CN105669844A - 一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法，所述方法包括：1)收集表达铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的菌体；2)将步骤1)收集的菌体破菌，并离心，收集上清；3)将步骤2)得到的上清通过GST亲和层析进行初纯化；4)将步骤3)处理后的重组蛋白Vac33进行Q？HP层析纯化；5)将步骤4)纯化后的重组蛋白Vac33进行G25层析柱纯化；6)将步骤5)纯化后的重组蛋白Vac33进行Q？HP层析纯化。本发明的纯化方法工艺简单，所获得目标蛋白纯度高，容易放大、重复性好，回收率较好。

Description

一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33(PcrV-OprI)的纯化方法。

背景技术

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)俗称绿脓杆菌，广泛分布于自然界、正常人皮肤、肠道、呼吸道中，感染可发生在人体任何部位和组织，常见于烧伤或创伤部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道，可引起心内膜炎、胃肠炎、脓胸甚至败血症，该菌目前已成为ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一，全身感染死亡率在20％以上。

目前在PA疫苗方面已开展了广泛研究，但普遍存在抗原类型单一、免疫保护效果低下等问题，尚无一种疫苗进入临床应用。PcrV是铜绿假单胞菌III型分泌系统的重要组件之一，它能够形成同源多聚体，组装成分泌系统运输毒力因子和效应蛋白的“管道”，是铜绿假单胞菌III型分泌系统的关键组件(TeijiS.等，CriticalCare2014)，鉴于PcrV在铜绿假单胞菌致病中的重要作用，该蛋白已成为铜绿假单胞菌感染治疗性抗体针对的重要靶标。OprI蛋白为铜绿假单胞菌的外膜脂蛋白(outermembranelipoprotein)，其位于铜绿假单胞菌的外膜，在细菌的生理和病理过程中发挥重要的作用。发明人构建了一种既能很好去除PA这些蛋白对细胞的毒性，又能保持这些蛋白抗原性的重组双亚单位基因工程重组蛋白Vac33。目前，尚未见针对该重组双亚单位基因工程蛋白Vac33疫苗纯化方法的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种铜绿假单胞菌(PA)重组双亚单位基因工程蛋白Vac33疫苗的纯化方法。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法，所述方法包括：

1)收集表达铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的菌体；

2)将步骤1)收集的菌体破菌，并离心，收集上清；

3)将步骤2)得到的上清通过GST亲和层析进行初纯化；其中，在所述亲和层析中A液洗脱使用PrescissionProtease酶进行酶切；

4)将步骤3)处理后的重组蛋白Vac33进行QHP层析纯化；其中，使用A液平衡层析系统及QHP层析柱，使用B液线性梯度洗脱；

5)将步骤4)纯化后的重组蛋白Vac33进行G25层析纯化；其中，采用C液平衡G25层析系统及层析柱，分离纯化重组蛋白，置换缓冲液；

6)将步骤5)纯化后的重组蛋白Vac33进行QHP层析纯化，加入0.1％TritonX-100混匀，采用D液平衡层析系统及QHP层析柱，去除痕量非目标蛋白，内毒素等杂质；

其中，A液为pH7.0-7.5的20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，B液为pH7.0-7.5的含1MNaCl的20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液；C液为pH6.0的含10mML-组氨酸，0.9％NaCl的溶液；D液为pH6.0的10mML-组氨酸，0.9％NaCl，0.1％TritonX-100溶液。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤2)是通过包括下述步骤的方法实现的：

将收集表达重组蛋白Vac33的大肠杆菌菌体以pH7.0-7.5的10mM的PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，10,000-15,000g的转速高速离心，收集上清。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤2)中以60～80MPa的高压破菌。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤3)中所述的GST亲和层析的层析柱的填料选自GlutathioneSepharose4B、GlutathioneSepharose4FF或GlutathioneSepharoseHP中的一种。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤3)中所述PrescissionProtease酶带有GST标签。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤4)所述的QHP层析柱的填料选自QSepharoseHP、QSepharoseFF或CaptoQ中的一种。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤4)中洗脱流速为15ml/min，洗脱梯度为B液从0到100％。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤5)所述的G25层析柱的填料选自SephadexG-25Coarse、SephadexG-25Medium、SephadexG-25Fine或SephadexG-25Superfine中的一种。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤6)所述的QHP层析柱的填料选自QSepharoseHP、QSepharoseFF或CaptoQ中的一种。

由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：

本发明的纯化方法工艺简单，所获得目标蛋白纯度高，容易放大、重复性好，回收率较好。

附图说明

图1为重组质粒pGex-6P-2-Vac33的双酶切鉴定结果。其中，泳道1：核酸(DNA)分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：4500、3000、2000、1200、800、500、200bp；泳道2：重组表达质粒pGEX-6p-2-Vac33经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段约4000bp和约1000bp。

图2为GST亲和PP酶酶切及QHP层析SDS-PAGE结果，图中，泳道M：蛋白分子量marker；泳道1：PP酶酶切后洗脱样本；泳道2：QHP洗脱样品。

图3为QHP层析图。

图4为G25层析图。

图5为QHP层析图。

图6为QHP层析后SDS-PAGE结果，图中，泳道M：蛋白分子量marker；泳道1：QHP流穿样品。

图7为蛋白HPLC检测结果(其中，①为杂质峰，②为目的蛋白峰，③为系统峰)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处说描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

除非特别指明，本申请所使用的重组蛋白Vac33由铜绿假单胞菌III型分泌系统组件蛋白(PcrV)的片段通过连接肽(Linker)与铜绿假单胞菌外膜脂蛋白(OprI)的片段融合而成，所述重组蛋白具有以下通式：PcrV片段-(Linker)_n-OprI片段；其中，所述连接肽序列选自GGGGS、GGSGG、YAPVDV中的一个，优选为GGGGS；n为1、2、3或4。

在本发明实施例中，所使用的重组蛋白Vac33的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；编码该重组蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO：1所示。

表达该重组蛋白Vac33的选自大肠杆菌XL1-blue、BL21系列或HMS174系列。

建议补充本发明所使用的各缓冲液、洗脱液的配制方法，以保证充分公开。

菌株与各种试剂如下：

1.铜绿假单胞菌菌株

铜绿假单胞菌国际标准株PA01由美国ATCC提供(BAA-47^TM)；

2.试剂

质粒pGEX-6p-2、GlutathioneSepharose4B、SephadexG-25Medium、QSepharoseHP购自GEHealthcareLifeSciences公司，申请人保存；

大肠杆菌菌株XL-1blue购自上海超研生物科技有限公司，申请人保存；

primeSTARHSDNAPolymerase、DNAMarker、限制性内切酶BamHI和EcoRI、蛋白Marker为大连TakaRa公司产品；

质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；

Na₂HPO₄.12H₂O、NaH₂PO₄.2H₂O、NaCl、NaOH、Tween-20、NaHCO₃，Na₂CO₃购自国药集团化学试剂有限公司；

PBS、HRP标记的羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；

Tryptone、Yeastextract均购自英国OXOID公司；

Ampicilline、0.9％氯化钠注射液购自太极集团西南药业；

IPTG、L-组氨酸、TritonX-100购自生工生物工程(上海)股份有限公司；

蛋白上样缓冲液购于碧云天生物技术；蛋白Marker购于Thermo公司；

TFA、乙腈购自TEDIA公司；Al(OH)₃购自Brenntage公司；

Tris购自ANGUS公司；

硫酸、盐酸购自成都科龙化工试剂厂；

牛血清白蛋白V购自BIOSHARP公司；

异氟烷购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

实施例1重组质粒的构建与鉴定

1.根据本发明的技术方案设计Vac33的DNA序列，在本实施例中该DNA序列为SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO：2。Vac33的DNA序列的合成和序列与pGEX-6p-2的连接由上海生工生物工程有限公司合成。

2.重组质粒的转化

从-80℃冰箱取3管大肠杆菌XL-1blue感受态细胞(上海超研生物科技有限公司)，第一管加入pGEX-6P-2质粒(GEHealthcareLifeSciences)，作阳性对照；第二管加入1ulVac33合成质粒；第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴50min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴2min。加入600μlLB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中220rp振摇1h。

各管以5000rpm室温离心3min.，弃去300μl上清，再重悬菌体，取200μl涂布于，Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。

阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确，结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜。

2.双酶切鉴定

取37℃摇床培养过夜的阳性质粒，按照说明书的步骤，通过快速质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)提取阳性克隆的质粒。使用BamHI(Takara公司)和Xhol(Takara公司)进行酶切，37℃水浴4h。体系如下：

灌制1.0％琼脂糖凝胶，其中含EB(上海俊晟生物科技有限公司)0.5ug/ml，将上述酶切反应体系中各加入1μl6×Loadingbuffer，通过凝胶80V电泳20min后，UV扫描仪观察酶切的结果。结果过发现阳性克隆的质粒被切成2个片段，大片段约4000bp为表达载体pGEX-6P-2部分，小片段约1000bp，为插入的编码Vac33的片段(图1)。

其中，Ampicilline溶液的配制：取Ampicilline500mg加入5mlI级水溶解完全，0.22μm无菌过滤器过滤。

Amp抗性LB固体培养基的配制：取Tryptone1g，Yeastextract0.5g，NaCl1g，琼脂粉1.5g，加I级水100ml溶解完全，调pH值至7.4，高压灭菌冷却至40℃左右加入0.1mlAmpicilline溶液，依次取约10ml倒入无菌培养皿中，冷却后4℃保存。

Amp抗性LB液体培养基的配制：取Tryptone1g，Yeastextract0.5g，NaCl1g加I级水100ml溶解完全，调pH值至7.4，高压灭菌冷却至40℃左右加A0.1mlAmpicilline溶液。

实施例2重组融合蛋白PcrV-OprI在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达

取过夜培养的pGEX-6P-2-Vac33/XL-1blue菌液100μL加入10mLAmp+抗性的LB培养基中，180rpm37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液400μL加入20mLAmp+抗性的LB培养基中(余下的菌液保存在4℃冰箱中备用)，37℃培养2～3h，转速200rpm，二次活化至OD600为0.8-1.0时，加入IPTG4μL，使其终浓度为200μM，再置于摇床诱导表达30℃诱导表达3h。其中，IPTG溶液的配制：取2.38gIPTG溶于10mlI级水溶解完全，0.22μm无菌过滤器过滤。

实施例3高压破菌、离心

将表达可溶性铜绿假单胞菌重组双亚单位基因工程蛋白Vac33的大肠杆菌工程菌，通过高密度发酵，离心收集菌体备用。

菌体400g左右以PBS(10mM，pH7.0-7.5)缓冲液(取4袋PBS干粉(1L/袋)加I级水4000ml溶解完全)，按重量：体积比1∶10比例混匀悬浮，4℃预冷。

高压匀浆机：使用蒸馏水冲洗高压匀浆机管道，开启低温循环系统预冷至1-4℃备用。

将预冷的悬浮菌液加入高压匀浆机中，压力维持在60-80Mpa破菌3-5次，取破菌液涂片进行结晶紫染色，在油镜每个视野下未破碎菌小于1-2个视为破菌完全。

高速离心：破菌后的液体装入离心桶，以4℃，10,000-15,000g转速离心15-30min，收集上清备用。

实施例4GST亲和纯化

选择GST亲和层析填料进行初步纯化，GST亲和填料选自GlutathioneSepharose4B、GlutathioneSepharose4FF、GlutathioneSepharoseHP中的一种，破菌菌体湿重每100g填料用量为100ml。

PrescissionProtease酶(PP酶)进行酶切洗脱：所使用的PP酶带有GST标签，以利于去除PP酶，获取目的蛋白700ml，紫外可见分光光度计测得浓度为1.1mg/ml，电泳结果如图2所示。经过GST初纯，目的蛋白的纯度进一步提高，但仍含有痕量杂质。

实施例5QHP层析纯化

收集实施例4的样品，使用A液(20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄，pHpH7.0-7.5)平衡层析系统及QHP层析柱，B液(20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄，1MNaCl，pH7.0-7.5)线性梯度洗脱，设定洗脱流速15ml/min，洗脱梯度为B液从0到100％，洗脱体积为500ml，收集洗脱下来的目的蛋白150ml，紫外可见分光光度计测得浓度为3.1mg/ml，保存在4℃备用。层析图如图3所示，电泳结果如图2所示。

其中，A液的配制：取Na₂HPO₄.12H₂O4.5g，NaH₂PO₄.2H₂O0.5g，加I级水900ml溶解完全，调pH值至7.5，加I级水定容至1L。

B液的配制：取Na₂HPO₄.12H₂O4.5g，NaH₂PO₄.2H₂O0.5g，NaCl58.5g，加I级水900ml溶解完全，调pH值至7.5，加I级水定容至1L。

实施例6G25层析纯化

将实施例5纯化获得的样品，使用SephadexG-25Medium层析柱纯化，采用C液(10mML-组氨酸，0.9％NaCl，pH6.0)平衡层析系统及层析柱，置换缓冲液，收集流穿下来的目的蛋白160ml，紫外可见分光光度计测得浓度为2.8mg/ml，保存在4℃备用。层析图如图4所示。

其中，C液的配制：取L-组氨酸0.775g溶于500ml0.9％氯化钠注射液中，调pH值至6.0。

实施例7QHP层析纯化

将实施例6纯化获得的样品，加入0.1％TritonX-100混匀，采用D液(10mML-组氨酸，0.9％NaCl，0.1％TritonX-100，pH6.0)平衡层析系统及QHP层析柱，去除痕量非目标蛋白，内毒素等杂质，收集流穿下来的目的蛋白240ml，BCA测得浓度为1.7mg/ml，保存在4℃备用。层析图如图5所示，电泳结果如图6所示。

其中，D液的配制：(取L-组氨酸0.775g，0.9％氯化钠注射液500ml，TritonX-1000.5ml溶解完全，调pH值至6.0)。

实施例8HPLC检测

使用C3(购自Agilent公司)对Vac33蛋白进行纯度检测，用0.1％TFA水溶液平衡柱子，上样10ul样品，0.1％TFA乙腈溶液洗脱，设定柱温60℃，流速0.5ml/min。洗脱程序为：10％～100％B液，30min，通过曲线测出Vac33蛋白的纯度为98.8％，计算得到Vac33蛋白回收率为52.35％(240ml*1.7mg/ml*98.8％/700ml*1.1mg/ml)，层析图如图7所示。

其中，0.1％TFA水溶液的配制：1LI级水加1mlTFA混匀，0.22μm滤膜过滤。

0.1％TFA乙腈溶液的配制：1L乙腈加1mlTFA混匀。

纯化后的抗原，做以下实验：

实施例9：免疫动物

1)首次免疫，用PBS稀释Vac33蛋白抗原，加入浓度为1mg/mL的Al(OH)₃；用5号半型针头，双侧腹股沟、足底及背部皮下对点注射，每只BALB/C小鼠注射量为100μL，并设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组；

2)第二次免疫，第7天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量是首次免疫的1/2，免疫途径同上；

3)第三次免疫，第14天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与第二次免疫相同，免疫途径同上；

实施例10：抗体的检测

第三次免疫后第7和14天，采集BALB/C小鼠的血，用ELISA检测小鼠免疫后，IgG、IgG1、IgG2a体液应答水平。

1.制备液体

1)包被液的配制：称取NaHCO₃1.6g，Na₂CO₃2.9g，溶于1LddH₂O，用pH计将pH调至9.6；

2)封闭液的配制：1g牛血清V，溶于100mL抗体稀释液(1∶100)；

3)抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1LddH₂O，再加入500μLTween-20，再用pH计将pH调至7.4；

4)洗涤液的制备：称取2.42gTris溶于1LddH₂O，再加入500μLTween-20，再用pH计将pH调至7.4；

5)显色液(TMB)，为天根公司产品；

6)终止液(2MH₂SO₄)的制备：将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mLddH₂O中。

2.ELISA检测Vac33重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价

1)用包被液将纯化后的Vac33重组蛋白稀释为：1ug/mL、5ug/mL、10ug/mL；

2)包被：将重组蛋白稀释液加入酶标板，200μL/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用；

3)封闭：酶标板加封闭液100μL/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；

4)将血清进行1∶100、1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000等倍比稀释；

5)取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，，置于37℃孵育箱30min，洗涤3遍，空干；

6)将加HRP标记的羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体保存液，稀释1∶5000，制成抗体工作液；

7)加入稀释抗体工作液，100μL/孔，置于37℃孵育箱1h，洗涤三遍，空干；

8)加入底物显色液(TMB)100μL/孔，室温避光反应5min；

9)加入终止液(2MH₂SO₄)，立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；

10)结果判断：A样品/A阴性值≥2.1为阳性(阴性对照为小鼠免疫前血清1∶1000倍稀释)。

结果：检测Vac33蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1∶512000；免疫后第7天的抗体阳性率达到95％，说明本发明构建的Vac33重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体。

实施例11：通过免疫小鼠确定Vac33重组蛋白免疫动物的攻毒保护

Vac33蛋白抗原末次免疫后10～14天，用生理盐水将准备PAXN-1菌液并调节浓度至1.5×10¹⁰CFU/mL，用异氟烷麻醉小鼠后采用滴鼻的方式感染，每只小鼠感染量为20μL，采用同样剂量的生理盐水(NS)作为空白对照。感染结束后每隔1天观察小鼠死亡情况，观察周期为7天，观察期结束后剩余动物以CO₂吸入法安乐处死。统计各组小鼠的存活率。结果示于表1。

表1Vac33重组蛋白免疫小鼠后的攻毒保护效果

表1显示：阴性对照组和空白对照组的平均免疫保护率分别为15％和20％，重组融合蛋白Vac33加Al(OH)₃佐剂组的平均免疫保护率为75％。因此，本发明的Vac33重组蛋白具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生免疫应答，并且能够对PAXN-1的感染起到保护作用，可以辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防铜绿假单胞菌的感染。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (9)

1.一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的纯化方法，其特征在于，所述方法包括：

1)收集表达铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33的菌体；

2)将步骤1)收集的菌体破菌，并离心，收集上清；

3)将步骤2)得到的上清通过GST亲和层析进行初纯化；其中，在所述亲和层析中A液洗脱使用PrescissionProtease酶进行酶切；

4)将步骤3)处理后的重组蛋白Vac33进行QHP层析纯化；其中，使用A液平衡层析系统及QHP层析柱，使用B液线性梯度洗脱；

5)将步骤4)纯化后的重组蛋白Vac33进行G25层析柱纯化；其中，采用C液平衡G25层析系统及层析柱，分离纯化重组蛋白，置换缓冲液；

6)将步骤5)纯化后的重组蛋白Vac33进行QHP层析纯化，加入0.1％TritonX-100混匀，采用D液平衡层析系统及QHP层析柱，去除杂质；

其中，A液为pH7.0-7.5的20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，B液为pH7.0-7.5的含1MNaCl的20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液；C液为pH6.0的含10mML-组氨酸，0.9％NaCl的溶液；D液为pH6.0的10mML-组氨酸，0.9％NaCl，0.1％TritonX-100溶液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)是通过包括下述步骤的方法实现的：

将收集表达重组蛋白Vac33的大肠杆菌菌体以pH7.0-7.5的10mM的PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，4℃，以10,000～15,000g的转速高速离心，收集上清。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)中以60～80MPa的高压破菌。

4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的GST亲和层析的层析柱的填料选自GlutathioneSepharose4B、GlutathioneSepharose4FF或GlutathioneSepharoseHP中的一种。

5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述PrescissionProtease酶带有GST标签。

6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的QHP层析柱的填料选自QSepharoseHP、QSepharoseFF或CaptoQ中的一种。

7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中洗脱流速为15ml/min，洗脱梯度为B液从0到100％。

8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤5)所述的G25层析柱的填料选自SephadexG-25Coarse或SephadexG-25Medium、SephadexG-25Fine或SephadexG-25Superfine中的一种。

9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤6)所述的QHP层析柱的填料选自QSepharoseHP、QSepharoseFF或CaptoQ中的一种。