CN103694321A - 金黄色葡萄球菌mSEB突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一种金黄色葡萄球菌（SA）的SEB蛋白突变体mSEB，包含该突变蛋白的载体、宿主、组合物或试剂盒，以及该蛋白的应用和制备、发酵和纯化方法。本发明的mSEB蛋白免疫原性强，可有效激发机体产生保护性免疫应答，从而抵抗SA感染，且安全有效、质量可控。

Description

金黄色葡萄球菌mSEB突变体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种金黄色葡萄球菌（SA）的SEB蛋白突变体mSEB。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)，以下简称金葡菌，有“嗜肉菌”的别称。作为革兰氏阳性菌的代表，它是引起医院感染和社区感染的一种重要致病菌。感染以急性、化脓性炎症为特征，局部感染可引起皮肤和软组织等的化脓性感染，经久不愈；全身感染可导致骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、肺炎、脓毒血症等严重感染及并发症，死亡率高达20％。同时，金葡菌的外毒素还可引起食物中毒、烫伤样皮肤综合征和中毒性休克综合征等全身致死性感染。

随着抗生素长期、广泛地使用，细菌耐药性问题日益突出，作为典型代表的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）自1961年被首次发现至今，目前已成为全球ICU病房、术后感染、烧伤、战创伤等感染率最高的医院內感染病原菌之一。同时，因其致病性强、传播途径广泛、易暴发流行，且呈多重耐药性发展而成为临床上治疗的难点，被称为“第一超级细菌”。

因此，加强对金葡菌感染的免疫防治研究，研制安全、有效的新型金葡菌基因工程疫苗将对有效控制金葡菌耐药性蔓延和临床金葡菌广泛感染具有重要的战略及现实意义。

金葡菌肠毒素（SE）是超抗原外毒素，通常由致病性金葡菌特别是MRSA产生。SE可通过促使多数T细胞释放大量细胞因子而产生生物学效应，引起毒素休克综合征等临床症状。目前SE有SEA、SEB、SEC、SED和SEE等9个血清型。SEB既是毒素也是超抗原，50%的金黄色葡萄球菌菌株能产生SEB。SEB不但能导致胃肠炎性食物中毒，也能刺激非特异性T细胞增殖。有研究表明，SEB可以通过消化道吸收入血，到达中枢神经系统刺激呕吐中枢而导致呕吐症状食物中毒；SEB进入机体后结合MHCⅡ类分子，在不依赖抗原识别的情况下通过结合T细胞抗原表位激活T细胞，从而刺激T细胞大量增殖和炎症因子的释放。SEB中毒后所引发的毒素休克综合征死亡率高达50%，如与流感并发，病死率可达90%以上，其也被作为一种重要的失能性生化武器。因此，针对SA重要的毒力靶点，研发具有自主知识产权、高效、安全无毒、经济的SA疫苗对控制SA感染、毒素扩散、耐药性发展及生物恐怖防御具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种金黄色葡萄球菌B型肠毒素的无毒性、无超抗原性的mSEB突变体重组蛋白，其可应用于检测、预防和治疗与金黄色葡萄球菌感染相关的生物制品。

在本发明的一个方面，提供一种mSEB重组蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

在本发明的第二个方面，提供编码本发明的mSEB重组蛋白的核苷酸序列，以及包含所述核苷酸序列的载体和宿主。

在本发明的第三个方面，提供一种制备本发明的mSEB重组蛋白的方法。

在本发明的第四个方面，提供一种发酵mSEB宿主（基因工程菌）以制备mSEB重组蛋白的方法。

在本发明的第五个方面，提供一种纯化本发明的mSEB重组蛋白的方法。

在本发明的第六个方面，提供本发明的mSEB重组蛋白作为抗原的应用，以及所述mSEB重组蛋白在制备用于检测、预防或治疗SA感染的生物制品中的应用。

在本发明的第七个方面，提供由本发明的mSEB重组蛋白免疫产生的多克隆抗体以及所述多克隆抗体在制备用于检测、预防或治疗SA感染的生物制品中的应用。

在本发明的第八个方面，提供包含本发明的mSEB重组蛋白的组合物或试剂盒，优选地，所述组合物是疫苗。

本发明采用基因工程技术克隆表达金黄色葡萄球菌mSEB突变体重组蛋白，表达量高，便于分离纯化，而且高效、安全。mSEB重组蛋白可以直接与佐剂（如Al(OH)₃、AlPO₄、MF59、AlSO₃、AlSO₄、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂等）配合使用，适用于注射免疫接种。可有效激发机体产生保护性免疫应答，从而抵抗SA感染，且安全有效、质量可控。

附图说明

图1、mSEB基因片段的PCR扩增结果；M：DNA分子量标准；1：mSEB基因片段(743bp)PCR产物。

图2、表达载体pGEX-6p-2-mSEB的酶切鉴定结果；M：DNA分子量标准；1～3：重组表达质粒经酶切后（片段4958bp和734bp）。

图3、mSEB基因片段的PCR扩增结果；M：DNA分子量标准；1、2：mSEB基因片段(739bp)PCR产物。

图4、表达载体pET22b-mSEB的酶切鉴定结果；M：DNA分子量标准；1～2：重组表达质粒（片段5474bp和731bp）。

图5、重组pET28a-mSEB/BL21(DE3)在30℃诱导表达后，目的蛋白随诱导时间而变化（0-5小时）。

图6、mSEB重组蛋白Ni琼脂糖凝胶HP交换层析图。实线和虚线分别列出了280nm处的紫外吸收值和B液浓度的变化。

图7、mSEB工程菌破菌上清及经Ni HP纯化样品；M：蛋白分子量标准；1：破菌离心上清；2：Ni层析流穿样品；3-8：Ni层析第一峰样品。

图8、PGEX-6P-2-mSEB重组表达载体在16℃过夜诱导表达后，获得含GST标签的融合蛋白，其中M：蛋白分子量标准；1-2：含有GST标签的mSEB融合蛋白。

图9、GST-mSEB的PP酶切结果；M：蛋白质分子量标准；1：酶切前GST-mSEB；2：酶切上清，28KD处蛋白为目的蛋白mSEB；3：残存于谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B上的mSEB及GST。

图10、重组pET22b-mSEB/BL21(DE3)在37℃诱导表达；M：分子量标准；1：未优化密码工程菌诱导前超声上清；2：未优化密码工程菌诱导后超声上清；3：未优化密码工程菌诱导后沉淀；4：优化密码工程菌诱导前超声上清；5：优化密码工程菌诱导后超声上清；6：优化密码工程菌诱导后沉淀。

图11、pET22b-mSEB/BL21(DE3)重组工程菌在四种培养基中的生长曲线。

图12、pET22b-mSEB/BL21(DE3)重组工程菌在M9和TB培养基中的表达mSEB情况1：蛋白质分子量标准；2：M9；3：TB。

图13、不同IPTG浓度对mSEB蛋白表达的影响；1：蛋白质分子量标准；2：0.1mM；3：0.2mM；4：0.5mM；5：1mM。

图14、不同接种量的mSEB工程菌的生长曲线。

图15、种子菌不同接种量对mSEB蛋白表达的影响；1：蛋白质分子量标准；2：5%；3：10%；4：15%。

图16、不同氧浓度下mSEB工程菌的生长曲线。

图17、PO₂不同浓度时，mSEB蛋白的表达情况；1：蛋白质分子量标准；2：25%；3：45%；4：65%。

图18、不同浓度的甘油对mSEB蛋白表达的影响；1：蛋白质分子量标准；2：5ml/L；3：10ml/L；4：15ml/L。

图19、mSEB工程菌在不同诱导温度和时间时蛋白表达的情况；1：蛋白质分子量标准；2：诱导0h；3：诱导2h；4：诱导4h；5：诱导6h；6：诱导8h；7：诱导10h。

图20、25L发酵mSEB工程菌的生长曲线。

图21、25L发酵mSEB工程菌时，mSEB蛋白表达情况；1：蛋白质分子量标准；2：诱导0h；3：诱导1h；4：诱导2h；5：诱导3h；6：诱导4h；7：诱导5h。

图22、mSEB蛋白经SP HP阳离子交换层析图，实线和虚线分别列出了280nm处的紫外吸收值和电导值的变化。

图23、mSEB蛋白经Phenyl疏水层析的层析图。实线和虚线分别列出了280nm处的紫外吸收值和电导值的变化。

图24、mSEB工程菌破菌样品、层析样品SDS-PAGE电泳结果；M：蛋白蛋白质分子量标准，1：全菌样品，2：破菌上清，3：阳离子交换层析第一峰样品，4：阳离子交换层析第二峰样品，5为疏水层析第一峰样品。

图25、mSEB蛋白脱盐层析图。

图26、mSEB蛋白脱内毒素后样品的电泳图；M：蛋白分子量标准，1-3：最终纯化的mSEB。

图27、mSEB蛋白最终样品的HPLC检测结果；主峰保留时间13.506分，主峰面积比率100.0%。

图28、天然SEB与mSEB的超抗原性比较。

图29、mSEB原液与疫苗制剂离心上清SDS-PAGE；M：蛋白质分子量标准；1：疫苗制剂离心上清；2：mSEB原液。

具体实施方式

本发明是利用生物信息学对SEB进行结构功能分析后对其进行了三个位点突变，使得SEB突变为无毒、无超抗原的mSEB重组蛋白亚单位疫苗，这为设计SA亚单位疫苗提供了理论基础。亚单位疫苗是去除病原体中与激发保护性免疫无关甚或有害的成分，但保留有效免疫原成分的新型疫苗。

因此，在第一个方面，本发明提供一种金黄色葡萄球菌B型肠毒素无毒、无超抗原突变体mSEB重组蛋白，其可应用于制备检测及防治金黄色葡萄球菌感染的疫苗、治疗性抗体以及相关的检测试剂盒；所述mSEB重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据工程菌的密码偏好性，本发明对表达SEB成熟肽的基因中的稀有密码进行密码子优化，用使用频率高的密码替代使用频率低的密码。具体地，指将野生型SEB成熟肽的编码序列（SEQ ID NO.11）中第36、41、50、190位密码子（编码Ile）优化为ATC，将第59、86、123、185、205位密码子（编码Gly）优化为GGT、将第163位密码子（编码Leu）优化为CTG，将第65、110、130、135位密码子（编码Arg）优化为CGC，将第99、184、235位密码子（编码Thr）优化为ACC；同时实施L45R、Y89A、Y94A的无毒点突变，以保证翻译的氨基酸序列与SEQ ID NO.1一致。为了便于表达，在SEB成熟肽N末端加了一个起始密码ATG编码的甲硫氨酸，故在SEQ ID NO.1里，三个突变体相应为46R、90A、95A。

在另一方面，本发明提供编码所述mSEB重组蛋白的核苷酸序列。在已知蛋白质氨基酸序列的情况下，本领域技术人员完全可以根据需要设计合适的编码所述氨基酸序列的核苷酸序列，并使其表达。

在一种优选的实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述编码mSEB重组蛋白的核苷酸序列可以是SEQ ID NO.2或在SEQ ID NO.2的一端或两端添加或缺失若干个核苷酸后、得到的编码与SEQ ID NO.1所示蛋白具有相同或相似功能蛋白的序列。

在另一方面，本发明提供一种用于表达mSEB重组蛋白的重组表达载体，其包含编码所述mSEB重组蛋白的核苷酸序列以及载体序列。优选地，所述载体是pGEX系列或pET系列载体，优选是pET22b载体；其主要特点是载体能将目的蛋白分泌至胞周质，最大限度地保持了mSEB的免疫原性。

在另一方面，本发明提供表达mSEB重组蛋白的宿主，所述宿主可以是本领域技术人员已知的任何表达细胞，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

在另一方面，本发明提供一种制备mSEB重组蛋白的方法，所述方法可以是本领域已知的任何方法，如化学合成法或者核苷酸表达法。本领域技术人员根据mSEB蛋白的序列和本领域常识完全可以知道如何制备本发明的mSEB蛋白。

在另一方面，本发明提供了一种发酵mSEB基因工程菌以表达mSEB重组蛋白的方法,所述方法包括将一定量的种子菌接种于含有甘油和一定溶氧量的培养基中，经诱导剂诱导一定时间而发酵。优选地，所述方法涉及培养基、种子菌接种量、培养基中的甘油量、溶氧量、诱导剂种类、诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间几方面因素。其中，所述培养基可以是动物源性TB、动物源性M9、植物源性TB、植物源性M9，优选为动物源性TB；所述种子菌的接种量是5%～15%，优选为10%；所述甘油量为5-15ml/L培养基，优选为10ml/L培养基；所述溶氧量是25%～65%，优选为45%；所述诱导剂可以是乳糖或IPTG，优选为IPTG；所述诱导剂的浓度是100μmol/L-1mmol/L培养基，优选为200μmol/L培养基；所述诱导温度为16～37℃，优选为30℃；所述诱导时间为1～6小时，优选为5小时。

在所述发酵工艺的一种具体实施方式中，基础培养基选用动物源性TB培养基，其中甘油量是10ml/L培养基；发酵开始时，种子菌接种量的比例是10%；在发酵过程中溶氧浓度始终保持在45%左右；诱导时，温度调为30℃、IPTG浓度为0.2mM、诱导5h。

在另一方面，本发明提供了一种在发酵mSEB重组菌之后纯化mSEB重组蛋白的方法，包括依次进行的阳离子交换层析初步纯化、Phenyl HP疏水层析、脱盐和去内毒素。

优选地，所述阳离子交换层析初步纯化为SP SEPHAROSE HIGH PERF层析纯化，使用的缓冲液为：A液：10-20mM PB，pH6.0的缓冲液，B液：10-20mmol/L PB，pH6.0，1mol/LNaCl的缓冲液；洗脱方式为：0-50%B液洗脱20个柱体积，收集目标蛋白峰；然后直接用100%B液洗脱杂蛋白。

优选地，所述Phenyl HP疏水层析使用的缓冲液为：缓冲液C：10-20mM PB，2M(NH₄)₂SO₄，缓冲液D：10-20mM PB，pH7.5。

优选地，所述脱盐使用G25柱。

优选地，所述去内毒素步骤使用Q HP层析；使用的缓冲液为：缓冲液A：疫苗稀释液；缓冲液B:1M NaOH。

优选地，在进行纯化之前，需要对宿主破菌，以将蛋白从菌体中释放出来。

在另一方面，本发明提供了mSEB重组蛋白在制备用于检测、预防或治疗SA感染的生物制品中的应用。优选地，所述生物制品是疫苗。

在另一方面，本发明提供由mSEB重组蛋白免疫产生的抗体，所述抗体为多克隆抗体，可以用于与SA感染相关的疾病的检测、预防和治疗，或用于制备相应的药物。

在另一方面，本发明提供一种包括所述mSEB的组合物或试剂盒。这样的组合物可以是试剂、药物（如疫苗），用于预防、检测或治疗SA感染。这样的试剂盒可以是检测试剂盒或治疗试剂盒等本领域已知的任何形式试剂盒。

本发明的基因工程重组蛋白的表达方法具有以下优点：

1）mSEB重组蛋白表达质粒在原核表达系统—大肠杆菌中诱导表达；

2）选择pET22b载体系列时，mSEB重组蛋白以分泌至胞质形式表达，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性；表达率约为30%，纯化出来的mSEB重组蛋白纯度大于95%；

3）mSEB重组蛋白能够诱导动物产生特异性的抗体。

利用本发明mSEB重组蛋白制备的亚单位疫苗可通过肌肉注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体和细胞免疫应答。并经动物实验证实，所述基因工程重组亚单位疫苗具有良好的抗SA感染的免疫保护效果。

本部分所使用的菌株与各种试剂如下：

1.菌株、质粒

金黄色葡萄球菌MRSA-252国际标准株由美国ATCC提供；

菌株BL21（DE3）大肠杆菌购于Novagen公司；

菌株XL-1blue大肠杆菌为美国安捷伦公司产品；

质粒pGEX-6p-2为美国GE Healthcare公司产品；

质粒pET-22b为美国merck公司产品；

pET28a购自上海捷瑞生物技术有限公司。

2.试剂

primeSTAR HS DNA聚合酶、DNA分子量标准、限制性内切酶BamH I和Not I、蛋白分子量标准、DNA连接酶为大连TakaRa公司产品；

质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；

MH培养基：购自北京奥博星生物技术有限责任公司，牛肉粉2.0g，可溶性淀粉1.5g，酸水解酪蛋白17.5g，加水至1L，pH值7.4±0.2；

MH平板：MH培养基加入琼脂糖至终浓度为1.5g/100mL；

PBS（磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g（国产分析纯），磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)2.9g（国产分析纯），氯化钠(NaCl)8.0g（国产分析纯），氯化钾(KCl)0.2g，加水至1000mL，pH7.4）；

20mM PB缓冲液：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)2.9g，氯化钾(KCl)0.2g，加水至1000mL，pH6.0；

氨苄西林、卡那霉素（华北制药）；

5×蛋白质上样缓冲液：250mM Tris-HCl（pH6.8）、10％（W/V）SDS、0.5％（W/V）溴酚蓝、50％（V/V）甘油、5％（W/V）β-巯基乙醇；

谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B（美国GE Healthcare公司）；

磷酸铝佐剂：美国GENERAL CHEMICAL公司(20mg/ml)；

疫苗稀释液（组氨酸（美国Merck公司，药用级）10mM、NaCl0.9%（四川科伦，注射用生理盐水）、泊洛沙姆188（美国Merck公司，药用级）0.01%、pH6.0），无热原；

琼脂粉、吐温-20等其余试剂均为国内市场购买。

实施例1：mSEB载体的构建和蛋白合成

1、pET28b-mSEB的构建：

以MRSA COL（GI:57650036）基因组中SEB基因（SACOL0907，核苷酸序列为SEQID NO.4，氨基酸序列为SEQ ID NO.5）的成熟肽序列（SEQ ID NO.6，核苷酸序列为SEQ IDNO.11）为模板，对其进行(L45R、Y89A、Y94A)的突变，为了便于表达，在N端开始加上甲硫氨酸（SEQ ID NO.1），故三个突变的位置在SEQ ID NO.1中分别增加一位，即46R、90A、95A。合成对应的核苷酸（SEQ ID NO.3）后，前后分别引入NcoI和XhoI酶切点以插入pET28a载体。序列设计好后交上海捷瑞生物技术有限公司合成并连接至pET28a，构建pET28a-mSEB质粒，然后转化BL21(DE3)(由公司直接完成)，重组工程菌命名为pET28a-mSEB/BL21(DE3)。

2、pGEX-6P-2-mSEB的构建：

1）设计PCR引物如下，分别为PSEBBAMHI1(SEQ ID NO.7)和PSEBNOTI2(SEQ IDNO.8)。

PSEBBAMHI1:AGCGGATCCGAGAGTCAACCAGATCCTAAACCAGA；

PSEBNOTI2:GATGCGGCCGCTCATTACTTTTTCTTTGTCGTAAG。

2）以pET-28a-mSEB质粒为模板PCR扩增mSEB基因片段：

PCR体系：

PCR扩增反应条件98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃完全延伸7min。反应完毕后使用1%的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，PCR扩增结果示于图1中。扩增片段理论值为743bp，图1结果表明，扩增片段与预期相符。

3.PCR产物的鉴定与克隆，步骤如下：

1）BamH I和Not I酶切pGEX-6P-2质粒和mSEB产物

酶切反应体系：

37℃酶切2h。

2）使用超薄回收试剂盒回收pGEX-6P-2质粒和经BamH I和Not I酶切的PCR产物。

3）连接和转化：

通过紫外分光光度计测定mSEB酶切回收产物核酸浓度为56ng/μl，pGEX-6P-2酶切回收产物核酸浓度为120ng/μl，根据载体与外源片段摩尔数一般比为1:2～10，设计以下连接反应体系。

连接反应体系：

混匀，16℃连接1.5h。

4）取3管大肠杆菌XL1blue感受态细胞，第一管加入pGEX-6P-2质粒，作阳性对照；第二管加入DNA连接产物；第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min。加入600μl LB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中100rpm振摇1h。

各管以5000rpm室温离心4min.，弃去400μl上清，再重悬菌体，取100μl涂布于氨苄西林抗性（终浓度100μg/ml）LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。

5）pGEX-6p-2-mSEB阳性重组质粒的筛选、鉴定：

①阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于氨苄西林抗性（终浓度100μg/ml）LB培养基中，37℃振荡培养过夜；

②质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行；

③质粒DNA进行BamH I和Not I双酶切；

双酶切反应体系：

37℃酶切2h；

④1%的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如图2，理论上切出4958bp和734bp两个片段，图中片段大小与理论吻合。可见泳道1-3样品为构建成功的pGEX-6p-2-mSEB重组质粒；重组工程菌命名为pGEX-6P-2-mSEB/XL-1Blue。

⑤将pGEX-6p-2-mSEB重组质粒送往大连宝生物公司测序，测序结果显示重组质粒的目的基因片段的序列是正确的。

4、pET22b-mSEB的构建：

1）设计PCR引物如下，PSEBNCO1(SEQ ID NO.9)，PSEBBAMH2（SEQ ID NO.10）：

PSEBNCO1:GCCC ATG GAG AGT CAA CCA GAT CCT AAA CCA GA；

PSEBBAMH2:GATGGATCCTCATTACTTTTTCTTTGTCGTAAG。

2）以合成的连接有mSEB序列的pET-28a-mSEB质粒为模板通过PCR扩增mSEB基因片段。

PCR体系：

PCR扩增反应条件：98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃完全延伸7min。反应完毕后使用1%的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，PCR扩增结果示于图3中。扩增片段理论值为739bp，图3结果表明，扩增片段与预期相符。

3）使用凝胶回收试剂盒回收mSEB PCR产物。

5、PCR产物的鉴定与克隆，步骤如下：

1）使用NcoI和XhoI酶切pET22b质粒和mSEB PCR产物

酶切反应体系：

37℃酶切2h。

2）使用超薄回收试剂盒回收经I酶切的pET22b质粒和PCR产物。

3）连接和转化

通过紫外分光光度计测定mSEB酶切回收产物核酸浓度为60ng/μl，pET22b酶切回收产物核酸浓度为110ng/μl，根据载体与外源片段摩尔数一般比为1：2～10，设计以下连接反应体系。

连接反应体系：

混匀，16℃连接1h。

4）取3管大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，第一管加入pET28a质粒，作阳性对照；第二管加入上述DNA连接产物；第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min。加入600μl LB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中，100rpm振摇1h。

各管以5000rpm室温离心4min，弃去400μl上清，再重悬菌体，取100μl涂布于氨苄西林素抗性（终浓度100μg/ml）的LB平板。平板倒置于37℃培养箱中过夜培养。

5）pET22b-mSEB阳性重组质粒的筛选、鉴定

①阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于氨苄西林抗性（终浓度100μg/ml）LB培养基中，37℃振荡培养过夜；

②质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行；

③质粒DNA进行NcoI和BamHI双酶切；

双酶切反应体系：

37℃酶切2h；

④用1%的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如图4，理论上切出5474bp和731bp两个片段，图中片段大小与理论相符。可见泳道1、2样品为构建成功的pET22b-mSEB重组质粒；重组工程菌命名为pET22b-mSEB/BL21(DE3)。

⑤将pET22b-mSEB重组质粒送往大连宝生物公司测序，测序结果比对显示序列是正确的。

实施例2：pET28a-mSEB/BL21(DE3)的诱导表达及亲和层析纯化

1.目的蛋白诱导表达

1）取双酶切鉴定正确的pET28a-mSEB/BL21(DE3)菌液100μL加入至10mL卡那霉素抗性（50μg/ml）的LB培养基中，80rpm37℃过夜培养。取过夜培养的菌液2mL加入至200mL卡那霉素抗性（50μg/ml）的LB培养基中，37℃培养，转速200rpm，二次活化至OD600为0.8～1.0时，加入IPTG40μL，使其终浓度为200μM，再置于摇床，220rpm30℃诱导表达5小时。每小时取样观察表达情况。结果见图5。

2)以6000rpm离心15min，弃去上清，加入10mL PBS混匀，超声（功率300瓦）裂解10min(工作6秒，休息9秒)，再4℃14000rpm离心15min，收取上清。

2、Ni Sepharose HP(GE Healthcare美国)亲和层析纯化

将构建的重组工程菌通过高密度发酵，离心收集菌体备用。

取菌体200-500g，加入20mmol/L PB+300mmol/L NaCl，pH7.0缓冲液，按重量:体积比1:10比例加入，混匀悬浮，4℃预冷。

高压匀浆：使用蒸馏水冲洗高压匀浆机（高压匀质机APV-1000，丹麦An InvernsysGroup）管道，低温循环系统开启预冷至1-4℃备用。

预冷的悬浮菌液加入高压匀浆机，压力维持在60-80Mpa破菌3-5次，取PBS涂片进行结晶紫染色，油镜下每个视野下未破碎菌小于2个视为破菌完全（破菌率大于90%）。

高速离心：破菌后的液体装入离心桶（Beckman，美国），4℃，10,000-15,000g离心15-30min，收集上清备用。

Ni Sepharose HP用A液:20mmol/L PB，300mmol/L NaCl，15mmol/L咪唑，pH7.0缓冲液平衡；上样，流速10ml/min；A液冲洗至UV280吸收基线；洗脱，B液：20mmol/L PB，300mmol/L NaCl，250mM咪唑pH7.0线性梯度洗脱，洗脱流速20ml/min，洗脱0-100%B，10个柱体积。结果见图6和图7。

实施例3：pGEX-6P-2-mSEB/XL-1Blue的诱导表达及初步纯化

1、目的蛋白诱导表达

1）取双酶切鉴定正确的pGEX-6P-2-mSEB/XL-1blue菌液100μL加入至10mL氨苄西林抗性（终浓度100μg/ml）的TB培养基中，80rpm37℃过夜培养。取过夜培养的菌液400μL加入至20mL氨苄西林抗性（终浓度100μg/ml）的TB培养基中，37℃培养2～3h，转速200rpm，二次活化至OD600为0.8～1.0时，加入IPTG40μL，使其终浓度为200μM，再置于摇床220rpm16℃过夜诱导表达。

2)将诱导表达后的菌液取出，以6000rpm离心15min，弃去上清，加入1mL PBS混匀，超声（功率300瓦）裂解10min(工作6秒，休息9秒)，再4℃14000rpm离心15min，收集上清。

2、处理上清

取谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B100μl，用PBS洗涤3次后，将上步分离的上清加入该谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B中，4℃旋转过夜结合（或室温结合1h）。在4℃下以14000rpm离心3min后，使用PBS-0.25%吐温20洗涤2次，PBS洗涤一次。加入PBS至体积为400μl，混匀后取谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B80μl，加入20μl5×蛋白质上样缓冲液，煮沸5min，14000rpm离心30s，上清用于SDS-PAGE上样。

3、将处理好的上清分别取10μL上样，进行10%SDS-PAGE电泳。结果示于图8。PGEX-6P-2-mSEB/XL-1blue在16℃表达出分子量大小约为55kDa的含有GST标签的mSEB，表明重组蛋白能与可溶形式表达。

4、初步纯化

将步骤2剩余的结合有融合蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B加入PP酶（Prescissionprotease酶，美国GE公司）10μl，4℃酶切过夜。离心收集上清，进行10%SDS-PAGE观察效果（图9）。

实施例4：pET22b-mSEB/BL21(DE3)的诱导表达

实施例2的蛋白表达较高，但Ni亲和层析后目的蛋白的纯度不高，仍需进一步纯化。实施例3表达的蛋白虽然经过亲和层析后纯度较高，但表达量低，同时也还需进一步纯化。故进一步对工程菌pET22b-mSEB/BL21(DE3)进行诱导表达及纯化。

为了进一步提高表达率，将编码mSEB的密码根据工程菌的偏好性进行优化。

将序列SEQ ID NO.3中第37、42、51、191位密码子（编码Ile）优化为ATC，将第60、87、124、186、206位密码子（编码Gly）优化为GGT、将第164位密码子（编码Leu）优化为CTG，将第66、111、131、136位密码子（编码Arg）优化为CGC，将第100、185、236位密码子（编码Thr）优化为ACC。优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。交上海捷瑞生物技术有限公司合成并连接至pET22b，构建pET22b-mSEB质粒，然后转化BL21(DE3)(由公司直接完成)。

诱导表达

1）分别取实施例1中第4步构建的双酶切鉴定正确的pET22b-mSEB/BL21(DE3)及本实施例中的由上海捷瑞构建的pET22b-mSEB/BL21(DE3)菌液100μL加入至10mL氨苄西林抗性（终浓度100μg/ml）的TB培养基中，80rpm37℃过夜培养。取过夜培养的菌液400μL加入至20mL氨苄西林抗性（终浓度100μg/ml）的TB培养基中，37℃培养2～3h，转速200rpm，二次活化至OD600为0.8～1.0时，加入IPTG使其终浓度为200μM，再置于摇床30℃诱导表达6小时。

2)将诱导表达后的菌液取出，以6000rpm离心15min，弃去上清，加入1mL PBS混匀，超声（功率300瓦）裂解10min(工作6秒，休息9秒)，再4℃14000rpm离心15min，收集上清。

3）上清进行10%SDS－PAGE观察表达结果（图10）。

由图10可看出，优化密码后目的蛋白显著提高。经凝胶成像系统分析，表达率为35%；优化前为25%。

以下，用优化密码后的重组工程菌pET22b-mSEB/BL21(DE3)作进一步研究。

实施例5：pET22b-mSEB/BL21(DE3)重组工程菌的发酵

1、发酵条件的确定

1）培养基对工程菌生长与目的蛋白表达的影响

通过如前述培养方法在摇瓶中测试四种培养基对蛋白表达的影响：

植物源性改良TB（磷酸二氢钾2.3g、十二水磷酸氢二钠13g、甘油5ml、酵母提取物24g、大豆蛋白胨12g、硫酸镁1g，加水至1L）；

动物源性改良TB（磷酸二氢钾2.3g、十二水磷酸氢二钠13g、甘油5ml、酵母提取物24g、动物源胰蛋白胨12g、硫酸镁1g，加水至1L）；

植物源性M9-CAA（磷酸氢二钠15.6g、磷酸二氢钾4.3g、氯化铵1g、硫酸镁1g、氯化钠0.67g、葡萄糖5g、大豆蛋白胨3.6g、植物源酵母粉4g、酸水解酪蛋白6g，加水至1L）；

动物源性M9-CAA（磷酸氢二钠15.6g、磷酸二氢钾4.3g、氯化铵1g、硫酸镁1g、氯化钠0.67g、葡萄糖5g、动物胰蛋白胨3.6g、动物源酵母粉4g、酸水解酪蛋白6g，加水至1L）。

结果如图11所示，可见在改良动物源性TB（下面简称为TB）和动物源性M9-CAA（下面简称为M9）培养基中，细菌生长最好。

将新鲜mSEB菌液（OD600大约2）按1:100分别接种于100ml TB和M9培养基中，37℃、200rpm摇至OD600为0.8左右，加入1mM的IPTG，25℃诱导12h。将100ml菌液离心，弃上清，称重TB为4g，M9为2.8g。以1g:10ml加入PBS，超声（功率300瓦）裂解10min(工作6秒，休息9秒)破菌，进行10%SDS-PAGE实验。结果如图12所示：以单位目的蛋白表达量来看，TB培养基好于M9培养基，且单位菌湿重TB大于M9，故mSEB工程菌发酵用基础培养基选用TB培养基。

2）IPTG浓度的影响

设定IPTG的终浓度分别是0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM（每升培养基），对其进行比较选出最佳浓度。将新鲜mSEB工程菌菌液（OD600大约2）按1:100分别接种于四个100ml TB中，37℃、200rpm摇至OD6000.8左右，加入IPTG使其分别对应于上述四个浓度（一瓶一个浓度），25℃诱导12h。将将四瓶菌液分别离心，弃上清，以1g:10ml加入PBS，超声（功率300瓦）裂解10min(工作6秒，休息9秒)破菌，进行10%SDS-PAGE实验，结果如图13所示。

由图可知：IPTG终浓度为0.2mM时蛋白表达明显好于0.1mM，与0.5mM、1mM时的蛋白表达基本相同，所以选择0.2mM为发酵用IPTG终浓度。

3）种子菌的不同接种量对工程菌的生长和目的蛋白表达的影响

研究5%、10%、15%三种不同种子菌接种量对发酵的影响。通过细菌生长曲线、单位蛋白表达量来确定最佳接种量。当mSEB种子菌OD600在2左右时，倒入发酵罐内开始计时，每1小时取样测OD600，直到诱导前结束，绘制mSEB前期生长期曲线，可判断细菌生长速度快慢。诱导结束后取样后，按照之前方法处理，进行10%SDS-PAGE，判断目的蛋白表达量。结果如图14和15所示。

由图14可知，5%接种量细菌生长最慢而且最高OD600较另两种接种量低很多，15%最好。

由图15可知，表达最好的是5%接种量，其次是10%，但相差不大，15%最差。

综上所述：5%接种量表达最好，但生长速度慢，最终细菌得率少；15%接种量生长速度快，但表达最差；10%接种量的表达量与5%相差不多，而且生长速度也与15%相差不多，所以选择10%接种量作为优选发酵接种量。

4）氧浓度对工程菌生长和目的蛋白表达的影响

此工程菌是兼性厌氧菌，氧浓度的高低对细菌生长影响很大，所以在发酵过程中对溶氧的控制就显得特别重要，现分别考察溶氧在25%、45%、65%时细菌的生长情况（图16）和目的蛋白表达量（图17）。

从细菌生长情况可知：45%溶氧条件下，细菌是长得最好的；从单位蛋白表达量来看，45%溶氧条件下，表达也是最好的，所以溶氧浓度优选为45%。

5）诱导时机的确定

在不同菌量时诱导，会影响mSEB的表达量，而发酵时培养基中甘油的量会直接影响菌量的多少。当罐内甘油消耗完，细菌停止生长，在短时间内pH值和溶氧值迅速上升，此时应马上加IPTG开始诱导。所以甘油的多少直接决定诱导时机。通过研究5ml/L、10ml/L、15ml/L培养基的甘油量对目的蛋白表达的影响和最终湿重得率来确定最佳诱导时机（图18）。

图18是三个不同甘油量对应的单位目的蛋白表达量，从图可知：5ml/L甘油浓度时，表达量最高；10ml/L其次，但相差不多；15ml/L相差加大。但是5ml/L甘油浓度时，最后菌体湿重是低很多的；10ml/L与15ml/L相差不多。所以最终确定所加的甘油的优选量是10ml/L培养基。

6）同的诱导温度和时间对目的蛋白表达的影响

考察30℃、25℃、16℃三个不同诱导温度对蛋白表达的影响，以及达到最大表达时用的时间。在诱导后每2h取样，诱导10h，处理样品，进行10%SDS-PAGE电泳，其结果如图19所示。

由图可知：30℃单位诱导表达量是最高的，且达到最大表达所用时间是最短的，4h-6h差别不大。而25℃、16℃单位表达量不如30℃，且表达时间长。故诱导温度和时间优选选用30℃、5h。

根据上述研究，最终确定了mSEB工程菌的优选发酵工艺是：

①基础培养基选用动物源性TB培养基，其中甘油量是10ml/L培养基；

②发酵开始时，加入种子菌的比例是10%；

③在发酵过程中溶氧浓度始终保持在45%左右；

④诱导时，温度调为30℃、IPTG浓度为0.2mM、诱导5h。

2、工程菌发酵工艺放大

按照上述的优化条件对发酵规模进行扩大（25L），结果显示为：mSEB生长曲线（图20）和单位蛋白表达电泳图（图21）。

由图20可知，工艺放大后，整个生长曲线比较标准，前期细菌生长较快，后期诱导时曲线较平稳，最终获得菌密度（OD600）达57，单位菌湿重59g/L。

由图21可知，从单位目的蛋白表达看：表达量随时间的延长有明显增加，5h表达量最高。

综上所述：mSEB工程菌发酵工艺放大成功，完全符合预期结果。本发明的发酵工艺可适用于大范围的工业生产应用。

实施例6：mSEB重组蛋白的纯化

向200-500g mSEB工程菌菌体加入20mmol/L PB，pH7.0缓冲液，按重量：体积比1：10比例加入，混匀悬浮，4℃预冷。

高压匀浆：使用蒸馏水冲洗高压匀浆机（高压匀质机APV-1000，丹麦An InvernsysGroup）管道，低温循环系统开启预冷至1-4℃备用。

预冷的悬浮菌液加入高压匀浆机，压力维持在60-80Mpa破菌3-5次，取PBS涂片进行结晶紫染色，油镜下每个视野下未破碎菌小于2个视为破菌完全（破菌率大于90%）。

高速离心：破菌后的液体装入离心桶（Beckman，美国），4℃，10,000-15,000g离心15-30min，收集上清备用。

1）SP SEPHAROSE HIGH PERF（17-1087-01，美国GE Healthcare）阳离子交换层析初步纯化

用20mM PB，pH6.0的缓冲液（A液）平衡层析系统及SP HP离子交换层析柱至电导和UV指数稳定，然后将收集的上清上样，上样结束后采用A液洗柱至UV280不再下降为止，此时采用10-20mmol/L PB，pH6.0，1mol/L NaCl的缓冲液（B液）梯度洗脱，具体洗脱方式为，0-50%B液20min，收集目标蛋白峰；然后直接用100%B液洗脱杂蛋白，4℃保存并进行SDS-PAGE电泳鉴定。整个操作过程中流速为10-15ml/min。层析图如图22所示。在离子交换层析过程中，有大量的杂蛋白流穿。洗脱过程中共出现2个峰，分别命名为第一峰和第二峰。结合电泳结果（图24）发现，第一峰主要为目的蛋白，纯度达到85%以上，第一峰中虽然仍有少量的目的蛋白，但大部分均为杂蛋白。由此，将第一峰的样品保存在4℃备用。

2)Phenyl HP疏水层析

将上步纯化获得的第一峰样品按照1:2的比例加入10-20mM PB，3M(NH₄)₂SO₄，pH7.5的缓冲液，边加边搅拌。采用phenyl HP疏水层析柱前先用10-20mM PB，2M(NH₄)₂SO₄的缓冲液（缓冲液C）平衡层析系统和层析柱，然后将上述处理的蛋白样品上样，上样结束后采用缓冲液C洗柱至UV280不再下降为止，此时采用10-20mM PB，pH7.5的缓冲液（缓冲液D）梯度洗脱。具体洗脱方式为，0-100%B液20min，收集目标蛋白峰，4℃保存并进行SDS-PAGE电泳鉴定。整个操作过程中流速为10-15ml/min。图23为疏水层析的层析图。层析图表明：上样过程中有少量的杂蛋白流穿，洗脱时主要表现为单一的高峰（第一峰），主峰后面紧跟一小峰，但峰不高，因此未进行电泳鉴定。电泳结果图24表明：经过疏水层析，离子交换层析样品中的大部分杂蛋白均已经去除，根据电泳图的灰度扫描，蛋白纯度达到98%以上。

3）脱盐

采用疫苗稀释液平衡脱盐G25柱，将上步纯化获得的样品通过脱盐柱置换缓冲液。

具体为：将上步获得的样品，用疫苗稀释液溶解，并用疫苗稀释液平衡层析系统（AKTAExplorer100，美国GE Healthcare）及层析柱XK50-60（美国GE Healthcare）(600mLSephadex G25)，以流速20mL/min脱盐。层析图如图25所示，蛋白和盐得到了有效的分离。

4）去内毒素

仪器系统：AKTA-explorer100液相色谱系统（GE Healthcare）；

层析填料：Q HP；

柱规格：(Φ)2.6cm×(H)20cm；

装柱体积：50ml；

缓冲液：缓冲液A：10mM His+0.01%泊洛沙姆188+0.9%NaCl，pH6.0，无内毒素（疫苗稀释液）；缓冲液B:1M NaOH；

上样样品：将上步脱盐后样品调节至与缓冲液A一致pH备用。

用缓冲液B(1mol/L NaOH)在位清洗消毒5个柱体积，放置半小时后，使用疫苗稀释液平衡系统至pH为6.0，然后上样。流速：8ml/min。收集穿透峰即目的蛋白峰，进行SDS-PAGE纯度分析（图26）。

5）HPLC纯度检测

HPLC仪Agilent1260（美国GE Healthcare），分析柱ZorBax SB-300-C34.6x150mm3.5micron（美国GE Healthcare）。

流动相：A：0.1%三氟乙酸（Tedia，美国），水（18.2MΩ）；B：0.1%三氟乙酸（国产色谱纯），乙腈（Tedia，美国）。

柱温60℃，流速0.5mL/min，上样10μl。

检测方法：0-30min：90%A，10%B；30-35min：100%B；35-40min：90%A，10%B；40-45min：90%A，10%B。

检测结果如图27和表1所示。

表1：mSEB蛋白的HPLC检测结果

峰#	保留时间（min）	类型	峰宽（min）	峰面积（mAU*s）	峰面积%
						1	11.158		0.0000	0.00000	0.0000
2	13.506	VV	0.1501	2484.53784	100.0000
						3	32.252		0.0000	0.00000	0.0000

检测结果：mSEB主峰保留时间13.506分，主峰面积比率100.0%。

6）蛋白N端、C端测序、分子量测定及氨基酸组成分析

委托上海中科新生命生物科技有限公司对获得的mSEB蛋白进行测序分析，结果与设计的序列完全一致。

实施例7：mSEB蛋白内毒素含量测定

1、将实施例6获得的样品用无热原水（湛江博康海洋生物有限公司）稀释至50μg/mL作为待测样品。根据内毒素检测试剂盒（湛江博康海洋生物有限公司）能检测到的最高范围0.25EU/mL，对待测样品进行稀释。即假定待测样品内毒素含量为5EU/mL，则用无热原水进一步稀释待测样品至2.5μg/mL(稀释20倍)；

2、按照试剂盒（湛江博康海洋生物有限公司）说明书配制内毒素标准品阳性对照溶液、待测样品工作液、待测样品检测溶液；

3、鲎试剂的准备：根据待测样品及对照品的数量，取鲎试剂，酒精棉球消毒瓶颈，晾干后开启，每支加入检查用水0.1ml，轻轻摇匀备用；

4、加样：向配制好的鲎试剂中分别加入待测样品检测溶液、内毒素标准品阳性对照液、检查用水各0.1ml，轻摇混匀，封口膜封口，37℃水浴60±2分钟，期间严禁移动；检查用水为阴性对照；

5、检测：取出样品，轻轻垂直旋转180°，观察瓶底，液体凝固不流动为阳性，流动不凝固为阴性；

6、测定结果：阴性，小于5EU/ml。

实施例8：mSEB毒性检测

1、实验动物：6周龄BALB/c小鼠（北京华阜康），体重约为16g。

2、动物分组及蛋白用量：

阳性对照：1组，6只，25μg天然SEB（Sigma，美国）股四头肌注射＋20mg D-氨基半乳盐酸盐（Sigma，美国）腹膜内注射。

试验1：6只，50μg mSEB股四头肌注射＋20mg D-氨基半乳糖盐酸盐腹膜内注射。

试验2：6只，100μg mSEB股四头肌注射＋20mg D-氨基半乳糖盐酸盐腹膜内注射。

试验3：6只，200μg mSEB股四头肌注射＋20mg D-氨基半乳糖盐酸盐腹膜内注射。

3、结果：

40小时后，阳性对照组小鼠全部死亡，实验组无一死亡，表明构建纯化的mSEB无毒。实施例9：mSEB超抗原性检测

1、猪脾单核白细胞制备：从附近屠宰场新鲜脾脏，消毒后放置于冰上，快速带回实验室。通过30目钢网然后过BD细胞滤网（BD公司，美国）制成细胞悬液。用Histopaque1077密度培养基（Sigma，美国）分散并离心分离出单核白细胞，用Hank’s液（Hyclone，美国）清洗。

2、细胞培养：清洗后的白细胞加入含10%胎牛血清（Hyclone，美国）的RPMI1640培养基（Hyclone，美国），以每孔500000个细胞接种于96孔细胞培养板（Corning，美国）。

3、抗原刺激：不同浓度的天然SEB（Sigma，美国）（1至10μg/ml）和mSEB(1至100μg/ml)以200μl加入培养孔（四复孔）。37℃，5%CO₂培养40小时。

4、ELISA：收集上步培养上清，细胞产生IFNγ的用IFNγELISA定量检测试剂盒（R＆D System，美国）依说明书方法进行。结果见图28。

每一直方图组中左为天然SEB，右为本发明的mSEB，结果表示为平均值±标准差。对于猪脾细胞而言，100μg/ml的天然SEB具有严重毒性，故未试验该浓度。IFNγ检测值低于50pg/ml视为未检出。由图28可见，mSEB没有超抗原性。

实施例10：mSEB疫苗的制备

磷酸铝为美国GENERAL CHEMICAL公司原装进口产品(20mg/ml)

1、配制重组金黄色葡萄球菌疫苗

1）量取磷酸铝佐剂80μL、疫苗稀释液220μL，均加入到配制瓶中，充分混匀；

2）用疫苗稀释液将mSEB稀释至30μg/300μL，充分混匀；

3）将等体积的稀释后佐剂溶液与稀释后蛋白溶液加入至分装瓶中，温度范围4℃-32℃条件下，垂直混悬或水平搅拌吸附1小时后即得。

2、12%SDS-PAGE鉴定重组金黄色葡萄球菌疫苗抗原蛋白磷酸铝佐剂吸附均一性与完全性

1）从1的疫苗样品中取样1ml，4℃，6000rpm离心5分钟，小心吸取上清，并从上清取样40μl；

2）补入与上清等体积的解离液（1M Na₂CO₃），室温条件下，垂直混悬1小时，取样40μl；

3）按步骤1的方法配制不含磷酸铝佐剂的蛋白溶液，磷酸铝所占体积以疫苗稀释液补足，充分混匀后取样40μl；

4）将所取样品加入10μl5×蛋白上样缓冲液，100℃加热5分钟，冷却并瞬时离心后，取10μl上样；

5）12%SDS-PAGE电泳，电压先80v电泳20分钟，再调至180v，电泳40分钟，然后将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，结果示于图29，磷酸铝佐剂能充分充分吸附蛋白mSEB。

实施例11：mSEB免疫动物及抗体的检测

1、免疫动物

1）实验动物：6只6周龄BALB/c小鼠（北京华阜康），体重约为16g；

2）免疫程序：将实施例10制备的疫苗制剂以30μg/600μl分三次股四头肌肌注（0、14、21天）免疫。

2、第三次免疫后第7天，采集BALB/C小鼠的血清，用ELISA检测小鼠免疫后IgG应答水平。

3、ELISA

1）制备液体

①包被液的配制：称取NaHCO₃1.6g，Na₂CO₃2.9g，溶于1L ddH₂O，将pH调至9.6；

②封闭液的配制：1g牛血清Ⅴ(Sigma，美国)，溶于100mL抗体稀释液(1:100)；

③抗体稀释液的配制：在电子天平上称取NaCl8g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KCl0.2g，吐温200.5mL，调节pH至7.4，加蒸馏水定容至1000mL；

④洗涤液的制备：称取2.42g Tris溶于1L ddH₂O，再加入500μL吐温20，再将pH调至7.4；

⑤显色液（TMB），为天根公司产品；

⑥终止液（2M H₂SO₄）的制备：将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mL ddH₂O中。

2）ELISA检测mSEB重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价

①包被：mSEB重组蛋白用包被液稀释至1μg/mL包被96孔板（Corning，美国），200μL/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用；设置PBS对照孔；

②封闭：酶标板加封闭液100μL/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；

③将血清按照1:100、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000进行倍比稀释；

④取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，置于37℃孵育箱30min，洗涤3遍，空干；

⑤将加HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体保存液，稀释1：5000，制成抗体工作液；

⑥加入稀释抗体工作液，100μL/孔，置于37℃孵育箱1h，洗涤三遍，空干；

⑦加入底物显色液（TMB）100μL/孔，室温避光反应5min；

⑧加入终止液（2mol/L H₂SO₄），立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；

⑨结果判断：A_样品/A_阴性值≥2.1为阳性（阴性对照为小鼠免疫前血清1:1000倍稀释）。

结果：所有免疫小鼠产生的抗mSEB蛋白的抗体IgG效价都能达到1:256000。说明本发明构建的mSEB重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体。

实施例12：通过免疫小鼠确定mSEB重组蛋白免疫动物的攻毒保护

同实施例11的免疫方案，第三次免疫小鼠后，在第14天采用致死剂量，尾静脉注射MRSA-252活菌进行攻毒实验，每只BALB/C小鼠注射菌液量为0.85×10⁹CFU，观察10天，统计各组小鼠的存活率。结果示于表2。

表2：mSEB重组蛋白免疫对小鼠的攻毒保护

表2为三次动物免疫试验(每次实验为10只小鼠)结果，表中结果显示阳性对照组、阴性对照组的平均免疫保护率分别为36.7%和6.7%，mSEB加AlPO₄佐剂组的平均免疫保护率为30%。

因此，本发明的SEB无毒、无超抗原性突变体mSEB重组蛋白具有良好的免疫原性，并且能够对MRSA-252感染起到保护作用，能够诱导机体产生免疫应答，可以例如辅以磷酸铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防金黄色葡萄球菌的感染。

通过以上实施例，本领域技术人员利用本领域普通技术知识可以显而易见地应用本发明所制备的重组蛋白与其他相关试剂，例如包被试剂、检测抗体、显色剂、终止剂等制备相关试剂盒，例如检测试剂盒，用于诊断是否感染金黄色葡萄菌、确定预后等。

Claims (10)

1.一种mSEB重组蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码如权利要求1所述的mSEB蛋白的核苷酸序列，优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种包括如权利要求2所述的核苷酸序列的载体或宿主；优选地，所述载体是pGEX或pET系列表达载体，进一步优选地，所述载体是pET22b载体；优选地，所述宿主是大肠杆菌BL21(DE3)。

4.一种制备如权利要求1所述的mSEB蛋白的方法，所述方法为化学合成法或核苷酸表达法。

5.一种发酵如权利要求3所述的宿主以表达权利要求1的mSEB重组蛋白的方法，包括将一定量的种子菌接种于含有甘油和一定溶氧量的发酵培养基中，经诱导剂诱导一定时间而发酵；优选地，所述发酵培养基选自动物源性TB、动物源性M9、植物源性TB或植物源性M9；优选地，所述种子菌的接种量是5%～15%，进一步优选为10%；优选地，所述发酵培养基中甘油量为5-15ml/L培养基，进一步优选为10ml/L培养基；优选地，所述发酵培养基中溶氧量是25%～65%，进一步优选为45%；优选地，所述发酵诱导剂是乳糖或IPTG；优选地，所述诱导剂的浓度是100μmol/L-1mmol/L培养基，进一步优选为200μmol/L培养基；优选地，所述诱导温度为16～37℃，进一步优选为30℃；优选地，诱导时间为1～6小时，进一步优选为5小时。

6.一种在发酵如权利要求3所述的宿主后纯化如权利要求1所述的mSEB蛋白的方法，包括依次进行的阳离子交换层析初步纯化、Phenyl HP疏水层析、脱盐和去内毒素；优选地，所述阳离子交换层析初步纯化为SP HP层析纯化，使用的缓冲液为：A液：10-20mMPB，pH6.0的缓冲液，B液：10-20mmol/L PB，pH6.0，1mol/L NaCl的缓冲液；洗脱方式为：0-50%B液洗脱20个柱体积，收集目标蛋白峰；然后直接用100%B液洗脱杂蛋白；优选地，所述Phenyl HP疏水层析使用的缓冲液为：缓冲液C：10-20mM PB，2M(NH₄)₂SO₄，缓冲液D：10-20mM PB，pH7.5；优选地，所述脱盐使用G25柱；优选地，所述去内毒素步骤使用Q HP层析，使用的缓冲液为：缓冲液A：疫苗稀释液，缓冲液B:1MNaOH。

7.根据权利要求1所述的mSEB蛋白在制备检测、预防或治疗SA感染的生物制品中的应用；优选地，所述生物制品是疫苗。

8.包括如权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的核苷酸序列或权利要求3所述的载体或宿主的试剂盒或组合物。

9.由权利要求1所述的mSEB蛋白免疫机体产生的抗体。

10.根据权利要求9所述的抗体在制备检测、预防或治疗SA感染的制剂中的应用。

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