发明内容
针对以上技术问题,本发明公开了一种用于免疫治疗的EB病毒LMP2A串联表位肽及其应用,将所述EB病毒LMP2A(latentmembraneprotein2A,潜伏膜蛋白2A)串联表位肽负载人外周血来源的DCs,DCs可被有效地激活,诱导成熟并能够将其递呈到DCs(dendriticcells,树突状细胞)细胞表面,与CTL细胞共培养后可激活特异性的抗病毒CTL(cytotoxicTlymphocytes,细胞毒性T淋巴细胞),并可分泌更多的细胞因子,促进淋巴细胞的增殖,具有更显著的肿瘤杀伤功能,更高的肿瘤细胞杀伤效率。
对此,本发明采用的技术方案为:
一种用于免疫治疗的EB病毒LMP2A串联表位肽,所述用于免疫治疗的EB病毒LMP2A串联表位肽包括SEQIDNO:1的氨基酸序列。
采用此技术方案,将LMP2A356-364和LMP2A426-434进行串联,得到LMP2A串联表位肽LMP2A356-364/426-434;LMP2A356-364和LMP2A426-434的序列为:
LMP2A356-364:FLYALALLL;
LMP2A426-434:CLGGLLTMV;
两者串联后得到的串联表位肽LMP2A356-364/426-434的序列为:
串联表位肽LMP2A:FLYALALLLCLGGLLTMV。
用体外构建质粒,包装病毒转染DCs的方法虽然可使目的蛋白在DCs内表达,但病毒的安全性在临床应用中仍受到一定限制,且不易被患者所接受。另外病毒对DCs的感染效率和表达效率都与病毒包装的滴度相关,操作重复性较差。而采用抗原表位肽对DCs直接负载,操作简便,可重复性高,而且经过实验证实发现LMP2A的串联肽与单个表位肽相比,能更有效地诱导DCs成熟,促进特异性CTL的增殖,能够更加有效地靶向性杀伤鼻咽癌细胞系。
所述LMP2A串联表位肽356-364/426-434负载DCs后,能更加有效地促进DCs成熟和表位肽递呈能力,可以分泌更多的细胞因子。负载了该串联表位肽的DCs与CTL共培养后,可诱导出EB病毒特异性的CTL细胞,实验证明,其在体外和体内均可有效地靶向性杀伤鼻咽癌细胞系CNE1。
通过体外细胞培养方法激活和大量增殖患者自身的DCs,有效负载病毒的抗原多肽,并与大量增殖的CTL细胞联合培养,再回输患者体内,直接提高了患者的抗病毒能力,打破机体的免疫耐受状态。
本发明还公开了所述用于免疫治疗的EB病毒LMP2A串联表位肽的应用,其用于EB病毒相关的疾病的免疫细胞临床治疗中。进一步的,用于鼻咽癌的免疫细胞临床治疗中。
鼻咽癌患者体内存在不同程度的免疫功能低下,其中DCs的数量和功能均有缺陷,患者的抗原提呈细胞(AntigenPresentingCell,APC)往往不能正确地处理和提呈抗原信号,直接影响了有效的CTL抗病毒反应。因此采用EB病毒LMP2A表位肽体外致敏DCs再回输给患者,可大大提高DCs对病毒抗原的提呈能力,激发特异性CTL的免疫应答反应。
本发明的有益效果为:
本发明的技术方案采用将EB病毒潜伏膜蛋白不同抗原多肽串联在一起,体外合成串联表位肽,负载人外周血来源的DCs,发现其可以更加有效地促进DCs增殖和成熟,使其可以分泌更多的细胞因子,负载了该串联表位肽的DCs与CTL共培养后,可激活特异性的抗病毒CTL,诱导出EB病毒特异性的CTL细胞,促进淋巴细胞的增殖,在体外和体内均可有效地靶向性杀伤鼻咽癌细胞系CNE1,且效果比单独应用LMP2A356-364或LMP2A426-434或两种表位肽混合物更好。
实验结果表明,与现有技术相比,采用本发明的技术方案能达到更高的诱导效率和体外体内实验的有效性,其诱导效率比现有技术高10-20%。由此可见,本发明技术方案的LMP2A串联表位肽在治疗鼻咽癌及EB病毒相关的其它疾病的免疫细胞临床治疗方面具有巨大的应用潜力。
具体实施方式
下面结合附图,对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
1、体外合成EB病毒串联表位肽
本发明中采用串联两个HLA*02:01型LMP2A表位肽,LMP2A356-364和LMP2A426-434的序列为:
LMP2A356-364:FLYALALLL;
LMP2A426-434:CLGGLLTMV;
将两者串联得到串联表位肽LMP2A356-364/426-434,得到的LMP2A串联表位肽的序列为:
LMP2A串联表位肽:FLYALALLLCLGGLLTMV。
将LMP2A串联表位肽负载DC细胞。
按照现有技术的方法合成上述三种表位肽,本例的串联表位肽按照现有技术的常规方法合成。经高效液相色谱和质谱分析鉴定证明合成的表位肽的序列和分子量均正确,且纯度达到95%以上,符合实验要求。
根据表位肽的溶解性,将其溶解在水或二甲基亚砜(DMSO)中,表位肽的储存液浓度为10mg/ml,用0.22μm的针筒滤器过滤除菌,分装后于-20℃保存。采用现有技术的方法,进行表位肽负载DCs;表位肽负载DCs时表位肽的终浓度为40μg/ml。
2、DCs和CTL的分离培养
(1)无菌条件下取正常人外周静脉血60ml,离心后取下层细胞层,加入PBS(PhosphateBufferedSaline,磷酸盐缓冲液)以1:1的比例进行稀释后,缓慢加入到淋巴细胞分离液上,1000g室温水平离心25min,取中间白膜层细胞,用PBS洗两遍。
(2)DCs的体外培养和表位肽负载
加入RPMI1640培养基,调整细胞密度为2×106/ml,在10cm培养皿中加入5ml细胞悬液,并放置于37℃,5%体积浓度的CO2培养箱中贴壁培养2h。然后将其中的悬浮细胞作为T细胞进行培养,贴壁细胞加入DCs培养基中,所述DCs培养基为含有100ng/mlGM-CSF和50ng/mlIL-4的RPMI1640培养基。在37℃,5%体积浓度的CO2培养箱中继续培养,每两天半量换液。第六天,在不同培养皿中分别加入LMP2A串联表位肽、LMP2A356-364和LMP2A426-434表位肽的混合物(两者浓度比例为1:1)、表位肽LMP2A356-364、表位肽LMP2A426-434,终浓度均为40μg/ml。第七天,分别加入50ng/mlTNF-α,培养48小时后检测DCs的表型。
(3)T淋巴细胞的培养和DC-CTL的体外诱导
将步骤(2)中的悬浮细胞作为T细胞进行培养。细胞浓度调整为107/ml,与步骤(2)中负载了不同表位肽的DCs分别进行混合培养,DCs与CTL的比例为1:10。分为以下几组分别进行实验:
①负载了串联表位肽的DC与CTL共培养;
②负载了LMP2A356-364和LMP2A426-434表位肽混合物的DC与CTL共培养;
③负载了LMP2A356-364表位肽的DC与CTL共培养;
④负载了LMP2A426-434表位肽的DC与CTL共培养;
⑤未负载表位肽的DC与CTL共培养;
⑥CTL空白对照组。
以上六组,每三天半量换液,加入GM-CSF(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor,粒-巨噬细胞集落刺激因子)、rhIL-4(重组人白细胞介素-4)和rhIL-2(重组人白细胞介素-2)继续培养,于37℃,5%CO2培养箱中培养7天后,与CTL细胞混合进行共培养,方法采用如BrossartP,etal.InductionofcytotoxicT-lymphocyteresponsesinvivoaftervaccinationswithpeptide-pulseddendriticcells,Blood.2000Nov1;96(9):3102-8中所述。
3、EB病毒串联表位肽负载DCs
合成连接FITC荧光基团的LMP2A串联表位肽,其序列为串联表位肽序列C端连接FITC荧光基团,具体序列为:
FLYALALLLCLGGLLTMV-FITC。
将FITC荧光基团的LMP2A串联表位肽对DCs进行负载,24h后在荧光显微镜下观察负载效率,发现LMP2A串联表位肽可有效地被DCs摄取递呈到细胞表面,如图1所示。采用流式细胞术检测其负载效率可达70%以上。
4、EB病毒串联抗原肽负载DCs的表型检测
采用流式细胞仪检测DCs表面标记CD80,CD83,CD86,HLA-DR,结果如图2所示。
由图2分析可见,表位肽负载DCs后,对DCs的表型进行检测,流式细胞术分析结果显示,负载了LMP2A串联表位肽的DCs比负载了单一表位肽的DCs、以及负载了混合LMP2A356-364和LMP2A426-434表位肽的DCs表型都高,DCs成熟标记和共刺激因子的表达百分比更高,说明LMP2A串联表位肽能够更加有效地诱导DCs成熟,提高DCs的抗原递呈能力。
5、混合淋巴细胞反应
为了检测负载了LMP2A串联表位肽的DCs是否能够促进外周血淋巴细胞增殖,并分泌细胞因子,将上述五组DCs与预先用CFSE标记的不同正常人的外周血淋巴细胞(PBL)进行混合培养,具体步骤如下:
(1)将PBL进行CFSE标记,用PBS洗涤两遍后,用淋巴细胞培养液重悬,调整细胞浓度为106/ml。
(2)将各组DCs重悬,调整细胞浓度为3×105/ml。
(3)按比例加入DCs与PBL细胞。DCs与PBL的比例分别为:30000:105,10000:105,3000:105,1000:105,300:105,100:105,并设PBL和DCs的对照孔。
六天后采用流式细胞术检测PBL的增殖曲线,结果如图3所示。结果说明,负载了串联表位肽的DCs对PBL具有明显的促进增殖作用,并且随着DCs与PBL比例的增加,促进效果逐渐增强。其中LMP2A串联表位肽负载的DCs对PBL的增殖促进作用最强,混合的LMP2A356-364和LMP2A426-434表位肽促进PBL增殖的作用次之,再其次为单一的表位肽,由此可见,LMP2A串联表位肽可以更加有效的促进DCs的功能,提高其抗原递呈能力。
6、细胞因子分泌检测
为了检测负载了LMP2A串联表位肽的DCs是否能够促进淋巴细胞分泌细胞因子,将五组DCs与来源于另一不同正常人的外周血淋巴细胞(PBL)进行混合培养,在第三天,第六天,第十天时收集培养液上清,用ELISA试剂盒检测其中IL-2,IFN-γ,TNF-α的分泌量,结果如图4所示。
图4的实验结果表明,负载了LMP2A串联表位肽的DCs可以更加有效地活化T细胞分泌多种细胞因子。IL-2和TNF-α的分泌在第三天达到峰值,IFN-γ的分泌在第六天达到峰值。负载了LMP2A串联表位肽的DCs促进T细胞分泌的细胞因子水平均较负载了单独表位肽的DCs、以及负载了混合LMP2A356-364和LMP2A426-434表位肽的DCs能够分泌更多的细胞因子。
7、负载了串联表位肽的DC-CTL的体外杀瘤实验检测
以附在了表位肽的DC-CTL为效应细胞,鼻咽癌细胞系CNE1作为靶细胞,体外检测肿瘤细胞杀伤效率,具体步骤如下。采用MTT法检测杀瘤效率,结果如图5所示。
(1)收集CNE1肿瘤细胞,用RPMI1640培养基(含5%FBS)重悬细胞,调整细胞浓度为5×104/ml,加入96孔板中,每孔加入100μl,细胞为5000个/孔。37℃,5%CO2培养箱中贴壁过夜。
(2)收集各组DC-CTL,重悬于RPMI1640培养基(含5%FBS)中,调整细胞浓度为106/ml,按照效靶比20:1,10:1,5:1加入效应细胞,用RPMI1640培养基(含5%FBS)补足体积。
(3)置于37℃,5%CO2培养箱中培养4h。
(4)每孔加入20μlMTT溶液(5mg/ml),在培养箱中继续培养4小时。
(5)2000rpm,10min,离心后小心地将上清尽量吸出,注意不要将板底的结晶紫吸出。然后加入150ulDMSO,避光,震荡10min,使结晶紫全部溶解。
(6)酶标仪检测,在波长492nm下检测每孔的吸光度值。
(7)计算杀瘤效率。杀瘤效率(%)=[1-(实验组OD值-单独效应细胞OD值)/单独靶细胞OD值]×100%。
图5的结果显示,负载了LMP2A串联表位肽的DC-CTL在效靶比为20:1的条件下,对CNE1的杀瘤效率可达57.1%,远远高于负载了单独表位肽的DC-CTL、以及负载了混合LMP2A356-364和LMP2A426-434表位肽的DC-CTL,且杀瘤效率随着效靶比的降低而下降。
8、负载了串联表位肽的DC-CTL的动物实验
检测负载了串联表位肽的DC-CTL在模型动物裸鼠体内杀伤肿瘤的效果。结果如图6所示。
(1)取六周龄裸鼠35只,分为7组,每组5只。分别为:①负载了串联表位肽LMP2A356-364/426-434的DC-CTL;②负载了LMP2A356-364和LMP2A426-434表位肽混合物的DC-CTL;③负载了LMP2A356-364表位肽的DC-CTL;④负载了LMP2A426-434表位肽的DC-CTL;⑤未负载表位肽的DC-CTL;⑥CTLonly;⑦PBS。
(2)收集CNE1细胞,重悬于PBS中,调整细胞浓度为1.5×107/ml,①-⑦组裸鼠,每只在腋窝皮下注射200μl,即3×106个。
(3)7天后,裸鼠皮下肿瘤直径约为5mm大小,将各组细胞进行局部注射。每只裸鼠注射的细胞量为107。隔一周后进行再次注射,共进行两次注射治疗。每隔三天测量一次肿瘤体积。结果如图6所示。
图6的结果显示,在皮下注射CNE1鼻咽癌肿瘤细胞系的模型动物进行负载了表位肽的DC-CTL治疗后,LMP2A串联表位肽的DC-CTL治疗组的肿瘤体积增长变缓,较其它几组的肿瘤增殖明显变慢,其它几组的肿瘤体积呈迅速增长趋势。说明,负载了LMP2A串联表位肽的DC-CTL可有效抑制肿瘤在模型动物体内的生长,可以起到抗肿瘤的作用。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。