CN101747416B - 拟态弧菌OmpU蛋白B细胞抗原多表位串联肽及其构建方法与用途 - Google Patents
拟态弧菌OmpU蛋白B细胞抗原多表位串联肽及其构建方法与用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分子免疫学领域，具体涉及一种能诱导鱼体产生抗拟态弧菌感染的保护性免疫反应的OmpU抗原B细胞多表位串联肽及其构建方法与用途。本发明中OmpU抗原B细胞多表位串联肽的氨基酸序列如SEQIDNO：10所示。本发明提供的是通过基因工程技术生产的拟态弧菌OmpU蛋白B细胞多表位串联肽，经免疫印迹分析、特异性抗体检测和免疫动物保护性实验验证，表明其能激发高效而特异的抗拟态弧菌感染的保护性体液免疫应答，由于本发明获得的此B细胞多表位串联肽可用于水产动物腹水病的免疫诊断和免疫防治，因此其具有较高的社会效益和经济效益。
Description
技术领域
本发明属于分子免疫学领域，具体涉及一种能诱导鱼体产生抗拟态弧菌感染的保护性免疫反应的OmpU抗原B细胞多表位串联肽及其构建方法与用途。
背景技术
拟态弧菌(Vibrio mimicus)是一种人和水产动物共患病病原菌，不仅可引起水产动物严重的腹水病，而且可通过水体和水产品感染人类，引起人类腹泻和食物中毒。据不完全统计，近年来鱼类腹水病的平均病死率达30％-40％，且有上升趋势，已成为水产养殖业持续发展的瓶颈。因此，建立该病快速诊断方法和研制新型高效的拟态弧菌疫苗显得十分必要，而寻找出理想的拟态弧菌保护性抗原或抗原表位则是解决问题的关键。
抗原表位是抗原分子中诱导特异性免疫应答最基本的结构和功能单位。以多个表位为基础而设计的多表位疫苗是一种新型、高效分子疫苗，除具有安全、无毒、特异性强和易于大规模生产等优点外，可将同种病原体的多个表位或不同病原体的多种表位连在同一载体上，以有效应付微生物变异和预防多种病原体的混合感染，也可非常针对性地开发疫苗，排除非相关免疫应答的产生，从而大大地降低副作用，还可以连接内在佐剂，大大提高免疫效果。制备多表位疫苗的关键技术是如何准确筛选和鉴定抗原表位。传统的表位筛选鉴定方法包括化学法、合成重叠肽法、酶解法及噬菌体展示技术等。这些方法虽然准确率较高，但是存在耗时费力、成本较高的缺点。近些年来，随着计算机辅助分子设计技术的发展和基因组测序工作的不断展开，国内外建立了大量蛋白质表位数据库，开发了大量表位分析软件，但预测的准确率在70％左右，仍需通过生物学实验加以验证。
同大多数病原菌一样，拟态弧菌的致病性是由黏附素、毒素和毒性酶类等多种毒力因子共同作用的结果，其中外膜蛋白U(Outer membraneprotein U，OmpU)是一种高度保守的黏附素蛋白。研究发现OmpU不仅可介导细菌黏附细胞，启动感染外，还能诱导机体产生抗体，阻断细菌黏附，在病原菌入侵最初阶段发挥免疫保护效应，是一种良好的疫苗候选抗原和诊断抗原。研究拟态弧菌OmpU抗原B细胞抗原表位对疾病的诊断和设计多表位疫苗具有重要意义。
发明内容
本发明首先提供了一种能诱导鱼体产生保护性免疫反应的OmpU蛋白B细胞多表位串联肽，所述的多表位串联肽的氨基酸序列如SEQIDNO：10所示。
本发明同时提供了OmpU蛋白B细胞多表位串联肽的构建方法，其包括以下步骤：
(1)设计编码OmpU蛋白B细胞多表位串联肽的多表位串联基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：9所示，也即SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6和SEQIDNO：7所示核苷酸序列，并以SEQIDNO：8所示的核苷酸序列相连接，在所述的多表位串联基因序列两端分别添加EcoR I酶切位点和Pst I酶切位点以及终止密码子TAA，全基因合成；
(2)构建重组表达OmpU蛋白B细胞多表位串联肽的重组表达菌，并进行表达、鉴定和纯化重组蛋白。
本发明还提供了上述多表位串联肽在拟态弧菌新型表位肽疫苗研制中的应用，具体包括如下方面：
(1)多表位串联肽疫苗的配制
(2)多表位肽疫苗的免疫及特异性抗体检测
(3)多表位肽疫苗的免疫保护性检测
(4)多表位肽疫苗的安全性检测
本发明提供的是通过基因工程技术生产的拟态弧菌OmpU蛋白B细胞多表位串联肽，经免疫印迹分析、特异性抗体检测和免疫动物保护性实验验证，表明其能激发高效而特异的抗拟态弧菌感染的保护性体液免疫应答。
本发明快速、准确、经济地获得了具有免疫保护性的拟态弧菌OmpU蛋白B细胞多表位串联肽，获得的此B细胞多表位串联肽可用于水产动物腹水病的免疫诊断和免疫防治。
附图说明
图1拟态弧菌OmpU蛋白B细胞多表位串联肽基因的PCR扩增
图2重组表达质粒pAML-c4x-OmpUepis的双酶切鉴定
图3拟态弧菌OmpU蛋白B细胞多表位串联肽基因的测序图
图4重组表达质粒表达产物的SDS-PAGE鉴定
图5表达产物的Western-Blot鉴定
图6重组多表位蛋白OmpUepis的纯化结果
图7免疫鱼血清中特异性抗体水平的检测
图8表达质粒pAML-c4x图谱
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
实施例1 拟态弧菌OmpU蛋白B细胞抗原表位的筛选与多表位串联肽的设计
一、材料
拟态弧菌安徽分离株OmpU基因的氨基酸序列；表位分析软件(DNAStar软件)。
二、方法与结果
1、拟态弧菌OmpU蛋白B细胞抗原表位的筛选
应用DNAStar软件，联合采用多种不同方法综合分析拟态弧菌外膜蛋白OmpU的二级结构、柔性区域、亲水性、表面可能性和抗原指数，筛选其B细胞表位。选取OmpU蛋白结构中亲水性指数≥0、表面可能性指数≥1和抗原指数≥1的区域，进一步排除二级结构位于α螺旋和β折叠区域内不易形成表位的区段，剩下的区段定为OmpU蛋白B细胞表位。
试验结果：共筛选出7个B细胞表位，各表位的氨基酸位置、氨基酸序列和平均抗原指数见表1。
表1 拟态弧菌OmpU的B细胞表位
| 表位Epitope | 氨基酸位置Amino location | 氨基酸序列amino acid sequence | 平均AIAverage AI |
| epitope1 | 183-198 | TENTVTDKYEDNGKDG | 2.13 |
| epitope2 | 275-287 | TYNNAETNDETSA | 1.49 |
| epitope3 | 56-66 | KDGKAEDKSRV | 1.21 |
| epitope4 | 253-258 | NGDYTG | 1.09 |
| epitope5 | 93-111 | ADSTATKTDNGSDLDNRYT | 1.87 |
| epitope6 | 123-129 | TYGKNDG | 2.37 |
| epitope7 | 24-31 | INQSGDKA | 2.14 |
2、拟态弧菌OmpU蛋白B细胞多表位串联肽的设计
7个B细胞表位按epitope1(SEQIDNO：1)-epitope2(SEQIDNO：2)-epitope3(SEQIDNO：3)-epitope4(SEQIDNO：4)-epitope5(SEQIDNO：5)-epitope6(SEQIDNO：6)-epitope7(SEQIDNO：7)顺序串联，以丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸(AAY，SEQIDNO：8)连接序列连接，形成OmpU蛋白B细胞多表位串联肽，其氨基酸序列如SEQIDNO：10所示：
TENTVTDKYEDNGKDGAAYTYNNAETNDETSAAAYKDGKAEDKSRVAAYNGDYTGAAYADSTATKTDNGSDLDNRYTAAYTYGKNDGAAYINQSGDKA(AAY为连接接头)
实施例2 拟态弧菌OmpU蛋白B细胞多表位串联肽的构建方法
一、材料
1、质粒、工程菌和试剂、
表达质粒pAML-c4x、大肠杆菌E.coli TB1株、Amylose层析柱和兔抗MBP血清购自NEB生物有限公司。
核酸限制性内切酶(PstI、EcoRI)、Taq DNA聚合酶和T4DNA连接酶购自大连TaKaRa生物技术工程有限公司
HRP标记羊抗兔IgG(HRP-IgG)、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、低分子量标准蛋白、Marker DL2000和Marker DL15000为美国MBI公司产品
DNA凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自杭州维特洁生物技术有限公司
琼脂糖、溴化乙锭、氨苄青霉素、考马斯亮蓝R250和异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)购自华美生物工程公司
N-十二烷基肌氨酸钠、乙二胺四乙酸、N，N，N`，N`-四甲基乙二胺、甘氨酸、溴酚蓝、丙烯酰胺和N，N`-亚甲基双丙烯酰胺：中国医药上海化学试剂公司
2.主要仪器
Hema 4800基因扩增仪及Hema凝胶成像系统：珠海海马医学仪器有限公司
超纯水发生器：美国Millipore公司
DYY-6B型稳压稳流电泳仪、DYY-III型水平电泳槽和DYY-28A夹心式垂直电泳槽：北京六一仪器厂
恒温振荡培养箱：上海荣华实验仪器厂
5412R微量冷冻离心机：德国eppendorf公司
TGL-16G高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂
JY92-II超声波细胞破碎机：宁波新芝科器研究所
紫外分光光度计：日本岛津公司
二、方法与结果
1.拟态弧菌OmpU蛋白B细胞多表位串联肽重组表达菌的构建
1.1编码OmpU蛋白B细胞多表位串联肽的基因合成
设计编码重组OmpU抗原B细胞多表位串联肽的基因，名称为OmpUepis，如SEQIDNO：9所示。即将SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6和SEQIDNO：7的核苷酸序列，并以SEQIDNO：8所示的核苷酸序列相连接。在OmpUepis基因序列两端分别添加EcoR I和Pst I酶切位点以及终止密码子TAA(共315bp)，全基因委托上海生工生物工程技术有限公司合成并克隆入pUC57载体构建成pUC57-OmpUepis。
重组OmpU的B细胞多表位串联肽的全基因序列如SEQIDNO：9所示：
acagaaaacacagtgactgataaatacgaagacaatggtaaagacggcgccgcctacacttacaacaacgcagaaactaacgacgaaacttcagcagccgcctacaaagatggcaaagctgaagataaatctcgcgtagccgcctacaacggtgattacactggtgccgcctacgcagattctacggcgacaaaaacagacaacggttctgatttagataaccgttacaccgccgcctacacttacggtaaaaacgatggtgccgcctacatcaaccaaagcggtgacaaagca(下划线部分为AAY接头的核苷酸序列)。
重组OmpU抗原B细胞多表位串联肽的氨基酸序列如SEQIDNO：10所示：
TENTVTDKYEDNGKDGAAYTYNNAETNDETSAAAYKDGKAEDKSRVAAYNGDYTGAAYADSTATKTDNGSDLDNRYTAAYTYGKNDGAAYINQSGDKA(AAY为连接接头)
1.2PCR引物设计与扩增
根据OmpUepis全基因序列，应用PrimerPremier5.0软件，设计合成一对特异性引物(P1：5’-GACGAATTCACAGAAAACAC-3’；P2：5’-GTCCTGCAGTTATGCTTTGTCACCG-3’)，并在引物P 1的5’端加上EcoRI(GAATTC)限制性内切酶序列和保护性碱基，在引物P2的5’端加上PstI(CTGCAG)限制性内切酶序列和保护性碱基。引物交由上海生工生物工程技术有限公司合成。
在Eppendorf管中分别加入以下组分(μl)
Primer 1(p125μmol/L) 1.0
Primer 2(p225μmol/L) 1.0
pUC57-OmpUepis重组质粒 1.0
dNTP Mix 1.0
10×PCR buffer(含Mg2+) 5.0
Taq酶 0.5
ddH2O 40.5
Total 50μl
轻弹混匀，瞬时离心，置于PCR仪内，设置反应条件为：
1× 95℃预变性2min
20× 94℃变性15s
55℃退火15s
72℃延伸20s
1× 72℃后延伸5min
PCR反应结束后，取5μl产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，紫外灯下观察结果。
实验结果见图1(泳道1：OmpU B细胞多表位串联肽基因的PCR产物；泳道2：DNA分子量Marker)，PCR扩增到预期大小为315bp的特异性DNA条带。
1.3PCR产物纯化
采用DNA凝胶回收试剂盒进行纯化。主要过程为：切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶放入Eppendorf管中，加入3-4倍凝胶体积的DE-A缓冲液，于75℃水浴至凝胶完全融化，按体积的50％加入Buffer DE-B缓冲液混合均匀，3，660rpm离心1min，弃滤液，加500μL W1缓冲液，3,660rpm离心1min，弃滤液，加入700μL含无水乙醇的W2缓冲液，3,660rpm离心1min，以同样方法用W2缓冲液洗涤一次，14,600rpm离心1min，将DNA-prep Tube置于另一洁净1.5mL离心管中，在silica膜中央加入25-30μL去离子水，室温静置1min，14,600rpm离心1min洗脱DNA。
1.4目的基因和表达质粒的双酶切与回收纯化
纯化PCR产物和表达质粒pAML-c4x分别用EcoR I和Pst I双酶切，酶切后用DNA凝胶回收试剂盒纯化酶切产物，方法同前。
1.5目的基因和表达质粒的连接
OmpUepis和pAML-c4x连接反应体系为：OmpUepis 14.0μL、pAML-c4x 7.5μL、10×T4DNA ligase buffer 2.5μL和T4DNA ligase 1.0μL，各成分混匀后，于16℃水浴连接过夜。
1.6感受态细胞的制备与转化
将大肠杆菌TB1菌株接种3mL LB液体培养基，37℃振荡培养过夜，按1∶100比例转种于100mL LB液体培养基中，37℃振荡培养(190r/min)35min至其OD590为0.4-0.6，将菌液转至遇冷的无菌离心管中，冰浴5～10min，4℃，3800rpm离心7min，弃上清，用10mL冰浴的0.1M CaCl2溶液轻轻重悬沉淀，4℃，3300rpm离心5min，去上清，再重复一次，用2mL冰浴的0.1mol/L CaCl2溶液(含10％甘油)轻悬沉淀，即可用于转化。向Eppendorf管中加入200μl感受态细胞和15μL连接产物，混匀后冰浴30min，迅速42℃水浴热冲击100s，迅速冰浴5min，加入950μLLB培养液，37℃振荡培养45min，取100μL菌液均匀涂布于含60μg/mLAmp LB琼脂板上，另设一管不加任何DNA片段，以检测感受态细胞的活性，将其涂布于不含Amp LB琼脂板上，37℃培养过夜。
1.7阳性克隆的筛选与鉴定
挑取白色单个菌落接种5mL含60μg/mL Amp LB培养液，37℃振荡培养过夜，采用质粒提取试剂盒抽提质粒。主要过程为：细菌过夜培养物，12000rpm离心2分钟，弃上清，用250μl试剂盒中的溶液I(含RNaseA1)悬浮细菌沉淀，加入250μl溶液II轻轻地上下翻转混合5-6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。加入400μl 4℃预冷的溶液III，轻轻上下翻转混合5-6次，直至形成紧实凝集块，室温静置2分钟，12000rpm离心10分钟，取上清。将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上，上清液转移至Spin Column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液。将500μl Rinse A加入Spin Column中，12000rpm离心30秒钟，弃滤液。将700μl Rinse B加入Spin Column中，12000rpm离心30秒钟，弃滤液。将Spin Column安置于1.5ml离心管上，在Spin Column膜中央处加入60μl灭菌蒸馏水，室温静置1分钟，12000rpm离心1分钟洗脱DNA。对抽提的质粒进行双酶切鉴定和测序鉴定。
试验结果：
(1)双酶切鉴定：重组表达质粒pAML-c4x用EcoR I和Pst I双酶切，经琼脂糖电泳检测结果见图2，图2中泳道1是DNAMarker DL15000；泳道2是pAML-c4x质粒；泳道3是pAML-c4x-OmpUepis重组质粒；泳道4是EcoR I和Pst I双酶切重组质粒，在预期位置上出现了大小分别为7153bp和309bp的特异性DNA条带；泳道5为PCR扩增产物；泳道6是DNA Marker DL2000。
(2)测序鉴定：阳性克隆送交上海生物技术有限公司进行序列测定，应用NCBI BLAST SERVER(Version 2.0)程序对序列图(如图3所示)进行拼接整理获得与预期要求完全符合的序列。
2.重组菌的原核表达与产物鉴定
2.1重组菌的原核表达
将重组菌pAML-c4x-OmpUepis/TB 1接种于2mL含100μg/mL AmpLB培养液，37℃振荡培养过夜。取50μL培养物转种至4mL含100μg/mLAmp LB培养液，37℃振荡培养至OD590为0.8，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续振荡培养4h，离心收集细菌沉淀，用100μL 1×SDS加样缓冲液重新悬浮细胞，沸水中煮3min，14,600rpm离心1min，吸取上清液用于鉴定。
2.2表达产物的鉴定
2.2.1SDS-PAGE电泳鉴定
配制12％分离胶，在烧杯中加入以下各组分(ml)
去离子水 1.8
30％丙烯酰胺溶液 1.8
1.5mol/L Tris-HCl(PH8.8) 1.25
10％SDS 0.05
TEMED 0.002
10％过硫酸铵 0.05
混匀后立即灌注于玻璃板胶膜内，留出灌注浓缩胶所需的空间，小心在分离胶上覆盖一层去离子水，放置约30min，待分离胶完全聚合后倾出去离子水，并用滤纸吸净残留液体。
配制5％浓缩胶，在烧杯中加入以下各组分(ml)
去离子水 2.1
30％丙烯酰胺溶液 0.5
1.0mol/L Tris-HCl(PH6.8) 0.38
10％SDS 0.03
TEMED 0.003
10％过硫酸铵 0.03
混匀后将浓缩胶灌注于已聚合的分离胶上，立即插入干净的梳子，在浓缩胶完全聚合后，移去梳子，在电泳装置内外槽加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，用注射器冲洗加样孔赶尽气泡。用微量加样器加入10μL处理后的样品，打开电源，50V稳压电泳至溴酚蓝进入分离胶，把电压升至90V，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。取下凝胶用蒸馏水冲洗，用考马斯亮蓝R250在脱色摇床上染色2-3h，然后用脱色液在脱色摇床上脱色至蓝色背景完全脱净后，将凝胶浸入蒸馏水中终止脱色。
试验结果：
重组菌pAML-c4x-OmpUepis/TB1经IPTG诱导后，与未经诱导菌体蛋白相比，可见在分子量为52.4kDa处，有一条明显的浓染蛋白带(参见图4泳道5)。此外，在图4中泳道1为蛋白标准分子量；泳道2为未诱导的空质粒pAML-c4x；泳道3为诱导后的空质粒pAML-c4x；泳道4为未诱导的pAML-c4x-OmpUepis。表明重组表达质粒原核表达成功。
2.2.2Western Blot鉴定
诱导表达的菌体蛋白上清夜经SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上，PBST洗膜3次后，用10％BSA封闭液封闭过夜，PBST洗膜3次，加入1∶200稀释的兔抗MBP血清，37℃反应1h。洗膜后再加入1∶2000稀释的羊抗兔HRP-IgG，37℃反应1h，加入底物DAB显色。
试验结果：
经IPTG诱导表达的拟态弧菌OmpU B细胞多表位串联肽能够与兔抗MBP血清发生特异性结合反应(参见图5)，表明重组多表位肽具有良好的免疫反应性。图5中泳道1为预染色蛋白标准分子量；泳道2为诱导后的pAML-c4x/TB1；泳道3为诱导后的pAML-c4x-OmpUepis/TB1。
3.重组蛋白的发酵表达和纯化
3.1重组蛋白的发酵表达
将重组菌pAML-c4x-OmpUepis/TB1接种于2mL含100μg/mL Amp的LB培养液，37℃振荡培养过夜。2mL培养物转种至200mL含100μg/mLAmp的LB培养液，37℃振荡培养过液至OD590为0.375。在发酵罐中配制2.5L起始发酵液(25g胰蛋白胨，12.5g酵母提取物，2.5g氯化铵，15g磷酸氢二钠，7.5g磷酸二氢钾)，并加入200mL重组菌种子液，终浓度为100μg/mL Amp，40ml 30％葡萄糖，12ml 1mol/L的硫酸镁。发酵2h后，再加入补料培养基(20g胰蛋白胨，20g葡萄糖，1.8g磷酸氢二钠)，继续培养1-2h，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续培养4h，8000rpm离心10min，收集细菌沉淀。
3.2发酵蛋白的纯化
使用Amylose亲和层析柱进行纯化。菌体沉淀用pH7.4，0.01mol/LPBS离心洗涤3次，按每克细胞(湿重)加10ml BufferA重新悬浮，-20℃反复冻融3次，超声波裂解(150w，3min：每次10s，间隔10s)菌体，4℃，14,500rpm离心5min，收集上清液作为过柱样品。将Amylose介质填充于规格为2.5×10cm层析柱中，用8倍柱体积的上层缓冲液洗柱；适当稀释上述提取的重组蛋白液，使其浓度大约为2.5mg/ml，并以1ml/h的速率上样；用12倍柱体积的上样缓冲液洗脱；用上柱缓冲液+10mM麦芽糖洗脱融合蛋白，以每组份3ml收集10-20个组份；SDS电泳鉴定，用冻干机冻干，用Lowry法蛋白含量检测试剂盒测定蛋白浓度。
试验结果：
采用Amylose亲和层析柱纯化发酵表达蛋白，进行SDS电泳鉴定。结果见图6，图6中泳道1为蛋白标准分子量；泳道2为未纯化的发酵表达蛋白液；泳道3为纯化后表达蛋白。同时经Lowry法测得纯化后的蛋白浓度为1mg/ml。
实施例3 多表位串联肽疫苗的配制及其免疫保护效应
一、材料
多表位串联肽，按上述实施例制备；健康草鱼(约100g/尾)购自安徽省肥西县丙子渔场；弗氏佐剂为美国MBI公司产品。
二、方法与结果
1.多表位串联肽疫苗的配制：纯化的重组多表位串联肽与弗氏佐剂完全佐剂或不完全佐剂等体积混合，乳化为免疫原(疫苗)
2.多表位串联肽疫苗的免疫及特异性抗体检测：30尾健康草鱼随机分成三组，每组10只。第一组鳍部肌肉注射多表位串联肽疫苗，第二组鳍部肌肉注射标签蛋白MBP，第三组鳍部肌肉注射生理盐水。免疫剂量为100ug/尾，14天后进行二次免疫，二免10天后三次免疫，7天后再加强免疫一次。分别于免疫前和免疫后第14d、21d、28d、35d和42d尾部取血，分离血清。以重组多表位串联肽为包被抗原，采用间接ELISA方法测定免疫鱼血清中特异性抗体水平。
实验结果：
由图7可见，免疫鱼在首次免疫7天后即可检测出特异性抗体，随着免疫次数和免疫时间增加，抗体水平不断提高，至免疫后30天抗体水平达到最高峰，随后逐渐下降。多表位串联肽免疫组血清中特异性抗体水平显著高于标签蛋白免疫组(P＜0.01)，表明重组多表位串联肽能诱导小鼠产生特异性抗体，具有良好的免疫原性，并且保留了拟态弧菌外膜蛋白OmpU的抗原性。
3.免疫鱼的攻毒保护性实验：末次免疫7d后，用50LD50拟态弧菌安徽分离株培养液(浓度为108CFU/mL)腹腔注射攻击各组实验草鱼，0.2mL/尾，观察2周，记录死鱼数，计算相对保护率。
试验结果：
结果由表2可见，标签蛋白免疫组和生理盐水对照组草鱼全部死亡；多表位串联肽免疫组草鱼存活9只，死亡1只，相对免疫保护率为90％。表明多表位串联肽具有良好的体内免疫保护作用，可通过与免疫佐剂混合或载体连接制成有效的疫苗。
表2 免疫保护性试验结果
| 组别 | 抗体效价 | 攻毒数/尾 | 死亡数/尾 | 保护率/％ |
| MBP-OmpUepis免疫组 | 1∶51200 | 10 | 1 | 90％ |
| MBP免疫组 | 1∶400 | 10 | 10 | 0％ |
| PBS对照组 | 0 | 10 | 10 | 0％ |
4.表位肽疫苗的安全性实验：以5倍免疫剂量的多表位串联肽疫苗鳍部肌肉注射实验鱼，三周内观察实验鱼有无异常反应。结果在实验期间未发现实验鱼有任何异常反应，说明该多表位串联肽疫苗具有良好的安全性。
实施例4 基于多表位串联肽的间接ELISA检测鱼抗拟态弧菌抗体
一、材料
聚苯乙烯酶标板、过氧化氢和邻苯二胺购自上海化学试剂公司；兔抗拟态弧菌抗体由本实验室制备；辣根过氧化物酶标记的兔抗鱼IgG抗体购自上海生物科技有限公司；酶标仪为瑞士TECAN公司产品。
二、方法与结果
1.抗原包被：用pH9.6，0.1M碳酸盐缓冲液稀释重组多表位串联肽至终浓度1ug/ml，按100ul/孔加入聚苯乙烯酶标板，4℃包被过夜。
2.洗涤：用PBST(0.5％Tween PBS)洗涤酶标板3次，立即用于检验或-20℃存放。
3.加入待检血清：加入待检血清(定性检测血清50倍稀释，抗体效价测定血清倍比稀释，同时设立阳性、阴性血清和空白对照)，100ul/孔，37℃孵育1h。
4.洗涤：同第2步。
5.加入酶标抗体：加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鱼IgG抗体，100ul/孔，37℃孵育1h。
6.洗涤：同第2步。
7.加入酶的底物：加入辣根过氧化物酶显色底物(过氧化氢和邻苯二胺)，50ul/孔，室温作用5～15分钟观察显色反应，充分显色后，加入2M硫酸终止反应，用酶标仪测定492nm波长的吸光值。
8.结果判定：空白对照和阴性血清孔吸光值小于或等于0.2，阳性血清对照孔吸光值大于0.4时结果有效，待检血清孔吸光值/阴性血清孔吸光值大于或等于2时为阳性；以反应阳性血清的最大稀释倍数为该样品血清的抗体效价。
试验结果见表3。
表3 多表位串联肽检测鱼血清结果
SEQUENCE LISTING
<110>安徽农业大学
<120>拟态弧菌OmpU蛋白B细胞抗原多表位串联肽及其构建方法与应用
<130>说明书，权利要求书
<160>10
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(48)
<223>
<400>1
aca gaa aac aca gtg act gat aaa tac gaa gac aat ggt aaa gac ggc 48
Thr Glu Asn Thr Val Thr Asp Lys Tyr Glu Asp Asn Gly Lys Asp Gly
1 5 10 15
<210>2
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(39)
<223>
<400>2
act tac aac aac gca gaa act aac gac gaa act tca gca 39
Thr Tyr Asn Asn Ala Glu Thr Asn Asp Glu Thr Ser Ala
1 5 10
<210>3
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(33)
<223>
<400>3
aaa gat ggc aaa gct gaa gat aaa tct cgc gta 33
Lys Asp Gly Lys Ala Glu Asp Lys Ser Arg Val
1 5 10
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(18)
<223>
<400>4
aac ggt gat tac act ggt 18
Asn Gly Asp Tyr Thr Gly
1 5
<210>5
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(57)
<223>
<400>5
gca gat tct acg gcg aca aaa aca gac aac ggt tct gat tta gat aac 48
Ala Asp Ser Thr Ala Thr Lys Thr Asp Asn Gly Ser Asp Leu Asp Asn
1 5 10 15
cgt tac acc 57
Arg Tyr Thr
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(21)
<223>
<400>6
act tac ggt aaa aac gat ggt 21
Thr Tyr Gly Lys Asn Asp Gly
1 5
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(24)
<223>
<400>7
atc aac caa agc ggt gac aaa gca 24
Ile Asn Gln Ser Gly Asp Lys Ala
1 5
<210>8
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(15)
<223>
<400>8
gcc gcc tac 9
Ala Ala Tyr
1
<210>9
<211>98
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>LIPID
<222>(1)..(98)
<223>
<400>9
Thr Glu Asn Thr Val Thr Asp Lys Tyr Glu Asp Asn Gly Lys Asp Gly
1 5 10 15
Ala Ala Tyr Thr Tyr Asn Asn Ala Glu Thr Asn Asp Glu Thr Ser Ala
20 25 30
Ala Ala Tyr Lys Asp Gly Lys Ala Glu Asp Lys Ser Arg Val Ala Ala
35 40 45
Tyr Asn Gly Asp Tyr Thr Gly Ala Ala Tyr Ala Asp Ser Thr Ala Thr
50 55 60
Lys Thr Asp Asn Gly Ser Asp Leu Asp Asn Arg Tyr Thr Ala Ala Tyr
65 70 75 80
Thr Tyr Gly Lys Asn Asp Gly Ala Ala Tyr Ile Asn Gln Ser Gly Asp
85 90 95
Lys Ala
<210>10
<211>294
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(294)
<223>
<400>10
aca gaa aac aca gtg act gat aaa tac gaa gac aat ggt aaa gac ggc 48
Thr Glu Asn Thr Val Thr Asp Lys Tyr Glu Asp Asn Gly Lys Asp Gly
1 5 10 15
gcc gcc tac act tac aac aac gca gaa act aac gac gaa act tca gca 96
Ala Ala Tyr Thr Tyr Asn Asn Ala Glu Thr Asn Asp Glu Thr Ser Ala
20 25 30
gcc gcc tac aaa gat ggc aaa gct gaa gat aaa tct cgc gta gcc gcc 144
Ala Ala Tyr Lys Asp Gly Lys Ala Glu Asp Lys Ser Arg Val Ala Ala
35 40 45
tac aac ggt gat tac act ggt gcc gcc tac gca gat tct acg gcg aca 192
Tyr Asn Gly Asp Tyr Thr Gly Ala Ala Tyr Ala Asp Ser Thr Ala Thr
50 55 60
aaa aca gac aac ggt tct gat tta gat aac cgt tac acc gcc gcc tac 240
Lys Thr Asp Asn Gly Ser Asp Leu Asp Asn Arg Tyr Thr Ala Ala Tyr
65 70 75 80
act tac ggt aaa aac gat ggt gcc gcc tac atc aac caa agc ggt gac 288
Thr Tyr Gly Lys Asn Asp Gly Ala Ala Tyr Ile Asn Gln Ser Gly Asp
85 90 95
aaa gca 294
Lys Ala
Claims (4)
1.一种拟态弧菌OmpU蛋白B细胞抗原多表位串联肽的构建方法，所述的多表位串联肽的氨基酸序列如SEQIDNO：10所示，构建方法包括以下步骤：
(1)设计编码OmpU蛋白B细胞多表位串联肽的多表位串联基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：9所示，也即SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6和SEQIDNO：7所示核苷酸序列，并以SEQIDNO：8所示的核苷酸序列相连接，在所述的多表位串联基因序列两端分别添加EcoR I酶切位点和Pst I酶切位点以及终止密码子TAA，全基因合成；
根据OmpU蛋白B细胞多表位串联肽的多表位串联基因，设计合成所述PCR引物如下：
P1：5’-GACGAATTCACAGAAAACAC-3’
P2：5’-GTCCTGCAGTTATGCTTTGTCACCG-3’
在所述引物P1的5’端加上EcoRI限制性内切酶和保护性碱基，在引物P2的5’端加上PstI限制性内切酶序列和保护性碱基以及终止密码子TAA；
所述PCR反应的条件如下：
在Eppendorf管中分别加入以下组分(μl)
轻弹混匀，瞬时离心，置于PCR仪内，设置反应条件为：
(2)构建重组表达OmpU蛋白B细胞多表位串联肽的重组表达菌，并进行表达、鉴定和纯化重组蛋白；
将所述的重组表达菌进行原核表达，也即将重组表达菌在LB培养液中培养至OD590为0.8，再加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续振荡培养，诱导表达4h，离心收集菌体，用缓冲液重新悬浮菌体，沸水煮3min后，离心收集上清，进行表达蛋白鉴定；
将由重组表达菌制得的重组蛋白进行发酵表达和产物纯化，步骤如下：
重组蛋白发酵表达：将重组表达菌接种于LB培养液中振荡培养OD590为0.375，将培养所得重组表达溶液加入发酵液中发酵2h后，再加入补料培养基继续培养1～2h，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养4h，离心收集菌体沉淀；
发酵蛋白的纯化：将发酵表达所得的菌体沉淀离心洗涤后，用缓冲液重新悬浮菌体，并在-20℃反复冻融，再用超声波裂解菌体后，离心收集上清液，进行亲和层析，收集表达蛋白组分。
2.根据权利要求1所述的拟态弧菌OmpU蛋白B细胞抗原多表位串联肽的构建方法，其特征在于：所述的重组表达菌为携带重组表达质粒的大肠杆菌E.coli TB1株，所述重组表达质粒是含OmpU蛋白B细胞多表位串联肽基因的质粒pAML-c4x。
3.根据权利要求1所述的拟态弧菌OmpU蛋白B细胞抗原多表位串联肽的构建方法，其特征在于：所述的发酵液的成分包括胰蛋白胨、酵母提取物、氯化铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、葡萄糖以及硫酸镁。
4.根据权利要求1所述的拟态弧菌OmpU蛋白B细胞抗原多表位串联肽的构建方法，其特征在于：所述的补料培养基的成分包括胰蛋白胨、葡萄糖以及磷酸氢二钠。
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