CN105622734B - 铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白Vac14的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种铜绿假单胞菌(PA)重组亚单位基因工程蛋白疫苗Vac14的纯化方法。Vac14蛋白为铜绿假单胞菌抗原分子的活性功能片段重组融合，通过大肠杆菌基因工程菌表达获得。采用对基因工程菌进行高压破菌、GST亲和层析、PP酶酶切、SP HP层析、G 25层析、Q HP层析等技术，获得高纯度的铜绿假单胞菌(PA)重组亚单位基因工程蛋白Vac14。该发明纯化工艺简捷、容易放大、重复性好，所获目标蛋白纯度高，动物试验证明可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。

Description

铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白Vac14的纯化方法
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及铜绿假单胞菌(PA)重组蛋白Vac14(β-lactamase)疫苗的纯化方法。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)俗称绿脓杆菌，广泛分布于自然界、正常人皮肤、肠道、呼吸道中，感染可发生在人体任何部位和组织，常见于烧伤或创伤部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道，也可引起心内膜炎、胃肠炎、脓胸甚至败血症，该菌目前已成为全球ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一，全身感染死亡率在20％以上。
PA致病因素包括生物膜、内毒素、分泌的毒力因子和蛋白酶，群体感应系统等，自然感染后能够诱导机体产生局部的粘膜免疫以及全身性的体液及细胞免疫应答，但这些应答并不足以很好的清除细菌。目前在疫苗方面的研究很多，但尚无一种疫苗进入临床应用，铜绿假单胞菌的β内酰胺酶(β-lactamase)属于C类β内酰胺酶，由铜绿假单胞菌染色体编码，组成型表达，能够催化6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基头孢烷酸(7-ACA)及其N-酰基衍生物分子中β-内酰胺环酰胺键的水解反应，由此灭活β内酰胺类的抗生素介导细菌的耐药(McKinney,D.C等，2015)。β内酰胺酶的组成性表达是绿脓杆菌耐药的关键，同样也是基因工程亚单位疫苗的候选抗原。
申请人采用基因工程技术克隆将铜绿假单胞菌抗原分子的活性功能片段重组融合，通过大肠杆菌基因工程菌表达获得获得铜绿假单胞菌(PA)疫苗重组蛋白Vac14，所述重组蛋白经动物试验证明，可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用，有利于铜绿假单胞菌的预防、诊断和治疗。目前，尚未见针对该重组蛋白Vac14纯化方法的报道。
发明内容
本发明的目的：提供一种铜绿假单胞菌(PA)重组亚单位基因工程蛋白Vac14疫苗的纯化方法。该方法工艺简单，所获得目标蛋白纯度高，容易放大、重复性好，回收率较好。
本发明的技术方案是：
铜绿假单胞菌亚单位重组基因工程疫苗候选抗原Vac14，该抗原的核酸序列如SEQID NO：1所示、氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
铜绿假单胞菌亚单位重组基因工程疫苗候选抗原Vac14的纯化方法，包括步骤：收集制备的所述抗原Vac14；按照高压破菌、离心；GST亲和纯化；SP HP层析纯化；G 25层析纯化；Q HP层析纯化的顺序组合对制备的抗原进行纯化。
上述纯化方法的具体步骤如下：
1)高压破菌
将收集的Vac14菌体作为目标蛋白，用pH为7.0-7.5的10mM PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；
2)GST亲和纯化
GST亲和层析填料进行初步纯化，使用A液对目标蛋白进行纯化，PrescissionProtease酶进行酶切洗脱：
3)SP HP层析纯化
经步骤2)收集的目标蛋白，用A液平衡层析系统及SP HP层析柱，B液(20mMNa2HPO4-NaH2PO4，1M NaCl,pH7.0-7.5)线性梯度洗脱；
4)G 25层析纯化
将经步骤3)纯化的目标蛋白，用G25层析柱纯化，C液平衡层析系统及层析柱，分离纯化目标蛋白，置换缓冲液；
5)Q HP层析纯化
将经步骤4)纯化的标蛋白，C液平衡层析系统及Q HP层析柱，去除痕量非目标蛋白，内毒素等杂质，分离纯化目标蛋白；
其中，A液为pH值7.0-7.5的20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液，B液为pH7.0-7.5的20mM Na2HPO4-NaH2PO4，1M NaCl缓冲溶液，C液为pH6.0的10mM His，0.9％NaCl缓冲溶液。
步骤1)所述的高压匀浆破菌采用60-80MPa，高速离心获取破菌上清。
步骤2)所述的GST亲和层析使用的填料为Glutathione Sepharose 4B或Glutathione Sepharose 4FF或Glutathione Sepharose HP。
步骤2)所述的Prescission Protease酶带有GST标签。
步骤3)所述的SP HP层析柱的填料为SP Sepharose HP或SP Sepharose FF或Capto SP。
步骤4)所述的G 25层析柱的填料为Sephadex G-25Coarse或Sephadex G-25Medium或Sephadex G-25Fine或Sephadex G-25Superfine。
步骤5)所述的Q HP层析柱的填料为Q Sepharose HP或Q Sepharose FF或CaptoQ。
上述纯化方法的抗原Vac14采用以下方法制备：
1)设计正向引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成获得铜绿假单胞菌亚单位重组基因工程疫苗Vac14蛋白片段的核苷酸序列；
2)将步骤1)获得的核苷酸序列克隆表达至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌；
3)诱导转换后的宿主菌表达重组蛋白。
发明效果
采用本发明所述的纯化方法，从表达铜绿假单胞菌(PA)重组亚单位基因工程蛋白Vac14的大肠杆菌工程菌中可以获得纯度大于98％，回收率大于50％的目的蛋白，通过氨基酸序列预测本发明人构建获得的蛋白Vac14分子质量约为40.3kD，等电点在pH 8.89左右。
本发明所述的纯化方法主要有GST亲和纯化、SP HP层析、G25层析、Q HP层析，通过上述方法纯化的蛋白用12％SDS-PAGE检测，呈现出单一目标蛋白条带，分子质量约为40kD。HPLC C3柱分析目的蛋白纯度99.2％。纯化后的Vac14与Al(OH)3佐剂共同注射免疫BalB/C小鼠，发现Vac14加免疫佐剂组血清中的IgG水平显著高于阴性对照组(PBS组)(P<0.01)，证明使用本发明人纯化方法获得的Vac14可有效刺激机体产生较高的免疫应答。使用临床株XN-1(CCTCC M 2015730)感染，发现Vac14加免疫佐剂组感染率为20％，对照组(PBS组)感染率为80％，计算得出Vac14抗PA感染的保护率为75％。
附图说明
图1为Vac14基因片段的PCR扩增结果；其中，泳道1：核酸(DNA)分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：4500、3000、2000、1200、800、500、200bp；；泳道2：目的基因片段Vac14(～1100bp)；
图2为重组质粒pGex-6P-2-Vac14的双酶切鉴定结果；其中，泳道1：核酸(DNA)分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：4500、3000、2000、1200、800、500、200bp；泳道2：重组表达质粒pGEX-6p-2-Vac14经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段约4000bp和约1100bp；
图3为蛋白Vac14诱导鉴定结果；其中，泳道1：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd、10Kd；泳道2：结合诱导表达的超声上清的GST填料；泳道3：经PP酶酶切后的上清；
图4为纯化后的蛋白Vac14SDS-PAGE电泳结果；其中，泳道1：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd、10Kd；泳道2：纯化的Vac14蛋白；
图5为GST亲和PP酶酶切及SP HP层析SDS-PAGE结果，图中，泳道M:蛋白分子量marker；泳道1：蛋白与GST亲和填料结合；泳道2：PP酶酶切后GST亲和填料；泳道3：PP酶酶切后洗脱样本；泳道4：SP HP洗脱样品；
图6为SP HP层析图；
图7为G 25层析图；
图8为Q HP层析图；
图9为Q HP层析后SDS-PAGE结果，图中，泳道M:蛋白分子量marker；泳道1：Q HP流穿样品；
图10为蛋白HPLC检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处说描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
菌株与各种试剂如下：
1.铜绿假单胞菌菌株
铜绿假单胞菌国际标准株PA01由美国ATCC提供(BAA-47TM)；
2.试剂
质粒pGEX-6p-2、Glutathione Sepharose 4B、SP Sepharose HP、Sephadex G-25Medium、Q Sepharose HP购自GE Healthcare Life Sciences公司，申请人保存；
大肠杆菌菌株XL-1blue购自上海超研生物科技有限公司，申请人保存；
primeSTAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、限制性内切酶BamH I和EcoR I、蛋白Marker为大连TakaRa公司产品；
质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；
Na2HPO4.12H2O、NaH2PO4.2H2O、NaCl、NaOH、Tween-20、NaHCO3，Na2CO3购自国药集团化学试剂有限公司；
PBS、HRP标记的羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；
Tryptone、Yeast extract均购自英国OXOID公司；
Ampicilline、0.9％氯化钠注射液购自太极集团西南药业；
琼脂粉、IPTG、L-组氨酸、购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
蛋白上样缓冲液购于碧云天生物技术；蛋白Marker购于Thermo公司；
TFA、乙腈购自TEDIA公司；
Al(OH)3购自Brenntage公司；
Tris购自ANGUS公司；
硫酸、盐酸购自成都科龙化工试剂厂；
牛血清白蛋白V购自BIOSHARP公司；
异氟烷购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。
实施例1：Vac14基因的克隆和重组质粒pGEX-6P-2-Vac14的构建
1.首先根据铜绿假单胞菌PA01的Vac14蛋白全长基因序列，应用生物信息软件进行结构分析，确定需要扩增的Vac14目的基因片段。
2.根据分析结果，采用PCR方法自PA01基因组扩增Vac14目的基因片段，扩增步骤如下：
1)设计PCR引物如下，分别为SEQ ID NO：3-4(下划线示酶切位点碱基序列)
Seq ID 引物名称 序列(5’-3’) 内切酶
Seq ID 3 Vac14-F ATCGGATCCGATCGCCTGAAGGCACTG BamH I
Seq ID 4 Vac14-R CCGGAATTCTCAGCGCTTCAGCGGC EcoR I
2)-80℃冷冻库中取出保存的铜绿假单胞菌菌株PA01涂布于LB固体培养基上，于37℃培养过夜，再挑取单菌落接种于LB液体培养基中培养8个小时，参照细菌基因组抽提试剂盒抽提PA01基因组。
3)以PA01全基因组DNA为模板PCR扩增Vac14基因片段
PCR体系：
模板(239.2ng/μl) 2.5μl
Vac14-F(50μM) 1.0μl
Vac14-R(50μM) 1.0μl
primeSTAR酶 2.5μl
dNTP 2.0μl
Buffer 15.0μl
灭菌双蒸水 26.0μl
总体积 50.0μl
PCR扩增反应条件98℃预变性5min，98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环，72℃完全延伸6min。反应完毕后使用1％的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，PCR扩增结果示于图1中。
4)使用凝胶回收试剂盒回收Vac14PCR产物。
3.PCR产物的鉴定与克隆，步骤如下：
1)BamH I和EcoR I酶切pGEX-6P-2质粒和Vac14PCR产物
酶切反应体系：
项目 体积
BamH I 3.0μl
EcoR I 3.0μl
10×K Buffer 3.0μl
0.1％BSA 6.0μl
Product 45.0μl
37℃酶切2h。
2)使用超薄回收试剂盒回收pGEX-6P-2质粒和经BamH I和EcoR I酶切的PCR产物。
3)连接和转化
通过紫外分光光度计测定Vac14酶切回收产物核酸浓度：21ng/μl，pGEX-6P-2酶切回收产物核酸浓度：60ng/μl。
连接反应体系：
混匀，16℃连接2h。
4)从-80℃冰箱取3管大肠杆菌XL1blue感受态细胞，第一管加入pGEX-6P-2质粒，作阳性对照；第二管加入DNA连接产物；第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴50min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴2min。加入600ul LB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中220rp振摇1h。
各管以5000rpm室温离心3min.，弃去300ul上清，再重悬菌体，取200μl涂布于Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。
5)pGEX-6p-2-Vac14阳性重组质粒的筛选、鉴定
①阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确，结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜；
②质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行；
③质粒DNA进行BamH I和EcoR I双酶切；
双酶切反应体系：
项目 体积
BamH I 0.5μl
Not I 0.5μl
10×K Buffer 0.5μl
0.1％BSA 1.0μl
重组质粒 8.0μl
37℃酶切2h；
④1％的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如图2，可见泳道2样品为构建成功的pGEX-6p-2-Vac14重组质粒；
⑤pGEX-6p-2-Vac14重组质粒送往上海英俊公司测序，测序结果比GeneBank序列信息比对，结果发现二者的序列核苷酸序列完全相同。
其中，Ampicilline溶液的配制：取Ampicilline 500mg加入5ml I级水溶解完全，0.22μm无菌过滤器过滤。
Amp抗性LB固体培养基的配制：取Tryptone 1g,Yeast extract 0.5g，NaCl 1g，琼脂粉1.5g，加I级水100ml溶解完全，调pH值至7.4，高压灭菌冷却至40℃左右加入0.1mlAmpicilline溶液，依次取约10ml倒入无菌培养皿中，冷却后4℃保存。
Amp抗性LB液体培养基的配制：取Tryptone 1g,Yeast extract 0.5g，NaCl 1g加I级水100ml溶解完全，调pH值至7.4，高压灭菌冷却至40℃左右加入0.1ml Ampicilline溶液。
实施例2：重组融合蛋白Vac14在原核表达系统－大肠杆菌中诱导表达及表达形式的鉴定
1.Vac14诱导表达
取过夜培养的pGEX-6P-2-Vac14/XL-1blue菌液100μL加入10mL Amp+抗性的LB培养基中，180rpm 37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液400μL加入20mL Amp+抗性的LB培养基中(余下的菌液保存在4℃冰箱中备用)，37℃培养2～3h，转速200rpm，二次活化至OD600为0.8-1.0时，加入IPTG 4μL，使其终浓度为200μM，再置于摇床诱导表达30℃诱导表达3h。
其中，IPTG溶液的配制：取2.38gIPTG溶于10ml I级水溶解完全，0.22μm无菌过滤器过滤。
2)将诱导表达后的菌液取出，以12000rpm离心5min，弃去上清，加入1mL lysisbuffer(20mM Na2HPO4-NaH2PO4,pH 7.2,250mM NaCl)混匀，超声裂解3min(超声6次30s/次)，再4℃14000rpm离心15min,分离上清和沉淀。
其中，lysisbuffer的配制：取Na2HPO4.12H2O 4.2g,NaH2PO4.2H20 0.8g，NaCl14.61g，加I级水900ml溶解完全，调pH值至7.2，加I级水定容至1L。
2.处理上清
取Glutathione Sepharose 4B 20μl，用PBS洗涤3次后，将准备好的上清加入Glutathione Sepharose 4B中，室温结合1h。在4℃下以14000rpm离心3min后，使用PBS-0.25％吐温20洗涤2次，PBS洗涤一次。向结合后的Glutathione Sepharose 4B加入20μL 2×蛋白质上样buffer，煮沸5min，14000rpm离心3min。
3.处理沉淀
在沉淀中加入500μL PBS重悬菌体，取80μL重悬菌液加入20μL 5×蛋白质上样buffer，煮沸5min，14000rpm离心3min。
4.SDS-PAGE电泳
将5％浓缩胶灌入制胶版中，在加入蒸馏水将胶压平，室温放置30min使其凝固，将上层的蒸馏水倒干，再灌入10％分离胶，立即插上梳子，室温放置30min使其凝固备用。将处理好的上清和沉淀分别取10μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先80v电泳30min，再调至180v，电泳1～2h后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，PGEX-6P-2-Vac14/XL-1blue在30℃为可溶性蛋白(图3)。
实施例3：Vac14抗原的制备
1.放大培养获取蛋白
取保存在4℃冰箱中备用的pGEX-6P-2-Vac14/XL-1blue菌液400μL加入到20mL含Amp抗性的LB培养基中进行一次活化，200rpm37℃培养5～6h后，取8mL一次活化的菌液加入到400mL含Amp抗性的LB培养基中进行二次活化，37℃培养3～4h至OD600为1.0时，加入80μLIPTG(终浓度为200μM)置于16℃摇床中过夜诱导后，12000rpm离心15min收集菌体,再加20mL lysis buffer(同实施例2)重悬菌体后，将菌液进行超声裂解3min(200V)，收集上清与800μL用于结合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B(GE公司)凝胶珠(beads)结合处理；再进行SDS-PAGE凝胶电泳。2.使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，获取Vac14目的蛋白
向余下约800μL已结合蛋白的Glutathione Sepharose 4B中加入800μL PBS和120μL PreScission protease(PP酶，GE公司)，室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清后，分别用800μL PBS洗涤3次，各后取10μL样品变性处理后，上样5μL进行蛋白电泳(方法同上)，在呈相系统下观察结果，酶切下来的Vac14蛋白分子量～43kDa，与预期蛋白分子量大小相符合，见图4。
实施例4 重组融合蛋白Vac14的纯化
1.高压破菌、离心
将上述表达可溶性铜绿假单胞菌重组亚单位基因工程蛋白Vac14的大肠杆菌工程菌，通过高密度发酵，离心收集菌体备用。
菌体300g左右以PBS(10mM，pH7.0-7.5)缓冲液(取3袋PBS干粉(1L/袋)加I级水3000ml溶解完全)，按重量：体积比1：10比例混匀悬浮，4℃预冷。
高压匀浆机：使用蒸馏水冲洗高压匀浆机管道，低温循环系统开启预冷至1-4℃备用。
预冷的悬浮菌液加入高压匀浆机，压力维持在60-80Mpa破菌3-5次，取破菌液涂片结晶紫染色，油镜每个视野下未破碎菌小于1-2个视为破菌完全。
高速离心：破菌后的液体装入离心桶，4℃，10,000-15,000g离心15-30min，收集上清备用。
2.GST亲和纯化
选择GST亲和层析填料进行初步纯化，GST亲和填料为Glutathione Sepharose4B、Glutathione Sepharose 4FF、Glutathione Sepharose HP之一，破菌菌体湿重每100g填料用量为100ml。
Prescission Protease酶(PP酶)进行酶切洗脱：所使用的PP酶带有GST标签，以利于去除PP酶，获取目的蛋白，电泳结果如图1所示。经过GST初纯，目的蛋白的纯度进一步提高，但仍有待提高，除去痕量杂质。
3.SP HP层析纯化
收集实施例2的样品，使用A液(20mM Na2HPO4-NaH2PO4，pH pH7.0-7.5)平衡层析系统及SP HP层析柱，B液(20mM Na2HPO4-NaH2PO4，1M NaCl,pH7.0-7.5)线性梯度洗脱,设定洗脱流速15ml/min，洗脱梯度为B％从0到100％，洗脱体积为500ml，收集洗脱下来的目的蛋白保存在4℃备用。层析图如图6所示，电泳结果如图5所示。
其中，A液的配制：取Na2HPO4.12H20 4.5g,NaH2PO4.2H20 0.5g，加I级水900ml溶解完全，调pH值至7.5，加I级水定容至1L。
B液的配制：取Na2HPO4.12H20 4.5g,NaH2PO4.2H20 0.5g，NaCl 58.5g，加I级水900ml溶解完全，调pH值至7.5，加I级水定容至1L。
4.G25层析纯化
将实施例3纯化获得的样品，使用Sephadex G-25 Medium层析柱纯化，采用C液(10mM L-组氨酸，0.9％NaCl，pH6.0)平衡层析系统及层析柱，置换缓冲液，收集流穿下来的目的蛋白保存在4℃备用。层析图如图7所示。
其中，C液的配制：取L-组氨酸0.775g溶于500ml 0.9％氯化钠注射液中,调pH值至6.0。
5.Q HP层析纯化
将实施例4纯化获得的样品，采用C液(10mM L-组氨酸，0.9％NaCl，pH6.0)平衡层析系统及Q HP层析柱，去除痕量非目标蛋白，内毒素等杂质，收集流穿下来的目的蛋白保存在4℃备用。层析图如图8所示，电泳结果如图9所示。
6.HPLC检测
使用C3(购自Agilent公司)对Vac14蛋白进行纯度检测，用0.1％TFA水溶液平衡柱子，上样10ul样品，0.1％TFA乙腈溶液洗脱，设定柱温60℃，流速0.5ml/min。洗脱程序为：10％～100％B，30min，通过曲线测出Vac14蛋白的纯度为99.2％，层析图如图10所示。
其中，0.1％TFA水溶液的配制：1L I级水加1ml TFA混匀，0.22μm滤膜过滤。
0.1％TFA乙腈溶液的配制：1L乙腈加1ml TFA混匀。
纯化后的抗原，做以下实验：
实施例5 免疫动物
1)首次免疫，用PBS稀释Vac14蛋白抗原，加入浓度为1mg/mL的Al(OH)3；用5号半型针头，双侧腹股沟、足底及背部皮下对点注射，每只BALB/C小鼠注射量为100μL，并设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组；
2)第二次免疫，第7天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量是首次免疫的1/2，免疫途径同上；
3)第三次免疫，第14天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与第二次免疫相同，免疫途径同上；
实施例6 抗体的检测
第三次免疫后第7和14天，采集BALB/C小鼠的血，用ELISA检测小鼠免疫后，IgG、IgG1、IgG2a体液应答水平。
1.制备液体
1)包被液的配制：称取NaHCO3 1.6g，Na2CO3 2.9g，溶于1L ddH2O，用pH计将pH调至9.6；
2)封闭液的配制：1g牛血清Ⅴ，溶于100mL抗体稀释液(1:100)；
3)抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1L ddH2O，再加入500μL Tween 20，再用pH计将pH调至7.4；
4)洗涤液的制备：称取2.42g Tris溶于1L ddH2O，再加入500μL Tween 20，再用pH计将pH调至7.4；
5)显色液(TMB)，为天根公司产品；
6)终止液(2M H2SO4)的制备：将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mL ddH2O中。
2.ELISA检测Vac14重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价
1)用包被液将纯化后的Vac14重组蛋白稀释为：1ug/mL、5ug/mL、10ug/mL；
2)包被：将重组蛋白稀释液加入酶标板，200μL/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用；
3)封闭：酶标板加封闭液100μL/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；
4)将血清进行1:100、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000等倍比稀释；
5)取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，,置于37℃孵育箱30min，洗涤3遍，空干；
6)将加HRP标记的羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体保存液，稀释1：5000，制成抗体工作液；
7)加入稀释抗体工作液，100μL/孔，置于37℃孵育箱1h，洗涤三遍，空干；
8)加入底物显色液(TMB)100μL/孔，室温避光反应5min；
9)加入终止液(2M H2SO4)，立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；
10)结果判断：A样品/A阴性值≧2.1为阳性(阴性对照为小鼠免疫前血清1:1000倍稀释)。
结果：检测Vac14蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1:512000；免疫后第7天的抗体阳性率达到100％，说明本发明构建的Vac14重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体。
实施例7 通过免疫小鼠确定Vac14重组蛋白免疫动物的攻毒保护
Vac14蛋白抗原末次免疫后10-14天，用生理盐水将准备PA XN-1菌液并调节浓度至1.5×1010CFU/mL，用异氟烷麻醉小鼠后采用滴鼻的方式感染，每只小鼠感染量为20μL，采用同样剂量的生理盐水(NS)作为空白对照。感染结束后每隔1天观察小鼠死亡情况，观察周期为7天，观察期结束后剩余动物以CO2吸入法安乐处死。统计各组小鼠
的存活率。结果示于表1。
表1 Vac14重组蛋白免疫小鼠后的攻毒保护效果
表1显示：阴性对照组和空白对照组的平均免疫保护率分别为25％和20％，重组融合蛋白Vac14加Al(OH)3佐剂组的平均免疫保护率为75％。因此，本发明的Vac14重组蛋白具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生免疫应答，并且能够对PA XN-1的感染起到保护作用，可以辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防铜绿假单胞菌的感染。

Claims (8)

1. 一种铜绿假单胞菌亚单位重组基因工程疫苗候选抗原Vac14的纯化方法，该抗原的核酸序列如SEQ ID NO：1所示、氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其特征在于，包括步骤：收集制备的所述抗原Vac14、按照高压破菌、离心、GST亲和纯化、SP HP层析纯化、G 25层析纯化、Q HP层析纯化的顺序组合对制备的抗原进行纯化；其中，
1）高压破菌
将收集的Vac14菌体作为目标蛋白，用pH为7.0-7.5的10mM PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；
2）GST亲和纯化
GST亲和层析填料进行初步纯化，使用A液对目标蛋白进行纯化，PrescissionProtease酶进行酶切洗脱：
3）SP HP层析纯化
经步骤2）收集的目标蛋白，用A液平衡层析系统及SP HP层析柱，B液线性梯度洗脱，其B液的组成为20mM Na2HPO4-NaH2PO4，1M NaCl ,pH7.0-7.5；
4）G 25层析纯化
将经步骤3）纯化的目标蛋白，用G25层析柱纯化， C液平衡层析系统及层析柱，分离纯化目标蛋白，置换缓冲液；
5）Q HP层析纯化
将经步骤4）纯化的标蛋白， C液平衡层析系统及Q HP层析柱，去除痕量非目标蛋白，内毒素等杂质，分离纯化目标蛋白；
其中，A液为pH值7.0-7.5的20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液，B液为pH7.0-7.5的20mMNa2HPO4-NaH2PO4，1M NaCl缓冲溶液，C液为pH6.0的10mM His，0.9%NaCl缓冲溶液。
2.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于：步骤1）所述的高压匀浆破菌采用60-80MPa，高速离心获取破菌上清。
3.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于：步骤2）所述的GST亲和层析使用的填料为Glutathione Sepharose 4B或Glutathione Sepharose 4FF或Glutathione SepharoseHP。
4.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于：步骤2）所述的Prescission Protease酶带有GST标签。
5.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于：步骤3）所述的SP HP层析柱的填料为SPSepharose HP或SP Sepharose FF或Capto SP。
6.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于：步骤4）所述的G 25层析柱的填料为Sephadex G-25 Coarse 或Sephadex G-25 Medium或Sephadex G-25 Fine或 Sephadex G-25 Superfine。
7.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于：步骤5）所述的Q HP层析柱的填料为QSepharose HP 或Q Sepharose FF或Capto Q。
8.根据权利要求1-7任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述抗原Vac14采用以下方法制备：
1）设计正向引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成获得铜绿假单胞菌亚单位重组基因工程疫苗Vac14蛋白片段的核苷酸序列；
2）将步骤1）获得的核苷酸序列克隆表达至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌；
3）诱导转换后的宿主菌表达重组蛋白。
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