JP3335629B2 - 蛋白質精製 - Google Patents

蛋白質精製

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は蛋白質精製の分野に関する。更に詳細には、
本発明は補体受容蛋白質の精製にクロマトグラフィーを
組み合わせて用いることに関する。
発明の背景 歴史的に、蛋白質精製法は精製される蛋白質および望
ましくない蛋白不純物間の分子の大きさ、電荷および溶
解度といった分子特性の違いに基づくものであった。こ
れらのパラメーターに基づく方法としては、サイズ排除
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
分画沈殿などが挙げられる。
サイズ排除クロマトグラフィー（あるいはゲル濾過又
はゲル透過クロマトグラフィーともいう）は移動相中の
高分子の固定相粒子の孔中への透過によるものである。
分画透過は粒子の流体力学的容積の関数である。従っ
て、理想的条件下で、大きな分子は粒子の内部から排除
され、一方小さい分子はこの容積に入りやすく、溶出容
積および分子量の対数間には直線関係があるので、溶出
の順序は蛋白質の大きさにより予想される。架橋デキス
トランを基材とするサイズ排除クロマトグラフィー支持
体（例えばSEPHADEX 、球状アガロースビーズ（例え
ば、SEPHAROSE ）（両方ともPharmacia AB.Uppsala,Sw
edenから市販されている）、架橋ポリアクリルアミドを
基材とするもの（例えば、BIO−GEL （BioRad Laborat
ories,Richmond,Californiaより市販されている）又は
エチレングリコール−メタクリレートコポリマーを基材
とするもの（例えば、TOYOPEARL HW65S（ToyoSoda Co.,
Tokyo,Japanより市販されている）に基づくサイズ排除
クロマトグラフィー支持体は本発明の実施において有用
である。
沈殿法は、蛋白質の粗混合物において個々の蛋白質の
溶解度は大きく異なることに基づく。水性媒体中の蛋白
質の溶解度は種々の要因に依存するが、この論考の目的
に関しては、一般的に、蛋白質は同種又は類似の蛋白質
分子との相互作用よりも溶媒との相互作用が強い場合に
蛋白質は溶解性であるといえる。沈殿現象を記載するい
かなる機械的理論により結合していないとしても、蛋白
質および水分子間の相互作用は数種の荷電していない基
との水素結合、および静電的に双極子として、荷電基と
の水素結合により起こり、一価カチオンの塩（例えば、
硫酸アンモニウム）などの沈殿剤は水分子に関して蛋白
質と競合し、従って、高い塩濃度では蛋白質は「脱水状
態」になり、水性環境との相互作用が減少し、同種又は
類似の蛋白質との凝集が増加し、その結果媒体から沈殿
する。
イオン交換クロマトグラフィーはサンプル中の荷電し
た官能基と吸着剤表面上の反対の電荷のイオン性官能基
との相互作用が関与する。２種の一般的な相互作用が知
られている。正電荷の表面と相互作用する負電荷のアミ
ノ酸側鎖（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン
酸）により媒介されるアニオン交換クロマトグラフィ
ー、および負電荷の表面と相互作用する正電荷のアミノ
酸残基（例えば、リシンおよびアルギニン）により媒介
されるカチオン交換クロマトグラフィーである。
最近、伝統的なサイズ排除およびイオン交換クロマト
グラフィー法を補足するために、アフィニティークロマ
トグラフィーおよび疎水的相互作用クロマトグラフィー
技術が開発されている。アフィニティークロマトグラフ
ィーは蛋白質の固定化リガンドとの相互作用による。リ
ガンドは特定の対象となる蛋白質に関して特異的であ
り、この場合、リガンドは基質、基質類似体、阻害物質
又は抗体である。あるいは、リガンドは多くの蛋白質と
反応できる。このようなアデノシン一燐酸、アデノシン
二燐酸、ニコチンアデニンジヌクレオチドまたはある種
の色素などの一般的なリガンドを用いて特定の種類の蛋
白質を回収してもよい。
疎水的相互作用クロマトグラフィーはまず蛋白質が炭
化水素スペーサーアームを含むが、アフィニティーリガ
ンドを含まないアフィニティーゲル上に保持されうると
いう観察にしたがって開発された。この分野においては
疎水的クロマトグラフィーという用語が使われる場合が
あるが、クロマトグラフィー工程ではなく、溶質および
ゲル間の相互作用が疎水的であるので疎水的相互作用ク
ロマトグラフィー（HIC）という用語が好ましい。疎水
的相互作用は高いイオン強度で最も強く、従って、この
形態の分離法は塩沈殿又はイオン交換法の後に行うのが
都合よい。HIC支持体からの溶出は溶媒、pH、イオン強
度の変更、又はカオトロピック剤又は有機モディファイ
アー、例えばエチレングリコールなどの添加により行う
ことができる。疎水的相互作用クロマトグラフィーの一
般的原則は、アメリカ合衆国特許第3917527号および第4
000098号に記載されている。
HICの特定の蛋白質の精製への応用は、以下の開示に
例示されている：ヒト成長ホルモン（アメリカ合衆国特
許第4332717号）、毒素抱合体（アメリカ合衆国特許第4
771128号）、抗溶血因子（アメリカ合衆国特許第474368
0号）、腫瘍壊死因子（アメリカ合衆国特許第4894439
号）、インターロイキン−２（アメリカ合衆国特許第49
08434号）、ヒトリンフォトキシン（アメリカ合衆国特
許第4920196号）およびリゾチーム（Fausnaugh,J.L.お
よびF.E.Regnier,J.Chromatog.359:131−146（198
6））。
本発明は補体受容体分子および補体受容体様分子の精
製に、イオン交換法、沈殿法、HICおよびサイズ排除ク
ロマトグラフィーを組み合わせて用いることに関する。
発明の簡単な説明 本発明は、補体受容蛋白質を含有する混合物を連続し
てカチオンクロマトグラフィー支持体、疎水的相互作用
クロマトグラフィー支持体およびサイズ排除クロマトグ
ラフィー支持体に付し、蛋白質を各支持体から選択的に
溶出することからなる補体受容蛋白質を含有する混合物
から該蛋白質を精製する方法に関する。別の態様におい
て、本発明は補体受容蛋白質の調整細胞培養培地からの
精製法を提供し、該方法において、蛋白質含有培地を連
続して、（ａ）カチオン交換クロマトグラフィー、
（ｂ）硫酸アンモニウム沈殿、（ｃ）疎水的相互作用ク
ロマトグラフィー、（ｄ）アニオン交換クロマトグラフ
ィー、（ｅ）更にカチオン交換クロマトグラフィー、お
よび（ｆ）サイズ排除クロマトグラフィーに付す。
更に別の態様において、本発明は、 （ａ）調整細胞培養培地を濃縮し、 （ｂ）補体受容蛋白質をカチオン交換クロマトグラフィ
ーカラム上に吸着させ、 （ｃ）吸着した蛋白質を最低一種の緩衝液で洗浄し、 （ｄ）洗浄した蛋白質を溶出し、 （ｅ）蛋白質を硫酸アンモニウムで沈殿させ、 （ｆ）沈殿した蛋白質を再溶解させ、 （ｇ）工程（ｆ）からの蛋白質を疎水的相互作用クロマ
トグラフィー支持体上に吸着させ、 （ｈ）蛋白質を選択的に溶出させ、 （ｉ）工程（ｈ）からの溶出液をアニオン交換樹脂上に
吸着させ、 （ｊ）吸着した蛋白質を溶出し、 （ｋ）工程（ｊ）からの溶出液をカチオン交換樹脂上に
吸着させ、 （ｌ）吸着した蛋白質を溶出し、 （ｍ）工程（ｌ）からの溶出液をサイズ排除クロマトグ
ラフィーに付し、 （ｎ）これより蛋白質を回収することからなる調整細胞
培養培地から補体受容蛋白質を精製する方法を提供す
る。
発明の詳細な記載 本発明は補体受容蛋白質の大規模な精製に応用される
蛋白質精製技術に関する。本発明により95％以上の蛋白
質純度の受容体蛋白質が回収されるので、本発明はとく
に有用である。本発明は多くの補体受容蛋白質および補
体受容体様蛋白質の精製に応用できる。
補体は血清蛋白質の一種であり、蛋白質の限定加水分
解により連続して活性化され、体液性免疫の重要なエフ
ェクターである。補体の活性化は初期作用補体成分の抗
原／抗体複合体との相互作用により起こる。この活性化
より得られる蛋白加水分解フラグメントは単独で、また
は他の蛋白質と共に、別の補体蛋白質を活性化し、その
結果凝血ファクターの役割を果たす蛋白質加水分解カス
ケードが得られる。あるいは、補体を細菌細胞壁成分、
蛋白質分解酵素（例えば、プラスミン）又は複合糖質
（たとえばイヌリン）により活性化することもできる。
多くの生物学的活性は補体系（例えば、免疫細胞溶解反
応、アナフィラトキシン産生、溶菌反応、走化性、溶血
反応、オプソニン作用、および食菌作用）の成分により
媒介される。
４種類の補体レセプター（CR）が知られている（CR1
〜CR4）。補体レセプター１（CR1）は補体成分C3bおよ
びC4bに対するレセプターである。補体レセプター２（C
R2）は成分C3dgおよびC3dに対するレセプターである。
補体レセプター３（CR3）はC3biに対するレセプターで
ある。補体レセプター４（CR4）はC3dgに対するレセプ
ターである。
１型補体レセプター（CR1）は赤血球、単核細胞／マ
クロファージ、顆粒球、Ｂ細胞、ある種のＴ細胞、脾小
胞樹状細胞、および糸球足細胞の膜上に存在する。CR1
はC3bおよびC4bに結合し、C3b/C4bレセプターと称す
る。その一次配列は決定されている（Klicksteinら、J.
Exp.Med.165:1095−1112（1987）、Klicksteinら、J.Ex
p.Med.168:1699−1717（1988）、Hourcadeら、J.Exp.Me
d.168:1255−1270（1988））。これは60〜70個のアミノ
酸を含有する30個の短いコンセンサス重複配列（SCR）
からなり、SCRあたり平均65個のアミノ酸のうち29個が
保持されている。各SCRはジスルフィド結合における３
番目および１番目ならびに４番目および２番目のシスチ
ンとのジスルフィド結合により３次元的三重ループ構造
を形成すると考えられる。SCRは更にそれぞれSCR7個ず
つの４個の長相同重複配列（LHR）を形成する。リーダ
ー配列に続いて、分子はC4b結合領域を含む最大のＮ末
端LHR−Ａ、次の２個の重複配列、即ちC3b結合領域を含
むLHR−ＢおよびLHR−Ｃ、Ｃ末端LHR−Ｄとそれに続く
２個の別のSCR、25個の推定トランスメンブラン領域残
基および43個の細胞質テール残基からなる。
CR1はSCR相同性を特徴とする超科に属する。この超科
はC3/C4結合機能、たとえばCR2、C4bp、ファクターＨ、
ファクターＢ、およびC2、ならびにこの機能をもたない
蛋白質例えば、インターロイキン−２レセプター、ベー
タ２−糖蛋白質Ｉ、C1r、ハプトグロビンアルファ鎖、
およびファクターXIII bを有するものを含む。
CR1は糖蛋白質であることが知られており、それに由
来するアミノ酸配列は細胞外領域においてＮ−結合オリ
ゴ糖に関して24個のポテンシャルサイトを有する。しか
し、ツニカマイシンの存在下でのCR1の合成（Lublin
ら、J.Biol.Chem.261:5736（1986））およびグルコサミ
ン含量分析（Sim、Biochem.J.232:883（1985））により
６〜８個の部位のみが実際にオリゴ糖と結合しているこ
とが示されている。糖蛋白質のＮ−末端は遮蔽されてい
ると考えられる。
４個の異なるCR1アロタイプが存在し、これは大きさ
が30〜50kD違う。これらの対立遺伝子多形性（アロタイ
プ）の遺伝子頻度はヒトの集団において異なる（Holer
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:2459−2463（198
7））。Ｆ（又はＡ）アロタイプは４個のLHRからなり、
約250kDである。大きいほうのＳ（またはＢ）アロタイ
プはLHR−Ｂの5'側半分とLHR−Ａの3'側半がキメラであ
る５番目のLHRを含み、３番目のC3b結合部位を有すると
考えられ（Wongら、J.Exp.Med.169:847（1989））、約2
90kDである。最小のF'（またはＣ）アロタイプは、全身
性紅斑性狼瘡（SLE）患者において発生率が高く（Van D
yneら、Clin.Exp.Immunol.68:570（1987）およびDykman
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:1698（1983））、LHR
−ＢおよびC3b結合部位が１個の欠失していることより
起こりやすい。
天然に存在するCR1の可溶型は正常な個人およびある
種のSLE患者の血漿において検出されている（Yoonおよ
びFearon、J.Immunol.134:3332−3338（1985））。その
特性は赤血球（細胞表面）CR1と構造的にも機能的にも
類似している。
Hourcadeら（J.Exp.Med.168:1255−1270（1988））は
ヒトCR1転写単位においてCR1の分泌型を産生すると考え
られるもう１つのポリアルデヒド化部位を観察した。こ
の末端を切断された形態の配列由来のmRNAはCR1の第１
の8.5SCRs（例えば、C4b結合領域）を含み、約80kDの蛋
白質をコードすることができる。この截形配列に対応す
るcDNAがCOS細胞中にトランスフェクションされ、発現
された場合、予想されるC4bが見られるが、C3b結合活性
は示さない（Kyrchら、F.A.S.E.B J.3:A368（198
9））。Krychらはまたある種のヒト細胞系において予想
されるものと類似したmRNAを観察し、このようなC4bと
結合できるCR1の末端を切断された形態の可溶形は人に
おいて合成できると仮定した。
数種のCR1の可溶性フラグメントは発現されたDNAから
トランスメンブラン領域を除去することにより組み換え
DNA法で産生されてきた（Fearonら、国際特許公開WO89/
0992号、1989年10月５日公開;Fearonら、国際特許公開W
O91/05047号、1991年４月18日公開）。可溶性CR1フラグ
メントはC3bおよび／またはC4bと結合でき、それに含ま
れる領域によってファクターＩコファクター活性を示す
ので機能的に活性である。更に、これらは好中球酸化破
裂、補体媒介溶血現象、およびC3aおよびC5a産生などの
in vitro CR1機能の抑制物質として挙動することができ
る。プラスミドsCR1/pBSCR1cによりコードされる可溶性
CR1構造は逆受身的アルチュス反応においてin vivo活性
を示し（Fearonら、（1989および1991）ならびにYeh
ら、J.Immunol.（1991））、局所貧血後心筋炎症および
壊死を抑制し（Fearonら、1989および1991ならびにWeis
manら、Science 249:146−151（1990））。更に、sCR1/
pBSCR1c生成物をｐ−アニソイル化ひとプラスミノーゲ
ン−ストレプトキナーゼ−アクチベータ複合体（APSA
C）と共に配合するとAPSAC単独と類似した抗溶血活性が
得られ、これにより補体抑制物質sCR1と血栓溶解物質と
を組み合わせると有効な複合療法ができることを示す
（Fearonら、国際特許公開WO91/05047号、1991年４月18
日公開）。
補体受容体様蛋白質は、本明細書に記載する方法によ
り精製される蛋白質であり、このような方法は必要に応
じて通例の、不適当な実験を必要としない非発明的調整
により変更してもよい。このような蛋白質としては、ア
ロタイプおよび対立遺伝子性のCR、末端を切断された形
態、例えばPEG処理などにより化学的に修飾された形
態、およびCR基を含有する融合蛋白質が挙げられる。こ
れらの蛋白質は、本発明の方法による精製を可能にする
のに十分なCR蛋白質特性を有するか又は保持するため補
体受容体様と称する。特記しないかぎり、補体受容蛋白
質なる語は補体受容体様蛋白質も包含する。CR−１−様
蛋白質はCR−１アロタイプ由来の対立遺伝子性、末端を
切断された、化学的に修飾された、および融合された蛋
白質を包含するCR様蛋白質のサブセット表わす。本明細
書において30個の細胞外SCR領域を全て含有するひとCR1
の可溶性形態と定義する可溶性補体受容体１（sCR1）は
CR−１−様蛋白質の一例である。
本発明の補体受容蛋白質は種々の技術により製造する
ことができる。完全長の天然鎖が必要な場合、天然分子
を前記細胞源より抽出する。可溶性形態が望ましい場
合、天然の完全長分子のフラグメントが好ましい。従っ
て、所望の鎖フラグメントをコードするDNAは組み換え
技術により産生される蛋白質フラグメントとして発現さ
れる。本発明は種々のsCR1産生組み換え体細胞系の調整
細胞培養培地からsCR1を精製するのに特に有用である。
本明細書に記載の開示に基づいて細胞系間および種々の
補体受容体生成物間に変動があると考えられるが、当業
者が本発明を特定の補体受容蛋白質および産生細胞系の
組み合わせに適用するための技術範囲内である。
一般に、補体受容体などの蛋白質をコードする遺伝子
は、ポリペプチドの所望の領域をコードするDNAフラグ
メントを組み換えDNAビヒクル（例えば、ベクター）中
に組み込み、適当な原核又は真核宿主を形質転換又はト
ランスフェクションすることによりクローンされる。適
当な原核宿主としては、エシェリキア、ストレプトミセ
ス、バチルスなどが挙げられるがこれに限定されるわけ
ではない。適当な真核宿主としては、酵母、例えばサッ
カロミセス属、および例えばVERO、HeLa、mouse C127、
チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、WI−38、BHK、CO
S、MDCK等の培養株中の動物細胞、および昆虫細胞系が
挙げられるが、これに限定されるわけではない。特に好
ましい宿主は、ジヒドロ葉酸還元酵素がないCHO細胞
系、例えば、ATCC CRL 1793、CRL 9096等のおよび以下
に記載する他の細胞系である。このような組み換え技術
は現在よく知られており、Methods in Enzymology（Aca
demic Press）第65巻および第69巻（1979）、第100巻お
よび第101巻（1983）およびこの中で言及されている文
献に記載されている。広範囲に及ぶ最も一般的に用いら
れる組み換えDNA方法論を包含する技術的論文は、Mania
tisら、Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Labora
tory（1982）またはCurrent Protocols in Molecular B
iology,Greene Publishing（1988、1991）に記載されて
いる。
補体受容体などの所望のポリペプチドをコードするDN
Aフラグメントを得るための方法の一例としては、cDNA
クローニングによるものがある。この方法においては、
メッセンジャーRNA（mRNA）を所望の蛋白質を産生する
ことが知られているかまたはその可能性のある細胞から
単離する。一連の酵素反応により、細胞のmRNA集団を相
補性DNA（cDNA）中に複写する。得られたcDNAを次にク
ローニングビヒクル中に挿入し、続いて適当な原核又は
真核宿主を形質転換するのに用いる。得られたcDNA「ラ
イブラリー」は形質転換された宿主細胞の集団を含み、
その各々は、一つの遺伝子又は遺伝子フラグメントを含
有する。全ライブラリーは、理論上、出発物質として用
いるmRNA混合物中に存在するコーディング情報の代表的
サンプルを提供する。
ライブラリーを、核酸又は抗体プローブを用いてスク
リーンし、特定のDNA配列を同定することができる。一
旦単離すると、これらのDNA配列は修飾したり、完全遺
伝子中に組み込むことができる。あるいは、本発明中に
記載したように、遺伝子の特定のフラグメントを遺伝子
の残りと独立して遺伝子操作することができる。これら
の遺伝子操作した遺伝子フラグメントによりコードされ
る蛋白質フラグメントは自然界には存在しないが、望ま
しくない生理状態の治療に著しい有用性がある。補体活
性が関与する症状の予防および／又は治療用の可溶性補
体受容体の遺伝子操作はこのような場合の一例である。
一旦遺伝子又は遺伝子フラグメントをクローンする
と、DNAが発現ベクター中に導入され、その構築物は適
切な宿主細胞を形質転換するのに用いられる。発現ベク
ターは本明細書において定義するような発現調節配列を
有し、対象となるDNA配列が操作可能に結合している場
合、ベクターはベクターを含有する宿主細胞中の対象と
なるDNA配列によりコードされる生成物の産生を促すこ
とができる。本発明に関して、一つのコーディング配列
のフラグメントを集成して発現により可溶性受容体蛋白
質が形成されるようにすることができる。この方法のSC
R1組み換え体産生への特に効率のよい適用法は前記のFe
aronら、PCT出願WO89/09220号（1989年10月５日公開）
およびWO91/05047号（1991年４月18日公開）に記載され
ている。
組み換え生成物が産生された後、この生成物を回収す
るのが望ましい。生成物がそれを産生する細胞により運
ばれる場合、生成物は細胞培養培地から直接回収でき
る。生成物が細胞内に保持される場合、細胞内の生成物
を得るために、細胞を機械的、化学的または生物学的手
段により物理的に破砕しなければならない。
蛋白質生成物の場合、精製法により他の蛋白質を本質
的に含まない、つまり調製物中の全蛋白質に関して最低
80％、好ましくは95％以上の純度である蛋白質生成物が
得られるだけでなく、他の宿主細胞不純物、DNA、RNA、
潛熱源等を除去するか又は許容できるレベルに減少させ
る。
既に記載したように、種々の宿主細胞を本発明の受容
体の産生に用いることができる。特定の宿主細胞の選択
は、とりわけ、受容体の性質、合成率、崩壊率および受
容体の発現を行う組み換えベクターの特徴等を考慮した
通常の当業者の技術範囲内である。宿主細胞発現系の選
択は用いる細胞培養法の性質を大いに左右する。特定の
製造方法がバッチ又は連続法、スピンナー又はエアーリ
フト、液体又は固定化のいずれであるかの選択は、発現
系が一旦選択されてから選択することができる。従っ
て、流動床バイオリアクター、中空糸バイオリアクタ
ー、ローラーボトル培養、又は撹拌タンクバイオリアク
ター（細胞ミクロキャリアーを用いても用いなくてもよ
い）を様々に用いることができる。このような選択の規
準は細胞培養技術において理解できるものである。これ
については本発明の範囲を逸脱するので、本明細書にお
いては詳細には記載しない。本発明は調整細胞培養培地
中に存在する補体受容体の精製に関する。
既に記載したように、本発明は、とりわけ補体受容蛋
白質の精製および分析に疎水的相互作用クロマトグラフ
ィー（HIC）を適用することに関する。水性溶媒中の疎
水性分子は自己会合している。この会合は疎水的相互作
用によるものである。蛋白質などの高分子は予想される
親水性基に加えて表面上に広範囲の疎水性パッチを有す
ると考えられる。HICはこれらのパッチとクロマトグラ
フィーの支持体に結合した疎水性リガンドとの相互作用
を一部利用したものである。マトリックスと結合した疎
水性リガンドは本明細書においては、HIC支持体、HICゲ
ル又はHICカラムなどさまざまに言及される。更に、蛋
白質およびHIC支持体間の相互作用の強度は蛋白質上の
極性表面に対する非極性表面の割合の関数であるだけで
なく、非極性表面の分布にもよる。
多くのマトリックスがHICカラムの調整に用いられる
が、最も広く用いられるのはアガロースである。シリカ
および有機ポリマー樹脂も用いられる。有用な疎水性リ
ガンドとしては、約２〜約10個の炭素原子を有するアル
キル基、例えばブチル、プロピル、又はオクチル；ある
いはアリール基、例えばフェニル基が挙げられるが、こ
れに限定されるわけではない。ゲルおよびカラムに関す
る通常のHIC生成物は、例えば、Pharmacia LKB AB,Upps
ala,Swedenから商品名ブチル−セファロース 、フェニ
ル−セファロース CL−4B、オクチル−セファロース
FF;Tosoh Corporation,Tokyo,Japanから製品名TOYOPEAR
L Butyl650M（フラクトゲル TSK ブチル−650）また
はTSK−GELフェニル−5PW;Miles−Yeda,Rehovot,Israel
から製品名アルキル−アガロース（アルキル基は２〜10
個の炭素原子を含有する）、およびJ.T.Baker,Phillips
burg,N.J.から製品名Bakerbond WP−HI−プロピルで市
販されている。
所望のHICカラムを通常の化学作用を用いて調製する
こともできる。例えば、 （式中、Ｍはアガロースなどのマトリックス）の形態の
マトリックス／リガンドの組み合わせは、Er−el,Zら、
Biochem.Biophys.Res.Comm.49:383（1972）により示唆
されるようにアルキルアミンとのカップリングによりア
ガロースの臭化シアン活性化の後に形成することができ
る。あるいは、 （式中、Ｍはアガロースなどのマトリックス、Ａはアリ
ールである）の形態の組み合わせは、グリシジルエーテ
ルカップリング法により調製できる（Ulbrich,V.らCol
l.Czech,Chem.Commum.9:1466（1964））。簡単に言う
と、ゲル（通常はアガロース）を有機溶媒（例えばジオ
キサン）中に移す。これをブフナー漏斗上で段階的に行
う（100mlの沈殿ゲルに対して100mlずつ）：即ち、
（１）水−ジオキサン（4:1）で１回洗浄、（２）水−
ジオキサン（3:2）で１回洗浄、（３）水−ジオキサン
（2:3）で１回洗浄、（４）水−ジオキサン（1:4）で１
回洗浄、（５）ジオキサンで７回洗浄。100mlのジオキ
サンを100mlの沈殿したゲルに添加し、48％のジエチル
エーテル中三フッ化ホウ素エーテル錯体溶液2mlを添加
し、５分間撹拌する。10mlのジオキサン中に溶解した1m
lの適当なグリシジルエーテルを分液濾斗から滴下す
る。反応は約40分要する。反応後、得られたゲルを水性
環境に戻し、前記工程（４）から（１）に逆戻りし、最
後の洗浄を水中で行って終わる。ゲルに結合するリガン
ドの量は、反応混合物に添加されるグリシジルエーテル
の量を変えることにより調整できる。反応は、一般に以
下の式で表わされる： （式中、Ｍはアガロースなどのマトリックス、Ｒはアル
キルまたはアリールである）。
リガンド密度は、重要なパラメーターであり、相互作
用の強度だけでなく、カラムの容量にも影響を与える。
市販のフェニルまたはオクチルフェニルゲルのリガンド
密度は40マイクロモル/mlゲルベッドのオーダーであ
る。ゲル容量は問題になる特定の蛋白質、およびpH、温
度および塩濃度の関数であるが、一般に３〜20mg/ml
（ゲル）の範囲内であると考えられる。
特定のゲルの選択は、当業者により決定できる。一般
に、蛋白質およびHICリガンド間の相互作用の強度は、
アルキルリガンドの鎖長が伸びるにしたがって増加する
が、約４〜約８個の炭素原子を有するリガンドがほとん
どの分離に関して適当である。フェニル基はペンチル基
とほとんど同じ疎水性を有するが、選択性は蛋白質上の
芳香属基とのパイ−パイ相互作用の可能性によりかなり
異なる。
HICカラムへの蛋白質の吸着は高い塩濃度の場合に有
利であるが、実際の濃度は蛋白質および選択された特定
のHICリガンドの性質によって広範囲にわたって変化し
うる。種々のイオンをそれらが疎水的相互作用を促進す
るか（塩析効果）又は水の構造を破壊し（カオトロピッ
ク効果）、それにより疎水的相互作用を弱めるかどうか
によって所謂疎溶媒性順に並べることができる。カチオ
ンはその塩析効果が高くなる順に、以下のように並べら
れる： Ba++＜Ca++＜Mg++＜Li+＜Cs+＜Na+＜K+＜Rb+＜NH4 +。一
方、アニオンはカオトロピック効果の増加する順に以下
のように並べられる： PO4 ---＜SO4 --＜CH3COO-＜Cl-＜Br-＜NO3 -＜ClO4 -＜I-
＜SCN-。
従って、以下の関係により示される相互作用の強さに
影響を与える塩を処方する： Na2SO4＞NaCl＞（NH4）2SO4＞NH4Cl＞NaBr＞NaSCN。
一般に、約0.75〜約2Mの塩濃度の硫酸アンモニウムま
たは約１〜約4MのNaClが有用である。
一般に温度が下がると相互作用は減少するが、HIC分
離に対する温度の影響は単純ではない。しかし、温度の
上昇により生じる利点は、そのような昇温が蛋白質の活
性に及ぼす悪影響と考え合わせなければならない。
溶出は、段階的であっても、勾配の形態をとっても、
種々の方法で行うことができる。即ち、（ａ）塩濃度を
変化させる、（ｂ）溶媒の極性を変化させる、または
（ｃ）界面活性剤を添加することにより行う。塩濃度を
低下させることにより、吸着された蛋白質は疎水性の低
い順に溶出する。極性の変化はエチレングリコール又は
（イソ）プロパノールなどの溶媒を添加することにより
影響を受け、それにより疎水的相互作用の強度が減少す
る。界面活性剤は蛋白質の置換体として機能し、本来膜
蛋白質の精製に関して用いられてきた。
既に記載したように、HICは他の蛋白質精製技術と組
み合わせて用いた場合に特に有用である。即ち、HICを
他の蛋白質精製法により部分的に精製した物質に適用す
るのが好ましい。「部分的に精製した」という語は対象
となる蛋白質が最低５重量％、より好ましくは最低10
％、最も好ましくは最低45％存在する蛋白質調製物を意
味する。従って、HICの適用は補体受容蛋白質の総合的
精製法に関して最も優れている。例えば、調整細胞培養
培地のサンプルをHICの適用の前に部分精製に付すのが
有効であることがわかっている。「調整細胞培養培地」
なる語は、細胞増殖および／又は細胞維持を促し、分泌
された生成物を含有する細胞培地を意味する。このよう
な培地の濃縮されたサンプルをHIC工程の適用以前に１
以上の蛋白質精製工程に付す。サンプルを第一段階とし
てイオン交換クロマトグラフィーに付す。既に記載した
ように、クロマトグラフィー用アニオンまたはカチオン
支持体を形成するために種々のアニオンまたはカチオン
置換基をマトリックスに結合させる。アニオン交換置換
基としては、ジエチルアミノエチル（DEAE）、第４アミ
ノエチル（QAE）および第４アミン（Ｑ）基が挙げられ
る。カチオン交換置換基としては、カルボキシメチル
（CM）、スルホエチル（SE）、スルホプロピル（SP）、
ホスフェート（Ｐ）およびスルホネート（Ｓ）が挙げら
れる。DE23、DE32、DE52、CM−23、CM−32およびCM−52
等のセルロース系イオン交換樹脂は、Whatman社（Maids
tone,Kent,U.K.）から入手可能である。SEPHADEX を基
材とする架橋性イオン交換体も公知である。例えば、DE
AE−、QAE−、CM−およびSP−SEPHADEX およびDEAE
−、Ｑ−、CM−およびＳ−SEPHAROSE は全てPharmacia
社から入手可能である。さらにTOYOPEARL DEAE−650Sお
よびTOYOPEARL CM−650SなどのDEAEおよびCMから誘導し
たエチレングリコール−メタクリレートコポリマーもTo
so Haas社（Philadelphia,Pa）から入手可能である。イ
オン支持体からの溶出には通常塩を添加し、既に記載し
たように、HICは塩濃度が増加すると向上するので、イ
オン交換クロマトグラフィー工程又は他の塩が介在する
精製工程の後にHIC工程を導入するのが特に好ましい。
カチオン交換クロマトグラフィー工程および硫酸アンモ
ニウム沈殿工程をHICの適用の前に行うのが好ましい。
更にイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマ
トグラフィー、ウイルス不活化、濃縮および凍結乾燥等
の精製法を行ってもよいが、かならずしもこれらに限定
されるわけではない。
HICから得られる溶出液を更にイオン交換クロマトグ
ラフィーに付す場合、アニオンおよびカチオン法のどち
らを用いるのも好ましい。
既に記載したように、ゲル濾過クロマトグラフィーは
分子の大きさに基づいた分離である。実際は分子篩いの
形態である。マトリックスおよび溶質間に相互作用がな
いのが望ましく、従って、全体として不活性なマトリッ
クス物質が好ましい。マトリックスは硬質で、多孔性が
高いものが望ましい。大規模な方法において、剛さは全
流量を確立するパラメーターであるので最も重要であ
る。通例の物質、例えば、SEPHADEX またはBIO−GEL
は十分不活性であり、種々の孔範囲で得られるが、これ
らのゲルは比較的柔軟であって、大規模の精製に特に適
しているわけではない。最近、剛さが向上したゲルが開
発されている（例えば、SEPHACRYL 、UTROGEL 、FRAC
TOGEL およびSUPEROSE ）。これらの物質は全て通常
の支持体において用いられるものより小さな粒子寸法で
入手可能であり、従って高い流速でも保持される。TOYO
PERAL HWシリーズマトリックス（Toso Haas）が好まし
い。
単なる例示のために、本発明を可溶型補体受容体の精
製に適用する。より詳細には、トランスメンブラン領域
の第一アラニン残基以前のリーダー、LHR−Ａ、LHR−
Ｂ、LHR−Ｃ、LHR−Ｄ、SCR29、SCR30領域およびトラン
スメンブラン領域の第一アラニン残基を含有し、Fearon
ら、1989年、国際特許公開第WO89/09220号（1989年10月
５日公開）のプラスミドpBSCR1c中のCR1コーディング配
列に対応する溶解性CR1構造（以下「TP10HD」と称す
る）に適用する。TP10HDの産生に関する組み換え体系の
構成は、前記PCT出願中に詳細に記載されており、要約
すると以下のとおりである。
CHO細胞をトリプシン処理し、60mmディッシュにつき
５×105が沈殿し、37℃にて加湿インキュベーター中、
５％CO2/95％空気の雰囲気下に増殖培地（Hams F12普通
培地（041−1765）＋１％ストックグルタミン（043−05
030）、１％stock pen−strep（043−05070）および10
％ウシ胎仔血清（011−6290）（Gibco,Paisley,Scotlan
d））中に放置する。21時間後、DNAトランスフェクショ
ンに該細胞を用いる。pBSCR1c由来のsCR1コーディング
配列を含有する発現プラスミドをpSV2dhfrを用いて、dh
fr要求チャイニーズハムスター卵巣細胞系（CHODUXB I
I）中にコトランスフェクションする。トランスフェク
ションは増殖培地中で行い、カルシウム随伴沈降／グリ
セロールショック法（DNA Cloning,D.M.Glover ed.（Ch
ap.15,C.Gorman）に記載）を用いる。pBSCR1c/pTCSgpt
およびpSV2dhfrを用いたトランスフェクションの後、細
胞を淘汰の前に増殖培地中増殖条件（前記のとおり）下
で46時間維持する。
淘汰および共増幅は本質的にはR.J.Kaufmanら、Mol.C
ell.Biol.5:1750−1759（1985）により記載されている
ようにして行う。トランスフェクション後46時間で、細
胞を選択培地MEM ALPHA（041−02571）、１％ストック
グルタミン、１％stock pen/strep（043−05070）およ
び透析ウシ胎仔血清（220−6300AJ）（Gibco,Paisley,S
cotland）に移す。細胞をdhfr＋コロニーが現れるまで
８〜10日間選択培地中に維持する。コロニーが確立した
ら、細胞をメトトレキサートを含有する選択培地（A677
0,Sigma Chem.Co.,St.Louis,Mo.）中に移す。メトトレ
キサート濃度は最初は0.02マイクロモルで、段階的に５
マイクロモルまで増加させる。増幅の間、増殖細胞由来
の増殖培地のアリコートをELISAによりTP10HD産生に関
して分析する。本発明にしたがった精製用の調整培地を
供給するのにどんな補体受容分泌組み換え体細胞系（例
えば、ATCC CRL 10052）を用いてもよく、特定の細胞系
を必ずしも必要としない。
TP10HDを産生できるトランスフェクションしたCHO細
胞系は種々の細胞培養技術により培養できる。本発明の
適用に関しては、特定の培養法に限定されるのではない
が、用いられる細胞培養法の一例は、アメリカ合衆国特
許第4861714号；第4863856号；第4978616号および第499
7753号（引例）に具体例が示されているVerax流動床技
術に基づく連続的潅流法である。従って、前記のような
トランスフェクションした細胞を、10％牛胎仔血清（FB
S）および5mMメトトレキサート（MTX）を追加したCCM−
３培地（DMEM、HamのＦ−12、牛血清アルブミンおよび
他の栄養素補給物の混合物）中スケールアップする。バ
イオリアクターに接種するのに十分な細胞数が得られる
まで細胞集団をローラーボトル中で増やす。接種前に、
S200バイオリアクターをクリーン・イン・プレース（CI
P）およびスチーム・イン・プレース（SIP）サイクルに
付す。つぎにこれを５％FBSを含有するCCM−３培地で満
たし、450グラムの微小球を入れる。微小球は、接種前
に培地を用いて調整する。リアクターに細胞を接種し、
操作パラメーターは、以下のとおりである:pH7.2、37
℃、入口（流動床の底）は溶解O2 100〜400torr、出口
（流動床の頂上部）は溶解O2 ０〜200torr。初期バッ
チ相に続いて、培地潅流を始める。その際速度を周期的
に増加させてグルコース濃度を1.0g/Lに維持する。これ
をＳ−2000バイオリアクターに接種するのに十分な数の
細胞がリアクター中に蓄積されるまでつづける。CIPお
よびSIPの後、Ｓ−2000リアクターを５％FBSおよび5mM
MTXを追加し、5000グラムの微小球を入れたCCM−３培地
で満たす。これらの微小球は接種前に培地に関して状態
調節する。温度、リアクター配列および溶解酸素に関す
る操作条件は前記のとおりである。Ｓ−200リアクター
からの微小球を無菌的にＳ−2000リアクターに移し、バ
ッチ段階を開始する。グルコース濃度が1.5g/Lより低く
なった場合、グルコース濃度を1.0g/Lに維持するのに十
分な速度で培地潅流（CCM−３、５％FBSおよび5mM MT
X）を始めて、増殖段階を開始する。酸素の吸収および
グルコース消費率を測定することにより細胞増殖をモニ
ターする。リアクター中に十分な量の細胞が蓄積された
ら、還流培地を１％FBSおよび5mM MTXを追加したCCM−
３、トランジション培地に変える。潅流速度を加減して
グルコース濃度を1.0g/Lに維持する。トランジション培
地中でさらに増殖した後、潅流培地をもう一度産生培地
（5mM MTXを追加したCCM−３）に変える。グルコース濃
度を1.0g/Lに維持するために潅流速度を増加させる。そ
の後、出口の溶解酸素又はリサイクル流量整定値を低く
して、反応器の制御を維持する。生成段階は典型的には
約60日間続く。
400〜1600リットルの４〜８℃にて貯蔵した反応器透
過物を、ミリポアプロスタックミクロフィルトレーショ
ンユニットで処理する。この操作から得られる細胞を含
まない透過物を限外ろ過工程に付す。透過物をミリポア
スパイラルワウンドシステムで30〜60倍に濃縮する。濃
縮の後、残留物を保持タンク中に抜き取り、システムを
５〜20Lの50mM燐酸緩衝液（pH7.5）で満たす。洗浄緩衝
液をシステムから抜き取り、残留物と合する。限外ろ過
濃縮物をプレフィルターおよびターミナル0.22mmフィル
ターを通してあらかじめ加圧加熱したNalgene bottle中
に濾過する。およそ800mlの濃縮物を各ボトル中に分散
させ、凍結保存する。
既に記載したように、特定の組み換え体産生系および
特定の細胞培養法は本発明の範囲外である。既に記載し
た系および方法は、当業者に利用可能な多くのオプショ
ンの代表的な物であり、本明細書においては例示のみの
目的で包含される。本発明の対象である精製法はルーチ
ンだけを変更してどのようにして産生又は培養するかに
関わらず種々の組み換え補体受容体および受容体様蛋白
質に適用可能である。
本発明の方法を実施して得られた精製補体受容蛋白質
は以下の性質を有する： （１）CR蛋白質95重量％以上、（２）４℃で蛋白質加水
分解に対して最低３ヵ月安定、（３）低（＜1E.U./mg蛋
白質）内毒素、（４）低（＜1pg/mg蛋白質）DNA、
（５）非−CR蛋白質＜５重量％、および（６）ウイルス
に対して不活性。以下の実施例で本発明を更に説明する
が、これにより特許請求の範囲を限定するものではな
い。
実施例１ 序論 以下に概要を記載する方法は調整細胞培養培地濃縮物
から溶解性補体受容体−１（sCR1）の単離および精製用
に開発されたものである。この方法は宿主細胞、細胞培
養培地又は他の原料由来の不純物を除去して蛋白質純度
が＞95％のsCR1を調製するためのものである。回収法は
カチオンおよびアニオン交換、疎水的相互作用、および
サイズ排除クロマトグラフィー；硫酸アンモニウム沈
殿；および２回のウイルス不活化処理を含む９段階から
なる。各工程を以下に詳細に記載する。工程１から工程
５は２〜８℃で行い、工程６から工程９は20〜25℃で行
う。
工程1:培地前処理 撹拌しながら、1N HClを添加して調整培地濃縮物をpH
5.2に調節する。添加完了後、撹拌を続け、pHを10分間
モニターする。pHを調節すると粘稠な沈殿が得られる。
一連の一列に連結した３個のミリポアポリガード−CRフ
ィルター（５ミクロン〜0.5ミクロン〜0.1ミクロン）を
通したミクロフィルトレーションにより清澄化する。sC
R1は濾液中に回収される。
培地濃縮物の酸性化および濾過により非sCR1蛋白質お
よび非蛋白質性物質の両方を除去し、sCR1含有瀘液を次
のＳセファロースクロマトグラフィーに適当なpHに調節
する。
工程2:ファーマシアＳセファロースファーストフロー
クロマトグラフィー pH5.2の濾液をあらかじめ緩衝液Ａで平衡化した、流
速60cm/時、容量＜３グラムsCR1/Lベッド容積のファー
マシアＳセファロースファーストフローゲルのカラムに
装入する。カラムを150cm/時で、３〜５ベッド容量の緩
衝液Ａで洗浄し、続いて５〜10ベッド容量の緩衝液Ｂで
洗浄する。sCR1はカラムに結合し、緩衝液Ｃで溶出され
る。カラムを３ベッド容量の緩衝液Ｄで洗浄することに
よりストリップする。
Ｓセファロースクロマトグラフィーにより、大部分の
細胞および培地由来の不純物（特に蛋白質）が除去さ
れ、更に処理する為に緩衝液Ｃカラム溶出物中のsCR1を
濃縮する。
工程3:硫酸アンモニウム沈殿 Ｓセファロース緩衝液Ｃ溶出液を緩衝液Ｅを添加して
硫酸アンモニウムが1.2Mになるように調節する。添加が
完了したら、撹拌を停止し、混合物を一夜静置する。
sCR1を含有する沈殿を10分間8000×Ｇで遠心分離する
ことにより集める。
ペレット化した物質を約4Lの緩衝液Ｆ中で穏やかに撹
拌して再懸濁する。溶液の280nmでの吸光度が1.5O.D.単
位になるまで更に緩衝液Ｆを添加する。溶液を一夜撹拌
し、ミリポアポリガードCR0.1ミクロンフィルターを通
して濾過する。
硫酸アンモニウム沈殿法により、更に不純物が除去さ
れ、疎水的相互作用クロマトグラフィー用のsCR1が調製
される。
工程4:TOYOPEARLブチル−650Mクロマトグラフィー 再溶解し、濾過した硫酸アンモニウムペレットを、撹
拌しながら緩衝液Ｅを添加することにより0.8M硫酸アン
モニウムになるように調節する。
添加が完了したら、混合物をあらかじめ緩衝液Ｇで平
衡化した、流速150cm/時、容量≦４グラム総蛋白質/Lカ
ラム容積のTOYOPEARLブチル−650Mゲルのカラムに付
す。緩衝液およびカラムを２〜８℃に維持する。添加が
完了したら、カラムを２〜３ベッド容量の緩衝液Ｇで洗
浄し、３ベッド容量の緩衝液Ｈで洗浄し、結合したsCR1
を緩衝液Ｉで溶出する。
工程5:ウイルス不活化およびファーマシアセファデク
スG25クロマトグラフィー 固体GuHClをブチル緩衝液Ｉ溶出液に添加して約2Mの
濃度にし、完全に溶解するまで撹拌する。pHをモニター
し、必要ならば、2.5N NaOHを用いてpH7.0に調節する。
GuHClが完全に溶解したら、溶液を６分間保持し、あ
らかじめ緩衝液Ｊで平衡化した流速60cm/時のファーマ
シアセファデクスG25カラムに装入する。添加容量はセ
ファデクスG25カラム容量の25％を越えてはならない。
sCR1が溶出された後（排除容量中に溶出）、「塩」の
ピークが溶出され、伝導率がベースラインレベルに戻る
までカラムを緩衝液Ｊで洗浄する。セファデクスG25生
成物を、2.5M NaOHを添加してpH11に調節し、溶液をpH1
1にて16分間維持し、2.5M HClでpH9.0に再調節する。物
質はこれでアニオン交換クロマトグラフィーができる状
態である。
GuHClおよびpH11処理により、ウイルスが存在する場
合、レトロウイルスに対して不活化され、セファデクス
G25クロマトグラフィーによりDEAE TOYOPEARLクロマト
グラフィー用のsCR1生成物が調製される。
工程6:TOYOPEARL DEAE−650Sクロマトグラフィー セファデクスG25生成物を、あらかじめ緩衝液Ｊで平
衡化した、流速150cm/時、容量≦６グラム蛋白質/Lカラ
ム容積のTOYOPEARL DEAE−650Sゲルのカラムに装入す
る。添加後、カラムを３ベッド容量の緩衝液Ｊで洗浄す
る。結合したsCR1を５カラム容量の直線的勾配（100％
緩衝液Ｊから始めて100％緩衝液Ｋ）で溶出する。カラ
ムを３ベッド容量の緩衝液Ｌで洗浄することによりスト
リップする。
TOYOPEARL DEAE−650Sクロマトグラフィーにより不純
物蛋白質、DNA、および潜在的ウイルス不純物が除去さ
れる。
工程7:TOYOPEARL CM−650Sクロマトグラフィー DEAE生成物を２容積の緩衝液Ｍで希釈し、2.5N HClで
pHを5.5に調節する。希釈混合物を、あらかじめ緩衝液
Ｍで平衡化した、流速150cm/時、容量≦11グラム蛋白質
/Lカラム容積のTOYOPEARL CM−650Sゲルのカラム上に添
加する。添加完了後、３カラムベッド容積の緩衝液Ｍで
洗浄し、結合したsCR1を５カラム容積の直線勾配（100
％緩衝液Ｍ→100％緩衝液Ｎ）で溶出する。カラムを３
ベッド容積の緩衝液Ｏでストリップする。生成物を含有
する溶出液を1/10容積の0.5M第二燐酸ナトリウムで中和
し、サイズ排除クロマトグラフィーができる状態にな
る。
TOYOPEARL CMクロマトグラフィーにより、蛋白質不純
物、DNAおよび潜在的ウイルス不純物が除去される。
工程8:TOYOPEARL HW65Sクロマトグラフィー TOYOPEARL CM生成物をあらかじめ緩衝液Ｆで平衡化し
たTOYOPEARL HW65Sカラム上に、流速30cm/時で添加す
る。添加容量はTOYOPEARL HW65Sカラム容量の５％を越
えてはならない。吸光度が最大吸光度の10％に減少する
まで全生成物ピークを集める。これで物質は最終濃縮が
できる状態になった。
サイズ排除クロマトグラフィーにより、低分子量蛋白
質不純物が除去され、緩衝液によりsCR1を最終目的の緩
衝液に変換される。
工程9:濃縮および最終濾過 TOYOPEARL HW65Sプールを100K MWCO Omega膜を備えた
ファーマジアミニセット限外ろ過ユニットを用いて５〜
6mg/mlに濃縮する。濃縮生成物をミリポア0.2ミクロン
ミリパックフィルターを通して濾過する。
緩衝液 緩衝液Ａ 20mM燐酸ナトリウム、60mM NaCl、pH5.2 緩衝液Ｂ 20mM燐酸ナトリウム、100mM NaCl、pH6.0 緩衝液Ｃ 20mM燐酸ナトリウム、500mM NaCl、pH7.0 緩衝液Ｄ 1M NaCl 緩衝液Ｅ 3M硫酸アンモニウム、100mM燐酸ナトリウ
ム、pH7.0 緩衝液Ｆ 10mM燐酸ナトリウム、0.9％w/v NaCl、pH7 緩衝液Ｇ 0.8M硫酸アンモニウム、100mM燐酸ナトリ
ウム、pH7.0 緩衝液Ｈ 0.7M硫酸アンモニウム、100mM燐酸ナトリ
ウム、pH7.0 緩衝液Ｉ 0.09M硫酸アンモニウム、100mM燐酸ナトリ
ウム、pH7.0 緩衝液Ｊ 50mM Tris/Tris・HCl、pH9.0 緩衝液Ｋ 50mM Tris/Tris・HCl、0.2M NaCl、pH9.0 緩衝液Ｌ 50mM Tris/Tris・HCl、1.0M NaCl、pH9.0 緩衝液Ｍ 50mM MES/MES・Na、pH5.5 緩衝液Ｎ 50mM MES/MES・Na、0.25M NaCl、pH5.5 緩衝液Ｏ 50mM MES/MES・Na、1.0M NaCl、pH5.5
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 オグラディ，ジョン・エイチ アメリカ合衆国コネティカット州06450、 メリデン、アパートメント・ナンバー 201、スコット・ストリート70番 (72)発明者 スミス，トーマス・エム アメリカ合衆国ペンシルベニア州19026、 ドレクセル・ヒル、マーシャル・ロード 4009番 (72)発明者 リフター，ジョン アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02191、ウェレスリー、ベレア・ロード 23番 (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ，233（３），ｐ. 883−889 社団法人日本生化学会編集，「タンパ ク質 ▲Ｉ▼ −分離・精製・性質 −」，第１版第１刷，第311−312頁 Ｙ．Ｓｈｉｂａｔａ，ｅｔ ａｌ．, Ｄｅｎｔｉｓｔｙ ｉｎ Ｊａｐａｎ, ｖｏｌ．28，ｐ．31− Ｊｏｈｎ Ｄ．Ｌａｍｂｒｉｓ ＆ Ｇｅｏｒｇｅ Ｃ．Ｔｓｏｋｏｓ，Ａｎ ｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ 「廣川 生物薬科学実験講座 10巻 免疫と生体防御「▲Ｉ▼」体液性免疫」 平成９年１月10日初版発行 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 30/88 B01D 15/08 C07K 1/16 C07K 14/705 G01N 30/46 A61K 38/00

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】保持された短いコンセンサス重複（SCR）
    構造を有する補体受容体蛋白質あるいは下記の工程によ
    る精製を可能にするのに十分な補体受容体蛋白質特性を
    保持するかまたは有するアロタイプ、対立遺伝子性、末
    端を切断された形態、化学的に修飾された形態もしくは
    融合蛋白質の該補体受容体蛋白質を含有する混合物から
    その＿蛋白質を精製する方法であって、 （ａ）該混合物をカチオンクロマトグラフィー支持体と
    接触させ、該蛋白質を選択的に溶出させ、 （ｂ）工程（ａ）の溶出液を疎水的相互作用クロマトグ
    ラフィー支持体と接触させ、該蛋白質を選択的に溶出さ
    せ、および （ｃ）工程（ｂ）の溶出液をサイズ排除クロマトグラフ
    ィー支持体と接触させ、該蛋白質を選択的に溶出させる ことからなる精製方法であって、該蛋白質が95％以上の
    純度で回収される方法。
  2. 【請求項２】補体受容体蛋白質がCR1および／またはそ
    のフラグメントである請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】補体受容体蛋白質がCR1の可溶性フラグメ
    ントである請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】補体受容体蛋白質が補体受容体１型のトラ
    ンスメンブラン領域の第一アラニン残基以前のLHR−
    Ａ、LHR−Ｂ、LHR−Ｃ、LHR−Ｄ、SCR−29およびSCR−3
    0とトランスメンブラン領域の第一アラニン残基よりな
    る請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】（ａ）カチオンクロマトグラフィー支持体
    が、カルボキシメチル置換セルロース、カルボキシメチ
    ル置換およびスルホプロピル置換架橋デキストラン、カ
    ルボキシメチル置換およびスルホネート置換アガロース
    ビーズ、カルボキシメチル置換エチレングリコール−メ
    タクリレートコポリマーからなる群より選択され、緩衝
    塩溶液を添加して溶出を行い； （ｂ）疎水的相互作用クロマトグラフィー支持体が、炭
    素数２〜８のアルキルアガロース、アリール−アガロー
    ス、アルキル−シリカ、アルキル有機ポリマー樹脂から
    なる群より選択され；および （ｃ）サイズ排除クロマトグラフィー支持体が、架橋ポ
    リアクリルアミドおよびエチレングリコール−メタクリ
    レートコポリマーから選択される； 請求項１または２記載の方法。
  6. 【請求項６】（ａ）カチオン支持体がスルホネート置換
    アガロースビーズであり、緩衝塩が20mM燐酸ナトリウ
    ム、500mM NaCl、pH7.0であり； （ｂ）疎水的相互作用クロマトグラフィー支持体がブチ
    ルエチレングリコール−メタクリレートコポリマーであ
    り、蛋白質が0.09M硫酸アンモニウムを含有する100mM燐
    酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で選択的に溶出され；お
    よび （ｃ）サイズ排除クロマトグラフィー支持体がエチレン
    グリコール−メタクリレートコポリマーであり、溶出を
    10mM燐酸ナトリウム、0.9％w/vNaCl,pH7.0を用いて行う 請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】さらに補体受容体蛋白質を含有する集めた
    フラクションをためる工程を含む請求項５記載の方法。
  8. 【請求項８】補体受容体１型蛋白質またはそのフラグメ
    ントを含有する調整細胞培養培地からその補体受容体１
    型蛋白質またはそのフラグメントを精製する方法であっ
    て、 （ａ）該培養培地を第一カチオン交換クロマトグラフィ
    ーに付し、 （ｂ）工程（ａ）の生成物を硫酸アンモニウム沈殿に付
    し、 （ｃ）工程（ｂ）の生成物を疎水的相互作用クロマトグ
    ラフィーに付し、 （ｄ）工程（ｃ）の生成物をアニオン交換クロマトグラ
    フィーに付し、 （ｅ）工程（ｄ）の生成物を第二カチオンクロマトグラ
    フィーに付し、および （ｆ）工程（ｅ）の生成物をサイズ排除クロマトグラフ
    ィーに付す ことからなる精製方法。
  9. 【請求項９】（ａ）第一カチオン交換クロマトグラフィ
    ーが、カルボキシメチル置換セルロース、カルボキシメ
    チル置換およびスルホプロピル置換架橋デキストラン、
    カルボキシメチル置換およびスルホネート置換アガロー
    スビーズ、カルボキシメチル置換エチレングリコール−
    メタクリレートコポリマーからなる群より選択される支
    持体を利用し、緩衝液溶液を添加して溶出を行い； （ｂ）硫酸アンモニウムが1.2Mの濃度で存在し； （ｃ）疎水的相互作用クロマトグラフィー支持体が炭素
    数２〜８のアルキルアガロース、アリール−アガロー
    ス、アルキル−シリカ、アルキル有機ポリマー樹脂から
    なる群より選択され； （ｄ）アニオン交換クロマトグラフィーが、ジエチルア
    ミノエチル−セルロース、ジエチルアミノエチル−およ
    び第四級アミノエチル−架橋デキストラン、ジエチルア
    ミノエチル−、第四級アミン−アガロースビーズ、およ
    びジエチルアミノエチルエチレングリコール−メタクリ
    レートコポリマーからなる群より選択される支持体を利
    用し； （ｅ）第二カチオン交換クロマトグラフィーが、支持体
    としてカルボキシメチルエチレングリコール−メタクリ
    レートコポリマーを利用し；および （ｆ）サイズ排除クロマトグラフィーが、架橋ポリアク
    リルアミドおよびエチレングリコール−メタクリレート
    コポリマーから選択される支持体を利用する 請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】（ａ）第一カチオン支持体がスルホネー
    トアガロースビーズであり、塩溶液が燐酸ナトリウム、
    500mM NaCl、pH7.0であり； （ｃ）疎水的相互作用クロマトグラフィー支持体がブチ
    ルエチレングリコール−メタクリレートコポリマーであ
    り、蛋白質が0.09M硫酸アンモニウムを含有する100mM燐
    酸ナトリウム（pH7.0）緩衝液で選択的に溶出され； （ｄ）アニオン交換支持体がジエチルアミノエチルエチ
    レングリコール−メタクリレートコポリマーであり；お
    よび （ｆ）サイズ排除クロマトグラフィー支持体がエチレン
    グリコール−メタクリレートコポリマーである 請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】保持された短いコンセンサス重複（SC
    R）構造を有する補体受容体蛋白質あるいは下記の工程
    による精製を可能にするのに十分な補体受容体蛋白質特
    性を保持するかまたは有するアロタイプ、対立遺伝子
    性、末端を切断された形態、化学的に修飾された形態も
    しくは融合蛋白質の該補体受容体蛋白質を調整細胞培養
    培地より精製する方法であって、 （ａ）調整細胞培養培地を濃縮し、 （ｂ）補体受容体蛋白質をカチオンクロマトグラフィー
    支持体上に吸着させ、 （ｃ）吸着した蛋白質を少なくとも１種の緩衝液で洗浄
    し、 （ｄ）洗浄した蛋白質を溶出させ、 （ｅ）該蛋白質を硫酸アンモニウムで沈殿させ、 （ｆ）該沈殿した蛋白質を再び溶解させ、 （ｇ）工程（ｆ）からの溶解した蛋白質を疎水的相互作
    用クロマトグラフィー支持体上に吸着させ、 （ｈ）蛋白質を選択的に溶出させ、 （ｉ）工程（ｈ）からの溶出液をアニオン交換支持体上
    に吸着させ、 （ｊ）該吸着した蛋白質を溶出させ、 （ｋ）工程（ｊ）からの溶出液をカチオン交換支持体上
    に吸着させ、 （ｌ）吸着した蛋白質を溶出させ、 （ｍ）工程（ｌ）からの溶出液をサイズ排除クロマトグ
    ラフィーに付し、および （ｎ）これより蛋白質を回収する ことからなる精製方法であって、該蛋白質が95％以上の
    純度で回収される方法。
  12. 【請求項１２】疎水的相互作用クロマトグラフィーの後
    に、ウイルスを不活化する任意の工程を含む請求項１な
    いし11のいずれか１つに記載の方法。
  13. 【請求項１３】工程（ｂ）のカチオン交換支持体がスル
    ホネート−置換アガロースであり、 工程（ｄ）の溶出液を1.2M硫酸アンモニウムに調節し、 工程（ｋ）＿のカチオン交換支持体がカルボキシメチル
    エチレングリコール−メタクリレートコポリマーであ
    り、 アニオン交換支持体がジエチルアミノエチルエチレング
    リコール−メタクリレートコポリマーであり、 疎水的相互作用クロマトグラフィー支持体がブチルエチ
    レングリコール−メタクリレートコポリマーであり、 サイズ排除クロマトグラフィーがエチレングリコール−
    メタクリレートコポリマーを利用する 請求項11記載の方法。
  14. 【請求項１４】回収工程（ｎ）を最終クロマトグラフィ
    ー工程（ｍ）から得たフラクションを含有する蛋白質を
    溜め、限外濾過により濃縮することで行う、請求項11記
    載の方法。
  15. 【請求項１５】疎水的相互作用クロマトグラフィー溶出
    工程（ｈ）後に、ウイルスが存在するならば、疎水的相
    互作用クロマトグラフィー溶出液を塩基およびグアニジ
    ン塩酸塩で処理することで、該ウイルスを不活化する工
    程を含む、請求項11記載の方法。
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