EA012520B1 - Способ получения цитотоксических лимфоцитов - Google Patents
Способ получения цитотоксических лимфоцитов Download PDFInfo
- Publication number
- EA012520B1 EA012520B1 EA200600459A EA200600459A EA012520B1 EA 012520 B1 EA012520 B1 EA 012520B1 EA 200600459 A EA200600459 A EA 200600459A EA 200600459 A EA200600459 A EA 200600459A EA 012520 B1 EA012520 B1 EA 012520B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cells
- cultivation
- medium
- fragment
- fibronectin
- Prior art date
Links
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 title claims abstract description 248
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 241
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 title claims abstract description 188
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 171
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 359
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 339
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims abstract description 278
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims abstract description 278
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 217
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 40
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims abstract description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 1057
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 258
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 94
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 87
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 85
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 75
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 70
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 65
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 49
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 45
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 38
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 30
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 26
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 26
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 25
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 21
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 21
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 20
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 18
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims description 17
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 17
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 17
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 11
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 9
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 claims description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 6
- 230000010556 Heparin Binding Activity Effects 0.000 claims description 5
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 4
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 claims description 4
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 4
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 605
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 339
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 128
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 117
- 239000002957 persistent organic pollutant Substances 0.000 description 90
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 47
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 46
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 46
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 42
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 40
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 37
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 35
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 35
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 35
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 33
- 239000000306 component Substances 0.000 description 32
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 32
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 31
- 230000006870 function Effects 0.000 description 26
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 26
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 24
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 21
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 20
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 20
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 19
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 18
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 18
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 18
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 18
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 17
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 16
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 10
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 10
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 7
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 6
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 6
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 5
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 3
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101150114515 CTBS gene Proteins 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000013337 sub-cultivation Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- IACFXVUNKCXYJM-AKSHDPDZSA-N 2-(chloromethyl)oxirane (2R,3R,4S,5S,6R)-2-[(2S,3S,4S,5R)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound ClCC1CO1.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IACFXVUNKCXYJM-AKSHDPDZSA-N 0.000 description 1
- XHPWRTXYJFNZAW-OWOJBTEDSA-N 5-azido-2-[(e)-2-(4-azido-2-sulfophenyl)ethenyl]benzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C1\C=C\C1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1S(O)(=O)=O XHPWRTXYJFNZAW-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101100291853 Caenorhabditis briggsae uba-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100167365 Caenorhabditis elegans cha-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100291854 Caenorhabditis elegans moc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229920001284 acidic polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000004805 acidic polysaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 101150099105 alien gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009134 cell regulation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012645 endogenous antigen Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 238000001050 pharmacotherapy Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037081 physical activity Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108010056030 retronectin Proteins 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 208000037707 susceptibility to 8 restless legs syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150033518 uba-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/58—Adhesion molecules, e.g. ICAM, VCAM, CD18 (ligand), CD11 (ligand), CD49 (ligand)
Abstract
Настоящее изобретение относится к способу получения цитотоксических лимфоцитов, отличающемуся тем, что он включает в себя осуществление по меньшей мере одной стадии, выбранной из индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов с использованием среды, содержащей сыворотку и плазму в суммарной концентрации, составляющей не более 5 об.%, в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси.
Description
Настоящее изобретение относится к способу получения цитотоксического лимфоцита, который применим в области медицины.
Уровень техники
Живой организм защищен от чужеродных веществ главным образом иммунным ответом, и иммунная система основана на различных клетках и продуцируемых ими растворимых факторах. Среди них ключевую роль играют лейкоциты, особенно лимфоциты. Лимфоциты делят на два основных типа, Влимфоциты (которые в дальнейшем могут называться В-клетками) и Т-лимфоциты (которые в дальнейшем могут называться Т-клетками), и те, и другие специфично узнают антиген и действуют на антиген, защищая живой организм.
Т-клетки подразделяют на хелперные Т-клетки, имеющие маркер СЭ4 (кластер дифференцировки) (в дальнейшем называемые Тн), главным образом вовлеченные в оказание помощи в продуцировании антител и индукции различных иммунных ответов, и цитотоксические Т-клетки, имеющие маркер СЭ8 (Тс: цитотоксические Т-лимфоциты, также называемые Т-клетками-киллерами, которые в дальнейшем могут называться СТЬ), главным образом проявляющие цитотоксическую активность. СТЬ, которые играют важнейшую роль в узнавании, разрушении и элиминации опухолевых клеток, инфицированных вирусом клеток и т. п., не продуцируют антитело, специфично взаимодействующее с антигеном, подобно В-клеткам, но непосредственно узнают и действуют на антигены (антигенный пептид) из клеткимишени, которые связаны с молекулами класса I главного комплекса гистосовместимости [МНС, которые у человека также могут называться человеческим лейкоцитарными антигенами (НЬА)], существующими на поверхности мембраны клетки-мишени. В это время рецептор Т-клеток (в дальнейшем называемый ТСК.), существующий на поверхности мембраны СТЬ, специфично узнает указанные выше антигенные пептиды и молекулы МНС класса I и определяют, является ли антигенный пептид аутологичным или неаутологичным. Затем клетка-мишень, которая была определена как неаутологичная, специфично разрушается и элиминируется клеткой СТЬ.
В последние годы терапия, которая могла бы вызвать тяжелую физическую нагрузку для пациента, такая как фармакотерапия и лучевая терапия, была пересмотрена, и возрос интерес к иммунотерапии с небольшой физической нагрузкой для пациента. Особенно отмечалась эффективность адоптивной иммунотерапии, при которой СТЬ, способный специфично взаимодействовать с представляющим интерес антигеном, индуцируют ех νίνο из лимфоцита, полученного от человека, обладающего нормальной иммунной функцией, или лимфоцит размножают без индукции и затем переносят пациенту. Например, получены свидетельства того, что в животной модели адоптивная иммунотерапия представляет собой эффективную терапию вирусной инфекции и опухоли (например, как в работе ОгееиЬегд, Ρ.Ό., опубликованной в 1992, АЖаисек ίη 1ттиио1о§у и Кеиккег Ρ. и трех других авторов, Β1οο6, 1991, 78(5), 13731380). В случае указанной терапии важно сохранить или увеличить количество клеток в состоянии, при котором антиген-специфическая цитотоксическая активность СТЬ сохраняется или усиливается.
В случае описанной выше адоптивной иммунотерапии необходимо вводить цитотоксические лимфоциты в заданном количестве клеток или большем количестве, чтобы получить терапевтический эффект. Другими словами можно сказать, что самой большой проблемой является получение указанного выше количества клеток ех νίνο в течение короткого периода времени.
Чтобы сохранить и усилить антиген-специфическую цитотоксическую активность СТЬ, как правило, использовали способ многократной стимуляции представляющим интерес антигеном при индукции специфичного ответа на антиген в случае СТЬ. Однако в указанном способе количество СТЬ, получаемое в конечном итоге, как правило, может уменьшаться, так что невозможно получить достаточное количество клеток.
В качестве способа получения Т-клетки, которая является эффективной для лечения заболевания, известна, например, адоптивная иммунотерапия с использованием активируемых лимфокином клетоккиллеров (ЬАК-клетки) (например, ^кепЬег^ 8.А. е1 а1., N. Еид1. 1. Меб. 1987, 316(15), 889-897) и адоптивная иммунотерапия с использованием инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (Т1Ь), индуцированных интерлейкином-2 (1Ь-2) в высокой концентрации (например, ^кепЬег^ 8.А. е1 а1., N. Еид1. 1. Меб., 1988, 319(25), 1676-1680 и Но М. и девять соавторов, Β1οο6, 1993, 81(8), 2093-2101).
Затем в отношении получения антиген-специфических СТЬ был опубликован способ выделения и экспансии СМУ-специфичного клона СТЬ с использованием аутологичного инфицированного СМУ фибробласта и 1Ь-2 (например, К1ббе11 8.А. и четверо соавторов, 1. Iттииο1., 1991, 146(8), 2795-2804) или с использованием моноклонального антитела против СЭ3 (анти-СЭ3-мАт) и 1Ь-2 (например, ОгееиЬегд, Ρ.Ό. с соавтором, 1. ^тимЕ Мебюбк. 1990, 128(2), 189-201).
Кроме того, в XVО 96/06929 описан способ КЕМ (способ быстрой экспансии). Указанный способ КЕМ представляет собой способ экспансии популяции первичных Т-клеток, содержащей антигенспецифические СТЬ и Тн, в течение короткого периода времени. Другими словами указанный способ отличается тем, что можно получить большое количество Т-клеток посредством пролиферации отдельных Т-клеточных клонов, и тем, что количество антиген-специфических СТЬ увеличивают, используя анти-СЭ3-антитело, 1Ь-2 и РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови), которые делают де
- 1 012520 фицитными в отношении способности к пролиферации путем облучения, и клетки, инфицированные вирусом Эпштейн-Барр (в дальнейшем просто называемым ЕВУ).
Кроме того, в \УО 97/32970 описан модифицированный способ КЕМ, и данный способ представляет собой способ с использованием в качестве питающих клеток линии неделящихся клеток млекопитающих, экспрессирующих стимулирующий Т-клетки компонент, которые отличаются от РВМС, чтобы уменьшить количество используемых РВМС.
Активируемые лимфокином клетки-киллеры (ЬАК-клетки) являются популяцией функциональных клеток, обладающих цитотоксической активностью, которые получают путем добавления 1Ь-2 к периферической крови (лейкоциты периферической крови), пуповинной крови, тканевой жидкости и т.п., содержащему лимфоциты, и культивируя клетки ίη νίΐτο в течение нескольких дней. Во время культивирования пролиферацию ЬЛК-клеток дополнительно ускоряют, добавляя к ним анти-СЭ3-антитела и культивируя клетки. Полученные таким образом ЬЛК-клетки обладают цитотоксической активностью, неспецифически направленной против различных злокачественных клеток и других мишеней. ЕЛК-клетки также используют в адоптивной иммунотерапии таким же образом, что и указанные выше СТЬ.
Как описано выше, применение 1Ь-2 важно на стадии получения цитотоксических лимфоцитов, например, СТЬ, ЬЛК-клеток, Т1Ь и т.п. Клетки дополнительно активируются связыванием 1Ь-2 с рецептором интерлейкина-2 (1Ь-2К) на поверхности клетки. Кроме того, 1Ь-2Р известен как маркер активации лимфоцита. С этих точек зрения важно увеличить экспрессию 1Ь-2К на поверхности клетки. Кроме того, при индукции СТЬ важно повысить эффективность индукции клеток-предшественников СТЬ, подвергаемых стимуляции антигеном, в виде СТЬ, т.е. увеличить долю (относительное содержание) СЭ8позитивных клеток в группе клеток после индукции.
Обычно также добавляют сыворотку или плазму в соотношении от 5 до 20 об.% при размножении указанных лимфоцитов ех νίνο. Указанная сыворотка или плазма является компонентом, необходимым в том случае, когда клетки, такие как лимфоциты, культивируют ех νίνο. Однако нельзя исключать риск развития различных вирусных инфекций и т.п., так как сыворотку или плазму получают из крови неаутологичного животного (человека, жвачных полорогих животных и т.п.). Кроме того, невозможно полностью отрицать присутствие вируса или патогенного микроорганизма, не выявляемого современными способами регистрации.
В этой связи в последние годы все больше и больше используют сыворотку или плазму, полученную от пациента (аутологичная сыворотка или плазма). Однако это может быть связано с риском для пациента в связи со взятием большого количества крови у пациента для получения сыворотки или плазмы в количестве, необходимом для культивирования, так как это вызывает тяжелую физическую нагрузку на пациента. Чтобы избежать указанного риска, используют небольшое количество сыворотки или плазмы для размножения, чтобы получить лимфоциты, требуемые для лечения, поэтому их приходится культивировать при низкой концентрации сыворотки или плазмы. Как правило, рост таких клеток, как лимфоциты, является нестабильным в условиях культуры с низкой концентрацией сыворотки или низкой концентрацией плазмы; в связи с этим невозможно получить клетки в количестве, необходимом для лечения. Кроме того, не содержащая сыворотки культура особенно требуется для того, чтобы избежать физической нагрузки и риска инфекции, как указано выше. Однако большинство клеток не может расти в таких условиях культивирования.
Следовательно, чрезвычайно необходим способ размножения лимфоцитов при низкой концентрации сыворотки или без сыворотки (при низкой концентрации плазмы или без плазмы).
Если разработать способ экспансии лимфоцитов в условиях без сыворотки (без плазмы), то могут быть исключены различия в сыворотке или плазме между партиями и могут быть исключены негативные элементы в результате присутствия сыворотки или плазмы от пациента (такие как иммуносупрессирующие компоненты), при этом преимущество, получаемое в результате разработки такой системы, неоценимо.
Фибронектин представляет собой гигантский гликопротеид, имеющий молекулярную массу 250 тысяч, который существует в крови животных, на поверхности культивируемых клеток или во внеклеточном матриксе ткани, и, как известно, обладает различными функциями. Его доменную структуру делят на семь частей (дальнейшее описание относится к фиг. 1), при этом в его аминокислотной последовательности содержится три вида сходных последовательностей, повторы каждой из указанных последовательностей составляют полную последовательность. Три вида сходных последовательностей называют последовательностями типа I, типа II и типа III. Среди них тип III состоит из 71-96 аминокислотных остатков, где доля совпадений указанных аминокислотных остатков составляет от 17 до 40%. В фибронектине имеется четырнадцать последовательностей типа III, из них 8-я, 9-я или 10-я последовательности (каждая из которых в дальнейшем называется Ш-8, Ш-9 или Ш-10) находятся в домене связывания с клеткой, а 12-я, 13-я или 14-я последовательность (каждая из которых в дальнейшем называется Ш-12, Ш-13 или Ш-14) находится в домене, связывающем гепарин. Кроме того, область связывания УЬЛ (антигена очень поздней активации)-5 находится в Ш-10, и ее коровой последовательностью является РСЭ8. Кроме того, область, называемая ШС8, существует с С-концевой стороны домена, связывающего гепарин. Область, называемая С8-1, состоящая из 25 аминокислот и обладающая связывающей активностью
- 2 012520 в отношении УЪЛ-4, существует в ШС8 (например, в работе автора Эеапе Р. Мотег, опубликованной в 1988, ПЬгопесЦп. Лсабетю Ртезз 1пс., Р1-8, Кишхика Р. и восьми других соавторов, 1. Вюсйет., 1991, 110(2), 284-291 и НапепЬегд Н. и пяти соавторов, Нитап Сепе Тйетару, 1997, 8(18), 2193-2206).
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является способ получения цитотоксического лимфоцита, обладающего цитотоксической активностью на высоком уровне, который в высокой степени безопасно и соответствующим образом используют в области медицины.
Суммируя, можно отметить, что первый вариант настоящего изобретения относится к способу получения цитотоксических лимфоцитов, который отличается тем, что включает в себя по меньшей мере одну стадию осуществления, выбранную из индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов с использованием среды, содержащей сыворотку и плазму в суммарной концентрации не более 5 об.% от объема среды, в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси, причем цитотоксические лимфоциты экспрессируют рецептор интерлейкина-2 в большей степени по сравнению с цитотоксическими лимфоцитами, полученными в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси. Кроме того, примером цитотоксических лимфоцитов, полученных в первом варианте осуществления настоящего изобретения, являются цитотоксические лимфоциты, которые содержат СО8-позитивные клетки в более высоком относительном количестве по сравнению с цитотоксическими лимфоцитами, полученными в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси. Кроме того, примером цитотоксических лимфоцитов, полученных в первом варианте осуществления настоящего изобретения, являются цитотоксические лимфоциты, кратность экспансии которых выше, чем кратность экспансии цитотоксических лимфоцитов, полученных способом получения цитотоксических лимфоцитов в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси. Также примером цитотоксических лимфоцитов, полученных в первом варианте осуществления настоящего изобретения, являются цитотоксические лимфоциты, которые обладают цитотоксической активностью, повышенной или поддерживаемой на высоком уровне по сравнению с цитотоксической активностью цитотоксических лимфоцитов, полученных в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси.
В первом варианте осуществления настоящего изобретения примером применения фибронектина, его фрагмента или их смеси является применение, при котором фибронектин, его фрагмент или их смесь иммобилизуют на твердой фазе. В данном случае примером твердой фазы является оборудование для культивирования клеток или носитель для культуры клеток. Примером оборудования для культивирования клеток является чашка Петри, флакон или мешок, и примером носителя для культуры клеток являются шарики, мембрана или предметное стекло.
В первом варианте осуществления настоящего изобретения примером цитотоксических лимфоцитов являются активируемые лимфокином клетки-киллеры.
В первом варианте осуществления настоящего изобретения примером фрагмента фибронектина является полипептид (а), содержащий по меньшей мере любую одну из аминокислотных последовательностей, показанных в БЕЦ ΙΌ N0: 1-8 в списке последовательностей, или полипептид (Ь), содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, имеющую замену, делецию, инсерцию или присоединение одной или большого количества аминокислот в любой из указанных выше аминокислотных последовательностей, при этом полипептид (Ь) обладает функцией, эквивалентной функции указанного выше полипептида (а). Примером фрагмента фибронектина являются фрагменты, которые обладают активностью в клеточной адгезии и/или связывающей активностью по отношению к гепарину. Примером фрагмента фибронектина также является по меньшей мере один полипептид, выбранный из группы, состоящей из полипептидов, имеющих любую из аминокислотных последовательностей, показанных в 8ЕЦ ΙΌ N0: 9-20 и 25 в списке последовательностей.
В первом варианте осуществления настоящего изобретения одним из вариантов способа получения, который осуществляют на оборудовании для культивирования клеток, является способ, который удовлетворяет следующим требованиям:
(a) отношение количества клеток к площади поверхности культуры в оборудовании для культивирования клеток в начале культивирования составляет от 1 до 5х 105 клеток/см2; и/или (b) концентрация клеток в среде в начале культивирования составляет от 1 до 5х 105 клеток/мл.
В первом варианте осуществления настоящего изобретения в качестве примера применяют способ, кроме того, включающий в себя стадию трансдукции чужеродного гена в цитотоксический лимфоцит. В данном случае примером трансдукции чужеродного гена является стадия, включающая в себя применение ретровируса, аденовируса, аденоассоциированного вируса или вируса обезьян.
Второй вариант осуществления настоящего изобретения относится к цитотоксическому лимфоциту, полученному способом согласно первому варианту осуществления настоящего изобретения.
Третий вариант осуществления настоящего изобретения относится к лекарственному средству, содержащему в качестве эффективного ингредиента цитотоксический лимфоцит, полученный способом согласно первому варианту осуществления настоящего изобретения.
Четвертый вариант осуществления настоящего изобретения относится к среде для культивирования
- 3 012520 цитотоксического лимфоцита, отличающейся тем, что среда содержит в качестве эффективного ингредиента фибронектин, его фрагмент или их смесь, и тем, что суммарная концентрация сыворотки и плазмы в среде составляет не более 5 об.%.
Настоящее изобретения относится к способу получения цитотоксического лимфоцита, который является в высокой степени безопасным и нагрузка которого на пациента снижена.
Краткое описание чертежа
Чертеж является схемой, показывающей доменную структуру фибронектина.
Наилучший способ осуществления изобретения
Настоящее изобретение было завершено благодаря выявлению того, что в случае получения цитотоксических лимфоцитов в присутствии фибронектина и/или фрагмента фибронектина в способе индукции, поддержания или экспансии цитотоксических лимфоцитов цитотоксические лимфоциты обладают достаточной цитотоксической активностью даже при более высокой кратности экспансии, высоким уровнем экспрессии 1Б-2К и высоким относительным содержанием СО8-позитивных клеток, даже если содержание сыворотки или плазмы в среде понижено или исключено.
В этой связи получение цитотоксического лимфоцита, используемое в данном описании, относится к стадии, включающей в себя каждую из стадий индукции (активации), поддержания и экспансии клеток или объединенные указанные стадии. Получение цитотоксического лимфоцита согласно настоящему изобретению также относится к культивированию цитотоксического лимфоцита.
Настоящее изобретение будет конкретно объяснено ниже.
(1) Фибронектин и его фрагмент, используемые в настоящем изобретении.
Фибронектин и его фрагмент, упоминаемые в данном описании, могут быть природного происхождения или искусственно синтезированными. Фибронектин и его фрагмент могут быть получены в значительной степени очищенной форме из вещества природного происхождения, например, на основе описания Кио81айй Е., е! а1. [1. ΒίοΙ. Сйет., 256(14), 7277-7281 (1981)]. Термин «в значительной степени очищенный фибронектин или фрагмент фибронектина» в использованном в данном описании смысле означает такой фибронектин и фрагмент фибронектина, который по существу не содержит других белков и тому подобного, существующих вместе с фибронектином в природе. Каждый из указанных выше фибронектина и его фрагмента могут быть использованы в настоящем изобретении отдельно или в смеси множества видов.
При этом известно, что существует большое количество вариантов сплайсинга фибронектина. В качестве фибронектина, применяемого в настоящем изобретении, можно использовать любой вариант при условии, что проявляются требуемые эффекты согласно настоящему изобретению, например, в случае фибронектина, полученного из плазмы, известно, что делетирована область, называемая ΕΌ-Β, присутствующая выше домена связывания с клеткой, и область, называемая ΕΌ-Ά, присутствующая между доменом связывания с клеткой и доменом, связывающим гепарин. Такой фибронектин, полученный из плазмы, также можно использовать в настоящем изобретении.
Полезную информацию, относящуюся к фрагментам фибронектина, которые можно использовать в настоящем изобретении, и к получению фрагментов, можно найти в Кпшйика Е., е! а1. [1. Вюсйет., 110, 284-291 (1991)], КотЬпЬй Α.Κ., е! а1. [ЕМВО 1., 4(7), 1755-1759 (1985)], 8ек1§исЫ К., е! а1. [ВюсйетЕйу, 25(17), 4936-4941 (1986)] и т.п. публикациях. Кроме того, аминокислотная последовательность фибронектина представлена в СепЬапк с номером доступа № ΝΜ_002026 (ΝΡ_002017).
В настоящем изобретении примером фрагмента фибронектина является, например, полипептид (а), содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, содержащую любую из областей ΙΙΙ-8 (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕО ΙΌ N0: 1 в списке последовательностей), ΙΙΙ-9 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Е0 ΙΌ N0: 2 в списке последовательностей), ΙΙΙ-10 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Е0 ΙΌ N0: 3 в списке последовательностей), ΙΙΙ-11 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Е0 ΙΌ N0: 4 в списке последовательностей), ΙΙΙ-12 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Е0 ΙΌ N0: 5 в списке последовательностей), ΙΙΙ-13 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Е0 ΙΌ N0: 6 в списке последовательностей), ΙΙΙ-14 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Е0 ΙΌ N0: 7 в списке последовательностей) и С8-1 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Е0 ΙΌ N0: 8 в списке последовательностей) (см. фиг. 1), или полипептид (Ь), содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, имеющую замену, делецию, инсерцию или присоединение одной или большого количества аминокислот в любой из аминокислотных последовательностей, описанных выше, при этом полипептид (Ь) обладает функцией, эквивалентной функции указанного выше полипептида (а).
Кроме того, в качестве фрагмента предпочтительно может быть использован фрагмент, обладающий активностью в клеточной адгезии и/или связывающей активностью по отношению к гепарину. Активность в клеточной адгезии можно оценить, анализируя связывание фрагмента (его домена связывания с клетками), используемого в настоящем изобретении, с клетками известным способом. Например, указанный выше способ включает способ согласно ^1Шат§ Ό.Α., е! а1. |№11иге. 352, 438-441 (1991)]. Способ представляет собой способ определения связывания клетки с фрагментом, иммобилизованным на планшете для культивирования.
- 4 012520
Кроме того, связывающую активность по отношению к гепарину можно оценить, анализируя связывание фрагмента (его гепаринсвязывающего домена), используемого в настоящем изобретении, с гепарином известным способом. Например, связывание фрагмента с гепарином можно оценить таким же образом, используя гепарин, например меченый гепарин, вместо клетки в описанном выше способе Х11Наш8 Ό.Ά., е! а1.
Кроме того, примером фрагмента фибронектина является полипептид, выбранный из С-274 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Еф ГО N0: 9 в списке последовательностей), Н-271 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Еф ГО N0: 10 в списке последовательностей), Н-296 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Еф ГО N0: 11 в списке последовательностей), СН271 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Еф ГО N0: 12 в списке последовательностей), СН-296 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Еф ГО N0: 13 в списке последовательностей), С-С81 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Еф ГО N0: 14 в списке последовательностей) или СН-296№1 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Еф ГО N0: 25 в списке последовательностей). В данном случае СН-296№ является полипептидом, полученным впервые в настоящем изобретении.
Каждый из указанных выше фрагментов СН-271, СН-296, СН-296№г С-274 и С-С81 представляет собой полипептид, имеющий домен связывания с клетками со связывающей активностью по отношению к УЪА-5. Также С-С81, Н-296, СН-296 и СН-296№1 являются полипептидами, имеющими С8-1 со связывающей активностью по отношению к УЪА-4. Кроме того, Н-271, Н-296, СН-271, СН-296 и СН-296№ являются полипептидами, имеющими гепаринсвязывающий домен. В данном случае СН-296№1 является полипептидом, содержащим область от домена связывания с клетками до С8-1 фибронектина, полученного из плазмы. В частности, СН-296№1 является полипептидом, в котором область (ЕЭ-Л) в пределах от Аки в положении 1631 до ТЬг в положении 1720 делетирована из полипептида, содержащего область от Рго в положении 1270 до ТЬг в положении 2016 аминокислотной последовательности фибронектина, описанной в СеиЬаик с номером доступа № ИМ_002026 (ИР_002017).
В настоящем изобретении также можно использовать фрагмент, в котором каждый из указанных выше доменов модифицирован. Гепаринсвязывающий домен фибронектина состоит из трех последовательностей типа III (ΙΙΙ-12, ΙΙΙ-13 и ΙΙΙ-14). Фрагмент, содержащий гепаринсвязывающий домен, имеющий делецию одной или двух из указанных выше последовательностей типа ΙΙΙ, также может быть использован в настоящем изобретении. Например, примерами фрагментов могут быть СНУ-89 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Еф ГО N0: 15 в списке последовательностей), СНУ-90 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Еф ГО N0: 16 в списке последовательностей) или СНУ92 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Еф ГО N0: 17 в списке последовательностей), которые представляют собой фрагменты, в которых связаны участок фибронектина связывания с клетками (УЪА-5-связывающий домен: Рго1239-8ег1515) и одна из последовательностей типа ΙΙΙ, или СНУ-179 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Еф ГО N0: 18 в списке последовательностей) или СНУ-181 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Еф ГО N0: 19 в списке последовательно стей), которые являются фрагментами, в которых связаны участок связывания фибронектина с клетками и две последовательности типа ΙΙΙ. СНУ-89, СНУ-90 и СНУ-92 содержат ΙΙΙ-13, ΙΙΙ-14 и ΙΙΙ-12 соответственно и СНУ-179 содержит ΙΙΙ-13 и ΙΙΙ-14, и СНУ-181 содержит ΙΙΙ-12 и ΙΙΙ-13 соответственно.
Кроме того, в настоящем изобретении может быть использован фрагмент, имеющий присоединение дополнительной аминокислоты к каждому из указанных выше фрагментов. Например, фрагмент может быть получен присоединением требуемой аминокислоты к каждому из указанных выше фрагментов согласно способу получения Н-275-Сук, описанному в примерах получения, приведенных ниже. Например, Н-275-Сук (аминокислотная последовательность, показанная в 8Еф ГО N0: 20 в списке последовательностей) представляет собой фрагмент, имеющий гепаринсвязывающий домен фибронектина и остаток цистеина на С-конце.
Фрагментом, используемым в настоящем изобретении, могут быть фрагменты, включающий в себя полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую замену, делецию, инсерцию или присоединение одной или большого количества аминокислот в аминокислотной последовательности полипептида, составляющего фрагмент, по меньшей мере, частично содержащего аминокислотную последовательность встречающегося в природе фибронектина, приведенного в качестве примера выше, при этом полипептид имеет функцию, эквивалентную функции фрагмента, при условии, что получают требуемые эффекты согласно настоящему изобретению.
Предпочтительно замену аминокислот или подобное изменение осуществляют в такой степени, что могут быть изменены физико-химические свойства и прочее исходного полипептида в таких пределах, в которых функция полипептида может сохраняться. Например, предпочтительно, чтобы замена аминокислот или подобное изменение было консервативным в таких пределах, чтобы свойства, присущие полипептиду (например, гидрофобность, гидрофильность, электрический заряд рК и пр.) существенно не изменялись. Например, предпочтительно, чтобы замена аминокислот представляла собой замены внутри каждой из групп: 1) глицин, аланин; 2) валин, изолейцин, лейцин; 3) аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аспарагин, глутамин; 4) серин, треонин; 5) лизин, аргинин; 6) фенилаланин, тирозин, и что
- 5 012520 бы делеция, присоединение или инсерция аминокислот представляла собой делецию, присоединение или инсерцию аминокислот, имеющих свойства, сходные со свойствами окружения данного сайта в полипептиде в таких пределах, чтобы свойства окружения данного сайта существенно не изменялись.
Замена аминокислот или подобное изменение может представлять собой замены, встречающиеся в природе, которые вызваны различиями между видами или индивидуумами, или может быть индуцирована искусственно. Искусственную индукцию можно осуществлять известным способом. Например, индукция может быть осуществлена, не ограничиваясь указанным, посредством получения заданной нуклеиновой кислоты, имеющей замену, делецию, присоединение или инсерцию одного или большого количества нуклеотидов в нуклеиновой кислоте, кодирующей указанную выше область или данный фрагмент, получаемый из встречающегося в природе фибронектина, и посредством использования нуклеиновой кислоты для получения полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую замену или подобное изменение в аминокислотной последовательности полипептида, составляющего указанную выше область или данный фрагмент, получаемый из встречающегося в природе фибронектина, имеющего функцию, эквивалентную функции фрагмента или т.п., с использованием известного способа.
Кроме того, фраза «имеющий функцию, эквивалентную» в данном описании относится к тому, что полипептид, который является сравнительным контролем, обладает, по меньшей мере, любой из следующих функций: (1) функцией усиления или сохранения цитотоксической активности цитотоксического лимфоцита, (й) функцией повышения уровня экспрессии 1Ь-2К, (ш) функцией повышения относительного содержания СЭЗ-позитивных клеток или (ίν) функцией повышения кратности экспансии цитотоксического лимфоцита, каждой из которых обладает встречающийся в природе фрагмент фибронектина. Указанные выше функции могут быть соответствующим образом подтверждены согласно способу, описанному в примерах, приведенных далее. Кроме того, в качестве фрагмента, содержащего полипептид, имеющий замену аминокислот или подобное изменение, предпочтителен фрагмент, обладающий активностью в адгезии клеток и/или гепаринсвязывающей активностью. Активность в клеточной адгезии и гепаринсвязывающую активность можно оценить согласно указанным выше способам определения указанных активностей.
В качестве фрагмента, содержащего полипептид, имеющий замену аминокислот и подобное изменение, в настоящем изобретении также может быть использован фрагмент, имеющий одну или несколько аминокислот, встроенных в виде линкера между двумя разными доменами.
В этой связи в качестве фибронектина, подобно описанному выше фрагменту, в настоящем изобретении можно использовать полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую замену, делецию, инсерцию или присоединение одной или большого количества аминокислот в аминокислотной последовательности, составляющей полипептид фибронектина, при этом полипептид обладает, по меньшей мере, любой из функций, указанных выше в (ί)-(ίν).
Фрагмент фибронектина, который упоминается в данном описании, также может быть получен из генетического рекомбинанта, например, на основе описания патента США № 5198423. Например, каждый из фрагментов Н-271 (8ЕО ГО N0: 10), Н-296 (8ЕС ГО N0: 11), СН-271 (8ЕС ГО N0: 12) и СН-296 (8ЕЦ ГО N0: 13) и способ получения указанных фрагментов подробно описаны в спецификации данного патента. Кроме того, С’Н-296№1 (8ЕЦ ГО N0: 25) и способ его получения описаны в разделе (3) С’Н-296№ и в примерах, приведенных ниже. Кроме того, указанный выше фрагмент С-274 (8ЕЦ ГО N0: 9) может быть получен согласно способу, описанному в патенте США № 5102988. Кроме того, фрагмент С-С81 (8ЕС ГО N0: 14) может быть получен согласно способу, описанному в публикации патента Японии № 3104178. Каждый из фрагментов СНУ-89 (8 ЕС) ГО N0: 15), СНУ-90 (8ЕС) ГО N0: 16) или СНУ-179 (8ЕЦ ГО N0: 18) могут быть получены согласно способу, описанному в публикации патента Японии № 2729712. Кроме того, фрагмент СНУ-181 (8ЕЦ ГО N0: 19) может быть получен согласно способу, описанному в \У0 97/18318. Фрагмент СНУ-92 (8ЕЦ ГО N0: 17) может быть получен способом генетической инженерии с использованием плазмиды, сконструированной обычным образом на основе плазмиды, описанной в литературе, при обращении в публикации патента Японии № 2729712 и \У0 97/18318.
Указанные фрагменты или фрагменты, которые могут быть получены из указанных фрагментов обычным способом, могут быть получены с использованием микроорганизмов, депонированных в международной депозитарии патентуемых организмов, №Шопа1 1п8Йи1е οί АФ'апсеб 1пби51па1 8с1епсе и Тсс11по1оду. ТкикиЬа Сеп1га1 6, 1-1, НщаЧн 1-сйоте, ТкикиЬа-кЫ, 1Ьагак1-кеп, 1арап (Ζίρ собе 305-8566) со следующими номерами доступа, или посредством модифицирования плазмиды, которую несет каждый микроорганизм, согласно известному способу.
ЕЕКМ ВР-2264 (ЕксйепсШа сой, несущая плазмиду, кодирующую Н-271. Дата депозита: 30 января 1989 г.);
ЕЕКМ ВР-2800 (ЕксйепсЫа сой, несущая плазмиду, кодирующую СН-296. Дата депозита: 12 мая 1989 г.);
ЕЕКМ ВР-2799 (ЕксйепсЫа сой, несущая плазмиду, кодирующую СН-271. Дата депозита: 12 мая 1989 г.);
ЕЕКМ ВР-7420 (ЕксйепсЫа сой, несущая плазмиду, кодирующую Н-296. Дата депозита: 12 мая
- 6 012520
1989 г.);
ΕΕΚΜ ВР-1915 (Έδοίιοποίιία сой, несущая плазмиду, кодирующую С-274. Дата депозита: 17 июня 1988 г.);
ΕΕΚΜ ВР-5723 (Е^сНспсЫа сой, несущая плазмиду, кодирующую С-С81. Дата депозита: 5 марта
1990 г.);
ΕΕΚΜ ВР-10073 (ЕхсНспсЫа со11, несущая плазмиду, кодирующую СН-296Ыа. Дата депозита: 23 июля 2004 г.);
ΕΕΚΜ Р-12182 (ЕхсНспсЫа сой, несущая плазмиду, кодирующую СНУ-89. Дата депозита: 8 апреля
1991 г.) и
ΕΕΚΜ Р-12183 (ЕхсНспсЫа сой, несущая плазмиду, кодирующую СНУ-179. Дата депозита: 8 апреля 1991 г.).
Так как фибронектин является гигантским гликопротеидом, нелегко получать и применять встречающийся в природе белок в промышленных целях и в целях получения лекарственного средства. Кроме того, так как фибронектин является многофункциональным белком, нужно учитывать некоторые недостатки, вызванные областью, отличающейся от области, проявляющей эффект, способом согласно настоящему изобретению, в зависимости от условий его применения. По этим причинам предпочтительно в настоящем изобретении может быть использован фрагмент фибронектина, более предпочтительно, если будет использован рекомбинантный фрагмент фибронектина, полученный как описано выше, с точки зрения доступности, простоты обработки и безопасности. Кроме того, особенно предпочтительным будет использование фрагмента фибронектина, который может оказывать такое действие, как увеличение кратности экспансии лимфоцитов, увеличение уровня экспрессии 1Ь-2К в размножаемых лимфоцитах, увеличение относительного содержания СЭ8-позитивных клеток в размножаемой популяции лимфоцитов или увеличение цитотоксической активности, как описано ниже. Кроме того, молекулярная масса фрагмента фибронектина, используемого в настоящем изобретении, составляет, не ограничиваясь указанным, предпочтительно от 1 до 200 кД, более предпочтительно от 5 до 190 кД, еще более предпочтительно от 10 до 180 кД. Молекулярная масса может быть определена, например, путем электрофореза в 8Ό8полиакриламидном геле.
В данном случае в аминокислотной последовательности полипептида, составляющего фрагмент фибронектина согласно настоящему изобретению, неполная аминокислотная последовательность, отличная от аминокислотной последовательности полипептида, составляющего встречающийся в природе фрагмент фибронектина, является произвольной и конкретно не ограничена, при условии, что не ингибируется проявление требуемых эффектов согласно настоящему изобретению.
(2) Способ получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению.
Ниже будет приведено конкретное объяснение способа получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению. Способ согласно настоящему изобретению представляет собой способ получения цитотоксических лимфоцитов, включающий в себя стадию осуществления по меньшей мере одного из следующего: индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов, с использованием среды, содержащей сыворотку и плазму в суммарной концентрации, составляющей не более 5%, в присутствии указанного выше фибронектина, его фрагмента или их смеси.
«Цитотоксические лимфоциты» в используемом в данном описании смысле означают группу клеток, содержащих цитотоксические лимфоциты. В узком смысле в некоторых случаях цитотоксические лимфоциты могут относиться только к цитотоксическим лимфоцитам, находящимся в указанной выше группе клеток. Кроме того, получение цитотоксических лимфоцитов в настоящем изобретении охватывает любое из индукции от клеток-предшественников, которые могут быть преобразованы в цитотоксические лимфоциты согласно настоящему изобретению, до лимфоцитов, обладающих цитотоксической активностью, поддержания цитотоксических лимфоцитов и экспансии цитотоксических лимфоцитов с использованием цитотоксических лимфоцитов и/или клеток-предшественников. В способе получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению вид клеток, подвергаемых обработке способом, условиям культивирования и т. п., соответствующим образом подбирают, чтобы осуществить индукцию, поддержание или экспансию цитотоксических лимфоцитов.
Цитотоксические лимфоциты согласно настоящему изобретению включают, но конкретно не ограничены указанным, например, активируемые лимфокином клетки-киллеры (ЕЛК-клетки), цитотоксические Т-клетки (СТЬ), инфильтрирующие опухоль лимфоциты (Т1Ь), ΝΚ-клетки и т.п., каждая из которых обладает цитотоксической активностью.
В настоящем изобретении клетки-предшественники могут быть преобразованы в цитотоксические лимфоциты, т. е. примером клеток-предшественников, которые обладают способностью к дифференцировке в лимфоциты, являются мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), ΝΚ-клетки, нативные клетки, клетки памяти, гематопоэтические стволовые клетки, мононуклеарные клетки пуповинной крови и т.п. Кроме того, при условии, что клетки являются гемоцитами, клетки могут быть использованы в настоящем изобретении в качестве клеток-предшественников. Любые из указанных клеток, которые собраны из живого организма, могут быть использованы непосредственно, или могут быть использованы клетки, которые хранят замороженными. В этой связи в способе получения цитотоксических
- 7 012520 лимфоцитов согласно настоящему изобретению можно использовать материал, содержащий указанные выше клетки, например кровь, такую как периферическая кровь или пуповинная кровь; материал, полученный удалением компонентов, таких как эритроциты и плазма из крови; костно-мозговую жидкость и т.п.
Один из основных характерных признаков способа получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению состоит в том, что цитотоксические лимфоциты получают в присутствии эффективного ингредиента, выбранного из фибронектина, его фрагмента или их смеси. В данном случае способ получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению осуществляют на протяжении полного периода культивирования цитотоксических лимфоцитов или на протяжении любой части такого периода. Другими словами настоящее изобретение охватывает такие варианты, которые включают в себя указанную выше стадию в виде части стадий получения цитотоксических лимфоцитов.
Кроме того, хотя традиционный способ экспансии цитотоксических лимфоцитов требовал добавления в среду сыворотки и плазмы в концентрации от 5 до 20 об.%, способ получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению отличается тем, что суммарная концентрация сыворотки и плазмы в среде составляет не более 5 об.%. Суммарная концентрация сыворотки и плазмы в среде может предпочтительно составлять не более 4 об.% и особенно предпочтительно не более 3 об.%. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения получение достаточного количества цитотоксических лимфоцитов можно осуществить совсем без добавления сыворотки или плазмы к среде, и является очень полезным способом с точки зрения безопасности или ослабления нагрузки на пациента. Кроме того, в настоящем изобретении в том случае, когда требуется дополнительно уменьшить количество используемой сыворотки и плазмы, количество используемой сыворотки и плазмы можно постепенно уменьшить в середине культивирования. Другими словами количество используемой сыворотки и плазмы может быть уменьшено больше, чем обычно посредством снижения концентрации сыворотки и плазмы в свежей среде, используемой при разведении раствора с культурой клеток, при замене среды или замене оборудования для культивирования клеток, описанных ниже, по отношению к концентрации сыворотки и плазмы в начале культивирования, или не добавляя сыворотку или плазму в свежую среду. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения цитотоксических лимфоцитов, включающему в себя по меньшей мере одну стадию разбавления раствора для культивирования клеток, стадию замены среды или стадию замены оборудования для культивирования клеток, при этом суммарная концентрация сыворотки и плазмы в среде сразу после по меньшей мере одной стадии разбавления раствора для культивирования клеток, стадии замены среды или стадии замены оборудования для культивирования клеток является такой же, как концентрация в начале культивирования или пониженной по сравнению с концентрацией в начале культивирования.
В данном случае источником сыворотки или плазмы может быть любая аутологичная (это означает, что источник используемых цитотоксических лимфоцитов является тем же самым, что и источник клеток-предшественников) сыворотка или плазма или неаутологичная (это означает, что источник используемых цитотоксических лимфоцитов отличается от источника клеток-предшественников) сыворотка или плазма. Предпочтительно можно использовать аутологичную сыворотку или плазму с точки зрения безопасности.
В способе согласно изобретению получение цитотоксических лимфоцитов, т.е. индукцию, поддержание и/или экспансию цитотоксических лимфоцитов обычно осуществляют в среде, содержащей определенные компоненты, в присутствии указанного выше эффективного ингредиента согласно настоящему изобретению.
Например, в способе согласно изобретению в том случае, когда планируется индукция или экспансия цитотоксических лимфоцитов, количество клеток (цитотоксических лимфоцитов и/или клеток предшественников) в начале культивирования в настоящем изобретении конкретно не ограничено. Например, примером количества клеток является от 1 до 1х108 клеток/мл, предпочтительно от 1 до 5х107 клеток/мл и более предпочтительно от 1 до 2х107 клеток/мл. Кроме того, условия культивирования конкретно не ограничены и могут быть использованы обычные условия культивирования клеток. Например, клетки можно культивировать в условиях 37°С в присутствии 5% СО2 и т.п. Кроме того, среду можно разбавлять добавлением свежей среды, среду можно менять или можно менять оборудование для культивирования клеток через соответствующие промежутки времени.
Среда, используемая в способе получения цитотоксических лимфоцитов согласно изобретению, конкретно не ограничена, за исключением суммарной концентрации сыворотки и плазмы, и можно использовать известную среду, получаемую смешиванием компонентов, необходимых для поддержания и роста цитотоксических лимфоцитов или их клеток-предшественников. Например, коммерчески доступная среда может быть соответствующим образом выбрана для применения. Указанные среды могут содержать подходящие белки, цитокины и другие компоненты, кроме составляющих их собственных компонентов. Предпочтительно в настоящем изобретении используют среду, содержащую 1Ь-2. Концентрация 1Ь-2 в среде, например, составляет предпочтительно от 0,01 до 1 х 105 ед./мл, более предпочтительно
- 8 012520 от 0,1 до 1 х 104 ед./мл, но конкретно не ограничена указанными значениями.
В качестве оборудования для культивирования клеток, используемого в способе получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению, например, можно использовать, без ограничения, чашку Петри, флакон, мешок, большую кювету для культивирования, биореактор и т.п. В данном случае в качестве мешка можно использовать проницаемый для газа СО2 мешок для культивирования клеток, как описано в примерах 34-38 и 45-52, приведенных ниже. Кроме того, при промышленном получении большого количества цитотоксических лимфоцитов можно использовать большие кюветы для культивирования. Кроме того, для культивирования можно использовать любую из открытых и закрытых систем. Предпочтительно культивирование осуществляют в закрытой системе с точки зрения безопасности получаемых в результате лимфоцитов.
Кроме того, клетки-предшественники, которые могут быть преобразованы в цитотоксические лимфоциты, можно культивировать совместно в среде, дополнительно содержащей анти-СЭЗ-антитело. Концентрация анти-СЭЗ-антитела в среде составляет, например, предпочтительно от 0,001 до 100 мкг/мл, особенно предпочтительно от 0,01 до 100 мкг/мл, но конкретно не ограничена указанными значениями. Анти-СЭЗ-антитело может быть добавлено с целью активации рецептора на лимфоците. Также кроме указанного выше, может быть добавлен стимулирующий лимфоциты фактор, такой как лектин. Концентрация компонента в среде конкретно не ограничена при условии, что могут быть получены требуемые эффекты.
Кроме одновременного присутствия указанных компонентов, включая эффективный ингредиент согласно настоящему изобретению, в результате растворения компонентов в среде, можно использовать иммобилизацию на соответствующей твердой фазе, например, оборудовании для культивирования клеток (включая любое оборудование в виде открытой системы и закрытой системы), таком как чашка Петри, флакон или мешок, или на носителе для культур клеток, таком как шарики, мембрана или предметное стекло. В данном случае иммобилизацию на шариках можно осуществлять в соответствии с описанием примеров 61 и 62, приведенных ниже, и полученные шарики можно использовать в соответствии с описанием примеров 63 и 64, приведенных ниже. Материалы для таких твердых фаз конкретно не ограничены при условии, что материалы могут быть использованы для культивирования клеток. В том случае, когда компоненты иммобилизуют, например, на указанном выше оборудовании, предпочтительно иммобилизовать определенное количество каждого компонента относительно заданного количества среды, помещаемой в оборудование, так чтобы среда имела соотношение, сходное с требуемой концентрацией в том случае, когда компоненты используют посредством растворения компонентов в среде при помещении среды в оборудование. Количество иммобилизованных компонентов конкретно не ограничено при условии, что могут быть получены требуемые эффекты. Указанный выше носитель используют посредством погружения носителя в культуральную среду в оборудовании для культивирования клеток во время культивирования клеток. Когда указанные выше компоненты иммобилизуют на указанном выше носителе, то при помещении носителя в среду предпочтительно иммобилизовать заданное количество каждого компонента на определенное количество среды, помещаемой в оборудование, так чтобы среда имела соотношение, сходное с требуемой концентрацией в том случае, когда компоненты используют посредством растворения компонентов в среде. Количество иммобилизованных компонентов конкретно не ограничено при условии, что могут быть получены требуемые эффекты.
Например, иммобилизация фрагмента фибронектина может быть осуществлена в соответствии со способами, описанными в \УО 97/18318 и \УО 00/09168.
После того как различные указанные выше компоненты или эффективный ингредиент согласно настоящему изобретению иммобилизуют на твердой фазе, цитотоксические лимфоциты можно легко отделить от эффективного ингредиента или т. п. после того, как лимфоциты получают способом согласно настоящему изобретению, только посредством отделения лимфоцитов от твердой фазы, так что можно предотвратить загрязнение лимфоцитов эффективным ингредиентом.
Кроме того, вместе с указанными выше компонентами можно использовать соединение, выбранное из группы, состоящей из кислых полисахаридов, кислых олигосахаридов, кислых моносахаридов и их солей, которые являются эффективными для индукции цитотоксических Т-клеток, обладающих антигенспецифичной цитотоксической активностью, описанных в XVО 02/14481, или вещество, выбранное из следующих веществ (А)-(О):
(A) вещества, обладающего связывающей активностью в отношении ί.Ό44;
(B) вещества, способного регулировать сигнал, испускаемый при связывании лиганда ί.Ό44 с СЭ44;
(C) вещества, способного ингибировать связывание фактора роста с рецептором фактора роста; и (Ό) вещества, способного регулировать сигнал, испускаемый при связывании фактора роста с рецептором фактора роста.
Примером указанного выше вещества, обладающего связывающей активностью в отношении ί.Ό44. является, например, лиганд ί.Ό44 и/или анти-СО44-антитело. Вещества, способные регулировать сигнал, испускаемый при связывании лиганда ί.Ό44 с СЭ44, включают в себя, например, различные ингибиторы или активаторы фосфоферментов и дефосфорилаз. Вещества, способные ингибировать связывание фактора роста с рецептором фактора роста, включают в себя, например, вещество, обладающее связываю
- 9 012520 щей активностью в отношении фактора роста и образующее комплекс с фактором роста, тем самым ингибирующее связывание фактора роста с рецептором фактора роста, или вещество, обладающее связывающей активностью в отношении рецептора фактора роста, таким образом ингибирующее связывание фактора роста с рецептором фактора роста. Кроме того, вещества, способные регулировать сигнал, испускаемый при связывании фактора роста с рецептором фактора роста, включают в себя, например, различные ингибиторы или активаторы фосфоферментов и дефосфорилаз. Концентрация указанных компонентов в среде конкретно не ограничена, при условии, что могут быть получены требуемые эффекты. Также указанные компоненты можно использовать посредством иммобилизации на соответствующей твердой фазе, как указано выше, кроме одновременного присутствия указанных компонентов в среде при растворении компонентов в среде.
В данном изобретении каждое из указанных выше различных веществ может быть использовано отдельно или в смеси с двумя или несколькими видами.
В настоящем изобретении фраза «в присутствии указанного выше эффективного ингредиента» относится к тому факту, что указанный выше эффективный ингредиент присутствует в таком состоянии, в котором эффективный ингредиент может проявлять свою функцию при осуществлении индукции, поддержания или экспансии цитотоксических лимфоцитов, и способ, обеспечивающий присутствие, конкретно не ограничен. Например, в том случае, когда эффективный ингредиент растворяют в используемой среде, содержание эффективного ингредиента согласно настоящему изобретению в среде, в которой осуществляют культивирование, конкретно не ограничено, при условии, что получают требуемые эффекты. Содержание эффективного ингредиента, например, составляет предпочтительно от 0,0001 до 10000 мкг/мл, более предпочтительно от 0,001 до 10000 мкг/мл, еще более предпочтительно от 0,005 до 5000 мкг/мл, особенно предпочтительно от 0,01 до 1000 мкг/мл.
Когда определяют уровень экспрессии 1Ь-2В для цитотоксических лимфоцитов, полученных способом согласно изобретению, выявляют значимое увеличение уровня экспрессии 1Ь-2В по сравнению с цитотоксическими лимфоцитами, полученными посредством осуществления, по меньшей мере, любого одного из следующих процессов: индукции, поддержания и экспансии, в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси. В данном случае уровень экспрессии 1Ь-2В можно определить известным способом, например, с использованием анти-1Т-2В-антитела.
Как описано выше, цитотоксические лимфоциты, полученные способом согласно изобретению, имеют повышенный уровень экспрессии 1Ь-2В. 1Ь-2В является маркером активации, который экспрессируется на поверхности активированной Т-клетки, и с экспрессией данной молекулы активируется продукция цитокина, цитотоксическая активность, активации пролиферации или пр. Таким образом, цитотоксические лимфоциты, полученные способом согласно изобретению, представляют собой группу клеток, обладающих высокой функциональной активностью.
Кроме того, так как цитотоксические лимфоциты, полученные способом согласно изобретению, имеют повышенный уровень экспрессии 1Б-2Я. то цитотоксические лимфоциты обладают повышенной чувствительностью к стимуляции интерлейкином 1Ь-2, добавляемым в среду, или 1Ь-2, продуцируемым клетками-предшественниками цитотоксических лимфоцитов, самими лимфоцитами или другими совместно существующими клетками. По этой причине цитотоксические лимфоциты могут активировать сами себя даже в окружающей среде с меньшим количеством 1Ь-2 (например, в живом организме или т.п.).
Кроме того, в цитотоксических лимфоцитах, полученных способом согласно изобретению, относительное содержание (СО8-позитивных) клеток, имеющих маркер СЭ8, выше по сравнению с цитотоксическими лимфоцитами, полученными при осуществлении по меньшей мере одного из следующих процессов: индукции, поддержания и экспансии, в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси. Указанный факт имеет некоторые преимущества, например, 1) что СО8-позитивная клетка продуцирует цитокин, такой как интерферон-γ, таким образом вызывая иммунологическую активацию, изменяя баланс Т-хелперных клеток в сторону доминирующей системы ТЫ, 2) что СО8-позитивная клетка является клеткой-иммуноцитом, который может эффективно исключать чужеродное вещество, такое как вирус или опухолевая клетка, 3) что в случае получения СО8-позитивных клеток, можно осуществить обогащение СО8-позитивными клетками с помощью культивирования клеток согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, при этом СО8-позитивные клетки обычным образом очищают с использованием магнитных шариков или проточного цитометра, 4) что цитотоксические лимфоциты соответствующим образом используют в качестве клеток-предшественников во время индукции СТЬ, поскольку относительное содержание СО8-позитивных клеток является высоким, 5) что можно культивировать даже популяцию клеток, имеющую низкое относительное содержание СО8-позитивных клеток, с увеличением относительного содержания СО8-позитивных клетки и пр. Таким образом, способ согласно изобретению особенно применим для получения цитотоксических лимфоцитов.
В данном изобретении относительное содержание СО8-позитивных клеток в цитотоксических лимфоцитах, полученных способом согласно изобретению, можно определить, например, с использованием анти-СЭ8-антитела, но не ограничиваясь указанным.
Кроме того, цитотоксический лимфоцит, полученный согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, имеет прекрасное свойство, заключающееся в том, что высокая цитотоксическая ак
- 10 012520 тивность, которая наблюдалась ранее, сохраняется даже в том случае, когда клетку после культивирования поддерживают в течение длительного периода или когда клетка пролиферирует. Другими словами, цитотоксический лимфоцит сохраняет высокую цитотоксическую активность по сравнению с цитотоксическим лимфоцитом, полученным при осуществлении по меньшей мере одного из процессов: индукции, поддержания и экспансии, в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси. Таким образом, можно поддерживать лимфоциты в виде лимфоцитов, обладающих стабильной цитотоксической активностью, посредством клонирования культивируемых цитотоксических лимфоцитов. Кроме того, индуцированные цитотоксические лимфоциты можно подвергнуть пролиферации и экспансии посредством стимуляции цитотоксических лимфоцитов антигеном, различными видами цитокинов или анти-СЭЗантителом. Можно использовать известный способ для поддержания или экспансии цитотоксических лимфоцитов без конкретного ограничения.
Поддержание указанных выше цитотоксических лимфоцитов относится к поддержанию цитотоксических лимфоцитов с сохранением их цитотоксической активности. Условия культивирования во время поддержания конкретно не ограничены, и можно использовать условия, применяемые для обычного культивирования клеток. Например, клетки можно культивировать в условиях 37°С в присутствии 5% СО2 и т.п. Кроме того, среду можно заменять свежей средой через соответствующие интервалы времени. Используемая среда и другие компоненты, используемые одновременно с ней, и т.п., представляют собой такие же среды и компоненты, которые указаны выше.
Один из основных отличительных признаков поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов в способе согласно изобретению заключается в том, что способ включает в себя, соответственно, непрерывное культивирование и экспансию цитотоксических лимфоцитов в среде, содержащей сыворотку и плазму в суммарной концентрации, составляющей не более 5 об.%, в присутствии эффективного ингредиента согласно изобретению, т.е. фибронектина, его фрагмента или их смеси. Соответственно при экспансии может увеличиваться количество клеток цитотоксических лимфоцитов в состоянии, в котором цитотоксическая активность, присущая цитотоксическим лимфоцитам, сохраняется. Другими словами в качестве одного варианта осуществления способа согласно изобретению предлагается способ экспансии цитотоксических лимфоцитов.
Цитотоксический лимфоцит, получаемый способом согласно изобретению, обладает способностью узнавать требуемую клетку-мишень и, например, разрушать клетку, которая должны быть мишенью, посредством своей цитотоксической активности. Цитотоксическую активность цитотоксических лимфоцитов можно оценить известным способом. Например, цитотоксическую активность цитотоксических лимфоцитов в отношении клеток-мишеней, меченных радиоактивным веществом, флуоресцентным веществом или пр., можно оценить посредством определения радиоактивности или интенсивности флуоресценции клеток-мишеней, разрушенных цитотоксическими лимфоцитами. Цитотоксическую активность также можно выявить посредством определения количества цитокина, такого как СМ-С8Р или ΙΡΝ-γ, специфически высвобождаемого из цитотоксических лимфоцитов или клеток-мишеней. Кроме того, цитотоксическую активность можно непосредственно подтвердить, используя комплекс антигенный пептид-МНС, меченный флуоресцентным красителем и т.п. В данном случае цитотоксическую активность цитотоксического лимфоцита можно, например, оценить в результате контактирования цитотоксического лимфоцита с первым флуоресцентным маркером, связанным с антителом, специфическим в отношении цитотоксического лимфоцита, с последующим контактированием с комплексом антигенный пептид-МНС, связанным со вторым флуоресцентным маркером, и осуществлением анализа РЛС8 (активируемая флуоресценцией сортировка клеток) в отношении присутствия клеток с двойным мечением.
Кроме того, способ получения цитотоксических лимфоцитов согласно изобретению отличается тем, что культивирование можно начинать при небольшом количестве клеток. Для осуществления адоптивной иммунотерапии требуется большое количество лимфоцитов, но большое количество лимфоцитов от пациента трудно получить. Кроме того, при обычной экспансии цитотоксических лимфоцитов требовалось выбирать оборудование для культивирования клеток, имеющее подходящую площадь для культивирования, в зависимости от количества используемых клеток, и требовалось культивирование в соответствующем количестве среды. Другими словами, обычно культивирование начинают в условиях высокой плотности, чтобы количество (число) клеток к площади культивирования в оборудовании для культивирования клеток [т.е. площади (см2) поверхности оборудования, контактирующей со средой] составляло 1х106 клеток/см2 или более, и чтобы концентрация клеток составляла 1х106 клеток/мл или более. При осуществлении культивирования в условиях ниже указанного уровня клеток, кратность экспансии [отношение количества клеток после экспансии к количеству клеток до экспансии (количество клеток после экспансии/количество клеток до экспансии)] становится очень низкой, тем самым требуя длительного периода культивирования, чтобы получить цитотоксические лимфоциты в большом количестве. Поэтому, как правило, большое количество лимфоцитов в настоящее время получают, например, начиная культивирование с использованием небольшого по объему оборудования для культивирования клеток, и затем используя постепенно все большее оборудование для культивирования клеток, или используя способ на основе увеличения количества отдельных единиц оборудования для культивирования кле
- 11 012520 ток и повторения процедур разведения. Как описано выше, требуется множество систем культивирования при обычной экспансии цитотоксических лимфоцитов.
Согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, даже в том случае, когда начинают с небольшого количества клеток, клетки можно культивировать с высокой кратностью экспансии, независимо от размера оборудования для культивирования клеток. Поэтому усложненный процесс, который осуществляли обычно, такой как замена оборудования для культивирования клеток или раствора для культивирования клеток и процессы разбавления раствора для культивирования клеток, становятся ненужными. Другими словами согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, экспансию цитотоксических лимфоцитов можно осуществить в достаточно степени посредством способов культивирования с использования одного оборудования для культивирования клеток, т. е. одной системы для культивирования. Таким образом, согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, можно осуществить способ получения цитотоксических лимфоцитов, который не требует стадии разбавления раствора для культивирования клеток. В особенности в том случае, когда размножают клетки ЬЛК согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, клетки ЬЛК можно размножать посредством добавления клеток-предшественников, которые могут быть преобразованы в клетки ЬЛК, и среды в оборудование для культивирования клеток большого объема, и добавления к ним только 1Ь-2 на последующих стадиях. Настоящее изобретение особенно применимо в том аспекте, что можно получить большое количество клеток ЬЛК простым способом. В данном случае предпочтительно можно использовать фрагмент фибронектина в качестве эффективного ингредиента согласно настоящему изобретению, который необходимо использовать с точки зрения получения более высокой кратности экспансии. Как описано выше, согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, необходимое количество цитотоксических лимфоцитов можно получить в течение более короткого периода времени.
Например, в том случае, когда по меньшей мере один из процессов: индукцию, поддержание и экспансию цитотоксических лимфоцитов начинают при небольшом количестве клеток в оборудовании для культивирования клеток, содержащем среду, в присутствии эффективного ингредиента согласно настоящему изобретению, индукцию, поддержание или экспансию можно осуществлять с использованием количества клеток, удовлетворяющих требованиям, выбранным из следующих требований (а) и (Ь), при низкой концентрации или низкой плотности в начале культивирования:
(a) отношение количества клеток к площади культуры в используемом оборудовании для культивирования клеток предпочтительно составляет от 1 до 5х105 клеток/см2, более предпочтительно от 10 до 1 х 105 клеток/см2, особенно предпочтительно от 1 х 102 до 5х104 клеток/см2; и (b) концентрация клеток в среде предпочтительно составляет от 1 до 5х105 клеток/мл, более предпочтительно от 10 до 1х105 клеток/мл и особенно предпочтительно от 1х102 до 5х 104 клеток/мл.
Термин «количество клеток» в используемом в данном описании смысле относится к количеству цитотоксических лимфоцитов и/или клеток-предшественников.
Кроме того, в случае способа согласно изобретению примером может быть способ, включающий в себя осуществление по меньшей мере одного из процессов: индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов в системе культивирования, который не требует стадии разбавления раствора для культивирования клеток.
Кроме того, способ получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению отличается тем, что культивирование также можно осуществлять при большом количестве клеток. Другими словами, в том случае, когда способ получения цитотоксических лимфоцитов в оборудовании для культивирования клеток, содержащем среду, включает в себя по меньшей мере одну стадию разбавления раствора для культивирования клеток свежей средой, стадию замены среды или стадию замены оборудования для культивирования клеток во время культивирования, даже когда сразу после указанных стадий устанавливаются условия культивирования в виде высокой концентрации (например, концентрация клеток в растворе для культивирования клеток составляет от 2х105 до 1х 108 клеток/мл, предпочтительно от 2х105 до 5х107 клеток/мл, более предпочтительно от 2х105 до 2х107 клеток/мл) или высокой плотности (например, отношение количества клеток в растворе для культивирования клеток к площади культуры в оборудовании для культивирования клеток составляет от 1 х 105 до 1х 108 клеток/см2, предпочтительно от 1х105 до 5х107 клеток/см2, более предпочтительно от 1х105 до 2х107 клеток/см2), способ согласно настоящему изобретению может достигать хорошей кратности экспансии по сравнению с кратностью экспансии при обычном способе. При обычной экспансии цитотоксических лимфоцитов количество клеток в начале культивирования устанавливают в виде сравнительно высокой концентрации или высокой плотности, и концентрацию клеток в растворе для культивирования клеток или плотность клеток в оборудовании для культивирования клеток устанавливают на низком уровне в соответствии с увеличением коэффициента пролиферации клеток. При установлении концентрации клеток или плотности клеток во время культивирования культура с большим количеством клеток согласно настоящему изобретению относится к получению цитотоксических лимфоцитов, при котором условия устанавливают в виде высокой концентрации или высокой плотности, при этом концентрация клеток в растворе для культивирования клеток составляет от 2х105 до 1 х 108 клеток/мл, или отношение количества клеток в растворе для культи
- 12 012520 вирования клеток к площади культуры в оборудовании для культивирования клеток составляет от 1 х 105 до 1 х 108 клеток/см2. В используемом в данном описании смысле выражение «сразу после стадии разбавления раствора для культивирования клеток свежей средой, стадии замены среды или стадии замены оборудования для культивирования клеток» не включает в себя начало культивирования.
Преимущества возможности осуществлять культивирование при большом количестве клеток, как описано выше, включают уменьшение количества среды, добавок в среду, таких как сыворотка и плазма, используемого оборудования для культивирования клеток, трудовых затрат и пространства для культивирования. Для адоптивной иммунотерапии необходимо большое количество лимфоцитов, при этом требуется очень большое количество среды или используемого оборудования для культивирования клеток. Соответственно, требуется большое пространство для культивирования и большие трудозатраты. Вышесказанное представляет собой большую проблему для распространения адоптивной иммунотерапии. Поэтому, так как способ согласно изобретению может решить проблему, которая описана выше, то он представляет собой очень творческое изобретение, относящееся к обеспечению или использованию возможностей.
Как описано выше, способ согласно изобретению может быть применим для любой культуры клеток при низкой концентрации или низкой плотности, или для культуры клеток при высокой концентрации или высокой плотности. Таким образом, применение способа согласно изобретению дает возможность получения цитотоксических лимфоцитов при различных концентрациях клеток или плотностях клеток, в зависимости от условий культивирования.
Кроме того, в способе согласно изобретению клетки можно культивировать совместно с подходящими питающими клетками. Когда цитотоксические лимфоциты культивируют совместно с питающими клетками, желательно, чтобы среда представляла собой среду, которая подходит для поддержания и роста как цитотоксических лимфоцитов, так и питающих клеток. В качестве среды можно использовать коммерчески доступную среду.
Питающие клетки, используемые в способе согласно изобретению, конкретно не ограничены при условии, что питающие клетки стимулируют цитотоксические лимфоциты вместе с анти-СП3-антителом, активируя рецептор Т-клеток. В настоящем изобретении используют, например, РВМС или В-клетки, трансформированные вирусом Эпштейн-Барр (клетки ЕВУ-В). Обычно питающие клетки используют после того, как удаляют их способность к пролиферации с помощью облучения и пр. В этой связи содержание питающих клеток в среде можно определить согласно известному способу. Например, содержание предпочтительно составляет от 1 х 105 до 1 х 107 клеток/мл.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в качестве питающих клеток используют неинфицированные вирусом клетки, например клетки, отличные от клеток ЕВУВ. При использовании неинфицированных вирусом клеток исключается возможность того, что клетки ЕВУ-В смешиваются с размножаемыми цитотоксическими лимфоцитами, что дает возможность повысить безопасность медицинского лечения с использованием цитотоксических лимфоцитов, такого как адоптивная иммунотерапия.
Кроме того, в способе согласно изобретению клетки также можно культивировать совместно с подходящими антигенпрезентирующими клетками. Антигенпрезентирующие клетки могут быть получены добавлением антигенного пептида к клеткам, обладающим антигенпрезентирующей способностью, таким образом обеспечивая возможность для презентации клетками антигенного пептида на поверхности [см., например, Вепбпагек М.А., е1 а1., 1. 1ттипо1., 147(12), 4047-4053 (1991)]. Кроме того, в том случае, когда клетки, обладающие антигенпрезентирующей способностью, обладают способностью процессировать антиген, к клеткам добавляют антиген, при этом антиген внедряется в клетки и там процессируется, и фрагментированные антигенные пептиды презентируются на клеточной поверхности. В этой связи в том случае, когда антигенный пептид добавляют к клеткам, обладающим антигенпрезентирующей способностью, используют антигенный пептид, соответствующий ограничению по МНС, или антигенный пептид, который не ограничен МНС используемых антигенпрезентирующих клеток и индуцируемыми цитотоксическими лимфоцитами.
Кстати, антиген, используемый в настоящем изобретении, конкретно не ограничен, и включает в себя, например, экзогенные антигены, такие как бактерии и вирусы, эндогенные антигены, такие как связанные с опухолями антигены (раковые антигены), и пр.
В настоящем изобретении предпочтительно антигенпрезентирующие клетки делают неспособными к пролиферации. Чтобы получить непролиферирующие клетки, например, можно подвергать клетки облучению рентгеновскими лучами и пр. или обработке таким агентом, как митомицин.
Когда получают клетки БАК способом получения согласно изобретению, культивирование клеток БАК осуществляют посредством инкубации клеток-предшественников, которые могут быть преобразованы в клетки БАК, вместе с 1Б-2 в присутствии указанного выше эффективного ингредиента. Клеткипредшественники, которые могут быть преобразованы в БАК-клетки, включают в себя, не ограничиваясь указанным, например, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), клетки ΝΕ, мононуклеарные клетки пуповинной крови, гематопоэтические стволовые клетки, компоненты крови, содержащие
- 13 012520 указанные клетки, и т. п.
Кроме того, общие условия культивирования клеток ЬЛК могут быть созданы в соответствии с известными условиями [например, см. 8а1Ьо Кодаки (Се11 ТесЬпо1оду), 14(2), 223-227, (1995); 8шЬо Ва1уо (Се11 СиНиге) 17(6), 192-195, (1991); ТНЕ ЬЛЫСЕТ, 356, 802-807, (2000); Сиггеп! РЮосоН ίη НппнпкНоду. 8ирр1етепР 17, ЬМТ 7.7], за исключением того, что используют указанную выше среду. Условия культивирования конкретно не ограничены, и можно применять условия, которые используют при обычном культивировании клеток. Например, культивирование можно осуществлять в условиях 37°С в присутствии 5% СО2 и т.п. Указанное совместное культивирование обычно осуществляют в течение примерно от 2 до 15 дней. Кроме того, можно осуществлять стадию разбавления раствора для культивирования клеток, стадию замены среды или стадию замены оборудования для культивирования клеток через соответствующие промежутки времени.
В отношении СТЬ и ТГЬ таким же способом, как способы указанной выше индукции, поддержания или экспансии клеток ЬЛК, может быть получена группа клеток, обладающих высокой цитотоксической активностью, посредством культивирования клеток в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси. В настоящем изобретении не существует конкретного ограничения способов активации указанных клеток, при условии, что одновременно присутствует фибронектин, его фрагмент или их смесь, и используют среду, содержащую сыворотку и плазму в суммарной концентрации, составляющей не более 5 об.%. Способы могут быть осуществлены с использованием среды, подходящей для культивирования или активации указанных выше клеток. Что касается используемого количества фибронектина, его фрагмента или их смеси, способа добавления компонента и т.п., то подходящие количества и способы могут быть выбраны в соответствии с указанным выше способом.
В данном случае способ экспансии цитотоксических лимфоцитов согласно изобретению конкретно не ограничен при условии, что указанный выше эффективный ингредиент присутствует в системе культивирования, используемой в способе, и суммарная концентрация сыворотки и плазмы в среде составляет не более 5 об.%. Настоящее изобретение охватывает такие варианты, в которых указанный выше эффективный ингредиент присутствует с системе культивирования и в которых суммарная концентрация сыворотки и плазмы в среде составляет не более 5 об.% при обычном способе экспансии цитотоксических лимфоцитов, отличном от способов, описанных выше. Примерами заболеваний, при которых вводят цитотоксические лимфоциты, полученные способом согласно настоящему изобретению, являются без конкретного ограничения, например, рак, злокачественная опухоль, гепатит или инфекционные болезни, такие как грипп, вызванные вирусом, бактериями или грибами. Кроме того, в случае дополнительного внедрения чужеродного гена, как описано ниже, также могут ожидаться эффекты по отношению к различным генетическим заболеваниям. Цитотоксические лимфоциты, полученные способом согласно настоящему изобретению, также можно использовать для инфузии донорских лимфоцитов и т.п. с целью профилактики инфекционного заболевания после трансплантации костного мозга или рентгеновского облучения.
В другом варианте осуществления изобретения предлагается среда для культивирования цитотоксических лимфоцитов, содержащая в качестве эффективного ингредиента фибронектин, его фрагмент или их смесь, при этом суммарная концентрация сыворотки и плазмы в среде составляет не более 5 об.%. Среда, кроме того, содержит другой необязательный ингредиент, например, компонент среды, белок и цитокин (предпочтительно ГЬ-2), которые используют для известной культуры клеток, и другие требуемые компоненты. В данном изобретении среда может быть получена известным способом с использованием эффективного ингредиента согласно настоящему изобретению и аутологичной или неаутологичной сыворотки или плазмы, так, чтобы суммарная концентрация в среде составляла не более 5 об.%. Содержание эффективного ингредиента согласно изобретению и т.п. в среде конкретно не ограничена, при условии, что могут быть получены требуемые эффекты согласно изобретению. Содержание при необходимости можно соответствующим образом определить, например, в соответствии с содержанием эффективного ингредиента и т.п. в указанной выше среде, используемой в способе согласно изобретению. Одним из вариантов среды согласно изобретению является среда, содержащая носитель для культуры клеток, на котором иммобилизован фибронектин, его фрагмент или их смесь, и среда, находящаяся в оборудовании для культивирования клеток, на котором иммобилизован фибронектин, его фрагмент или их смесь.
Обычно к культуре, содержащей лимфоциты, полученной с использованием способа получения цитотоксических лимфоцитов, который описан выше, примешивают другие клетки, отличные от цитотоксических лимфоцитов, такие как хелперные Т-клетки. Однако так как лимфоциты, обладающие цитотоксической активностью, находятся в большом количестве в культуре, содержащей лимфоциты, полученной согласно изобретению, то культивируемые клетки могут быть собраны из культуры центрифугированием или подобным способом и непосредственно использованы в качестве цитотоксических лимфоцитов, полученных способом согласно изобретению. Кроме того, если указанный выше эффективный ингредиент или т.п. иммобилизуют на оборудовании для культивирования клеток или т.п., не существует риска смешивания компонента или т. п. с полученными в результате цитотоксическими лимфоцитами.
Кроме того, популяция клеток (или культура), обогащенная цитотоксическими лимфоцитами, мо
- 14 012520 жет быть далее отделена от культуры известным способом и использована в качестве цитотоксических лимфоцитов, полученных способом согласно настоящему изобретению. Другими словами способ получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению может включать в себя стадию отбора популяции клеток, обогащенной цитотоксическими лимфоцитами, из культуры, полученной данным способом.
Способ отбора популяции клеток, обогащенной цитотоксическими лимфоцитами, конкретно не ограничен. Примером способа является, например, способ, включающий в себя селективный сбор только требуемых клеток из культуры с использованием оборудования для культивирования клеток или носителя, с которым связано антитело против поверхностного антигена клетки, экспрессированного на поверхности требуемой клетки, например, анти-С'О8-антитело. или способ с использованием проточного цитометра. Примером указанного выше носителя являются магнитные шарики или колонка. Кроме того, популяцию клеток, обогащенную требуемыми клетками, можно получить удалением посредством адсорбции других клеток, отличных от требуемых клеток, из культуры. Например, хелперные Т-клетки можно удалить из культуры лимфоцитов с использованием антитела против поверхностного антигена клетки, экспрессированного на поверхности хелперных Т-клеток, например, анти-С'О4-антитела. На указанной стадии также можно использовать проточный цитометр.
Кроме того, настоящее изобретение относится к цитотоксическому лимфоциту, полученному способом получения цитотоксического лимфоцита согласно настоящему изобретению, указанному выше. Лимфоцит обладает высокой цитотоксической активностью, которая отличается тем, что происходит незначительное снижение цитотоксической активности даже когда лимфоциты подвергают непрерывному культивированию или экспансии в течение длительного периода времени. Кроме того, настоящее изобретение относится к лекарственному средству (терапевтическому средству), содержащему лимфоцит в качестве эффективного ингредиента. Особенно полезно применение указанного выше терапевтического средства, содержащего лимфоцит, в адоптивной иммунотерапии. В адоптивной иммунотерапии лимфоциты, обладающие цитотоксической активностью, подходящие для лечения пациента, вводят пациенту, например, посредством внутривенного введения. Терапевтическое средство очень полезно для применения при указанных выше заболеваниях или при инфузии лимфоцитов доноров. Терапевтическое средство может быть получено, например, путем смешивания лимфоцитов, полученных способ согласно изобретению, в качестве эффективного ингредиента, например, с известным органическим или неорганическим носителем, подходящим для неперорального введения, эксципиентом, стабилизатором и пр. согласно способу, известному в области фармации. В этой связи различные условия для терапевтического средства, такие как содержание лимфоцитов согласно изобретению в терапевтическом средстве и доза терапевтического средства, могут быть соответствующим образом определены в соответствии с известной адоптивной иммунотерапией.
Способ получения цитотоксического лимфоцита согласно изобретению, кроме того, может включать в себя стадию трансдукции чужеродного гена в лимфоцит. Другими словами, один вариант осуществления изобретения относится к способу получения цитотоксического лимфоцита, дополнительно включающему в себя трансдукцию чужеродного гена в цитотоксический лимфоцит. В данном случае термин «чужеродный» относится к тому, что является чужеродным по отношению к лимфоциту, в который необходимо трансдуцировать ген.
При осуществлении способа получения цитотоксических лимфоцитов согласно изобретению, особенно способа экспансии цитотоксических лимфоцитов, усиливают способность культивируемых лимфоцитов к пролиферации. Поэтому посредством комбинирования способа получения цитотоксических лимфоцитов согласно настоящему изобретению со стадией трансдукции гена, предполагают увеличение эффективности трансдукции гена.
Способы трансдукции чужеродного гена конкретно не ограничены, и подходящий способ может быть выбран из известных способов трансдукции гена. Стадия трансдукции гена может быть осуществлена в любой заданной точке во время получения цитотоксических лимфоцитов. Например, с точки зрения производительности предпочтительно осуществление стадии одновременно с любой стадией из указанных выше стадий индукции, поддержания и/или экспансии лимфоцитов или после стадии.
В качестве указанного выше способа трансдукции гена в настоящем изобретении можно применять любой из способов с использованием вирусного вектора и способы без использования вектора. Подробное описание указанных способов уже опубликовано в многочисленной литературе.
Указанный выше вирусный вектор конкретно не ограничен, и используют известный вирусный вектор, обычно применяемый в способе трансдукции гена, например, ретровирусный вектор, лентивирусный вектор, аденовирусный вектор, аденоассоциированный вирусный вектор, вектор на основе вируса обезьян, вектор на основе вируса вакцинии, вектор на основе вируса Сендай или т.п. Особенно предпочтительно в качестве вирусного вектора используют ретровирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус или вирус обезьян. В качестве указанного выше вирусного вектора предпочтительны векторы, не обладающие способностью к репликации, для того чтобы вирусный вектор не мог самореплицироваться в инфицированной клетке.
Ретровирусный вектор используют в целях генной терапии и т.п., поскольку можно стабильно вне
- 15 012520 дрить чужеродный ген, встроенный в вектор, в хромосомную ДНК в клетке, в которую трансдуцируют вектор. Так как вектор обладает высокой эффективностью инфицирования клеток во время митоза и пролиферации, то трансдукцию гена предпочтительно осуществляют на стадии получения цитотоксических лимфоцитов, например, на стадии экспансии.
В качестве способа трансдукции гена без использования вирусного вектора можно, например, применять без конкретного ограничения способ с использованием носителя, такого как липосома или лиганд-полилизин, способом на основе фосфата кальция, способом электропорации, способом с применением «ушки» для частиц и пр. В данном случае трансдуцируют чужеродный ген, включенный в плазмидную ДНК или линейную ДНК.
Чужеродный ген, трансдуцируемый в цитотоксические лимфоциты, в настоящем изобретении конкретно не ограничен, и можно выбрать произвольный ген, который требуется трансдуцировать в указанные выше клетки. В качестве описанного выше гена кроме гена, кодирующего белок (например, фермент, цитокин, рецептор или т.п.), можно использовать, например, ген, кодирующий антисмысловую нуклеиновую кислоту, к|КУА (малую интерферирующую РНК) или рибозим. Кроме того, одновременно можно трансдуцировать подходящий маркерный ген, который обеспечивает возможность селекции клеток, в которые трансдуцируют ген.
Указанный выше чужеродный ген, например, можно встроить в вектор, плазмиду или т.п., так чтобы экспрессировать чужеродный ген под контролем подходящего промотора, и использовать. Кроме того, чтобы добиться эффективной транскрипции гена, в векторе может существовать другой регуляторный элемент, который действует совместно с промотором или сайтом инициации транскрипции, например, последовательность энхансера или последовательность терминатора. Кроме того, с целью встраивания чужеродного гена в хромосому лимфоцита, в который трансдуцируют ген, посредством гомологичной рекомбинации чужеродный ген, например, может быть расположен между фланкирующими последовательностями, содержащими нуклеотидные последовательности, каждая из которых обладает гомологией с нуклеотидными последовательностями, расположенными по обеим сторонам требуемого для инсерции сайта-мишени гена в хромосоме. Трансдуцируемым чужеродным геном может быть ген, который встречается в природе, или искусственно созданный ген, или ген, в котором молекулы ДНК, имеющие разное происхождение, связаны известными способами, такими как лигирование. Кроме того, чужеродным геном может быть ген, имеющий последовательность, в которой введена мутация в последовательности, встречающейся в природе, в зависимости от цели.
Согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, например, можно трансдуцировать ген, кодирующий фермент, связанный с резистентностью к лекарственному средству, используемому для лечения пациента со злокачественной опухолью или т.п. заболеванием, в цитотоксические лимфоцит, таким образом, придавая лимфоциту резистентность к лекарственному средству. Если применяют описанные выше цитотоксические лимфоциты, то можно комбинировать адоптивную иммунотерапию и лекарственную терапию и таким образом можно получить более высокие терапевтические эффекты. Примером гена резистентности к лекарственному средству является, например, ген множественной резистентности.
С другой стороны, в отличие от указанного выше варианта в цитотоксический лимфоцит может быть трансдуцирован ген для того, чтобы придать чувствительность к конкретному лекарственному средству, таким образом, придавая чувствительность к лекарственному средству. В данном случае лимфоциты после трансплантации в живой организм могут быть удалены с помощью введения лекарственного средства. Примером гена для придания чувствительности к лекарственному средству является, например, ген тимидинкиназы.
(3) СН-296№1.
В настоящем изобретении также предлагается новый полипептид, имеющий аминокислотную последовательность (а), показанную в 8ЕЦ ГО N0: 25 (СН-296№1) в списке последовательностей, или полипептид, имеющий аминокислотные последовательности (Ь), содержащие делецию, инсерцию, присоединение или замену одной или большого количества аминокислот в аминокислотной последовательности (а), при этом полипептид, имеющий аминокислотную последовательность (Ь), обладает функцией, эквивалентной функции полипептида, имеющего аминокислотную последовательность (а), и нуклеиновая кислота, кодирующая новый полипептид. Примером нуклеиновой кислоты является нуклеиновая кислота, содержащая (1) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в 8ЕЦ ГО N0: 26 (нуклеиновая кислота, кодирующая СН-296№); (2) ДНК, кодирующую полипептид, содержащую нуклеотидную последовательность, имеющую делецию, замену, инсерцию или присоединение одной или большого количества нуклеотидов в нуклеотидной последовательности, показанной в 8ЕЦ ГО N0: 26, при этом полипептид обладает функцией, эквивалентной функции полипептида, кодируемого ДНК (1); или (3) ДНК, которая гибридизуется с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, показанную в 8Е0 ГО N0: 26, в жестких условиях, которая кодирует полипептид, обладающий функцией, эквивалентной функции полипептида, кодируемого ДНК (1).
В некоторых случаях в настоящем описании новый полипептид называют полипептидом согласно настоящему изобретению, и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, называют нуклеиновой
- 16 012520 кислотой согласно настоящему изобретению.
В дальнейшем будет описан полипептид согласно изобретению, нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, и способ получения полипептида.
Полипептид согласно изобретению включает в себя полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько замен, делеций, инсерций или присоединений одной или большого количества аминокислот в указанной выше аминокислотной последовательности, при условии, что полипептид обладает любой из требуемых функций [функции согласно указанным выше пунктам (ί)-(ίν)] при получении цитотоксических лимфоцитов, как указано выше. Примером другого полипептида согласно настоящему изобретению, отличного от СН-296Ыа, является полипептид, имеющий одну или несколько из замен, делеций, инсерций или присоединений предпочтительно от 1 до 20 аминокислот, более предпочтительно от 1 до 10 аминокислот и еще более предпочтительно от 1 до 5 аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в 8Ε0 ΙΌ N0: 25 в списке последовательностей. В данном случае замену аминокислоты или т.п. можно осуществить в такой степени, чтобы можно было изменить физико-химические свойства и т.п., присущие полипептиду, в таких пределах, при которых может быть сохранена функция полипептида. Подробности и способ получения полипептида описаны выше.
Нуклеиновая кислота, показанная в виде последовательности 8ΕΩ ΙΌ N0: 26 в списке последовательностей, кодирующая полипептид согласно настоящему изобретению, может быть получена в виде фрагмента ДНК, кодирующего СН-296№1. посредством осуществления ПЦР с использованием в качестве матрицы кДНК, кодирующей фибронектин человека, полученный из плазмы. Праймер, используемый в ПЦР, конкретно не ограничен. Например, в качестве праймера можно использовать праймер СН-296№11 или праймер СН-296№2, показанные в 8ΕΩ ΙΌ N0: 27 или 28 в списке последовательностей. Кроме того, нуклеиновую кислоту можно получить связыванием плазмиды указанного выше ΕΕΚΜ ВР-2800 (Εδс11спе1иа со§1, несущая плазмиду, кодирующую СН-296) и фрагмента ДНК, имеющего последовательность, которая присутствует между доменом, связывающим клетки, и гепаринсвязывающим доменом нативного фибронектина, полученного из плазмы (повторяющаяся последовательности типа III, 11 на фиг. 1), с использованием подходящего сайта рестрикции.
Кроме того, к нуклеиновым кислотам согласно настоящему изобретению также относится нуклеиновая кислота, имеющая одну или несколько замен, делеций, инсерций или присоединений одного или большого количества нуклеотидов в нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в 8Ε0 ΙΌ N0: 26 в списке последовательностей. Например, примером нуклеиновой кислоты является нуклеиновая кислота, имеющая одну или несколько замен, делеций, инсерций или присоединений от 1 до 60 нуклеотидов, более предпочтительно от 1 до 30 нуклеотидов, еще более предпочтительно от 1 до 15 нуклеотидов в нуклеотидной последовательности, показанной в 8Ε0 ΙΌ N0: 26 в списке последовательностей. В данном случае замену нуклеотида или подобное можно осуществить в такой степени, чтобы можно было изменить физико-химические свойства и т.п. полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, в таких пределах, при которых может быть сохранена функция полипептида. Подробности и способ замены нуклеотида или т.п. соответствуют описанию указанной выше замены аминокислоты или т. п.
Кроме того, к нуклеиновым кислотам согласно изобретению относится нуклеиновая кислота, которая гибридизуется с нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, показанную в 8Ε0 ΙΌ N0: 26, в жестких условиях, и которая кодирует полипептид, обладающий функцией, эквивалентной функции полипептида согласно настоящему изобретению, т.е., по меньшей мере, любой из функций по пунктам (ί)-(ίν) при получении цитотоксических лимфоцитов, указанных выше. «Жесткие условия» конкретно не ограничены и могут быть установлены посредством соответствующего определения температуры и концентрации соли при гибридизации, предпочтительно дополнительно при промывке, в зависимости от ДНК, которая гибридизуется с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, показанную в 8Ε0 ΙΌ N0: 26. Жесткие условия включают в себя, например, условия, описанные в литературе, такой как 8атЬгоок с( а1., Мо1еси1аг с1оши§, А 1аЬога1огу тапиа1 3'1 еййюи, 2001, опубликованной 8ргт§ НагЬог ЬаЬога1огу Рге§8.
В частности, примером жестких условий является, например, инкубация при 50°С, предпочтительно при 65°С в растворе, содержащем 6х88С (1х88С представляет собой 0,15 М №С1, 0,015 М цитрат натрия, рН 7,0), 0,5% 8Ό8, 5х раствор Денхардта (0,1% бычий сывороточный альбумин (БСА), 0,1% поливинилпирролидон, 0,1% фикол 400) и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося. Когда известно значение Тт используемой ДНК, указанная выше температура может быть ниже, чем данное значение на 5-12°С. Кроме того, могут быть добавлены такие условия, как осуществление стадии удаления ДНК, гибридизующейся неспецифически, посредством промывки, при этом с точки зрения повышения точности промывку осуществляют в условиях, например, 2х88С, более жестко 0,1х88С и т.п. и/или в условиях более высокой температуры, такой как 25°С или выше, более жесткие условия при 37°С или выше, еще более жесткие условия 42°С или выше, еще более жесткие условия 50°С или выше, варьирующих в зависимости от значения Тт используемой ДНК.
- 17 012520
Настоящее изобретение также охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с полинуклеотидом согласно настоящему изобретению в условиях более низкой жесткости. Варьирование жесткости гибридизации и регистрации сигнала осуществляют, главным образом манипулируя концентрацией формамида (более низкое процентное содержание формамида приводит к пониженной жесткости), концентрацией соли или температурой. Например, менее жесткие условия включают инкубацию в течение ночи при 37°С в растворе, содержащем 6х88РЕ (20х88РЕ=3 М ЫаС1; 0,2 М ЫаН2РО4; 0,02 М ΕΌΤΑ, рН 7,4), 0,5% 8Ό8, 30% формамид, 100 мкг/мл блокирующей ДНК спермы лосося; с последующей промывкой 1х88РЕ и 0,1% 8Ό8 при 50°С. Кроме того, чтобы осуществить менее жесткие условия, промывку, проводимую после жесткой гибридизации, можно осуществлять при более высокой концентрации соли (например, 5х88С).
Указанные выше условия могут быть модифицированы добавлением и/или заменой альтернативным блокирующим реагентом, используемым для подавления фона в эксперименте по гибридизации. Обычный блокирующий реагент включает в себя реагент Денхардта, ВЬОТТО, гепарин, денатурированную ДНК спермы лосося и коммерчески доступный препарат. Кроме того, в некоторых случаях для модификации необходимы другие элементы, отличные от указанных выше условий гибридизации, в зависимости от такой модификации.
С другой стороны, полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕО ГО ΝΌ: 25 в списке последовательностей, можно получить способом генетической инженерии, используя полученную нуклеиновую кислоту. Другими словами, полипептид может быть получен встраиванием нуклеиновой кислоты в подходящий экспрессирующий вектор, включая, но конкретно не ограничивая указанным, вектор рЕТ, вектор рСо1й и т.п., чтобы экспрессировать полипептид известным способом, например, в Εδοίιοποίιία со11 или т.п.
Примеры
Настоящее изобретение будет более конкретно описано с помощью примеров, которые никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Пример получения 1. Получение фрагмента фибронектина.
(1) Получение фрагмента фибронектина.
Н-271, фрагмент, происходящий из фибронектина человека, получали из ЕксЕепсЫа сой ΗΒ101/ρΗΌ101 (ЕЕКМ ВР-2264) согласно способу, описанному в патенте США № 5198423.
Кроме того, Н-296, СН-271 и СН-296, фрагменты, происходящие из фибронектина человека, каждый получали из культуры. Полученной культивированием ЕксЬепсЫа со11 ΗΒ101/ρΗΌ102 (ЕЕКМ ВР7420), ЕксЕепсЫа соИ НВ101/рСН101 (ЕЕКМ ВР-2799) или ЕзсЕепсЫа со11 НВ101/рСН102 (ЕЕКМ ВР2800) согласно способу, описанному в указанном выше издании.
С-274, фрагмент, происходящий из фибронектина человека, получали из культуры, получаемой культивированием ЕксЬепсЫа со11 !М109/рТЕ7221 (ЕЕКМ ВР-1915) согласно способу, описанному в патенте США № 5102988.
С-С81, фрагмент, происходящий из фибронектина человека, получали из культуры, получаемой культивированием Е^сНепсЫа со11 НВ101/рС825 (ЕЕКМ ВР-5723) согласно способу, описанному в публикации патента Японии № 3104178.
СНУ-89 и СНУ-179, фрагменты, происходящие из фибронектина человека, каждый получали из культуры, получаемой культивированием Е^сНепсЫа со11 НВ101/рСНУ89 (ЕЕКМ Р-12182) или Е§сНепсЫа со11 НВ101/рСНУ179 (ЕЕКМ Р-12183) согласно способу, описанному в публикации патента Японии № 2729712.
Кроме того, СНУ-90, фрагмент, происходящий из фибронектина человека, получали согласно способу, описанному в публикации патента Японии № 2729712. Конкретно, конструировали плазмиду рСНУ90 согласно способам, описанным в публикации, и затем культивировали трансформант, несущий плазмиду, и СНУ-90 получали из культуры.
СНУ-181, фрагмент, происходящий из фибронектина человека, получали конструированием плазмиды (рСНУ181), содержащей ДНК, кодирующую СНУ-181, согласно способу, описанному в VО 97/18318, затем культивируя ЕксЬепсЫа со11 НВ101/рСНУ181, в которую была введена плазмида, и получая фрагмент из культуры таким же образом, как в случае указанного выше СНУ-179.
(2) Получение СНУ-92.
Что касается рСНУ181, плазмиды для экспрессии указанного выше полипептида СНУ-181, то конструировали плазмиду СНУ92, имеющую делецию области, кодирующей область ΙΙΙ-13 в области, кодирующей СНУ-181. Способы делеции осуществляли в соответствии со способами делеции области, кодирующей ΙΙΙ-14, из плазмиды рСНУ179, которые описаны в публикации патента Японии № 2729712.
Культивировали ЕксЬепсЫа со11 НВ101, трансформированные указанной выше плазмидой рСНУ92 (ЕксЬепсЫа со11 НВ101/рСНУ92), и способы очистки осуществляли согласно способу очистки полипептида СНУ-89, описанному в публикации патента Японии № 2729712, чтобы получить очищенный препарат СНУ-92 из полученной в результате культуры.
(3) Получение Н-275-Сук.
- 18 012520
Конструировали плазмиду для экспрессии полипептида Н-275-Суз согласно следующим способам. Конкретно плазмиду рСН102 получали из ЕзсйейсЫа сой НВ101/рСН102 (РЕЕМ ВР-2800). Осуществляли ПЦР с использованием праймера 128, имеющего нуклеотидную последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 21 в списке последовательностей, и праймера 14А, имеющего нуклеотидную последовательность, показанную в 8ЕЭ ΙΌ N0: 22 в списке последовательностей, с указанной выше плазмидой в качестве матрицы, получая фрагмент ДНК фрагмент длиной примерно 0,8 т.п.о., кодирующий гепаринсвязывающий домен фибронектина. Полученный в результате фрагмент ДНК расщепляли №о1 и ВатН1 (оба производства ТАКАКА ΒΙΟ ΙΝΟ). и затем лигировали с ρΤν118Ν (производства ТАКАКА ΒΙΟ ΙΝΟ). которая была расщеплена №οΙ и ВатШ, чтобы сконструировать плазмиду рКН1.
Плазмидный вектор ρΙΝΙΙΙ-отрА! [СйтауеЬ Р, с1 а1., ЕМВ0 Р, 3(10), 2437-2442 (1984)] расщепляли ВатШ и НтсП (производства ТАКАКА ВЮ ΙΝΒ), чтобы собрать фрагмент ДНК длиной примерно 0,9 т.п.о., содержащий область терминатора липопротеида. Полученный фрагмент смешивали и лигировали с указанной выше плазмидой рКН1, которая была расщеплена ВатШ и Ηίηάί, получая плазмиду рКН1-Т, содержащую промотор 1ас, фрагмент ДНК, кодирующий гепаринсвязывающий домен, и терминатор липопротеида в указанном порядке.
Реакцию ПЦР осуществляли, используя праймер Суз-А, имеющий нуклеотидную последовательность, показанную в 8ЕЭ ΙΌ ΝΟ: 23 в списке последовательностей, и праймер Суз-8, имеющий нуклеотидную последовательность, показанную в 8ЕЭ ΙΌ ΝΟ: 24 в списке последовательностей, с указанной плазмидой рКН1-Т в качестве матрицы. Затем собранный амплифицированный фрагмент ДНК расщепляли ферментом ΝοΐΙ (производства ТАКАКА ВЮ ΙΝΒ), и затем фрагмент ДНК фрагмент подвергали самолигированию. Полученную таким образом циклическую ДНК расщепляли 8ρеI и 8саI (производства ТАКАКА ВЮ ΙΝΒ), получая фрагмент ДНК длиной 2,3 т.п.о., и полученный в результате фрагмент смешивали и лигировали с фрагментом ДНК фрагмент длиной 2,5 т.п.о., полученным расщеплением плазмиды рКН1-Т ферментами 8ρеI и 8саГ (производства ТАКАКА ВЮ ΙΝΒ), получая плазмиду рКНСуз. Плазмида кодирует полипептид Н-275-Суз, в котором четыре аминокислоты Ме!-А1а-А1а-8ет были добавлены с Ν-концевой стороны указанного выше Н-271 и дополнительный Суз был добавлен к Сконцу Н-271.
Полипептид Н-275-Суз получали следующим способом. ЕзсйепсЫа сой НВ101, которую трансформировали указанной выше плазмидой рКН-Суз (ЕзсйейсЫа сой НВ101/рКН-Суз), культивировали в течение ночи при 37°С в 120 мл среды ЬВ. Бактериальные клетки, собранные из культуральной среды, суспендировали в 40 мл буфера для разрушения (50 мМ трис-НС1, 1 мМ ЕЭТА, 150 ММ №С1, 1 мМ ОТТ, 1 мМ РМ8Р, рН 7,5), и суспензию подвергали ультразвуковой обработке, чтобы разрушить бактериальные клетки. Надосадок, полученный при центрифугировании, наносили на колонку Н1 Тгар-гепарин (производства Рйаттас1а), которая была уравновешена буфером для очистки (50 мМ трис-НС1, рН 7,5). Неадсорбированную на колонке фракцию промывали таким же буфером, затем осуществляли элюирование буфером для очистки, имеющим градиент концентрации 0-1 М №С1. Элюат анализировали электрофорезом в 8Э8-полиакриламидном геле и собирали фракции, соответствующие молекулярной массе Н-275Суз, получая очищенный препарат Н-275-Суз.
Пример 1. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток БАК (активируемые лимфокином клетки-киллеры) с использованием среды с низким содержанием сыворотки.
(1) Выделение и хранение РВМС.
Собирали компонент крови от отдельного нормального донора, получаемый при согласии с предоставлением полной информации. Собранный компонент крови разбавляли в 2 раза в РВ8(-), наслаивали на фикол-пак (производства Рйатташа) и центрифугировали при 500/д в течение 20 мин. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) в промежуточном слое собирали пипеткой и промывали. Собранные РВМС суспендировали в растворе для хранения 90% РВ8 (производства Вю ^Ыйакет)/10% ДМСО (производства 8ЮМА) и хранили в жидком азоте. Во время индукции БАК указанные находящиеся на хранении РВМС быстро размораживали на водяной бане при 37°С и промывали средой КРМI 1640 (производства Вю ^Ыйакет), содержащей 10 мкг/мл ДНКазы (производства Са1Ьюсйет). Затем количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим. Клетки подвергали каждому из описанных экспериментов.
(2) Иммобилизация антитела против СЭ3 человека и фрагмента ΡΝ.
Антитело против СЭ3 человека и фрагмент ΡΝ иммобилизовали на оборудовании для культивирования, используемом в следующем эксперименте. Конкретно, 1 мл (в случае 24-луночного планшета) или 2 мл (в случае флакона объемом 12,5 см2) РВ8, содержащего антитело против СЭ3 человека (производства Гапззеп-Куо^а) (конечная концентрация 5 мкг/мл), добавляли в 24-луночный планшет для культивирования клеток или во флакон для культивирования клеток объемом 12,5 см2 (производства Ра1соп). При добавлении каждый из фрагментов фибронектина (РМт), перечисленных в примере получения 1, добавляли в группу с добавлением фрагмента ΡN так, чтобы получить конечную концентрацию 10 мкг/мл (в случае 24-луночного планшета) или 25 мкг/мл (в случае флакона объемом 12,5 см2). В качестве контроля также помещали группу без добавления РМг.
После инкубации указанного оборудования для культивирования при комнатной температуре в те- 19 012520 чение 5 ч оборудование для культивирования хранили при 4°С вплоть до использования. Сразу после использования РВ8, содержащий антитело и ЕМг, удаляли отсасыванием из указанного оборудования для культивирования и затем каждую лунку два раза промывали РВ8 и затем один раз средой ХУ1У020 (производства В1о ^Ы!!акег), и оборудование для культивирования использовали в каждом из экспериментов.
(3) Индукция и культивирование клеток БАК.
РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в ХУ!У020, содержащей 1% сыворотки АВ человека (в дальнейшем просто называемой 1% ХУ1У020), так чтобы получить концентрацию 1х106 клеток/мл, и затем суспензию помещали в планшет с иммобилизованным антителом против СБ3 человека или планшет с иммобилизованным антителом против СБ3 человека и ЕМг, полученным согласно пункту (2) примера 1, в объеме 1 мл/каждую лунку, и к ней добавляли ГБ-2 (производства 81иопощ апй Со., Б(й.) так, чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Полученные планшеты подвергали культивированию при 37°С в 5% С02 (нулевой день культивирования). На второй и третий день после начала культивирования добавляли 1% ХУ1У020, содержащую 1000 Ед./мл Ιβ-2, в объеме 1 мл/каждую лунку. На четвертый день после начала культивирования культуральную среду, надлежащим образом разбавленную 1% ХУТУ020, переносили в свежий флакон, на котором ничего не иммобилизовали, и добавляли Ιβ-2 так, чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. Культивирование продолжали, культуральную среду соответствующим образом разбавляли 1% ХУ1У020 каждые 2 или 3 дня таким же образом, как на четвертый день после начала культивирования, и добавляли Ιβ-2 так, чтобы получить конечную концентрацию 300-500 Ед./мл. На одиннадцатый или пятнадцатый день после начала культивирования подсчитывали количество живых клеток способом окрашивания трипановым синим, и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Результаты показаны в табл. 1.
Таблица 1
Концентрация сыворотки (%) | Дни куль тивир ов а ния | Фрагмент фи бр о не кт ин а | Кратность экспансии |
1 | 11 дней | Контроль (без иммобилизации П-Иг) | х252 |
1 | 11 дней | СН-296 | х670 |
1 | 11 дней | Н-296 | х615,6 |
1 | 15 дней | Контроль (без иммобилизации И£г) | х403,2 |
1 | 15 дней | СН-296 | х588 |
1 | 15 дней | Н-296 | х708 |
Как показано в табл. 1, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина, с использованием на ранней стадии индукции клеток БАК среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, кратность экспансии клеток БАК была высокой по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим при культивировании клеток БАК с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки.
Пример 2. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток БАК с использованием среды с низким содержанием сыворотки (экспансия при многократной стимуляции).
(1) Индукция и культивирование клеток БАК.
РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в 0,5% или 1% ХУ1У020 так, чтобы получить концентрацию 1х 106 клеток/мл, и затем суспензию помещали в планшет, на котором иммобилизовали антитело против СБ3 человека, или планшет, на котором иммобилизовали антитело против СБ3 человека и ЕМг, полученный согласно пункту (2) примера 1, в объеме 1 мл/каждую лунку, и добавляли Ιβ-2 (производства 81иопощ апй Со., Б!й.) так, чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Полученные планшеты подвергали культивированию при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования). На второй и третий день после начала культивирования добавляли 0,5 или 1% ХУ1У020, содержащую 1000 Ед./мл Ιβ-2, в объеме 1 мл/каждую лунку. На четвертый день после начала культивирования культуральную среду, надлежащим образом разбавленную 0,5 или 1% ХУ1У020, переносили в свежий флакон, на котором ничего не иммобилизовали, и добавляли Ιβ-2 так, чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На девятый день после начала культивирования культуральную среду, соответствующим образом разбавленную 0,5 или 1% ХУ1У020, переносили во флакон, в котором иммобилизовали антитело против СБ3 человека, или во флакон, в котором иммобилизовали антитело против СИ3 человека и ЕМг (так, чтобы концентрация антитела против СИ3 человека, используемая при иммобилизации, составляла 0,5 мкг/мл), приготовленный таким же образом, как в пункте (2) примера 1, и добавляли Ιβ-2 так, чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На двенадцатый день после начала культивирования культуральную среду, соответствующим образом разбавленную 0,5 или 1% ХУ1У020, переносили в свежий флакон, в котором ничего не иммобилизовали, и добавляли Ιβ-2 так, чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На пятнадцатый день после начала культивирова
- 20 012520 ния количество живых клеток считывали способом на основе окрашивания трипановым синим и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Результаты показаны в табл. 2.
Таблица 2
Концентрация сыворотки (%) | Фрагмент фибронектина | Стимуляция в 0 день от начала культивирования | Стимуляция на 9-й день после начала культивирования | Кратность экспансии |
0, 5 | Контроль (без иммобилизации РЫГг) | Анти-СОЗ | нет | х13 |
0,5 | Без иммобили з ации | Анти-СОЗ | Анти-СОЗ | х88 |
0,5 | СН-296 | Анти-СЭЗ+СН- 296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | х410 |
1 | Контроль (бег иммобилизации ΕΝίΓ) | Анти-СОЗ | нет | х403 |
1 | Без иммобилизации ЕЫ£г | Анти-СОЗ | Анти-СОЗ | Х1624 |
1 | СН-296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | нет | х588 |
1 | СН-296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | х3560 |
1 | Н-2 96 | АнТИ-СОЗ+Н- 296 | нет | х708 |
1 | Н-296 | Анти-СОЗ+Н- 296 | Анти-СЦЗ+Н- 296 | хЗООО |
Как показано в табл. 2, в группе с многократным использованием оборудования для культивирования, в котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина и анти-СЭЗ-антитело на ранней стадии и промежуточной стадии индукции клеток ЬЛК с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, кратность экспансии клеток ЬЛК была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Указанные кратности экспансии были намного выше, чем кратность экспансии в группе с многократным использованием оборудования для культивирования, в котором иммобилизовали только анти-СЭЗ-антитело на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток ЬЛК. Другими словами, очевидно, что клетки ЬЛК можно было индуцировать и культивировать с высокой кратностью экспансии посредством стимуляции с использованием фрагмента фибронектина и антиСЭЗ-антитела на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток ЬЛК даже в том случае, когда использовали среду, содержащую низкую концентрацию сыворотки.
Пример 3. Индукция экспрессии рецептора 1Ь-2 (1Б-2К) в системе культивирования клеток ЬЛК с использованием среды с низким содержанием сыворотки.
(1) Индукция и культивирование клеток ЬЛК.
Индукцию и культивирование клеток ЬЛК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (1) примера 2.
(2) Определение относительной экспрессии 1Б-2К в клетках ЬЛК.
Клетки ЬЛК, которые получали согласно пункту (1) примера 3, в количестве 2х105 клеток фиксировали в РВ8 (производства Νίδδυί). содержащем 1% параформальдегида (производства Ν;·ι1<;·ι1;·ιί Тс5с.|ис. 1пс.), и затем промывали РВ8. Фиксированные клетки суспендировали в 100 мкл РВ8, содержащего 1% БСА (производства 81СМА), и добавляли ФИТЦ-меченый 1дС1 мыши или ФИТЦ-меченое мышиное антитело против 1Б-2К человека (СИ25) (оба производства ИАКО), и затем смесь инкубировали на льду в течение 30 мин. После инкубации клетки промывали РВ8 и снова суспендировали в РВ8, содержащем 1% параформальдегида. Клетки подвергали проточной цитометрии, используя ЕАС8 УагИадс (производства Всс1оп О1ск1п8оп), и определяли относительное содержание позитивных по экспрессии 1Б-2К клеток. Результаты показаны в табл. 3. В таблице относительное содержание позитивных по экспрессии 1Б-2К клеток (%) показано в виде относительной экспрессии 1Б-2К (%).
Таблица 3
Концентрация сыворотки (¾) | Фрагмент фибронектина | Стимуляция в 0 день от начала культивирования | Стимуляция на 9-й день после начала культи виро в ания | Относительная экспрессия ΙΙι2Й (*) |
0,5 | Контроль (без иммо би лиза ции Шг) | Анти-СОЗ | нет | 3, 48 |
- 21 012520
0, 5 | Без иммобилизации ГКЕг | Анти-СЦЗ | Анти-СЦЗ | 43,22 |
0,5 | СН-296 | Анти-ССЗ+СН- 296 | Анти-СЦЗ+СН- 296 | 81,11 |
0, 5 | Н-296 | Анти-СОЗ+Н- 296 | Анти-СОЗ+Н-29( | 71,49 |
1 | Контроль (без иммобилизации ΡΝίτ) | Анти-СОЗ | нет | 8,02 |
1 | Без иммобилизации ГМЕг | Анти-СОЗ | Анти-СОЗ | 42,8 |
1 | СН-296 | Анти-СЭЗ+СН- 296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | 77,94 |
1 | Н-296 | Анти-СЦЗ+Н- 296 | Анти-СОЗ+Н- 296 | 70,29 |
Как показано в табл. 3, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток ЬАК с использованием среды, содержащей сыворотку в низкой концентрации, относительную экспрессию ΙΕ-2Κ на поверхности клеток ЬАК во время культивирования можно было индуцировать на высоком уровне. Другими словами, выяснили, что клетки ЬАК можно было индуцировать и культивировать с увеличением относительной экспрессии ΙΕ-2Κ в том случае, когда клетки БАК индуцировали с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки и одновременно содержащей фрагмент фибронектина.
Пример 4. Относительное содержание СО8-позитивных клеток в популяции клеток БАК при использовании среды с низким содержанием сыворотки.
(1) Индукция и культивирование клеток БАК.
Индукцию и культивирование клеток БАК осуществляли таким же способом, как описано в пункте (1) примера 2.
(2) Определение относительного содержания популяции СИ8-позитивных клеток среди клеток ЬАК.
Клетки БАК, которые получали согласно пункту (1) примера 4, в количестве 2х105 клеток фиксировали в РВ8, содержащем 1% параформальдегида, и затем промывали РВ8. Фиксированные клетки суспендировали в 100 мкл РВ8, содержащего 1% БСА, добавляли ФИТЦ-меченый !дС1 мыши или ФИТЦмеченое мышиное антитело против СИ8 человека (оба производства ИАК0) и затем смесь инкубировали на льду в течение 30 мин. После инкубации клетки промывали РВ8 и снова суспендировали в РВ8, содержащем 1% параформальдегида. Клетки подвергали проточной цитометрии, используя БАС8 Уаи1аде, и определяли относительное содержание СИ8-позитивных клеток. Результаты показаны в табл. 4.
Таблица 4
Концентрация сыворо тки (%) | Фрагмент фибронектина | Стимуляция в 0 день от начала культивирования | Стимуляция на 9-й день после начала культивирования | Относительная экспрес сия ΙΕ2К. (%) |
0,5 | Контроль (без иммобилизации ΕΝίι | Анти-СОЗ | Анти-СЦЗ | 26,95 |
0,5 | СН-296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | Анти-СОЗ+СН-29 | 44,67 |
1 | Контроль (без иммобилизации ГЯЕг. | Анти-СОЗ | нет | 53,26 |
1 | Без иммобилизации ГИЕг | Анти-СБЗ | Анти-СОЗ | 35,56 |
1 | СН-296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | нет | 61,29 |
1 | СН-296 | Анти-СЦЗ+СН- 296 | Анти-СЦЗ+СН- 296 | 62,58 |
Как показано в табл. 4, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии или на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток БАК с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, относительное содержание СИ8-позитивных клеток среди клеток ЬАК во время культивирования может быть индуцировано на высоком уровне. Другими словами, выяснено, что клетки ЬАК можно было индуцировать и культивировать с увеличением относительного содержания СИ8-позитивных клеток среди клеток ЬАК в том случае, когда клетки ЬАК индуцировали с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки и одновременно содержащей фрагмент фибронектина.
Пример 5. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬАК с использованием бессывороточной среды.
(1) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в ХУ!У020, не содержащей сыворотки (в дальнейшем просто называемой 0% ХУГУ020), так чтобы получить концентрацию
- 22 012520
1х106 клеток/мл, и затем суспензию помещали в планшет, на котором было иммобилизовано антитело против СБ3 человека, или в планшет, на котором было иммобилизовано антитело против СБ3 человека и ΡΝίτ, полученный согласно пункту (2) примера 1, в объеме 1 мл/каждую лунку и добавляли ТЬ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Указанные планшеты подвергали культивированию при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования). На второй и третий день после начала культивирования добавляли 0% ХУ1УО20, содержащую 1000 Ед./мл ТЬ-2 в объеме 1 мл/каждую лунку. На четвертый день после начала культивирования, культуральную среду, соответствующим образом разбавленную 0% ХУ1УО20, переносили в свежий флакон, на котором ничего не иммобилизовали, и добавляли ТЬ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. Культивирование продолжали и культуральную среду соответствующим образом разбавляли через каждые 2 или 3 дня средой 0% ХУ1УО20 таким же образом, как на четвертый день после начала культивирования, и добавляли ТЬ-2, так чтобы получить конечную концентрацию от 300 до 500 Ед./мл. На одиннадцатый день или пятнадцатый день после начала культивирования, количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим, и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Результаты показаны в табл. 5.
Таблица 5
Концентрация сыворотки (%) | Дни культивирования | Фрагмент фибронектина | Кратность экспансии (раз) |
0 | 11 Дней | Контроль (Без иммобилизации БЦ£г) | 36 |
0 | 11 Дней | СН-296 | 103, 7 |
0 | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ЕЫ£г) | 76,3 |
0 | 15 Дней | СН-296 | 134,6 |
0 | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ΓΝ£τ) | 28,8 |
0 | 15 Дней | Н-296 | 46,8 |
Как показано в табл. 5, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток ЬЛК с использованием среды, не содержащей сыворотки, кратность экспансии клеток ЬЛК была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Из указанного выше очевидно, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим при культивировании клеток ЬЛК с использованием среды, не содержащей сыворотки.
Пример 6. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬЛК в бессывороточной среде (экспансия посредством многократной стимуляции).
(1) Индукция и культивирование клеток ЬЛК.
РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в 0% ХУ1УО20. так чтобы получить концентрацию 1х 106 клеток/мл, и затем суспензию помещали в планшет, на котором иммобилизовали антитело против СБ3 человека, или в планшет, на котором иммобилизовали антитело против СБ3 человека и ΡΝίτ, полученный согласно пункту (2) примера 1, в объеме 1 мл/каждую лунку и добавляли ТЬ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Указанные планшеты подвергали культивированию при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования). На второй и третий день после начала культивирования добавляли 0% ХУ1УО20. содержащую 1000 Ед./мл ТЬ-2, в объеме 1 мл/каждую лунку. На четвертый день после начала культивирования, культуральную среду, соответствующим образом разбавленную 0% ХУТУО20, переносили в свежий флакон, в котором ничего не иммобилизовали, и добавляли ТЬ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На девятый день после начала культивирования, культуральную среду соответствующим образом разбавленную 0% ХУТУО20, переносили во флакон, в котором иммобилизовали антитело против СБ3 человека, или во флакон, в котором иммобилизовали антитело против СБ3 человека и ΡΝίτ (при условии, что концентрация антитела против СБ3 человека, используемая при иммобилизации, составляла 0,5 мкг/мл), приготовленный таким же образом, как описано в пункте (2) примера 1, и добавляли ТЬ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На двенадцатый день после начала культивирования культуральную среду, снова соответствующим образом разбавленную 0% ХУТУО20, переносили в свежий флакон, в котором ничего не иммобилизовали, и в него добавляли ТЬ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На пятнадцатый день после начала культивирования количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим, и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Результаты показаны в табл. 6.
- 23 012520
Таблица 6
Концентрация сыворотки (% > | Фрагмент фибронектина | Стимуляция в 0 день от начала культивирования | Стимуляция на 9-й день после начала куль тивиро вамня | Кратность экспансии (раз) |
0 | Контроль (Без иммобилизации ΓΝ£γ) | Анти-СБЗ | Нет | х29 |
0 | Без иммобилизации ГИ£г | Анти-СБЗ | Анти-СБЗ | хЗб |
0 | СН-296 | Анти-СБЗТСН- 296 | Нет | х56 |
0 | СН-296 | Анти-СБЗТСН- 296 | Анти-СБЗтСН- 296 | Х199 |
0 | Н-296 | Анти-СБЗ+Н- 296 | Нет | х47 |
0 | Н-296 | Анти-СБЗТН- 296 | Анти-СБЗТН- 296 | х209 |
Как показано в табл. 6, в группе с многократным использованием нового оборудования для культивирования, в каждом из которых иммобилизовали фрагменты фибронектина и анти-СВ 3-антитело на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток ЬАК с использованием среды, не содержащей сыворотки, кратность экспансии клеток ЬЛК была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Указанные кратности экспансии были намного выше, чем кратность экспансии в группе с многократным использованием нового оборудования для культивирования, в котором иммобилизовали только анти-СЭЗ-антитело на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток ЬЛК. Другими словами, выяснено, что клетки ЬЛК можно было индуцировать и культивировать с высокой кратностью экспансии посредством стимуляции с использованием фрагмента фибронектина и антиСЭЗ-антитела на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток ЬЛК, даже если использовали среду, не содержащую сыворотки.
Пример 7. Индукция экспрессии 1Ь-2В в системе культивирования клеток ЬЛК с использованием бессывороточной среды.
(1) Индукция и культивирование клеток ЬЛК.
Индукцию и культивирование клеток ЬЛК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (1) примера 6.
(2) Определение относительной экспрессии 1Ь-2В в клетках ЬЛК.
Относительное содержание позитивных по экспрессии 1Ь-2В клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 3. Результаты показаны в табл. 7. В таблице относительное содержание позитивных по экспрессии 1Ь-2В клеток (%) показано в виде относительной экспрессии 1Ь-2В (%).
Таблица 7
Концентрация сыворотки {%) | Фрагмент фибронектина | Стимуляция в 0 день от начала культивирования | Стимуляция на 9-й день после начала культивирования | Относительная экспрессия II,2К {%) |
0 | Контроль (Без иммобилизации ΓΝίτ) | Анти-СБЗ | Нет | 1,7 |
0 | Без иммобилизации РИ£г | Анти-СБЗ | Анти-СБЗ | 50,5 |
0 | СН-296 | АНТИ-СБЗ+СН- 296 | Нет | 3, 0 |
0 | СН-296 | Анти-СБЗТСН- 296 | Анти-СБЗтСН- 296 | 82,2 |
0 | Н-296 | Анти-СБЗТН- 296 | Нет | 3,2 |
0 | Н-296 | Анти-СВтН-296 | Анти-СБЗТН- 296 | 91, 9 |
Как показано в табл. 7, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток ЬЛК с использованием среды, не содержащей сыворотки, относительная экспрессия 1Ь2В на поверхности клеток ЬЛК во время культивирования может быть индуцирована на высоком уровне. Другими словами, выяснено, что клетки ЬЛК можно было индуцировать и культивировать с повышением, относительной экспрессии 1Ь-2В в том случае, когда клетки ЬЛК индуцировали с использованием среды, не содержащей сыворотки и одновременно содержащей фрагмент фибронектина.
Пример 8. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬЛК с использованием бессывороточной среды (ΑΙΜ V).
(1) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Индукцию и культивирование клеток ЬАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте
- 24 012520 (1) примера 5, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли на среду ΑΙΜ V, не содержащую сыворотки (производства 1пу11годеп, в дальнейшем просто называемую 0% ΑΙΜ V). Результаты показаны в табл. 8.
Таблица 8
Концентрация сыворотки и среда | Дни культивирования | Фрагмент фибронектина | Кратность экспансии (раз) |
0% ΑΙΜ V | 12 Дней | Контроль (Без иммобилизации ΓΝ£γ) | х21 |
0% ΑΙΜ V | 12 Дней | СН-296 | х110 |
0% ΑΙΜ V | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ЕП£г) | х44 |
0% ΑΙΜ V | 15 Дней | СН-296 | Х498 |
0% ΑΙΜ V | 12 Дней | Контроль (Без иммобилизации ГЫ£г) | Не пролиферировали, не выявлено |
0% ΑΙΜ V | 12 Дней | Н-296 | хЗЗ |
0% ΑΙΜ V | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ΕΝ£γ) | не пролиферировали г не выявлено |
0% ΑΙΜ V | 15 Дней | Н-296 | х245 |
Как показано в табл. 8, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток ЬАК с использованием среды, не содержащей сыворотки, кратность экспансии клеток ЬАК была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Кроме того, указанный эффект проявлялся даже когда заменяли основную среду для культивирования без сыворотки. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим при культивировании клеток ЬАК с использованием среды, не содержащей сыворотки.
Пример 9. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬАК в бессывороточной среде (индукция и культивирование клеток ЬАК, начиная с небольшого количества клеток/культивирование без процессов разведения).
(1) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в Χνΐνθ20 (не содержащей сыворотки) так, чтобы получить концентрацию 1х105 клеток/мл, и затем суспензию помещали в планшет, на котором иммобилизовали антитело против СИЗ человека, или в 6-луночный планшет, на котором иммобилизовали антитело против СИЗ человека и ΕΝίϊ, полученный таким же образом, как описано в пункте (2) примера 1, в объеме 1 мл/каждую лунку, добавляли 4 мл Χνΐν020 (не содержащей сыворотки) (1х104 клеток/см2), и затем добавляли Ι6-2 так, чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. Указанные планшеты подвергали культивированию при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования). На второй, третий и четвертый дни после начала культивирования добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. Культивирование продолжали и Ι6-2 добавляли каждые 2 или 3 дня на седьмой день и в последующие дни после начала культивирования так, чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. Во время культивирования процедуру разбавления культуральной среды не проводили совсем.
На пятнадцатый день после начала культивирования количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим, и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Результаты показаны в табл. 9.
Таблица9
Дни культивирования | Фрагмент фибронектина | Кратность экспансии (раз) |
15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ГЫ£г) | Не пролиферировали, не выявлено |
15 Дней | СН-296 | х64,3 |
Как показано в табл. 9, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина во время индукции клеток ЬАК, начиная с небольшого количества клеток, высокую кратность экспансии получали на пятнадцатый день после начала культивирования без необходимости в процессах разведения клеток в ходе индукции. С другой стороны, в контрольной группе клетки почти не пролиферировали даже на пятнадцатый день после начала культивирования. Другими словами, выяснено, что клетки ЬАК можно было индуцировать и культивировать с высокой кратностью экспансии в том случае, когда клетки ЬАК индуцировали, начиная с небольшого количества клеток с использованием бессывороточной среды, также содержащей фрагмент фибронектина, без необходимости в процессах разбавления.
Пример 10. Индукция экспрессии Ι6-2Β в системе культивирования клеток ЬАК с использованием
- 25 012520 бессывороточной среды (индукция и культивирование клеток БАК, начиная с небольшого количества клеток/культивирование без процедур разведения).
(1) Индукция и культивирование клеток БАК.
Индукцию и культивирование клеток БАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (1) примера 9.
(2) Определение относительной экспрессии 1Б-2К в клетках БАК.
Относительное содержание позитивных по экспрессии 1Б-2К клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 3. Результаты показаны в табл. 10. В таблице относительное содержание позитивных по экспрессии 1Б-2К клеток (%) показано в виде относительной экспрессии 1Б-2К.
Таблица 10
Дни культивирования | Фрагмент фибронектина | Относительная экспрессия 1Ь-2В (%) |
15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ΕΝίτ) | Не пролиферировали, не выявлено |
15 Дней | СН-296 | х98,0 |
Как показано в табл. 10, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина, во время индукции клеток БАК, начиная с небольшого количества клеток, относительная экспрессия 1Б-2К на поверхности клеток БАК во время культивирования может быть индуцирована на высоком уровне без необходимости в процессах разведения клеток в ходе индукции. Другими словами, выяснено, что клетки БАК можно было индуцировать и культивировать с увеличением относительной экспрессии 1Б-2К в том случае, когда клетки БАК индуцировали, начиная с небольшого количества клеток, с использованием бессывороточной среды и одновременно в присутствии фрагмента фибронектина без необходимости в процедурах разбавления.
Пример 11. Относительное содержание СИ8-позитивных клеток в популяции клеток БАК, культивируемых в бессывороточной среде (А1М V).
(1) Индукция и культивирование клеток БАК.
Индукцию и культивирование клеток БАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (1) примера 8.
(2) Определение относительного содержания популяции СИ8-позитивных клеток среди клеток БАК.
Относительное содержание СИ8-позитивных клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 4. Результаты показаны в табл. 11.
Таблица11
Концентрация сыворотки и среда | Фрагмент фибронектина | Относительное содержание СБ8-позитивных клеток (%) |
0% ΑΙΜ V | Контроль (Без иммобилизации ГЫ£г) | 24,7 |
0% ΑΙΜ V | СН-296 | 45,8 |
0% ΑΙΜ V | Н-296 | 62,6 |
Как показано в табл. 11, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток БАК с использованием среды, не содержащей сыворотки, относительное содержание СИ8-позитивных клеток среди клеток БАК во время культивирования может быть индуцировано на высоком уровне. Другими словами, выяснено, что клетки БАК можно было индуцировать и культивировать с повышением относительного содержания СИ8-позитивных клеток среди клеток БАК в том случае, когда клетки БАК индуцировали с использованием среды, не содержащей сыворотки, и одновременно в присутствии фрагмента фибронектина.
Пример 12. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток БАК с использованием среды с низким содержанием сыворотки (А1М V).
(1) Индукция и культивирование клеток БАК.
Индукцию и культивирование клеток БАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (3) примера 1, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли на среду А1М V, содержащую 1 или 5% сыворотки АВ человека (в дальнейшем просто называемую 1% А1М V или 5% А1М V). Результаты показаны в табл. 12.
- 26 012520
Таблица 12
Концентрация сыворотки и среда | Дни культивирования | Фрагмент фибронектина | Кратность экспансии (раз) |
1% ΑΙΜ V | 11 Дней | Контроль (Без иммобилизации ГЫ£г) | х7 |
1% ΑΙΜ V | 11 Дней | СН-296 | х156 |
1% ΑΙΜ V | 11 Дней | Н-296 | х39 |
1% ΑΙΜ V | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ΓΝ£γ) | хЗ |
1ΐ ΑΙΜ V | 15 Дней | СН-296 | х651 |
1% ΑΙΜ V | 15 Дней | Н-296 | х305 |
5% ΑΙΜ V | 11 Дней | Контроль (Без иммобилизации РЫ£г) | х454 |
5% ΑΙΜ V | 11 Дней | СН-296 | Х1087 |
5% ΑΙΜ V | 11 Дней | Н-296 | х727 |
5% АТМ V | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ΓΝίι) | х778 |
5% ΑΙΜ V | 15 Дней | СН-296 | Х1548 |
5% ΑΙΜ V | 15 Дней | Н-296 | х882 |
Как показано в табл. 12, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток БАК с использованием среды (А1М У), содержащей низкую концентрацию сыворотки, кратность экспансии клеток БАК была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим при культивировании клеток БАК с использованием среды А1М У, содержащей низкую концентрацию сыворотки.
Пример 13. Влияние на кратность экспансии в системе культивирования клеток БАК использования различных сред с низким содержанием сыворотки.
(1) Индукция и культивирование клеток БАК.
Индукцию и культивирование клеток БАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (3) примера 1, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли на среду ХУ1УО20, среду ХУ1УО10 или среду А1М У, каждая из которых содержала 1% сыворотки АВ человека (в дальнейшем называемые просто 1% ХУ1УО20, 1% ХУ1УО10 или 1% А1М У, соответственно). Определяли кратность экспансии в каждой среде. Результаты показаны в табл. 13.
Таблица 13
Концентрация сыворотки и среда | Дни культивирования | Фрагмент фибронектина | Кратность экспансии (раз) |
1% χνΐνθ20 | 11 Дней | Контроль (Без иммобилизации ГЫ£г) | х49 |
1% ХУ1УО20 | 11 Дней | СН-296 | х153 |
1% ΑΙΜ V | 11 Дней | Контроль (Без иммобилизации ΓΝ£τ) | х79 |
1% ΑΙΜ V | 11 Дней | СН-296 | х832 |
1% ХУ1УО20 | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ΓΝ£γ) | х272 |
1% Χνΐνθ20 | 15 Дней | СН-296 | х513 |
ι% χνινοιο | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ГМГг) | х113 |
ι% χνινοιο | 15 Дней | СН-296 | Х162 |
1% ΑΙΜ V | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ГЫ£г) | х744 |
1% ΑΙΜ V | 15 Дней | СН-296 | х8928 |
Как показано в табл. 13 в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток БАК с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, кратность экспансии клеток БАК была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Кроме того, такой эффект проявлялся даже в том случае, когда основную среду заменяли. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим при культивировании клеток БАК с использованием любой среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки.
Пример 14. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток БАК с использованием среды с низким содержанием сыворотки.
(1) Индукция и культивирование клеток БАК.
Индукцию и культивирование клеток БАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (3) примера 1, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли на среду ХУ1УО20, содержащую 0,2% сыворотки АВ человека. Результаты показаны в табл. 14.
- 27 012520
Таблица 14
Концентрация сыворотки и среда | Дни культивирования | Фрагмент фибронектина | Кратность экспансии (раз) |
0,2% ХУ1УО20 | 15 Дней | Контроль (Вез иммобилизации ΡΝ£γ) | х11 |
0,2% Χνΐνθ20 | 15 Дней | СН-296 | х67 |
Как показано в табл. 14, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток ЬЛК с использованием среды (ХУ1УО20), содержащей низкую концентрацию (0,2%) сыворотки, кратность экспансии клеток ЬЛК была высокой по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим при культивировании клеток ЬЛК с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки.
Пример 15. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬЛК с использованием среды с низким содержанием сыворотки (экспансия посредством многократной стимуляции).
(1) Индукция и культивирование клеток ЬЛК.
Индукцию и культивирование клеток ЬЛК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (1) примера 2, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли средой ХУ1УО20, содержащей 0,2% сыворотки АВ человека, или средой ХУ1УО10, содержащей 1% сыворотки АВ человека. Результаты показаны в табл. 15.
Таблица 15
Концентрация сыворотки и среда | Фрагмент фибронектина | Стимуляция в 0 день от начала культивирования | Стимуляция на 9-й день после начала культивирования | Кратность экспансии (раз) |
0,2% Χνΐνθ20 | Контроль (Без иммобилизаци и ΓΝ£ι) | Анти-СОЗ | Нет | х11 |
0,2% ХУ1У020 | Без иммобилизаци И ΓΝίΓ | Анти-СЭЗ | Анти-СЭЗ | х9 |
0,2% ХУ1УО20 | СН-296 | Анти-СЦЗ+СН- 296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | х36 |
ι% χνινοιο | Контроль (Беа иммобили з а ци и ЕВД | Анти-СОЗ | Нет | Х113 |
ι% χνινοιο | Без иммобилизаци И ΓΝίί | Анти-СОЗ | Анти-СОЗ | х281 |
1% χνινοιο | СН-296 | Анти-СЭЗ+СН- 296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | Х1282 |
1% χνινοιο | Контроль (Без иммобилизаци и РМ£г} | Анти-СОЗ | Нет | х24 |
1% χνινοιο | Без иммобилизаци и ГИ£г | Анти-СРЗ | Анти-СОЗ | х367 |
1% χνινοιο | СН-296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | хЮЗО |
1% χνινοιο | Н-296 | Анти-СОЗ+Н- 296 | Анти-СОЗ+Н- 296 | Х1001 |
Как показано в табл. 15, в группе с многократным использованием нового оборудования для культивирования, в котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина и анти-СП3-антитело на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток ЬАК с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки (0,2%), кратность экспансии клеток ЬАК была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Указанные кратности экспансии были намного выше, чем кратность экспансии в группе с многократным использованием нового оборудования для культивирования, в котором иммобилизовали только анти-СП3-антитело на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток ЬАК. Кроме того, данный эффект проявлялся даже когда основную среду заменяли. Другими словами, выяснено, что клетки ЬАК можно было индуцировать и культивировать с высокой кратностью экспансии при стимуляции с использованием фрагмента фибронектина и анти-СП3-антитела на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток ЬАК даже когда использовали среду, содержащую низкую концентрацию сыворотки.
Пример 16. Индукция экспрессии рецептора 1Ь-2 (1Ь-2К.) в системе культивирования клеток ЬАК с использованием среды с низким содержанием сыворотки.
(1) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Индукцию и культивирование клеток ЬАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (1) примера 2, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли
- 28 012520 средой Χνΐνθ20, содержащей 0,2% сыворотки АВ человека, или средой ΧνίνΟΙΟ, содержащей 1% сыворотки АВ человека.
(2) Определение относительной экспрессии 1Б-2Р в клетках БАК
Относительное содержание позитивных по экспрессии 1Б-2Р клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 3. Результаты показаны в табл. 16. В таблице относительное содержание позитивных по экспрессии 1Б-2Р клеток (%) показано в виде относительной экспрессии 1Б-2Р (%).
Таблица 16
Концентрация сыворотки и среда | Фрагмент фибр он е ктина | Стимуляция в 0 день от начала культивирования | Стимуляция на 9~й день после начала культивирования | Относительная экспрессия 1Ь’2К (%} |
0,2% ХУ1У020 | Контроль (Без иммобилизации ΓΝ£ι?) | Анти-СОЗ | Нет | 3,01 |
0,2% Χνΐνθ20 | Без иммобилизации ЕП£г | Анти-СВЗ | Анти-СОЗ | 59, 08 |
0,2% Χνΐν02 0 | СН-296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | Анти-СИЗ+СН- 296 | 77,88 |
ι% χνινοιο | Контроль (Без иммобилизации ЕШг) | Анти-СЦЗ | Нет | 13,77 |
ι% χνινοιο | Без иммобилизации ГЫ£г | Анти-СЦЗ | Анти-СОЗ | 58,28 |
1% χνινοιο | СН-296 | Анги-СОЗ+СН- 296 | Анти-СОЗТСН- 296 | 91, 11 |
Как показано в табл. 16, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток БАК с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, относительная экспрессия 1Б-2Р на поверхности клеток БАК во время культивирования может быть индуцирована на высоком уровне. Кроме того, указанный эффект проявлялся даже когда заменяли основную среду. Другими словами, выяснено, что клетки БАК можно было индуцировать и культивировать с увеличением относительной экспрессии 1Б-2Р в том случае, когда клетки БАК индуцировали с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки и одновременно в присутствии фрагмента фибронектина.
Пример 17. Относительное содержание СЭЗ-позитивных клеток в популяции клеток БАК при использовании среды с низким содержанием сыворотки.
(1) Индукция и культивирование клеток БАК.
Индукцию и культивирование клеток БАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (3) примера 1, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли средой ΧνΐνΟ20, содержащей 0,2 или 1% сыворотки АВ человека, или средой ΧνΐνΟ10, содержащей 1% сыворотки АВ человека.
(2) Определение относительного содержания популяции СИ8-позитивных клеток среди клеток БАК.
Относительное содержание СО8-позитивных клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 4. Результаты показаны в табл. 17.
Таблица 17
Концентрация сыворотки и среда | Фрагмент фибронектина | Относительное содержание СйБ-поэитивных клеток (%) |
0,2% Χνΐνθ20 | Контроль (Без иммобилизации Шг) | 50,9 |
0,2% Χνΐνθ20 | СН-296 | 70,9 |
1% Χνΐνθ20 | Контроль (Без иммобилизации ЕИ£г) | 36,2 |
1% Χνΐνθ20 | СН-296 | 53,6 |
1% χνΐνο20 | Н-296 | 50,6 |
1% χνινοιο | Контроль (Без иммобилизации Ш£г) | 19,9 |
1% χνινοιο | СН-296 | 45,5 |
1% χνινοιο | Н-296 | 53,6 |
Как показано в табл. 17, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток БАК с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, относительное содержание СИ8позитивных клеток среди клеток БАК во время культивирования может быть индуцировано на высоком уровне. Кроме того, указанный эффект наблюдался даже в случае замены основной среды. Другими словами, выяснено, что клетки БАК можно было индуцировать и культивировать с повышением относительного содержания СИ8-позитивных клеток среди клеток БАК в том случае, когда клетки БАК инду
- 29 012520 цировали с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, и одновременно в присутствии фрагмента фибронектина.
Пример 18. Относительное содержание СО8-позитивных клеток в популяции клеток ЬАК при использовании среды с низким содержанием сыворотки (экспансия посредством многократной стимуляции).
1) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Индукцию и культивирование клеток ЬАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (1) примера 2, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли средой ХУ1У020, содержащей 0,2% сыворотки АВ человека, или средой ХУ1У010, содержащей 1% сыворотки АВ человека.
(2) Определение относительного содержания популяции СО8-позитивных клеток среди клеток ЬАК.
Относительное содержание СП8-позитивных клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 4. Результаты показаны в табл. 18.
Таблица 18
Концентрация сыворотки и среда | Фрагмент фибронектина | Стимуляция в 0 день от начала культивирования | Стимуляция на 9-й день после начала культивирования | Относительное Содержание аппозитивных клеток (%) |
0,2% ХУ1УО20 | Контроль (Без иммобилизации ΡΝίϋ) | Анти-СОЗ | Анти-СОЗ | 38,9 |
0,2% Χνΐνθ20 | СН-296 | Анти-СЦЗ+СН- 296 | Анти- СОЗ+СН-296 | 44,5 |
ι% χνινοιο | Контроль (Без иммобили з а ции | Анти-СОЗ | Анти-СОЗ | 25,6 |
ΕΝίχ) | ||||
ι% χνινοιο | СН-296 | Анти-СРЗ+СН- 296 | Анти- СОЗ+СН-296 | 38,3 |
Как показано в табл. 18, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии или на промежуточной стадии индукции клеток ЬАК с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, относительное содержание СП8-позитивных клеток среди клеток ЬАК во время культивирования может быть индуцировано на высоком уровне. Кроме того, указанный эффект наблюдался даже в случае замены основной среды. Другими словами, выяснено, что клетки ЬАК можно было индуцировать и культивировать с увеличением относительного содержания СО8-позитивных клеток среди клеток ЬАК в том случае, когда клетки ЬАК индуцировали с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки и одновременно в присутствии фрагмента фибронектина.
Пример 19. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬАК с использованием бессывороточной среды.
(1) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Индукцию и культивирование клеток ЬАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (1) примера 5, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли средой ХУ1У010 или средой А1М У, не содержащей сыворотки. Результаты показаны в табл. 19.
Таблица 19
Концентрация сыворотки и среда | Дни куль тивирования | Фрагмент фибронектина | Кратность экспансии (раз) |
о% χνινοιο | 11 Дней | Контроль (Без иммобилизации ГИЕг) | х32 |
0% χνινοιο | 11 Дней | СН-296 | х95 |
о% χνινοιο | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ΕΝίτ) | х205 |
о% χνινοιο | 15 Дней | СН-296 | х407 |
ο% χνινοιο | 11 Дней | Контроль (Без иммобилизации ЕП£г) | х29 |
0% χνινοιο | 11 Дней | Н-296 | х78 |
- 30 012520
0% χνινοιο | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ГЫГг) | х27 |
0% χνινοιο | 15 Дней | Н-296 | Х194 |
0% ΑΙΜ V | 11 Дней | Контроль (Без иммобилизации ЕЫ£г) | х25 |
0% ΑΙΜ V | 11 Дней | СН-296 | х85 |
0% ΑΙΜ V | 11 Дней | Н-296 | х69 |
0% ΑΙΜ V | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ГМСг) | х61 |
0% ΑΙΜ V | 15 Дней | СН-296 | х202 |
0% ΑΙΜ V | 15 Дней | Н-296 | х392 |
Как показано в табл. 19, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток ЬЛК с использованием среды не содержащей сыворотки, кратность экспансии клеток ЬЛК была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Кроме того, указанный эффект наблюдался даже в случае замены основной среды. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим во время культивирования клеток ЬЛК с использованием среды, не содержащей сыворотки.
Пример 20. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬЛК с использованием бессывороточной среды (экспансия посредством многократной стимуляции).
(1) Индукция и культивирование клеток ЬЛК.
Индукцию и культивирование клеток ЬЛК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (1) примера 6, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли средой XVIУО10, не содержащей сыворотки. Результаты показаны в табл. 20.
Таблица 20
Концентрация сыворотки и среда | Фрагмент фибронектина | Стимуляция в 0 день от начала культивирования | Стимуляция на 9~й день после начала культивирования | Кратность экспансии (раз) |
о% χνινοιο | Контроль (Без иммо билиз а ции ΓΝίτ} | Анти-СОЗ | Нет | х27 |
0¾ χνινοιο | Без иммо билиз а ции ΓΝ£γ | Анти-СЦЗ | Анти-СОЗ | х288 |
о% χνινοιο | СН-296 | Анти-СЦЗ+СН- 296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | х845 |
о% χνινοιο | Н-296 | Анти-СЦЗ+Н- 296 | Анти-СОЗ+Н- 296 | х893 |
Как показано в табл. 20, в группе с многократным использованием нового оборудования для культивирования, в котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина и анти-СО3-антитело на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток ЬЛК с использованием среды, не содержащей сыворотки, кратность экспансии клеток ЬЛК была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Указанные кратности экспансии были намного выше, чем кратность экспансии в группе с многократным использованием оборудования для культивирования, в котором иммобилизовали только анти-СО3-антитело на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток ЬЛК. Кроме того, указанный эффект наблюдался даже в случае замены основной среды. Другими словами, выяснено, что клетки ЬЛК можно было индуцировать и культивировать с высокой кратностью экспансии посредством стимуляции с использованием фрагмента фибронектина и анти-СО3-антитела на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток ЬЛК даже в случае использования среды, не содержащей сыворотки.
Пример 21. Индукция экспрессии ГЬ-2К в системе культивирования клеток ЬЛК с использованием бессывороточной среды.
(1) Индукция и культивирование клеток ЬЛК.
Индукцию и культивирование клеток ЬЛК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (1) примера 6, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли средой ΧνΣνθ10, не содержащей сыворотки.
(2) Определение относительной экспрессии ГЬ-2К в клетках ЬЛК.
Относительное содержание позитивных по экспрессии ГЬ-2К клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 3. Результаты показаны в табл. 21. В таблице относительное содержание позитивных по экспрессии ГЬ-2К клеток (%) показано в виде относительной экспрессии ГЬ-2К (%).
- 31 012520
Таблица 21
Концентрация сыворотки и среда | Фрагмент фибронектина | Стимуляция в 0 день от начала культивирования | Стимуляция на 9-й день после начала культивирования | Относительная экспрессия 1Ъ-2Н (%) |
о% χνινοιο | Контроль (Без иммобилизации ГЫ£г) | Анти-СОЗ | Нет | 24,99 |
о% χνινοιο | Без иммобилизации | Анти-СОЗ | Анти-СЭЗ | 80,58 |
0% χνινοιο | СН-296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | Нет | 40,17 |
о% χνινοιο | СН-296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | 92,59 |
0% χνινοιο | Н-296 | Анти-СОЗ+Н- 296 | Нет | 30,09 |
ο% χνινοιο | Н-296 | Анти-СВЗ+Н- 296 | Анти-СОЗ+Н- 296 | 87,15 |
Как показано в табл. 21, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток ЬАК с использованием среды, не содержащей сыворотки, относительная экспрессия ГЬ2К на поверхности клеток ЬАК во время культивирования может быть индуцирована на высоком уровне. Другими словами, выяснено, что клетки ЬАК можно было индуцировать и культивировать с увеличением относительной экспрессии ΙΕ-2Κ в том случае, когда клетки ЬАК индуцировали с использованием среды, не содержащей сыворотки, и одновременно в присутствии фрагмента фибронектина.
Пример 22. Относительное содержание СИ8-позитивных клеток в популяции клеток ЬАК, культивируемых с использованием бессывороточной среды.
(1) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Индукцию и культивирование клеток ЬАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (1) примера 5, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли средой ΧνΙν020, ΧνΙν010 или ΛΙΜ V, каждая из которых не содержала сыворотки.
(2) Определение относительного содержания популяции СИ8-позитивных клеток среди клеток ЬАК.
Относительное содержание СИ8-позитивных клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 4. Результаты показаны в табл. 22.
Таблица 22
Концентрация сыворотки и среда | Фрагмент фибронектина | Относительное содержание С08-позитивных клеток (%> |
0% χνινο20 | Контроль (Без иммобилизации БЯ£г) | 20,01 |
0% χνινο20 | СН-296 | 64,48 |
о% χνινοιο | Контроль (Без иммобилизации БЫ£г) | 27,91 |
о% χνινοιο | СН-296 | 47,72 |
0% ΑΙΜ V | Контроль (Без иммобилизации ΕΝ£γ) | 21,14 |
0% ΑΙΜ V | СН-296 | 58,8 |
ο% χνινοιο | Контроль (Без иммобилизации №г) | 16,53 |
0% χνινοιο | СН-296 | 35,22 |
0% χνινοιο | Н-296 | 27,29 |
Как показано в табл. 22, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток ЬАК с использованием среды, не содержащей сыворотки, относительное содержание СИ8-позитивных клеток сред клеток ЬАК во время культивирования может быть индуцировано на высоком уровне. Кроме того, указанный эффект наблюдался даже в случае замены основной среды. Другими словами, выяснено, что клетки ЬАК можно было индуцировать и культивировать с повышением относительного содержания СИ8-позитивных клеток среди клеток ЬАК в том случае, когда клетки ЬАК индуцировали с использованием среды, не содержащей сыворотки, и одновременно в присутствии фрагмента фибронектина.
Пример 23. Относительное содержание СИ8-позитивных клеток в популяции клеток ЬАК при использовании бессывороточной среды (экспансия посредством многократных стимуляций).
(1) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Индукцию и культивирование клеток ЬАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (1) примера 6, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли средой ΧνΙν020 или ΧνΙν010, не содержащей сыворотки.
- 32 012520 (2) Определение относительного содержания СО8-позитивных клеток среди клеток БАК. Относительное содержание СО8-позитивных клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 4. Результаты показаны в табл. 23.
Таблица 23
Концентрация сыворотки и среда | Фрагмент фибронектина | Стимуляция в 0 день от начала культивирования | Стимуляция на 9-й день после начала культивирования | Относительное содержание СП9позитизных клеток (%) |
0% χνΐνθ20 | Контроль (Вез иммобилизации | Анти-СОЗ | Нет | 20,01 |
0% χνΐνθ20 | СН-296 | Анти-СЦЗ+СН- 296 | Нет | 64,48 |
0% χνΐνθ20 | СН-296 | Анти-СЦЗ+СН- 296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | 35,21 |
о% χνινοιο | Контроль (Вез иммобилизации ГЫ£г) | Анти-СБЗ | Нет | 27,91 |
0¾ χνινοιο | СН-296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | Нет | 47,72 |
0% χνινοιο | Без иммобилизации ΚΝίτ | Анти-СОЗ | Анти-СОЗ | 37,97 |
0% χνινοιο | СН-296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | Анти-СЦЗ+СН- 296 | 50,22 |
0% χνινοιο | Контроль (Без иммобилизации ГЫ£г) | Анти-СОЗ | Нет | 16,53 |
ο% χνινοιο | СН-296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | Нет | 35,22 |
0% χνινοιο | Н-296 | Анти-СОЗ+Н- 296 | Нет | 27,29 |
0% χνινοιο | СН-296 | Анти-СЦЗ+СН- 296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | 75,33 |
0% χνινοιο | Н-296 | Анти-СЦЗ+Н- 296 | Анти-СОЗ+Н- 296 | 61,08 |
Как показано в табл. 23, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии или на ранней - средней стадии индукции клеток БАК с использованием среды, не содержащей сыворотки, относительное содержание СП8-позитивных клеток среди клеток БАК во время культивирования может быть индуцировано на высоком уровне. Кроме того, указанный эффект наблюдался даже в случае замены основной среды. Другими словами, выяснено, клетки БАК можно было индуцировать и культивировать с увеличением относительного содержания СО8-позитивных клеток среди клеток БАК в том случае, когда клетки БАК индуцировали с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, и одновременно в присутствии фрагмента фибронектина.
Пример 24. Индукция экспрессии !Б-2К в системе культивирования клеток БАК с использование седы с низким содержанием сыворотки (индукция и культивирование клеток БАК, начиная с небольшого количества клеток/культивирование без процедур разбавления).
(1) Индукция и культивирование клеток БАК.
РВМС, полученные согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в ХУ1У020, содержащей 1% сыворотки АВ человека (в дальнейшем просто называемой 1% ХУ1У020), так чтобы получить концентрацию 1 х 105 или 5х104 клеток/мл, и затем суспензию помещали в планшет, на котором иммобилизовали антитело против СБ3 человека, или 6-луночный планшет, на котором иммобилизовали антитело против СБ3 человека и БМг, полученный таким же образом, как описано в пункте (2) примера 1, в объеме 1 мл/каждую лунку, добавляли 4 мл 1% ХУ1У020 (1х104 или 5х103 клеток/см2) и затем добавляли Ιβ-2 (производства ЗИлопощ апй Со., Б!й.), так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. Полученные планшеты подвергали культивированию 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования). На второй, третий и четвертый дни после начала культивирования добавляли Ιβ-2, так чтобы получить конечную концентрация 500 Ед./мл. Культивирование продолжали, и добавляли Ιβ-2 через каждые 2 или 3 дня на седьмой и последующие дни после начала культивирования, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. Во время культивирования процедуры разбавления культуральной среды не проводили совсем. На шестнадцатый день после начала культивирования собирали клетки.
(2) Определение относительной экспрессии Ιβ-2Κ в клетках БАК.
Относительное содержание позитивных по экспрессии Ιβ-2Κ клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 3. В таблице относительное содержание позитивных по экспрессии Ιβ2К клеток (%) показано в виде относительной экспрессии Ιβ-2Κ (%). Результаты показаны в табл. 24.
- 33 012520
Таблица 24
Концентрация сыворотки и среда | Фрагмент фибронектина | Относительная экспрессия 1Ь-2К (%) |
1% χνΐνθ20 | Контроль (Без иммобилизации ΚΝίΓ) | 12,15 |
СН-296 | 97, 47 | |
Н-296 | 95,43 |
Как показано в табл. 24, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина во время индукции клеток ЬАК, начиная с небольшого количества клеток, относительная экспрессия 1Ь-2К на поверхности клеток ЬАК во время культивирования может быть индуцирована на высоком уровне без необходимости в процедурах разведения клеток в ходе индукции. Другими словами, выяснено, что клетки ЬАК можно было индуцировать и культивировать с увеличением относительной экспрессии 1Ь-2К в том случае, когда клетки ЬАК индуцировали, начиная с небольшого количества клеток, с использованием среды с низким содержанием сыворотки и одновременно в присутствии фрагмента фибронектина, совсем не нуждаясь в процедурах разбавления.
Пример 25. Определение цитотоксической активности в системе культивирования клеток ЬАК с использованием бессывороточной среды или среды с низким содержанием сыворотки.
(1) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Индукцию и культивирование клеток ЬАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (3) примера 1, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли средой ХУ1УО20, содержащей от 0 до 5% сыворотки АВ человека, или средой А1М У, содержащей от 0 до 5% сыворотки АВ человека, или средой ХУ1УО10, содержащей 5% сыворотки АВ человека.
(2) Определение цитотоксической активности культивируемых клеток ЬАК.
Цитотоксическую активность ЬАК, полученный согласно пункту (1) примера 25, на пятнадцатый день после начала культивирования оценивали способом определения цитотоксической активности с использованием кальцеин-АМ |Ыс111епГе15 К., е1 а1., 1. 1ттпо1. МеПюйх 172(2), 227-239 (1994)]. Клетки линии К562, Όαιιάί суспендировали в среде КРМ1 1640, содержащей 5% ЕВ8 (производства Вю νΐίΐίοΚΌΓ), так чтобы получить концентрацию 1х 106 клеток/мл. Затем к суспензии добавляли кальцеинАМ (производства ИоШе), так чтобы получить конечную концентрацию 25 мкМ, и клетки культивировали при 37°С в течение 1 ч.
Клетки промывали средой, не содержащей кальцеин-АМ, получая меченные кальцеином клеткимишени.
Клетки ЬАК, полученные согласно пункту (1) примера 25, ступенчато разводили КРМ1, содержащей 5% сыворотки человека (в дальнейшем просто называемой 5НКРМ1), так чтобы получить концентрацию от 1 х 106 до 3х106 клеток/мл в качестве эффекторных клеток. Затем каждое разведение помещали в каждую лунку 96-луночного планшета для культивирования клеток в количестве 100 мкл/каждую лунку. В него добавляли меченные кальцеином клетки-мишени, приготовленные в концентрации 1х 105 клеток/мл, в количество 100 мкл/каждую лунку. Планшет, содержащий указанную выше суспензию клеток, центрифугировали при 400хд в течение 1 мин и затем инкубировали в СО2-инкубаторе влажного типа при 37°С в течение 4 ч. Через 4 ч из каждой лунки собирали 100 мкл надосадка культуры и определяли количество кальцеина, высвобождаемого (интенсивность флуоресценции) в надосадок культуры, используя устройство для считывания флуоресценции для планшетов (485 нм/538 нм). Цитотоксическую активность клеток ЬАК рассчитывали по следующей формуле 1:
Цитотоксическая активность (%)=[(найденное значение для каждой лунки - минимальное высвобождаемое количество)/(максимальное высвобождаемое количество - минимальное высвобождаемое количество)] х 100.
В указанной выше формуле минимальное высвобождаемое количество означает количество кальцеина, высвобождаемого в лунке, содержащей только клетки-мишени, показывающее количество кальцеина, высвобождаемого естественным образом из клеток-мишеней. Кроме того, максимальное высвобождаемое количество относится к количеству кальцеина, высвобождаемого в том случае, когда клетки полностью разрушаются при добавлении к клеткам-мишеням поверхностно-активного вещества тритона Х-100 (производства Ν;·ι1<;·ι1;·ιί Те^цие, 1пс.) до получения конечной концентрации 0,05%. Результаты показаны в табл. 25. В таблице «Е/Т» показывает отношение количества эффекторных клеток к количеству клеток-мишеней (эффекторные клетки/клетки-мишени).
- 34 012520
Таблица 25
Концентраци я сыворотки и среда | Фрагмент фибронектина | Е/Т | Цитотоксическая активность (%) (клеткимишени К562) | Цитотоксическая активность (%) (клеткимишени БаисН) |
0% χνΐνθ20 | Контроль (Без иммобилизации ΕΉ£γ) | 20 | 28,7 | 13,3 |
0% χνΐνθ20 | СН-296 | 20 | 46,7 | 23,8 |
0% χνΐνθ20 | Н-296 | 20 | 49, 9 | 19,0 |
0,2% χνΐνθ20 | Контроль (Без иммобилизации ГЫ£г) | 10 | 13,3 | 11, 6 |
0,2% χνΐνθ20 | СН-296 | 10 | 18,2 | 18,6 |
1% χνΐνθ20 | Контроль (Без иммобилизации ЕЫ£г) | 20 | 36,5 | 24,8 |
1% χνΐνθ20 | Н-296 | 20 | 62,8 | 39,0 |
5% χνΐνθ20 | Контроль (Бёз иммобилизации ГИ£г) | 30 | 57,0 | 56,6 |
5% χνΐνθ20 | СН-296 | 30 | 78,1 | 59,1 |
0% ΑΙΜ V | Контроль (Без иммобилизации ΡΝίτ) | 30 | 25,2 | 23,4 |
0% ΑΙΜ V | СН-296 | 30 | 36, 8 | 28,1 |
5% ΑΙΜ V | Контроль (Без иммобилизации ΓΝ£γ) | 30 | 55,3 | 49, 8 |
5% ΑΙΜ V | СН-296 | 30 | 77,2 | 53, 6 |
5% ΑΙΜ V | Контроль (Без иммобилизации ГЫ£г) | 10 | 35,1 | 50, 5 |
5% ΑΙΜ V | СН-296 | 10 | 71, 6 | 51, 8 |
5% ΑΙΜ V | Н-2 96 | 10 | 73, 9 | 57, 8 |
5% χνινοιο | Контроль (Без иммобилизации ГЫ£г) | 10 | 72, 6 | 51,1 |
5% χνινοιο | СН-296 | 10 | 84,6 | 57,4 |
5% χνινοιο | Н-2 96 | 10 | 89,3 | 69, 5 |
Как показано в табл. 25, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток БАК с использованием среды, не содержащей сыворотки, или среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, цитотоксическая активность клеток БАК была выше по сравнению с цитотоксической активностью в контрольной группе. Кроме того, указанный эффект наблюдался даже в случае замены основной среды. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим во время культивирования клеток БАК с использованием среды, не содержащей сыворотки, или среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки.
Пример 26. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток БАК с использованием среды с низким содержанием сыворотки (А1М V) (экспансия посредством многократной стимуляции)-1.
(1) Индукция и культивирование клеток БАК.
Индукцию и культивирование клеток БАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (1) примера 2, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли средой А1М V, содержащей 1% сыворотки АВ человека. Результаты показаны в табл. 26.
Таблица26
Концентрация сыворотки и среда | Фрагмент фибронектина | Стимуляция в 0 день от начала куль тивирования | Стимуляция на 9-й день после начала культивирования | Кратность экспансии (раз) |
1% ΑΙΜ V | Контроль (Без иммобилизации Εν£ε) | Анти-СОЗ | Анти-СБЗ | х130 |
1% ΑΙΜ V | СН-296 | Анти-СБЗ+СН- 296 | Анти-СБЗ+СН- 296 | х2419 |
Как показано в табл. 26, в группе с многократным использованием нового оборудования для культивирования, в котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина и анти-СИ3-антитело на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток БАК с использованием среды А1М V, содержащей низкую концентрацию сыворотки (1%), кратность экспансии клеток БАК была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Указанные кратности экспансии были намного выше, чем кратность экспансии в группе с многократным использованием оборудования для культивирования, в котором иммобилизовали только анти-СИ3-антитело на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток БАК. Другими словами, выяснено, что клети БАК можно было индуцировать и культивировать с высокой кратностью экспансии посредством стимуляции с использованием фрагмента фибронектина и анти-СИ3-антитела на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток БАК
- 35 012520 даже в том случае, когда использовали среду, содержащую низкую концентрацию сыворотки.
Пример 27. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬЛК с использованием среды с низким содержанием сыворотки (АТМ V) (экспансия посредством многократной стимуляции)-2.
(1) Иммобилизация антитело против СЭ3 человека и фрагмента ΡΝ.
Антитело против СЭ3 человека и фрагмент ΡΝ иммобилизовали на оборудования для культивирования (в сосуде), используемом в последующем эксперименте. Конкретно 1,9 мл (в случае 12-луночного планшет) или 2 мл (в случае флакона объемом 12,5 см2) РВ8, содержащего антитело против СБ3 человека (конечная концентрация 5 мкг/мл), добавляли в 12-луночный планшет для культивирования клеток или флакон для культивирования клеток объемом 12,5 см2 (производства Ра1соп). После указанного добавления в группу с добавлением фрагмента ΡΝ добавляли каждый из фрагментов фибронектина (ΡΝίτ), перечисленных в примере получения 1, так чтобы получить конечную концентрацию 10 мкг/мл (в случае 12-луночого планшета) или 25 мкг/мл (в случае флакона объемом 12,5 см2). В качестве контроля также брали группу без добавления ΡΝίτ.
После инкубации указанного оборудования для культивирования при комнатной температуре в течение 5 ч оборудование для культивирования хранили при 4°С вплоть до использования. Непосредственно перед использованием РВ8, содержащий антитело и ΡΝίτ, удаляли из оборудования для культивирования посредством аспирации и затем каждую лунку дважды промывали РВ8 и затем один раз средой АТМ V и оборудование для культивирования использовали в каждом из указанных эксперименте.
(2) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
РВМС, полученные согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в 1% АТМ V, так чтобы получить концентрацию 5х105 клеток/мл, и затем суспензию помещали в планшет, на котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека, или в планшет, на котором было иммобилизовано антитело против СБ3 человека и ΡΝίτ, полученный согласно пункту (1) примера 27, в объеме 1 мл/каждую лунку, и в лунки добавляли ТЬ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Указанные планшеты подвергали культивированию при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования). На второй и третий день после начала культивирования добавляли 1% АТМ V, содержащую 1000 Ед./мл ТЬ-2, в объеме 1 мл/каждую лунку. На четвертый день после начала культивирования культуральную среду переносили во флакон для культивирования клеток объемом 25 см2 (производства ЕЫсоп), в котором ничего не иммобилизовали, затем добавляли 7 мл 1% АТМ V и добавляли ТЬ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На седьмой день после начала культивирования часть культуральной среды, концентрацию клеток в которой доводили до 2х105 клеток/мл с помощью среды 1% АТМ V, переносили в свежий флакон, в котором ничего не иммобилизовали, и добавляли ТЬ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На девятый день после начала культивирования часть культуральной среды, концентрацию клеток в которой доводили до 2х105 клеток/мл с использованием 1% АТМ V, переносили во флакон, в котором иммобилизовали антитело против СЭ3 человека, или во флакон, в котором иммобилизовали антитело против СБ3 человека и ΡΝίτ (при условии, что концентрация антитела против СБ3 человека, используемая при иммобилизации, составляла 0,5 мкг/мл), полученный таким же образом, как описано в пункте (1) примера 27, и добавляли ТЬ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На двенадцатый день после начала культивирования часть культуральной среды, концентрацию клеток в которой соответствующим образом доводили до 2х105 клеток/мл с использованием 1% АТМ V, снова переносили в свежий флакон, в котором ничего не иммобилизовали, и добавляли ТЬ-2 так, чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На пятнадцатый день после начала культивирования количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Экспансию осуществляли в таких же условиях при п=3, и каждый из результатов в виде средней±стандартное отклонение показан в табл. 27.
Таблица 27
Концентрация сыворотки и среда | Фрагмент фибронектина | Стимуляция в 0 день от начала культивирования | Стимуляция на 9-й день после начала культивирования | Кратность экспансии (раз) |
1% ΑΙΜ V | Контроль (Без иммо били з а ции ГЫ£г) | Анти-СОЗ | Нет | х3392±779 |
1% ΑΙΜ V | Без иммобилизации ГЫ£г | Анти-СЬЗ | Анти-СРЗ | х4389±1234 |
1% ΑΙΜ V | СН-296 | Анти-СбЗ+СН-296 | Анти-СОЗ+СН-296 | х8545±1328 |
среднее±стандартное отклонение
Как показано в табл. 27, в группе с многократным использованием нового оборудования для культивирования, в котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина и анти-СЭ3-антитело на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток ЬАК с использованием среды, содержащей
- 36 012520 низкую концентрацию сыворотки (1%), кратность экспансии клеток ЬАК была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Указанные кратности экспансии были намного выше, чем кратность экспансии в группе с многократным использованием оборудования для культивирования, в котором иммобилизовали только анти-СОЗ-антитело на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток ЬАК. Другими словами выяснено, что клетки ЬАК можно было индуцировать и культивировать с высокой кратностью экспансии при стимуляции с использованием фрагмента фибронектина и анти-СОЗ-антитела на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток ЬАК даже в том случае, когда использовали среду, содержащую низкую концентрацию сыворотки.
Пример 28. Относительное содержание СО8-позитивных клеток в популяции клеток ЬАК с использованием бессывороточной среды (А1М V) (экспансия посредством многократной стимуляции).
(1) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Индукцию и культивирование клеток ЬАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (1) примера 2, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли средой А1М V, не содержащей сыворотки АВ человека.
(2) Определение относительного содержания популяции СО8-позитивных клеток среди клеток ЬАК.
Относительное содержание СО8-позитивных клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 4. Результаты показаны в табл. 28.
Таблица 28
Концентрация сыворотки и среда | Фрагмент фибронектина | Стимуляция в 0 день от начала культивирования | Стимуляция на 9-й день после начала куль тивирования | Относительное содержание СОвпозитивных клеток <%) |
0% ΑΙΜ V | Контроль (Без иммо били за ции | Анти-СЦЗ | Нет | 43,8 |
ΗΉ£γ) | ||||
0% ΑΙΜ V | СН-296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | Нет | 64,4 |
0% ΑΙΜ V | СН-296 | Анти-СЦЗ+СН- 296 | Анти-СЦЗ+СН- 296 | 76, 6 |
Как показано в табл. 28, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии или на промежуточной стадии индукции клеток ЬАК с использованием среды А1М V, не содержащей сыворотки, относительное содержание СО8-позитивных клеток в популяции клеток, рассчитанное после культивирования клеток ЬАК, может быть индуцировано во время культивирования на высоком уровне. Другими словами, выяснено, что клетки ЬАК можно было индуцировать и культивировать с увеличением относительного содержания СО8-позитивных клеток среди клеток ЬАК в том случае, когда клетки ЬАК индуцировали с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, и одновременно в присутствии фрагмента фибронектина.
Пример 29. Относительное содержание СО8-позитивных клеток в популяции клеток ЬАК при использовании среды с низким содержанием сыворотки (А1М V) (экспансия посредством многократной стимуляции).
(1) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Индукцию и культивирование клеток ЬАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (1) примера 2, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли средой А1М V, содержащей 1% сыворотки АВ человека.
(2) Определение относительного содержания популяции СО8-позитивных клеток среди клеток ЬАК.
Относительное содержание СО8-позитивных клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 4. Результаты показаны в табл. 29.
Таблица 29
Концентрация сыворотки и среда | Фрагмент фибронектина | Стимуляция в 0 день от начала культивирования | Стимуляция на 9-й день после начала культивирования | Относительное содержание СО8позитивных клеток (%) |
1% ΑΙΜ V | Контроль (Без иммобилизации ГМГг) | Анти-СОЗ | Нет | 39,2 |
1% ΑΙΜ V | Контроль (Без иммобилизации γν£γ) | Анти-СОЗ | Анти-СВЗ | 60,0 |
1% ΑΙΜ V | СН-296 | Анти-СЦЗ+СН- 296 | Нет | 49,2 |
1% ΑΙΜ V | СН-296 | Анти-СОЗ«СН- 296 | Анти- СОЗ+СН-296 | 71,0 |
Как показано в табл. 29, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии или на ранней - промежуточной
- З7 012520 стадии индукции клеток ЬАК с использованием среды ΑΙΜ V, содержащей низкую концентрацию сыворотки, относительное содержание СО8-позитивных клеток в популяции клеток ЬАК после культивирования может быть индуцировано на высоком уровне. Другими словами, выяснено, что клетки ЬАК можно было индуцировать и культивировать с увеличением относительного содержания СО8-позитивных клеток среди клеток ЬАК в том случае, когда клетки ЬАК индуцировали с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, и одновременно в присутствии фрагмента фибронектина.
Пример 30. Индукция экспрессии рецептора 1Ь-2 (1Ь-2В) в системе культивирования клеток ЬАК с использованием бессывороточной среды (А1М V).
(1) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Индукцию и культивирование клеток ЬАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (1) примера 2, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли средой А1М V, не содержащей сыворотки АВ человека.
(2) Определение относительной экспрессии 1Ь-2В среди клеток ЬАК.
Относительное содержание позитивных по экспрессии 1Ь-2В клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 3. Результаты показаны в табл. 30. В таблице относительное содержание позитивных по экспрессии 1Ь-2В клеток (%) показано в виде относительной экспрессии 1Ь-2В (%).
Таблица 30
Концентрация сыворотки и среда (%) | Фрагмент фибронектина | Стимуляция в 0 день от начала куль тивирования | Стимуляция на 9-й день после начала культивирования | Относительная экспрессия ΙΕ-2Η (%) |
0% ΑΙΜ V | Контроль (Вез иммобилизации ΓΝϊγ) | Анти-СБЗ | Нет | 22, 0 |
0% ΑΙΜ V | Контроль (Без иммобилизации ГЫ£г) | Анти-СБЗ | Анти-СБЗ | 39, 9 |
0% ΆΙΜ V | СН-296 | Анти-СБЗ+СН- 296 | Анти- СБЗ+СН-296 | 51,9 |
Как показано в табл. 30, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток ЬАК с использованием среды А1М V, не содержащей сыворотки, относительная экспрессия 1Ь-2В на поверхности клеток ЬАК после культивирования может быть индуцирована на высоком уровне. Другими словами, выяснено, что клетки ЬАК можно было индуцировать и культивировать с увеличением относительной экспрессии 1Ь-2В в том случае, когда клетки ЬАК индуцировали с использованием среды, не содержащей сыворотки, и одновременно в присутствии фрагмента фибронектина.
Пример 31. Индукция экспрессии рецептора 1Ь-2 (1Ь-2В) в системе культивирования клеток ЬАК с использованием среды с низким содержанием сыворотки (А1М V) (экспансия посредством многократной стимуляции).
(1) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Индукцию и культивирование клеток ЬАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (1) примера 2, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли средой А1М V, содержащей 1% сыворотки АВ человека.
(2) Определение относительной экспрессии 1Ь-2В в клетках ЬАК.
Относительное содержание позитивных по экспрессии 1Ь-2В клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 3. Результаты показаны в табл. 31. В таблице относительное содержание позитивных по экспрессии 1Ь-2В клеток (%) показано в виде относительной экспрессии 1Ь-2В (%).
Таблица 31
Концентрация сыворотки и среда (%) | Фрагмент фибронектина | Стимуляция в 0 день от начала культивирования | Стимуляция на 9-й день после начала культивирования | Относительная Экспрессия 1Ъ-2К (%) |
1% ΆΙΜ V | Контроль (Без иммобилизации ΓΝίτ) | Анти-СБЗ | Нет | 23, 6 |
1% ΑΙΜ V | СН-296 | Анти-СБЗ+СН- 296 | Нет | 27,2 |
1% ΑΙΜ V | СН-296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | Анти-СБЗ+СН- 296 | 69,1 |
Как показано в табл. 31, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток ЬАК с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, относительная экспрессия 1Ь-2В на поверхности клеток ЬАК во время культивирования может быть индуцирована на высоком уровне. Другими словами, выяснено, что клетки ЬАК можно было индуцировать и культивировать с увеличением относительной экспрессии 1Ь-2В в том случае, когда клетки ЬАК индуцировали с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, и одновременно в
- 38 012520 присутствии фрагмента фибронектина.
Пример 32. Относительное содержание СО8-позитивных клеток в популяции клеток БАК при использовании среды с низким содержанием сыворотки (А1М У).
(1) Индукция и культивирование клеток БАК.
Индукцию и культивирование клеток БАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (3) примера 1, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли средой А1М У, содержащей 1% сыворотки АВ человека.
(2) Определение относительного содержания популяции СО8-позитивных клеток среди клеток БАК.
Относительное содержание СО8-позитивных клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 4. Результаты показаны в табл. 32.
Таблица 32
Концентрация сыворотки и среда | Фрагмент фибронектина | Относительное содержание С08-позитивных клеток (%) |
1% ΑΙΜ V | Контроль (Без иммобилизации ЕЫ£г) | 41, 02 |
1% ΑΙΜ V | СН-296 | 56,73 |
Как показано в табл. 32, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток БАК с использованием среды А1М У, содержащей низкую концентрацию сыворотки, относительное содержание СО8-позитивных клеток среди клеток БАК во время культивирования может быть индуцировано на высоком уровне. Другими словами, выяснено, что клетки БАК можно было индуцировать и культивировать с увеличением относительного содержания СО8-позитивных клеток среди клеток БАК в том случае, когда клетки БАК индуцировали с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, и одновременно в присутствии фрагмента фибронектина.
Пример 33. Определение цитотоксической активности в системе культивирования клеток БАК с использованием бессывороточной среды или среды с низким содержанием сыворотки.
(1) Индукция и культивирование клеток БАК.
Индукцию и культивирование клеток БАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (3) примера 1 или в пункте (1) примера 2, при условии, что среду, используемую во время индукции и культивирования, заменяли средой ХУ1УО10, ХУ1УО20 или А1М У, содержащей 0 или 1% сыворотки АВ человека.
(2) Определение цитотоксической активности культивируемых клеток БАК.
Цитотоксическую активность БАК на пятнадцатый день после начала культивирования определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 25. Результаты показаны в табл. 33.
Таблица 33
Концентрация сыворотки и среда | Фрагмент фибронектина | Стимуляция в 0 день от начала культивирования | Стимуляция на 9-й день после начала культивирования | Е/Т | Цитотоксическая активность (%) клет ки-мишени К562 | Цитотоксическая активность <%) клетки-мишени 0аис11 |
о% χνινοιο | Контроль (без иммобилиз а ции ГНГг) | Анти-СЭЗ | Нет | 10 | 11,88 | 10,84 |
0% χνινοιο | СН-296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | Нет | 10 | 19, 55 | 26,23 |
1% ΑΙΜ V | Контроль (без иммо били э а ции Шг) | Анти-СОЗ | Нет | 10 | 16,82 | 33,02 |
1% ΑΙΜ V | СН-296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | Нет | 10 | 46,54 | 42,3 |
0% χνΐνο20 | Контроль (без иммобилиз а ции ЕШ) | Анти-СОЗ | Анти-СОЗ | 10 | 24,5 | 13,3 |
0% χνΐνθ20 | СН-296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | 10 | 30,8 | 23,3 |
1% χνΐν020 | Контроль (без иммобилизации ЕЫ£г) | Анти-СОЗ | Анти-СОЗ | 10 | 18,5 | 13,9 |
1% χνΐνΟ20 | СН-296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | 10 | 30,8 | 28,5 |
1% χνινοιο | Контроль (без иммобилизации ГЫ£г) | Анти-СОЗ | Анти-СОЗ | 10 | 13,8 | 8,4 |
1% χνινοιο | СН-296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | Анти-СОЗ+СН- 296 | 10 | 33,0 | 31,8 |
Как показано в табл. 33, в группе с использованием оборудования для культивирования, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии или на ранней стадии и на промежуточной стадии индукции клеток БАК с использованием среды, не содержащей сыворотки, или среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, цитотоксические активность клеток БАК была выше
- 39 012520 по сравнению с цитотоксической активностью в контрольной группе. Кроме того, указанный эффект наблюдался даже в случае замены основной среды. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим во время культивирования клеток ЬАК с использованием среды, не содержащей сыворотки, или среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки.
Пример 34. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬАК С использованием среды с низким содержанием сыворотки (ХУ1У010) (культивирование с использованием проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток).
(1) Иммобилизация антитела против СЭ3 человека и фрагмента ЕК
Антитело против СЭ3 человека и фрагмент ЕN иммобилизовали на оборудования для культивирования (проницаемый для газа СО2 мешок для культивирования клеток), используемом в последующем эксперименте. Конкретно, 20 мл РВ8, содержащего антитело против СЭ3 человека (конечная концентрация: 5 мкг/мл), добавляли в проницаемый для газа СО2 мешок для культивирования клеток объемом 85 см2 (производства Вах1ет). После добавления в группу с добавлением фрагмента ЕN добавляли каждый из фрагментов фибронектина (Е^т), описанных в примере получения 1, так чтобы получить конечную концентрацию 425 мкг/мл. В качестве контроля также использовали группу без добавления ЕШг.
После инкубации указанного оборудования для культивирования при комнатной температуре в течение 5 ч оборудование для культивирования хранили при 4°С вплоть до использования. Непосредственно перед использованием РВ8, содержащий антитело и ЕШг удаляли из оборудования для культивирования посредством аспирации и затем каждую лунку дважды промывали РВ8 и затем один раз средой ХУ1У010, содержащей 1% сыворотки АВ человека (в дальнейшем просто называемой 1% ХУ1У010), чтобы далее подвергнуть экспериментам.
(2) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
РВМС, полученные согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в 1% ХУ1У010, так чтобы получить концентрацию 1х106 клеток/мл, и затем суспензию клеток помещали в количестве 10 мл/каждый мешок в проницаемый для газа СО2 мешок для культивирования клеток, на котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека, или в проницаемый для газа СО2 мешок для культивирования клеток, на котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека и ЕШк полученный согласно пункту (1) примера 34, и добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Указанные проницаемые для газа СО2 мешки для культивирования клеток инкубировали при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования). На второй день после начала культивирования добавляли 1% ХУ1У010, содержащую 1000 Ед./мл 1Ь-2, в количестве 20 мл/каждый мешок. На четвертый день после начала культивирования добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На шестой день после начала культивирования добавляли 1% ХУ1У010 в количестве 30 мл/каждый мешок, и добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На восьмой день после начала культивирования часть культуральной среды соответствующим образом разбавляли и затем разбавление переносили в проницаемый для газа СО2 мешок для культивирования клеток объемом 85 см2, в котором ничего не иммобилизовали, и в него добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На одиннадцатый и тринадцатый день после начала культивирования добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На пятнадцатый день после начала культивирования количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим, и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Результаты показаны в табл. 34.
Таблица 34
Концентрация сыворотки и среда | Дни культивирования | Фрагмент фибронектина | Кратность экспансии (раз) |
ι% χνινοιο | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ΡΝ£γ) | х34 |
1% χνινοιο | 15 Дней | СН-296 | хЮ1 |
Как показано в табл. 34, в группе с использованием проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток ЬАК с использованием среды (ХУ1У010), содержащую низкую концентрацию сыворотки (1%), и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток кратность экспансии клеток ЬАК была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим во время культивирования клеток ЬАК с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток.
Пример 35. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬАК с использованием среды с низким содержанием сыворотки (ХУ1У010) (культивирование в случае комбинирования флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток).
(1) Иммобилизация антитела против СЭ3 человека и фрагмента Е№
Антитело против СЭ3 человека и фрагмент ЕN иммобилизовали на оборудовании для культивиро
- 40 012520 вания (флакон для культивирования клеток объемом 25 см2), используемом в последующем эксперименте. Конкретно, 6 мл РВ8, содержащего антитело против СБ3 человека (конечная концентрация: 5 мкг/мл) добавляли во флакон для культивирования клеток объемом 25 см2 (производства Согшпд). После добавления в группе с добавлением фрагмента ΡN добавляли каждый из фрагментов фибронектина (РМг), описанных в примере получения, так чтобы получить конечную концентрацию 42,5 мкг/мл. В качестве контроля также использовали группу без добавления РМг.
После инкубации указанного оборудования для культивирования при комнатной температуре в течение 5 ч оборудование для культивирования хранили при 4°С вплоть до использования. Непосредственно перед использованием РВ8, содержащий антитело и РМг, удаляли из оборудования для культивирования и каждый флакон дважды промывали РВ8 и затем один раз средой ΧνΙν010, содержащей 1% сыворотки АВ человека (в дальнейшем просто называемой 1% ΧνΙν010), используя далее в каждом из экспериментов.
(2) Индукция и культивирование клеток БАК.
РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в 1% ΧνΙν010, так чтобы получить концентрацию 1/106 клеток/мл, и затем суспензию клеток помещали в количестве 3 мл/каждый флакон во флакон, в котором было иммобилизовано антитело против СБ3 человека, или во флакон, в котором было иммобилизовано антитело против СБ3 человека и РКТт, полученный согласно пункту (1) примера 35, и в него добавляли ГБ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Указанные флаконы инкубировали при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования). В первый день или во второй день после начала культивирования добавляли 1% ΧνΙν010, содержащую 1000 Ед./мл ΙΕ-2, в количестве 7 мл/каждый флакон. Далее инкубацию осуществляли в зависимости от периода стимуляции анти-СП3-антителом ± СН-296 двумя способами. (ί) На четвертый день после начала культивирования культуральную среду переносили в проницаемый для газа СО2 мешок для культивирования клеток объемом 85 см2, в котором ничего не иммобилизовали. Затем в него добавляли 1% ΧνΙν010 в количестве 20 мл/каждый мешок и добавляли 1Б-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. Затем на шестой день после начала культивирования добавляли 1% ΧνΙν010 в количестве 30 мл/каждый мешок и добавляли ΙΕ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл (период стимуляции анти-СП3-антителом ± СН-296: 4 дня). (ίί) На четвертый день или на пятый день после начала культивирования в культуральную среду добавляли ΙΕ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На шестой день после начала культивирования культуральную среду переносили в проницаемый для газа СО2 мешок для культивирования клеток объемом 85 см2, в котором ничего не иммобилизовали, в него добавляли 1% ΧνΙν010 в количестве 50 мл/каждый мешок и добавляли ΙΕ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл (период стимуляции анти-СБ3-антителом ± СН296: 6 дней). В обоих условиях на восьмой день после начала культивирования часть культуральной среды соответствующим образом разбавляли и клетки в разведении переносили в проницаемый для газа СО2 мешок для культивирования клеток объемом 85 см2, в котором ничего не иммобилизовали, и в него добавляли ΙΕ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На одиннадцатый и тринадцатый день после начала культивирования добавляли ΙΕ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На пятнадцатый день после начала культивирования количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Результаты показаны в табл. 35.
Таблица 35
Концентрация сыворотки и среда | Период стимуляции антиСОЗ±СН-296 | Дни культивирования | Фрагмент фибронектина | Кратность экспансии (раз) |
ι% χνινοιο | 4 Дней | 15 Дней | Контроль (Бев иммобилизации ΚΝίΓ) | х235 |
1% χνινοιο | 4 Дней | 15 Дней | СН-296 | х498 |
ι% χνινοιο | 6 Дней | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ΓΝ£γ) | х425 |
ι% χνινοιο | 6 Дней | 15 Дней | СН-296 | х690 |
Как показано в табл. 35, в группе с использованием флакона для культивирования клеток, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток БАК, в случае комбинирования флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды (ΧνΙν010), содержащей низкую концентрацию сыворотки (1%), кратность экспансии клеток БАК была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим во время культивирования клеток БАК в случае комбинирования флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки.
Пример 36. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток БАК с использо
- 41 012520 ванием среды с низким содержанием сыворотки (АГМ У) (культивированием в случае комбинирования флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток).
(1) Иммобилизация антитела против СЭ3 человека и фрагмента ЕЛ.
Антитело против ΕΌ3 человека и фрагмент ΕN иммобилизовали на оборудовании для культивирования (флакон для культивирования клеток объемом 25 см2), используемом в последующем эксперименте, таким же образом, как описано в пункте (1) примера 35. Непосредственно перед использованием РВ8, содержащий антитело и ЕХГг, удаляли из указанного оборудования для культивирования, и каждый флакон дважды промывали РВ8 и один раз средой ΛΙΜ У, содержащей 1% сыворотки АВ человека (в дальнейшем просто называемой 1% А^ У), используя далее в каждом из экспериментов.
(2) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в 1% А^ У, так чтобы получить концентрацию 1 х 106 клеток/мл, и затем суспензию клеток помещали в количестве 3 мл/каждый флакон во флакон, в котором было иммобилизовано антитело против ΕΌ3 человека, или во флакон, в котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека и ЕНГг, полученный согласно пункту (1) примера 36, и в него добавляли ΙΕ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Указанные флаконы инкубировали в 5% СО2 при 37°С (нулевой день культивирования). В первый день после начала культивирования добавляли 1% А^ У, содержащую 1000 Ед./мл ΙΕ-2, в количестве 7 мл/каждый флакон. На четвертый день после начала культивирования культуральную среду переносили в проницаемый для газа СО2 мешок для культивирования клеток объемом 85 см2, в котором ничего не иммобилизовали, добавляли 1% АПЧ У в количестве 20 мл/каждый мешок и добавляли ΙΕ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На шестой день после начала культивирования добавляли 1% АВМ У в количестве 30 мл/каждый мешок и добавляли ΙΕ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На восьмой день после начала культивирования часть культуральной среды соответствующим образом разбавляли и затем переносили в проницаемый для газа СО2 мешок для культивирования клеток объемом 85 см2, в котором ничего не иммобилизовали, и в него добавляли ΙΕ-2, так чтобы получить конечную концентрация 500 Ед./мл. На одиннадцатый и тринадцатый день после начала культивирования добавляли ΙΕ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На пятнадцатый день после начала культивирования количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Результаты показаны в табл. 36.
Таблица 36
Концентрация сыворотки и среда | Дни куль тивир о в а ни я | Фрагмент фибронектина | Кратность экспансии (раз) |
1% ΑΙΜ V | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации Е14£г) | х327 |
1% ΑΙΜ V | 15 Дней | СН-296 | х566 |
Как показано в табл. 36, в группе с использованием флакона для культивирования клеток, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток БАК, в случае комбинирования флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды (АВМ У), содержащей низкую концентрацию сыворотки (1%), кратность экспансии клеток БАК была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим во время культивирования клеток БАК в случае использования комбинирования флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки.
Пример 37. Относительное содержание СО8-позитивных клеток в популяции клеток БАК при использовании среды с низким содержанием сыворотки (ХУ1У010) (культивирование с использованием проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток).
(1) Индукция и культивирование клеток БАК.
Индукцию и культивирование клеток БАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 34.
(2) Определение относительного содержания популяции СО8-позитивных клеток среди клеток БАК.
Относительное содержание СО8-позитивных клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 4. Результаты показаны в табл. 37.
- 42 012520
Таблица 37
Концентрация сыворотки и среда | Дни культивирования | Фрагмент фибронектина | Относительное содержание С08-ПОЗИТИВНЫХ клеток (%) |
ι% χνινοιο | 15 Дней | Контроль (Вез иммобилизации РЫ£г) | 45,7 |
1% χνινοιο | 15 Дней | СН-296 | 61,6 |
Как показано в табл. 37, в группе с использованием проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток ЬАК с использованием среды (ХУ1УО10), содержащей низкую концентрацию сыворотки (1%), и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток, относительное содержание СП8-позитивных клеток среди клеток ЬАК после культивирования может быть индуцировано на высоком уровне. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим во время культивирования клеток ЬАК с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток.
Пример 38. Относительное содержание СО8-позитивных клеток в популяции клеток ЬАК при использовании среды с низким содержанием сыворотки (ХУ1УО10) (культивирование в случае комбинирования флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток).
(1) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Индукцию и культивирование клеток ЬАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 35.
(2) Определение относительного содержания популяции СО8-позитивных клеток среди клеток ЬАК.
Относительное содержание СО8-позитивных клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 4. Результаты показаны в табл. 38.
Таблица 38
Концентрация сыворотки и среда | Период стимуляции анти-СОЗ±СН296 | Дни культивирования | Фрагмент фибронектина | Относительное содержание СИ8позитивных клеток (¾) |
1% χνινοιο | 4 Дней | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ЕП£г) | 58,1 |
1% χνινοιο | 4 дней | 15 Дней | СН-296 | 70,3 |
ι% χνινοιο | 6 Дней | 15 Дней | Контроль (Вез иммобилизации ΡΝ£ι) | 58,3 |
ι% χνινοιο | 6 Дней | 15 Дней | СН-296 | 72,7 |
Как показано в табл. 38, в группе с использованием флакона для культивирования клеток, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток ЬАК в случае комбинирования флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды (ХУ1УО10), содержащей низкую концентрацию сыворотки (1%), относительное содержание СО8-позитивных клеток среди клеток ЬАК после культивирования может быть индуцировано на высоком уровне по сравнению с содержанием в контрольной группе. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим во время культивирования клеток ЬАК в случае комбинирования флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки.
Пример 39. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬАК с использованием среды с низким содержанием сыворотки (А1М У) (концентрации в начале культивирования и концентрации при субкультивировании).
Подтверждали влияние концентраций клеток в начале культивирования и во время субкультивирования в системе культивирования ЬАК на кратность экспансии.
Концентрации клеток в начале культивирования были 0,5х106 и 1х106 клеток/мл. Концентрации клеток при субкультивировании на четвертый день культивирования были 0,025х106 и 0,05х106 клеток/мл. Концентрации клеток при субкультивировании на седьмой, девятый и одиннадцатый день культивирования составляли 0,2х106 и 0,5х106 клеток/мл. Указанные выше образцы показаны в следующей табл. 39-1.
- 43 012520
Таблица 39-1
Концентрация в начале культивирования | Концентрация на четвертый день после начала культивирования | Концентрация на седьмой, девятый и одиннадцатый день после начала культивирования | |
Образец концентрации клеток 1 | 0,500 | 0,025 | 0,2 |
Образец концентрации клеток 2 | 0,500 | 0, 05 | 0,2 |
Образец концентрации клеток 3 | 0,500 | 0,05 | ю I о 1 |
Образец концентрации клеток 4 | 1,000 | 0,025 | 0,2 |
Образец концентрации клеток 5 | 1,000 | 0,05 | 0,2 |
Образец концентрации клеток 6 | 1,000 | 0, 05 | 0,5 |
* Концентрация клеток (х 106 клеток/мл) (1) Иммобилизация антитела против СЭ3 человека и фрагмента ΕΝ.
Антитело против СЭ3 человека и фрагмент ΕΝ иммобилизовали на оборудования для культивирования, используемом в последующем эксперименте. Конкретно, 1 мл РВ8, содержащего антитело против СЭ3 человека (конечная концентрация: 5 мкг/мл), добавляли в 24-луночный планшет для культивирования клеток. После добавления в группе с добавлением фрагмента ΕΝ добавляли фрагмент фибронектина (СН-296), описанный в примере получения 1, так чтобы получить конечную концентрацию 25 мкг/мл. В качестве контроля также использовали группу без добавления СН-296.
Затем указанное оборудование культивировали при комнатной температуре в течение 5 ч и оборудование для культивирования хранили при 4°С вплоть до использования. Непосредственно перед использованием РВ8, содержащий антитело против СЭ3 человека и СН-296, удаляли аспирацией из указанного оборудования для культивирования и каждую лунку дважды промывали РВ8 и один раз средой КРМД чтобы затем использовать в каждом из экспериментов.
(2) Индукция и культивирование клеток ЬЛК.
РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в ЛГМ V, содержащей 1% сыворотки АВ человека, так чтобы группы, в которых клетки культивировали в виде образцов концентрации клеток 1, 2 и 3, имели концентрацию 0,5х106 клеток/мл, и чтобы группы, в которых клетки культивировали в виде образцов концентрации клеток 4, 5 и 6, имели концентрацию 1х106 клеток/мл. Затем суспензию клеток помещали в количестве 1 мл/каждую лунку в планшет, на котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека, или в планшет, на котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека и СН-296, полученный согласно пункту (1), и в него добавляли Ш-2, так чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Указанные планшеты инкубировали при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования). На второй и третий день после начала культивирования добавляли 1% ЛГМ V, содержащую 1000 Ед./мл Ш-2, в количестве 1 мл/каждую лунку.
На четвертый день после начала культивирования группы, в которых клетки культивировали в виде образцов концентрации клеток 1 и 4, разбавляли ΆΣΜ V, содержащей 1% сыворотки АВ человека (максимальное количество жидкости: 6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,025х106 клеток/мл, и группы, в которых клетки культивировали в виде образцов концентрации клеток 2, 3, 5 и 6, разбавляли ΆΖΜ V, содержащей 1% сыворотки АВ человека (максимальное количество жидкости: 6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,05 х106 клеток/мл, и клетки в разведении соответственно переносили во флакон для культивирования клеток объемом 12,5 см2, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе добавляли ^-2. так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На седьмой, девятый и одиннадцатый день после начала культивирования группы, в которых клетки культивировали в виде образцов концентрации клеток 1, 2, 4 и 5, разбавляли ΆΖΜ V, содержащей 1% сыворотки АВ человека (максимальное количество жидкости: 6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,2х106 клеток/мл, и группы, в которых клетки культивировали в виде образцов концентрации клеток 3 и 6, в каждом случае разбавляли ΆΖΜ V, содержащей 1% сыворотки АВ человека (максимальное количество жидкости: 6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,5х106 клеток/мл, и клетки в разведении соответственно переносили во флакон для культивирования клеток объемом 12,5 см2, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе добавляли Ш-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На пятнадцатый день после начала культивирования количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим, и рассчитывали в виде кратности экспансии посредст
- 44 012520 вом сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Каждый эксперимент осуществляли три раза. Средние результаты для каждого случая показаны в табл. 39-2.
Таблица 39-2
Стимуляция в нулевой день от начала культивирования | Кратность экспансии (раз) | |
Образец концентрации клеток 1 | Анти-СОЗ | 1427 |
Анти-СОЗ+ СН-296 | 2649 | |
Образец концентрации клеток 2 | Анти-СОЗ | 3401 |
Анти-СОЗ+ СН-296 | 3691 | |
Образец концентрации клеток 3 | Анти-СОЗ | 749 |
Анти-СОЗ+ СН-296 | 2508 | |
Образец концентрации клеток 4 | Анти-СОЗ | 256 |
Анти-СБЗ+ СН-296 | 436 | |
Образец концентрации клеток 5 | Анти-СОЗ | 1091 |
Анти-С03 + СН-296 | 1179 | |
Образец концентрации клеток 6 | Анти-СВЗ+ СН-296 | 476 |
Как показано в табл. 39-2, в культуре клеток ЬАК при различных концентрациях клеток в начале культивирования и при субкультивировании в любой группе концентраций клеток высокую кратность экспансии получали в группе, стимулированной СН-296 и анти-СО3-антителом, по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе (стимуляция только анти-СО3-антителом). Другими словами, показано, что клетки ЬАК очевидно могут быть индуцированы и культивированы с высокой кратностью экспансии посредством стимуляции СН-296 в случае концентраций клеток в начале культивирования и во время субкультивирования, которые могут варьировать при различных обстоятельствах.
Пример 40. Относительное содержание СО8-позитивных клеток в популяции клеток ЬАК, культивируемых с использованием среды с низким содержанием сыворотки (А1М V) (концентрации в начале культивирования и при субкультивировании).
(1) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Индукцию и культивирование клеток ЬАК осуществляли таким же образом, как в примере 39.
(2) Определение относительного содержания популяции СО8-позитивных клеток среди клеток ЬАК.
Относительное содержание СО8-позитивных клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 4. Результаты показаны в табл. 40.
Таблица 40
Стимуляция в нулевой день от начала культивирования | Относительное содержание С08позитивных клеток (%) | |
Образец концентрации клеток 1 | Анти-СОЗ | 55 |
Анти-СБЗ+ СН-296 | 63 | |
Образец концентрации клеток 2 | Анти-СЭЗ | 62 |
Анти-С03+ СН-296 | 73 | |
Образец концентрации клеток 3 | Анти-СОЗ | 71 |
Анти-СОЗ+ СН-296 | 75 | |
Образец концентрации клеток 4 | Анти-СЭЗ | 56 |
Анти-С03+ СН-296 | 70 | |
Образец концентрации клеток 5 | Анти-СОЗ | 61 |
Анти-С03+ СН-296 | 70 | |
Образец концентрации клеток 6 | Анти-С03+ СН-296 | 76 |
Как показано в табл. 40, в культуре клеток ЬАК при различных концентрациях клеток в начале культивирования и при субкультивировании в любой группе концентраций клеток относительное содержание СО8-позитивных клеток в клетках ЬАК во время культивирования может быть индуцировано на высоком уровне в группе, стимулированной СН-296 и анти-СО3-антителом, по сравнению с содержанием в контрольной группе (стимуляция только анти-СО3-антителом). Другими словами, выяснено, что клетки ЬАК можно индуцировать и культивировать с явно увеличенным относительным содержанием СО8-позитивных клеток среди клеток ЬАК при стимуляции СН-296 в случае концентраций клеток в начале культивирования и при субкультивировании, которые могут варьировать при различных обстоятельствах.
Пример 41. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬАК с использо
- 45 012520 ванием среды с низким содержанием сыворотки (А1М V) (высокая концентрация, высокая плотность культуры).
В системе культивирования клеток БАК можно уменьшить количество среды, материала и трудозатрат, если в максимально возможной степени можно регулировать конечное количество культуральной среды и конечную площадь культуры. Влияние на кратность экспансии подтверждали в случае культивирования клеток при высокой концентрации и высокой плотности.
Брали группу без регулирования концентрации клеток и плотности клеток при субкультивировании (группа обычного культивирования); группу, в которой концентрации клеток при субкультивировании на седьмой и десятый день культивирования соответственно были в 1,8 раза и примерно в 6 раз выше, чем в группе обычного культивирования (группа культивирования при высокой концентрации, при условии, что плотность клеток сходным образом была 1,8-кратной и примерно 6-кратной пропорционально концентрации); группу, в которой концентрации клеток при субкультивировании на седьмой и десятый день культивирования соответственно были в 1,3 раза и примерно в 2,5 раза выше, чем в группе обычного культивирования, а плотности клеток соответственно были примерно 3,9-кратными и 7,5-кратными (группа высокой концентрации, высокой плотности культивирования). Концентрация клеток и плотность клеток при субкультивировании в каждой из указанных выше групп показаны в следующей табл. 41-1.
Таблица 41-1
Нулевой день культивирования | Четвертый день культивирования | Седьмой день культивирования | Десятый день культивирования | ||
Группа обычного культивирования | Концентрация клеток (х 10й клеток/мл) | 0,333 | 0,050 | 0,100 | 0,15 |
Плотность клеток (х 10® клеток/сьг) | 0,263 | 0,024 | 0,043 | 0,072 | |
Группа культивирования при высокой | Концентрация клеток (х 10® клеток/мл) | 0,333 | 0,050 | 0,180 | 0,893 |
концентрации | |||||
Плотность клеток (х106 клеток/см3) | 0,263 | 0,024 | 0,086 | 0,429 | |
Группа культивирования при высокой концентрации, высокой плотности | Концентрация клеток (х 10® клеток/мл) | 0,333 | 0,050 | 0,13 | 0,38 |
Плотность клеток (х 10® клеток/см2) | 0,263 | 0,024 | 0,186 | 0,543 |
(1) Иммобилизация антитела против ί'Ό3 человека и фрагмента ΕΝ.
Антитело против ί'Ό3 человека и фрагмент ΡΝ иммобилизовали на оборудования для культивирования, используемом в следующем эксперименте. Конкретно, 1,9 мл РВ8, содержащего антитело против ί'Ό3 человека (конечная концентрация: 5 мкг/мл) добавляли в 12-луночный планшет для культивирования клеток. После добавления к группе с добавлением фрагмента ΡΝ добавляли фрагмент фибронектина (СН-296), описанный в примере получения 1, так чтобы получить конечную концентрацию 25 мкг/мл. В качестве контроля также использовали группу без добавления СН-296.
После инкубации указанного оборудования для культивирования при комнатной температуре в течение 5 ч, оборудование для культивирования хранили при 4°С вплоть до использования. Непосредственно перед использованием РВ8, содержащий антитело против СЭ3 человека и СН-296, удаляли аспирацией из указанного оборудования для культивирования и затем каждую лунку два раза промывали РВ8 и один раз средой КРМ1. Каждый эксперимент осуществляли, используя данное оборудование для культивирования.
(2) Индукция и культивирование клеток БАК.
В каждой группе культивирования РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в А1М V, содержащей 1% сыворотки АВ человека, так чтобы получить концентрацию 0,33х106 клеток/мл, и затем суспензию клеток помещали в планшет, на котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека, или в планшет, на котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека и СН-296, полученный согласно пункту (1) примера 41, в объеме 3 мл/каждую лунку, и в него добавляли 1Б-2, так чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Указанные планшеты инкубировали при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования).
На четвертый день после начала культивирования каждую группу культивирования разбавляли А1М V, содержащей 1% сыворотки АВ человека (максимальное количество жидкости: 6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,05х106 клеток/мл, и клетки в разведении переносили во флакон для культивирования клеток объемом 12,5 см1 2, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе добавляли 1Б2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На седьмой день после начала культивирования группу обычного культивирования и группу культивирования при высокой концентрации разбавляли А1М V, содержащей 1% сыворотки АВ человека
- 46 012520 (максимальное количество жидкости: 6 мл), так чтобы получить концентрацию в группе обычного культивирования, равную 0,1х106 клеток/мл, и концентрацию в группе культивирования при высокой концентрации, равную 0,18х106 клеток/мл. Клетки в разведении переносили во флакон для культивирования клеток объемом 12,5 см2, в котором ничего не иммобилизовали. Кроме того, группу культивирования при высокой концентрации, высокой плотности разбавляли А1М У, содержащей 1% сыворотки АВ человека (максимальное количество жидкости: 9 мл), так чтобы получить концентрацию 0,13х106 клеток/мл, и клетки в разведении переносили во флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, который выдерживали в вертикальном состоянии, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На десятый день после начала культивирования группу обычного культивирования и группу культивирования при высокой концентрации разбавляли А1М У, содержащей 1% сыворотки АВ человека (максимальное количество жидкости: 6 мл), так чтобы получить концентрацию в группе обычного культивирования 0,15х106 клеток/мл, и концентрацию в группе культивирования при высокой концентрации 0,893х106 клеток/мл. Клетки в разведении переносили во флакон для культивирования клеток объемом 12,5 см2, в котором ничего не иммобилизовали. Кроме того, группу культивирования при высокой концентрации, высокой плотности разбавляли А1М У, содержащей 1% сыворотки АВ человека (максимальное количество жидкости: 9 мл), так чтобы получить концентрацию 0,38х106 клеток/мл, и клетки в разведении переносили во флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, который выдерживали в вертикальном состоянии, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На одиннадцатый день после начала культивирования в каждой группе добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На пятнадцатый день после начала культивирования количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Каждый эксперимент проводили дважды. Средние результаты для каждого случая показаны в табл. 41-2.
Таблица 41-2
Стимуляция в нулевой день от начала культивирования | Кратность экспансии (раз) | |
Группа обычного культивирования | АнТи-СОЗ | 601 |
Антц-СОЗ+СН-296 | 2325 | |
Группа культивирования при высокой концентрации | Анти-СЦЗ | 112 |
Анти-СЦЗ+СН-296 | 1131 | |
Группа культивирования при высокой концентрации, высокой плотности | Анти-СОЗ | 215 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 1307 |
Как показано в табл. 41-2, в группе обычного культивирования, группе культивирования при высокой концентрации или группе культивирования при высокой концентрации, высокой плотности, высокую кратность экспансии получали в группе, стимулированной СН-296 и анти-СП3-антителом в любой из указанных групп по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе (стимуляция только анти-СП3-антителом).
Другими словами выявлено явное влияние на экспансию стимуляции СН-296 в культуре с высокой концентрацией, высокой плотностью, что может уменьшать количество среды, материала и трудозатраты.
Пример 42. Относительное содержание СО8-позитивных клеток в популяции клеток ЬАК, культивируемых с использованием среды с низким содержанием сыворотки (А1М У) (культура с высокой концентрацией, высокой плотностью).
(1) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Индукцию и культивирование клеток ЬАК осуществляли таким же образом, как в примере 41.
(2) Определение относительного содержания популяции СО8-позитивных клеток среди клеток ЬАК.
Относительное содержание СО8-позитивных клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 4. Результаты показаны в табл. 42.
Таблица 42
Стимуляция в нулевой день от начала культивирования | Относительное содержание С08позитивных клеток (%) | |
Группа обычного культивирования | Анти-СБЗ | 53 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 63 | |
Группа культивирования при высокой концентрации | Анти-СБЗ | 55 |
Анти-СПЗ+СН-296 | 72 | |
Группа культивирования при высокой концентрации, высокой плотности | Анти-СБЗ | 63 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 65 |
- 47 012520
Как показано в табл. 42, в группе обычного культивирования, группе культивирования при высокой концентрации или группе культивирования при высокой концентрации, высокой плотности относительное содержание СО8-позитивных клеток среди клеток ЬАК во всех группах во время культивирования может быть индуцировано на высоком уровне в группе, стимулированной СН-296 и анти-СП3-антителом в любой из групп по сравнению с содержанием в контрольной группе (стимуляция только анти-СО3антителом). Другими словами, выяснено, что клетки ЬАК очевидно могут быть индуцированы и культивированы с увеличением относительного содержания СО8-позитивных клеток среди клеток ЬАК при стимуляции СН-296 в культуре с высокой концентрацией, высокой плотностью, что может уменьшить количество среды, материала и трудозатраты.
Пример 43. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬАК с использованием среды с низким содержанием сыворотки (АЕМ ν) (концентрации сыворотки 0%, 0,15%, 5%^0,1%).
В том случае, когда при культивировании клеток ЬАК кровь берут в объеме 30 мл за один раз, получают примерно 15 мл плазмы. Если учесть, что культивирование в среде, содержащей указанную плазму, проводят в конечном объеме до 10 л, то концентрация плазмы должны составлять 0,15%. Кроме того, в том случае, когда культивирование начинают при концентрации плазмы 5%, на четвертый и последующие дни концентрация плазмы в среде во время субкультивирования и разведения клеток должна составлять примерно 0,1%. С указанной выше точки зрения подтверждали влияние концентрации сыворотки на систему культивирования клеток ЬАК.
В начале культивирования брали группу, содержащую 0%, 0,15% или 5% сыворотки АВ человека, соответственно. РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в АЕМ ν, содержащей сыворотку АВ человека в указанной концентрации, так чтобы получить концентрацию 0,33х106 клеток/мл, и затем суспензию помещали в планшет, на котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека, или в планшет, на котором были иммобилизованы антитело против СЭ3 человека и СН-296, полученный согласно пункту (1) примера 41, в объеме 3 мл/каждую лунку и добавляли ΙΕ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Указанные планшеты инкубировали при 37°С в 5% С02 (нулевой день культивирования).
На четвертый день после начала культивирования группу, подвергнутую культивированию в АЕМ ν, содержащей 0% или 0,15% сыворотки АВ человека, разбавляли ν, содержащей 0% или 0,15% сыворотки АВ человека, так чтобы получить максимальную концентрацию 0,05х106 клеток/мл, и клетки в разведении переносили во флакон для культивирования клеток объемом 12,5 см2, в котором ничего не иммобилизовали (количество жидкости 2,5 мл). Группу, подвергнутую культивированию в АЕМ ν, содержащей 5% сыворотки АВ человека, разбавляли АВМ ν, содержащей 0,1% сыворотки АВ человека (количество жидкости 6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,05х106 клеток/мл, и клетки в разведении переносили во флакон для культивирования клеток объемом 12,5 см2, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе добавляли ΙΕ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На седьмой день после начала культивирования группу, подвергнутую культивированию в АЕМ ν, содержащей 0 или 0,15% сыворотки АВ человека, разбавляли АЕМ ν, содержащей такую же концентрацию сыворотки, так чтобы получить концентрацию 0,11 х 106 клеток/мл, и клетки в разведении переносили в свежий флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, поддерживаемый в вертикальном положении, в котором ничего не иммобилизовали (максимальное количество жидкости: 12,6 мл). Группу, подвергнутую культивированию в АЕМ ν, содержащей 5% сыворотки АВ человека, разбавляли АЕМ ν, содержащей 0,1% сыворотки АВ человека, так чтобы получить концентрацию 0,11х106 клеток/мл, и клетки в разбавлении переносили в свежий флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, поддерживаемый в вертикальном положении, в котором ничего не иммобилизовали (максимальное количество жидкости: 12,6 мл). В каждой группе добавляли ΙΕ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На десятый день после начала культивирования каждую группу, подвергнутую культивированию в АЕМ ν, содержащей 0 или 0,15% сыворотки АВ человека, разбавляли АЕМ ν, содержащей такую же концентрацию сыворотки, так чтобы получить концентрацию 0,22х106 клеток/мл, и клетки в разведении переносили в свежий флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, поддерживаемый в вертикальном положении, в котором ничего не иммобилизовали (максимальное количество жидкости: 12,6 мл).
Группу, подвергнутую культивированию в АЕМ ν, содержащей 5% сыворотки АВ человека, разбавляли АЕМ ν, содержащей 0,1% сыворотки АВ человека, так чтобы получить концентрацию 0,6х106 клеток/мл, и клетки в разведении переносили в свежий флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, поддерживаемый в вертикальном положении, в котором ничего не иммобилизовали (максимальное количество жидкости: 12,6 мл). В каждой группе добавляли ΙΕ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На пятнадцатый день после начала культивирования количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим, и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Каждый эксперимент прово- 48 012520 дили дважды. Средние результаты для каждого случая показаны в табл. 43.
Таблица 43
Концентрация сыворотки и среда | Стимуляция в нулевой день от начала культивирования | Кратность экспансии (раз) |
0% ΑΙΜ V | Анти-СОЗ | 25 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 322 | |
0,15% ΑΙΜ V | Анти-СОЗ | 42 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 197 | |
5% -> 0, 1% ΑΙΜ V | Анти-СОЗ | 175 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 353 |
Как показано в табл. 43, в культуре клеток ЬАК при использовании среды АТМ V, содержащей каждую из указанных концентраций сыворотки, высокую кратность экспансии получали в группе, стимулированной СН-296 и анти-СБ3-антителом, причем в любой группе по концентрации сыворотки по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе (стимуляция только анти-СП3-антителом). Другими словами, в культуре клеток ЬАК при концентрации сыворотки, рассчитанной исходя из условия, что собрано 30 мл крови, клетки ЬАК могут быть безусловно индуцированы и культивированы с высокой кратностью экспансии при стимуляции СН-296 и анти-СП3-антителом. Кроме того, в данном случае клетки во время культивирования присутствовали в высокой концентрация и высокой плотности. Кратность экспансии очевидно была выше даже в тех условиях, которые описаны выше, при стимуляции СН-296, таким образом выявлена эффективность СН-296.
Пример 44. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬАК с использованием среды с низким содержанием сыворотки (АТМ V) (концентрации сыворотки 3%— 1%—·0%—>0%, 3%— 1%—0,1%—>0%, 3%—0,5%—0,2%—0,2% (примерно половина количества конечной культуральной среды), 3%—0,5%—0,2%—0,05%).
Исходя из той же точки зрения, что и в примере 43, подтверждали влияние концентраций сыворотки на систему культивирования клеток ЬАК, принимая в расчет концентрации плазмы, получаемые при сборе 30 мл крови.
Концентрация сыворотки АВ человека составляла 3% в начале культивирования. Соответственно брали группу, в которой клетки разбавляли средой АТМ V, содержащей 1% или 0,5% сыворотки АВ человека на четвертый день культивирования; группу, в которой клетки разбавляли средой АТМ V, содержащей 0%, 0,1% или 0,2% сыворотки АВ человека, на седьмой день культивирования; и группу, в которой клетки разбавляли средой АТМ V, содержащей 0%, 0,05% или 0,2% сыворотки АВ человека, на десятый день культивирования. Указанные выше образцы показаны в следующей табл. 44-1.
Таблица 44-1
Четвертый день культивирования | Седьмой день культивирования | Десятый день культивирования | |
Концентрация сыворотки Образец 1 | 1% | 0% | 0% |
Концентрация сыворотки Образец 2 | 1% | 0,1% | 0% |
Концентрация сыворотки Образец 3 | 0,5% | 0,2% | 0,2% |
Концентрация сыворотки Образец 4 | 0,5% | 0,2% | 0,05% |
* указывает концентрацию сыворотки АВ человека, находящуюся в среде для разведения среды культивирования клеток.
РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в АТМ V, содержащей 3% сыворотки АВ человека, так чтобы получить концентрацию 0,33х106 клеток/мл, и затем суспензию помещали в планшет, на котором было иммобилизовано антитело против СБ3 человека, или в планшет, на котором было иммобилизовано антитело против СБ3 человека и СН-296, полученный согласно пункту (1) примера 41, в объеме 3 мл/каждую лунку, и в него добавляли ТЬ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Указанные планшеты инкубировали при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования).
На четвертый день после начала культивирования группы, подвергнутые культивированию в виде образцов концентрации сыворотки 1 и 2, разбавляли АТМ V, содержащей 1% сыворотки АВ человека (количество жидкости 6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,05х 106 клеток в мл, и разбавление клеток переносили во флакон для культивирования клеток объемом 12,5 см2, в котором ничего не иммобилизовали. Группы, подвергнутые культивированию в виде образцов концентрации сыворотки 3 и 4, разбавляли АТМ V, содержащей 0,5% сыворотки АВ человека (количество жидкости 6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,058х106 клеток/мл, и разбавление клеток переносили во флакон для культивирования клеток объемом 12,5 см2, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе добавляли ТЬ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На седьмой день после начала культивирования группу, подвергнутую культивированию в виде образца концентрации сыворотки 1, разбавляли АТМ V, не содержащей сыворотки АВ человека (количест
- 49 012520 во жидкости 12,6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,28х106 клеток/мл, и группу, подвергнутую культивированию в виде образца концентрации сыворотки 2, разбавляли А1М V, содержащей 0,1% сыворотки АВ человека (количество жидкости 12,6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,28х106 клеток/мл, и разбавление клеток переносили в свежий флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, поддерживаемый в вертикальном положении, в котором ничего не иммобилизовали, соответственно. Группы, подвергнутые культивированию в виде образцов концентрации сыворотки 3 и 4, разбавляли А1М V, содержащей 0,2% сыворотки АВ человека (количество жидкости 12,6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,48х106 клеток/мл, и разбавление клеток переносили в свежий флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, поддерживаемый в вертикальном положении, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На десятый день после начала культивирования группы, подвергнутые культивированию в виде образцов концентрации сыворотки 1 и 2, разбавляли А1М V, не содержащей сыворотки АВ человека (количество жидкости 12,6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,51 х106 клеток/мл, и разбавление клеток переносили в свежий флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, поддерживаемый в вертикальном положении, в котором ничего не иммобилизовали. Группу, подвергнутую культивированию в виде образца концентрации сыворотки 3, разбавляли А1М V, содержащей 0,2% сыворотки АВ человека (количество жидкости 12,6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,839х106 клеток/мл, и группу, подвергнутую культивированию в виде образца концентрации сыворотки 4, разбавляли А1М V, содержащей 0,05% сыворотки АВ человека (количество жидкости 12,6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,43х106 клеток/мл, и разбавление клеток переносили в свежий флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, поддерживаемый в вертикальном положении, в котором ничего не иммобилизовали, соответственно. В каждой группе добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На пятнадцатый день после начала культивирования количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим, и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Каждый эксперимент осуществляли дважды. Средние результаты для каждого случая показаны в табл. 44-2.
Таблица 44-2
Стимуляция в нулевой день от начала культивирования | Кратность экспансии (раз) | |
Концентрация сыворотки Образец 1 | Анти-СОЗ | 182 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 425 | |
Концентрация сыворотки Образец 2 | Анти-СОЗ | 195 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 430 | |
Концентрация сыворотки Образец 3 (примерно половина количества конечной культуральной среды) | Анти-СОЗ | 101 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 242 | |
Концентрация сыворотки Образец 4 | Анти-СОЗ | 190 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 416 |
Как показано в табл. 44-2, в культуре клеток БАК с использованием среды А1М V, содержащей каждую из указанных концентраций сыворотки, получали высокую кратность экспансии в группе, стимулированной СН-296 и анти-СО3-антителом, в любой группе по концентрации сыворотки по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе (стимуляция только анти-СО3-антителом). Другими словами, в культуре клеток БАК при концентрации сыворотки, рассчитанной исходя из условия, что собрано 30 мл крови, клетки БАК могут быть безусловно индуцированы и культивированы с высокой кратностью экспансии при стимуляции СН-296 и анти-СП3-антителом по сравнению со стимуляцией только одним анти-СП3-антителом. Кроме того, в данном случае клетки во время культивирования присутствовали в высокой концентрация и высокой плотности. Кратность экспансии очевидно была выше даже в тех условиях, которые описаны выше, при стимуляции СН-296, таким образом выявлена эффективность СН-296.
Пример 45. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток БАК с использованием среды с низким содержанием сыворотки (А1М V) (культивирование при комбинировании флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток).
(1) Индукция и культивирование клеток БАК.
Индукцию и культивирование клеток БАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 36. Результаты показаны в табл. 45.
- 50 012520
Таблица 45
Концентрация сыворотки и среда | Период стимуляции АнтиСОЗ±СН-296 | Дни культивирования | Фрагмент фибронектина | Кратность экспансии (раз) |
1% ΑΙΜ V | 4 Дней | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ПКг) | х327 |
1% ΑΙΜ V | 4 Дней | 15 Дней | СН-296 | х566 |
1% ΑΙΜ V | б Дней | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ВД | х371 |
1% ΑΙΜ V | 6 Дней | 15 Дней | СН-296 | Х425 |
Как показано в табл. 45 в группе с использованием флакона для культивирования клеток, на котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток ЬАК в случае комбинирования флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа С02 мешка для культивирования клеток с использованием среды У), содержащей низкую концентрацию сыворотки (1%), кратность экспансии клеток ЬАК была выше по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим во время культивирования клеток ЬАК в случае комбинирования флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки.
Пример 46. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬАК с использованием свежевыделенных РВМС и среды, содержащей аутологичную плазму (с использованием среды А^ У, содержащей 0,5% аутологичной плазмы, культивирования при комбинировании флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток).
(1) Выделение и хранение РВМС.
Отбирали 30 мл крови, используя инъекционный шприц для сбора крови, от одного здорового человека-донора, получаемые при согласии с предоставлением полной информации, и затем собранную кровь центрифугировали при 500хд в течение 20 мин, чтобы собрать аутологичную плазму и слой в виде лейкоцитарной пленки. Собранный слой лейкоцитарной пленки разбавляли РВ8, наслаивали на фикол-пак (производства РНаппааа) и центрифугировали при 500хд в течение 20 мин. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) из промежуточного слоя собирали пипеткой и промывали. Относительно собранных свежевыделенных РВМС рассчитывали количество живых клеток способом на основе окрашивания трипановым синим. Каждый эксперимент осуществляли, используя оборудование для культивирования.
Собранную аутологичную плазму инактивировали при 56°С в течение 30 мин и затем центрифугировали при 800хд в течение 30 мин и использовали надосадок в качестве инактивированной аутологичной плазмы (в дальнейшем просо называемой аутологичной плазмой).
(2) Иммобилизация антитела против СЭ3 человека и фрагмента ЕЛ.
Антитело против ΕΌ3 человека и фрагмент ΕN иммобилизовали на оборудование для культивирования (флакон для культивирования клеток объемом 25 см2), используемом в последующем эксперименте, таким же образом, как описано в пункте (1) примера 35. Непосредственно перед использованием РВ8, содержащий антитело и ЕЫГг, удаляли из оборудования для культивирования, и каждый флакон дважды промывали РВ8 и один раз средой А^ У. Каждый эксперимент осуществляли, используя оборудование для культивирования.
(3) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Свежевыделенные РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 46, суспендировали в А^ У, содержащей 0,5% аутологичной плазмы (в дальнейшем просто называемой АРМ У с 0,5% аутологичной плазмы), так чтобы получить концентрацию 1х 106 клеток/мл, и затем суспензию клеток помещали во флакон, на котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека, или во флакон, на котором было иммобилизовано антитело против ΕΌ3 человека и ЕНГг, полученный согласно пункту (2) примера 46, в объеме 3 мл/каждый флакон, и в него добавляли ΙΕ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Указанные флаконы инкубировали при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования). В первый день после начала культивирования добавляли А^ У с 0,5% аутологичной плазмы, содержащую 1000 Ед./мл ΙΕ-2, в количестве 7 мл/флакон. На четвертый день после начала культивирования культуральную среду переносили в проницаемый для газа СО2 мешок для культивирования клеток объемом 85 см2 (мешок 0рЙ8Йе или мешок Х-Ео1й производства Вах1ег), в котором ничего не иммобилизовали. Затем в него добавляли А^ У с 0,5% аутологичной плазмы в количестве 20 мл/каждый мешок, и добавляли ΙΕ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На шестой день после начала культивирования добавляли А^ У с 0,5% аутологичной плазмы в количестве 30 мл/каждый мешок и добавляли ΙΕ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На восьмой день после начала культивирования часть культуральной среды соответствующим образом разбавляли, разбавление переносили в проницаемый для газа СО2 мешок для культивирования клеток объемом 85 см2 (мешок 0р11811е
- 51 012520 или мешок Х-Ео1й), в котором ничего не иммобилизовали, и в него добавляли Ιβ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На одиннадцатый и тринадцатый день после начала культивирования добавляли Ιβ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На пятнадцатый день после начала культивирования количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Результаты показаны в табл. 46.
Таблица 46
Концентрация плазмы, среда и проницаемый для газа СОг мешок для куль тивирования клеток | Донор РВМС | Дни культивирования | Фрагмент фибронектина | Кратность экспансии (раз) |
ΑΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы и мешок ОрЪхздЛе | А | 15 Дней | Контроль (Без иымобилиз ации ЕИ£г) | х22 |
ΑΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы и мешок 0рД131Де | А | 15 Дней | СН-296 | х259 |
ΑΙΜ Ус 0,5% аутологичной плазмы и мешок Χ-Γοίά | А | 15 Дней | СН-296 | Х360 |
ΑΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы и мешок ОрЪхздЛе | В | 15 Дней | Контроль (Без иммо билиз ации РКГг) | х34 |
ΑΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы и мешок 0р1:1з1Де | в | 15 Дней | СН-296 | х432 |
ΑΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы и мешок Χ-Εοίά | в | 15 Дней | СН-296 | х360 |
Как показано в табл. 46, в группе с использованием флакона для культивирования клеток, в котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток БАК, в случае комбинирования флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды (А£М V), содержащую низкую концентрацию аутологичной плазмы (0,5%), кратность экспансии клеток БАК была выше, независимо от видов проницаемых для газа СО2 мешков для культивирования клеток. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим во время культивирования клеток БАК в случае комбинирования флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды, содержащей низкую концентрацию плазмы.
Пример 47. Определение относительного содержания СО8-позитивных клеток в популяции клеток БАК при использовании свежевыделенных РВМС и среды, содержащей аутологичную плазму (с использованием среды А[М V, содержащей 0,5% аутологичной плазмы, культивирование при комбинировании флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток).
(1) Индукция и культивирование клеток БАК.
Индукцию и культивирование клеток БАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (3) примера 46. На пятнадцатый день после начала культивирования определяли относительное содержание СП8-позитивных клеток, таким же образом, как описано в пункте (2) примера 4. Результаты показаны в табл. 47.
- 52 012520
Таблица 47
Концентрация плазмы, среда и проницаемый для газа СО2 мешок для культивирования клеток | Донор РВМС | Дни культивирования | Фрагмент фибронектина | Относительное содержание СО8позитивных клеток (%) |
ΑΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы и мешок 0рЪ131Ье | В | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ΓΝΓγ) | 45,0 |
ΑΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы и мешок Ορΐίδΐϋθ | В | 15 Дней | СН-296 | 89,8 |
ΑΙΜ V С 0,5% аутологичной плазмы и мешок Χ-Γοίά | В | 15 Дней | СН-296 | 90,0 |
Как показано в табл. 47, в группе с использованием флакона для культивирования клеток, в котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток ЬАК при комбинировании флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды (А1М У), содержащей низкую концентрацию аутологичной плазмы (0,5%), относительное содержание СО8-позитивных клеток в популяции клеток ЬАК было выше независимо от видов проницаемых для газа СО2 мешков для культивирования клеток. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим во время культивирования клеток ЬАК в случае комбинирования флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды, содержащей низкую концентрацию плазмы.
Пример 48. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬАК с использованием свежевыделенных РВМС и среды, содержащей аутологичную плазму (с использованием среды А1М У, содержащей 0,5% аутологичной плазмы, культивирование при комбинировании флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток).
(1) Иммобилизация антитела против СЭ3 человека и фрагмента ЕХ.
Антитело против СЭ3 человека и фрагмент ЕN иммобилизовали на оборудовании для культивирования (флакон для культивирования клеток объемом 25 см2), используемом в следующем эксперименте, таким же образом, как описано в пункте (1) примера 35. Непосредственно перед использованием РВ8, содержащий антитело и ЕШг удаляли из оборудования для культивирования, и каждый флакон дважды промывали РВ8 и один раз средой А1М У. Каждый эксперимент осуществляли с использованием оборудования для культивирования.
(2) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Свежевыделенные РВМС, которые получали таким же образом, как описано в пункте (1) примера 46, суспендировали в А1М У, содержащей 0,5% аутологичной плазмы (в дальнейшем просто называемой А1М У с 0,5% аутологичной плазмы), так чтобы получить концентрацию 1х106 клеток/мл, и затем суспензию клеток помещали во флакон, на котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека, или во флакон, на котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека и ЕШг полученный согласно пункту (1) примера 48, в количестве 3 мл/каждый флакон и в него добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Указанные флаконы инкубировали при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования). В первый день после начала культивирования добавляли А1М У с 0,5% аутологичной плазмы, содержащую 1000 Ед./мл 1Ь-2, в количестве 7 мл/каждый флакон. На четвертый день после начала культивирования культуральную среду переносили в проницаемый для газа СО2 мешок для культивирования клеток объемом 85 см2 (мешок 0рЙ811е), в котором ничего не иммобилизовали, в него добавляли А1М У с 0,5% аутологичной плазмы в количестве 20 мл/каждый мешок и добавляли 1Ь2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На шестой день после начала культивирования добавляли А1М У с 0,5% аутологичной плазмы в количестве 30 мл/каждый мешок и добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На восьмой день после начала культивирования часть культуральной среды соответствующим образом разбавляли, затем разбавление переносили в проницаемый для газа СО2 мешок объемом 85 см (мешок 0р11811е) для культивирования клеток, в котором ничего не иммобилизовали, и в него добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На одиннадцатый и тринадцатый день после начала культивирования добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
Кроме того, подобным образом часть (7 мл из 10 мл) культуральной среды после культивирования вплоть до четвертого дня переносили в проницаемый для газа СО2 мешок для культивирования клеток объемом 180 см2, в котором ничего не иммобилизовали, затем в него добавляли А1М У с 0,5% аутологичной плазмы в количестве 58 мл/каждый мешок и добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную кон
- 53 012520 центрацию 500 Ед./мл. На шестой день после начала культивирования в него добавляли А1М У с 0,5% аутологичной плазмы в количестве 65 мл/каждый мешок и добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На восьмой день после начала культивирования часть культуральной среды соответствующим образом разбавляли, затем разбавление переносили в проницаемый для газа СО2 мешок для культивирования клеток объемом 180 см2 (мешок Ор(181(е), в котором ничего не иммобилизовали, и в него добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На одиннадцатый и тринадцатый день после начала культивирования добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. При добавлении также получали систему, в которой добавляли 130 мл А1М У с 0,5% аутологичной плазмы на одиннадцатый день после начала культивирования. На пятнадцатый день после начала культивирования количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Результаты показаны в табл. 48.
Таблица 48
Концентрация плазмы, среда и проницаемый для газа СО2 мешок ДЛЯ культивирования клеток | Площадь мешка для культивирования | Добавление среды на 11-й день | Дни культивирования | Фрагмент фибронектина | Кратность экспансии (раз) |
ΑΙΜ V с 0/5% аутологичной плазмы и мешок Ορϋεϊΐ© | 85 см2 | Нет | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ΡΝ&) | х22 |
ΑΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы и мешок ОрМззЛе | 85 см2 | Нет | 15 Дней | СН-296 | х259 |
ΑΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы и мешок ОрМзлЛе | 180 см2 | Нет | 15 Дней | СН-296 | х473 |
ΑΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы и мешок Ορίίδΐίδ | 180 см2 | Да | 15 Дней | СН-296 | х911 |
Как показано в табл. 48, в группе с использованием флакона для культивирования клеток, в котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток ЬАК при комбинировании флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды (А1М У), содержащей низкую концентрацию аутологичной плазмы (0,5%), кратность экспансии клеток ЬАК была выше независимо от площади культивирования, способа культивирования, конечного количества среды в случае проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим во время культивирования клеток ЬАК в случае комбинирования флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды, содержащей низкую концентрацию плазмы.
Пример 49. Определение относительного содержания СЦ8-позитивных клеток в популяции клеток ЬАК при использовании свежевыделенных РВМС и среды, содержащей аутологичную плазму (с использованием среды А1М У, содержащей 0,5% аутологичной плазмы, культивирование с комбинированием флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток).
(1) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Индукцию и культивирование клеток ЬАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 48. На пятнадцатый день после начала культивирования относительное содержание СЭ8позитивных клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 4. Результаты показаны в табл. 49.
- 54 012520
Таблица 49
Концентрация плазмы, среда и проницаемый для газа СОг мешок для культивирования клеток | Площадь мешка ДЛЯ культивирования | Добавление среды на П-йдень | Дни культивирования | Фрагмент фибронектина | Относительное содержание СО8позитивных клеток (%) |
ΑΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы и мешок Ορΐί&ίΙέ | 85 СкТ | Нет | 15 Дней | Контроль (Без иммобилизации ГЫИ·) | 37,4 |
ΑΙΜ УсО,5% аутологичной плазмы и молок Ор1и11е | 85 см1 | Нет | 15 Дней | СН-296 | 70,0 |
ΑΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы и мешок ОрНзйе | 180 см1 | Нет | 15 Дней | СН-296 | 56,2 |
ΑΙΜ Ус 0,5% аутологичной плазмы и мешок ОрОзИе | 180 см3 | Да | 15 Дней | СН-296 | 58,4 |
Как показано в табл. 49, в группе с использованием флакона для культивирования клеток, в котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток ЬАК, при комбинировании флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды (А1М V), содержащую низкую концентрацию аутологичной плазмы (0,5%), относительное содержание СО8-позитивных клеток в популяции клеток ЬАК было выше независимо от площади культивирования, способа культивирования, конечного количества среды в проницаемом для газа СО2 мешке для культивирования клеток. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим во время культивирования клеток ЬАК в случае комбинирования флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды, содержащей низкую концентрацию плазмы.
Пример 50. Определение цитотоксической активности в системе культивирования клеток ЬАК с использованием свежевыделенных РВМС и среды, содержащей аутологичную плазму (с использованием среды А1М V, содержащей 0,5% аутологичной плазмы и культивирования при комбинировании флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток).
(1) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Индукцию и культивирование клеток ЬАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (3) примера 46.
(2) Определение цитотоксической активности культивируемых клеток ЬАК.
Цитотоксическую активность ЬАК на пятнадцатый день после начала культивирования определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 25. Результаты показаны в табл. 50.
Таблица 50
Концентрация плазмы, среда и проницаемый для газа СОг мешок для культивирования клеток | Дни культивирования | Фрагмент фибронектина | Е/Т | Цитотоксическая активность (%) {Клетки-мишени К562) | Цитотоксичес кая активность (%) (Клеткимишени Саиб!) |
ΑΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы и мешок Ορΐίβίΐβ | 15 Дней | Контроль (Вез иммобилизации ΓΝ£γ) | 90 | 50,9 | 56,2 |
30 | 32,9 | 49,6 | |||
10 | 16,9 | 35,7 | |||
ΑΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы и мешок ΟρϊίβίΧ© | 15 Дней | СН-296 | 90 | 75,9 | 62,3 |
30 | 48,3 | 53,7 | |||
10 | 19,6 | 40,2 |
Как показано в табл. 50, в группе с использованием флакона для культивирования клеток, в котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток ЬАК, при комбинировании флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды (А1М V), содержащей низкую концентрацию аутологичной плазмы (0,5%), цитотоксическая активность клеток ЬАК была выше по сравнению с цитотоксической активностью в контрольной группе. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим во время культивирования клеток ЬАК при комбинировании флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды, содержащей низкую концентрацию плазмы.
Пример 51. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬАК с использованием свежевыделенных РВМС и среды, содержащей аутологичную плазму (с использованием среды А1М V, содержащей 0,5% аутологичной плазмы и культивирования при комбинировании флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток).
(1) Иммобилизация антитела против СОЗ человека и фрагмента ΕΝ.
- 55 012520
Антитело против СЭ3 человека и фрагмент ΕΝ иммобилизовали на оборудовании для культивирования (флакон для культивирования клеток объемом 25 см2), используемом в следующем эксперименте, таким же образом, как описано в пункте (1) примера 35. Непосредственно перед использованием РВ8, содержащий антитело и ΕΝίτ, удаляли из оборудования для культивирования и каждый флакон дважды промывали РВ8 и один раз средой А1М V. Каждый эксперимент проводили с использованием оборудования для культивирования.
(2) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Свежевыделенные РВМС, которые получали таким же образом, как описано в пункте (1) примера 46, суспендировали в А1М V, содержащей 0,5% аутологичной плазмы (в дальнейшем просто называемой А1М V с 0,5% аутологичной плазмы), так чтобы получить концентрацию 5х105 клеток/мл (при условии, что количество живых клеток подсчитывали, используя раствор Ти1к (производства КаШо Кадаки)), затем суспензию клеток помещали во флакон, на котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека, или во флакон, на котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека и ΕΝίΐ, полученный согласно пункту (1) примера 51, в количестве 3 мл/флакон каждый, и в него добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Указанные флаконы инкубировали при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования). В первый день после начала культивирования добавляли А1М V с 0,5% аутологичной плазмы, содержащую 1000 Ед./мл 1Ь-2, в количестве 7 мл/каждый флакон каждый. На четвертый день после начала культивирования часть (7 мл из 10 мл) культуральной среды переносили в проницаемый для газа СО2 мешок для культивирования клеток объемом 180 см2, в котором ничего не иммобилизовали, затем в него добавляли А1М V с 0,5% аутологичной плазмы в количестве 58 мл/каждый мешок и добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На шестой день после начала культивирования добавляли А1М V с 0,5% аутологичной плазмы в количестве 65 мл/каждый мешок и добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На восьмой день после начала культивирования часть культуральной среды соответствующим образом разбавляли, разбавление переносили в проницаемый для газа СО2 мешок для культивирования клеток объемом 180 см2 (мешок Ορΐίδίΐβ), в котором ничего не иммобилизовали, и в него добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. На одиннадцатый и тринадцатый день после начала культивирования в него добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл. При добавлении также получали систему, в которую добавляли 130 мл А1М V, не содержащей аутологичной плазмы, или А1М V с 0,5% аутологичной плазмы на одиннадцатый день после начала культивирования. На пятнадцатый день после начала культивирования количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Результаты показаны в табл. 51.
Таблица 51
Концентрация плазмы, среда и проницаемый для газа СОг мешок для культивирования клеток | Донор РВМС | Добавление среды на 11-й день | Среда, добавленная на 11-й день | Фрагмент фибро не к тин а | Кратность экспансии (раз) |
ΆΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы и мешок Ορίίδίίβ | С | Нет | Нет | Контроль (Веэ иммобилизации ΓΝίτ) | х570 |
Нет | Нет | СН-296 | Х1034 | ||
Да | ΑΙΜ V с 0,5% ау т оло гич ной плазмы | СН-296 | Х1857 | ||
Да | ΑΙΜ V С 0% аутологичной плазмы | СН-296 | Х1882 | ||
ΑΙΜ V С 0,5% аутологичной плазмы и мешок Ορΐίβίίθ | ϋ | Нет | Нет | Контроль (Без иммобилизации ЕЫ£г) | х947 |
Нет | Нет | СН-296 | х1213 | ||
Да | ΑΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы | СН-296 | Х1647 | ||
Да | ΑΙΜ V с 0% аутологичной плазмы | СН-296 | Х1832 | ||
ΆΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы и мешок Ορϋδΐίβ | Е | Нет | Нет | Контроль (Вез иммо били з а ции ЕП£г) | х743 |
Нет | Нет | СН-296 | х931 | ||
Да | ΑΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы | СН-296 | Х1960 | ||
Да | ΑΙΜ V с 0% аутологичной плазмы | СН-296 | Х1747 |
- 56 012520
Как показано в табл. 51, в группе с использованием флакона для культивирования клеток, в котором иммобилизовали каждый фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток БАК, при комбинировании флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды (АЕМ ν), содержащей низкую концентрацию аутологичной плазмы (0,5%), кратность экспансии клеток БАК была выше независимо от площади культивирования, способа культивирования, конечного количества среды в проницаемом для газа СО2 мешке для культивирования клеток. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим во время культивирования клеток БАК при комбинировании флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды, содержащей низкую концентрацию плазмы.
Пример 52. Определение относительного содержания СЦ8-позитивных клеток в популяции клеток БАК при использовании свежевыделенных РВМС и среды, содержащей аутологичную плазму (СС использованием среды АЕМ ν, содержащей 0,5% аутологичной плазмы, культивирование при комбинировании флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток).
(1) Индукция и культивирование клеток БАК.
Индукцию и культивирование клеток БАК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 51. На пятнадцатый день после начала культивирования относительное содержание СБ8позитивных клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 4. Результаты показаны в табл. 52.
Таблица 52
Концентрация плазмы, среда и проницаемый для газа СО? мешок ДЛЯ культивирования клеток | Донор РВМС | Добавление среды на 11-й день | Среда, добавленная на 11-й день | Фрагмент фибронектина | Относительное содержание СО8позитивных клеток {%) |
ΑΙΜ V С 0,5% аутологичной плазмы и мешок ΟρΚϊβίίο | с | Нет | Нет | Контроль (Вез иммобили эации ЕПГг) | 59,1 |
Нет | Нет | СН-296 | 80,8 | ||
Да | ΑΙΜ V С 0,5% аутологичной плазмы | СН-296 | 83,3 | ||
Да | ΑΙΜ V с 0% аутологичной плазмы | СН-296 | 83, 6 | ||
ΑΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы и | О | Нет | Нет | Контроль (Без иммобилизации ЕН£г) | 77,2 |
плазмы и мешок ОрМздЛе | Нет | Нет | СН-296 | 83,4 | |
Да | ΑΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы | СН-296 | 84,0 | ||
Да | ΑΙΜ V с 0% аут ологичн ой плазмы | СН-296 | 85,9 | ||
ΑΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы и мешок ОрМвЮе | Е | Нет | Нет | Контроль (Без иммобилизации ГЫ£г) | 72,6 |
Нет | Нет | СН-296 | 84,6 | ||
Да | ΑΙΜ V с 0,5% аутологичной плазмы | СН-296 | 86,8 | ||
Да | ΑΙΜ V с 0% аут оло гич ной плазмы | СН-296 | 89,4 |
Как показано в табл. 52, в группе с использованием флакона для культивирования клеток, в котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток БАК, при комбинировании флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды (АЕМ ν), содержащей низкую концентрацию аутологичной плазмы (0,5%), относительное содержание СЦ8-позитивных клеток в популяции клеток БАК была выше, независимо площади культивирования, способа культивирования, конечного количества среды в проницаемом для газа СО2 мешке для культивирования клеток. Исходя из указанного выше, выяснено, что каждый из фрагментов фибронектина соответственно применим во время культивирования клеток БАК при комбинировании флакона для культивирования клеток и проницаемого для газа СО2 мешка для культивирования клеток с использованием среды, содержащей низкую концентрацию плазмы.
Пример 53. Индукция экспрессии рецептора ΙΕ-2 (1Б-2К) в системе культивирования клеток БАК с использованием среды с низким содержанием сыворотки (АЕМ ν).
- 57 012520 (1) Индукция и культивирование клеток ЬЛК.
Индукцию и культивирование клеток ЬЛК осуществляли таким же образом, как описано в пункте (3) примера 1. При индукции и культивировании среду для использования заменяли средой V, содержащей 1% сыворотки АВ человека.
(2) Определение относительной экспрессии ГО-2К. в клетках ЬЛК.
Относительное содержание позитивных по экспрессии ГО-2К. клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 3. Результаты показаны в табл. 53. В таблице относительное содержание позитивных по экспрессии ГО-2К. клеток (%) показано в виде относительной экспрессии ГО-2К (%).
Таблица 53
Концентрация сыворотки и среда | Фрагмент фибронектина | Относительная экспрессия 1Ь-2В (%) |
1% ΑΙΜ V | Контроль (Без иммобилизации ЕМ£г) | 23,5 |
1% ΑΙΜ V | СН-296 | 27,2 |
Как показано в табл. 53, в группе с использованием оборудования для культивирования, в котором иммобилизовали каждый из фрагментов фибронектина на ранней стадии индукции клеток ЬЛК с использованием среды V, содержащей низкую концентрацию сыворотки, относительная экспрессия ГО^К на поверхности клеток ЬЛК во время культивирования может быть индуцирована на высоком уровне. Другими словами, выяснено, что клетки ЬЛК можно было индуцировать и культивировать с увеличением относительной экспрессии ГО^К при использовании среды, содержащей низкую концентрацию сыворотки, и одновременно в присутствии фрагмента фибронектина во время индукции клеток ЬЛК.
Пример 54. Экспрессия мутантного белка ретронектина (СН-296№1).
(1) Конструирование вектора, экспрессирующего СН-296№.
ПЦР осуществляли с использованием синтетических ДНК-праймеров с последовательностями 8Е0 ГО N0: 27 и 28 (праймер СН-296№11 и праймер СН-296№2. соответственно) и с использованием в качестве матрицы рСН102, вектора, экспрессирующего СН-296. Полученный в результате фрагмент ДНК обрабатывали ферментами рестрикции NάеI и НшДШ. С другой стороны, получали вектор ρСο1ά14N^2, имеющий сайт NάеI в кодоне инициации трансляции, полученный из рСо1404, описанной в пример 5 в публикации \У0 99/27117, согласно способу примера 4 в той же публикации. Указанный выше фрагмент ДНК встраивали в сайт ферментов рестрикции ШеТ-НшйШ вектора ρСο1ά14N^2, чтобы получить вектор ρ^1ά14ΝΏ2^Η296. Затем осуществляли ПЦР с вектором рЬР2435, имеющим кДНК, кодирующую часть С-конца связывающего клетки домена фибронектина, в качестве матрицы, используя синтетические ДНК-праймеры с последовательностями 8Е0 ГО N0: 28 и 29 (праймер СН-296№2 и праймер СН296№13, соответственно). Полученный в результате фрагмент ДНК обрабатывали ферментами рестрикции ВатШ и ΗίηάΠΕ Полученный таким образом фрагмент ДНК лигировали с продуктом, полученным при обработке ρСο1ά14N^2-СΗ296 ферментами рестрикции ВатШ и ΗίηάΠΕ получая вектор для экспрессии СН-296№1.
(2) Экспрессия и очистка СН-296№1.
ЕксйейсЫа сой ВЬ21 трансформировали с использованием рСо1Д14-СН296№, полученного согласно указанному выше пункту (1) примера 54, и полученный в результате трансформант выращивали на среде ЬВ среда (содержащей 50 мкг/мл ампициллина), содержащей агар в концентрации 1,5% (мас./об.). Выращенную колонию высевали в 30 мл жидкой среды ЬВ (содержащей 50 мкг/мл ампициллина) и колонию культивировали в течение ночи при 37°С. Все количество культивированных клеток высевали в 3 л такой же среды ЬВ и клетки культивировали при 37°С вплоть до логарифмической фазы роста. При указанном культивировании использовали мини-ферментер объемом 5 л (производства В1ой) и культивирование осуществляли в условиях 150 об/мин и аэрацией = 1,0 л/мин. После указанного выше культивирования культуральную среду охлаждали до 15°С, затем в нее добавляли ЕРТС, так чтобы получить конечную концентрацию 1,0 мМ, и осуществляли культивирование в таком состоянии при 15°С в течение 24 ч, чтобы индуцировать экспрессию. Затем бактериальные клетки собирали центрифугированием и ресуспендировали в растворе для разрушения [50 мМ трис-НС1 (рН 7,5), 1 мМ ЕЭТЛ, 1 мМ ЭТТ, 1 мМ РМ8Р, 50 мМ №1С1| в 4-кратном количестве от объема бактериальных клеток. Бактериальные клетки разрушали ультразвуковой обработкой и разрушенные клетки центрифугировали (11000 об/мин, 20 мин), чтобы разделить продукт разрушения на экстракт в надосадке и осадок. Надосадок диализовали против 2 л буфера А [50 мМ трис-НС1 (рН 7,5), 50 мМ №С1], и примерно 40 мл полученного в результате раствора использовали для дальнейшей очистки ионообменной хроматографией следующим образом.
Конкретно, готовили колонку (0 4 см, 20 см) с 8Р-сефарозой (производства Лтегайат Рйагташа), имеющую объем смолы, соответствующий 100 мл, насыщенную буфером А, и диализованный образец наносили на колонку. Колонку промывали 300 мл буфера А и затем осуществляли элюирование с колонки, используя по порядку по 200 мл буфера В [50 мМ трис-НС1 (рН 7,5), 200 мМ №С1], буфера С [50 мМ трис-НС1 (рН 7,5), 300 мМ №С1] и буфера Ω [50 мМ, трис-НС1 (рН 7,5), 500 мМ №С1], и собирали порции примерно по 100 мл каждая, получая фракции 1-6. Собранные фракции подвергали электрофорезу в
- 58 012520
10% δΌδ-ПААГ и после этого фракции 2 и 3 (примерно 200 мл), которые, как было обнаружено, в большом количестве содержали требуемый белок, имеющий молекулярную массу примерно 71 кД, собирали и диализовали против 2 л буфера А.
Затем готовили колонку (03 см, 16 см) с О-сефарозой (производства Атегайат Рйагтааа), имеющую объем смолы, соответствующий 50 мл, насыщенную буфером А, и диализованный образец наносили на колонку. Колонку промывали 200 мл буфера А и затем осуществляли элюирование с колонки, используя по порядку по 150 мл буфера Е [50 мМ трис-НС1 (рН 7,5), 140 мМ ЫаС1], буфера В и буфера С, и собирали порции по 100 мл каждая, получая фракции 1-5. Полученный фракции подвергали электрофорезу в 10% δΌδ-ПААГ и после этого фракцию 1, которая, как было обнаружено, содержит только требуемый белок в большом количестве, собирали в количестве примерно 100 мл и диализовали против 2 л буфера Е [50 мМ натрий-карбонатный буфер, рН 9,5].
Затем диализованную фракцию концентрировали примерно в 4 раза до объема 25 мл, используя СеЩпсопе-10 (производства М1Шроге Согрогайоп), и концентрат исследовали в 10% δΌδ-ПААГ. В результате требуемый белок, имеющий молекулярную массу примерно 71 кД, выявили в виде почти одной полосы и назвали СН-296Ыа. Затем определяли концентрацию белка, используя набор МкгоВСА (производства Р1егсе). В результате обнаружено, что концентрация белка составляла 3,8 мг/мл.
Пример 55. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬАК с использованием среды с низким содержанием сыворотки (А1М V) (концентрации сыворотки 5%— 1%—0%—>0%, 5% —1% —0,05% —0.05%. 3%—1%—0,05%—0,05%, 3%—1%—0,1%—0,05%, 1%—1%—0,1%—0,05%).
Исходя из той же точки зрения, что и в примере 43, исследовали влияние концентрации сыворотки на систему культивирования клеток ЬАК, из расчета концентрации плазмы, получаемой при сборе 30 мл крови.
Соответственно готовили группу, содержащую концентрацию сыворотки АВ человека 5, 3 или 1% в начале культивирования, и впоследствии группу разбавляли средой А1М V, содержащей концентрацию сыворотки АВ человека, которая показана в следующей табл. 54. В данном случае использовали группы, в которых концентрации при субкультивировании соответственно изменяли в каждый день субкультивирования, как показано в следующей табл. 54.
Таблица 54
Образцы концентрации сыворотки
В 0-й день после начала культивирования | На 4-й день после начала культивирования | На 7-й день после начала культивирования | На 10-Й день после начала культивирования | ||
Концентрация сыворотки Образец 1-1 | Концентрация сыворотки | 5% | 1% | 0% | 0% |
Концентрация при субкультнвированни | - | 0,1 | 0,321 | 0,873 | |
Концентрация сыворотки Образец 1*2 | Концентрация сыворотки | 5% | 1% | 0,05% | 0,05% |
Концентрация при субкультивировании | - | 0,2 | 0,321 | 0,841 | |
Концентрация сыворотки Образец 2-1 | Концентрация сыворотки | 3% | 1% | 0,05% | 0,05% |
Концентрация при субкультивировании | — | 0,1 | 0,321 | 0,746 | |
Концентрация сыворотки Образец 2-2 | Концентрация сыворотки | 3% | 1% | 0,1% | 0,05% |
Концентрация при субкультивировании | — | 0,2 | 0,321 | 0,643 | |
Концентрация сыворотки Образец 3-1 | Концентрация сыворотки | 1% | 1% | 0,1% | 0,05% |
Концентрация при еубкультивированин | - | 0,1 | 0,321 | 0,643 | |
Концентрация сыворотки Образец 3-2 | Концентрация сыворотки | 1% | 1% | 0,1% | 0,05% |
Концентрация при еубкультивированин | - | 0,05 | 0,417 | 1,214 | |
Концентрация сыворотки Образец 3-3 | Концентрация сыворотки | 1% | 1% | 0,1% | Без субхультивировдиия, без добавления среды |
Концентрация при субЕсультивироваиии | - | 0,05 | 0,23 |
* Концентрация клеток при субкультивировании (х 106 клеток/мл).
* Концентрации сыворотки в таблице представляют собой концентрации в начале нулевого дня от начала культивирования и концентрации сыворотки, присутствующей в среде, используемой для разведения в последующие дни.
РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в А1М V, содержащей 5, 3 или 1% сыворотки АВ человека, так чтобы получить концентрацию 0,33х106 клеток/мл, и затем суспензию помещали в планшет, на котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека, или в планшет, на котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека и СН-296, полученный согласно пункту (1) примера 41, в объеме 3 мл/каждую лунку, и в него добавляли 1Ь-2, так чтобы получить
- 59 012520 конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Указанные планшеты инкубировали при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования).
На четвертый день после начала культивирования каждую из групп разбавляли А1М У, содержащей 1% сыворотки АВ человека (количество жидкости 6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,1 х106 клеток/мл для групп, в которых культивирование осуществляли при концентрации сыворотки согласно образцам 1-1, 2-1 и 3-1, или так чтобы получить концентрацию 0,2х106 клеток/мл для групп, в который культивирование осуществляли при концентрации сыворотки согласно образцам 1-2 и 2-2, или так чтобы получить концентрацию 0,05х106 клеток/мл для групп, в которых культивирование осуществляли при концентрации сыворотки согласно образцам 3-2 и 3-3. Разбавленные клетки переносили во флакон для культивирования клеток объемом 12,5 см2, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе в него добавляли 1Б-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На седьмой день после начала культивирования группу, в которой культивирование осуществляли при концентрации сыворотки согласно образцу 1-1, разбавляли А1М У, не содержащей сыворотки АВ человека (количество жидкости 12,6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,321 х106 клеток/мл, группы, в которых культивирование осуществляли при концентрации сыворотки согласно образцам 1-2 и 2-1, разбавляли А1М У, содержащей 0,05% сыворотки АВ человека (количество жидкости 12,6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,321х106 клеток/мл, и каждую из групп разбавляли А1М У, содержащей 0,1% сыворотки АВ человека (количество жидкости 12,6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,321х106 клеток/мл для групп, в которых культивирование осуществляли при концентрации сыворотки согласно образцам 2-2 и 3-1, или так чтобы получить концентрацию 0,417х106 клеток/мл для группы, в которой культивирование осуществляли при концентрации сыворотки согласно образцу 3-2, или так чтобы получить концентрацию 0,23 х106 клеток/мл для группы, в которой культивирование осуществляли при концентрации сыворотки согласно образцу 3-3, соответственно. Каждую группу переносили в свежий флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, поддерживаемый в вертикальном положении, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе добавляли 1Б-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На десятый день после начала культивирования группу, в которой культивирование осуществляли при концентрации сыворотки согласно образцу 1-1, разбавляли А1М У, не содержащей сыворотки АВ человека (количество жидкости 12,6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,873 х106 клеток/мл, и каждую группу разбавляли А1М У, содержащей 0,05% сыворотки АВ человека (количество жидкости 12,6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,841 х 106 клеток/мл для группы, в которой культивирование осуществляли при концентрации сыворотки согласно образцу 1-2, или так чтобы получить концентрацию 0,746х106 клеток/мл для группы, в которой культивирование осуществляли при концентрации сыворотки согласно образцу 2-1, или так чтобы получить концентрацию 0,643х106 клеток/мл для групп, в которых культивирование осуществляли при концентрации сыворотки согласно образцам 2-2 и 3-1, или так чтобы получить концентрациию 1,214х 106 клеток/мл для группы, в которой культивирование осуществляли при концентрации сыворотки согласно образцу 3-2, соответственно. Разбавленные клетки переносили в свежий флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, поддерживаемый в вертикальном положении, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе добавляли 1Б-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На пятнадцатый день после начала культивирования, количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим, и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с их количеством в начале культивирования. Каждый эксперимент проводили дважды. Средние результаты для каждого случая показаны в табл. 55.
Таблица 55
Стимуляция в нулевой день от начала культивирования | Кратность экспансии (раз) | |
Концентрация сыворотки Образец 1-1 | Анти-СбЗ | 460 |
Анти-СйЗ+СН-296 | 708 | |
Концентрация сыворотки Образец 1-2 | Анти-СЦЗ | 354 |
Анти-СЦЗ+СН-296 | 616 | |
Концентрация сыворотки Образец 2-1 | Анти-СБЗ | 338 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 630 | |
Концентрация сыворотки Образец 2-2 | Анти-СбЗ | 289 |
Анти-СБЗ+СН-296 | 514 | |
Концентрация сыворотки Образец 3-1 | Анти-СБЗ | 317 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 551 | |
Концентрация сыворотки Образец 3-2 | Анти-СЦЗ | 243 |
Анти-СЦЗ+СН-296 | 587 | |
Концентрация сыворотки Образец 3-3 | Анти-СбЗ | 257 |
Анти-СЦЗ+СН-296 | 564 |
Как показано в табл. 55, во время культивирования клеток БАК с использованием среды А1М У, содержащей каждую из указанных концентраций сыворотки, в любой группе по концентрации сыворотки и в группе по концентрации при субкультивировании высокую кратность экспансии получали в груп
- 60 012520 пе, стимулированной СН-296 и анти-СО3-антителом, по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе (стимуляция только анти-СЭ3-антителом). Другими словами, в культуре клеток ЬАК при концентрации сыворотки, основанной на предположении, что собирают 30 мл крови, клетки ЬАК могут быть безусловно индуцированы и культивированы с высокой кратностью экспансии при стимуляции СН296 и анти-СЭ3-антителом. Кроме того, клетки во время указанного культивирования присутствовали в высокой концентрация и высокой плотности, и кратность экспансии очевидно была выше при стимуляции СН-296 даже в тех условиях, которые описаны выше, таким образом выявлена эффективность СН296.
Пример 56. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬАК с использованием среды с низким содержанием сыворотки (А1М У) (концентрации 1Ь-2 100 Ед./мл^ 150 Ед./мл^ 150 Ед./мл^300 Ед./мл, 200 Ед./млСТ300 Ед./млСТ300 Ед./мл^400 Ед./мл, 1000 Ед./мл^ 500 Ед./мл^500 Ед./мл^500 Ед./мл).
Подтверждали влияние концентрации 1Ь-2 на систему культивирования ЬАК.
Концентрации 1Ь-2, добавляемые в начале культивирования и во время субкультивирования, подбирали так, как показано в следующей табл. 56-1.
Таблица 56-1
В нулевой день после начала культивирования | На четвертый день после начала культивирования | На седьмой день после начала культивирования | На десятый день после начала культивирования | |
Концентрация 1Ъ-2 Образец 1 | 100 | 150 | 150 | 300 |
Концентрация 11,-2 Образец 2 | 200 | 300 | 300 | 400 |
Концентрация 1Ь-2 Образец 3 | 1000 | 500 | 500 | 500 |
* Концентрация 1Ь-2 (Ед./мл).
РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в А1М У, содержащей 3% сыворотки АВ человека, так чтобы получить концентрацию 0,33х106 клеток/мл, и затем суспензию помещали в планшет, на котором было иммобилизовано антитело против ί.Ό3 человека, или в планшет, на котором было иммобилизовано антитело против ί.Ό3 человека и СН-296, полученный согласно пункту (1) примера 41, в объеме 3 мл/каждую лунку, и в него добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 100 Ед./мл, 200 Ед./мл или 1000 Ед./мл. Указанные планшеты инкубировали при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования).
На четвертый день после начала культивирования каждую группу разбавляли А1М У, содержащей 1% сыворотки АВ человека (количество жидкости 6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,1 х106 клеток/мл, и клетки в разведении переносили во флакон для культивирования клеток объемом 12,5 см2, в котором ничего не иммобилизовали. В него добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 150 Ед./мл в случае образца 1 концентрации 1Ь-2, или так чтобы получить конечную концентрацию 300 Ед./мл в случае образца 2 концентрации 1Ь-2, или так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл в случае образца 3 концентрации 1Ь-2, соответственно.
На седьмой день после начала культивирования каждую группу разбавляли А1М У, содержащей 0,05% сыворотки АВ человека (количество жидкости 12,6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,262х106 клеток/мл, и клетки в разведении переносили в свежий флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, поддерживаемый в вертикальном положении, в котором ничего не иммобилизовали. В него добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 150 Ед./мл в образце 1 концентрации 1Ь-2, или так чтобы получить конечную концентрацию 300 Ед./мл в образце 2 концентрации 1Ь-2, или так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл в образце 3 концентрации 1Ь-2, соответственно.
На десятый день после начала культивирования каждую группу разбавляли А1М У, содержащей 0,05% сыворотки АВ человека (количество жидкости 12,6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,585х106 клеток/мл, и клетки в разбавлении переносили в свежий флакон для культивирований клеток объемом 25 см2, поддерживаемый в вертикальном положении, в котором ничего не иммобилизовали. В него добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 300 Ед./мл в образце 1 концентрации 1Ь-2, или так чтобы получить конечную концентрацию 400 Ед./мл в образце 2 концентрации 1Ь-2, или так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл в образце 3 концентрации 1Ь-2.
На пятнадцатый день после начала культивирования количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим, и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с их количеством в начале культивирования. Каждый эксперимент проводили дважды. Средние результаты для каждого случая показаны в табл. 56-2.
- 61 012520
Таблица 56-2
Стимуляция в нулевой день от начала культивирования | Кратность экспансии (раз) | |
Концентрация 1Ъ-2 Образец 1 | Анти-СОЗ | 312 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 522 | |
Концентрация 1Ь-2 Образец 2 | Анти-СОЗ | 331 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 730 | |
Концентрация 1Ь-2 Образец 3 | Анти-СОЗ | 146 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 571 |
Как показано в табл. 56-2, во время культивирования клеток ЬАК, при котором культивирование осуществляли с различными концентрациями ΙΕ-2 во время субкультивирования, в любой группе по концентрации ΙΕ-2 высокую кратность экспансии получали в группе, стимулированной СН-296 и антиСЭ3-антителом по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе (стимуляция только антиСЭ3-антителом). Другими словами, даже в том случае, когда изменяли концентрации ΙΕ-2, клетки ЬАК очевидно можно было индуцировать и культивировать с высокой кратностью экспансии при стимуляции СН-296 и анти-СП3-антителом по сравнению с кратностью экспансии при стимуляции только анти-СЭ3антителом. Кроме того, клетки во время данного культивирования присутствовали в высокой концентрации и высокой плотности. Также концентрацию сыворотки готовили, полагая, что кровь собирают в объеме 30 мл и суммарное количество культуральной среды составляет 10 л, и кратность экспансии очевидно была высокой даже в тех условиях, которые указаны выше, при стимуляции СН-296, таким образом выявлена эффективность СН-296.
Пример 57. Относительное содержание СО8-позитивных клеток в популяции клеток ЬАК, культивируемых с использованием среды с низким содержанием сыворотки (АЕМ ν) (исследования концентрации Ш-2).
(1) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Индукцию и культивирование клеток ЬАК осуществляли таким же образом, как в примере 56.
(2) Определение относительного содержания популяции СО8-позитивных клеток среди клеток ЬАК.
Относительное содержание СО8-позитивных клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 4. Результаты показаны в табл. 57.
Таблица 57
Стимуляция в нулевой день от начала куль тивиро ва ния | Относительное содержание СБ8-позитивных клеток (%) | |
Концентрация 1Ь-2 Образец 1 | Анти-СОЗ | 60 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 65 | |
Концентрация 1Ь-2 Образец 2 | Анти-СОЗ | 60 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 62 | |
Концентрация 1Ь-2 Образец 3 | Анти-СОЗ | 59 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 67 |
Как показано в табл. 57, в любой группе, в которой концентрации Ш-2 изменяли в начале культивирования или во время субкультивирования, относительное содержание СО8-позитивных клеток среди клеток ЬАК во время культивирования может быть индуцировано на высоком уровне в группе, стимулированной СН-296 и анти-СП3-антителом по сравнению с относительным содержанием СО8-позитивных клеток в контрольной группе (стимулированной только анти-СП3-антителом). Другими словами, выяснено, что клетки ЬАК очевидно могут быть индуцированы и культивировали с увеличением относительного содержания СО8-позитивных клеток среди клеток ЬАК при стимуляции СН-296 даже в случае изменения концентрации Ш-2.
Пример 58. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬАК с использованием среды с низким содержанием сыворотки (АЕМ ν) (исследования исходной концентрации в начале культивирования).
Исследовали влияние исходной концентрации клеток в начале культивирования на кратность экспансии в системе культивирования клеток ЬАК, исходя из предположения о сборе 30 мл крови и конечном количестве культуральной среды, составляющем примерно 10 л.
Готовили группы, имеющие исходную концентрацию клеток в начале культивирования 0,083 х106, 0,167х106 или 0,33 х106 клеток/мл.
(1) Иммобилизация антитела против СЭ3 человека и фрагмента РК
Антитело против СЭ3 человека и фрагмент ΕN иммобилизовали на оборудовании для культивирования, используемом в следующем эксперименте. Конкретно, 1,9 или 4,8 мл РВ8, содержащего антитело против СЭ3 человека (конечная концентрация: 5 мкг/мл), добавляли в 12-луночный планшет для культивирования клеток или в 6-луночный планшет для культивирования клеток (производства Еа1сои). После добавления в группу с добавлением фрагмента ΕN добавляли фрагмент фибронектина (СН-296), описанный в примере получения 1, так чтобы получить конечную концентрацию 25 мкг/мл. В качестве контро
- 62 012520 ля также готовили группу без добавления СН-296.
Указанное оборудование для культивирования инкубировали при комнатной температуре в течение 5 ч и хранили при 4°С вплоть до использования. Непосредственно перед использованием РВ8, содержащий антитело против СБ3 человека и СН-296, удаляли отсасыванием из указанного оборудования для культивирования, и каждую лунку дважды промывали РВ8 и один раз средой ΚΡΜΙ. Каждый эксперимент проводили с использованием оборудования для культивирования.
(2) Индукция и культивирование клеток БАК.
РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в А^ V, содержащей 3% сыворотки АВ человека, так чтобы получить концентрацию 0,083х106, 0,167х106 или 0,33х106 клеток/мл. Затем суспензию помещали в 6-луночный планшет для культивирования клеток, на котором было иммобилизовано антитело против СБ3 человека, или в 6-луночный планшет для культивирования клеток, на котором было иммобилизовано антитело против СБ3 человека и СН-296, полученный согласно пункту (1) примера 58, в объеме 7,5 мл/каждую лунку в группе, в которой культивирование начинали при концентрации 0,083 х106 или 0,167х106 клеток/мл; или суспензию помещали в 12-луночный планшет для культивирования клеток, на котором было иммобилизовано антитело против СБ3 человека, или в 12луночный планшет для культивирования клеток, на котором было иммобилизовано антитело против СБ3 человека и СН-296, полученный согласно пункту (1) примера 58, в объеме 3 мл/каждую лунку в группе, в которой культивирование начинали при концентрации 0,33х106 клеток/мл. Добавляли Ιβ-2 так, чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Указанные планшеты инкубировали при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования).
На четвертый день после начала культивирования каждую группу разбавляли А^ V, содержащей 1% сыворотки АВ человека (количество жидкости 6 мл), так чтобы получить максимальную концентрацию 0,1 х106 клеток/мл, и разбавленные клетки переносили во флакон для культивирования клеток объемом 12,5 см2, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе добавляли Ιβ-2 так, чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На седьмой день после начала культивирования каждую группу разбавляли А^ V, содержащей 0,05% сыворотки АВ человека (максимальное количество жидкости: 12, мл), так чтобы получить концентрацию 0,227х106 клеток/мл в случае группы, в которой культивирование начинали при концентрации 0,083 х106 клеток/мл, или так чтобы получить концентрацию 0,276х106 клеток/мл в случае группы, в которой культивирование начинали при концентрации 0,167х106 клеток/мл, или так чтобы получить концентрацию 0,465 х106 клеток/мл в случае группы, в которой культивирование начинали при концентрации 0,33х106 клеток/мл, соответственно. Клетки в разведении переносили в свежий флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, поддерживаемый в вертикальном положении, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе добавляли Ιβ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На десятый день после начала культивирования каждую группу разбавляли АБ! V, содержащей 0,05% сыворотки АВ человека (количество жидкости 12,6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,58х106 клеток/мл в случае группы, в которой культивирование начинали при концентрации 0,083 х106 клеток/мл, так чтобы получить концентрацию 0,75х106 клеток/мл в случае группы, в которой культивирование начинали при концентрации 0,167х106 клеток/мл, или так, чтобы получить концентрацию 0,79х106 клеток/мл в случае группы, в которой культивирование начинали при концентрации 0,33х106 клеток/мл, соответственно. Клетки в разведении переносили в свежий флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, поддерживаемый в вертикальном положении, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе добавляли Ιβ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На пятнадцатый день после начала культивирования количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Каждый эксперимент проводили дважды. Средние результаты для каждого случая показаны в табл. 58.
Таблица 58
Исходная концентрация клеток в начале культивирования (х10б клеток/мл) | Стимуляция в нулевой день от начала культивирования | Кратность экспансии (раз) |
0,083 | Анти-СОЗ | 70 |
Анти-СЦЗ+СН-296 | 593 | |
0,167 | Анти-СЭЗ | 104 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 525 | |
0,33 | Анти-СОЗ | 272 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 565 |
Как показано в табл. 58, даже в группе, в которой культивирование начинали при любой концентрации клеток, высокую кратность экспансии получали в группе, стимулированной СН-296 и анти-СБ3антителом по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе (стимуляция только анти-СБ3антителом). Другими словами, даже в том случае, когда культивирование начинали при различных кон- 63 012520 центрациях клеток, клетки БАК очевидно можно было индуцировать и культивировать с высокой кратностью экспансии посредством стимуляции СН-296 и анти-СО3-антителом по сравнению с кратностью экспансии при стимуляция только анти-СП3-антителом. Кроме того, культивирование осуществляли, исходя из предположения о сборе 30 мл крови и конечном количестве культуральной среды 10 л, и кратность экспансии очевидно была высокой при стимуляции СН-296 даже в условиях, указанных выше, таким образом выявлена эффективность СН-296. Кроме того, хотя в контрольной группе была подтверждена ситуация, когда кратность экспансии сильно изменялась в зависимости от исходной концентрации клеток в начале культивирования, в группе, стимулированной СН-296, получали стабильную кратность экспансии, независимо от исходной концентрации клеток в начале культивирования.
Пример 59. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток БАК с использованием среды с низким содержанием сыворотки (А1М V) (период стимуляции).
Исследовали влияние количества дней стимуляции в начале культивирования только анти-СО3антителом или анти-СП3-антителом и СН-296 в системе культивирования клеток БАК на кратность экспансии.
Готовили группы, в которых количество дней стимуляции составляло 2 дня, 3 дня или 4 дня.
РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в А1М V, содержащей 3% сыворотки АВ человека, так чтобы получить концентрацию 0,33х106 клеток/мл в каждой группе, затем суспензию помещали в планшет, на котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека, или в планшет, на котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека и СН-296, полученный согласно пункту (1) примера 41, в объеме 3 мл/каждую лунку, и в него добавляли 1Б-2, так чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Указанные планшеты инкубировали при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования).
На второй день или третий день после начала культивирования, группу с 2-дневной стимуляцией или группу с 3-дневной стимуляцией переносили как таковую в свежий 12-луночный планшет для культивирования, в котором ничего не иммобилизовали.
На четвертый день после начала культивирования каждую группу разбавляли А1М V, содержащую 1% сыворотки АВ человека (количество жидкости 6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,1 х106 клеток/мл, и клетки в каждом разбавлении переносили во флакон для культивирования клеток объемом 12,5 см2, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе соответственно добавляли 1Б-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На седьмой день после начала культивирования каждую группу разбавляли А1М V, содержащей 0,05% сыворотки АВ человека (количество жидкости 12,6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,45х106 клеток/мл, и клетки в каждом разбавлении переносили в свежий флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, поддерживаемый в вертикальном положении, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе соответственно добавляли 1Б-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На десятый день после начала культивирования каждую группу разбавляли А1М V, содержащей 0,05% сыворотки АВ человека (количество жидкости 12,6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,6х106 клеток/мл, и клетки в каждом разбавлении переносили в свежий флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, поддерживаемый в вертикальном положении, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе соответственно добавляли 1Б-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На пятнадцатый день после начала культивирования количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества с количеством клеток в начале культивирования. Каждый эксперимент проводили дважды. Средние результаты для каждого случая показаны в табл. 59.
Таблица 59
Стимуляция в нулевой день от начала культивирования | Кратность экспансии (раз) | |
Период стимуляции: 2 дней | Анти-СИЗ | 266 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 438 | |
Период стимуляции: 3 дней | Анти-СОЗ | 424 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 562 | |
Период стимуляции: 4 дней | Анти-СОЗ | 257 |
Анти-СОЗ+СН-296 | 568 |
Как показано в табл. 59, во время культивирования клеток БАК, культивируемых с использованием различных периодов стимуляции от начала культивирования в любой группе с любым периодом стимуляции высокую кратность экспансии получали в группах, стимулированных СН-296 и анти-СО3антителом по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе (стимуляция только анти-СЭ3антителом). Другими словами даже при изменении периода стимуляции клетки БАК очевидно могут быть индуцированы и культивированы с высокой кратностью экспансии при стимуляции СН-296 и анти
- 64 012520
СО3-антителом по сравнению кратностью экспансии при стимуляции только анти-СО3-антителом. Кроме того, клетки в ходе указанного культивирования присутствовали в высокой концентрации и высокой плотности, и концентрация сыворотки была основана на предположении о сборе 30 мл крови и суммарном количестве культуральной среды 10 л, кратность экспансии очевидно была выше при стимуляции СН-296 даже в условиях, описанных выше, таким образом выявлена эффективность СН-296.
Пример 60. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток БАК с использованием среды с низким содержанием сыворотки (А1М V) (СН-296№1).
Определяли кратность экспансии в системе культивирования клеток БАК с использованием СН296Να в качестве фрагмента ΡΝ.
Готовили группу, в которой СН-296№1 иммобилизовали на планшете для культивирования клеток, и группу, в которой С.'Н-296№1 как таковой добавляли в среду культивирования клеток.
(1) Иммобилизация антитела против СЭЛ человека и фрагмента ΡΝ.
Антитело против СЭ3 человека и фрагмент ΓΝ иммобилизовали на оборудования для культивирования, используемом в следующем эксперименте. Конкретно, 1,9 мл РВ8, содержащего антитело против СЭ3 человека (конечная концентрация: 5 мкг/мл), добавляли в 12-луночный планшет для культивирования клеток. После добавления в группу с добавлением фрагмента ΓΝ добавляли фрагмент фибронектина (СН-296№1). описанный в примере 54, так чтобы получить конечную концентрацию 28,6 мкг/мл. В качестве контроля также готовили группу без добавления СН-296№1.
Указанное оборудование для культивирования инкубировали при комнатной температуре в течение 5 ч и хранили при 4°С вплоть до использования. Непосредственно перед использованием РВ8, содержащий антитело против СЭ3 человека и СН-296№, удаляли из оборудования для культивирования отсасыванием и каждую лунку дважды промывали РВ8 и один раз средой КРМ1. Каждый эксперимент осуществляли с использованием оборудования для культивирования.
(2) Индукция и культивирование клеток БАК.
РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, соответственно суспендировали в А1М V, содержащей 3% сыворотки АВ человека, так чтобы получить концентрацию 0,33х106 клеток/мл, и затем суспензию помещали в планшет для культивирования клеток, на котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека, или в планшет для культивирования клеток, на котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека и СН-296№, полученный согласно пункту (1) примера 60, в объеме 3 мл/каждую лунку. Кроме того, в группе, в которой СН-296№1 добавляли как таковой в среду культивирования клеток, СН-296№1 добавляли к клеткам, которые были помешены в планшет для культивирования клеток, на котором было иммобилизовано антитело против СЭ3 человека, так чтобы получить конечную концентрацию 1 мкг/мл. В каждой группе добавляли 1Б-2, так чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Указанные планшеты инкубировали при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования).
На четвертый день после начала культивирования каждую группу разбавляли А1М V, содержащей 1% сыворотки АВ человека (количество жидкости 6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,1 х106 клеток/мл, и клетки в разбавлении переносили во флакон для культивирования клеток объемом 12,5 см2, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе добавляли 1Б-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На седьмой день после начала культивирования каждую группу разбавляли А1М V, содержащей 0,05% сыворотки АВ человека (количество жидкости 12,6 мл), соответственно, так чтобы получить концентрацию 0,5х106 клеток/мл, и клетки в каждом разбавлении переносили в свежий флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, поддерживаемый в вертикальном положении, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе добавляли 1Б-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На десятый день после начала культивирования каждую группу разбавляли А1М V, содержащей 0,05% сыворотки АВ человека (количество жидкости 12,6 мл), соответственно, так чтобы получить концентрацию 0,94х106 клеток/мл, и клетки в каждом разбавлении переносили в свежий флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, поддерживаемый в вертикальном положении, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе добавляли 1Б-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На пятнадцатый день после начала культивирования количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с их количеством в начале культивирования. Каждый эксперимент проводили дважды. Средние результаты для каждого случая показаны в табл. 60.
Таблица 60
Стимуляция в нулевой день от начала культивирования | Кратность экспансии (раз) |
Анти-СЭЗ | 222 |
Иммобилизация Анти-СОЗ+СЯ-29бНа | 922 |
Добавление Анти-СбЗ+СН-29бЦа | 651 |
- 65 012520
Как показано в табл. 60, высокую кратность экспансии получали в любой группе, в которой СН296Να иммобилизовали или добавляли в раствор, по сравнению с кратностью экспансии в контрольной группе (стимуляция только анти-СБ3-антителом). Другими словами, клетки ЬАК очевидно можно индуцировать и культивировать с высокой кратностью экспансии при стимуляции СН-296№ и анти-СБ3антителом по сравнению с кратностью экспансии при стимуляции только анти-СБ3-антителом. В данном случае культивирование осуществляли, исходя из предположения о сборе 30 мл крови и конечного количества культуральной среды 10 л, и кратность экспансии очевидно была выше при стимуляции СН296Να в описанных выше условиях, таким образом выявлены эффективность СН-296№1.
Пример 61. Получение СН-296-шариков.
В качестве шариков для иммобилизации СН-296 использовали БупаЬеак М-450 Ероху (производства Бупа1). 2,8х108 БупаЬеак М-450 Ероху три раза промывали 0,1 М фосфатным буфером (рН 7,0). Промытые 2,8х108 БупаЬеак М-450 Ероху суспендировали в 0,7 мл РВ8, содержащего 140 мкг СН-296, и реакцию иммобилизации осуществляли в течение ночи при 4°С при осторожном перемешивании. Реакционный раствор удаляли и три раза заменяли 0,7 мл РВ8, содержащего 0,1% сывороточного альбумина человека (Н8А), и затем хранили при 4°С, получая таким образом СН-296-шарики.
Кроме того, шарики, не содержащие СН-296, обрабатывали таким же образом для получения контрольных шариков.
Пример 62. Получение СБ3/СН-296-шариков.
В качестве шариков для иммобилизации СН-296 и антитела против СБ3 человека использовали БупаЬеак М-450 Ероху. 4х108 БупаЬеак М-450 Ероху три раза промывали 0,1 М фосфатным буфером (рН 7,0). Промытые 4х108 БупаЬеак М-450 Ероху суспендировали в 1 мл РВ8, содержащего 160 мкг СН-296 и 32 мкг антитела против СБ3 человека, и реакцию иммобилизации осуществляли в течение ночи при 4°С при осторожном перемешивании. Реакционный раствор удаляли и три раза заменяли 1 мл РВ8, содержащего 0,1% сывороточного альбумина человека (Н8А), и затем хранили при 4°С, таким образом получая СБ3/СН-296-шарики.
Пример 63. Определение кратности экспансии в системе культивирования клеток ЬАК с использованием среды с низким содержанием сыворотки (АТМ V) (стимуляция шариками, на которых был иммобилизован ΡΝίτ).
Исследовали влияние на культивирование клеток ЬАК фрагмента фибронектина (СН-296), иммобилизованного на носителе для культивирования клеток (шариках).
Получали группу, стимулированную СБ3-шариками, при этом на шариках было иммобилизовано анти-СБ3-антитело, и контрольными шариками, на которых ничего не иммобилизовали (группа с использованием СБ3-шариков), группу, стимулированную СБ3-шариками и СН-296-шариками, при этом на шариках иммобилизовали СН-296 (группа с использованием СБ3-шариков+СН-296-шариков), и группу, стимулированную СБ3/СН-296-шариками, при этом на шариках иммобилизовали анти-СБ3-антитело и СН-296 (группа с использованием СБ3/СН-296-шариков).
РВМС, которые получали согласно пункту (1) примера 1, суспендировали в АТМ V, содержащей 1% сыворотки АВ человека, так чтобы получить концентрацию 0,33х106 клеток/мл. Затем суспензию помещали в 12-луночный планшет для культивирования, в котором ничего не иммобилизовали, в объеме 3 мл/каждую лунку, также добавляли СБ3-шарики (БупаЬеабк М-450 СБ3 (рапТ), ВеШкик, БВ11113) в количестве 1х 106 шариков/лунку и добавляли контрольные шарики, которые получали согласно примеру 61, в количестве 3,8х106 шариков/лунку в группе с использованием СБ3-шариков, или также добавляли СБ3-шарики в количестве 1х 106 шариков/лунку и добавляли СН-296-шарики, которые получали согласно примеру 61, в количестве 0,76х106 шариков/лунку в группе с использованием СБ3-шариков+СН-296шариков, или также добавляли СБ3/СН-296-шарики, которые получали согласно примеру 62, в количестве 2,3 х106 шариков/лунку в группе с использованием СБ3/СН-296-шариков. В каждую лунку добавляли ТЬ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 1000 Ед./мл. Указанные планшеты инкубировали при 37°С в 5% СО2 (нулевой день культивирования).
На четвертый день после начала культивирования в каждой группе шарики, находящиеся в культуральной среде, удаляли с помощью магнитной подставки и затем культуральную среду разбавляли АТМ V, содержащей 1% сыворотки АВ человека (количество жидкости 6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,07х106 клеток/мл, и клетки в разбавлении переносили во флакон для культивирования клеток объемом 12,5 см2, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе добавляли ТЬ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На седьмой день после начала культивирования каждую группу разбавляли АТМ V, содержащей 1% сыворотки АВ человека (количество жидкости 12,6 мл), так чтобы получить концентрацию 0,25х106 клеток/мл, и клетки в разбавлении переносили в свежий флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, поддерживаемый в вертикальном положении, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе добавляли ТЬ-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На десятый день после начала культивирования каждую группу разбавляли АТМ V, содержащей 1% сыворотки АВ человека (количество жидкости 12,6 мл), так чтобы получить концентрацию
- 66 012520
0,685х106 клеток/мл, и разбавленные клетки переносили в свежий флакон для культивирования клеток объемом 25 см2, поддерживаемый в вертикальном положении, в котором ничего не иммобилизовали. В каждой группе добавляли 1Ь-2, так чтобы получить конечную концентрацию 500 Ед./мл.
На пятнадцатый день после начала культивирования количество живых клеток подсчитывали способом на основе окрашивания трипановым синим и рассчитывали в виде кратности экспансии посредством сравнения количества клеток с количеством в начале культивирования. Каждый эксперимент проводили дважды. Средние результаты для каждого случая показаны в табл. 61.
Таблица 61
Стимуляция в нулевой день от начала культивирования | Кратность экспансии (раз) | |
СЭЗ шарики | Анти-СОЗ | 420 |
СОЗ шарики+СН-296 шарики | Анти-СОЗ+СН-296 | 830 |
СОЗ/СН-296 шарики | Анти-СОЗ+СН-296 | 748 |
Как показано в табл. 61, в культуре клеток ЬАК, стимулированной каждым из видов шариков, высокую кратность экспансии получали в группе, стимулированной в группе с СО3-шариками+СН-296шариками и в группе с СО3/СН-296-шариками, по сравнению с кратностью экспансии в случае СЭ3шариками. Другими словами, в культуре клеток ЬАК с использованием шариков в качестве носителя для культуры клеток клетки ЬАК очевидно можно индуцировать и культивировать с высокой кратностью экспансии при стимуляции шариками, на которых были иммобилизованы СН-296 и анти-СП3-антитело, по сравнению с кратностью экспансии при стимуляции шариками, на которых иммобилизовано только анти-СП3-антитело. Кроме того, клетки во время культивирования присутствовали в высокой концентрации и при высокой плотности, и кратность экспансии очевидно была выше при стимуляции СН-296шариками даже в описанных выше условиях, таким образом выявлена эффективность СН-296.
Пример 64. Относительное содержание СО8-позитивных клеток в популяции клеток ЬАК, культивируемых с использованием среды с низким содержанием сыворотки (А1М У) (стимуляция шариками, на котором был иммобилизован ΕΝίτ).
(1) Индукция и культивирование клеток ЬАК.
Индукцию и культивирование клеток ЬАК осуществляли таким же образом, как в примере 63.
(2) Определение относительного содержания популяции СО8-позитивных клеток среди клеток ЬАК.
Относительное содержание СО8-позитивных клеток определяли таким же образом, как описано в пункте (2) примера 4. Результаты показаны в табл. 62.
Таблица 62
Стимуляция в нулевой день от начала кул ь ти виро в а ни я | Относитель ное содержание 008позитив ных клеток (%) | |
СОЗ шарики | Анти-СОЗ | 47 |
СЭЗ шарики+СН-296 шарики | Анти-СОЗ+СН-296 | 49 |
СОЗ/СН-296 шарики | Анти-СОЗ+СН-296 | 59 |
Как показано в табл. 62, в культуре клеток ЬАК, стимулированной каждым из видов шариков, относительное содержание СО8-позитивных клеток среди клеток ЬАК во время культивирования может быть индуцировано на высоком уровне в группе, стимулированной СО3-шариками+СН-296-шариками, и в группе с СО3/СН-296-шариками, по сравнению с кратностью экспансии в группе с СО3-шариками. Другими словами, в культуре клеток ЬАК с использованием шариков в качестве носителя для культуры клеток, выяснено, что клетки ЬАК очевидно могут быть индуцированы и культивированы с увеличением относительного содержания СО8-позитивных клеток среди клеток ЬАК при стимуляции шариками, на котором были иммобилизованы СН-296 и анти-СО3-антитело, по сравнению с содержанием при стимуляции шариками, на которых иммобилизовали только анти-СО3 антитело.
Список последовательностей в виде свободного текста
8ΕΟ ΙΌ NО: 1. Частичная область фибронектина, названная ΙΙΙ-8.
8ΕΟ ΙΌ NО: 2. Частичная область фибронектина, названная ΙΙΙ-9.
8ΕΟ ΙΌ NО: 3. Частичная область фибронектина, названная ΙΙΙ-10.
8ΕΟ ΙΌ NО: 4. Частичная область фибронектина, названная ΙΙΙ-11.
8ΕΟ ΙΌ NО: 5. Частичная область фибронектина, названная ΙΙΙ-12.
8ΕΟ ΙΌ NО: 6. Частичная область фибронектина, названная ΙΙΙ-13.
8ΕΟ ΙΌ NО: 7. Частичная область фибронектина, названная ΙΙΙ-14.
8ΕΟ ΙΌ NО: 8. Частичная область фибронектина, названная С8-1.
8ΕΟ ΙΌ NО: 9. Фрагмент фибронектина, названный С-274.
8ΕΟ ΙΌ NО: 10. Фрагмент фибронектина, названный Н-271.
8ΕΟ ΙΌ NО: 11. Фрагмент фибронектина, названный Н-296.
8ΕΟ ΙΌ NО: 12. Фрагмент фибронектина, названный СН-271.
- 67 012520
8ЕС) ΙΌ N0 8ЕС) ΙΌ N0 8ЕС) ΙΌ N0 8ЕС) ΙΌ N0 8ЕС) ΙΌ N0 8ЕС) ΙΌ N0 8ЕС) ΙΌ N0 8ЕС) ΙΌ N0 8ЕС) ΙΌ N0 8ЕС) ΙΌ N0 8ЕС) ΙΌ N0 8ЕС) ΙΌ N0 8ЕС) ΙΌ N0 8ЕС) ΙΌ N0 8ЕС) ΙΌ N0 8ЕС) ΙΌ N0 8ЕС) ΙΌ N0
13. Фрагмент фибронектина, названный СН-296.
14. Фрагмент фибронектина, названный С-С81.
15. Фрагмент фибронектина, названный СНУ-89.
16. Фрагмент фибронектина, названный СНУ-90.
17. Фрагмент фибронектина, названный СНУ-92.
18. Фрагмент фибронектина, названный СНУ-179.
19. Фрагмент фибронектина, названный СНУ-181.
20. Фрагмент фибронектина, названный Н-275-Сук.
21. Праймер 128.
22. Праймер 14А.
23. Праймер Су5-Л.
24. Праймер Су§-8.
25. Фрагмент фибронектина, названный СН-296№1.
26. Полинуклеотид, кодирующий фрагмент фибронектина, названный СН-296№1.
27. Праймер ^-296^1.
28. Праймер СН-296Nа2.
29. Праймер СН-296№3.
Промышленная применимость
Согласно способу получения цитотоксического лимфоцита, предлагаемого в настоящем изобретении, получают цитотоксические лимфоциты, кратность экспансии которых выше даже при использовании бессывороточной среды или среды с низкой концентрацией сыворотки, поддерживается высокая цитотоксическая активность, уровень экспрессии ΙΌ-2Κ в значительной степени повышен и увеличено относительное содержание СО8-позитивных клеток. Лимфоциты подходят для применения, например, при адоптивной иммунотерапии. Таким образом, предполагается большой вклад способа согласно настоящему изобретению в область медицины.
Список последовательностей <110> ТАКАКА ΒΙΟ ТЫС.
<120> СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЛИМФОЦИТОВ <130> 04-058-РСТЛР <150> ЛР 2003-298208 <151> 2003-08-22 <150> ЛР 2004-699 <151> 2004-01-05 <150> ЛР 2004-115648 <151> 2004-04-09 <150> ЛР 2004-222441 <151> 2004-07-29 <160> 29 <210> 1 <211> 87 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 68 012520 <22О>
<223> Частичная область фибронектина, названная ΙΙΙ-8 <40О> 1
Рго | ТЬг | Азр | Ьеи | Агд | РЬе | ТЬг | Азп | 11е | 61у | Рго | Азр | ТЬг | МеЬ | Агд |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
νβΐ | ТЫ | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | 11е | Азр | Ьеи | ТЬг | А5Г1 | РЬе | Ьеи |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
νβΐ | Агд | Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ьуз | Азп | С1и | С1и | Азр | Уа1 | А1а | С1и | Ьеи |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Зег | 11е | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЬс | Азп | Ьеи | Ьеи |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
Рго | 61у | ТЬг | Б1и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | С1и | 61п |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||
Н1з | 61 и | Зег | ТЬг | Рго | Ьеи | Агд | <51 у Агд | Б1п | Ьуз | ТЬг |
85 <210> 2 <211> 90 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Частичная область фибронектина, названная ΙΙΙ-9
- 69 012520 <400> 2
С1у | Ьеи | Азр | Зег | Рго | ТЬг | 61у | Не | Азр | РЬе | Зег | Азр | Не | ТЬг | А1а |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
АЗП | Зег | РЬе | ТЬг | Уа1 | ΗΪ3 | Тгр | Не | А1а | Рго | Агд | А1а | ТЬг | Не | ТЬг |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
С1у | Туг | Агд | Не | Агд | ΗΪ3 | Н13 | Рго | С1и | ΗΪ3 | РЬе | Зег | 61у Агд | Рго | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Агд | 61и | Азр | Агд | Уа1 | Рго | наз | Зег | Агд | Азп | Зег | Не | ТЬг | Ьеи | ТЬг |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
Азп | Ьеи | ТЬг | Рго | 61у | ТЫ | <31и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Не | Уа1 | А1а | Ьеи |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||
Азп | 61 у Агд | 61и | 61и | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | Не | 61у | 61п | 61п | Зег | ТЬг |
95 90 <210> 3 <211> 94 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Частичная область фибронектина, названная ΙΙΙ-10 <400> 3
Уа1 Зег Азр Уа1 Рго Агд Азр Ьеи С1и Уа1 Уа1 А1а А1а ТЬг Рго
10 15
- 70 012520
ТЬг | Зег | Ьеи Ьеи | 11е Зег Тгр Азр А1а Рго А1а Уа1 ТЬг Ча! Агд | |||||||||||
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
Туг | Туг | Агд | Пе | ТЬг | Туг | 01 у | 01и | ТЬг | 01у | С1у | Азп | Зег | Рго | Уа1 |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
О1п | О1и | РЬе | ТЬг | Уа1 | Рго | 01 у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЫ | Не | Зег |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
С1у | Ьеи | Ьуз | Рго | О1у | Уа1 | Азр | Туг | ТЬг | 11е | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||
ТЬг | С1у | Агд | 61у Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | 11е | Зег | Не |
85 90
Азп Туг Агд ТЬг <210> 4 <211> 84 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Частичная область фибронектина, названная II1-11 <400> 4
61а Мек 61п Уа1 ТЬг Азр Уа1 С1п Азр Азп Бег Не 8ег Уа1 Ьуз
10 15
Тгр Ьеи Рго Зег Зег Зег Рго Ча1 ТЬг 01 у Туг Агд 7а 1 ТЬг ТЬг
25 30
- 71 012520
ТЬг | Рго | Ьуз | Азп | С1у | Рго | 01 у | Рго | ТЬг | Ьуз | ТЬг | Ьуз | ТЬг | А1а | С1у |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Рго | Азр | 61п | ТЬг | 61и | Меб | ТЬг | Не | □1и | С1у | Ьеи | б1п | Рго | ТЬг | Уа1 |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
С1и | Туг | Уа1 | Уа1 | бег | Уа1 | Туг | А1а | 61п | Азп | Рго | Зег | 61у | С1и | Зег |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||
С1п | Рго | Ьеи | Уа1 | С1п | ТЬг | А1а | Уа1 | ТЬг |
<210> 5 <211> 92 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Частичная область фибронектина, названная ΙΙΙ-12 <400> 5
А1а | 11е | Рго | А1а | Рго | ТЬг | Азр | ьеи | Ьуз | РЬе | ТЬг | О1п | Уа1 | ТЬг | Рго |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
ТЬг | Зег | Ьеи | Зег | А1а | 01п | Тгр | ТЬг | Рго | Рго | Азп | Уа1 | 01п | Ьеи | ТЬг |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
С1у | Туг | Агд | Уа1 | Агд | Уа1 | ТЬг | Рго | Ьуз | С1и | Ьуз | ТЬг | 61 у | Рго | МеЬ |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Ьуз | <3111 | Не | Азп | Ьеи | А1а | Рго | Азр | Зег | Зег | Зег | Уа1 | Уа1 | Уа1 | Зег |
- 72 012520
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
С1у | Ьеи | МеС | Уа1 | А1а | ТЬг | Ьуз | Туг | С1и | Уа1 | Зег | 7а1 | Туг | А1а | Ьеи |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||
Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Бег | Агд | Рго | А1а | С1п | С1у | Уа1 | Уа1 | ТЬг | ТЬг |
80 | 85 | 90 |
Ьеи С1и <210> 6 <211> 89 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Частичная область фибронектина, названная ΙΙΙ-13 <400> 6
Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд А1а | Агд | Уа1 | ТЬг | Азр | А1а | ТЬг | С1и |
1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||
ТЬг | ТЬг | Не | ТЬг | 11е | Зег | Тгр Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | 61и | ТЬг | 11е | ТЬг |
20 | 25 | 30 | |||||||||||
С1у | РЬе | С1п | Уа1 | Азр | А1а | Уа1 Рго | А1а | Азп | С1у | С1п | ТЬг | Рго | 11е |
35 | 40 | 45 | |||||||||||
Θΐπ | Агд | ТЬг | 11е | Ьуз | Рго | Азр Уа1 | Агд | Зег | Туг | ТЬг | 11е | ТЬг | Е1у |
50 | 55 | 60 | |||||||||||
Ьеи | 61п | Рго | 61у | ТЬг | Азр | Туг Ьуз | Пе | Туг | Ьеи | Туг | ТЬг | Ьеи | Азп |
- 7З 012520
70 75
Азр Азп А1а Агд Бег Бег Рго 7а1 7а1 Не Азр А1а Бег ТЬг
85 <210> 7 <211> 90 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Частичная область фибронектина, названная ΙΙΙ-14 <400> 7
А1а 1 | 11е Азр А1а Рго 5 | Бег | Азп Ьеи Агд РЬе 10 | Ьеи А1а | ТЬг ТЬг | Рго 15 | ||||||||
Азп | Бег | Леи | Ьеи | Уа1 | Бег | Тгр | 61п | Рго | Рго | Агд | А1а | Агд | Не | ТЬг |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
<51у | Туг | Не | Не | Ьуз | Туг | 01и | Ьуз | РГО | 01 у | Зег | Рго | Рго | Агд | С1и |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Уа1 | ν»1 | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | С1у | Уа1 | ТЬг | 01и | А1а | ТЬг | Не | ТЬг |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
О1у | Ьеи | 61и | Рго | 61у | ТЬг | С1и | Туг | ТЬг | Не | Туг | Уа1 | 11е | А1а | Ьеи |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||
Ьуз | Азп | Азп | 01п | Ьуз | Бег | С1и | Рго | Ьеи | Не | С1у | Агд | Ьуз | Ьуз | ТЬг |
85 90
- 74 012520 <210> 8 <211> 25 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Частичная область фибронектина, названная СЗ-1 <400> 8
Азр С1и Ьеи Рго 61п Ьеи '/а1 ТЬг Ьеи Рго НЬз Рго Азп Ьеи Шз
10 15
С1у Рго С1и 11е Ьеи Азр Уа1 Рго Зег ТЬг
25 <210> 9 <211> 274 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <220>
<223> Фрагмент фибронектина, названный С-274 <400> 9
- 75 012520
РГО | 'ГЬг | Аар | Ьеи | Агд | РЬе | ТЬг | Азп | Не | 61 у | Рго | Азр | ТЬг | Мек | Агд |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
Уа1 | ТЬг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | 11е | Азр | Ьеи | ТЬг | Азп | РЬе | Ьеи |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
Уа1 | Агд | Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ьуз | Азп | 61и | С1и | Азр | Уа1 | А1а | 61и | Ьеи |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Зег | 11е | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | νβΐ | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | Ьеи |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
Рго | 61у | ТЬг | 61 и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | 61и | 61 п |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||
Н13 | Й1и | Зег | ТЬг | РГО | Ьеи | Агд | 61у Агд | 61п | Ьуз | ТЬг | 61у | Ьеи | Азр | |
80 | 85 | 90 | ||||||||||||
Зег | РГО | ТЬг | 61у | 11е | Азр | РЬе | Зег | Азр | 11е | ТЫ | А1а | Азп | Зег | РЬе |
95 | 100 | 105 | ||||||||||||
ТЬг | ν3ι | Н±з | Тгр | Пе | А1а | Рго | Агд | А1а | ТЬг | 11е | ТЬг | 61у | Туг Агд | |
110 | 115 | 120 | ||||||||||||
Не | Агд | ΗΪ3 | ΗΪ3 | Рго | 61и | НГЗ | РЬе | Зег | б1у Агд | Рго | Агд | 61и | Азр | |
125 | 130 | 135 | ||||||||||||
Агд | Уа1 | Рго | ΗΪ3 | Зег | Агд | Азп | Зег | 11е | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЬг |
140 | 145 | 150 | ||||||||||||
Рго | 61у | ТЬг | 61и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Не | Уа1 | А1а | Ьеи | Азп | 61у | Агд |
155 | 160 | 165 | ||||||||||||
61и | 61и | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | 11е | 61 у | 61п | 61п | Зег | ТЬг | Уа1 | Зег | Азр |
170 | 175 | 180 | ||||||||||||
Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ьеи | 61и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | Рго | ТЫ | Зег | Ьеи |
185 | 190 | 195 |
- 76 012520
Ьеи | Не | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Агд | Туг | Туг | Агд |
200 | 205 | 210 | ||||||||||||
Не | ТЬг | Туг | С1у | 61и | ТЬг | С1у С1у | АЗП | Зег | Рго | νβΐ | С1п | 01и | РЬе | |
215 | 220 | 225 | ||||||||||||
ТЬг | Уа1 | Рго | С1у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | Не | Зег | б1у | Ьеи | Ьуз |
230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Рго | (31 у | Уа1 | Азр | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЬг | С1у | Агд |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||
С1у Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | 11е | Зег | Не | Азп | Туг | Агд | |
260 | 265 | 270 |
ТЬг С1и Не Азр <210> 10 <211> 271 <212> БЕЛОК <213> Человеческий <220>
<223> Фрагмент фибронектина, названный Н-271 <400> 10
А1а 11е Рго А1а Рго ТЬг Азр Ьеи Ьуз РЬе ТЬг С1п 7а1 ТЬг Рго
10 15
ТЬг Зег Ьеи Зег А1а 61п Тгр ТЬг Рго Рго Азп Уа1 С1п Ьеи ТЬг
25 30
- 77 012520
(31у | Туг Агд | νβΐ | Агд 35 | Уа1 ТЬг Рго Ьуз С1и 40 | Ьуз | ТЬг С1у Рго МеЬ 45 | ||||||||
Ьуз | б1и | Не | Азп | Ьеи | А1а | Рго | Азр | Зег | Зег | Зег | Уа1 | Уа1 | Уа1 | Зег |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
61у | ьеи | МеЪ | Уа1 | А1а | ТЬг | Ьуз | туг | 61и | Уа1 | Зег | Уа1 | Туг | А1а | Ьеи |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||
Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Зег | Агд | Рго | А1а | С1п | С1у | Уа1 | Уа1 | ТЬг | ТЬг |
80 | 85 | 90 | ||||||||||||
Ьеи | С1и | Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго | Агд Агд | А1а | Агд | Уа1 | ТЬг | Азр | А1а | |
95 | 100 | 105 | ||||||||||||
ТЬг | С1и | ТЬг | ТЬг | Не | ТЬг | Не | Зег | Тгр | Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | 01и | ТЬг |
110 | 115 | 120 | ||||||||||||
Не | ТЬг | еьу | РЬе | С1п | Уа1 | Азр | А1а | Уа1 | Рго | А1а | Азп | 61у | С1п | ТЬг |
125 | 130 | 135 | ||||||||||||
Рго | Не | 61п | Агд | ТЬг | Не | Ьуз | Рго | Азр | Уа1 | Агд | Зег | Туг | ТЬг | 11е |
140 | 145 | 150 | ||||||||||||
ТЬг | С1у | Ьеи | С1п | Рго | С1у | ТЬг | Азр | Туг | Ьуз | Не | Туг | Ьеи | Туг | ТЬг |
155 | 160 | 165 | ||||||||||||
Ьеи | Азп. | Азр | АЗП | А1а | Агд | Зег | Зег | Рго | Уа1 | Уа1 | Не | Азр | А1а | Зег |
170 | 175 | 180 | ||||||||||||
ТЬг | А1а | Пе | Азр | А1а | Рго | Зег | Азп | Ьеи | Агд | РЬе | Ьеи | А1а | ТЬг | ТЬг |
185 | 190 | 195 | ||||||||||||
Рго | Азп | Зег | Ьеи | Ьеи | Уа1 | Зег | Тгр | С1п | Рго | Рго | Агд | А1а | Агд | Не |
200 | 205 | 210 | ||||||||||||
ТЬг | С1у | Туг | Не | Не | Ьуз | Туг | 61и | Ьуз | Рго | 51у | Зег | Рго | Рго | Агд |
215 220 225
- 78 012520
С1и | Уай | Уай | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | 61у | Уай | ТЬг | С1и | Айа | ТЬг | Пе |
230 | 235 | 240 | ||||||||||||
ТЬг | Сйу | Ьеи | бйи | Рго | Кйу | ТЬг | 61и | Туг | ТЬг | Не | Туг | Уай | Не | Айа |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||
Ьеи | Ьуз | Азп | Азп | Сйп | Ьуз | Зег | 61и | Рго | Ьеи | 11е | Сйу | Агд | Ьуз | Ьуз |
260 265 270
ТЬг <210> 11 <211> 296 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент фибронектина, названный Н-296 <400> 11
А1а | 11е | Рго | Айа | РГО | ТЬг | Азр | Ьеи | Ьуз | РЬе | ТЬг | С1п | Уай | ТЬг | Рго |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
ТЬг | Зег | Ьеи | Зег | Айа | Сйп | Тгр | ТЬг | Рго | Рго | Азп | Уай | Сйп | Ьеи | ТЬг |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
Сйу | Туг | Агд | Уай | Агд | Уай | ТЬг | Рго | Ьуз | бйи | Ьуз | ТЫ | Сйу | Рго | Меб |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Ьуз | бйи | 11е | Азп | Ьеи | Айа | РГО | Азр | Зег | Зег | Зег | Уай | Уай | Уай | Зег |
55 60
- 79 012520
С1у | Ьеи Мек | Уа1 | А1а 65 | ТЬг Ьуз Туг С1и Уа1 Зег Уа1 Туг А1а Ьеи | ||||||||||
70 | 75 | |||||||||||||
Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Зег | Агд | Рго | А1а | 61п | 61 у | Уа1 | Уа1 | ТЬг | ТЬг |
80 | 85 | 90 | ||||||||||||
Ьеи | 61и | АЗП | Уа1 | 8ег | Рго | Рго | Агд | Агд | А1а | Агд | Уа1 | ТЬг | Азр | А1а |
95 | 100 | 105 | ||||||||||||
ТЬг | С1и | ТЬг | ТЬг | 11е | ТЬг | Не | Зег | Тгр Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | 61и | ТЬг | |
но | 115 | 120 | ||||||||||||
Не | ТЬг | 61 у | РЬе | 61п | Уа1 | Азр | А1а | Уа1 | Рго | А1а | Азп | 61у | 61п | ТЬг |
125 | 130 | 135 | ||||||||||||
РГО | 11е | 61п | Агд | ТЬг | Не | Ьуз | Рго | Азр | Уа1 | Агд | Зег | Туг | ТЬг | Не |
140 | 145 | 150 | ||||||||||||
ТЬг | 61у | Ьеи | 61п | Рго | С1у | ТЬг | Азр | Туг | Ьуз | Не | Туг | Ьеи | Туг | ТЬг |
155 | 160 | 165 | ||||||||||||
Ьеи | Азп | Азр | Азп | А1а | Агд | Зег | Зег | Рго | Уа1 | Уа1 | Не | Азр | А1а | Зег |
170 | 175 | 180 | ||||||||||||
ТЬг | А1а | 11е | Азр | А1а | Рго | Зег | Азп | Ьеи | Агд | РЬе | Ьеи | А1а | ТЬГ | ТЬг |
185 | 190 | 195 | ||||||||||||
Рго | Азп | Зег | Ьеи | Ьеи | Уа1 | Зег | Тгр | 61п | Рго | Рго | Агд | А1а | Агд | Пе |
200 | 205 | 210 | ||||||||||||
ТЬг | 61у Туг | Не | Не | Ьуз | Туг | 61и | Ьуз | Рго | 61у | Зег | Рго | Рго | Агд | |
215 | 220 | 225 | ||||||||||||
0111 | Уа1 | Уа1 | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | 61у | Уа1 | ТЬг | 61и | А1а | ТЬг | Не |
230 | 235 | 240 | ||||||||||||
ТЬг | б1у Ьеи | С1и | Рго | 61у | ТЬг | 61и | Туг | ТЬг | 11е | Туг | Уа1 | Не | А1а |
245 250 255
- 80 012520
Ьеи Ьуз | АЗП | Азп | С1п Ьуз Зег 61и Рго Ьеи Не С1у Агд Ьуз Ьуз | |||||||||
260 | 265 | 270 | ||||||||||
ТЬг | Азр | О1и | Ьеи | РГО | βΐη | Ьеи | Уа1 | ТЬг | Ьеи | Рго Шз Рго | Азп | Ьеи |
275 | 230 | 285 | ||||||||||
Н1з | С1у | Рго | 61и | Не | Ьеи | Азр | Уа1 | Рго | Зег | ТЬг |
290 295 <210> 12 <211> 549 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент фибронектина, названный СН-271 <400> 12
Рго 1 | ТЬг | Азр Ьеи | Агд РЬе ТЬг Азп Не (51у Рго Азр ТЬг Меб Агд | |||||||||||
5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Уа1 | ТЬг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | Не | Азр | Ьеи | ТЬг | Азп | РЬе | Ьеи |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
Уа1 | Агд | Туг | Зег | Рго | νβΐ | Ьуз | Азп | 61и | 61и | Азр | Уа1 | А1а | 61и | Ьеи |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Зег | Не | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | Ьеи |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
Рго | 31у | ТЬг | 61и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | 61и | С1п |
- 81 012520
70 75
Ηί3 | б1и Зег | ТЬг | Рго 80 | Ьеи Агд 51у Агд С1п 85 | Ьуз | ТЬг | 31у | Ьеи | Азр 90 | |||||
Зег | Рго | ТЬг | С1у | 11е | Азр | РЬе | Зег | Азр | Не | ТЬг | А1а | Азп | Зег | РЬе |
95 | 100 | 105 | ||||||||||||
ТЬг | Уа1 | ΗΪ3 | Тгр | Не | А1а | РГО | Агд | А1а | ТЬг | Не | ТЬг | 31 у | Туг | Агд |
110 | 115 | 120 | ||||||||||||
Не | Агд | Ньз | Н1з | Рго | 61и | Н1з | РЬе | Зег | 81у Агд | Рго | Агд | 31 и | Азр | |
125 | 130 | 135 | ||||||||||||
Агд | Уа1 | Рго | ΗΪ3 | Зег | Агд | АЗП | Зег | Не | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЫ |
140 | 145 | 150 | ||||||||||||
Рго | 31у | ТЬг | 31и | Туг | νβΐ | Уа1 | Зег | Не | Уа1 | А1а | Ьеи | Азп | 31у | Агд |
155 | 160 | 165 | ||||||||||||
С1и | 81и | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | Не | 31у | С1п | С1п | Зег | ТЬг | Уа1 | Зег | Азр |
170 | 175 | 180 | ||||||||||||
Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ьеи | С1и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи |
185 | 190 | 195 | ||||||||||||
Ьеи | Пе | Зег | Тгр Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Агд | Туг | Туг | Агд | |
200 | 205 | 210 | ||||||||||||
Не | ТЬг | Туг | 31у | 61и | ТЬг | 31у | 31у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | 81п | С1и | РЬе |
215 | 220 | 225 | ||||||||||||
ТЬг | Уа1 | Рго | 61у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЫ | Не | Зег | С1у | Ьеи | Ьуз |
230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Рго | 31у | Уа1 | Азр | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЫ | 31у Агд | |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||
51у Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | 11е | Зег | Пе | Азп | Туг Агд |
- 82 012520
260 265 270
ТЬг | 01и 11е | Азр | Ьуз 275 | Рго Зег МеЬ А1а Не Рго А1а Рго ТЬг Азр | ||||||||||
280 | 285 | |||||||||||||
Ьеи | Ьуз | РЬе | ТЬг | 61п | Уа1 | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи | Зег | А1а | 61п | Тгр |
290 | 295 | 300 | ||||||||||||
ТЬг | Рго | Рго | Азп | Уа1 | 61п | Ьеи | ТЬг | 61 у | Туг | Агд | Уа1 | Агд | УаЬ | ТЬг |
305 | 310 | 315 | ||||||||||||
Рго | Ьуз | 61и | Ьуз | ТЬг | 61у | Рго | МеЬ | Ьуз | 61и | Не | Азп | Ьеи | АЬа | Рго |
320 | 325 | 330 | ||||||||||||
Азр | Зег | Зег | Зег | Уа1 | Уа1 | Уа1 | Зег | 61 у | Ьеи | МеЬ | УаЬ | А1а | ТЬг | Ьуз |
335 | 340 | 345 | ||||||||||||
Туг | 61и | Уа1 | Зег | Уа1 | Туг | А1а | Ьеи | Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Зег | Агд |
350 | 355 | 360 | ||||||||||||
Рго | А1а | 61п | С1у | Уа1 | Уа1 | ТЬг | ТЫ | Ьеи | 61и | АЗП | Уа1 | Зег | Рго | Рго |
365 | 370 | 375 | ||||||||||||
Агд | Агд | А1а | Агд | УаЬ | ТЬг | Азр | А1а | ТЬг | 61и | ТЬг | ТЫ | Не | ТЬг | Не |
380 | 385 | 390 | ||||||||||||
Зег | Тгр Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | 61и | ТЬг | Не | ТЬг | 61у | РЬе | С1п | Уа1 | Азр | |
395 | 400 | 405 | ||||||||||||
А1а | Уа1 | Рго | А1а | Азп | 61у | 61п | ТЬг | Рго | Не | 61п | Агд | ТЬг | Не | Ьуз |
410 | 415 | 420 | ||||||||||||
Рго | Азр | Уа1 | Агд | Зег | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | 61у | Ьеи | 61п | Рго | 61у | ТЬг |
425 | 430 | 435 | ||||||||||||
Азр | Туг | Ьуз | Не | Туг | Ьеи | Туг | ТЬг | Ьеи | Азп | Азр | Азп | А1а | Агд | Зег |
440 | 445 | 450 | ||||||||||||
Зег | Рго | Уа1 | Уа1 | Не | Азр | А1а | Зег | ТЬг | А1а | Не | Азр | А1а | Рго | Зег |
- 83 012520
455 460 465
АЗП | Ьеи | Агд РЬе | Ьеи А1а ТЬг ТЬг 470 | Рго | Азп Зег Ьеи 475 | Ьеи | Уа1 | Зег 480 | ||||||
Тгр | 61п | Рго | Рго | Агд | А1а | Агд | Не | ТЬг | 61 у | Туг | Не | Пе | Ьуз | Туг |
485 | 4 90 | 495 | ||||||||||||
61 и | Ьуз | Рго | С1у | Зег | Рго | Рго | Агд | С1и | Уа1 | Уа1 | Рго | Агд | Рго | Агд |
500 | 505 | 510 | ||||||||||||
Рго | 61у | Уа1 | ТЬг | С1и | А1а | ТЬг | Пе | ТЬг | С1у | Ьеи | С1и | Рго | 61 у | ТЬг |
515 | 520 | 525 | ||||||||||||
61и | Туг | ТЬг | Не | Туг | Уа1 | Не | А1а | Ьеи | Ьуз | Азп | Азп | б1п | Ьуз | Зег |
530 | 535 | 540 | ||||||||||||
61и | Рго | Ьеи | Не | 61у | Агд | Ьуз | Ьуз | ТЬг |
545 <210> 13 <211> 574 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент фибронектина, названный СН-296 <400> 13
Рго ТЬг Азр Ьеи Агд РЬе ТЬг Азп 11е 61у Рго Азр ТЬг МеЬ Агд
10 15
- 84 012520
Уа1 | ТЬг Тгр | А1а | Рго 20 | Рго Рго Зег | Не Азр Ьеи ТЬг Азп РЬе Ьеи | |||||||||
25 | 30 | |||||||||||||
Уа1 | Агд | Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ьуз | Азп | 61и | 61и | Азр | Уа1 | А1а | 61и | Ьеи |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Зег | Не | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | Ьеи |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
Рго | 61у | ТЬг | 61и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | 61 и | С1п |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||
Н13 | 61и | Зег | ТЬг | РГО | Ьеи | Агд | С1у | Агд | С1п | Ьуз | ТЬг | 61 у | Ьеи | Азр |
80 | 85 | 90 | ||||||||||||
Зег | Рго | ТЬг | 01у | Не | Азр | РЬе | Зег | Азр | Не | ТЬг | А1а | Азп | Зег | РЬе |
95 | 100 | 105 | ||||||||||||
ТЬг | Уа1 | ΗΪ3 | Тгр | 11е | А1а | Рго | Агд | А1а | ТЬг | Не | ТЬг | 61 у | Туг | Агд |
110 | 115 | 120 | ||||||||||||
Не | Агд | Н1з | Н13 | Рго | 61и | Н13 | РЬе | Зег | С1у | Агд | Рго | Агд | 61и | Азр |
125 | 130 | 135 | ||||||||||||
Агд | Уа1 | Рго | ΗΪ3 | Зег | Агд | Азп | Зег | Не | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЬг |
140 | 145 | 150 | ||||||||||||
Рго | 61у | ТЬг | 61и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Не | Уа1 | А1а | Ьеи | Азп | 61у | Агд |
155 | 160 | 165 | ||||||||||||
С1и | С1и | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | Не | С1у | С1п | С1п | Зег | ТЬг | Уа1 | Зег | Азр |
170 | 175 | 180 | ||||||||||||
Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ьеи | С1и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи |
185 | 190 | 195 | ||||||||||||
Ьеи | Пе | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Агд | Туг | Туг | Агд |
200 205 210
- 85 012520
Ые | ТЪг Туг | С1у | С1и 215 | ТЬг С1у С1у Азп Зег Рго Уа1 С1п 61и РЬе | ||||||||||
220 | 225 | |||||||||||||
ТЫ | Уа1 | Рго | б1у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | Не | Зег | 61 у | Ьеи | Ьуз |
230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Рго | С1у | Уа1 | Азр | туг | ТЬг | 11е | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | УаЬ | ТЬг | С1у Агд | |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||
С1у Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | Не | Зег | Не | Азп | Туг | Агд | |
260 | 265 | 270 | ||||||||||||
ТЬг | 61и | 11е | Азр | Ьуз | Рго | Зег | меь | А1а | Не | Рго | А1а | Рго | ТЬг | Азр |
275 | 280 | 285 | ||||||||||||
Ьеи | Ьуз | РЬе | ТЫ | С1п | Уа1 | ТЬг | Рго | ТЫ | Зег | Ьеи | Зег | А1а | 31п | Тгр |
290 | 295 | 300 | ||||||||||||
ТЬг | Рго | Рго | Азп | Уа1 | 61п | Ьеи | ТЬг | б1у Туг | Агд | Уа1 | Агд | Уа1 | ТЬг | |
305 | 310 | 315 | ||||||||||||
Рго | Ьуз | 61и | Ьуз | ТЬг | 61у | Рго | МеЬ | Ьуз | 61и | Не | Азп | Ьеи | А1а | Рго |
320 | 325 | 330 | ||||||||||||
Азр | Зег | Зег | Зег | Уа1 | Уа1 | Уа1 | Зег | С1у | Ьеи | МеС | Уа1 | А1а | ТЬг | Ьуз |
335 | 340 | 345 | ||||||||||||
Туг | С1и | УаЬ | Зег | Уа1 | туг | А1а | Ьеи | Ьуз | АЗр | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Зег | Агд |
350 | 355 | 360 | ||||||||||||
Рго | А1а | С1п | С1у | Уа1 | Уа1 | ТЬг | ТЬг | Ьеи | С1и | Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго |
365 | 370 | 375 | ||||||||||||
Агд | Агд | А1а | Агд | Уа1 | ТЬг | Азр | А1а | ТЬг | С1и | ТЬг | ТЬг | 11е | ТЬг | Не |
380 | 385 | 390 | ||||||||||||
Зег | Тгр | Агд | ТЬГ | Ьуз | ТЬг | 61и | ТЬГ | Не | ТЬг | 31у | РЬе | 61п | Уа1 | Азр |
395 400 405
- 86 012520
А1а Уа1 | Рго А1а Азп 410 | б1у | 61п ТЬг Рго | Не 61п Агд ТЬг Не Ьуз | ||||||||||
415 | 420 | |||||||||||||
Рго Азр | Уа1 | Агд | Зег | Туг | ТЬг | 11е | ТЬг | 61у | Ьеи | 61п | Рго | 61у | ТЬг | |
425 | 430 | 435 | ||||||||||||
Азр Туг | Ьуз | 11е | Туг | Ьеи | Туг | ТЬг | Ьеи | Азп | Азр | Азп | А1а | Агд | Зег | |
440 | 445 | 450 | ||||||||||||
Зег | Рго | Уа1 | Уа1 | Не | Азр | А1а | Зег | ТЬг | А1а | 11е | Азр | А1а | Рго | Зег |
455 | 460 | 465 | ||||||||||||
Азп | Ьеи | Агд | РЬе | Ьеи | А1а | ТЬг | ТЬг | Рго | Азп | Зег | Ьеи | Ьеи | Уа1 | Зег |
470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Тгр | 61п | Рго | Рго | Агд | А1а | Агд | Не | ТЬг | 61у | Туг | Не | 11е | Ьуз | Туг |
485 | 490 | 495 | ||||||||||||
61и | Ъуз | Рго | 61у | Зег | Рго | рго | Агд | 61и | Уа1 | Уа1 | Рго | Агд | Рго | Агд |
500 | 505 | 510 | ||||||||||||
Рго | б1у | νβΐ | ТЬг | 61и | А1а | ТЬг | 11е | ТЬг | С1у | Ьеи | 61 и | Рго | 61у | ТЬг |
515 | 520 | 525 | ||||||||||||
61и | туг | ТЬг | Не | Туг | Уа1 | 11е | А1а | Ьеи | Ьуз | Азп | Азп | 61п | Ьуз | Зег |
530 | 535 | 540 | ||||||||||||
61и | Рго | ьеи | Не | С1у | Агд | Ьуз | ьуз | ТЬг | Азр | 61и | Ьеи | Рго | С1п | Ьеи |
545 | 550 | 555 | ||||||||||||
Уа1 | ты | Ьеи | Рго | Н1з | Рго | Азп | Ьеи | Н1з | 61 у | Рго | 61и | 11е | Ьеи | Азр |
560 | 565 | 570 | ||||||||||||
Уа1 | Рго | Зег | ТЬг |
<210> 14
- 87 012520 <211> 302 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент фибронектина, названный С-С31 <400> 14
РГО | ТЬг | Азр | Ьеи | Агд | РЬе | ТЬг | Азп | Не | С1у | Рго | Азр | ТЬг | Мер | Агд |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
Уа1 | ТЬг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | Не | Азр | Ьеи | ТЫ | Азп | РЬе | Ьеи |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
Уа1 | Агд | Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ьуз | Азп | 31и | 61и | Азр | Уа1 | А1а | С1и | Ьеи |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Зег | Не | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | Ьеи |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
Рго | (51 у | ТЬг | 61и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | С1и | С1п |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||
Н1з | <31и | Зег | ТЬг | Рго | Ьеи | Агд | С1у Агд | 61п | Ьуз | ТЬг | 61у | Ьеи | Азр | |
80 | 85 | 90 | ||||||||||||
Зег | РГО | ТЬг | 61у | 11е | Азр | РЬе | Зег | Азр | Не | ТЬг | А1а | Азп | Зег | РЬе |
95 | 100 | 105 | ||||||||||||
ТЫ | Уа1 | ΗΪ3 | Тгр | Не | А1а | Рго | Агд | А1а | ТЬг | Не | ТЬг | С1у Туг | Агд | |
но | 115 | 120 | ||||||||||||
Не | Агд | βίβ | ΗΪ5 | Рго | 61и | Н13 | РЬе | Зег | 61у | Агд | Рго | Агд | <31и | Азр |
125 130 135
- 88 012520
Агд | Уа1 Рго ΗΪ3 Зег 140 | Агд | Азп | Зег | Не ТЬг Ьеи ТЫ 145 | Азп | Ьеи | ТЬг 150 | ||||||
Рго | 61 у | ТЫ | 61и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Не | Уа1 | 711а | Ьеи | Азп | 61у Агд | |
155 | 160 | 165 | ||||||||||||
61 и | 61и | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | Не | 61у | 61 п | 61п | Зег | ТЫ | Уа1 | Зег | АЗР |
170 | 175 | 180 | ||||||||||||
Уа1 | Рго | Агд | Азр | ьеи | 61и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи |
185 | 190 | 195 | ||||||||||||
Ьеи | 11е | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Агд | Туг | Туг | Агд |
200 | 205 | 210 | ||||||||||||
11е | ТЬг | Туг | 61у | 61и | ТЬг | 61у | 61у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | 61п | 61и | РЬе |
215 | 220 | 225 | ||||||||||||
ТЬг | Уа1 | Рго | 61у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | Не | Зег | С1у | Ьеи | Ьуз |
230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Рго | 61у | Уа1 | Азр | Туг | ТЬг | 11е | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЬг | 61у Агд | |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||
61у Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | Пе | Зег | 11е | Азп | туг | Агд | |
260 | 265 | 270 | ||||||||||||
ТЬг | 61 и | Не | Азр | Ьуз | Рго | Зег | Азр | 61и | Ьеи | Рго | С1п | Ьеи | Уа1 | ТЬг |
275 | 280 | 285 | ||||||||||||
Ьеи | Рго | Н13 | РГО | Азп | Ьеи | ΗΪ3 | 61У | Рго | 61и | Не | Ьеи | Азр | Уа1 | Рго |
290 295 300
Зег ТЬг <210> 15
- 89 012520 <211> 367 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент фибронектина, названный СНУ-89 <400> 15
Рго | ТЬг | Азр | Ьеи | Агд | РЬе | ТЬг | Азп | Пе | О1у | Рго | Азр | ТЬг | Меб | Агд |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
Уа1 | ТЬг | Тгр | А1а | РГО | Рго | Рго | Зег | Пе | АЗр | Ьеи | ТЬГ | Азп | РЬе | Ьеи |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
Уа1 | Агд | Туг | Зег | РГО | Уа1 | Ьуз | Азп | С1и | 01и | Азр | Уа1 | А1а | 61и | Ьеи |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Зег | Пе | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | Ьеи |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
Рго | е1у | ТЬг | 01и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | 01и | 01п |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||
Шз | 61и | Зег | ТЬг | Рго | Ьеи | Агд | Θ1у Агд | О1п | Ьуз | ТЬг | О1у | Ьеи | Азр | |
80 | 85 | 90 | ||||||||||||
Зег | Рго | ТЬг | С1у | Пе | Азр | РЬе | Зег | Азр | Пе | ТЬг | А1а | Азп | Зег | РЬе |
95 | 100 | 105 | ||||||||||||
ТЬг | Уа1 | Н13 | Тгр | Т1е | А1а | Рго | Агд | А1а | ТЬг | Пе | ТЬг | 01у | Туг | Агд |
110 | 115 | 120 | ||||||||||||
Пе | Агд | ΗΪ3 | ΗΪ3 | Рго | 01и | Н1з | РЬе | Зег | 01 у Агд | Рго | Агд | 61и | Азр |
125 130 135
- 90 012520
Агд | Уа1 | Рго | ΗΪ3 | Зег | Агд | Азп | Зег | 11е | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЬг |
140 | 145 | 150 | ||||||||||||
Рго | С1у | ТЬг | С1и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Пе | Уа1 | А1а | Ьеи | Азп | 61у | Агд |
155 | 160 | 165 | ||||||||||||
61и | 61и | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | 11е | 61у | 61п | 61п | Зег | ТЬг | Уа1 | Зег | Азр |
170 | 175 | 180 | ||||||||||||
Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ьеи | 61и | νβΐ | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи |
185 | 190 | 195 | ||||||||||||
Ьеи | 11е | Зег | Тгр Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Агд | Туг | Туг | Агд | |
200 | 205 | 210 | ||||||||||||
11е | ТЬг | Туг | 61у | 61и | ТЬг | 61у | С1у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | 61п | б1и | РЬе |
215 | 220 | 225 | ||||||||||||
ТЬг | Уа1 | Рго | С1у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | 11е | Зег | 61у | Ьеи | Ьуз |
230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Рго | 61у | Уа1 | Азр | Туг | ТЬг | Не | ТЫ | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЬг | 61 у | Агд |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||
61у | Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | Пе | Зег | Не | Азп | Туг | Агд |
260 | 265 | 270 | ||||||||||||
ТЬг | С1и | 11е | Азр | Ьуз | Рго | Зег | Мес | Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд |
275 | 280 | 285 | ||||||||||||
А1а | Агд | Уа1 | ТЬг | Азр | А1а | ТЬг | 61и | ТЬг | ТЫ | Не | ТЬг | Пе | Зег | Тгр |
290 | 295 | 300 | ||||||||||||
Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | 61и | ТЬг | Не | ТЬг | 61 у | РЬе | 61п | Уа1 | Азр | А1а | Уа1 |
305 | 310 | 315 | ||||||||||||
Рго | А1а | Азп | 61у | С1п | ТЬг | Рго | Не | 61п | Агд | ТЬг | 11е | Ьуз | Рго | Азр |
320 325 330
- 91 012520
Уа1 | Агд | Бег Туг ТЬг 11е ТЬг С1у Ьеи 61п Рго С1у ТЬг Азр Туг | ||||||||||
335 | 340 | 345 | ||||||||||
Ьуз | 11е | Тух | Ьеи | Туг | ТЬг | Ьеи Азп | Азр | Азп | А1а Агд | Бег | Бег | РГО |
350 | 355 | 360 | ||||||||||
Уа1 | Уа1 | 11е | Азр | А1а | Бег | ТЬг |
365 <210> 16 <211> 368 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент фибронектина, названный СНУ-90 <400> 16
Рго 1 | ТЬг | Азр Ьеи | Агд РЬе ТЬг Азп 11е 61 у Рго Азр ТЬг МеО Агд | |||||||||||
5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Уа1 | ТЬг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | 11е | Азр | Ьеи | ТЬг | Азп | РЬе | Ьеи |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
Уа1 | Агд | Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ьуз | Азп | 61 и | 61и | Азр | Уа1 | А1а | 61и | Ьеи |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Бег | 11е | Бег | Рго | Бег | Азр | АЗП | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | Ьеи |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
Рго | С1у | ТЬг | 61и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | 61и | 61п |
- 92 012520
70 75
ΗΪ3 | Сйи Зег | ТЬг | Рго 80 | Ьеи Агд Сйу Агд Сйп 85 | Ьуз | ТЬг Сйу Ъеи Азр 90 | ||||||||
Зег | Рго | ТЬг | Сйу | 11е | Азр | РЬе | Зег | Азр | Не | ТЬг | Айа | Азп | Зег | РЬе |
95 | 100 | 105 | ||||||||||||
ТЬГ | Уа1 | Н13 | Тгр | 11е | Айа | Рго | Агд | Айа | ТЬг | 11 е | ТЬг | Сйу Туг | Агд | |
110 | 115 | 120 | ||||||||||||
Не | Агд | нйз | ΗΪ3 | Рго | Сйи | ΗΪ3 | РЬе | Зег | 61у Агд | Рго | Агд | С1и | АЗр | |
125 | 130 | 135 | ||||||||||||
Агд | Уай | Рго | Нйз | Зег | Агд | Азп | Зег | Пе | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Азп | Ъеи | ТЬг |
140 | 145 | 150 | ||||||||||||
Рго | Сйу | ТЬг | Сйи | Туг | Уай | Уай | Зег | Пе | Уай | Айа | Ьеи | Азп | Сйу Агд | |
155 | 160 | 165 | ||||||||||||
С1и | Сйи | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | Не | 61у | Сйп | Сйп | Зег | ТЬг | νβΐ | Зег | АЗр |
170 | 175 | 180 | ||||||||||||
7а1 | Рго | Агд | Азр | Ьеи | Сйи | уай | Уа1 | Айа | Айа | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи |
185 | 190 | 195 | ||||||||||||
Ьеи | 11е | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | Айа | Уай | ТЬг | Уай | Агд | Туг | Туг | Агд |
200 | 205 | 210 | ||||||||||||
Не | ТЬг | Туг | Сйу | Сйи | ТЬг | Сйу | Сйу | Азп | Зег | Рго | Уай | Сйп | Сйи | РЬе |
215 | 220 | 225 | ||||||||||||
ТЬг | Уай | Рго | Сйу | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | Айа | ТЬг | Не | Зег | С1у | Ьеи | Ьуз |
230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Рго | Сйу | Уай | Азр | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | Уай | Туг | А1а | Уа1 | ТЬг | Сйу Агд | |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||
Сйу | АЗр | Зег | РГО | Айа | Зег | Зег | Ьуз | Рго | Пе | Зег | Пе | Азп | Туг Агд |
- 93 012520
260 265 270
ТЬг | С1 и 11е Азр Ьуз Рго Зег Мек. А1а 11е Азр А1а Рго Зег Азп | |||||||||||||
275 | 280 | 285 | ||||||||||||
Ьеи | Агд | РЬе | Ьеи | А1а | ТЬг | ТЬг | Рго | Азп | Зег | Ьеи | Ьеи | Уа1 | Зег | Тгр |
290 | 295 | 300 | ||||||||||||
61п | Рго | Рго | Агд | А1а | Агд | Пе | ТЬг | О1у Туг | Пе | Пе | Ьуз | Туг | 01 и | |
305 | 310 | 315 | ||||||||||||
Ьуз | Рго | С1у | Зег | Рго | Рго | Агд | С1и | Уа1 | Уа1 | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго |
320 | 325 | 330 | ||||||||||||
О1у | Уа1 | ТЬг | С1и | А1а | ТЬг | 11е | ТЬг | 01 у | Ьеи | 01 и | РГО | С1у | ТЬг | 61и |
335 | 340 | 345 | ||||||||||||
Туг | ТЬг | Не | Туг | Уа1 | Пе | А1а | Ьеи | Ьуз | Азп | Азп | С1п | Ьуз | Зег | С1и |
350 | 355 | 360 | ||||||||||||
Рго | Ьеи | Пе | 01у Агд | Ьуз | Ьуз | ТЬг |
365 <210> 17 <211> 370 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22 0>
<223> Фрагмент фибронектина, названный СНУ-92 <400> 17
- 94 012520
Рго 1 | ТЬг Азр | Ьеи | Агд 5 | РЬе ТЬг Азп 11е 61у Рго Азр ТЬг Мек Агд | ||||||||||
10 | 15 | |||||||||||||
Уа1 | ТЬг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | 11е | Азр | Ьеи | ТЬГ | Азп | РЬе | Ьеи |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
Уа1 | Агд Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ьуз | Азп | 61и | 61и | Азр | Уа1 | А1а | 61и | Ьеи | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Зег | Не | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | ν«ι | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | Ьеи |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
Рго | 61у | ТЬг | 61и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | 61и | 61п |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||
Ηί3 | С1и | Зег | ТЬг | Рго | Ьеи | Агд | 61у Агд | 61п | Ьуз | ТЬг | 61у | Ьеи | Азр | |
80 | 85 | 90 | ||||||||||||
Зег | Рго | ТЬг | 61у | 11е | Азр | РЬе | Зег | Азр | 11е | ТЬг | А1а | Азп | Зег | РЬе |
95 | 100 | 105 | ||||||||||||
ТЬг | Уа1 | Н1з | Тгр | Пе | А1а | Рго | Агд | А1а | ТЬг | Пе | ТЬг | 61у | Туг | Агд |
110 | 115 | 120 | ||||||||||||
Пе | Агд | Н13 | Н1з | Рго | 61и | ΗΪ3 | РЬе | Зег | 61у Агд | РГО | Агд | 61и | Азр | |
125 | 130 | 135 | ||||||||||||
Агд | Уа1 | Рго | Н13 | Зег | Агд | Азп | Зег | 11е | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЬг |
140 | 145 | 150 | ||||||||||||
Рго | 61у | ТЬг | 61и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | 11е | Уа1 | А1а | Ьеи | Азп | 61у Агд | |
155 | 160 | 165 | ||||||||||||
61 и | 61 и | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | Пе | 61у | 61п | 61П | Зег | ТЬг | Уа1 | Зег Азр | |
170 | 175 | 180 | ||||||||||||
Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ьеи | С1и | Уа1 | 7а1 | А1а | А1а | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи |
185 190 195
- 95 012520
Ьеи | Не | Зег | Тгр Азр А1а Рго А1а 7а1 ТЬг Уа1 Агд Туг Туг Агд | |||||||||||
200 | 205 | 210 | ||||||||||||
Не | ТЬг | Туг | С1у | 61и | ТЬг | 61у | 61у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | б1п | б1и | РЬе |
215 | 220 | 225 | ||||||||||||
ТЬг | Уа1 | Рго | С1у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | 11е | Зег | 61у | Ьеи | Ьуз |
230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Рго | 61у | Уа1 | Азр | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЬг | 61у Агд | |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||
61у | Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | ьуз | Рго | 11е | Зег | Не | Азп | Туг | Агд |
260 | 265 | 270 | ||||||||||||
ТЬг | 61и | 11е | Азр | Ьуз | Рго | Зег | Мек | А1а | Не | Рго | А1а | Рго | ТЬг | Азр |
275 | 280 | 285 | ||||||||||||
Ьеи | Ьуз | РЬе | ТЬг | С1п | Уа1 | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи | Зег | А1а | 61п | Тгр |
290 | 295 | 300 | ||||||||||||
ТЬг | Рго | Рго | Азп | Уа1 | 61п | Ьеи | ТЬг | С1у | Туг Агд | Уа1 | Агд | Уа1 | ТЬг | |
305 | 310 | 315 | ||||||||||||
Рго | Ьуз | 61и | Ьуз | ТЬг | 61у | Рго | Мек | Ьуз | С1и | Не | Азп | Ьеи | А1а | Рго |
320 | 325 | 330 | ||||||||||||
Азр | Зег | Зег | Зег | νβΐ | Уа1 | Уа1 | Зег | 61у | Ьеи | Мек | Уа1 | А1а | ТЬг | Ьуз |
335 | 340 | 345 | ||||||||||||
Туг | О1и | 7а1 | Зег | Уа1 | Туг | А1а | Ьеи | Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Зег | Агд |
350 | 355 | 360 | ||||||||||||
Рго | А1а | С1п | 61у | Уа1 | Уа1 | ТЬг | ТЬг | Ьеи | 61и |
365 370
- 96 012520 <210> 18 <211> 457 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент фибронектина, названный СНУ-179 <400> 18
Рго ТЬг Азр 1 | Ьеи | Агд РЬе ТЬг Азп 11е С1у Рго | Азр | ТЬг МеЬ | Агд 15 | |||||||||
5 | 10 | |||||||||||||
Уа1 | ТЬг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | 11е | Азр | Ьеи | ТЬГ | Азп | РЬе | Ьеи |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
Уа1 | Агд | Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ьуз | Азп | 61и | б1и | Азр | Уа1 | А1а | 61 и | Ьеи |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Зег | 11е | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | Ьеи |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
Рго | 61у | ТЬг | 61и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | 61и | 51п |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||
Н13 | С1и | Зег | ТЬг | Рго | Ьеи | Агд | С1у Агд | 31п | Ьуз | ты | С1у | Ьеи | Азр | |
80 | 85 | 90 | ||||||||||||
Зег | Рго | ТЬг | 31у | 11е | Азр | РЬе | Зег | Азр | Не | ТЬг | А1а | Азп | Зег | РЬе |
95 | 100 | 105 | ||||||||||||
ТЬг | Уа1 | Н13 | Тгр | Пе | А1а | Рго | Агд | А1а | ТЬг | Не | ТЬг | С1у | Туг | Агд |
110 | 115 | 120 | ||||||||||||
11е | Агд | Н1Э | ΗΪ5 | Рго | 61и | ΗΪ3 | РЬе | Зег | 51 у Ахд | Рго | Агд | С1и | Азр |
- 97 012520
125 130 135
Агд | УаЬ Рго | НЬз | Зег 140 | Агд Азп Зег 11е ТЫ 145 | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЬг 150 | |||||
Рго | 61у | ТЬг | 61и | Туг | Уа1 | УаЬ | Зег | Не | УаЬ | А1а | Ьеи | Азп | 61у Агд | |
155 | 160 | 165 | ||||||||||||
С1и | 61и | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | Не | 61у | 61п | 6Ьп | Зег | ТЬг | УаЬ | Зег | Азр |
170 | 175 | 180 | ||||||||||||
УаЬ | Рго | Агд | Азр | Ьеи | 61и | УаЬ | УаЬ | А1а | АЬа | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи |
185 | 190 | 195 | ||||||||||||
Ьеи | Не | Зег | Тгр Азр | А1а | Рго | А1а | УаЬ | ТЬг | УаЬ | Агд | Туг | Туг | Агд | |
200 | 205 | 210 | ||||||||||||
Не | ТЬг | Туг | 6Ьу | С1и | ТЬг | 61у | 61у | Азп | Зег | Рго | УаЬ | СЬп | 61и | РЬе |
215 | 220 | 225 | ||||||||||||
ТЬг | УаЬ | Рго | б1у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | Не | Зег | еьу | Ьеи | Ьуз |
230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Рго | 61 у | УаЬ | Азр | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | Уа1 | Туг | АЬа | УаЬ | ТЬг | 61 у Агд | |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||
61у Азр | Зег | Рго | АЬа | Зег | Зег | Ьуз | Рго | 11е | Зег | Не | Азп | Туг | Агд | |
260 | 265 | 270 | ||||||||||||
ТЬг | 61и | Не | Азр | Ьуз | Рго | Зег | Мек | АЗП | УаЬ | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд |
275 | 280 | 285 | ||||||||||||
А1а | Агд | УаЬ | ТЬг | Азр | АЬа | ТЬг | 61и | ТЬг | ТЬг | Не | ТЬг | Не | Зег | Тгр |
290 | 295 | 300 | ||||||||||||
Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | 61и | ТЬг | Не | ТЬг | 61у | РЬе | 6Ьп | УаЬ | Азр | АЬа | УаЬ |
305 | 310 | 315 | ||||||||||||
Рго | АЬа | Азп | 6Ьу | 61П | ТЬг | Рго | Не | 61п | Агд | ТЫ | Не | Ьуз | Рго | Азр |
- 98 012520
320 325 330
7а1 Агд Бег Туг ТЬг 335 | Пе | ТЬг | С1у | Ьеи 61п Рго 61 у ТЬг Азр Туг | ||||||||||
340 | 345 | |||||||||||||
Ьуз | 11е | Туг | Ьеи | Туг | ТЬг | Ьеи | Азп | Азр | Азп | А1а | Агд | Бег | Зег | Рго |
350 | 355 | 360 | ||||||||||||
Уа1 | Уа1 | Пе | Азр | А1а | Бег | ТЬг | А1а | Не | Азр | А1а | Рго | Зег | Азп | Ьеи |
365 | 370 | 375 | ||||||||||||
Агд | РЬе | Ьеи | А1а | ТЬг | ТЬг | Рго | Азп | Бег | Ьеи | Ьеи | Уа1 | Зег | Тгр | 61п |
390 | 385 | 390 | ||||||||||||
Рго | Рго | Агд | А1а | Агд | Пе | ТЬг | С1у Туг | 11е | Пе | Ьуз | Туг | С1и | Ьуз | |
395 | 400 | 405 | ||||||||||||
Рго | 61у | Бег | Рго | Рго | Агд | 61и | Уа1 | Уа1 | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | 61у |
410 | 415 | 420 | ||||||||||||
Уа1 | ТЬг | 61и | А1а | ТЬг | 11е | ТЬг | С1у | Ьеи | С1и | Рго | 61у | ТЬг | 61и | Туг |
425 | 430 | 435 | ||||||||||||
ТЬг | Пе | Туг | Уа1 | Пе | А1а | Ьеи | Ьуз | Азп | Азп | С1п | Ьуз | Зег | 61и | Рго |
440 | 445 | 450 | ||||||||||||
Ьеи | 11е | 61 у Агд | Ьуз | Ьуз | ТЬг |
455 <210> 19 <211> 459 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 99 012520 <220>
<223> Фрагмент фибронектина, названный СНУ-181 <400> 19
Рго 1 | ТЬг | Азр | Ьеи Агд РЬе ТЬг Азп 11е 61у Рго Азр ТЬг МеЬ Агд | |||||||||||
5 | 10 | 15 | ||||||||||||
Уа1 | ТЬг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | 11е | Азр | Ьеи | ТЫ | Азп | РЬе | Ьеи |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
Уа1 | Агд | Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ьуз | Азп | 61и | 61и | Азр | Уа1 | А1а | 61и | Ьеи |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Зег | 11е | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЫ | Азп | Ьеи | Ьеи |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
РГО | 61у | ТЬг | б1и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | 61и | 61п |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||
ΗΪ3 | 61и | Зег | ТЬг | Рго | Ьеи | Агд | 61у Агд | 61п | Ьуз | ТЬг | 61у | Ьеи | Азр | |
80 | 85 | 90 | ||||||||||||
Зег | Рго | ТЬг | 61у | 11е | Азр | РЬе | Зег | Азр | 11е | ТЬг | А1а | Азп | Зег | РЬе |
95 | 100 | 105 | ||||||||||||
ТЬг | Уа1 | Н1з | Тгр | Не | А1а | Рго | Агд | А1а | ТЬг | 11е | ТЬг | 61у | Туг | Агд |
110 | 115 | 120 | ||||||||||||
11е | Агд | Н13 | Н1з | Рго | 61и | ΗΪ3 | РЬе | Зег | 61 у Агд | Рго | Агд | С1и | Азр | |
125 | 130 | 135 | ||||||||||||
Агд | Уа1 | Рго | Н1з | Зег | Агд | Азп | Зег | 11е | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЬг |
140 | 145 | 150 | ||||||||||||
Рго | С1у | ТЬг | 61и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Не | Уа1 | А1а | Ьеи | Азп | 61у | Агд |
155 160 165
- 100 012520
61и | 51и Зег | Рго | Ьеи 170 | Ьеи Не С1у 61п 61п Зег ТЫ Уа1 Зег Азр | ||||||||||
175 | 180 | |||||||||||||
Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ьеи | 61и | νβΐ | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи |
185 | 190 | 195 | ||||||||||||
Ьеи | Не | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Агд | Туг | Туг | Агд |
200 | 205 | 210 | ||||||||||||
Не | ТЬг | Туг | 61у | 61и | ТЬг | 61у | 61у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | 61п | 61и | РЬе |
215 | 220 | 225 | ||||||||||||
ТЬг | Уа1 | Рго | 61у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | Не | Зег | 61у | Ьеи | Ьуз |
230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Рго | 61 у | Уа1 | Азр | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЬг | С1у Агд | |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||
61у Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | ьуз | Рго | Не | Зег | Не | Азп | Туг | Агд | |
260 | 265 | 270 | ||||||||||||
ТЬг | 61и | Не | Азр | Ьуз | Рго | Зег | Мек | А1а | Не | Рго | А1а | Рго | ТЬг | Азр |
275 | 280 | 285 | ||||||||||||
Ьеи | Ьуз | РЬе | ТЬг | 61п | Уа! | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи | Зег | А1а | 61п | Тгр |
290 | 295 | 300 | ||||||||||||
ТЬг | Рго | Рго | АЗП | νβΐ | 61п | Ьеи | ТЬг | 61у | Туг | Агд | Уа1 | Агд | Уа1 | ТЬг |
305 | 310 | 315 | ||||||||||||
Рго | Ьуз | 61и | Ьуз | ТЬг | 61у | Рго | Мек | Ьуз | 61и | Не | Азп | Ьеи | А1а | РГО |
320 | 325 | 330 | ||||||||||||
Азр | Зег | Зег | Зег | Уа1 | Уа1 | Уа1 | Зег | 61у | Ьеи | Мек | Уа1 | А1а | ТЬг | Ьуз |
335 | 340 | 345 | ||||||||||||
Туг | 61 и | Уа1 | Зег | Уа1 | Туг | А1а | Ьеи | Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Зег | Агд |
350 355 360
- 101 012520
Рго | А1а Е1п 61у Уа1 Уа1 ТЬг ТЬг Ьеи С1и Азп Уа1 Зег Рго Рго | |||||||||||||
365 | 370 | 375 | ||||||||||||
Агд | Агд | А1а | Агд | Уа1 | ТЬг | Азр | А1а | ТЬг | 61и | ТЬг | ТЬг | Не | ТЬг | Не |
380 | 385 | 390 | ||||||||||||
Зег | тгр | Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | С1и | ТЬг | Не | ТЬг | С1у | РЬе | 61п | Уа1 | Азр |
395 | 400 | 405 | ||||||||||||
А1а | Уа1 | Рго | А1а | Азп | <31у | 61п | ТЬг | Рго | Не | 61п | Агд | ТЬг | 11е | Ьуз |
410 | 415 | 420 | ||||||||||||
Рго | Азр | Уа1 | Агд | 5ег | Туг | ТЬг | 11е | ТЬг | 61у | Ьеи | 61п | Рго | 61у | ТЬг |
425 | 430 | 435 | ||||||||||||
Азр | Туг | Ьуз | Не | Туг | Ьеи | Туг | ТЬг | Ьеи | Азп | Азр | Азп | А1а | Агд | Зег |
440 | 445 | 450 | ||||||||||||
Зег | Рго | Уа1 | Уа1 | 11е | Азр | А1а | Зег | ТЬг |
455 <210> 20 <211> 276 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент фибронектина, названный Η-275-Суз <400> 20
Меб А1а А1а Зег А1а Не Рго А1а Рго ТЬг Азр Ьеи Ьуз РЬе ТЬг
- 102 012520
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
01η | Уа1 | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи | Зег | А1а | 61п | тгр | ТЬг | Рго | Рго | Азп |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
Уа1 | 61п | ьеи | ТЬг | 61у Туг Агд | Уа1 | Агд | Уа1 | ТЬг | Рго | Ьуз | 61и | Ьуз | ||
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
ТЬг | 61у | РГО | мег | Ьуз | 61и | 11е | Азп | Ьеи | А1а | Рго | Азр | Зег | Зег | Зег |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
νβΐ | Уа1 | Уа1 | зег | 61 у | Ьеи | МеС | Уа1 | АЬа | ТЬг | Ьуз | Туг | 61и | Уа1 | Зег |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||
νβΐ | Туг | А1а | Ьеи | Ьуз | АЗр | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Зег | Агд | РГО | АЬа | 61п | 61 у |
80 | 85 | 90 | ||||||||||||
νβΐ | 7а1 | ТЬг | ТЬг | Ьеи | 61и | Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд | А1а | Агд |
95 | 100 | 105 | ||||||||||||
νβΐ | ТЬг | Азр | А1а | ТЬг | 61и | ТЬг | ТЬг | 11е | ТЬг | Не | Зег | Тгр | Агд | ТЬг |
110 | 115 | 120 | ||||||||||||
Ьуз | ТЫ | 61и | ТЬг | Не | ТЬг | 61у | РЬе | 61п | Уа1 | Азр | А1а | Уа1 | Рго | А1а |
125 | 130 | 135 | ||||||||||||
Азп | 61у | 61 п | ТЬг | Рго | Не | 61п | Агд | ТЬг | Не | Ьуз | Рго | Азр | Уа1 | Агд |
140 | 145 | 150 | ||||||||||||
Зег | Туг | ТЬг | 11е | ТЬг | 61у | Ьеи | 61п | Рго | 61у | ТЬг | Азр | Туг | Ьуз | Не |
155 | 160 | 165 | ||||||||||||
Туг | Ьеи | Туг | ТЬг | Ьеи | Азп | Азр | Азп | АЬа | Агд | Зег | Зег | Рго | Уа1 | Уа1 |
170 | 175 | 180 | ||||||||||||
Не | Азр | А1а | зег | ТЬг | АЬа | Не | Азр | АЬа | Рго | Зег | Азп | Ьеи | Агд | РЬе |
185 | 190 | 195 | ||||||||||||
Ьеи | А1а | ТЬг | ТЬг | Рго | Азп | Зег | Ьеи | Ьеи | Уа1 | Зег | тгр | С1п | Рго | Рго |
- 103
200 205 210
Агд | А1а | Агд 11е | ТЬг С1у туг Не Не Ьуз Туг С1и | Ьуз Рго С1у 225 | ||||||||||
215 | 220 | |||||||||||||
Зег | Рго | Рго | Агд | 61и | Уа1 | Уа1 | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | С1у | Уа1 | ТЬг |
230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Й1и | А1а | ТЬг | Не | ТЬг | С1у | Ьеи | 61и | Рго | С1у | ТЬг | С1и | Туг | ТЬг | Не |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||
Туг | Уа1 | Не | А1а | Ьеи | ьуз | Азп | Азп | С1п | Ьуз | Зег | С1и | Рго | Ьеи | Не |
260 | 265 | 270 | ||||||||||||
61у | Агд | Ьуз | Ьуз | ТЬг | Суз |
275 <210> 21 <2Η> 38 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер 123 <400> 21 ааассаРддс адсРадсдсР аРРссРдсас саасЬдас 38 <210> 22
- 104 012520 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер 14А <400> 22 аааддагссс ЬаасЪадГоЬ ёШссйсс ааьсад 36 <210> 23 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер Суз-А <400> 23 аааадсддсс дсьадсдсаа дсса^ддГсГ. дЬЪЬссЕдЪд 40 <210> 24 <211> 41 <212> ДНК
- 105 012520 <213> искусственная последовательность <220>
<223> Праймер Суз-8 <400> 24 аааадсддсс дсасРадРдс аРадддаРсс ддсРдадсаа с 41 <210> 25 <211> 658 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Фрагмент фибронектина, названный СН-296На <400> 25
Мер 1 | Рго ТЬг | Азр | Ьеи Агд РЬе ТЬг Азп Не С1у Рго Азр ТЫ Мер Агд | ||||||||||||
5 | 10 | 15 | |||||||||||||
Уа1 | ТЬг | Тгр | А1а | Рго | РГО | Рго | Зег | 11е | Азр | Ьеи | ТЬг | Азп | РЬе | Ьеи | Уа1 |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Агд | Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ьуз | Азп | С1и | О1и | Азр | Уа1 | А1а | С1и | Ьеи | Зег | Не |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
5ег | Рго | Зег | АЗр | АЗП | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | Ьеи | Рго | С1у | ТЬг |
55 60
- 106 012520
С1и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | 61и | <31п | Н13 | 61и | Зег | ТЬг |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Рго | Ьеи | Агд | С1у Агд | С1п | Ьуз | ТЬг | 61у | Ьеи | Азр | Зег | Рго | ТЬг | С1у | Не | |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
азр | РЬе | Зег | Азр | 11е | ТЬг | А1а | Азп | Зег | РЬе | ТЬг | Уа1 | ΗΪ3 | Тгр | 11е | А1а |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Рго | Агд | А1а | ТЬг | 11е | ТЬг | С1у | Туг Агд | 11е | Агд | ΗΪ3 | Н±з | Рго | 61и | Нхз | |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
РЬе | Зег | С1у | Агд | Рго | Агд | 61и | Азр Агд | Уа1 | Рго | Н1з | Зег | Агд | Азп | Зег | |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
11е | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЬг | Рго | С1у | ТЬг | 61и | Туг | Уа1 | Уа! | Зег | 11е |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Уа1 | А1а | Ьеи | Азп | 61у Агд | С1и | С1и | 5ег | Рго | Ьеи | Ьеи | 11е | 61у | С1п | 61п | |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Зег | ТЬг | Уа1 | Зег | Азр | Уа1 | Рго | Агд Азр | Ьеи | 61и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Рго | ТЬг | Зег | Ьеи | Ьеи | 11е | Зег | Тгр Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Агд | |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Туг | Туг | Агд | Не | ТЫ | Туг | 61у | С1и | ТЬг | С1у | <31у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | С1п |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
61и | РЬе | ТЫ | Уа1 | Рго | 61у | Зег | Ьуз | Зег | ТЫ | А1а | ТЬг | 11е | Зег | С1у | Ьеи |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Ьуз | Рго | С1у | Уа1 | Азр | Туг | ТЬг | 11е | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЬг | С1у | Агд |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
С1у Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | ьуз | Рго | 11е | Зег | 11е | Азп | Туг | Агд | ТЬг | |
260 | 265 | 270 |
- 107 012520
С1и 11е Азр Ьуз | Рго Зег | С1п | МеЬ С1п Уа1 ТЬг Азр Уа1 С1п Азр Азп | ||||||||||||
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Зег | 11е | Зег | Уа1 | Ьуз | Тгр | Ьеи | Рго | Зег | Зег | Зег | Рго | Уа1 | ТЬг | <31у | Туг |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Агд | Уа1 | ТЬг | ТЬг | ТЬг | Рго | Ьуз | Азп | 61у | Рго | 61у | Рго | ТЬг | Ьуз | ТЬг | Ьуз |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
ТЬг | А1а | 61у | Рго | Азр | 61п | ТЬг | 61и | МеГ | ТЬг | Не | 61и | 61у | Ьеи | б1п | Рго |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
ТЫ | Уа1 | 61и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Туг | А1а | 61п | Азп | Рго | Зег | С1у | С1и |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Зег | С1п | Рго | Ьеи | Уа1 | 61п | ТЬг | А1а | Уа1 | ТЬг | А1а | Не | Рго | А1а | Рго | ТЬг |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Азр | Ьеи | Ьуз | РЬе | ТЬг | е1п | Уа1 | ТЬг | Рго | ТЫ | Зег | Ьеи | Зег | А1а | С1п | Тгр |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
ТЬг | Рго | Рго | Азп | Уа1 | С1п | Ьеи | ТЬг | С1у Туг | Агд | Уа1 | Агд | Уа1 | ТЬг | Рго | |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Ьуз | С1и | Ьуз | ТЬг | 31у | Рго | Меь | Ьуз | С1и | Пе | Азп | Ьеи | А1а | Рго | Азр | Зег |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Зег | Зег | Уа1 | Уа1 | Уа1 | Зег | <31у | Ьеи | МеЬ | Уа1 | А1а | ТЬг | Ьуз | Туг | С1и | Уа1 |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Зег | Уа1 | Туг | А1а | Ьеи | Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Зег | Агд | Рго | А1а | С1п | С1у |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Уа1 | Уа1 | ТЬг | ТЬг | Ьеи | б1и | Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго | Агд Агд | А1а | Агд | Уа1 | |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
ТЬг | Азр | А1а | ТЬг | С1и | ТЬг | ТЬг | Не | ТЬг | 11е | Зег | Тгр Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | |
465 | 470 | 475 | 480 |
- 108 012520
С1и ТЬг 11е ТЬг 61у РЬе С1п Уа1 Азр А1а Уа! Рго А1а | Азп 01 у 495 | С1П | |||||||||||||
485 | 490 | ||||||||||||||
ТЬг | Рго | 11е | 61п | Агд | ТЬг | Не | Ьуз | Рго | Азр | Уа1 | Ахд | Зег | Туг | ТЬг | Не |
500 | 505 | 510 | |||||||||||||
ТЬг | С1у | Ьеи | <31п | РГО | 61у | ТЬг | Азр | Туг | Ьуз | 11е | Туг | Ьеи | Туг | ТЬг | Ьеи |
515 | 520 | 525 | |||||||||||||
Азп | Азр | Азп | А1а | Агд | Зег | Зег | Рго | Уа1 | Уа1 | 11е | Азр | А1а | Зег | ТЬг | А1а |
530 | 535 | 540 | |||||||||||||
11е | Азр | А1а | Рго | Зег | Азп | Ьеи | Агд | РЬе | Ьеи | А1а | ТЬг | ТЬг | Рго | Азп | Зег |
545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
Ьеи | Ьеи | Уа1 | Зег | Тгр | С1п | Рго | Рго | Агд | А1а | Агд | 11е | ТЬг | С1у | Туг | 11е |
565 | 570 | 575 | |||||||||||||
11е | Ьуз | Туг | 61и | Ьуз | Рго | Й1у | Зег | Рго | Рго | Агд | С1и | Уа1 | Уа1 | Рго | Агд |
580 | 585 | 590 | |||||||||||||
Рго | Агд | Рго | 61у | Уа1 | ТЬг | 01и | А1а | ТЬг | 11е | ТЬг | 01у | Ьеи | 01и | Рго | С1у |
595 | 600 | 605 | |||||||||||||
ТЬг | 61и | Туг | ТЬг | Ι1Θ | Туг | Уа1 | 11е | А1а | Ьеи | Ьуз | Азп | Азп | 01п | Ьуз | Зег |
610 | 615 | 620 | |||||||||||||
С1и | Рго | Ьеи | Не | С1у Агд | Ьуз | Ьуз | ТЬг | Азр | 01 и | Ьеи | Рго | 61п | Ьеи | Уа1 | |
625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
ТЬг | Ьеи | Рго | Η13 | Рго | Азп | Ьеи | Н13 | 61у | Рго | С1и | 11е | Ьеи | Азр | Уа1 | Рго |
645 | 650 | 655 |
Зег ТЬг
- 109 012520 <210> 26 <211> 1939 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Полинуклеотид, кодирующий СН-296Иа <400> 26
саГаГдссса | сГдассГдсд | аггсассаас | аГГддСссад | асассагдсд | ГдЪсассГдд | 60 |
дсГссасссс | саЪссаИда | ГГЬаассаае | ГГссГддГдс | д-ЬЪасГсдсс | ГдЪдааааа!: | 120 |
даддаадаГд | ГЬдсададЫ: | дГсааГЪЪс!: | ссЪЪсадаса | аГдсадЪддЪ | сГГаасаааГ | 180 |
сГссГдссГд | дСасадааЪа | СдГадГдадЪ | дГсГссадГд | ЪсЪасдааса | асаГдададс | 240 |
асассЬсГГа | даддаадаса | даааасаддГ | сГГдаЪГссс | саасгддсаг | ЕдасЕГЕГсГ | 300 |
даГаГЪасГд | 003301:01:1:1: | ГасГдГдсас | гддаггдсгс | сГсдадссас | саГсасГддс | 360 |
ЪасаддаГсс | дссаЪсаГсс | сдадсасГГс | адГдддадас | сгсдадаада | ГсдддГдссс | 420 |
сасГсГсдда | аГГссаГсас | ссГсассаас | сГсасЬссад | дсасададЪа | ГдГддГсадс | 480 |
аГсдГГдсЪс | ГГааГддсад | ададдааадГ | сссЪГаЪЪда | ГГддссааса | аГсаасадГС | 540 |
ьсГдаГдГЛс | сдадддассГ | ддаадГГдГГ | дсГдсдассс | ссассадссГ | асГдаГсадс | 600 |
ГдддаГдсГс | сгдсьдьсас | адГдадаГаГ | ГасаддаЬса | сГГасддада | аасаддадда | 660 |
ааГадсссГд | ГссаддадП: | сасГдГдссГ | дддадсаадГ | сЪасадсГас | саГсадсддс | 720 |
сГГааассГд | дад-ЬГдаГГа | ГассаГсасГ | дГдГаГдсСд | ГсасГддссд | Гддадасадс | 780 |
сссдсаадса | дсаадссааГ | ТГссаГГаа!: | Гассдаасад | аааГГдасаа | ассаГсссад | 840 |
аГдсаадЪда | ссдаГдГЪса | ддасаасадс | аГЬадЪдГса | адГддсЪдсс | ГЪсаадГГсс | 900 |
ссЪдГЬасГд | дГЬасададГ | аассассасГ | сссаааааГд | дассаддасс | аасааааасЪ | 960 |
аааасГдсад | дЬссадаЬса | аасадаааГд | асГаГГдаад | дсГГдсадсс | сасадГддад | 1020 |
- 110 012520
1а£дСдд66а | дСдСсСаЬдс | ЬсадааЬсса | адсддадада | дЬсадссЬсб | ддНсадас! | 1080 |
дсадьаассд | сбаЬбссЬдс | ассаасЬдас | с£даад61са | сЬсаддЪсас | асссасаадс | 1140 |
сЬдадсдссс | адбддасасс | асссааЬд!:!: | садсЬсасЬд | да^а^сдадЪ | дсдддЬдасс | 1200 |
сссааддада | адассддасс | аа*дааадаа | аЬсаассббд | с!сс1:дасад | сЬсабссдЬд | 1260 |
дЫдЬаЬсад | дасЬЬаЬддб | ддссассааа | ЬаСдаадГда | дЬдЬсбаЬдс | ЬсПааддас | 1320 |
асбЬЪдасаа | дсадассадс | ^садддСдЬЬ | дЬсассасЬс | 1ддадааГ,д1 | садсссасса | 1380 |
адаадддсЬс | дЬдбдасада | ±дс£ас1дад | ассассаЬса | ссаНадсЬд | дадаассаад | 1440 |
ас£дадасда | ЪсасЪддс'Ы: | ссаадЬЬдаЬ | дссдЬбссад | ссаагддсса | дасСссаабс | 1500 |
сададаасса | Ьсаадссада | £д1садаадс | ЬасассаЪЬа | саддбЪЬаса | ассаддсасЬ | 1560 |
дас£асаада | бсЪассЪдЪа | сассЫдааЪ | дасаабдсЬс | ддадсЪсссс | ЪдСддбсаЪс | 1620 |
дасдсс!сса | сЪдссаЪЪда | ЬдсассаЪсс | аассЬдсдЫ: | гссГ.ддссас | сасасссааЬ | 1680 |
ЁссЬЬдсЬдд | ЬаЬсаЬддса | дссдссасдЪ | дссадда£1а | ссддсЬасаЬ | саСсаадЬаЬ | 1740 |
дадаадссЬд | ддЬсЬссбсс | сададаадГд | д-ЬсссГсддс | сссдсссбдд | Г.дЪсасадад | 1800 |
дсЬасЬаЬЬа | сЪддссЬдда | ассдддаасс | даабабасаа | ЬЬЬаЬдЬсаЬ | ЪдсссЬдаад | 1860 |
аабааСсада | ададсдадсс | сс1да±£дда | аддааааада | садасдадсЬ | ЪссссаасСд | 1920 |
дЬаасссЫс | сасассссаа | ЬсЬЬсабдда | ссададабсъ | Ъддабдббсс | ЬЪссасаЬаа | 1980 |
СадаадсЛС 1909 <210> 27 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер СН-29бНа1
- 111 012520 <400> 27 аксакакдсс сасГдасс+д сд 22 <210> 26 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер СН-29б№2 <400> 28 акаадсккск аккакдкдда адд 23 <210> 29 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер СН-296ИаЗ <400> 29 ассаксаскд дсрасаддак сс 22
Claims (20)
1. Способ получения цитотоксических лимфоцитов, отличающийся тем, что заключается в осуществлении по меньшей мере одной стадии, выбранной из индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов с использованием среды, содержащей сыворотку и плазму в суммарной концентрации, составляющей не более 5 об.%, в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси, при этом цитотоксические лимфоциты в более высокой степени экспрессируют рецептор интерлейкина-2 по сравнению с цитотоксическими лимфоцитами, полученными в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси.
2. Способ получения цитотоксических лимфоцитов, отличающийся тем, что заключается в осуществлении по меньшей мере одной стадии, выбранной из индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов с использованием среды, содержащей сыворотку и плазму в суммарной концентрации, составляющей не более 5 об.%, в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси, при этом цитотоксические лимфоциты имеют более высокое относительное содержание СО8-позитивных клеток по сравнению с цитотоксическими лимфоцитами, полученными в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси.
- 112 012520
3. Способ получения цитотоксических лимфоцитов, отличающийся тем, что заключается в осуществлении по меньшей мере одной стадии, выбранной из индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов с использованием среды, содержащей сыворотку и плазму в суммарной концентрации, составляющей не более 5 об.%, в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси, при этом кратность экспансии лимфоцитов выше по сравнению с кратностью экспансии в способе получения цитотоксических лимфоцитов в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси.
4. Способ получения цитотоксических лимфоцитов, отличающийся тем, что заключается в осуществлении по меньшей мере одной стадии, выбранной из индукции, поддержания и экспансии цитотоксических лимфоцитов с использованием среды, содержащей сыворотку и плазму в суммарной концентрации, составляющей не более 5 об.%, в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси, при котором цитотоксическая активность лимфоцитов усилена или поддерживается более высокая цитотоксическая активность по сравнению с лимфоцитами, полученными в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси.
5. Способ по любому из пп.1-4, где фибронектин, его фрагмент или их смесь иммобилизируют на твердой фазе.
6. Способ по п.5, где твердой фазой является оборудование для культивирования клеток или носитель для культуры клеток.
7. Способ по п.6, где оборудование для культивирования клеток представляет собой чашку Петри, флакон или мешок, а носителем для культуры клеток являются шарики, мембрана или предметное стекло.
8. Способ по любому из пп.1-7, где цитотоксическим лимфоцитом является активируемая лимфокином клетка-киллер.
9. Способ по любому из пп.1-8, где фрагмент фибронектина является полипептидом (а), содержащим по меньшей мере любую одну из аминокислотных последовательностей 8ЕЦ ΙΌ N0: 1-8 в списке последовательностей, или полипептидом (б), содержащим по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, имеющую замену, делецию, инсерцию или добавление одной аминокислоты или большего количества аминокислот по сравнению с любой из указанных аминокислотных последовательностей, при этом полипептид (б) обладает функцией, эквивалентной функции полипептида (а).
10. Способ по п.9, где фрагмент фибронектина обладает активностью клеточной адгезии и/или гепаринсвязывающей активностью.
11. Способ по п.9, где фрагмент фибронектина представляет собой по меньшей мере один полипептид, выбранный из группы, состоящей из полипептидов, имеющих любую одну из аминокислотных последовательностей 8ЕЦ ΙΌ N0: 9-20 и 25 в списке последовательностей.
12. Способ по любому из пп.1-11, который удовлетворяет условиям, выбранным из следующих условий (а) и (Ь) в начале культивирования:
(a) отношение количества клеток к площади засеваемой поверхности оборудования для культивирования клеток в начале культивирования составляет от 1 до 5х105 клеток/см2; и/или (b) концентрация клеток в среде в начале культивирования составляет от 1 до 5х 105 клеток/мл.
13. Цитотоксический лимфоцит, полученный способом по любому из пп.1-12.
14. Лекарственное средство для адоптивной иммунотерапии, содержащее в качестве эффективного ингредиента цитотоксический лимфоцит, полученный способом по любому из пп.1-12.
15. Среда для культивирования цитотоксических лимфоцитов, отличающаяся тем, что содержит в качестве эффективного ингредиента фибронектин, его фрагмент или их смесь, и тем, что суммарная концентрация сыворотки и плазмы в среде составляет не более 5 об.%, где указанная среда используется для продуцирования цитотоксических лимфоцитов, которые в высокой степени экспрессируют рецептор интерлейкина-2 по сравнению с цитотоксическими лимфоцитами, культивируемыми в среде в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси;
продуцирования цитотоксических лимфоцитов, которые имеют высокое относительное содержание СО8-позитивных клеток по сравнению с цитотоксическими лимфоцитами, культивируемыми в среде в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси;
культивирования с более высокой кратностью экспансии по сравнению с кратностью экспансии в случае использования среды, не содержащей фибронектин, его фрагмент или их смеси, и/или усиления цитотоксической активности или поддержания высокой цитотоксической активности по сравнению с цитотоксической активностью цитотоксических лимфоцитов, культивируемых в среде в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси.
16. Способ по любому из пп.1-12, дополнительно предусматривающий стадию трансдукции чужеродного гена в цитотоксический лимфоцит.
17. Способ по п.16, где чужеродный ген трансдуцируют, используя ретровирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус или вирус обезьян.
18. Полипептид, имеющий аминокислотную последовательность (а) 8ЕЦ ΙΌ N0: 25 в списке последовательностей или аминокислотную последовательность (б), имеющую делецию, инсерцию, добавление
- 113 012520 или замену одной или большего количества аминокислот по сравнению с аминокислотной последовательностью (а), при этом полипептид, имеющий аминокислотную последовательность (б), обладает функцией, эквивалентной функции полипептида с аминокислотной последовательностью (а).
19. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по п.18.
20. Нуклеиновая кислота по п.19, которая содержит (1) ДНК, включающую нуклеотидную последовательность 8Ε^ П) N0: 26; (2) ДНК, включающую нуклеотидную последовательность, имеющую делецию, замену, инсерцию или добавление одного нуклеотида или большего количества нуклеотидов по сравнению с нуклеотидной последовательностью 8Ε^ П) N0: 26, при этом указанная ДНК кодирует полипептид, обладающий функцией, эквивалентной функции полипептида, кодируемого ДНК (1); или (3) ДНК, которая гибридизуется с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 8Ε^ П) N0: 26, в жестких условиях, при этом указанная ДНК кодирует полипептид, обладающий функцией, эквивалентной функции полипептида, кодируемого ДНК (1).
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003298208 | 2003-08-22 | ||
JP2004000699 | 2004-01-05 | ||
JP2004115648 | 2004-04-09 | ||
JP2004222441 | 2004-07-29 | ||
PCT/JP2004/012238 WO2005019450A1 (ja) | 2003-08-22 | 2004-08-19 | 細胞傷害性リンパ球の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA200600459A1 EA200600459A1 (ru) | 2006-08-25 |
EA012520B1 true EA012520B1 (ru) | 2009-10-30 |
Family
ID=34222501
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200600459A EA012520B1 (ru) | 2003-08-22 | 2004-08-19 | Способ получения цитотоксических лимфоцитов |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8927273B2 (ru) |
EP (1) | EP1666589B1 (ru) |
JP (1) | JP4870432B2 (ru) |
KR (2) | KR101331746B1 (ru) |
CN (1) | CN1839202B (ru) |
AT (1) | ATE458046T1 (ru) |
AU (1) | AU2004267313B2 (ru) |
CA (1) | CA2536492C (ru) |
DE (1) | DE602004025591D1 (ru) |
EA (1) | EA012520B1 (ru) |
HK (1) | HK1095606A1 (ru) |
MX (1) | MXPA06002039A (ru) |
TW (1) | TW200517501A (ru) |
WO (1) | WO2005019450A1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2596505C1 (ru) * | 2015-07-02 | 2016-09-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский радиологический центр" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИРЦ" Минздрава России) | Способ лечения онкологических больных цитотоксическими лимфоцитами |
RU2652752C1 (ru) * | 2017-06-15 | 2018-04-28 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии" | Способ лечения бронхиальной астмы |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI334442B (en) | 2002-03-25 | 2010-12-11 | Takara Bio Inc | Process for producing cytotoxic lymphocyte |
EA012520B1 (ru) | 2003-08-22 | 2009-10-30 | Такара Био Инк. | Способ получения цитотоксических лимфоцитов |
EP1814580B1 (en) | 2004-11-24 | 2016-08-10 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods of using il-21 for adoptive immunotherapy and identification of tumor antigens |
KR101279172B1 (ko) | 2005-08-17 | 2013-06-27 | 다카라 바이오 가부시키가이샤 | 림프구의 제조 방법 |
JP4741906B2 (ja) * | 2005-08-31 | 2011-08-10 | タカラバイオ株式会社 | リンパ球の製造方法 |
WO2007040105A1 (ja) | 2005-09-30 | 2007-04-12 | Takara Bio Inc. | T細胞集団の製造方法 |
KR20090024782A (ko) | 2006-06-09 | 2009-03-09 | 다카라 바이오 가부시키가이샤 | 림프구의 제조 방법 |
US20110158954A1 (en) * | 2007-03-09 | 2011-06-30 | Mitsuko Ideno | Method for producing gamma delta t cell population |
WO2008143014A1 (ja) * | 2007-05-11 | 2008-11-27 | Takara Bio Inc. | がん治療剤 |
US20110027242A1 (en) * | 2008-03-27 | 2011-02-03 | Takara Bio Inc. | Method for production of transfected cell |
CN102656263A (zh) | 2009-08-25 | 2012-09-05 | 宝生物工程株式会社 | 用于在视黄酸存在下制备t细胞群的方法 |
RU2708199C2 (ru) * | 2014-06-10 | 2019-12-04 | Полибайосепт Аб | Культуральная среда для клеточной иммунотерапии |
FR3026744B1 (fr) * | 2014-10-06 | 2024-04-19 | Hopitaux Paris Assist Publique | Methode de generation de progeniteurs de cellules t |
EP4053268A3 (en) * | 2017-01-20 | 2022-12-07 | Kyoto University | Method for producing cd8alpha+beta+cytotoxic t cells |
CN107099503A (zh) * | 2017-06-01 | 2017-08-29 | 溯源生命科技股份有限公司 | 具有高杀伤力的自然杀伤性细胞高效体外扩增培养方法 |
CN111655842B (zh) * | 2018-01-25 | 2023-10-20 | 宝生物工程株式会社 | 淋巴细胞生产方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003016511A1 (en) * | 2001-08-15 | 2003-02-27 | Takara Bio Inc. | Method of extended culture for antigen-specific cytotoxic t lumphocytes |
Family Cites Families (56)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8516421D0 (en) * | 1985-06-28 | 1985-07-31 | Biotechnology Interface Ltd | Fibronectins |
EP0287652B1 (en) * | 1986-10-20 | 1994-01-12 | Life Technologies Inc. | Serum-free medium for the proliferation of lymphokine-activated killer cells |
US5019646A (en) | 1987-08-25 | 1991-05-28 | Regents Of The University Of Minnesota | Polypeptides with fibronectin activity |
JP2561131B2 (ja) | 1988-06-30 | 1996-12-04 | 寳酒造株式会社 | 細胞接着活性ポリペプチド |
GB8909916D0 (en) * | 1989-04-29 | 1989-06-14 | Delta Biotechnology Ltd | Polypeptides |
US5198423A (en) | 1989-05-26 | 1993-03-30 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Functional polypeptide containing a cell binding domain and a heparin binding domain of fibronectin |
GR1001034B (el) | 1989-07-21 | 1993-03-31 | Ortho Pharma Corp | Μεθοδος διεγερσης του πολλαπλασιασμου λεμφοκυτταρων περιφερειακου αιματος. |
US5188959A (en) * | 1989-09-28 | 1993-02-23 | Trustees Of Tufts College | Extracellular matrix protein adherent t cells |
JP3104178B2 (ja) | 1990-03-30 | 2000-10-30 | 寶酒造株式会社 | 機能性ポリペプチド |
JPH04108377A (ja) * | 1990-08-27 | 1992-04-09 | Ube Nitto Kasei Co Ltd | 細胞培養用基材 |
JPH04297494A (ja) | 1991-03-26 | 1992-10-21 | Fuji Photo Film Co Ltd | ペプチド誘導体とその用途 |
JP2729712B2 (ja) | 1991-04-23 | 1998-03-18 | 寳酒造株式会社 | 機能性ポリペプチド |
JPH07102131B2 (ja) | 1991-07-15 | 1995-11-08 | 日本石油株式会社 | ヒトリンパ球の癌細胞に対する傷害活性を高める方法 |
JPH06172203A (ja) | 1992-12-02 | 1994-06-21 | Takara Shuzo Co Ltd | フィブロネクチンレセプター産生異常細胞抑制剤 |
JPH06306096A (ja) | 1993-02-26 | 1994-11-01 | Fuji Photo Film Co Ltd | ペプチド誘導体及びその用途 |
US5405772A (en) * | 1993-06-18 | 1995-04-11 | Amgen Inc. | Medium for long-term proliferation and development of cells |
GB9315810D0 (en) | 1993-07-30 | 1993-09-15 | Univ London | Stabilised materials |
DE4336399A1 (de) | 1993-10-26 | 1995-04-27 | Augustinus Dr Med Bader | Verfahren zur Verbesserung der Matrixbedingungen bipolar adhärierter Hepatozyten und zur Herstellung eines entsprechend konfigurierten Zellkulturkits |
US6821778B1 (en) | 1993-12-01 | 2004-11-23 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Methods for using dendritic cells to activate gamma/delta-T cell receptor-positive T cells |
DE4412794A1 (de) | 1994-04-14 | 1995-12-14 | Univ Ludwigs Albert | Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen, so erhaltene Zellen und Behälter zur Durchführung dieses Verfahrens |
GB9413029D0 (en) | 1994-06-29 | 1994-08-17 | Common Services Agency | Stem cell immobilisation |
US5827642A (en) | 1994-08-31 | 1998-10-27 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes |
DE69518437T2 (de) | 1994-11-29 | 2001-02-08 | Takara Shuzo Co | Verfahren zur herstellung transformierter zellen |
CA2206449A1 (en) | 1994-12-01 | 1996-06-06 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | In vitro t-lymphopoiesis system |
US7067318B2 (en) | 1995-06-07 | 2006-06-27 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods for transfecting T cells |
US6692964B1 (en) | 1995-05-04 | 2004-02-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Methods for transfecting T cells |
ATE292689T1 (de) | 1995-05-04 | 2005-04-15 | Us Navy | Verbesserte verfahren zur transfektion der t- zellen |
DE19624887A1 (de) | 1995-06-21 | 1997-01-02 | Fraunhofer Ges Forschung | Elektrochemisches Festelektrolyt-Zellsystem |
JPH0925299A (ja) | 1995-07-13 | 1997-01-28 | Sumitomo Electric Ind Ltd | Cd44リガンド |
WO1997005239A1 (en) | 1995-07-25 | 1997-02-13 | Celltherapy, Inc. | Autologous immune cell therapy: cell compositions, methods and applications to treatment of human disease |
DE19537494C2 (de) | 1995-09-25 | 1997-10-02 | Desitin Arzneimittel Gmbh | Kreatin zum Schutz von neuralem Gewebe |
AU720359B2 (en) | 1995-09-29 | 2000-06-01 | Indiana University Research And Technology Corporation | Methods for enhanced virus-mediated DNA transfer using molecules with virus- and cell-binding domains |
JP3343357B2 (ja) | 1995-11-13 | 2002-11-11 | 寳酒造株式会社 | レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入方法 |
US6734014B1 (en) | 1996-02-08 | 2004-05-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Methods and compositions for transforming dendritic cells and activating T cells |
US6316257B1 (en) | 1996-03-04 | 2001-11-13 | Targeted Genetics Corporation | Modified rapid expansion methods (“modified-REM”) for in vitro propagation of T lymphocytes |
CA2247131A1 (en) | 1996-03-04 | 1997-09-12 | Targeted Genetics Corporation | Modified rapid expansion methods ("modified-rem") for in vitro propagation of t lymphocytes |
JPH1029952A (ja) | 1996-07-16 | 1998-02-03 | Takara Shuzo Co Ltd | ヒト免疫不全ウイルス感染の制御用組成物および制御方法 |
EP0929664A1 (en) | 1996-09-23 | 1999-07-21 | Ontogeny, Inc. | Hematopoietic stem cells and methods for generating such cells |
GB9625175D0 (en) * | 1996-12-04 | 1997-01-22 | Medi Cult As | Serum-free cell culture media |
CA2278189A1 (en) | 1997-01-31 | 1998-08-06 | Epimmune, Inc. | Peptides and peptide-loaded antigen presenting cells for the activation of ctl |
TWI239352B (en) | 1997-07-23 | 2005-09-11 | Takara Bio Inc | Gene transfer method with the use of serum-free medium |
AU1865899A (en) | 1997-12-24 | 1999-07-19 | Resolution Pharmaceuticals Inc. | Peptide chelators that predominately form a single stereoisomeric species upon coordination to a metal center |
JP2002507387A (ja) | 1997-12-24 | 2002-03-12 | コリクサ コーポレイション | 乳癌の免疫療法および診断のための化合物ならびにそれらの使用のための方法 |
WO2000009168A1 (en) | 1998-08-11 | 2000-02-24 | The United States Of America, Represented By Department Of Health And Human Services | A method of transducing mammalian cells, and products related thereto |
KR100674140B1 (ko) | 1999-03-23 | 2007-01-26 | 다카라 바이오 가부시키가이샤 | 유전자 치료제 |
US6797514B2 (en) * | 2000-02-24 | 2004-09-28 | Xcyte Therapies, Inc. | Simultaneous stimulation and concentration of cells |
EP1257632B1 (en) | 2000-02-24 | 2007-09-12 | Xcyte Therapies, Inc. | Simultaneous stimulation and concentration of cells |
JP3904374B2 (ja) | 2000-02-29 | 2007-04-11 | 独立行政法人科学技術振興機構 | キラー活性を増強したリンパ球 |
CN1222612C (zh) * | 2000-08-16 | 2005-10-12 | 宝生物工程株式会社 | 抗原特异细胞毒性t细胞的扩大培养方法 |
KR20040048379A (ko) * | 2001-06-01 | 2004-06-09 | 싸이트 테라피스 인코포레이티드 | T 세포 유도된 조직 복구 및 재생 |
JP4759890B2 (ja) | 2001-09-12 | 2011-08-31 | 大日本印刷株式会社 | パール調印刷物の印刷濃度管理方法 |
US7745140B2 (en) * | 2002-01-03 | 2010-06-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool |
TWI334442B (en) | 2002-03-25 | 2010-12-11 | Takara Bio Inc | Process for producing cytotoxic lymphocyte |
WO2004018667A1 (ja) | 2002-08-26 | 2004-03-04 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | ペプチド及びこれを含む医薬 |
EA012520B1 (ru) | 2003-08-22 | 2009-10-30 | Такара Био Инк. | Способ получения цитотоксических лимфоцитов |
JP4297494B2 (ja) | 2003-11-06 | 2009-07-15 | タイヨーエレック株式会社 | 組合せ式遊技機 |
-
2004
- 2004-08-19 EA EA200600459A patent/EA012520B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-08-19 DE DE602004025591T patent/DE602004025591D1/de active Active
- 2004-08-19 JP JP2005513357A patent/JP4870432B2/ja active Active
- 2004-08-19 WO PCT/JP2004/012238 patent/WO2005019450A1/ja active Application Filing
- 2004-08-19 CN CN2004800241727A patent/CN1839202B/zh active Active
- 2004-08-19 KR KR1020127008838A patent/KR101331746B1/ko active IP Right Grant
- 2004-08-19 AT AT04772194T patent/ATE458046T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-08-19 MX MXPA06002039A patent/MXPA06002039A/es active IP Right Grant
- 2004-08-19 EP EP04772194A patent/EP1666589B1/en active Active
- 2004-08-19 KR KR1020067003419A patent/KR20060039940A/ko not_active Application Discontinuation
- 2004-08-19 CA CA2536492A patent/CA2536492C/en active Active
- 2004-08-19 US US10/568,745 patent/US8927273B2/en active Active
- 2004-08-19 AU AU2004267313A patent/AU2004267313B2/en not_active Ceased
- 2004-08-20 TW TW093125347A patent/TW200517501A/zh unknown
-
2007
- 2007-03-16 HK HK07102871.3A patent/HK1095606A1/xx unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003016511A1 (en) * | 2001-08-15 | 2003-02-27 | Takara Bio Inc. | Method of extended culture for antigen-specific cytotoxic t lumphocytes |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Cell Immunol., vol. 135, No.1, pages 105 to 117 (1991) * |
Eur. J. Immunol., vol. 21, pages 1559 to 1562 (1991) * |
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 80, No. 16, pages 3218 to 3222 (1983) * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2596505C1 (ru) * | 2015-07-02 | 2016-09-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский радиологический центр" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИРЦ" Минздрава России) | Способ лечения онкологических больных цитотоксическими лимфоцитами |
RU2652752C1 (ru) * | 2017-06-15 | 2018-04-28 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии" | Способ лечения бронхиальной астмы |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1666589A4 (en) | 2006-10-04 |
EP1666589A1 (en) | 2006-06-07 |
US8927273B2 (en) | 2015-01-06 |
CA2536492C (en) | 2013-10-08 |
CA2536492A1 (en) | 2005-03-03 |
DE602004025591D1 (de) | 2010-04-01 |
TW200517501A (en) | 2005-06-01 |
HK1095606A1 (en) | 2007-05-11 |
KR101331746B1 (ko) | 2013-11-20 |
CN1839202A (zh) | 2006-09-27 |
ATE458046T1 (de) | 2010-03-15 |
US20090221077A1 (en) | 2009-09-03 |
MXPA06002039A (es) | 2006-05-25 |
AU2004267313B2 (en) | 2009-09-24 |
JPWO2005019450A1 (ja) | 2006-10-19 |
KR20120051089A (ko) | 2012-05-21 |
JP4870432B2 (ja) | 2012-02-08 |
CN1839202B (zh) | 2012-07-18 |
AU2004267313A1 (en) | 2005-03-03 |
EP1666589B1 (en) | 2010-02-17 |
EA200600459A1 (ru) | 2006-08-25 |
KR20060039940A (ko) | 2006-05-09 |
WO2005019450A1 (ja) | 2005-03-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5156382B2 (ja) | T細胞集団の製造方法 | |
KR101279172B1 (ko) | 림프구의 제조 방법 | |
EA012520B1 (ru) | Способ получения цитотоксических лимфоцитов | |
CN105378063B (zh) | 红细胞的产生与用途 | |
EA010434B1 (ru) | Способ получения цитотоксических лимфоцитов | |
JP5805089B2 (ja) | 細胞集団の製造方法 | |
CN101824400B (zh) | 一种放大增殖抗原特异性t细胞的方法 | |
CN110157686B (zh) | 一种免疫检查点激活免疫共刺激的复制型溶瘤腺病毒及其构建方法和应用 | |
CN105950662B (zh) | 一种靶向cd22的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用 | |
Sabado et al. | Dendritic cell vaccines | |
JP4741906B2 (ja) | リンパ球の製造方法 | |
CN110157674A (zh) | 一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用 | |
EP3999080B1 (en) | P21 expressing monocytes for cancer cell therapy | |
CN103495158B (zh) | 中国人群hla特异慢粒白血病表位疫苗 | |
CN117903264A (zh) | 新冠病毒SARS-CoV-2 HLA-A2限制性表位肽及应用 | |
CN117820493A (zh) | 表达膜结合型il-15融合蛋白的工程化til及其应用 | |
CN117402261A (zh) | 一种基于重组腺病毒的car-nk细胞制备方法及其应用 | |
JP2010099022A (ja) | リンパ球の製造方法 | |
JP2010063455A (ja) | リンパ球の製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |