CN104861050B - 鲍曼不动杆菌锌依赖寡肽a1s_1610蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

鲍曼不动杆菌锌依赖寡肽a1s_1610蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鲍曼不动杆菌A1S_1610蛋白以及包含蛋白的载体、工程菌、组合物或试剂盒，以及该蛋白的制备方法和应用。本发明的A1S_1610蛋白从未用于重组亚单位疫苗领域，本发明的A1S_1610蛋白能够有效激发机体引起保护性免疫应答，从而抵御鲍曼不动杆菌致死性感染。本发明还公开了构建所述重组蛋白的表达载体、转化宿主菌而制备该重组蛋白的方法，以及所述重组蛋白在制备抗鲍曼不动杆菌的亚单位疫苗以及相关检测试剂盒中的用途。本发明采用基因工程技术克隆表达此的保护性抗原成分A1S_1610蛋白，表达量高，便于分离纯化，高效安全。所述基因工程重组疫苗具有良好的抗鲍曼不动杆菌感染的免疫保护效果。

Description

鲍曼不动杆菌锌依赖寡肽A1S_1610蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种鲍曼不动杆菌A1S_1610蛋白及其在制备鲍曼不动杆菌疫苗中的应用。
背景技术
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)为非发酵革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界，属于条件致病菌。广泛存在于自然界的水及土壤、医院环境及人体皮肤、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，为条件致病菌。科室分布以ICU最多，其次为呼吸内科患者。感染的病人多是老年患者、危重疾病及机体抵抗力弱的患者，以及使用各种侵入性操作和长期使用广谱抗生素治疗的患者。可引起肺炎、烧伤感染、伤口感染、脑膜炎、尿路感染、腹膜炎、心内膜炎、骨髓炎、关节炎等，并可进一步发展为败血症。国内资料表明，鲍曼不动杆菌约占临床分离的不动杆菌的70％以上。鲍曼不动杆菌对第三代和第四代头孢菌素的耐药率已达63.0％～89.9％。对四种氨基糖苷类(阿米卡星、庆大酶素、奈替米星、妥布霉素)和环丙沙星的耐药率达96.3％。我国目前的绝大多数菌株对亚胺培南、美罗培南、头孢鲍曼不动杆菌派酮/舒巴坦和多黏菌素B保持敏感，但在呼吸道感染的治疗中效果较差。
由于现有抗生素难以有效治疗鲍曼不动杆菌感染，且鲍曼不动杆菌引起的感染性疾病也变得日益复杂，近年来医学界的相关的病原微生物研究学习者也对鲍曼不动杆菌的预防和治疗进行了相关研究。西班牙Michael J.McCnnell等人利用急性脓血症小鼠模型对鲍曼不动杆菌灭活全菌疫苗的主动免疫和被动免疫两个方面进行了评价；同时，MichaelJ.McCnnell等人在2011年对鲍曼不动杆菌的外膜蛋白疫苗进行了研究，结果提示OMC可以刺激T细胞分泌IFN-γ及活化Th1及Th2辅助B细胞分泌IgG抗体，均对小鼠具有良好的免疫保护性。但是由于全菌疫苗为传统疫苗，其所含疫苗成分复杂，且具有一定的毒副作用，因此安全性不高。外膜复合物疫苗成分复杂，同时含有大量的内毒素，对机体的毒副作用较大，因此研发一种质量可控，安全有效的鲍曼不动杆菌疫苗是必然的趋势。
发明内容
本发明提供一种鲍曼不动杆菌A1S_1610蛋白或其变体，所述A1S_1610蛋白具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；优选地，其氨基酸序列如SEQID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示。然而，本领域技术人员理解，可在SEQ ID NO:1、3或5中天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加)，而不影响A1S_1610的生物学特性。因此，在本发明中，术语“A1S_1610”意欲包括全长A1S_1610蛋白、其成熟肽和其变体，包括SEQ ID NO:1、3或5所示的多肽以及其天然或人工的变体，所述变体保留了A1S_1610的生物学特性，即，具有强免疫原性。并且，当描述A1S_1610的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO:1、3或5所示的多肽的序列片段，还包括该多肽的天然或人工变体中的相应序列片段。
根据本发明，当在蛋白/多肽的背景中使用时，术语“变体”是指这样的蛋白，其氨基酸序列与参照蛋白/多肽(例如，本发明的A1S_1610蛋白)的氨基酸序列具有一个或多个(例如1-10个或1-5个或1-3个)氨基酸差异(例如，保守氨基酸置换)，或者具有至少60％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性，并且其保留了参照蛋白/多肽的必要特性。在本发明中，蛋白/多肽(例如，本发明的A1S_1610蛋白)的必要特性可以指，具有强免疫原性。
根据本发明，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物学活性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
根据本发明，A1S_1610蛋白与其他蛋白的连接可包括例如融合和缀合等。特别地，A1S_1610蛋白可通过接头与其他蛋白连接。根据本发明，术语“接头”是指用于连接两个分子(例如蛋白)的短肽。通常，通过将编码该短肽的多核苷酸序列引入(例如，通过PCR扩增或连接酶)分别编码所要连接的两种目的蛋白的2个DNA片段之间，并进行蛋白质表达来获得融合蛋白，例如目的蛋白1-接头-目的蛋白2。如本领域技术人员公知的，接头包括但不限于柔性连接肽，例如Gly-Gly-Gly-Gly，Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，Gly-Gly-Ser-Ser和(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3。
根据本发明，术语“免疫原性(immunogenicity)”是指，能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的特性，也指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答。
在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义，可互换使用。
本发明鉴于全长A1S_1610蛋白含有一个信号肽，其信号肽对应1～31位的氨基酸序列，为了在最大限度上保持A1S_1610的结构和功能不发生较大的变化，本发明还提供了一种融合蛋白，其包含A1S_1610蛋白的成熟肽、其变体或其片段以及标签蛋白。优选地，所述标签蛋白为GST；优选地，标签蛋白融合于A1S_1610蛋白的成熟肽的N端。上述融合蛋白经酶切获得A1S_1610重组蛋白；优选地，当标签蛋白为GST时，酶切所用酶为PreScissionprotease(PP酶),酶切获得的A1S_1610重组蛋白在A1S_1610蛋白的成熟肽N端增加五个氨基酸残基GPLGS。
在另一个方面，本发明涉及编码本发明的A1S_1610蛋白、融合蛋白及其变体的多核苷酸以及含有该多核苷酸的载体。
可用于插入目的多核苷酸的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个实施方案中，载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。
在另一个方面，本发明还涉及包含上述多核苷酸或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系。
本发明提供一种获得A1S_1610重组蛋白的方法，其包含以下步骤：
(1)利用重组宿主细胞表达本发明的融合蛋白；
(2)回收所述融合蛋白；
(3)对回收的融合蛋白进行酶切，并从酶切产物中回收A1S_1610重组蛋白；
优选地，当标签蛋白为GST时，酶切所用酶为PreScission protease(PP酶)。
在一个优选实施方案中，获得本发明的A1S_1610重组蛋白的方法的步骤(1)还包括：
(ⅰ)根据编码A1S_1610蛋白的核酸序列设计正向引物和反向引物；
(ⅱ)使用步骤(ⅰ)设计的正向引物和反向引物，通过PCR扩增出编码A1S_1610蛋白的基因片段；
(ⅲ)将步骤(ⅱ)所获得的基因片段克隆至表达载体，然后转化至宿主细胞；
(ⅳ)诱导转化后的宿主细胞表达A1S_1610融合蛋白。
本发明优选采用pGEX-6p-2质粒来构建重组原核细胞(例如大肠杆菌)，表达A1S_1610融合蛋白，其主要特点是所表达的融合蛋白中的氨基端接有一个26kDa的GST标签，该标签可作为蛋白纯化标记。与其他融合载体相比，pGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。
优选地，本发明设计的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，所使用的宿主细胞为大肠杆菌XL-1bule。
本发明还提供一种A1S_1610重组蛋白在制备抗鲍曼不动杆菌的亚单位疫苗中的应用。
本发明还提供一种A1S_1610重组蛋白在制备鲍曼不动杆菌检测试剂盒中的应用。
本发明还提供一种抗A1S_1610蛋白或包含A1S_1610蛋白的融合蛋白的抗体。
本发明利用反向疫苗学筛选出一种锌依赖寡肽(Zn-dependentol igopeptidase)A1S_1610，该蛋白由677个氨基酸残基组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其编码核酸序列如SEQ ID NO.6所示。利用生物信息学对A1S_1610蛋白进行结构功能分析，发现A1S_1610是一种分泌蛋白，由1～31位氨基酸组成的信号肽引导分泌至胞外，其成熟肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用A1S_1610蛋白的成熟肽，设计一种亚单位疫苗。
本发明采用基因工程技术克隆表达此保护性抗原A1S_1610重组蛋白，表达量高，便于分离纯化，而且高效安全。A1S_1610重组蛋白可以直接与佐剂(如Al(OH)3佐剂、AlPO4佐剂、MF59、AS03、AS04、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂等)配合使用，优选AlPO4佐剂用于肌肉注射免疫。
本发明的基因工程重组蛋白的表达方法具有以下6个优点：
1、A1S_1610蛋白及从A1S_1610蛋白均未用于重组亚单位疫苗领域；
2、A1S_1610蛋白的表达质粒在原核表达系统(优选大肠杆菌)中诱导表达，表达量高，质量安全可控；
3、选择pGEX-6p-2表达载体，A1S_1610重组蛋白以融合蛋白形式表达，最大限度保持了其原有的空间构象；
4、所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性；
5、A1S_1610融合蛋白表达率约为30％，纯化后的A1S_1610融合蛋白纯度大于95％；
6、A1S_1610重组蛋白能够诱导动物产生特异性的抗体。
利用本发明A1S_1610重组蛋白制备的亚单位疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，激发机体产生IgG抗体和细胞免疫应答。并经动物实验证实，所述基因工程重组单价亚单位疫苗具有良好的抗鲍曼不动杆菌感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。
为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
附图说明
图1是A1S_1610基因片段的PCR扩增结果，其中，泳道M：核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道1-2：A1S_1610基基因片段(1941bp)的PCR扩增产物。
图2为表达载体pGEX-6p-2-A1S_1610的酶切鉴定结果：泳道M：核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道1-4：重组表达质粒pGEX-6p-2-A1S_1610经酶切后的鉴定结果，其中泳道1-4均表示酶切后分离的片段4000bp和1941bp。
图3表示不同温度下诱导蛋白表达结果：泳道M：蛋白分子量标准(Marker)；泳道1：1号重组工程菌在16℃下诱导表达后，在上清中获得的融合蛋白；泳道2：1号重组工程菌在25℃下诱导表达后，在上清中获得的融合蛋白；泳道3：2号重组工程菌在16℃下诱导表达后，在上清中获得的融合蛋白；泳道4：2号重组工程菌在25℃下诱导表达后，在上清中获得的融合蛋白；泳道5：3号重组工程菌在16℃下诱导表达后，在上清中获得的融合蛋白；泳道6：3号重组工程菌在25℃下诱导表达后，在上清中获得的融合蛋白。
图4表示重组工程菌在30℃下诱导表达后，上清中获得含的融合蛋白，其中，泳道M：蛋白分子量标准(Marker)；泳道1：1号重组工程菌在30℃中诱导后，在上清中获得的融合蛋白；泳道2：2号重组工程菌在30℃中诱导后，在上清中获得的融合蛋白；泳道3：3号重组工程菌在30℃中诱导后，在上清中获得的融合蛋白。
图5表示2号重组工程菌在25℃下诱导表达后，获得含A1S_1610-GST融合蛋白酶切后获得A1S_1610重组蛋白结果：泳道M：蛋白分子量标准(Marker)；泳道1：酶切后，获取的A1S_1610重组蛋白；泳道2：酶切后，获取的A1S_1610重组蛋白；泳道3：酶切后，获取的A1S_1610重组蛋白；泳道4：酶切后，非特异性结合在谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B上的目的蛋白和特异性结合在谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B上的酶和GST标签。
图6为利用在线信号肽分析软件http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/对A1S_1610蛋白信号肽预测结果图。
图7为重组工程菌测序后与A1S_1610蛋白的编码核酸序列对比结果。
具体实施方式
本发明所使用的菌株与各种试剂如下：
1.菌株
鲍曼不动杆菌17978国际标准株由美国ACTT提供；
2.试剂
质粒pGEX-6p-2(购于GE公司)、pET-22b(购于Novagen公司)和大肠杆菌菌株XL-1blue(购于普如汀公司)由申请人微生物教研室保存；
primeSTAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、DNA Ligation Mix、限制性内切酶BamH I和Not I、蛋白Marker为大连TakaRa公司产品；
质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；
细菌基因组提取试剂盒、超薄回收试剂盒以及显色液为天根公司产品；
谷胱甘肽-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose 4B为美国GE Healthcare公司产品。
实施例1：鲍曼不动杆菌A1S_1610蛋白的克隆
1.首先根据鲍曼不动杆菌17978标准株A1S_1610基因序列，应用信号肽分析软件进行分析，结果参见附图6。
2.根据分析结果，采用PCR方法以鲍曼不动杆菌17978全基因组为模板扩增A1S_1610蛋白的基因片段，扩增步骤如下：
1)设计PCR引物如下，分别为SEQ ID NO.7-8(下划线示酶切位点碱基序列)
正向引物PA1S1610B1(SEQ ID NO.7)：
5'-CGCGGATCCGAAGCGACGCGTGCGACA-3'
BamH Ⅰ
反向引物PA1S1610N2(SEQ ID NO.8)：
5'-TTATGCGGCCGCCTTATTTAACCCGTTGTCCGGTAA-3'
Not Ⅰ
本实施例将编码SEQ ID NO.1所示A1S_1610蛋白氨基酸序列的DNA序列SEQ IDNO.2作为目的基因片段进行PCR扩增。
2)-80℃冷冻库中取出保存的鲍曼不动杆菌17978菌株涂布于专用LB固体培养基上，于37℃培养过夜，再挑取单菌落接种于LB液体培养基中培养8个小时，参照细菌基因组抽提试剂盒抽提全基因组。
3)以鲍曼不动杆菌17978全基因组DNA为模板，PCR扩增A1S_1610蛋白基因片段；
PCR体系：
模板(179ng/μl) 1μl
PA1S1610B1(1μM) 2μl
PA1S1610N2(1μM) 2μl
Taq酶 0.5μl
dNTP 4μl
Buffer 10μl
灭菌双蒸水 30.5μl
总体积 50μl
PCR扩增反应条件：98℃预变性20s，94℃变性30s，68℃退火40s，72℃延伸2min，30个循环，72℃完全延伸10min。
反应完毕后使用1％的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，PCR扩增结果示于图1中。
4)使用凝胶回收试剂盒回收A1S_1610PCR产物。
3.PCR产物的鉴定与克隆，步骤如下：
1)BamH I和Not I酶切pGEX-6P-2质粒和A1S_1610PCR产物，37℃酶切3h。
酶切反应体系：
BamH I 3μl
Not I 3μl
10×K Buffer 3μl
0.1％BSA 6μl
Product 45μl
总体积 60μl
2)使用超薄回收试剂盒回收pGEX-6P-2质粒和经BamH I和Not I酶切的PCR产物。
3)连接和转化
通过紫外分光光度计测定目的基因酶切回收产物核酸浓度：58ng/μl，pGEX-6P-2酶切回收产物核酸浓度：48ng/μl，根据载体与外源片段摩尔数一般比为1：2～10，设计以下连接反应体系。
连接反应体系：
DNA Ligation Mix 5μl
目的基因酶切回收产物 4.5μl
PGEX-6P-2酶切回收产物 0.5μl
总体积 10μl
混匀，16℃连接1h。
4)从-80℃冰箱取3管大肠杆菌XL-1blue感受态细胞，第一管加入pGEX-6P-2质粒，作阳性对照；第二管加入DNA连接产物；第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴30min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴2min。加入600ulLB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中200rp振摇1h。
各管以5000rpm室温离心5min.，弃去400ul上清，再重悬菌体，取100μl涂布于Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。
5)pGEX-6p-2/A1S_1610阳性重组质粒的筛选、鉴定
①阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确，结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜；
②质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行；
③质粒DNA进行BamH I和Not I双酶切；
双酶切反应体系：
BamH I 0.5μl
Not I 0.5μl
10×K Buffer 0.5μl
0.1％BSA 1μl
重组质粒 8μl
总体积 12.5μl
37℃酶切2h；
④1％的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如图2，可见泳道1～4样品为构建成功的pGEX-6p-2/A1S_1610重组质粒；
⑤pGEX-6p-2/A1S_1610重组质粒送往宝生物公司测序，测序结果比对结果示于图7，可见重组质粒的目的基因片段的序列是正确的。
实施例2：鲍曼不动杆菌-17978A1S_1610蛋白在原核表达系统－大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定
1.目的蛋白诱导表达
1)取双酶切鉴定正确的pGEX-6P-2-A1S_1610/XL-1blue菌液100μL加入10mL Amp抗性的TB培养基中，100rpm 37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液2ml加入18mL Amp抗性的TB培养基中(余下的菌液保存在4℃冰箱中备用)，37℃培养2～3h，转速250rpm，二次活化至OD600为0.8～1.2时，加入IPTG4.4μL，使其终浓度为200μM，再置于摇床诱导表达30℃3h，25℃5h，16℃过夜诱导表达。
2)将诱导表达后的菌液取出，以1000rpm离心2min，弃去上清，加入1mLPBS缓冲液混匀，超声裂解3min，再4℃14000rpm离心15min,收集上清。
2.处理上清
取谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B 20μl，用PBS洗涤3次后，将准备好的上清加入谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B中，4℃旋转过夜结合(或室温结合1h)。在4℃下以5000rpm离心3min后，使用PBS-0.25％吐温20洗涤2次，PBS洗涤一次。向结合后的谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B加入5μl5×蛋白质上样buffer，加入处理5min，10000rpm离心2min。
3.SDS-PAGE电泳，将5％浓缩胶灌入制胶版中，在加入蒸馏水将胶压平，室温放置30min使其凝固，将上层的蒸馏水倒干，再灌入10％分离胶，立即插上梳子，室温放置30min使其凝固备用。
4.将处理好的上清样品分别取10μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先80v电泳30min，再调至200V，电泳45min后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，结果示于图3和图4，PGEX-6P-2-A1S_1610/XL-1blue有在30℃、25℃、16℃条件下均能表达出分子量大小约为100kDa的含有GST标签的A1S_1610蛋白，且重组蛋白均在超声裂解的上清中，因此所述重组蛋白在各诱导温度条件均为可溶性蛋白，并且在25℃诱导温度目的蛋白的表达量高，其纯度达到95％。
实施例3：A1S_1610蛋白抗原的制备
1.放大培养获取蛋白
取保存在-80℃冰箱中的pGEX-6P-2-A1S_1610/XL-1blue菌种接种于LB氨苄抗性平板，37℃培养过夜；挑取单菌落接种于100ml LB氨苄抗性培养基，37℃，200rpm培养过夜；将活化的100ml菌液加入到2L含Amp抗性的LB培养基中进行二次活化，37℃培养3～4h至OD600为1.2时，加入420ml IPTG(终浓度为200uM)置于30℃摇床中诱导3h后，6000rpm离心5min收集菌体,再加80ml PBS重悬菌体后，将菌液进行超声裂解30min，同上离心收集上清与4ml谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B结合；获得大量的含有GST标签的A1S_1610融合蛋白。
2.使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，获取A1S_1610重组蛋白
向余下约4ml已结合目的蛋白的谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B中加入4ml PBS和120μLPreScission protease(PP酶)，4℃垂直旋转酶切过夜，离心吸取上清后，分别用2ml PBS洗涤2次，取10μL样品变性处理后，上样10μL进行SDS-PAGE蛋白电泳，在呈相系统下观察结果，酶切后获得A1S_1610蛋白分子量在74kDa左右，与预期蛋白分子量大小相符合，电泳结果示于图5，泳道1表示酶切后，由于目的蛋白与结合于凝胶珠的GST标签分离，在上清获取的目的蛋白；泳道2表示酶切后，第一次洗涤凝胶珠获取的目的蛋白；泳道3表示酶切后，第二次洗涤凝胶珠获取的的目的蛋白；泳道4表示酶切后，非特异性结合在凝胶珠上的目的蛋白和特异性结合在填料上的酶和GST标签。
3.置换缓冲液，将目的蛋白保存于组氨酸缓冲液中(10μm组氨酸，pH6.0)。
4.BCA法测定蛋白浓度，浓度为3.2mg/mL。
实施例4：感染用鲍曼不动杆菌(国际标准株17978)标准定量曲线的建立
将菌株接种于MH平板置于37℃孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接种于MH液体培养基中，置于37℃恒温摇床中震荡培养6小时后6000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤菌体2次；再将菌液进行10倍和1.25倍稀释，并在紫外分光系统下测定各菌液的在600nm处的吸光度(OD600)，并取各个稀释度的菌液100μl涂布于MH平板，置于37℃孵育24小时后计数菌落；根据各个平板菌落数和菌液的OD600值绘制标准定量曲线。
结果：标准曲线公式为Y＝3.012X+0.0051(109CFU/ml)，相关系数为0.9998。
实施例5：脓毒血症动物模型的构建
1.将菌株接种于MH平板置于37℃孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接种于MH液体培养基中，置于37℃恒温摇床中震荡培养6小时后收集菌体，并利用标准曲线公式进行定量，再将菌液稀释(或浓缩)为2.0×109CFU/mL、2.1×109CFU/mL、4×109CFU/mL不同浓度组，再用各组菌液通过腹腔注射6～8周龄、体重为18～20g的BALB/C小鼠(100μl/只)进行全身感染，同时设置生理盐水对照组，观察7天并统计各组小鼠的死亡率；
2、感染后计时在每隔24h(观察7天)采用菌落计数法对细菌定植量进行检测：从各感染组和对照组中随机选取3只小鼠，利用眼球摘除法，取小鼠血样100μl涂于平板，置于37℃，24h后计数克隆数；取完血样后将小鼠处死放入75％酒精中浸泡消毒后，取出将其四肢固定，将其解剖，取出脾、肾、肝脏，置于1mL无菌的PBS中，于洁净的玻璃匀浆器中进行匀浆，取100μl均浆按照1:10、1:100、1:1000比例进行稀释；每稀释度各取100μL轻轻涂布于固体培养基上，置于37℃，培养24h，做菌落计数。
结果显示于表1：
表1 鲍曼不动杆菌-17978感染剂量与致死剂量的确定
2.0×108CFU剂量组7天内小鼠死亡率为0；2.2×108CFU剂量组48h内小鼠死亡率为20％；4.2×108CFU剂量组48h内小鼠死亡率为90％；由此可见鲍曼不动杆菌-17978感染剂量为2.2×108CFU，亚致死剂量为4.2×108CFU。
3.鲍曼不动杆菌-17978感染BALB/C小鼠后在血液和各脏器中的定植量：
感染后肺中细菌的在24h时达到峰值，最大定植量达到2.0×104CFU/ml，在48h时肺中细菌量开始减少，到72h时肺中未检测出细菌；感染后肾脏中细菌的在24h时达到峰值，最大定植量达到1.0×103CFU/ml，在48h时肺中细菌量开始减少，到72h时肺中未检测出细菌；感染后血液、脾、心脏、肝脏中定植的细菌均未检测到；对照组小鼠的血液、脾、肾、肝脏中的细菌定植检测结果均为零。
以上结果针对小鼠的生存率和血液、脾、肾、肝脏主要器官细菌定植量进行了动物模型的评价，为鲍曼不动杆菌单个亚单位疫苗和鲍曼不动杆菌亚单位融合疫苗的成功研制及鲍曼不动杆菌感染的发病机制的研究奠定了基础。
实施例6：免疫动物及抗体的检测
1.免疫动物
1)首次免疫，将实施例3中获得的A1S_1610重组蛋白抗原与AlPO4佐剂物理混合，用蛋白保存液将抗原浓度调节为200μg/ml，并置于4℃旋转吸附过夜制成疫苗；用5号半型针头，双侧腹股沟注射，每只BALB/C小鼠注射量为150μl，并设置阴性对照组(AlPO4佐剂组)和空白对照组(蛋白保存液组)；
2)第二次免疫，第14天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量与首次免疫的相同，免疫途径同上；
3)第三次免疫，第21天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量与首次免疫的相同，免疫途径同上；
2.第三次免疫后第7和14天，采集BALB/C小鼠的血，用ELISA检测小鼠免疫后IgG体液应答水平。
1)制备液体
①包被液的配制：称取NaHCO31.6g，Na2CO32.9g，溶于1L ddH2O，用PH计将pH调至9.6；
②封闭液的配制：1g牛血清Ⅴ，溶于100mL抗体稀释液(1:100)；
③抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1L ddH2O，再加入500μl Tween 20，再用PH计将pH调至7.4；
④洗涤液的制备：称取2.42g Tris溶于1L ddH2O，再加入500μl Tween 20，再用PH计将pH调至7.4；
⑤显色液(TMB)，为天根公司产品；
⑥终止液(2M H2SO4)的制备：将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mL ddH2O中。
2)ELISA检测A1S_1610重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价
①用包被液将纯化后的A1S_1610重组蛋白稀释为10μg/mL；
②包被：将重组蛋白稀释液加入酶标板，200μl/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍；
③封闭：酶标板加封闭液100μl/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；
④将血清进行1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000等倍比稀释；
⑤取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μl/孔，,置于37℃孵育箱30min，洗涤3遍，空干；
⑥将加HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体保存液，稀释1：5000，制成抗体工作液；
⑦加入稀释抗体工作液，100μl/孔，置于37℃孵育箱45min，洗涤三遍，空干；
⑧加入底物显色液(TMB)100μl/孔，室温避光反应5min；
⑨加入终止液(2M H2SO4)，立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；
⑩结果判断：A样品/A阴性值≧2.1为阳性(阴性对照为小鼠免疫前血清)。
结果：检测A1S_1610蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1:16000；免疫后第7天的抗体阳性率达到90％，免疫后第14天的抗体阳性率达到100％；说明本发明构建的A1S_1610重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体。
实施例7：通过免疫小鼠确定A1S_1610重组蛋白免疫动物的攻毒保护
同实施例6的免疫方案，第三次免疫小鼠后，在第14天采用致死剂量，腹腔注射鲍曼不动杆菌-17978活菌进行攻毒实验，每只BALB/C小鼠注射菌液量为4×108CFU，观察10天，统计各组小鼠的存活率。结果示于表2。
表2
表2显示：为四次动物免疫试验(每次实验为10只小鼠)结果，表中结果显示阴性对照组和空白对照组的平均免疫保护率分别为16.66％和10％，A1S_1610重组蛋白辅以AlPO4佐剂组的平均免疫保护率为50％。
因此，本发明的A1S_1610蛋白具有良好的免疫原性，并且能够对鲍曼不动杆菌-17978感染起到免疫保护性作用，能够诱导机体产生免疫应答，可以例如辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防鲍曼不动杆菌的感染。
通过以上实施例，本领域技术人员利用本领域普通技术知识可以显而易见地应用本发明所制备的A1S_1610蛋白与其他相关试剂，例如包被试剂、检测抗体、显色剂、终止剂等制备相关试剂盒，例如检测试剂盒，用于诊断是否感染鲍曼不动杆菌、确定预后等。
本领域技术人员可以将本发明A1S_1610蛋白用于其他任何适用的用途。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

Claims (9)

1.一种鲍曼不动杆菌A1S_1610重组蛋白，其特征在于: 包含A1S_1610成熟肽，所述成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.编码权利要求1所述A1S_1610重组蛋白的多核苷酸。
3.一种表达载体，其特征在于：包含编码权利要求1所述的重组蛋白的多核苷酸。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体是pGEX-6P-2。
5.一种宿主菌，其特征在于：包含权利要求3所述的表达载体。
6.根据权利要求5所述的宿主菌，其特征在于：所述宿主菌是大肠杆菌XL1-Blue。
7.权利要求1所述A1S_1610重组蛋白的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
1）设计PCR的引物如下：
正向引物
5'-CGCGGATCCGAAGCGACGCGTGCGACA -3'
反向引物
5'-TTATGCGGCCGCCTTATTTAACCCGTTGTCCGGTAA -3'
2）使用步骤1）设计的引物通过PCR扩增出编码所述成熟肽的目的基因片段；
3）步骤2）所得的基因片段克隆至含有GST标签的表达载体，然后转化至宿主菌；
4）诱导转化后的宿主菌表达融合蛋白，所述融合蛋白由GST标签蛋白融合于所述A1S_1610成熟肽的N端形成；
5）纯化融合蛋白，PreScission蛋白酶酶切融合蛋白，得到A1S_1610重组蛋白。
8.权利要求1所述的A1S_1610重组蛋白在制备预防或治疗鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。
9.权利要求1所述的A1S_1610重组蛋白在制备鲍曼不动杆菌检测试剂盒中的应用。
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