CN116445448B - 鲍曼不动杆菌plpfp重组蛋白、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白、制备方法及应用，涉及生物技术领域。该鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白包括PLPFP蛋白，所述PLPFP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明的鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白具有良好的免疫原性，并且能够对鲍曼不动杆菌感染起到免疫保护性作用，能够诱导机体产生免疫应答，可以例如辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防鲍曼不动杆菌的感染。且本发明PLPFP重组蛋白的制备流程简单、成本低廉、易于重复，适合大规模生产，且产物成分简单，相对而言安全性较高。

Description

鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白、制备方法及应用。
背景技术
鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是一种非发酵型、需氧的革兰氏阴性杆菌，可正常定植于人体，属于条件致病菌。在自然界及医院均广泛分布，尤其是医院的ICU病房及呼吸科，常见的研究用鲍曼不动杆菌菌株的来源均为医院。常引起多种感染如肺炎、伤口感染、脑膜炎、尿路感染、皮肤及软组织感染、心内膜炎等，病情严重时可导致败血症，其死亡率可高达70%。据中国细菌耐药检测网（CHINET）2021年来自全国各省市共71家医院的数据统计显示，30万株临床分离菌株中，鲍曼不动杆菌排第五，占比7.28%，其中呼吸道标本和脑脊液标本来源的菌株中占比排第二，分别高达14.1%和11.3%。
随着抗生素药物的广泛使用甚至滥用，临床分离的鲍曼不动杆菌菌株耐药性逐渐增强，甚至出现了多重耐药株（MDR），对常见的抗菌药物具有耐药性，包括头孢菌素类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、喹诺酮类等，使临床对鲍曼不动杆菌感染的治疗困难重重。多数鲍曼不动杆菌菌株对多粘菌素类和替加环素保持敏感，但在临床的治疗效果仍不理想。因此，一种能有效干预鲍曼感染的手段亟待研发。疫苗是防控鲍曼不动杆菌感染的有效手段，其中亚单位疫苗作为一种疫苗形式，其组分明确，安全性好，辅以合适的佐剂可以获得有效的免疫保护，是一种有转化前景的疫苗形式，研发有效的亚单位疫苗，需要有有效的重组蛋白作为疫苗的抗原成分。
发明内容
本发明的目的在于提供鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白、制备方法及应用，本发明的鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白包括马铃薯糖蛋白样磷脂酶家族蛋白（patatin-likephospholipase family protein，PLPFP）（GenBank: QKY25916.1）。PLPFP是发明人利用反向疫苗学，从鲍曼不动杆菌菌株基因组序列中筛选出来的可作为疫苗候选疫苗抗原之一。编码PLPFP的基因序列全长933个核苷酸，该蛋白具有311个氨基酸，蛋白分子量约33.5kDa。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供的鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白，包括PLPFP蛋白，所述PLPFP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
根据一种优选实施方式，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
第二方面，本申请提供了编码上述鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白的多核苷酸。
第三方面，本申请提供了上述鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：
（1）根据鲍曼不动杆菌PLPFP蛋白基因序列设计PCR引物，以鲍曼不动杆菌的全基因组DNA为模板，根据所设计的PCR引物对编码鲍曼不动杆菌的PLPFP蛋白氨基酸序列的目的基因片段进行PCR扩增；
其中，所设计的PCR引物的正向引物：5'-CGCGGATCCATGGTGTTGGCCGGGTG-3'，反向引物：5'-TTATGCGGCCGCTTATTGCGTTTGCGCACTTAA-3'；
（2）将步骤（1）所得的PCR扩增产物克隆至含有GST标签的表达载体，并转化至原核表达系统重进行诱导表达含有GST标签的PLPFP融合蛋白；
（3）使用酶切方法将目的蛋白和GST标签分开，获得鲍曼不动杆菌的PLPFP重组蛋白。
第四方面，本申请还提供了一种表达载体，所述表达载体包括编码上述鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白的多核苷酸，所述表达载体为pGEX-6P-2质粒。
第五方面，本申请提供了一种宿主细胞，包括上述的表达载体。
根据一种优选实施方式，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。
第六方面，本申请提供了上述鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白在制备治疗或预防鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。
根据一种优选实施方式，所述药物为鲍曼不动杆菌疫苗。
第七方面，本申请提供了鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白在制备鲍曼不动杆菌检测试剂盒中的应用。
基于上述技术方案，本发明的鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白、制备方法及应用至少具有如下有益效果：
（1）PLPFP蛋白的表达质粒在原核表达系统（大肠杆菌）中诱导表达，表达量高，质量安全可控。
（2）选择pGEX-6P-2表达载体，PLPFP重组蛋白以融合蛋白可溶形式表达，最大限度保持了其原有的空间构象。
（3）所表达的融合蛋白中就含有一个GST 标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。
（4）利用本发明PLPFP重组蛋白制备的亚单位疫苗可通过肌肉注射途径进行免疫接种，激发机体产生高效价的IgG抗体。并经动物实验证实，所述基因工程重组单价亚单位疫苗具有良好的抗鲍曼不动杆菌感染的免疫保护效果。为进一步的多价亚单位融合疫苗研究打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为PLPFP基因片段的PCR扩增结果图；
图2为表达载体pGEX-6P-2-PLPFP的酶切鉴定结果图；
图3为重组质粒pGEX-6p-2-PLPFP测序与目的蛋白的DNA序列比对结果图；
图4为pGEX-6P-2-PLPFP/BL21（DE3）表达菌株经16℃小量诱导表达后，鉴定GST-PLPFP重组蛋白的表达情况图；
图5为pGEX-6P-2-PLPFP/BL21（DE3）表达菌株在诱导表达后，上清中获得含GST融合蛋白，即GST-PLPFP，并用PP蛋白酶将GST标签切除后获得的PLPFP重组蛋白图；
图6 为诱导表达的重组蛋白PLPFP经过阴离子交换柱纯化后的蛋白电泳凝胶考马斯亮蓝染色结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
1.菌株
鲍曼不动杆菌菌株ATCC17978购自美国ACTT。
2.试剂
质粒pGEX-6p-2（购于GE公司）、大肠杆菌菌株BL21（DE3）（购于擎科公司）；
2× High Fidelity PCR Master Mix、DNA Marker、DNA Ligation Mix购买于北京擎科生物公司；限制性内切酶BamH I和Not I购于美国NEB公司；蛋白Marker为伯乐公司产品。
质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒、超薄回收试剂盒以及显色液为天根公司产品；
谷胱甘肽-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose 4B为上海生物公司产品。
实施例1：鲍曼不动杆菌PLPFP蛋白表达工程菌克隆。
1. 首先查找NCBI基因序列库中鲍曼不动杆菌PLPFP蛋白序列（GenBank:QKY25916.1），其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2. 根据PLPFP基因序列设计PCR引物，以鲍曼不动杆菌的全基因组DNA为模板，扩增PLPFP蛋白的基因片段，步骤如下：
1）设计PCR引物如下，用正向引物和反向引物扩增DNA片段；
（下划线示酶切位点碱基序列）。
正向引物（SEQ ID NO.4）：
5'-CGCGGATCCATGGTGTTGGCCGGGTG-3'
BamH I
反向引物（SEQ ID NO.5）：
5'-TTATGCGGCCGCTTATTGCGTTTGCGCACTTAA-3'
Not I
本实施例将编码SEQ ID NO.1所示PLPFP蛋白氨基酸序列的DNA序列SEQ ID NO.2作为目的基因片段进行PCR扩增，但本领域技术人员应该理解，可以选择衍生自SEQ IDNO.2所示DNA序列、在其对应编码蛋白氨基酸序列氨基端缺失多个密码子后所获得的任意序列作为目的基因片段。
2）将鲍曼不动杆菌的冻存菌株以划线法涂布于TSA固体培养基上，于37℃恒温孵育过夜，第二天挑取单菌落接种于TSB液体培养基中，220rpm/37℃震荡培养5小时，参照细菌基因组抽提试剂盒说明书抽提鲍曼不动杆菌全基因组DNA。
3）以鲍曼不动杆菌 全基因组DNA为模板，PCR扩增PLPFP蛋白基因片段。
PCR体系：
组分 体积（μL）
鲍曼不动杆菌基因组DNA （156 ng/μL） 2
正向引物 （1μM） 1
反向引物 （1μM） 1
2×High Fidelity PCR Master Mix 20
总体积（用无菌去离子水补齐） 40
PCR扩增反应条件：98℃预变性10s，98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1 min，30个循环，72℃完全延伸5 min。反应结束后用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，结果示于图1中，其中，泳道M：核酸（DNA）分子量标准（Marker）；泳道1：PLPFP基因片段（933bp）的PCR扩增产物。
4）使用凝胶回收试剂盒回收PCR产物。
3. 原核表达质粒的连接，步骤如下：
1）BamH I和Not I酶切pGEX-6P-2质粒，BamH I和Not I酶切PLPFP基因PCR产物。
酶切反应体系：
组分 体积或质量
BamH I 2μL
Not I 2μL
10×CutSmart Buffer 4μL
PCR 产物或质粒 1μg
总体积（用无菌去离子水补齐） 40μL
37℃酶切1h。
2）使用超薄DNA产物纯化试剂盒回收步骤1）中的两个反应液。
3）连接和转化。
通过紫外分光光度计测定步骤2）中回收产物的核酸浓度，载体与外源片段摩尔比设置为1：3，进行连接反应。
连接反应体系：
组分 体积（μL）
T4 DNA Ligase 0.5
目的基因酶切回收产物 0.7
pGEX-6P-2酶切回收产物 4.3
10×ligation buffer 1
总体积（用无菌去离子水补齐） 10
混匀，16℃连接1 h。
4）从-80℃冰箱取3管大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，冰浴8min后，第一管加入pGEX-6P-2质粒1μL，作阳性对照；第二管加入DNA连接产物10μL；第三管不加外源DNA，作阴性对照。轻弹混匀后冰浴静置30 min，42℃水浴中热激90s，迅速放至冰浴静置2min。加入600 μL LB培养基，放入摇床中，200 rpm/37℃振荡复苏1h。
各管以5000 rpm室温离心5 min，弃去400μL上清，再重悬菌体，取100μL涂布于Amp抗性LB平板，于37℃培养箱中倒置培养18 h。
5）pGEX-6P-2-PLPFP阳性重组质粒的筛选、鉴定。
①阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确，结果可信。挑取连接产物转化的平板上形态良好的单菌落，接种于含氨苄青霉素（工作浓度100μg/mL）的LB培养基中，220 rpm/37℃振荡培养过夜；
②质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行；
③质粒DNA进行BamH I和Not I双酶切；
双酶切反应体系：
组分 体积或质量
BamH I 1μL
Not I 1μL
10×CutSmart Buffer 2μL
质粒 1μg
总体积（用无菌去离子水补齐） 20μL
37℃酶切1 h；
④1%的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如附图2，：其中，泳道M：核酸（DNA）分子量标准（Marker）；泳道1：重组表达质粒pGEX-6P-2-PLPFP经酶切后的鉴定结果，酶切后的片段大小分别约4954bp和943 bp，可见泳道1样品酶切后的片段与目的蛋白PLPFP核酸片段大小相符，为构建成功的pGEX-6P-2-PLPFP重组质粒；
⑤pGEX-6P-2-PLPFP重组质粒送往生工生物公司进行核酸测序，经比对，测序结果与目的蛋白核酸序列完全相符，如图3所示，结果显示重组工程菌的序列正确。
实施例2：鲍曼不动杆菌PLPFP蛋白在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达及表达形式的鉴定。
1.目的蛋白诱导表达。
取双酶切鉴定正确的pGEX-6P-2-PLPFP/BL21（DE3）菌液1μL加入10 mL含氨苄青霉素钠（工作浓度100mg/mL）的LB培养基中，220 rpm/37℃振荡培养过夜。第二天取过夜培养的菌液2 mL加入18 mL含氨苄青霉素钠的LB培养基中（余下的菌液保存在4℃冰箱中备用），220 rpm/37℃振荡培养2-3 h，待OD600达0.8-1.0时，加入1M IPTG 10μL使其终浓度为500μM，220rpm/16℃过夜诱导表达，诱导时间约16h。
2.电泳检测蛋白表达结果及表达形式。
将诱导后的菌液取出2mL，12000rpm离心1min，弃去上清，加入1 mL PBS缓冲液混匀取40μL进行制样；剩余菌悬液在冰水浴上进行超声裂解，条件设置为200W，4s on/4soff，总时间15 min；超声结束后，13000 rpm/4℃离心5 min，取上清进行制样，破菌沉淀用1mL PBS重悬后进行制样。
本步骤的制样方法：取40μL样品与10μL 5×SDS 蛋白上样缓冲液（碧云天）混匀，100℃金属浴煮样10min。
3. SDS-PAGE电泳检测。
将制好的样品取10μL 上样至蛋白胶，进行SDS-PAGE电泳。待溴酚蓝前沿迁移至胶板下沿约0.5cm时停止电泳，将胶取出置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于去离子水中，微波炉加热至微沸后放至室温振荡脱色，反复脱色至凝胶背景干净透明。电泳结果示于附图4，图4为pGEX-6P-2-PLPFP/BL21（DE3）表达菌株经16℃小量诱导表达后，鉴定GST-PLPFP重组蛋白的表达情况图，包括是否能成功表达以及其表达形式是否为可溶（即重组蛋白是否存在于细菌的破菌上清中）；泳道M：蛋白分子量标准（Marker）；泳道1：加IPTG诱导表达前的全菌蛋白；泳道2：诱导表达后的全菌蛋白；泳道3：诱导表达后破菌上清中的蛋白。可见重组GST-PLPFP融合蛋白的表达，且在破菌上清中，以可溶形式表达，目的蛋白如箭头所示。
分析电泳结果得知，pGEX-6P-2-PLPFP/BL21（DE3）在16℃条件下能成功诱导表达分子量大小约60.4 kDa的含有GST标签的PLPFP融合蛋白，并且部分蛋白为可溶表达形式即破菌上清中表达（其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示）。
实施例3：PLPFP重组蛋白抗原的制备。
1．放大培养获取融合蛋白GST-PLPFP。
取保存在-80℃冰箱中的pGEX-6P-2-PLPFP/BL21（DE3）菌种接种于LB固体培养基平板，37℃培养过夜；挑取单菌落接种于50mL LB培养基，220rpm/37℃培养过夜；取10mL菌液加入到1L LB培养基中进行二次活化，37℃培养3-4 h至OD600为0.8-1.0时，加入1M 浓度的IPTG储存液 0.5mL使其终浓度为500μM，220rpm/16℃过夜诱导表达，诱导时间约16h；6000rpm离心15min收集菌体沉淀，加100 mL PBS重悬菌体，用高压均质仪破碎菌体，离心收集上清与10mL GST填料4℃旋转过夜结合，获得大量的含有GST标签的PLPFP融合蛋白。
本步骤的LB固体和液体培养基均含100mg/mL氨苄青霉素；
本步骤的高压均质仪条件设置为压力800bar，循环温度4℃，流速40mL/min；
本步骤的GST填料全称GST 4FF 琼脂糖纯化树脂。
2．使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，获取PLPFP重组蛋白。
向已结合目的蛋白的GST填料中加入4mL 20mM PB（pH8.0）和800μL PreScissionprotease（PP酶），4℃旋转酶切过夜，收集酶切后的液体，分别用2mL 20mM PB（pH8.0）洗涤2次，取40μL制样，进行SDS-PAGE电泳，在成像系统下观察结果；酶切后获得PLPFP蛋白分子量在34 kDa左右，与预期蛋白分子量大小相符合，电泳结果示于图5，泳道M：蛋白分子量标准（Marker）；泳道1：诱导表达后的全菌；泳道2：破菌上清与凝胶过夜低温结合的蛋白酶切前与GST填料结合的蛋白，主要为GST-PLPFP蛋白和部分杂蛋白；泳道3：融合蛋白经蛋白酶切后的PLPFP蛋白，泳道4：酶切以及洗脱后，凝胶上残留GST填料上的蛋白，主要包括GST标签以及PP蛋白酶。
3.使用离子交换柱对PLPFP重组蛋白进行进一步纯化，获取高纯度的PLPFP重组蛋白。
在蛋白纯化仪上安装阴离子交换柱，用去离子水冲洗交换柱5个柱体积，用A液对柱进行充分平衡；对保存于A液中样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合，2% B液和4%B液先后进行洗杂；拉线性梯度至100% B液对目的蛋白进行洗脱，根据A280nm值收集洗脱液进行电泳检测，如图6所示，泳道M：蛋白分子量标准；泳道PLPFP：经离子交换层析精纯后的重组PLPFP，泳道PLPFP表示用离子交换层析柱精纯后的PLPFP重组蛋白，凝胶扫描后用Image Lab软件对PLPFP泳道中目标蛋白的灰度值进行扫描分析计算其灰度值占整个泳道灰度值的比例，结果显示其蛋白纯度达到98%以上。高纯度的重组蛋白获得为后续疫苗效果及安全性提供了保证。
本步骤的A液为20mM PB（pH8.0），B液为20mM PB+500mM NaCl（pH8.0），均用0.45μm滤膜过滤后使用。
4.将步骤3中获得的蛋白洗脱液用Sephadex G25脱盐柱置换缓冲液为PBS。
5.按照BCA法蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度，最终测得浓度为0.53mg/mL。
实施例4：小鼠菌血症模型的构建。
将鲍曼不动杆菌用三线法接种于TSA固体培养基平板，37℃恒温孵育16小时；在平板上挑取单菌落，接种于10ml TSB液体培养基中，置于37℃恒温摇床中220rpm震荡培养。5小时后收集菌体，用无菌PBS稀释15倍后测其OD600的值，并以1.5×109CFU/ml/OD600进行计算，将菌液稀释至1×108CFU/ml、2×108CFU/ml、3×108CFU/ml，4×108CFU/ml三种不同浓度，再将各组菌液经静脉注射入C57Bl/6雌性小鼠尾静脉（100μL/只）。6-8周龄、体重为18-20g的小鼠最佳。设置每组5只小鼠，连续观察7天并统计各组小鼠的死亡率。最终得到鲍曼不动杆菌感染剂量为3×107CFU/只小鼠，后续小鼠模型构建均选用此剂量。
表1：鲍曼不动杆菌致死剂量的确定
感染剂量（CFU/mouse） 小鼠（只） 七天内死亡数（只） 死亡率
1 x 107 5 0 0
2 x 107 5 2 40%
3 x 107 5 5 100%
4 x 107 5 5 100%
实施例5：PLPFP重组蛋白亚单位疫苗的制备。
将重组PLPFP蛋白与不同的佐剂进行吸附做预实验并检测吸附效果，发现Al（OH）3吸附效率最好，后续主要Al（OH）3作为佐剂成分，进行吸附制备亚单位疫苗。经摸索后的方法如下：量取氢氧化铝佐剂用pH6.0的组氨酸稀释液调整浓度到5 mg/ml，充分混匀，得溶液A；用pH6.0的组氨酸稀释液将PLPFP重组蛋白稀释至200 μg/mL，得溶液B；取等体积的溶液A和溶液B于4℃条件下旋转混悬吸附1小时后获得疫苗。 同样条件将重组抗原溶液用疫苗稀释液替代制备不含抗原的佐剂对照制剂。
实施例6：重组蛋白疫苗制剂免疫动物。
1）首次免疫，用胰岛素针头将实施例5中制备的亚单位疫苗，于小鼠大腿内侧行肌肉注射，每只C57BL/6小鼠注射量为200μL，左右大腿各100μl，并设置佐剂对照组；
2）第14天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量与首次免疫的相同，免疫途径同上，本次免疫肌肉注射小鼠大腿外侧；
3）第21天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量与首次免疫的相同，免疫途径同上，本次免疫肌肉注射小鼠大腿内侧；
4）第三次免疫后第7天，采集C57BL/6小鼠的静脉血，凝固后离心分离血清，用ELISA检测小鼠免疫后IgG体液应答水平。
实施例7：重组蛋白免疫后蛋白特异性抗体效价检测。
1. ELISA试剂盒的制备。
1）配置试剂：包被液：0.05 M碳酸盐缓冲液（NaHCO3 1.6g/L，Na2CO3 2.9g/L，pH9.6）；洗涤液为PBST（PBS+0.05%吐温-20，pH7.4）；封闭液为含PBS（pH7.4）+3% BSA；血清及抗体稀释液为PBS（pH7.4）+1% BSA +0.05%吐温-20，终止液为2M H2SO4。
2）包被抗原：用包被液将纯化后的PLPFP重组蛋白稀释为4μg/mL；将稀释好的重组蛋白加入酶标板，100μL/孔，4℃孵育过夜后用洗涤液洗涤4遍；
3）封闭：酶标板加封闭液，100μL/孔，37℃孵育2小时，洗涤4遍即获得检测抗体用ELISA试剂板；
4) 配以HRP标记的兔抗小鼠IgG抗体以及抗体稀释液，TMB显色液及终止液即为PLPFP抗体检测试剂盒。
2. PLPFP重组蛋白特异性抗体的检测。
1）将蛋白免疫后的血清及对照组血清分别进行倍比稀释，稀释梯度设置为1:1000、1:5000、1:25000、1: 125000；
2）取PLPFP抗体ELISA检测试剂盒中封闭好的酶标板，依次加入不同稀释浓度的血清，100μL/孔，同时设置PBS空白孔置于37℃孵育箱2h，洗涤3遍，控干；
3）将HRP标记的兔抗小鼠IgG抗体储存液以1:10000稀释，制成抗体工作液；
4）加入稀释抗体工作液，100μL/孔，置于37℃孵育箱45min，洗涤5遍，控干；
5）加入底物显色液TMB，100μL/孔，室温避光反应10-15 min；
6）加入终止液50μL/孔，置于酶标仪上以450 nm波长处测定OD值；
7）结果判断：A样品∕A阴性值≧2.1为阳性。
表2 免疫后血清抗体滴度检测（OD450）
血清稀释比例 佐剂对照组 PLPFP蛋白免疫组
1:125000 0.038 0.475
1:25000 0.036 1.237
1:5000 0.053 2.421
1:1000 0.085 3.351
结果：PLPFP蛋白ELISA检测试剂盒及检测方法建立成功，可以用于PLPFP蛋白特异性抗体的检测。用此试剂盒检测PLPFP蛋白抗体效价，结果显示：在血清稀释比例1:125000时，PLPFP蛋白免疫组与佐剂对照组的比值仍>2.1，即检测PLPFP蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价大于1:125000，本发明构建的PLPFP重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生高效价抗体（表2），说明PLPFP蛋白具有很好的免疫原性，是较好的疫苗抗原。
实施例8：通过免疫小鼠确定PLPFP重组蛋白免疫动物的攻毒保护。
同实施例6的免疫方案，第三次免疫小鼠后，在第7天采用尾静脉注射致死剂量鲍曼不动杆菌进行攻毒，每只C57BL/6小鼠注射菌液量为3×107 CFU，观察7天，统计各组小鼠的存活率，结果示于表3。
表3 重组蛋白免疫后对小鼠细菌攻毒的保护结果
组别 免疫组分 小鼠（只） 死亡小鼠数量 死亡率（%） 保护率（%）
PLPFP免疫组 PLPFP+ Al(OH)3佐剂 20 10 50 47.36
佐剂对照组 组氨酸溶液+Al(OH)3佐剂 20 19 95 0
表3为动物免疫试验结果，显示佐剂对照组的死亡率为95%，PLPFP疫苗免疫组死亡率50%，根据公式计算疫苗保护率：[疫苗保护率=（对照组发病率-接种组发病率）/对照组发病率×100%]， PLPFP蛋白免疫组的保护率为47.36%。
因此，本发明的PLPFP重组蛋白具有良好的免疫原性，并且能够对鲍曼不动杆菌感染起到免疫保护性作用，能够诱导机体产生免疫应答，可以例如辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防鲍曼不动杆菌的感染。且本发明 PLPFP重组蛋白的制备流程简单、成本低廉、易于重复，适合大规模生产，且产物成分简单，相对而言安全性较高。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (2)

1.鲍曼不动杆菌 PLPFP 重组蛋白在制备预防鲍曼不动杆菌感染的疫苗中的应用，其特征在于，所述鲍曼不动杆菌 PLPFP 重组蛋白包括 PLPFP 蛋白，所述 PLPFP 蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 所示，所述重组蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO.3 所示。
2.权利要求 1 所述的鲍曼不动杆菌 PLPFP 重组蛋白在制备鲍曼不动杆菌检测试剂盒中的应用。
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