JPH0925299A - Ｃｄ４４リガンド - Google Patents
Ｃｄ４４リガンドInfo
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- JPH0925299A JPH0925299A JP20047995A JP20047995A JPH0925299A JP H0925299 A JPH0925299 A JP H0925299A JP 20047995 A JP20047995 A JP 20047995A JP 20047995 A JP20047995 A JP 20047995A JP H0925299 A JPH0925299 A JP H0925299A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 癌の転移やリンパ球のホーミングに重要な役
割を担う細胞表面タンパク質ＣＤ４４のリガンドであっ
て、ヒアルロン酸ではない新規なＣＤ４４リガンド、そ
の抗体、その製造方法、それを用いたＣＤ４４検出法を
提供する。 【解決手段】 （１）分子量約６０万の糖タンパク質
（プロテオグリカン）、（２）タンパク質部分（コアタ
ンパク質）の分子量約１．８万〜約２．２万、（３）糖
鎖がコンドロイチン４硫酸であり、（４）アミノ酸配列
中にセリン−グリシン繰り返し構造を持ち、（５）細胞
障害性Ｔ細胞をそれが持つＣＤ４４を介して活性化で
き、（６）ヒアルロン酸との結合部位とは異なる部位で
ＣＤ４４と結合するＣＤ４４リガンド。セルグリシン産
生細胞の培養上清中から陰イオン交換クロマトグラフィ
ーとゲル濾過を繰り返し、最終的にハイドロキシアパタ
イトカラムで精製する前記ＣＤ４４リガンドの製造方
法、それに対する抗体、そのコアタンパク質とそのコア
タンパク質に対する抗体、前記ＣＤ４４リガンドを蛍光
色素、酵素または放射性同位元素で標識して使用するＣ
Ｄ４４発現細胞または組織の検出法。
割を担う細胞表面タンパク質ＣＤ４４のリガンドであっ
て、ヒアルロン酸ではない新規なＣＤ４４リガンド、そ
の抗体、その製造方法、それを用いたＣＤ４４検出法を
提供する。 【解決手段】 （１）分子量約６０万の糖タンパク質
（プロテオグリカン）、（２）タンパク質部分（コアタ
ンパク質）の分子量約１．８万〜約２．２万、（３）糖
鎖がコンドロイチン４硫酸であり、（４）アミノ酸配列
中にセリン−グリシン繰り返し構造を持ち、（５）細胞
障害性Ｔ細胞をそれが持つＣＤ４４を介して活性化で
き、（６）ヒアルロン酸との結合部位とは異なる部位で
ＣＤ４４と結合するＣＤ４４リガンド。セルグリシン産
生細胞の培養上清中から陰イオン交換クロマトグラフィ
ーとゲル濾過を繰り返し、最終的にハイドロキシアパタ
イトカラムで精製する前記ＣＤ４４リガンドの製造方
法、それに対する抗体、そのコアタンパク質とそのコア
タンパク質に対する抗体、前記ＣＤ４４リガンドを蛍光
色素、酵素または放射性同位元素で標識して使用するＣ
Ｄ４４発現細胞または組織の検出法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＣＤ４４リガンド
に関し、さらに詳しくは、癌の転移やリンパ球のホーミ
ングに関し重要な役割を担う細胞表面タンパク質ＣＤ４
４のリガンドであって、ヒアルロン酸ではない新規なＣ
Ｄ４４リガンド、その抗体、ＣＤ４４リガンドの製造方
法、及び該ＣＤ４４リガンドを用いたＣＤ４４検出法に
関する。
に関し、さらに詳しくは、癌の転移やリンパ球のホーミ
ングに関し重要な役割を担う細胞表面タンパク質ＣＤ４
４のリガンドであって、ヒアルロン酸ではない新規なＣ
Ｄ４４リガンド、その抗体、ＣＤ４４リガンドの製造方
法、及び該ＣＤ４４リガンドを用いたＣＤ４４検出法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】ＣＤ４４（ＣＤ４４分子）は、Ｐｇｐ−
１、Ｈｅｒｍｅｓ抗原、ＥＣＭＲ ＩＩＩまたはＩｎ
（Ｌｕ）−ｒｅｌａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ等の名前で
知られている膜貫通型の糖タンパク質である。ＣＤ４４
の分子構造は、Ｎ末端の軟骨リンクタンパク質に相同性
のある部分、コンドロイチン硫酸が付加される部分（以
上の２つの部分が細胞外部分）、膜貫通部位、及び細胞
内部分に大別される。ＣＤ４４は、白血球、赤血球、線
維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞などの広範な細胞に
発現が認められている。
１、Ｈｅｒｍｅｓ抗原、ＥＣＭＲ ＩＩＩまたはＩｎ
（Ｌｕ）−ｒｅｌａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ等の名前で
知られている膜貫通型の糖タンパク質である。ＣＤ４４
の分子構造は、Ｎ末端の軟骨リンクタンパク質に相同性
のある部分、コンドロイチン硫酸が付加される部分（以
上の２つの部分が細胞外部分）、膜貫通部位、及び細胞
内部分に大別される。ＣＤ４４は、白血球、赤血球、線
維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞などの広範な細胞に
発現が認められている。
【０００３】ＣＤ４４の機能は、極めて多彩である。例
えば、間質細胞上のＣＤ４４は、ヒアルロン酸を結合
し、その周囲にプロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｂｌｙ
ｃａｎ）を集めることによって、マトリックスを構築す
ることが示唆されている。また、リンパ球系の細胞で
は、ＣＤ４４が細胞内情報伝達物質として働いている。
その例としては、リンパ球系細胞表面のＣＤ４４分子に
刺激を与えると、同種細胞凝集が誘導される。
えば、間質細胞上のＣＤ４４は、ヒアルロン酸を結合
し、その周囲にプロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｂｌｙ
ｃａｎ）を集めることによって、マトリックスを構築す
ることが示唆されている。また、リンパ球系の細胞で
は、ＣＤ４４が細胞内情報伝達物質として働いている。
その例としては、リンパ球系細胞表面のＣＤ４４分子に
刺激を与えると、同種細胞凝集が誘導される。
【０００４】細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）においては、
ＣＤ４４からの刺激は、グランザイムの放出を誘導し、
ＣＴＬ活性を上昇させる。リンパ球−血管内皮細胞の反
応では、ＣＤ４４は、リンパ球がそれぞれに特定のリン
パ組織に集まる（ｈｏｍｉｎｇ）ときの接着を担う、リ
ンパ球表面分子であるホーミングレセプター（ｈｏｍｉ
ｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であると考えられている。ま
た、ＣＤ４４には、ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉ
ｃｉｎｇにより、多数のアイソフォームが存在するが、
ある種のアイソフォームでは、癌細胞が転移する際に出
現することが確かめられている。このように、ＣＤ４４
は、リンパ球の増殖、活性化などに重要な情報伝達分子
であること、癌の転移にも直接関与し得る接着分子であ
ることが知られている。
ＣＤ４４からの刺激は、グランザイムの放出を誘導し、
ＣＴＬ活性を上昇させる。リンパ球−血管内皮細胞の反
応では、ＣＤ４４は、リンパ球がそれぞれに特定のリン
パ組織に集まる（ｈｏｍｉｎｇ）ときの接着を担う、リ
ンパ球表面分子であるホーミングレセプター（ｈｏｍｉ
ｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であると考えられている。ま
た、ＣＤ４４には、ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉ
ｃｉｎｇにより、多数のアイソフォームが存在するが、
ある種のアイソフォームでは、癌細胞が転移する際に出
現することが確かめられている。このように、ＣＤ４４
は、リンパ球の増殖、活性化などに重要な情報伝達分子
であること、癌の転移にも直接関与し得る接着分子であ
ることが知られている。
【０００５】しかしながら、ＣＤ４４のリンパ球ホーミ
ングレセプターとしての機能には、いまだ不明な点が多
い。これを調べるには、ＣＤ４４の機能調節機構の解明
が必要である。そのために、ＣＤ４４が関与する各種現
象において、ＣＤ４４が認識するリガンドが何であるか
についての探究が不可欠となっており、近年、その検索
に関する研究が行われている。これまでにヒアルロン酸
（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、コラーゲン、及
びフィブロネクチンがＣＤ４４リガンドとして知られて
いる。ヒアルロン酸は、ＣＤ４４のＮ末端の軟骨リンク
タンパク質に相同性のある部分でＣＤ４４と結合する。
ングレセプターとしての機能には、いまだ不明な点が多
い。これを調べるには、ＣＤ４４の機能調節機構の解明
が必要である。そのために、ＣＤ４４が関与する各種現
象において、ＣＤ４４が認識するリガンドが何であるか
についての探究が不可欠となっており、近年、その検索
に関する研究が行われている。これまでにヒアルロン酸
（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、コラーゲン、及
びフィブロネクチンがＣＤ４４リガンドとして知られて
いる。ヒアルロン酸は、ＣＤ４４のＮ末端の軟骨リンク
タンパク質に相同性のある部分でＣＤ４４と結合する。
【０００６】末梢リンパ球をＰＭＡなどで刺激すると、
速やかにヒアルロン酸と結合するようになる。一方、前
述のホーミングレセプターとしてのＣＤ４４が認識する
リガンドは、ヒアルロン酸を分解するヒアルロニダーゼ
処理を行った後も、ＣＤ４４と強い結合を示す。この結
果は、リンパ球ホーミングレセプターとしてのヒアルロ
ン酸以外の新しいＣＤ４４リガンドが存在することを示
唆している。また、前述のようにＣＤ４４には多数のア
イソフォームが存在し、アイソフォーム特異なリガンド
の存在も推定することができる。これらのＣＤ４４の未
知のリガンドを得ることができるならば、免疫学や癌の
基礎研究の試薬として有効である。さらに、癌の予防薬
として使用できる可能性もある。
速やかにヒアルロン酸と結合するようになる。一方、前
述のホーミングレセプターとしてのＣＤ４４が認識する
リガンドは、ヒアルロン酸を分解するヒアルロニダーゼ
処理を行った後も、ＣＤ４４と強い結合を示す。この結
果は、リンパ球ホーミングレセプターとしてのヒアルロ
ン酸以外の新しいＣＤ４４リガンドが存在することを示
唆している。また、前述のようにＣＤ４４には多数のア
イソフォームが存在し、アイソフォーム特異なリガンド
の存在も推定することができる。これらのＣＤ４４の未
知のリガンドを得ることができるならば、免疫学や癌の
基礎研究の試薬として有効である。さらに、癌の予防薬
として使用できる可能性もある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、癌の
転移やリンパ球のホーミングに関し重要な役割を担う細
胞表面タンパク質ＣＤ４４のリガンドであって、ヒアル
ロン酸ではない新規なＣＤ４４リガンドを提供すること
にある。本発明の他の目的は、このような新規なＣＤ４
４リガンドの抗体、該ＣＤ４４リガンドの製造方法、及
び該ＣＤ４４リガンドを用いたＣＤ４４検出法を提供す
ることにある。さらに、ＣＤ４４リガンドに対する抗体
を用いれば、ＣＤ４４リガンドを発現している組織等が
あきらかになるとともに、リンパ球ホーミングの解析に
有用である。また、癌においては、抗体がＣＤ４４リガ
ンドをブロックしておくことで癌の予防や転移の抑制に
もかかわってくる。本発明者らは、従来から知られてい
るヒアルロン酸、ファイブロネクチン、及びコラーゲン
以外に新しいＣＤ４４のリガンドがあるのではと考え、
鋭意研究を行った結果、新規なＣＤ４４リガンドを見い
出した。
転移やリンパ球のホーミングに関し重要な役割を担う細
胞表面タンパク質ＣＤ４４のリガンドであって、ヒアル
ロン酸ではない新規なＣＤ４４リガンドを提供すること
にある。本発明の他の目的は、このような新規なＣＤ４
４リガンドの抗体、該ＣＤ４４リガンドの製造方法、及
び該ＣＤ４４リガンドを用いたＣＤ４４検出法を提供す
ることにある。さらに、ＣＤ４４リガンドに対する抗体
を用いれば、ＣＤ４４リガンドを発現している組織等が
あきらかになるとともに、リンパ球ホーミングの解析に
有用である。また、癌においては、抗体がＣＤ４４リガ
ンドをブロックしておくことで癌の予防や転移の抑制に
もかかわってくる。本発明者らは、従来から知られてい
るヒアルロン酸、ファイブロネクチン、及びコラーゲン
以外に新しいＣＤ４４のリガンドがあるのではと考え、
鋭意研究を行った結果、新規なＣＤ４４リガンドを見い
出した。
【０００８】すなわち、ＣＤ４４分子を発現していない
細胞にＣＤ４４遺伝子を導入し、ＣＤ４４を介した細胞
間接着を誘導できるかどうか検討した。そして、細胞間
接着を誘導できた細胞において、ヒアルロニダーゼ処
理、ファイブロネチン、コラーゲン添加等の処理をして
も、接着が影響されない系を構築し、その細胞の培養上
清及び細胞の表面分子から、ＣＤ４４と結合する分子を
抽出単離することにより新しいＣＤ４４リガンド分子を
得た。この新規なＣＤ４４リガンドは、セリン−グリシ
ンの繰り返し構造を持つセルグリシンにコンドロイチン
４硫酸が多数結合した構造のプロテオグリカンである。
本発明は、これらの知見に基づいて完成するに至ったも
のである。
細胞にＣＤ４４遺伝子を導入し、ＣＤ４４を介した細胞
間接着を誘導できるかどうか検討した。そして、細胞間
接着を誘導できた細胞において、ヒアルロニダーゼ処
理、ファイブロネチン、コラーゲン添加等の処理をして
も、接着が影響されない系を構築し、その細胞の培養上
清及び細胞の表面分子から、ＣＤ４４と結合する分子を
抽出単離することにより新しいＣＤ４４リガンド分子を
得た。この新規なＣＤ４４リガンドは、セリン−グリシ
ンの繰り返し構造を持つセルグリシンにコンドロイチン
４硫酸が多数結合した構造のプロテオグリカンである。
本発明は、これらの知見に基づいて完成するに至ったも
のである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、（１）
分子量約６０万の糖タンパク質（プロテオグリカン）で
あり、（２）タンパク質部分（コアタンパク質）の分子
量が約１．８万〜約２．２万で、（３）糖鎖がコンドロ
イチン４硫酸であり、（４）タンパク質のアミノ酸配列
中にセリン−グリシンの繰り返し構造を持ち、（５）細
胞障害性Ｔ細胞を該Ｔ細胞が持つＣＤ４４を介して活性
化することができ、（６）ＣＤ４４とヒアルロン酸との
結合部位とは異なる部位でＣＤ４４と結合することがで
きることを特徴とするＣＤ４４リガンドが提供される。
分子量約６０万の糖タンパク質（プロテオグリカン）で
あり、（２）タンパク質部分（コアタンパク質）の分子
量が約１．８万〜約２．２万で、（３）糖鎖がコンドロ
イチン４硫酸であり、（４）タンパク質のアミノ酸配列
中にセリン−グリシンの繰り返し構造を持ち、（５）細
胞障害性Ｔ細胞を該Ｔ細胞が持つＣＤ４４を介して活性
化することができ、（６）ＣＤ４４とヒアルロン酸との
結合部位とは異なる部位でＣＤ４４と結合することがで
きることを特徴とするＣＤ４４リガンドが提供される。
【００１０】また、本発明によれば、セルグリシン産生
細胞の培養上清中から陰イオン交換クロマトグラフィー
とゲル濾過を繰り返し行い、最終的にハイドロキシアパ
タイトカラムで精製することを特徴とする前記ＣＤ４４
リガンドの製造方法が提供される。さらに、本発明によ
れば、ＣＤ４４リガンドの抗体、前記ＣＤ４４リガンド
を蛍光色素、酵素または放射性同位元素で標識し、これ
をＣＤ４４発現細胞または組織の検出に使用することを
特徴とするＣＤ４４検出法が提供される。この検出法で
は、前記ＣＤ４４リガンドに、まずビオチンを結合さ
せ、得られた結合体をＣＤ４４発現細胞または組織と反
応させた後、蛍光色素、酵素または放射性同位元素とア
ビシンまたはストレプトアビジンとの結合体と反応させ
ることが好ましい。
細胞の培養上清中から陰イオン交換クロマトグラフィー
とゲル濾過を繰り返し行い、最終的にハイドロキシアパ
タイトカラムで精製することを特徴とする前記ＣＤ４４
リガンドの製造方法が提供される。さらに、本発明によ
れば、ＣＤ４４リガンドの抗体、前記ＣＤ４４リガンド
を蛍光色素、酵素または放射性同位元素で標識し、これ
をＣＤ４４発現細胞または組織の検出に使用することを
特徴とするＣＤ４４検出法が提供される。この検出法で
は、前記ＣＤ４４リガンドに、まずビオチンを結合さ
せ、得られた結合体をＣＤ４４発現細胞または組織と反
応させた後、蛍光色素、酵素または放射性同位元素とア
ビシンまたはストレプトアビジンとの結合体と反応させ
ることが好ましい。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳述する。
ＣＤ４４がどのような機構で調節を受けて、その機能が
発現するのかを調べるためにＣＤ４４陰性マウスＣＴＬ
Ｌ−２細胞を、ＣＤ４４遺伝子（マウスＣＤ４４ｃＤＮ
Ａ）を導入して、培養したところ、非常に強い細胞の凝
集が認められた。次に、この凝集がＣＤ４４遺伝子を細
胞に導入したことに起因するものであるか否かを調べる
ために、この系に抗ＣＤ４４抗体を共存させてＣＤ４４
が機能しないようにして培養実験を行ったところ、細胞
の凝集が完全に阻害された。したがって、この凝集は、
ＣＤ４４を介した現象であると推定された。一方、この
ときのＣＤ４４と結合している分子が何であるかについ
て調べるために、ＣＤ４４遺伝子を導入したＣＴＬＬ−
２細胞（トランスフェクタント）にヒアルロン酸分解酵
素（ヒアルロニダーゼ）を作用させたが、細胞の凝集
は、まったく影響を受けなかった。したがって、細胞の
凝集は、ヒアルロン酸とＣＤ４４との結合によるもので
はないことが判明した。
ＣＤ４４がどのような機構で調節を受けて、その機能が
発現するのかを調べるためにＣＤ４４陰性マウスＣＴＬ
Ｌ−２細胞を、ＣＤ４４遺伝子（マウスＣＤ４４ｃＤＮ
Ａ）を導入して、培養したところ、非常に強い細胞の凝
集が認められた。次に、この凝集がＣＤ４４遺伝子を細
胞に導入したことに起因するものであるか否かを調べる
ために、この系に抗ＣＤ４４抗体を共存させてＣＤ４４
が機能しないようにして培養実験を行ったところ、細胞
の凝集が完全に阻害された。したがって、この凝集は、
ＣＤ４４を介した現象であると推定された。一方、この
ときのＣＤ４４と結合している分子が何であるかについ
て調べるために、ＣＤ４４遺伝子を導入したＣＴＬＬ−
２細胞（トランスフェクタント）にヒアルロン酸分解酵
素（ヒアルロニダーゼ）を作用させたが、細胞の凝集
は、まったく影響を受けなかった。したがって、細胞の
凝集は、ヒアルロン酸とＣＤ４４との結合によるもので
はないことが判明した。
【００１２】このような実験結果から、ヒアルロン酸で
はないＣＤ４４リガンドが関与していることが明らかに
なった。ＣＤ４４の細胞外領域と免疫グロブリンの定常
領域とを連結して作成した可溶性ＣＤ４４（ＣＤ４４−
Ｉｇ）をプローブとして、ＣＤ４４リガンドの検索を行
ったところ、ＣＴＬＬ−２及びトランスフェクタントの
細胞表面には、ＣＤ４４リガンドは検出されなかった。
そこで、ＣＴＬＬ−２及びトランスフェクタントを35Ｓ
−メチオニンで標識し、その培養上清を用いてＣＤ４４
−Ｉｇで免疫沈降を行ったところ、ＣＤ４４−Ｉｇに特
異的に免疫沈降される高分子量のタンパク質が認められ
た。これらの実験結果から、上記の培養上清にＣＤ４４
リガンドが存在することが明らかになった。
はないＣＤ４４リガンドが関与していることが明らかに
なった。ＣＤ４４の細胞外領域と免疫グロブリンの定常
領域とを連結して作成した可溶性ＣＤ４４（ＣＤ４４−
Ｉｇ）をプローブとして、ＣＤ４４リガンドの検索を行
ったところ、ＣＴＬＬ−２及びトランスフェクタントの
細胞表面には、ＣＤ４４リガンドは検出されなかった。
そこで、ＣＴＬＬ−２及びトランスフェクタントを35Ｓ
−メチオニンで標識し、その培養上清を用いてＣＤ４４
−Ｉｇで免疫沈降を行ったところ、ＣＤ４４−Ｉｇに特
異的に免疫沈降される高分子量のタンパク質が認められ
た。これらの実験結果から、上記の培養上清にＣＤ４４
リガンドが存在することが明らかになった。
【００１３】そこで、ＣＴＬＬ−２細胞の培養上清か
ら、ＣＤ４４と結合しうる物質の精製を試みた。具体的
には、ＣＴＬＬ−２細胞の培養上清から、４Ｍ尿素を含
む緩衝液を用いたイオン交換クロマトグラフィー、６Ｍ
グアニジンを含む０．１％ＣＨＡＰＳ緩衝液を用いたゲ
ル濾過、４Ｍ尿素を含む緩衝液を用いたハイドロキシア
パタイトクロマトグラフィーを用いて精製した。得られ
た精製品を種々の糖鎖切断酵素で処理したところ、コン
ドロイチナーゼ処理によりＣＤ４４を介した細胞の凝集
が完全に消失した。したがって、ＣＤ４４リガンドは、
糖鎖としてコンドロイチン４硫酸を持つ糖タンパク質
（プロテオグリカン）であることがわかった。その分子
量は、糖鎖のないコアタンパク質が約１８〜約２２ｋｄ
（約１．８万〜約２．２万）であり、糖鎖が付加されれ
ば約６００ｋｄ（約６０万）であることがＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ電気泳動によりわかった。
ら、ＣＤ４４と結合しうる物質の精製を試みた。具体的
には、ＣＴＬＬ−２細胞の培養上清から、４Ｍ尿素を含
む緩衝液を用いたイオン交換クロマトグラフィー、６Ｍ
グアニジンを含む０．１％ＣＨＡＰＳ緩衝液を用いたゲ
ル濾過、４Ｍ尿素を含む緩衝液を用いたハイドロキシア
パタイトクロマトグラフィーを用いて精製した。得られ
た精製品を種々の糖鎖切断酵素で処理したところ、コン
ドロイチナーゼ処理によりＣＤ４４を介した細胞の凝集
が完全に消失した。したがって、ＣＤ４４リガンドは、
糖鎖としてコンドロイチン４硫酸を持つ糖タンパク質
（プロテオグリカン）であることがわかった。その分子
量は、糖鎖のないコアタンパク質が約１８〜約２２ｋｄ
（約１．８万〜約２．２万）であり、糖鎖が付加されれ
ば約６００ｋｄ（約６０万）であることがＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ電気泳動によりわかった。
【００１４】ＣＤ４４リガンドのタンパク質部分につい
て、ペプチドシーケンサーで処理したところ、アミノ酸
分析の結果は、ＣＤ４４リガンドのコアタンパク質のＮ
末端は、ＤＤＹＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧであった。この
コアタンパク質は、セリン−グリシンの繰り返し構造か
らなるセルグリシン（ｓｅｒｇｌｙｃｉｎ）の一種であ
る。つまり、このＣＤ４４リガンドは、コンドロイチン
４硫酸の糖鎖がついたセルグリシンである。また、本発
明のＣＤ４４リガンドは、実施例４に示すように、ヒア
ルロン酸に比べ有意に細胞障害性Ｔ細胞のグランザイム
放出を増強し、該Ｔ細胞を活性化させるものである。こ
のことから、本発明のＣＤ４４リガンドは、ヒアルロン
酸とは異なる機能を媒介し得るＣＤ４４リガンドである
と言える。
て、ペプチドシーケンサーで処理したところ、アミノ酸
分析の結果は、ＣＤ４４リガンドのコアタンパク質のＮ
末端は、ＤＤＹＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧであった。この
コアタンパク質は、セリン−グリシンの繰り返し構造か
らなるセルグリシン（ｓｅｒｇｌｙｃｉｎ）の一種であ
る。つまり、このＣＤ４４リガンドは、コンドロイチン
４硫酸の糖鎖がついたセルグリシンである。また、本発
明のＣＤ４４リガンドは、実施例４に示すように、ヒア
ルロン酸に比べ有意に細胞障害性Ｔ細胞のグランザイム
放出を増強し、該Ｔ細胞を活性化させるものである。こ
のことから、本発明のＣＤ４４リガンドは、ヒアルロン
酸とは異なる機能を媒介し得るＣＤ４４リガンドである
と言える。
【００１５】後記の実施例の実験結果から明らかなよう
に、本発明のＣＤ４４リガンドは、（１）分子量約６０
万の糖タンパク質（プロテオグリカン）であり、（２）
タンパク質部分（コアタンパク質）の分子量が約１．８
万〜約２．２万であり、（３）糖鎖がコンドロイチン４
硫酸であり、（４）タンパク質のアミノ酸配列中にセリ
ン−グリシンの繰り返し構造を持ち、（５）細胞障害性
Ｔ細胞を該Ｔ細胞が持つＣＤ４４を介して活性化するこ
とができ、そして、（６）ＣＤ４４とヒアルロン酸との
結合部位とは異なる部位で結合する新規なＣＤ４４リガ
ンドである。
に、本発明のＣＤ４４リガンドは、（１）分子量約６０
万の糖タンパク質（プロテオグリカン）であり、（２）
タンパク質部分（コアタンパク質）の分子量が約１．８
万〜約２．２万であり、（３）糖鎖がコンドロイチン４
硫酸であり、（４）タンパク質のアミノ酸配列中にセリ
ン−グリシンの繰り返し構造を持ち、（５）細胞障害性
Ｔ細胞を該Ｔ細胞が持つＣＤ４４を介して活性化するこ
とができ、そして、（６）ＣＤ４４とヒアルロン酸との
結合部位とは異なる部位で結合する新規なＣＤ４４リガ
ンドである。
【００１６】本発明のＣＤ４４リガンドは、マウスＣＴ
Ｌ細胞株（ＣＴＬＬ−２）の培養上清中から陰イオン交
換クロマトグラフィーとゲル濾過を繰り返し行い、最終
的にハイドロキシアパタイトカラムで精製することによ
り精製品として得ることができる。本発明のＣＤ４４リ
ガンドを蛍光色素、酵素または放射性同位元素で標識す
れば、これをＣＤ４４発現細胞または組織の検出に使用
することができる。この場合、ＣＤ４４リガンドに、ま
ずビオチンを結合させ、得られた結合体をＣＤ４４発現
細胞または組織と反応させた後、蛍光色素、酵素または
放射性同位元素とアビシンまたはストレプトアビジンと
の結合体と反応させる方法が好ましい。
Ｌ細胞株（ＣＴＬＬ−２）の培養上清中から陰イオン交
換クロマトグラフィーとゲル濾過を繰り返し行い、最終
的にハイドロキシアパタイトカラムで精製することによ
り精製品として得ることができる。本発明のＣＤ４４リ
ガンドを蛍光色素、酵素または放射性同位元素で標識す
れば、これをＣＤ４４発現細胞または組織の検出に使用
することができる。この場合、ＣＤ４４リガンドに、ま
ずビオチンを結合させ、得られた結合体をＣＤ４４発現
細胞または組織と反応させた後、蛍光色素、酵素または
放射性同位元素とアビシンまたはストレプトアビジンと
の結合体と反応させる方法が好ましい。
【００１７】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明についてより
具体的に説明する。
具体的に説明する。
【００１８】［実施例１］ＣＤ４４リガンドの精製 （１）ＣＴＬＬ−２の大量培養 ＣＴＬＬ−２は、無血清培地ＥＸ−ｃｅｌｌ ３００Ｔ
Ｍ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）を用いて培養し
た。培養には、ＩＬ−２をＩｎＭ培養液中に加え、ソフ
トセルバック（積水化学製）６００ｍｌ用に１リットル
の培地を入れ、合計６リットル培養した。 （２）濃縮 細胞培養後、５０００ｇで２０分間遠心分離を行い、培
養上清を回収した。この培養上清を、Ｍｉｎｉｔａｎ
ＴＭ ｓｙｓｔｅｍ（分子量３０，０００カット、ミリ
ポア製）を用いて、４５０ｍｌに濃縮した。この濃縮液
を、８Ｍ尿素、４０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）と０．４
Ｍ ＮａＣｌ ４５０ｍｌにて２倍に希釈した。その
後、さらにＭｉｎｉｔａｎ ＴＭ ｓｙｓｔｅｍにて４
５０ｍｌに再濃縮した。 （３）イオン交換クロマトグラフィー 前記（２）で濃縮した液をイオン交換グロマトグラフィ
ーにて精製した。ＴＳＫＧ−ＤＥＡＥ（東ソ−製）のゲ
ルを用い、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で、ＮａＣｌの０．２
Ｍから１．０Ｍの直線グラジエントで精製した。緩衝液
は、４Ｍ尿素、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、０．２
Ｍ ＮａＣｌから１．０Ｍ ＮａＣｌで行った。０．５
ＭのＮａＣｌで溶出した画分を回収し、蒸留水で透析し
た。その後、セントリプレップー３０（アミコン製）に
て濃縮した。
Ｍ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）を用いて培養し
た。培養には、ＩＬ−２をＩｎＭ培養液中に加え、ソフ
トセルバック（積水化学製）６００ｍｌ用に１リットル
の培地を入れ、合計６リットル培養した。 （２）濃縮 細胞培養後、５０００ｇで２０分間遠心分離を行い、培
養上清を回収した。この培養上清を、Ｍｉｎｉｔａｎ
ＴＭ ｓｙｓｔｅｍ（分子量３０，０００カット、ミリ
ポア製）を用いて、４５０ｍｌに濃縮した。この濃縮液
を、８Ｍ尿素、４０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）と０．４
Ｍ ＮａＣｌ ４５０ｍｌにて２倍に希釈した。その
後、さらにＭｉｎｉｔａｎ ＴＭ ｓｙｓｔｅｍにて４
５０ｍｌに再濃縮した。 （３）イオン交換クロマトグラフィー 前記（２）で濃縮した液をイオン交換グロマトグラフィ
ーにて精製した。ＴＳＫＧ−ＤＥＡＥ（東ソ−製）のゲ
ルを用い、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で、ＮａＣｌの０．２
Ｍから１．０Ｍの直線グラジエントで精製した。緩衝液
は、４Ｍ尿素、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、０．２
Ｍ ＮａＣｌから１．０Ｍ ＮａＣｌで行った。０．５
ＭのＮａＣｌで溶出した画分を回収し、蒸留水で透析し
た。その後、セントリプレップー３０（アミコン製）に
て濃縮した。
【００１９】（４）ゲル濾過 前記（３）で精製し、濃縮した液を、６Ｍグアニジン、
２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、０．１％ＣＨＡＰＳ緩
衝液に置換後、ＴＳＫＧ−３０００カラムを用いて、
０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速にてゲル濾過した。その後、
ボイドボリュームのフラクションを回収した。これを蒸
留水で透析後、６Ｍグアニジン、２０ｍＭトリス（ｐＨ
８．０）、０．１％ＣＨＡＰＳ緩衝液で、ＴＳＫＧ−３
０００カラムで０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速にてゲル濾過
した。再びボイドのフラクションを回収後、１０ｍＭの
リン酸緩衝液にて透析した。 （５）ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー 前記（４）で回収した液をハイドロキシアパタイトカラ
ムでクロマトグラフィーを行った。非吸着の部分を回収
し、蒸留水にて透析後、４Ｍ尿素、２０ｍＭトリス（ｐ
Ｈ８．０）、０．２ＭＮａＮｌの液に置換した。 （６）イオン交換クロマトグラフィー 前記（５）で回収した液を再び（３）で実施した内容と
同様の操作を行った。０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出される
画分（フラクション）を回収後、蒸留水で透析し、凍結
乾燥した。こうして得られたＣＤ４４リガンドの収量
は、１．２ｍｇであった。
２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、０．１％ＣＨＡＰＳ緩
衝液に置換後、ＴＳＫＧ−３０００カラムを用いて、
０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速にてゲル濾過した。その後、
ボイドボリュームのフラクションを回収した。これを蒸
留水で透析後、６Ｍグアニジン、２０ｍＭトリス（ｐＨ
８．０）、０．１％ＣＨＡＰＳ緩衝液で、ＴＳＫＧ−３
０００カラムで０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速にてゲル濾過
した。再びボイドのフラクションを回収後、１０ｍＭの
リン酸緩衝液にて透析した。 （５）ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー 前記（４）で回収した液をハイドロキシアパタイトカラ
ムでクロマトグラフィーを行った。非吸着の部分を回収
し、蒸留水にて透析後、４Ｍ尿素、２０ｍＭトリス（ｐ
Ｈ８．０）、０．２ＭＮａＮｌの液に置換した。 （６）イオン交換クロマトグラフィー 前記（５）で回収した液を再び（３）で実施した内容と
同様の操作を行った。０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出される
画分（フラクション）を回収後、蒸留水で透析し、凍結
乾燥した。こうして得られたＣＤ４４リガンドの収量
は、１．２ｍｇであった。
【００２０】［実施例２］ＣＤ４４リガンドの同定 （１）アミノ酸分析 精製したＣＤ４４リガンドをコンドロイチナーゼＡＢＣ
２０μｇ／ｍｌで処理後、４７５Ａ−ガスフェイズ・プ
ロテインシーケンサー（ＡＢＩ製）にてＮ末端を調べ
た。その結果、ＣＤ４４リガンドのＮ末端がＤＤＹＧＳ
ＧＳＧＳＧＳＧＳＧであることがわかり、セルグリシン
の一種であることが同定された。 ＣＤ４４リガンドのＮ末端：Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（すなわち、Ｄ
ＤＹＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧ） （２）糖鎖の分析 精製したＣＤ４４リガンドを（１）と同様にコンドロイ
チナーゼＡＢＣ処理した後、ＨＰＬＣにてオリゴ糖の分
析を行った。その結果、コンドロイチン４硫酸であるこ
とがわかった。 （３）分子量の測定 精製したＣＤ４４リガンドを、酵素処理前後で、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。その結
果、ＣＤ４４リガンドは、分子量約６０万で、そのコア
タンパク質の分子量が約１８〜約２２ｋｄであることが
判明した。すなわち、得られたＣＤ４４リガンドは、分
子量約１．８〜約２．２万のコアタンパク質と糖鎖がコ
ンドロイチン４硫酸からなる分子量約６０万の糖タンパ
ク質（ただし、プロテオグリカン）であった。
２０μｇ／ｍｌで処理後、４７５Ａ−ガスフェイズ・プ
ロテインシーケンサー（ＡＢＩ製）にてＮ末端を調べ
た。その結果、ＣＤ４４リガンドのＮ末端がＤＤＹＧＳ
ＧＳＧＳＧＳＧＳＧであることがわかり、セルグリシン
の一種であることが同定された。 ＣＤ４４リガンドのＮ末端：Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（すなわち、Ｄ
ＤＹＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧ） （２）糖鎖の分析 精製したＣＤ４４リガンドを（１）と同様にコンドロイ
チナーゼＡＢＣ処理した後、ＨＰＬＣにてオリゴ糖の分
析を行った。その結果、コンドロイチン４硫酸であるこ
とがわかった。 （３）分子量の測定 精製したＣＤ４４リガンドを、酵素処理前後で、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。その結
果、ＣＤ４４リガンドは、分子量約６０万で、そのコア
タンパク質の分子量が約１８〜約２２ｋｄであることが
判明した。すなわち、得られたＣＤ４４リガンドは、分
子量約１．８〜約２．２万のコアタンパク質と糖鎖がコ
ンドロイチン４硫酸からなる分子量約６０万の糖タンパ
ク質（ただし、プロテオグリカン）であった。
【００２１】［実施例３］ＣＤ４４リガンドのＣＤ４４結合におけるコンドロイチ
ン４硫酸の重要性 ＣＤ４４リガンドを、コンドロイチナーゼＡＢＣ処理の
有無で、ＣＤ４４との反応性を調べた。精製したＣＤ４
４リガンド、該リガンドをコンドロイチナーゼＡＢＣ処
理した物及び該リガンドのコアタンパク質をそれぞれＣ
Ｄ４４を発現しているＢＷ５１４７の培養液中に添加し
たところ、精製したＣＤ４４リガンドを添加した場合に
のみ細胞の凝集が認められ、コンドロイチナーゼ処理物
では細胞の凝集が起こらなかった。また、標準品のコン
ドロイチン４硫酸のみでも、ＢＷ５１４７は凝集しな
い。したがって、コンドロイチン４硫酸がセルグリシン
のコアタンパク質に結合した立体構造が細胞の凝集のた
めに重要であることが判明した。
ン４硫酸の重要性 ＣＤ４４リガンドを、コンドロイチナーゼＡＢＣ処理の
有無で、ＣＤ４４との反応性を調べた。精製したＣＤ４
４リガンド、該リガンドをコンドロイチナーゼＡＢＣ処
理した物及び該リガンドのコアタンパク質をそれぞれＣ
Ｄ４４を発現しているＢＷ５１４７の培養液中に添加し
たところ、精製したＣＤ４４リガンドを添加した場合に
のみ細胞の凝集が認められ、コンドロイチナーゼ処理物
では細胞の凝集が起こらなかった。また、標準品のコン
ドロイチン４硫酸のみでも、ＢＷ５１４７は凝集しな
い。したがって、コンドロイチン４硫酸がセルグリシン
のコアタンパク質に結合した立体構造が細胞の凝集のた
めに重要であることが判明した。
【００２２】［実施例４］新しいＣＤ４４リガンドの細胞傷害性Ｔ細胞の活性化 細胞障害性Ｔ細胞２×１０5個を抗ＣＤ３抗体１０μｇ
／ｍｌでコートした。これを９６ｗｅｌｌ培養プレート
に入れ、そして、１０μｇ／ｍｌのヒアルロン酸と５０
μｇ／ｍｌのＣＤ４４リガンドを入れた培地１０％ＦＣ
Ｓ・ＲＰＭＩ１６４０ ２００μｌ／ｗｅｌｌにて培養
した。３７℃で３時間培養した後、培養上清２０μｌに
ついて、グランザイムの一種であるセリンエステラーゼ
の放出を調べた。また、対象として、ＣＤ４４リガンド
を入れず、ヒアルロン酸のみを加えた培地でも同様に培
養した。その結果、ＣＤ４４リガンドを加えることによ
り、セリンエステラーゼの放出が増強されることが認め
られた（表１）。したがって、ＣＤ４４リガンドが細胞
障害性Ｔ細胞を該Ｔ細胞が持つＣＤ４４を介して活性化
することができることがわかった。
／ｍｌでコートした。これを９６ｗｅｌｌ培養プレート
に入れ、そして、１０μｇ／ｍｌのヒアルロン酸と５０
μｇ／ｍｌのＣＤ４４リガンドを入れた培地１０％ＦＣ
Ｓ・ＲＰＭＩ１６４０ ２００μｌ／ｗｅｌｌにて培養
した。３７℃で３時間培養した後、培養上清２０μｌに
ついて、グランザイムの一種であるセリンエステラーゼ
の放出を調べた。また、対象として、ＣＤ４４リガンド
を入れず、ヒアルロン酸のみを加えた培地でも同様に培
養した。その結果、ＣＤ４４リガンドを加えることによ
り、セリンエステラーゼの放出が増強されることが認め
られた（表１）。したがって、ＣＤ４４リガンドが細胞
障害性Ｔ細胞を該Ｔ細胞が持つＣＤ４４を介して活性化
することができることがわかった。
【００２３】
【表１】 （＊１）放出量は、細胞中に含まれるセリンエステラー
ゼ全量を１００％とする。
ゼ全量を１００％とする。
【００２４】
【発明の効果】本発明の新しいＣＤ４４リガンドは、例
えば、免疫学や癌の基礎研究の試薬として有効である。
また、このＣＤ４４リガンドは、細胞障害性Ｔ細胞を活
性化することから、免疫増強剤としての期待がもてる。
さらには、ＣＤ４４が癌の転移に関わることから、新規
ＣＤ４４リガンドは、癌転移の予防薬としての有用性が
期待される。
えば、免疫学や癌の基礎研究の試薬として有効である。
また、このＣＤ４４リガンドは、細胞障害性Ｔ細胞を活
性化することから、免疫増強剤としての期待がもてる。
さらには、ＣＤ４４が癌の転移に関わることから、新規
ＣＤ４４リガンドは、癌転移の予防薬としての有用性が
期待される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (8)
- 【請求項１】 （１）分子量約６０万の糖タンパク質
（プロテオグリカン）であり、（２）タンパク質部分
（コアタンパク質）の分子量が約１．８万〜約２．２万
で、（３）糖鎖がコンドロイチン４硫酸であり、（４）
タンパク質のアミノ酸配列中にセリン−グリシンの繰り
返し構造を持ち、（５）細胞障害性Ｔ細胞を該Ｔ細胞が
持つＣＤ４４を介して活性化することができ、（６）Ｃ
Ｄ４４とヒアルロン酸との結合部位とは異なる部位でＣ
Ｄ４４と結合することを特徴とするＣＤ４４リガンド。 - 【請求項２】 セルグリシン産生細胞の培養上清中から
陰イオン交換クロマトグラフィーとゲル濾過を繰り返し
行い、最終的にハイドロキシアパタイトカラムで精製す
ることを特徴とする請求項１記載のＣＤ４４リガンドの
製造方法。 - 【請求項３】 細胞株がマウスＣＴＬ細胞株（ＣＴＬＬ
−２）であることを特徴とする請求項２記載のＣＤ４４
リガンド。 - 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
のＣＤ４４リガンドのコアタンパク質。 - 【請求項５】 請求項１記載のＣＤ４４リガンドに対す
る抗体。 - 【請求項６】 請求項４記載のＣＤ４４リガンドのコア
タンパク質に対する抗体。 - 【請求項７】 請求項１記載のＣＤ４４リガンドを蛍光
色素、酵素または放射性同位元素で標識し、これをＣＤ
４４発現細胞または組織の検出に使用することを特徴と
するＣＤ４４検出法。 - 【請求項８】 請求項１記載のＣＤ４４リガンドに、ま
ずビオチンを結合させ、得られた結合体をＣＤ４４発現
細胞または組織と反応させた後、蛍光色素、酵素または
放射性同位元素とアビシンまたはストレプトアビジンと
の結合体と反応させる請求項７記載のＣＤ４４検出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20047995A JPH0925299A (ja) | 1995-07-13 | 1995-07-13 | Ｃｄ４４リガンド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20047995A JPH0925299A (ja) | 1995-07-13 | 1995-07-13 | Ｃｄ４４リガンド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0925299A true JPH0925299A (ja) | 1997-01-28 |
Family
ID=16425005
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20047995A Pending JPH0925299A (ja) | 1995-07-13 | 1995-07-13 | Ｃｄ４４リガンド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0925299A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7910368B2 (en) | 2001-08-15 | 2011-03-22 | Takara Bio Inc. | Method of extended culture for antigen-specific cytotoxic lymphocytes |
| US8728811B2 (en) | 2002-03-25 | 2014-05-20 | Takara Bio Inc. | Process for producing cytotoxic lymphocyte |
| US8765469B2 (en) | 2005-08-17 | 2014-07-01 | Takara Bio Inc. | Method of producing lymphocytes |
| US8927273B2 (en) | 2003-08-22 | 2015-01-06 | Takara Bio Inc. | Process for producing cytotoxic lymphocytes |
-
1995
- 1995-07-13 JP JP20047995A patent/JPH0925299A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7910368B2 (en) | 2001-08-15 | 2011-03-22 | Takara Bio Inc. | Method of extended culture for antigen-specific cytotoxic lymphocytes |
| US8728811B2 (en) | 2002-03-25 | 2014-05-20 | Takara Bio Inc. | Process for producing cytotoxic lymphocyte |
| US8975070B2 (en) | 2002-03-25 | 2015-03-10 | Takara Bio Inc. | Process for producing cytotoxic lymphocyte |
| US8927273B2 (en) | 2003-08-22 | 2015-01-06 | Takara Bio Inc. | Process for producing cytotoxic lymphocytes |
| US8765469B2 (en) | 2005-08-17 | 2014-07-01 | Takara Bio Inc. | Method of producing lymphocytes |
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