CN105669844B - 一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法,所述方法包括:1)收集表达铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的菌体;2)将步骤1)收集的菌体破菌,并离心,收集上清;3)将步骤2)得到的上清通过GST亲和层析进行初纯化;4)将步骤3)处理后的重组蛋白Vac33进行Q HP层析纯化;5)将步骤4)纯化后的重组蛋白Vac33进行G25层析柱纯化;6)将步骤5)纯化后的重组蛋白Vac33进行Q HP层析纯化。本发明的纯化方法工艺简单,所获得目标蛋白纯度高,容易放大、重复性好,回收率较好。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33 (PcrV-OprI)的纯化方法。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)俗称绿脓杆菌,广泛分布于自然界、正常人皮肤、肠道、呼吸道中,感染可发生在人体任何部位和组织,常见于烧伤或创伤部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道,可引起心内膜炎、胃肠炎、脓胸甚至败血症,该菌目前已成为ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一,全身感染死亡率在20%以上。
目前在PA疫苗方面已开展了广泛研究,但普遍存在抗原类型单一、免疫保护效果低下等问题,尚无一种疫苗进入临床应用。PcrV是铜绿假单胞菌III 型分泌系统的重要组件之一,它能够形成同源多聚体,组装成分泌系统运输毒力因子和效应蛋白的“管道”,是铜绿假单胞菌III型分泌系统的关键组件 (Teiji S.等,Critical Care 2014),鉴于PcrV在铜绿假单胞菌致病中的重要作用,该蛋白已成为铜绿假单胞菌感染治疗性抗体针对的重要靶标。OprI蛋白为铜绿假单胞菌的外膜脂蛋白(outer membrane lipoprotein),其位于铜绿假单胞菌的外膜,在细菌的生理和病理过程中发挥重要的作用。发明人构建了一种既能很好去除PA这些蛋白对细胞的毒性,又能保持这些蛋白抗原性的重组双亚单位基因工程重组蛋白Vac33。目前,尚未见针对该重组双亚单位基因工程蛋白Vac33疫苗纯化方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种铜绿假单胞菌(PA)重组双亚单位基因工程蛋白 Vac33疫苗的纯化方法。
为实现上述目的,本发明提供如下的技术方案:
一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法,所述方法包括:
1)收集表达铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的菌体;
2)将步骤1)收集的菌体破菌,并离心,收集上清;
3)将步骤2)得到的上清通过GST亲和层析进行初纯化;其中,在所述亲和层析中A液洗脱使用Prescission Protease酶进行酶切;
4)将步骤3)处理后的重组蛋白Vac33进行Q HP层析纯化;其中,使用A 液平衡层析系统及Q HP层析柱,使用B液线性梯度洗脱;
5)将步骤4)纯化后的重组蛋白Vac33进行G25层析纯化;其中,采用C 液平衡G25层析系统及层析柱,分离纯化重组蛋白,置换缓冲液;
6)将步骤5)纯化后的重组蛋白Vac33进行Q HP层析纯化,加入0.1%Triton X-100混匀,采用D液平衡层析系统及Q HP层析柱,去除痕量非目标蛋白,内毒素等杂质;
其中,A液为pH7.0-7.5的20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液,B液为 pH7.0-7.5的含1MNaCl的20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液;C液为pH6.0的含 10mM L-组氨酸,0.9%NaCl的溶液;D液为pH6.0的10mM L-组氨酸,0.9%NaCl, 0.1%Triton X-100溶液。
在根据本发明的一个实施方案中,步骤2)是通过包括下述步骤的方法实现的:
将收集表达重组蛋白Vac33的大肠杆菌菌体以pH7.0-7.5的10mM的PBS 缓冲液混匀悬浮,预冷后采用高压匀浆破菌,10,000-15,000g的转速高速离心,收集上清。
在根据本发明的一个实施方案中,步骤2)中以60~80MPa的高压破菌。
在根据本发明的一个实施方案中,步骤3)中所述的GST亲和层析的层析柱的填料选自Glutathione Sepharose 4B、Glutathione Sepharose 4FF或Glutathione SepharoseHP中的一种。
在根据本发明的一个实施方案中,步骤3)中所述Prescission Protease酶带有GST标签。
在根据本发明的一个实施方案中,步骤4)所述的Q HP层析柱的填料选自QSepharose HP、Q Sepharose FF或Capto Q中的一种。
在根据本发明的一个实施方案中,步骤4)中洗脱流速为15ml/min,洗脱梯度为B液从0到100%。
在根据本发明的一个实施方案中,步骤5)所述的G 25层析柱的填料选自Sephadex G-25Coarse、Sephadex G-25Medium、Sephadex G-25Fine或Sephadex G-25Superfine中的一种。
在根据本发明的一个实施方案中,步骤6)所述的Q HP层析柱的填料选自QSepharose HP、Q Sepharose FF或Capto Q中的一种。
由于采用了上述技术方案,本发明具有如下的优点:
本发明的纯化方法工艺简单,所获得目标蛋白纯度高,容易放大、重复性好,回收率较好。
附图说明
图1为重组质粒pGex-6P-2-Vac33的双酶切鉴定结果。其中,泳道1:核酸(DNA)分子量标准(Marker),从上到下大小分别为:4500、3000、2000、1200、 800、500、200bp;泳道2:重组表达质粒pGEX-6p-2-Vac33经酶切后的鉴定结果,酶切后分离的片段约4000bp和约1000bp。
图2为GST亲和PP酶酶切及Q HP层析SDS-PAGE结果,图中,泳道M:蛋白分子量marker;泳道1:PP酶酶切后洗脱样本;泳道2:Q HP洗脱样品。
图3为Q HP层析图。
图4为G 25层析图。
图5为Q HP层析图。
图6为Q HP层析后SDS-PAGE结果,图中,泳道M:蛋白分子量marker;泳道1:Q HP流穿样品。
图7为蛋白HPLC检测结果(其中,①为杂质峰,②为目的蛋白峰,③为系统峰)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进一步详细说明。应当理解,此处说描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
除非特别指明,本申请所使用的重组蛋白Vac33由铜绿假单胞菌III型分泌系统组件蛋白(PcrV)的片段通过连接肽(Linker)与铜绿假单胞菌外膜脂蛋白 (OprI)的片段融合而成,所述重组蛋白具有以下通式:PcrV片段-(Linker)n-OprI 片段;其中,所述连接肽序列选自GGGGS、GGSGG、YAPVDV中的一个,优选为GGGGS;n为1、2、3或4。
在本发明实施例中,所使用的重组蛋白Vac33的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示;编码该重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。
表达该重组蛋白Vac33的选自大肠杆菌XL1-blue、BL21系列或HMS174系列。
菌株与各种试剂如下:
1.铜绿假单胞菌菌株
铜绿假单胞菌国际标准株PA01由美国ATCC提供(BAA-47TM);
2.试剂
质粒pGEX-6p-2、Glutathione Sepharose 4B、Sephadex G-25 Medium、QSepharose HP购自GE Healthcare Life Sciences公司,申请人保存;
大肠杆菌菌株XL-1blue购自上海超研生物科技有限公司,申请人保存;
primeSTAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、限制性内切酶BamH I和EcoR I、蛋白Marker为大连TakaRa公司产品;
质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品;
Na2HPO4.12H2O、NaH2PO4.2H2O、NaCl、NaOH、Tween-20、NaHCO3,Na2CO3购自国药集团化学试剂有限公司;
PBS、HRP标记的羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司;
Tryptone、Yeast extract均购自英国OXOID公司;
Ampicilline、0.9%氯化钠注射液购自太极集团西南药业;
IPTG、L-组氨酸、Triton X-100购自生工生物工程(上海)股份有限公司;
蛋白上样缓冲液购于碧云天生物技术;蛋白Marker购于Thermo公司;
TFA、乙腈购自TEDIA公司;Al(OH)3购自Brenntage公司;
Tris购自ANGUS公司;
硫酸、盐酸购自成都科龙化工试剂厂;
牛血清白蛋白V购自BIOSHARP公司;
异氟烷购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。
实施例1重组质粒的构建与鉴定
1.根据本发明的技术方案设计Vac33的DNA序列,在本实施例中该DNA序列为SEQID NO:1所示的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。 Vac33的DNA序列的合成和序列与pGEX-6p-2的连接由上海生工生物工程有限公司合成。
2.重组质粒的转化
从-80℃冰箱取3管大肠杆菌XL-1blue感受态细胞(上海超研生物科技有限公司),第一管加入pGEX-6P-2质粒(GE Healthcare Life Sciences),作阳性对照;第二管加入1ulVac33合成质粒;第三管不加外源DNA,作阴性对照。冰浴50min, 42℃金属浴中热击90s,迅速冰浴2min。加入600μl LB空白培养基,混匀,置于 37℃摇床中220rp振摇1h。
各管以5000rpm室温离心3min.,弃去300μl上清,再重悬菌体,取200μl涂布于,Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。
阴性对照平板没有菌落出现;阳性对照平板长满菌落,说明感受态细胞制作正确,结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落,接种于Amp抗性LB培养基中,37℃振荡培养过夜。
2.双酶切鉴定
取37℃摇床培养过夜的阳性质粒,按照说明书的步骤,通过快速质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)提取阳性克隆的质粒。使用BamHI(Takara公司)和Xhol(Takara公司)进行酶切,37℃水浴4h。体系如下:
灌制1.0%琼脂糖凝胶,其中含EB(上海俊晟生物科技有限公司)0.5ug/ml,将上述酶切反应体系中各加入1μl 6×Loading buffer,通过凝胶80V电泳20min 后,UV扫描仪观察酶切的结果。结果过发现阳性克隆的质粒被切成2个片段,大片段约4000bp为表达载体pGEX-6P-2部分,小片段约1000bp,为插入的编码 Vac33的片段(图1)。
其中,Ampicilline溶液的配制:取Ampicilline 500mg加入5ml I级水溶解完全,0.22μm无菌过滤器过滤。
Amp抗性LB固体培养基的配制:取Tryptone 1g,Yeast extract 0.5g,NaCl 1g,琼脂粉1.5g,加I级水100ml溶解完全,调pH值至7.4,高压灭菌冷却至40 ℃ 左右加入0.1mlAmpicilline溶液,依次取约10ml倒入无菌培养皿中,冷却后4 ℃ 保存。
Amp抗性LB液体培养基的配制:取Tryptone 1g,Yeast extract 0.5g,NaCl 1g加I级水100ml溶解完全,调pH值至7.4,高压灭菌冷却至40 ℃ 左右加入 0.1ml Ampicilline溶液。
实施例2重组融合蛋白PcrV-OprI在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达
取过夜培养的pGEX-6P-2-Vac33/XL-1blue菌液100μL加入10mLAmp+抗性的LB培养基中,180rpm 37℃过夜培养,分别取过夜培养的菌液400μL加入 20mLAmp+抗性的LB培养基中(余下的菌液保存在4℃冰箱中备用),37℃培养2~3h,转速200rpm,二次活化至OD600为0.8-1.0时,加入IPTG 4μL,使其终浓度为200μM,再置于摇床诱导表达30℃诱导表达3h。其中,IPTG溶液的配制:取2.38gIPTG溶于10ml I级水溶解完全,0.22μm无菌过滤器过滤。
实施例3高压破菌、离心
将表达可溶性铜绿假单胞菌重组双亚单位基因工程蛋白Vac33的大肠杆菌工程菌,通过高密度发酵,离心收集菌体备用。
菌体400g左右以PBS(10mM,pH7.0-7.5)缓冲液(取4袋PBS干粉(1L/袋)加 I级水4000ml溶解完全),按重量:体积比1:10比例混匀悬浮,4℃预冷。
高压匀浆机:使用蒸馏水冲洗高压匀浆机管道,开启低温循环系统预冷至 1-4℃备用。
将预冷的悬浮菌液加入高压匀浆机中,压力维持在60-80Mpa破菌3-5次,取破菌液涂片进行结晶紫染色,在油镜每个视野下未破碎菌小于1-2个视为破菌完全。
高速离心:破菌后的液体装入离心桶,以4℃,10,000-15,000g转速离心 15-30min,收集上清备用。
实施例4 GST亲和纯化
选择GST亲和层析填料进行初步纯化,GST亲和填料选自Glutathione Sepharose4B、Glutathione Sepharose 4FF、Glutathione Sepharose HP中的一种,破菌菌体湿重每100g填料用量为100ml。
Prescission Protease酶(PP酶)进行酶切洗脱:所使用的PP酶带有GST标签,以利于去除PP酶,获取目的蛋白700ml,紫外可见分光光度计测得浓度为 1.1mg/ml,电泳结果如图2所示。经过GST初纯,目的蛋白的纯度进一步提高,但仍含有痕量杂质。
实施例5 Q HP层析纯化
收集实施例4的样品,使用A液(20mM Na2HPO4-NaH2PO4,pH pH7.0-7.5) 平衡层析系统及Q HP层析柱,B液(20mM Na2HPO4-NaH2PO4,1M NaCl, pH7.0-7.5)线性梯度洗脱,设定洗脱流速15ml/min,洗脱梯度为B液从0到100%,洗脱体积为500ml,收集洗脱下来的目的蛋白150ml,紫外可见分光光度计测得浓度为3.1mg/ml,保存在4℃备用。层析图如图3所示,电泳结果如图2所示。
其中,A液的配制:取Na2HPO4.12H20 4.5g,NaH2PO4.2H20 0.5g,加I级水 900ml溶解完全,调pH值至7.5,加I级水定容至1L。
B液的配制:取Na2HPO4.12H20 4.5g,NaH2PO4.2H20 0.5g,NaCl 58.5g,加 I级水900ml溶解完全,调pH值至7.5,加I级水定容至1L。
实施例6 G25层析纯化
将实施例5纯化获得的样品,使用Sephadex G-25Medium层析柱纯化,采用C液(10mM L-组氨酸,0.9%NaCl,pH6.0)平衡层析系统及层析柱,置换缓冲液,收集流穿下来的目的蛋白160ml,紫外可见分光光度计测得浓度为2.8mg/ml,保存在4℃备用。层析图如图4所示。
其中,C液的配制:取L-组氨酸0.775g溶于500ml 0.9%氯化钠注射液中, 调pH值至6.0。
实施例7 Q HP层析纯化
将实施例6纯化获得的样品,加入0.1%Triton X-100混匀,采用D液(10mM L-组氨酸,0.9%NaCl,0.1%Triton X-100,pH6.0)平衡层析系统及Q HP层析柱,去除痕量非目标蛋白,内毒素等杂质,收集流穿下来的目的蛋白240ml,BCA 测得浓度为1.7mg/ml,保存在4℃备用。层析图如图5所示,电泳结果如图6 所示。
其中,D液的配制:(取L-组氨酸0.775g,0.9%氯化钠注射液500ml,Triton X-1000.5ml溶解完全,调pH值至6.0)。
实施例8 HPLC检测
使用C3(购自Agilent公司)对Vac33蛋白进行纯度检测,用0.1%TFA水溶液平衡柱子,上样10ul样品,0.1%TFA乙腈溶液洗脱,设定柱温60℃,流速 0.5ml/min。洗脱程序为:10%~100%B液,30min,通过曲线测出Vac33蛋白的纯度为98.8%,计算得到Vac33蛋白回收率为52.35% (240ml*1.7mg/ml*98.8%/700ml*1.1mg/ml),层析图如图7所示。
其中,0.1%TFA水溶液的配制:1L I级水加1ml TFA混匀,0.22μm滤膜过滤。
0.1%TFA乙腈溶液的配制:1L乙腈加1ml TFA混匀。
纯化后的抗原,做以下实验:
实施例9:免疫动物
1)首次免疫,用PBS稀释Vac33蛋白抗原,加入浓度为1mg/mL的Al(OH)3;用5号半型针头,双侧腹股沟、足底及背部皮下对点注射,每只BALB/C小鼠注射量为100μL,并设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组;
2)第二次免疫,第7天进行第二次免疫,免疫组分同上,注射量蛋白抗原量是首次免疫的1/2,免疫途径同上;
3)第三次免疫,第14天进行第三次免疫,免疫组分同上,注射量蛋白抗原量与第二次免疫相同,免疫途径同上;
实施例10:抗体的检测
第三次免疫后第7和14天,采集BALB/C小鼠的血,用ELISA检测小鼠免疫后,IgG、IgG1、IgG2a体液应答水平。
1.制备液体
1)包被液的配制:称取NaHCO31.6g,Na2CO32.9g,溶于1L ddH2O,用pH 计将pH调至9.6;
2)封闭液的配制:1g牛血清Ⅴ,溶于100mL抗体稀释液(1:100);
3)抗体稀释液的配制:将磷酸盐溶于1L ddH2O,再加入500μL Tween-20,再用pH计将pH调至7.4;
4)洗涤液的制备:称取2.42gTris溶于1L ddH2O,再加入500μL Tween-20,再用pH计将pH调至7.4;
5)显色液(TMB),为天根公司产品;
6)终止液(2M H2SO4)的制备:将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mL ddH2O 中。
2.ELISA检测Vac33重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价
1)用包被液将纯化后的Vac33重组蛋白稀释为:1ug/mL、5ug/mL、10ug/mL;
2)包被:将重组蛋白稀释液加入酶标板,200μL/孔,4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍,空干后用保鲜膜包上,置于4℃冰箱中备用;
3)封闭:酶标板加封闭液100μL/孔,置于37℃孵育箱中2小时,洗涤3 遍;
4)将血清进行1:100、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000等倍比稀释;
5)取封闭好的酶标板,依次加入稀释血清,100μL/孔,,置于37℃孵育箱 30min,洗涤3遍,空干;
6)将加HRP标记的羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体保存液,稀释1:5000,制成抗体工作液;
7)加入稀释抗体工作液,100μL/孔,置于37℃孵育箱1h,洗涤三遍,空干;
8)加入底物显色液(TMB)100μL/孔,室温避光反应5min;
9)加入终止液(2M H2SO4),立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD 值;
10)结果判断:A样品/A阴性值≧2.1为阳性(阴性对照为小鼠免疫前血清 1:1000倍稀释)。
结果:检测Vac33蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1:512000;免疫后第7天的抗体阳性率达到95%,说明本发明构建的Vac33重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体。
实施例11:通过免疫小鼠确定Vac33重组蛋白免疫动物的攻毒保护
Vac33蛋白抗原末次免疫后10~14天,用生理盐水将准备PA XN-1菌液并调节浓度至1.5×1010CFU/mL,用异氟烷麻醉小鼠后采用滴鼻的方式感染,每只小鼠感染量为20μL,采用同样剂量的生理盐水(NS)作为空白对照。感染结束后每隔1天观察小鼠死亡情况,观察周期为7天,观察期结束后剩余动物以CO2吸入法安乐处死。统计各组小鼠的存活率。结果示于表1。
表1 Vac33重组蛋白免疫小鼠后的攻毒保护效果
表1显示:阴性对照组和空白对照组的平均免疫保护率分别为15%和20%,重组融合蛋白Vac33加Al(OH)3佐剂组的平均免疫保护率为75%。因此,本发明的Vac33重组蛋白具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生免疫应答,并且能够对PA XN-1的感染起到保护作用,可以辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防铜绿假单胞菌的感染。
尽管本发明已进行了一定程度的描述,明显地,在不脱离本发明的精神和范围的条件下,可进行各个条件的适当变化。可以理解,本发明不限于所述实施方案,而归于权利要求的范围,其包括所述每个因素的等同替换。
Claims (9)
1.一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法,其特征在于,该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述方法包括:
1)收集表达铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的菌体;
2)将步骤1)收集的菌体破菌,并离心,收集上清;
3)将步骤2)得到的上清通过GST亲和层析进行初纯化;其中,在所述亲和层析中A液进行洗脱,使用Prescission Protease酶进行酶切;
4)将步骤3)处理后的重组蛋白Vac33进行Q HP层析纯化;其中,使用A液平衡层析系统及Q HP层析柱,使用B液线性梯度洗脱;
5)将步骤4)纯化后的重组蛋白Vac33进行G25层析柱纯化;其中,采用C液平衡G25层析系统及层析柱,分离纯化重组蛋白,置换缓冲液;
6)将步骤5)纯化后的重组蛋白Vac33进行Q HP层析纯化,加入0.1%Triton X-100混匀,采用D液平衡层析系统及Q HP层析柱,去除杂质;
其中,A液为pH7.0-7.5的20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液,B液为pH7.0-7.5的含1M NaCl的20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液;C液为pH6.0的含10mM L-组氨酸,0.9%NaCl的溶液;D液为pH6.0的10mM L-组氨酸,0.9%NaCl,0.1%Triton X-100溶液。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2)是通过包括下述步骤的方法实现的:
将收集表达重组蛋白Vac33的大肠杆菌菌体以pH7.0-7.5的10mM的PBS缓冲液混匀悬浮,预冷后采用高压匀浆破菌,4℃,以10,000~15,000g的转速高速离心,收集上清。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于,步骤2)中以60~80MPa的高压破菌。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3)中所述的GST亲和层析的层析柱的填料选自Glutathione Sepharose4B、Glutathione Sepharose4FF或Glutathione SepharoseHP中的一种。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3)中所述Prescission Protease酶带有GST标签。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤4)所述的Q HP层析柱的填料选自QSepharose HP、QSepharose FF或CaptoQ中的一种。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤4)中洗脱流速为15ml/min,洗脱梯度为B液从0到100%。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤5)所述的G25层析柱的填料选自Sephadex G-25 Coarse或Sephadex G-25 Medium、Sephadex G-25 Fine或Sephadex G-25Superfine中的一种。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤6)所述的Q HP层析柱的填料选自QSepharose HP、Q Sepharose FF或Capto Q中的一种。
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