于SadA类型的V型分泌系统展呈表达靶标抗原，通过间接凝集试验验证载体菌表达鸡伤寒沙门氏菌SadA类型的V型分泌系统，其菌体表面成功展示表达Hp-CagA-TBEA，无需传统血清学检测方法所需的蛋白质抗原制备，包括蛋白质抗原异源表达、纯化、包被和非特异性清洗等多步骤，同时去除了蛋白质抗原中由于存在非靶标抗原而导致的多种背景反应，可保障抗原表位专一识别与结合特异性凝集抗体，特异敏感。
2、本发明基于VacA蛋白分子在启动H.pylori感染和致病中的作用，探索了毒力因子VacA的B细胞表位靶标抗原(TBEA)，通过YaiU类型的V型分泌系统展呈表达靶标抗原，并在载体菌表面展呈表达放大靶标抗原数量，大大地提高抗体检测的敏感性；同时利用靶标抗原替代完整的蛋白质抗原，而事实上VacA靶标抗原正是结合和识别特异性凝集抗体的抗原表位，这一靶向抗原抗体反应有效地保障了本检测方法的专一特异性，克服了蛋白质抗原抗体反应中由于存在非靶标抗原而导致的多种背景反应的技术瓶颈局限。本发明基于YaiU类型的V型分泌系统展呈表达靶标抗原，通过间接凝集试验验证载体菌表达鸡伤寒沙门氏菌YaiU类型的V型分泌系统，其菌体表面成功展示表达Hp-VacA-TBEA，能形成TBEA-抗体复合物聚合体，肉眼清晰可见，无需传统血清学检测方法所需的蛋白质抗原制备，包括蛋白质抗原异源表达、纯化、包被和非特异性清洗等多步骤，可保障抗原表位专一识别与结合特异性凝集抗体，特异敏感。
附图说明
图1、鸡伤寒沙门氏菌SadA类型的V型分泌系统结构示意图。
图2、鸡伤寒沙门氏菌SadA类型的V型分泌系统编码基因(sadA基因)的PCR扩增鉴定电泳图。其中泳道M为Trans 2K plus II DNA Marker，泳道1为鸡伤寒沙门氏菌标准株NCTC 13346的PCR扩增产物；泳道2为鸡伤寒沙门氏菌疫苗株SG01的PCR扩增产物；泳道3为鸡伤寒沙门氏菌分离株C79-23的PCR扩增产物；泳道4为禽致病性大肠杆菌分离株APEC-XM的基因组作为阴性对照；泳道5为大肠杆菌工程菌DH5α的基因组作为阴性对照。
图3、表达载体pBR-SadA酶切鉴定的核酸电泳图。其中泳道M为Trans 2K plus IIDNA Marker，泳道1为重组环状质粒pBR-SadA，泳道2为BamHI单酶切pBR-SadA的DNA条带，泳道3为SalI单酶切pBR-SadA的DNA条带，泳道4为BamHI和SalI双酶切pBR-SadA的DNA条带。
图4、插入Hp-CagA-TBEA-GD11序列后sadA-Hp-CagA-TBEA-GD11的PCR扩增鉴定电泳图。其中泳道M为Trans 2K Plus II DNA Marker，泳道1为sadA基因的PCR扩增产物，模板DNA来自鸡伤寒沙门氏菌标准株NCTC 13346，作为阳性对照；泳道2为sadA-Hp-CagA-TBEA-GD11的PCR扩增产物；泳道3为禽致病性大肠杆菌分离株APEC-XM的基因组作为阴性对照；泳道5为大肠杆菌工程菌DH5α的基因组作为阴性对照。
图5、含sadA-Hp-CagA-TBEA-GD11基因的重组质粒pBR-SadA-Hp-CagA-TBEA-GD11酶切鉴定电泳图。其中泳道M为Trans 2K Plus II DNA Marker，泳道1为pBR322环状质粒阴性对照；泳道2为pBR-SadA-Hp-CagA-TBEA-GD11环状质粒；泳道3为pBR-SadA-Hp-CagA-TBEA-GD11的BamHI单酶切产物；泳道4为pBR-SadA-Hp-CagA-TBEA-GD11的SalI单酶切产物；泳道5为pBR-SadA-Hp-CagA-TBEA-GD11的BamHI和SalI双酶切产物。
图6、表达载体pBR-SadA-Hp-CagA-TBEA-GD11重组质粒示意图。
图7、H.pylori凝集抗体检测系统载体菌DH-5a+SadA-Hp-CagA-TBEA-GD11，分别与不同来源H.pylori阳性血清凝集反应结果图。A：阴性个体对照1，Hp凝集抗体检测系统与健康人志愿者(未感染幽门螺杆菌)血清样品的不凝集反应；B：阴性个体对照2，Hp凝集抗体检测系统与健康SPF小鼠血清样品均不凝集；C：Hp凝集抗体检测系统与人工感染幽门螺杆菌的小鼠血清样品的凝集反应；D：Hp凝集抗体检测系统与幽门螺杆菌感染确诊患者志愿者血清样品的凝集反应；E：阴性对照1，Hp凝集抗体检测系统与小鼠肝螺杆菌阳性血清样品均不凝集；F：阴性对照2，Hp凝集抗体检测系统与小鼠源的人空肠弯曲杆菌阳性血清样品均不凝集；G：阴性对照3，Hp凝集抗体检测系统与O2大肠杆菌阳性血清样品均不凝集；H：阴性对照4，Hp凝集抗体检测系统与O78大肠杆菌阳性血清样品均不凝集；I：阴性对照5，Hp凝集抗体检测系统与O157大肠杆菌阳性血清样品均不凝集；J：阴性对照6，Hp凝集抗体检测系统与鸭沙门氏菌阳性血清样品均不凝集；K：阴性对照7，Hp凝集抗体检测系统与鼠伤寒沙门氏菌阳性血清样品均不凝集；L：阴性对照8，Hp凝集抗体检测系统与鼠伤寒沙门氏菌阳性血清样品均不凝集。
图8、Hp-CagA凝集抗体检测系统的抗体效价定量测试结果。
图9、鸡伤寒沙门氏菌YaiU类型的V型分泌系统结构示意图。
图10、鸡伤寒沙门氏菌V型分泌系统YaiU编码基因(yaiU基因)的PCR扩增鉴定电泳图。其中泳道M为Trans 2K plus II DNA Marker，泳道1为鸡伤寒沙门氏菌标准株NCTC13346的PCR扩增产物；泳道2为鸡伤寒沙门氏菌疫苗株SG01的PCR扩增产物；泳道3为禽致病性大肠杆菌分离株APEC-XM的基因组作为阴性对照；泳道4为大肠杆菌工程菌DH5α的基因组作为阴性对照。
图11、表达载体pBR-YaiU酶切鉴定的核酸电泳图。其中泳道M为Trans 2K plusIIDNA Marker，泳道1为重组环状质粒pBR-YaiU，泳道2为BamHI单酶切pBR-YaiU的DNA条带，泳道3为SalI单酶切pBR-YaiU的DNA条带，泳道4为BamHI和SalI双酶切pBR-YaiU的DNA条带。
图12、插入Hp-VacA-TBEA-AD11序列后yaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11的PCR扩增鉴定电泳图。其中泳道M为Trans 2K Plus II DNA Marker，泳道1为yaiU基因的PCR扩增产物，模板DNA来自鸡伤寒沙门氏菌标准株NCTC 13346，作为阳性对照；泳道2为yaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11的PCR扩增产物；泳道3为禽致病性大肠杆菌分离株APEC-XM的基因组作为阴性对照；泳道5为大肠杆菌工程菌DH5α的基因组作为阴性对照。
图13、含yaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11基因的重组质粒pBR-YaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11的酶切鉴定电泳图。其中泳道M为Trans 2K Plus II DNAMarker，泳道1为pBR322环状质粒阴性对照；泳道2为pBR-YaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11环状质粒；泳道3为pBR-YaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11的BamHI单酶切产物；泳道4为pBR-YaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11的SalI单酶切产物；泳道5为pBR-YaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11的BamHI和SalI双酶切产物。
图14、表达载体pBR-YaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11重组质粒示意图。
图15、H.pylori凝集抗体检测系统DH-5α+YaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11，分别与不同来源H.pylori阳性血清凝集反应结果图。A：阴性个体对照1，Hp凝集抗体检测系统与健康人志愿者(未感染幽门螺杆菌)血清样品的不凝集；B：阴性个体对照2，Hp凝集抗体检测系统与健康SPF小鼠血清样品均不凝集；C：Hp凝集抗体检测系统与人工感染幽门螺杆菌的小鼠血清样品的凝集反应；D：Hp凝集抗体检测系统与幽门螺杆菌感染确诊患者志愿者血清样品的凝集反应；E：阴性对照1，Hp凝集抗体检测系统与小鼠肝螺杆菌阳性血清样品均不凝集；F：阴性对照2，Hp凝集抗体检测系统与小鼠源的人空肠弯曲杆菌阳性血清样品均不凝集；G：阴性对照3，Hp凝集抗体检测系统与O2大肠杆菌阳性血清样品均不凝集；H：阴性对照4，Hp凝集抗体检测系统与O78大肠杆菌阳性血清样品均不凝集；I：阴性对照5，Hp凝集抗体检测系统与O157大肠杆菌阳性血清样品均不凝集；J：阴性对照6，Hp凝集抗体检测系统与鸭沙门氏菌阳性血清样品均不凝集；K：阴性对照7，Hp凝集抗体检测系统与鼠伤寒沙门氏菌阳性血清样品均不凝集；L：阴性对照8，Hp凝集抗体检测系统与鼠伤寒沙门氏菌阳性血清样品均不凝集。
图16、Hp-VacA凝集抗体检测系统的抗体效价定量测试结果。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解：本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解：本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1鸡伤寒沙门氏菌SadA类型的V型分泌系统基因的克隆和在载体菌菌体表面展示功能验证SadA
沙门氏菌SadA类型的V型分泌系统，位于细菌表面的一种关键毒力因子，由N端的信号肽序列，载客结构域，连接片和β-结构域4部分组成(图1)。其中，载客结构域在分泌过程中能展示特殊功能肽段至胞外，通过SadA类型的V型分泌系统表面展呈表达本申请发明幽门螺杆菌特异性TBEA。因此，SadA类型的V型分泌系统基因的克隆和功能鉴定是本发明的前提条件。基于鸡伤寒沙门氏菌源SadA类型的V型分泌系统基因的扩增和鉴定，克隆至pBR322表达质粒，通过电转化的方式将重组质粒pBR-SadA导入大肠杆菌载体菌中扩增表达，并进一步通过间接凝集试验表明携带重组质粒pBR-SadA的重组工程菌细菌悬液与鸡伤寒沙门氏菌阳性血清出现明显的凝集现象，验证大肠杆菌载体菌功能性表达鸡伤寒沙门氏菌SadA类型的V型分泌系统。具体实施程序如下：
根据NCBI公布的鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella Gallinamm)NCTC 13346全基因组序列设计分子克隆引物，上游引物SP sadA Up 5’-GACGGATCCATGAATAGAATATTTAAAGTCCTCTGGAAT-3’，下游引物SP sadA Down 5’-CGCGTCGACTTACCACTGGAAGCCCG-3’，下划线序列分别代表BamHI和SalI限制性酶切位点，上述引物由南京擎科生物科技有限公司合成。
以鸡伤寒沙门氏菌NCTC 13346菌株的基因组为模板，利用上、下游引物SP sadAUp/Down进行PCR扩增，扩增体系为：2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTPs 1μL，上下游引物(10mM)各2μL，NCTC 13346基因组(250ng/μL)1 μL，超纯水18μL。将上述体系混合均匀后利用热循环仪(Bio-Red)进行PCR扩增，程序如下：预变性95℃ 3min，扩增阶段共35个循环，包括变性95℃ 30s、退火56.5℃ 30s和延伸72℃ 4.5min，进一步扩增72℃5min，扩增结束后温度降低至12℃。鸡伤寒沙门氏菌疫苗株SG01(Dai，Peng；Wu，Hu-Cong；Ding，Hai-Chuan；Li，Shou-Jun；Bao，En-Dong；Yang，Bao-Shou；Li，Ya-Jie；Gao，Xiao-Lei；Duan，Qiang-de；Zhu，Guo-Qiang.Safety and protective effects of an avirulent SalmonellaGallinarum isolate as a vaccine candidate against Salmonella Gallinaruminfections in young chickens[J].Veterinary Immunology and Immunopathology，2022.253：110501.)和鸡伤寒沙门氏菌标准株C79-23(购自中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心)的基因组作为阳性对照；禽致病性大肠杆菌分离株APEC-XM(刘家奇，武琥琮，尹义，张东，夏芃芃，任文凯，朱国强.禽源大肠杆菌致新生儿大肠杆菌型脑膜炎小鼠模型的构建研究[J].中国家禽，2019，41(10)：26-30.)和大肠杆菌工程菌DH5α的基因组作为阴性对照。
配置1％的琼脂糖凝胶，110V电泳45min后利用溴化乙锭染色后在紫外成像仪下成像观察，结果如图2所示，鸡伤寒沙门氏菌标准株NCTC 13346、鸡伤寒沙门氏菌疫苗株SG01和鸡伤寒沙门氏菌分离株C79-23均扩增出4276bp的DNA产物；禽致病性大肠杆菌分离株APEC-XM和大肠杆菌工程菌DH5α的基因组中未扩增出任何条带。利用通用型DNA纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取鸡伤寒沙门氏菌标准株NCTC 13346基因组的PCR扩增产物。
提取pBR322质粒(商品化质粒，购自淼灵质粒平台，货号P0090)，利用NheI和SalI限制性内切酶(NEB)对鸡伤寒沙门氏菌标准株NCTC 13346的sadA基因(Genbank登录号AM933173.1，3931983-3936183)PCR扩增产物与pBR322质粒分别进行双酶切，然后利用T4DNA连接酶(NEB)对上述线性DNA片段在16℃金属浴中过夜连接，次日将连接产物转化DH-5α感受态细胞(代红星，张庆桥，樊宝良.一种简捷有效的大肠杆菌感受态细胞制备方法[J].安徽农业科学，2008(29)：12627-12628.)通过涂布含100μg/mL的氨苄青霉素固体培养基进行抗性菌落筛选。挑取平板上的单菌落接种至含100μg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中生长至平台期，提取质粒后经NheI、SalI单酶切和两种限制性内切酶双酶切。配置1％的琼脂糖凝胶，110V电泳45min后利用溴化乙锭染色后在紫外成像仪下成像观察，结果如图3所示，重组质粒pBR-SadA的BamHI和SalI单酶切产物均为8363bp，双酶切产物为4085bp的线性载体和4278bp的SadA线性DNA片段，与预期片段大小一致，通过DNA测序验证(南京擎科生物科技有限公司)。
携带sadA基因的重组质粒pBR-SadA的DH-5α工程菌在含100μg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中生长14小时至平台期，4000rpm离心5min后弃上清，用等体积无菌生理盐水重悬，离心洗涤2次后制备细菌悬液(终浓度1×1010CFU/mL)。将上述重组DH-5α工程菌细菌悬液与SPF鸡阴性血清(北京勃林格殷格翰公司)和鸡伤寒沙门氏菌阳性血清(经鸡伤寒沙门氏菌疫苗株SG01两次免疫SPF鸡，在免疫后45天采血后析出获得)进行凝集试验，并利用含pBR322空载体的DH-5α工程菌的细菌悬液作为阴性对照。结果如表1所示，两种菌株的细菌悬液均不与阴性血清发生反应。携带重组质粒pBR-SadA的DH-5α工程菌细菌悬液与阳性血清出现明显的凝集现象，凝集颗粒大，背景清晰；而含pBR322空载体的DH-5α工程菌细菌悬液与阳性血清不发生凝集现象，无凝集颗粒，背景呈浑浊状。该结果表明来自鸡伤寒沙门氏菌SadA类型的的V型分泌系统能够在DH-5α工程菌表面功能性展呈表达。
表l携带重组质粒pBR-SadA的DH-5a工程菌表达鸡伤寒沙门氏菌SadA的功能验证
实施例2携带幽门螺杆菌毒力因子CagA的B细胞表位靶标抗原(TBEA)的SadA类型的V型分泌系统表达载体构建及其功能性表达验证
基于鸡伤寒沙门氏菌V型分泌系统SadA基因的克隆和在载体菌菌体表面展示功能验证的基础上，将幽门螺杆菌(H.pylori)毒力因子CagA的一种B细胞表位TBEA的DNA序列插入鸡伤寒沙门氏菌SadA类型的V型分泌系统基因序列中，构建表达载体pBR-SadA-Hp-TBEA，导入大肠杆菌载体菌中扩增表达，验证在载体菌菌体表面成功展示表达pBR-SadA-Hp-TBEA。具体实施程序如下：
通过NCBI数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)检索H..pylori J99菌株(韩秀瑞.幽门螺杆菌黏附素BabA蛋白结合区特征及其作用分析[D].中国疾病预防控制中心，2021.)序列(登录号：AE001439.1)，从全基因组中找到毒力因子CagA蛋白序列(登录号：AAD06073.1)。利用蛋白质数据库(https://www.rcsb.org/)找到已经解析的CagA晶体结构，从而保障H..pylori的TBEA在空间结构的独特性(引用晶体结构的蛋白数据库ID为：4DVY)。利用NovoPro在线工具(https://www.novopro.cn/tools/)对CagA氨基酸序列进行疏水性分析，筛选亲水基序，并通过蛋白质分析软件Pymol(https://pymol.org/2/)在空间结构上进行进一步分析和比对，筛选出1种表面暴露较好的靶标抗原的氨基酸序列即为TBEA，分别为：Hp-CagA-TBEA-GD11：GDNGGPEARHD。其对应的TBEA的基因序列分别为：Hp-CagA-TBEA-GD11：GGGGATAATGGTGGTCCTGAAGCTAGGCATGAT。
同上方法，通过Pymol软件分析鸡伤寒沙门氏菌SadA类型的V型分泌系统蛋白结构中暴露性好的基序作为TBEA替代区域。分析结果如表2所示，在SadA蛋白的筛共选到8个暴露性好的替代位点，由于上述筛选到的TBEA均为亲水基序，因此根据8个替代序列的亲水性对替代位点进行评分，评分规则如下：序列中每存在一个疏水氨基酸-1分，每存在一个亲水氨基酸(包括极性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸)+1分，得分最高的序列作为替代TBEA的基序，即YHANSTEEDS，该序列亲水性评分达到9，包含10个亲水氨基酸，其基因序列为TACCACGCAAACTCAACGGAAGAAGATTCA。
表2筛选到的SadA蛋白潜在替代TBEA的位点
由南京擎科生物科技有限公司合成一种嵌合基因，由Hp-CagA-TBEA-GD11替代sadA基因序列中的替代位点，获得的嵌合基因命名为sadA-Hp-CagA-TBEA-GD11。以上述嵌合基因为模板(1μL，含1ng嵌合基因)，鸡伤寒沙门氏菌标准株NCTC 13346基因组作为阳性对照，禽致病性大肠杆菌分离株APEC-XM基因组和大肠杆菌工程菌DH5α基因组作为阴性对照，并用实施例1中提到的一对引物SP sadAUp和SP sadADown进行PCR扩增，PCR的体系和程序与实施例1中完全一致。配置1％的琼脂糖凝胶，110V电泳45min后利用溴化乙锭染色后在紫外成像仪下成像，PCR结果如图4所示，阳性对照的扩增大小为4278bp；sadA-Hp-CagA-TBEA-GD11的PCR产物为：4278bp；阴性对照无扩增条带。利用通用型DNA纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取sadA-Hp-CagA-TBEA-GD11PCR扩增产物。
提取pBR322质粒，利用BamHI和SalI限制性内切酶(NEB)对sadA-Hp-CagA-TBEA-GD11 PCR扩增产物与pBR322质粒分别进行双酶切，然后利用T4 DNA连接酶(NEB)对上述线性DNA片段在16℃金属浴中过夜连接，次日将连接产物转化DH-5α感受态细胞，通过涂布含100μg/mL的氨苄青霉素固体培养基进行抗性筛选。挑取平板上的单菌落接种至含100μg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中生长至平台期，提取质粒后经BamHI、SalI单酶切和两种限制性内切酶双酶切。配置l％的琼脂糖凝胶，110V电泳45min后利用溴化乙锭染色后在紫外成像仪下成像，结果如图5所示，重组质粒pBR-SadA-Hp-CagA-TBEA-GD11的BamHI和SalI单酶切产物分别为8361bp和8361 bp；两种载体的双酶切产物菌包含4085bp的线性载体，以及4276bp的sadA-Hp-CagA-TBEA-GD11线性DNA片段，与预期大小一致。
携带重组质粒pBR-SadA-Hp-CagA-TBEA-GD11的DH-5α工程菌在含100μg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中生长至平台期，4000rpm离心5min后弃上清，用等体积无菌生理盐水重悬，连续离心洗涤2次，制备细菌悬液(终浓度1×1010CFU/mL)。将携带上述重组质粒的重组DH-5α工程菌细菌悬液与Hp-CagA阴性血清(SPF小鼠血清和健康人志愿者血清各10份)和Hp阳性血清(人工感染小鼠血清10份，Hp感染确诊患者志愿者血清10份)分别进行凝集试验，并利用含pBR-SadA的DH-5α工程菌的细菌悬液作为阴性对照。结果如表3所示，所有菌株的细菌悬液均不与阴性血清发生反应；携带重组质粒pBR-SadA-Hp-CagA-TBEA-GD11的重组DH-5α工程菌细菌悬液与阳性血清出现显著的凝集现象，凝集颗粒大，背景清晰；而仅含pBR-SadA质粒的DH-5α工程菌细菌悬液与阳性血清均不发生凝集现象，无凝集颗粒，背景呈浑浊状。该结果表明来自Hp-CagA的B细胞表位靶标抗原(TBEA)能够通过SadA类型的V型分泌系统实现菌体表面展呈表达，并且能够特异性检测针对Hp的抗体。
在该抗体检测系统中，大肠杆菌DH-5α+pBR-SadA细菌悬液作为对照系统，抗体检测系统仅增加TBEA替代蛋白质抗原，专一识别与结合特异性抗体，排除蛋白质抗原中由于存在非靶标抗原而导致的多种背景反应和假阳性反应，从而确保个体精准诊断；DH-5α+pBR-SadA-Hp-CagA-TBEA-GD11细菌悬液作为Hp特异性抗体检测系统，靶标抗原特异性识别针对Hp-CagA的抗体。
表3载体菌DH-5α表面展呈表达SadA-Hp-CagA-TBEA的功能验证
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注：“-”代表凝集反应阴性；“+”代表凝集反应阳性
实施例3Hp-CagA凝集抗体检测系统的特异性和敏感性测试
基于载体菌DH-5α表面展呈表达SadA-Hp-CagA-TBEA的功能验证，进一步对Hp凝集抗体检测系统的特异性和敏感性测试，具体实施程序如下：
根据实施例2中的相同方法，准备对照系统DH-5α+pBR-SadA细菌悬液、Hp凝集抗体检测系统DH-5α+pBR-SadA-Hp-CagA-TBEA-GD11细菌悬液。将上述三种细菌悬液分别与不同背景来源的血清进行凝集测试，以验证该凝集抗体检测系统的特异性，参与检测的血清包括：100份健康人志愿者(未感染幽门螺杆菌)血清(由江苏省苏北人民医院提供)、8份健康SPF小鼠血清(由扬州大学比较医学中心朱国强教授课题组提供)、40份幽门螺杆菌感染确诊患者血清(由江苏省苏北人民医院提供)、10份人工感染幽门螺杆菌小鼠血清(由扬州大学比较医学中心朱国强教授课题组提供)、1份小鼠肝螺杆菌阳性血清(由扬州大学比较医学中心张泉教授课题组提供)、8份小鼠源的人空肠弯曲杆菌阳性血清(由北京农林科学院徐福洲研究员提供)、10份O2大肠杆菌阳性血清(由扬州大学比较医学中心朱国强教授课题组提供)、10份O78大肠杆菌阳性血清(由扬州大学比较医学中心朱国强教授课题组提供)、10份O157大肠杆菌阳性血清(由扬州大学比较医学中心朱国强教授课题组提供)、10份鸭沙门氏菌阳性血清(由扬州大学比较医学中心朱国强教授课题组提供)和10份鼠伤寒沙门氏菌阳性血清(由扬州大学比较医学中心朱国强教授课题组提供)。检测结果如表4所示，40份幽门螺杆菌感染确诊患者志愿者血清和10份人工感染幽门螺杆菌小鼠血清与对照系统不发生凝集，而与Hp-CagA抗体检测系统发生凝集反应；同时上述系统与全部健康志愿者(未感染幽门螺杆菌)血清、健康SPF小鼠血清、肝螺杆菌阳性血清、小鼠源的人空肠弯曲杆菌感染阳性血清、O2大肠杆菌阳性血清、O78大肠杆菌阳性血清、O157大肠杆菌阳性血清、鸭沙门氏菌阳性血清和鼠伤寒沙门氏菌阳性血清均不发生凝集反应，其特异性为100％。血清样品的凝集图见图7所示。
表4Hp-CagA靶标抗原导向的凝集抗体检测系统的特异性验证
注：“-”代表凝集反应阴性；“+”代表凝集反应阳性
为明确本发明的测试敏感性，本发明利用幽门螺杆菌标准株NTCT11639感染10只C57BL/6小鼠(第1天)，感染前一天(第0天)利用尾静脉采血采集上述小鼠血清作为阴性对照。从感染后第1天至第15天每天利用尾静脉采血采集所有小鼠全血且制备血清，然后利用Hp-CagA凝集抗体检测系统进行定量测试。测试方式如下：将上述160份血清进行2n倍比稀释：在96孔板各孔中加入10μL无菌生理盐水，然后吸取10μL血清加入每一列的第一孔，与无菌生理盐水充分混合后将10μL稀释的血清加入下一孔，并以此为循环稀释至26倍。将每个稀释度的血清与DH-5α+pBR-SadA和DH-5α+pBR-SadA-Hp-CagA-TBEA-GD11细菌悬液分别进行凝集测试，其中DH-5α+pBR-SadA作为阴性对照，最后一个出现凝集颗粒的稀释度作为该血清抗体效价。凝集试验的阳性率结果如表5所示，感染小鼠中最早可以在第5天检测到凝集抗体，该敏感性显著高于传统血清学检测技术，且随着感染时长的增加，凝集测试的阳性率逐渐增加；定量测试结果如图8所示，在免疫后第14天，可测得感染凝集抗体效价达到1∶16。
综上所述，本发明的Hp-CagA靶标抗原导向的凝集抗体测试方法的特异性和敏感性好。与目前针对Hp-CagA的免疫学检测方法(胶体金、免疫发光、ELISA等)报道的结果比较，本技术的敏感性显著性提高，且能定量检测到特异性凝集抗体效价。
表5Hp-CagA靶标抗原导向的凝集抗体检测系统的敏感性验证
实施例4鸡伤寒沙门氏菌YaiU类型的V型分泌系统基因的克隆和在载体菌菌体表面展示功能验证YaiU
YaiU是沙门氏菌一种V型分泌系统，包括分泌出位于细菌表面的毒力效应因子，由N端的信号肽序列，载客结构域，连接片和β-结构域4部分组成(图9)。其中，载客结构域在分泌过程中能展示特殊功能肽段至胞外，通过YaiU类型的V型分泌系统展呈表达本发明幽门螺杆菌特异性VacATBEA。因此，V型分泌系统YaiU基因的克隆和功能鉴定是本发明的前提条件。基于鸡伤寒沙门氏菌源YaiU类型的v型分泌系统基因的扩增和鉴定，克隆至pBR322表达质粒，通过电转化的方式将重组质粒pBR-YaiU导入大肠杆菌载体菌中扩增表达，并进一步通过间接凝集试验表明携带重组质粒pBR-YaiU的重组工程菌细菌悬液与鸡伤寒沙门氏菌阳性血清出现明显的凝集现象，验证大肠杆菌载体菌功能性表达鸡伤寒沙门氏菌YaiU类型的V型分泌系统。具体实施程序如下：
根据NCBI公布的鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella Gallinamm)NCTC 13346全基因组序列设计分子克隆引物，上游引物SPYaiUUp 5’-GACGGATCCATGCACTCCTGGAAAAAGAAACT-3’，下游引物SP YaiU Down 5’-CGCGTCGACTTACCAGGTATATTTAACACCAACGTT-3’，下划线序列分别代表BamHI和SalI限制性酶切位点，上述引物由南京擎科生物科技有限公司合成。
以鸡伤寒沙门氏菌NCTC 13346菌株的基因组为模板，利用上、下游引物SP YaiUUp/Down进行PCR扩增，扩增体系为：2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTPs 1μL，上下游引物(10mM)各2μL，NCTC 13346基因组(200ng/μL)1μL，超纯水18μL。将上述体系混合均匀后利用热循环仪(Bio-Red)进行PCR扩增，程序如下：预变性95℃ 3min，扩增阶段共35个循环，包括变性95℃ 30s、退火56℃ 30s和延伸72℃ 3min，进一步扩增72℃ 5min，扩增结束后温度降低至12℃。鸡伤寒沙门氏菌疫苗株SG01和鸡伤寒沙门氏菌分离株C79-23的基因组作为阳性对照；禽致病性大肠杆菌分离株APEC-XM和大肠杆菌工程菌DH5α的基因组作为阴性对照。
配置1％的琼脂糖凝胶，110V电泳45min后利用溴化乙锭染色后在紫外成像仪下成像观察，结果如图10所示，鸡伤寒沙门氏菌标准株NCTC 13346、鸡伤寒沙门氏菌疫苗株SG01和鸡伤寒沙门氏菌分离株C79-23均扩增出3033bp的DNA产物；禽致病性大肠杆菌分离株APEC-XM和大肠杆菌工程菌DH5α的基因组中未扩增出任何条带。利用通用型DNA纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取鸡伤寒沙门氏菌标准株NCTC 13346基因组的PCR扩增产物。
提取pBR322质粒，利用BamHI和SalI限制性内切酶(NEB)对鸡伤寒沙门氏菌标准株NCTC13346的yaiU基因(GenBank登录号AM933173.1，423208-426163)PCR扩增产物与pBR322质粒分别进行双酶切，然后利用T4 DNA连接酶(NEB)对上述线性DNA片段在16℃金属浴中过夜连接，次日将连接产物转化DH-5α感受态细胞，通过涂布含100μg/mL的氨苄青霉素固体培养基进行抗性菌落筛选。挑取平板上的单菌落接种至含100μg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中生长至平台期，提取质粒后经BamHI、SaiI单酶切和两种限制性内切酶双酶切。配置1％的琼脂糖凝胶，110V电泳45min后利用溴化乙锭染色后在紫外成像仪下成像观察，结果如图11所示，重组质粒pBR-YaiU的BamHI和SalI单酶切产物均为7118bp，双酶切产物为4085bp的线性载体和3033bp的YaiU线性DNA片段，与预期片段大小一致，通过DNA测序验证(南京擎科生物科技有限公司)。
携带YaiU基因重组质粒pBR-YaiU的DH-5α工程菌在含100μg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中生长14小时至平台期，4000rpm离心5min后弃上清，用等体积无菌生理盐水重悬，离心洗涤2次后制备细菌悬液(终浓度1×1010CFU/mL)。将上述重组DH-5α工程菌细菌悬液与SPF鸡阴性血清(北京勃林格殷格翰公司)和鸡伤寒沙门氏菌阳性血清(经鸡伤寒沙门氏菌疫苗株SG01两次口服免疫SPF鸡，在免疫后45天采血后析出获得)进行凝集试验，并利用含pBR322空载体的DH-5α工程菌的细菌悬液作为阴性对照。结果如表6所示，两种菌株的细菌悬液均不与阴性血清发生反应。携带重组质粒pBR-YaiU的DH-5α工程菌细菌悬液与阳性血清出现明显的凝集现象，凝集颗粒大，背景清晰；而含pBR322空载体的DH-5α工程菌细菌悬液与阳性血清不发生凝集现象，无凝集颗粒，背景呈浑浊状。该结果表明来自鸡伤寒沙门氏菌的YaiU类型的V型分泌系统能够在DH-5α工程菌表面功能性展呈表达。
表6携带重组质粒pBR-YaiU的DH-5α工程菌表达鸡伤寒沙门氏菌YaiU的功能验证
实施例5携带幽门螺杆菌毒力因子VacA的B细胞表位靶标抗原(TBEA)的YaiU类型的V型分泌系统表达载体构建及其功能性表达验证
基于鸡伤寒沙门氏菌YaiU类型的V型分泌系统基因的克隆和在载体菌菌体表面展示功能验证的基础上，将幽门螺杆菌(H.pylori)毒力因子VacA的一种B细胞表位TBEA的DNA序列插入鸡伤寒沙门氏菌YaiU类型的V型分泌系统基因序列中，构建表达载体pBR-YaiU-Hp-TBEA，导入大肠杆菌载体菌中扩增表达，验证在载体菌菌体表面成功展示表达pBR-YaiU-Hp-TBEA。具体实施程序如下：
通过NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)检索Hpylori J99菌株序列(登录号：AE001439.1)，从全基因组中找到毒力因子VacA蛋白序列(登录号：AAD05855.1)。利用蛋白质数据库(https://www.rcsb.org/)找到已经解析的VacA晶体结构，从而保障H.pylori的TBEA在空间结构的独特性(引用晶体结构的蛋白数据库ID为：6ODY)。利用NovoPro在线工具(https://www.novopro.cn/tools/)对VacA氨基酸序列进行疏水性分析，筛选亲水基序，并通过蛋白质分析软件Pymol(https://pymol.org/2/)在空间结构上进行进一步分析和比对，筛选出1种表面暴露较好的靶标抗原的氨基酸序列即为TBEA，为：Hp-VacA-TBEA-AD11：ANVEARYYYGD。其对应的TBEA的基因序列为：Hp-VacA-TBEA-AD11：GCTAATGTGGAAGCGCGCTATTATTATGGAGAC。
同上方法，通过Pymol软件分析鸡伤寒沙门氏菌YaiU类型的V型分泌系统蛋白结构中表面暴露性好的基序作为TBEA替代区域。分析结果如表7所示，在YaiU蛋白的筛共选到8个暴露性好的替代位点，由于上述筛选到的TBEA均为亲水基序，因此根据8个替代序列的亲水性对替代位点进行评分，评分规则如下：序列中每存在一个疏水氨基酸-1分，每存在一个亲水氨基酸(包括极性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸)+1分，得分最高的序列作为替代TBEA的基序，即DRTNDTTKSN，该序列亲水性评分达到9，包含10个亲水氨基酸，其基因序列为GATCGTACTAACGACACGACTAAGTCTAAC。
表7筛选到的YaiU蛋白潜在替代TBEA的位点
由南京擎科生物科技有限公司合成嵌合基因，由Hp-VacA-TBEA-AD11替代yaiU基因序列中的替代位点，获得的嵌合基因命名为yaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11以上述嵌合基因为模板(1μL，含1ng嵌合基因)，鸡伤寒沙门氏菌标准株NCTC 13346基因组作为阳性对照，禽致病性大肠杆菌分离株APEC-XM基因组和大肠杆菌工程菌DH5α基因组作为阴性对照，并用实施例4中提到的一对引物SP YaiU Up和SP YaiU Down进行PCR扩增，PCR的体系和程序与实施例4中完全一致。配置1％的琼脂糖凝胶，110V电泳45min后利用溴化乙锭染色后在紫外成像仪下成像，PCR结果如图12所示，阳性对照的扩增大小为3033bp；yaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11的PCR产物分别为：3033bp；阴性对照无扩增条带。利用通用型DNA纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取YaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11和YaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11的PCR扩增产物。
提取pBR322质粒，利用BamHI和SalI限制性内切酶(NEB)对YaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11 PCR扩增产物与pBR322质粒分别进行双酶切，然后利用T4 DNA连接酶(NEB)对上述线性DNA片段在16℃金属浴中过夜连接，次日将连接产物转化DH-5α感受态细胞，通过涂布含100μg/mL的氨苄青霉素固体培养基进行抗性筛选。挑取平板上的单菌落接种至含100μg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中生长至平台期，提取质粒后经BamHI、SalI单酶切和两种限制性内切酶双酶切。配置1％的琼脂糖凝胶，110V电泳45min后利用溴化乙锭染色后在紫外成像仪下成像，结果如图13所示，重组质粒pBR-YaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11的BamHI和SalI单酶切产物均为7118bp；两种载体的双酶切产物菌包含4085bp的线性载体，以及3033bp的yaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11线性DNA片段，与预期大小一致。
携带重组质粒pBR-YaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11的DH-5α工程菌在含100μg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中生长至对数期后平台期，4000rpm离心5min后弃上清，用等体积无菌生理盐水重悬，连续离心洗涤2次，制备细菌悬液(终浓度1×1010CFU/mL)。将携带上述重组质粒的重组DH-5α工程菌细菌悬液与Hp-VacA阴性血清(SPF小鼠血清和健康人志愿者血清各10份)和Hp阳性血清(人工感染小鼠血清10份，Hp感染确诊患者志愿者血清10份)分别进行凝集试验，并利用含pBR-YaiU的DH-5α工程菌的细菌悬液作为阴性对照。结果如表8所示，所有菌株的细菌悬液均不与阴性血清发生反应；携带重组质粒pBR-YaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11的重组DH-5α工程菌细菌悬液与阳性血清出现明显的凝集现象，凝集颗粒大，背景清晰；而仅含pBR-YaiU质粒的DH-5α工程菌细菌悬液与阳性血清均不发生凝集现象，无凝集颗粒，背景呈浑浊状。该结果表明来自Hp-VacA的B细胞表位靶标抗原(TBEA)能够通过V型分泌系统YaiU实现菌体表面展呈表达，并且能够特异性检测针对Hp的抗体。
在该抗体检测系统中，DH-5α+pBR-YaiU细菌悬液作为对照系统，抗体检测系统仅增加TBEA，专一识别与结合特异性抗体，排除假阳性反应，从而确保个体精准诊断；DH-5α+pBR-YaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11细菌悬液作为Hp靶标抗原导向的特异性抗体检测系统，特异性识别针对Hp-VacA靶标抗原的抗体。
表8载体菌DH-5α表面展呈表达YaiU-Hp-VacA-TBEA的功能验证
注：“-”代表凝集反应阴性；“+”代表凝集反应阳性
实施例6Hp-VacA凝集抗体检测系统的特异性和敏感性测试
基于载体菌DH-5α表面展呈表达YaiU-Hp-VacA-TBEA的功能验证，进一步对Hp凝集抗体检测系统的特异性和敏感性测试，具体实施程序如下：
根据实施例5中的相同方法，准备对照系统DH-5α+pBR-YaiU细菌悬液、Hp凝集抗体检测系统DH-5α+pBR-YaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11细菌悬液。将上述三种细菌悬液分别与不同背景来源的血清进行凝集测试，以验证该凝集抗体检测系统的特异性，参与检测的血清包括：100份健康人志愿者(未感染幽门螺杆菌)血清(由江苏省苏北人民医院提供)、8份健康SPF小鼠血清(由扬州大学比较医学中心朱国强教授课题组提供)、40份幽门螺杆菌感染确诊患者志愿者血清(由江苏省苏北人民医院提供)、10份人工感染幽门螺杆菌小鼠血清(由扬州大学比较医学中心朱国强教授课题组提供)、1份小鼠肝螺杆菌阳性血清(由扬州大学比较医学中心张泉教授课题组提供)、8份小鼠源的人空肠弯曲杆菌阳性血清(由北京农林科学院徐福洲研究员提供)、10份O2大肠杆菌阳性血清(由扬州大学比较医学中心朱国强教授课题组提供)、10份O78大肠杆菌阳性血清(由扬州大学比较医学中心朱国强教授课题组提供)、10份O157大肠杆菌阳性血清(由扬州大学比较医学中心朱国强教授课题组提供)、10份鸭沙门氏菌阳性血清(由扬州大学比较医学中心朱国强教授课题组提供)和10份鼠伤寒沙门氏菌阳性血清(由扬州大学比较医学中心朱国强教授课题组提供)。检测结果如表9所示，40份幽门螺杆菌感染确诊患者志愿者血清和10份人工感染幽门螺杆菌小鼠血清与对照系统不发生凝集，而与Hp-VacA抗体检测系统发生凝集反应；同时上述系统与健康个体(未感染幽门螺杆菌)血清、健康SPF小鼠血清、肝螺杆菌阳性血清、空肠弯曲杆菌感染阳性血清、O2大肠杆菌阳性血清、O78大肠杆菌阳性血清、O157大肠杆菌阳性血清、鸭沙门氏菌阳性血清和鼠伤寒沙门氏菌阳性血清均不发生凝集反应，其特异性为100％。血清样品的凝集图见图15所示。
表9Hp-VacA靶标抗原导向的凝集抗体检测系统的特异性验证
注：“-”代表凝集反应阴性；“+”代表凝集反应阳性
为明确本发明的测试敏感性，本发明利用幽门螺杆菌标准株NTCT11639感染10只C57BL/6小鼠(第1天)，感染前一天(第0天)利用尾静脉采血采集上述小鼠血清作为阴性对照。从感染后第1天至第15天每天利用尾静脉采血采集所有小鼠全血且制备血清，然后利用Hp-VacA靶标抗原导向的凝集抗体检测系统进行定量测试。测试方式如下：将上述160份血清进行2n倍比稀释：在96孔板各孔中加入10μL无菌生理盐水，然后吸取10μL血清加入每一列的第一孔，与无菌生理盐水充分混合后将10μL稀释的血清加入下一孔，并以此为循环连续稀释至26倍。将每个稀释度的血清与DH-5α+pBR-YaiU和DH-5α+pBR-YaiU-Hp-VacA-TBEA-AD11细菌悬液分别进行凝集测试，其中DH-5α+pBR-YaiU作为阴性对照，最后一个出现凝集颗粒的稀释度作为该血清抗体效价。凝集试验的阳性和阳性率结果如表10所示，感染小鼠中最早可以在第5天检测到凝集抗体，该敏感性显著高于传统血清学检测技术，且随着感染时长的增加，凝集测试的阳性率逐渐增加；定量测试结果如图16所示，在免疫后第14天，可测得感染凝集抗体效价达到1∶16。
综上所述，本发明的Hp-VacA靶标抗原凝集抗体测试方法的特异性和敏感性好。与目前针对Hp-VacA完整蛋白质抗原的免疫学检测方法(胶体金、免疫发光、ELISA等)报道的结果比较，本技术的特异性、敏感性显著性提高，且能定量检测到特异性凝集抗体效价。
表10Hp-VacA靶标抗原导向的凝集抗体检测系统的敏感性验证
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Claims (6)
1.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是将编码携带幽门螺杆菌毒力因子Hp CagA的B细胞表位靶标抗原的基因替代鸡伤寒沙门氏菌的SadA 类型的V型分泌系统的亲水基序，构建得到的重组表达载体，所述靶标抗原的基因序列为GGGGATAATGGTGGTCCTGAAGCTAGGCATGAT。
2.一种凝集抗体检测系统，其特征在于，所述凝集抗体检测系统还包括将权利要求1所述的重组表达载体导入载体菌中即得。
3.权利要求1所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）携带幽门螺杆菌Hp毒力因子CagA的B细胞表位的靶标抗原编码的DNA序列的获得；所述DNA序列为GGGGATAATGGTGGTCCTGAAGCTAGGCATGAT；
（2）将步骤（1）得到的DNA序列替代鸡伤寒沙门氏菌SadA 类型的V型分泌系统的亲水基序，构建表达载体。
4.权利要求2所述的凝集抗体检测系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）携带幽门螺杆菌Hp毒力因子CagA的B细胞表位的靶标抗原编码的DNA序列的获得；所述DNA序列为GGGGATAATGGTGGTCCTGAAGCTAGGCATGAT；
（2）将步骤（1）得到的DNA序列替代鸡伤寒沙门氏菌SadA 类型的V型分泌系统的亲水基序，构建表达载体；
（3）将步骤（2）得到的表达载体通过电转化的方式导入载体菌中即得。
5.权利要求1所述的重组表达载体或权利要求2所述的凝集抗体检测系统在制备检测幽门螺杆菌凝集抗体的试剂或试剂盒中的应用。
6.一种检测幽门螺杆菌Hp凝集抗体的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括权利要求1重组表达载体或权利要求2所述的凝集抗体检测系统。
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