CN101039964B - 带电多糖的分级 - Google Patents
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Abstract
将多分散并带电的多糖分级为具有低的多分散系数的级分(优选pd<1.1),每个级分含有分子量分布狭窄的种类。将多分散多糖的水溶液与柱中的离子交换树脂接触,然后用水性缓冲洗脱液对多糖进行选择性洗脱。选择性洗脱过程包括依次使用至少三种各自具有不同的且恒定的离子强度和/或pH的缓冲洗脱液,并且后一种缓冲液与之前的缓冲液相比具有较高的离子强度和/或pH。这种新的制备方法特别适用于生产拟用于人类和动物的PSA衍生治疗剂。
Description
本发明涉及将任选具有活性基团的多分散的带电多糖分级为低多分散系数(pd)的级分(优选pd<1.1)。分级的多糖可用于缀合连接底物——例如肽、蛋白质、药物、药物传递系统(例如脂质体)、病毒、细胞(例如动物细胞、微生物、合成聚合物等),或者在药用组合物中用作赋形剂或稀释剂。
聚唾液酸(PSA)是唾液酸的天然存在的非支链聚合物形式,由某些细菌菌株和哺乳动物的某些细胞产生[Roth等,1993]。产生的PSA可为多种聚合度:从n=约80或更多唾液酸残基低至n=2,可由有限的酸水解、神经氨酸酶的消化作用或由来源于细菌或细胞的天然形式的聚合物分级而产生。不同的PSA的组成也彼此存在差异,存在I.均聚物形式,即α-2,8连接的PSA,包括大肠杆菌菌株K1和B组脑膜炎球菌的荚膜多糖,该形式也存在于神经细胞黏附分子(N-CAM)的胚胎形式中。II.杂聚物形式,例如大肠杆菌菌株K92的交替α-2,8α-2,9PSA和脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)的C组多糖。此外,还有III.交替共聚物,含有不同于唾液酸的唾液酸单体,例如脑膜炎奈瑟菌的W135组和Y组。PSA具有重要的生物学功能,包括使免疫系统和补体系统避免致病细菌,以及调节胎儿发育过程中未成熟神经元的神经胶质的黏着性(其中该聚合物具有抗黏着作用)[Muhlenhoff等,1998;Rutishauser,1989;Troy,1990,1992;Cho和Troy,1994]。哺乳动物体内没有已知的PSA受体。大肠杆菌菌株K1的α-2,8连接的PSA也被称为“多聚乙酰神经氨酸”(CA),并用来(为各种长度)示例性说明本发明。
α-2,8连接形式的PSA在细菌多糖中是唯一非免疫原性的(不引起哺乳动物个体内的T细胞或抗体应答),即使与免疫原性载体蛋白缀合时也是如此,这可以表现为其作为哺乳动物(以及细菌)聚合物存在。在广泛分布于体内的细胞表面神经节苷脂中发现了较短的聚合物(n最高为4),并认为该较短聚合物可有效地导致并保持对PSA的免疫耐受性。近些年来,已利用了PSA的生物学特性,特别是α-2,8连接的均聚PSA的生物学特性,以改变蛋白质和低分子量药物分子的药物代谢动 力学性质[Gregoriadis,2001;Jain等,2003;US-A-5846,951;WO-A-0187922]。包括过氧化氢酶和天冬酰胺酶在内的一些治疗性蛋白的PSA衍生物[Fernandes和Gregoriadis,1996和1997]使得循环半衰期大幅度提高,并使得这些蛋白可用于应对预存抗体,所述预存抗体是由于之前暴露于治疗性蛋白而不期望(有时是不可避免)产生的[Fernandes和Gregoriadis,2001]。在很多方面,聚唾液酸化蛋白质的改进的性质与用聚乙二醇(PEG)衍生的蛋白质相当。例如均提高了半衰期,并且蛋白质和肽在蛋白水解消化中更稳定,但采用PSA时生物活性的保持力比PEG更强[Hreczuk-Hirst等,2002]。在采用需要长期给药的治疗剂时使用PEG也存在问题,因为PEG只能非常缓慢地生物降解[Beranova等,2000]并且高分子量形式的PEG易于在组织中积累[Bendele等,1998;Convers等,1997]。已经发现PEG化的蛋白质能产生抗PEG的抗体,该抗PEG的抗体也会影响缀合物在血液循环中的停留时间[Cheng等,1990]。尽管PEG作为与治疗物缀合连接的肠胃外给药聚合物已有一定历史,但仍需对其免疫毒理学、药理学和代谢进行更深入的了解[Hunter和Moghimi,2002;Brocchini,2003]。同样也对PEG在需要大剂量使用的治疗剂中的应用(因此最终导致大剂量的PEG)有所担忧,因为PEG的积累可产生毒性。因此α-2,8连接的PSA成为一种引人关注的PEG替代物,其作为免疫上“不可见”的可生物降解的聚合物自然成为人体的一部分,并且可通过组织神经氨酸酶降解为无毒的糖类——唾液酸。
我们小组在之前的科学论文和授权专利中记载了天然PSA在提高蛋白质治疗物的药物代谢动力学性质中的用途[Gregoriadis,2001;Fernandes和Gregoriadis,1996,1997,2001;Gregoriadis等,1993,1998,2000;Hreczuk-Hirst等,2002;Mital,2004;Jain等,2003,2004;US-A-05846,951;WO-A-0187922]。这里,我们记载了新的PSA衍生物,该衍生物产生新的组合物和制造PSA衍生蛋白质(以及其它形式的治疗剂)的方法。
之前已经对将多糖连接在治疗剂例如蛋白质上的方法有报导[Jennings和Lugowski,1981;US-A-5846,951;WO-A-0187922]。这些方法中的某些方法依靠对聚合物的“非还原”端的化学衍生以生成对 蛋白质有活性的醛部分(图1、2)。在缀合连接过程中为保持蛋白质的构象和PSA的化学完整性需要温和的条件,而PSA(以及其它多糖)还原端在这种温和条件下只具有微弱的与蛋白质反应的活性。唾液酸末端单元的非还原端含有邻位二醇,能够容易地(和选择性地)被高碘酸盐氧化生成单醛衍生物。该衍生物对蛋白质的活性高得多,并且包含可通过还原性胺化和其他化学作用连接到蛋白质上的适合的活性部分。我们之前已在US-A-5846,951和WO-A-0187922中对此有所记载。该反应在图1a和2中进行了示例说明,其中:
1a)显示了使用高碘酸钠氧化CA(来自大肠杆菌的α-2,8连接的PSA)以在末端唾液酸的非还原端生成对蛋白质有反应活性的醛,并且
2)显示了使用氰基硼氢化钠(NaCNBH3)进行席夫(Schiff)碱的选择性还原以与蛋白质氨基基团形成稳定的、不可逆的共价键。
可以利用还原端的弱活性产生有益效果(通过破坏非还原端,使还原端封端并使用二官能交联剂进行衍生),从而避免现有方法(图1a)产生图1b中所示的复杂产物,所述现有方法为使用高碘酸盐氧化的CA对蛋白质进行还原性胺化。
市售聚合物(尤其是天然聚合物,例如多聚乙酰神经氨酸(CA);在多数上述论文中采用)由细菌产生并且高度多分散。这些聚合物可能还含有细菌污染物例如内毒素、盐等。这种材料可能不适用于生产拟用于人类和动物的PSA衍生治疗剂,由于医学道德准则和管理机构(例如FDA、EMEA)的安全要求,在该治疗剂中对药物体的化学和分子上的限定非常重要。
因此我们通过开发出新的将多分散多糖制剂分级为一系列低多分散性(<1.1pd)级分的方法解决了上述问题,所述每个低多分散性级分都包含分子量分布范围狭窄的种类。这些新的制备方法特别适用于制造拟用于人类和动物的PSA衍生治疗剂,其中由于医学道德准则和管理机构(例如FDA、EMEA)的安全要求,在该治疗剂中对药物体的化学和分子上的限定非常重要。
离子交换色谱法是本领域已知的用于分离复杂混合物的方法。一般来说,现有技术通过离子强度的变化达到分离目的。在完全解离的电解质溶液中,离子强度(I)定义为I=0.5∑iCiZi 2,其中Ci为特定离子的浓 度,Zi为该离子种类的电荷数。
Constantino等,[1999]报导了一种适用于从带负电的多糖多分散制剂中分离高分子量级分的色谱方法,所述带负电的多糖例如b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)抗原以及A组和C组脑膜炎奈瑟菌抗原。所获得的物质仍然含有分子量分布较宽的种类(即仍为高度多分散的),但已不含小分子低聚糖。低聚糖的去除使该材料更适用于基于多糖的疫苗。低分子量种类的去除通过两步洗脱过程实现。简单来说,将带负电的多糖Hib(b型流感嗜血杆菌抗原)结合到离子交换树脂上,通过使用低离子强度的缓冲液充分冲洗将低分子量的种类洗脱。仍保留在柱上的中等分子量和高分子量的种类通过用高离子强度的缓冲液洗脱而进行回收。
Zhang等(1997)报导了使用高效离子交换色谱进行多聚乙酰神经氨酸聚合物的分离。将三种母液混合以形成硝酸钠浓度逐渐升高的线性梯度。
本发明与Constantino等和Zhang等所公开内容的区别在于使用分级梯度而不是线性梯度洗脱。Constantino等使用大量低离子强度的冲洗液从柱上去除所有低分子量的种类,然后再使用大量高离子强度的冲洗液从柱上去除全部其他种类。这种方法不能分离出低多分散性的级分。使用本发明的分级梯度使得能够分离为低多分散性的级分,所述分级梯度彼此仅在离子强度上有微小差别。
Ravenscroft等,[1999]开发了一种使用离子交换色谱(IEC)测定低分子量Hib低聚糖的分子量的方法。离子交换为DP(聚合度)值为10或更低的小分子低聚糖提供了很好的分离度。这一点被用于通过离子交换将低聚物混合物分离为单独的低聚物。用质谱法测量DP值,然后将纯化的低聚糖用作标准物标定离子交换柱,从而使得能够使用分析型离子交换测定小分子低聚糖的分子量。
本发明以高收率制得可用于制造药用蛋白质-聚合物缀合物的低多分散性多糖级分。现有技术中没有记载用这种方式将多糖分级的技术。
本发明提供了一种将带离子电荷的多分散多糖分离为具有不同平均分子量的级分的方法,其中将多分散多糖的水溶液与柱中的离子交换树脂接触,然后用水性缓冲洗脱液对多糖进行选择性洗脱,并从洗脱的 各部分中回收多糖,其特征在于选择性洗脱包括用至少三种缓冲洗脱液依次冲洗柱中的树脂,所述至少三种洗脱液各自具有不同的且恒定的离子强度和/或pH,并且第二种缓冲液和其后的缓冲液与相邻的前一种缓冲液相比具有较高的离子强度和/或pH。
在本方法中,优选所有的缓冲洗脱液具有相同的pH值,但具有由升高的离子浓度所产生的逐渐升高的离子强度,所述离子例如强无机酸和强无机碱的盐的离子。所述盐优选为氯化钠。离子强度的升高量优选与NaCl浓度升高5-100mM、优选升高25mM所产生的离子强度升高量相同。这对应于离子强度升高0.005至0.1M,优选0.025M。
或者,缓冲洗脱液也可具有逐渐升高的pH值。优选各洗脱液之间的pH之差是相同的,优选为0.2pH单位。每种缓冲液的pH优选在7.4-13的范围内。一般地,第一种缓冲洗脱液具有7.4左右的pH值并且在本方法中至少使用5步洗脱。理想的是所有缓冲洗脱液的离子强度小于25M。缓冲液中的氢离子和氢氧根离子的浓度足够低以保证它们对溶液的总离子强度的贡献可被忽略。
在本分级方法中离子强度的增加和pH的增加可先后使用。可选择地,首先在一系列步骤中进行pH洗脱,将pH从7.4提高到至少8.8,然后再开始离子强度洗脱。作为另一种可选的方案,可以在一个小的盐梯度之后提高pH,但这需要大于7.4的起始pH。当使用强离子交换柱时可在低pH范围(4左右)进行分级。但是由于很多多糖在此pH下不稳定,因此这种情况下洗脱的级分的pH应被立刻调节到7.4左右。
优选缓冲洗脱液含有碱,该碱优选为三乙醇胺。
可以存在起始洗脱步骤,其中使用低离子浓度的缓冲洗脱液冲洗柱子。例如,该起始洗脱步骤可使用盐浓度比本发明使用的三种基本缓冲洗脱液中第一种的盐浓度低100mM以上的缓冲液。这种起始步骤可洗出低分子量的污染物或其他作为天然材料回收过程副产物的污染物。这种起始洗脱步骤可使用至少1个柱体积、优选至少1.5个柱体积的洗脱液,所述柱体积以离子交换树脂柱的体积计。应指出离子交换树脂柱可具有大于高度的横截面直径,或者可象传统柱那样具有大于横截面直径的高度。体积可为1至5000mL。柱高度可为1cm至5000cm。横截面积可为1cm2至5000cm2。横截面可为任何形状,但优选为圆形。
我们发现优选每个基本洗脱步骤使用至少1.0、优选至少1.25、最优选至少1.5个柱体积的各种缓冲洗脱液。优选使用不大于3个柱体积的缓冲洗脱液。对于75ml的基质,优选使用7ml/分钟的流速。
本发明的方法优选包括至少5个、例如多达20个、或者通常为6至12个用离子强度逐渐升高的缓冲洗脱液进行的连续洗脱步骤。所述基本洗脱步骤中的第一步的离子强度通常在1mM至1M范围内。较强的反荷离子应具有较弱的离子浓度,例如硫酸根离子与氯离子相比。
优选通过改变强无机酸和强无机碱的盐浓度来改变缓冲洗脱液的离子强度,所述盐优选为氯化钠。
关于回收步骤,其通常包括将多糖与盐分离的步骤,该分离步骤例如使用膜,例如超滤膜。该步骤可对多糖进行浓缩以形成浓度更高的溶液。该溶液可进行另外的膜处理步骤,例如连续超滤或其他过滤步骤。缓冲洗脱液可能含有挥发性酸或碱,在这种情况下,回收包括从洗脱级分中挥发掉挥发性酸或碱。虽然可以通过沉淀技术从水溶液中回收多糖,例如使用多糖的非溶剂进行沉淀,但优选不使用这种溶剂,因为这会导致最终从相应的溶剂中进行分离更加困难。因此最终回收步骤优选包括将水蒸发,并且优选将洗脱步骤残留的所有挥发性缓冲成分蒸发。在存在三乙醇胺的优选情况下,三乙醇胺阳离子和乙酸阴离子均为挥发性的,可容易地通过真空去除。
最后可通过干燥、优选减压干燥将多糖从溶液中分离出来。优选通过冻干来实现。
沉淀法、优选使用非溶剂的沉淀法,可作为分级的预备步骤实施,以去除一部分物质并降低较高分子量级分的多分散系数。优选使用乙醇示差沉淀(differential ethanol precipitation)。
这里所述的本发明为分级梯度方法的应用,该应用使得能够从结合在离子交换树脂上的多分散聚合物整体中逐步移出(并在之后进行收集)分子量逐渐增加的种类。离子交换树脂可为任何强或弱的阴离子或阳离子交换介质。使用任何给定离子强度的冲洗液可从柱上洗脱多种种类的复杂集合。通过依次使用一系列较短的冲洗液,每一步骤洗脱总体物质的一部分,而总体物质将在下一步骤被洗脱,因此在每一点实际上只洗脱出一小部分物质,从而使得能够将多分散制剂分级为多分散性较 窄的级分。这种方法还可能有助于去除杂质,例如盐、内毒素等。
在IEC中,在较低盐浓度下,分子并不保持绝对静止。它们极其缓慢地呈带状移动。其速度取决于分子对柱子的结合常数,该结合常数随离子强度变化。当结合常数例如为中等大小时,谱带通过柱子的移动相对较慢并有一定程度的展宽。当结合常数较弱时,谱带移动非常快但其展宽可忽略。当结合常数较强时,谱带移动非常缓慢,多数情况下有展宽。线形梯度可防止展宽,可得到较窄的谱带和边界清楚的峰。另一方面,分级梯度将特定浓度下具有低结合常数的分子以紧密谱带的形式洗出,并将具有中等结合常数的分子以扩散谱带(可能延及至下一级分中)的形式洗出。具有高结合常数的分子移动很小并且其大多为较宽谱带。结果是每一步骤得到一个上升非常迅速然后缓慢下降产生拖尾的峰。已经充分证明了分级梯度表现为这种形式。峰的上升部分包含多数具有低结合常数的种类,拖尾部分包含多数具有中等结合常数的种类(也会延及至下一级分)。每一步进行得越长,越可能导致中等结合常数的种类的谱带展宽并最终导致其中一些被洗出,并使留在柱中的较高结合常数的种类富集。因此分级梯度也会洗出下述种类,所述种类在线性梯度下会在较高离子强度下洗出并导致甚至更高谱带的偏移。尽管这对分离度没有帮助,但却有利于分级。如果两种种类具有非常接近的结合常数,分级梯度可以为具有较高结合常数的种类提供纯化或富集作用。第一步骤将两种物质均洗脱出来,但更优先洗出结合常数较低的物质。第二步骤将两种物质均洗脱出来,但由于结合常数低的物质中的多数已在前一步骤中被去除,因此该级分主要为具有高结合常数的物质。因此,尽管分级梯度不能完全分离具有相近结合常数的物质,但可以实现结合常数较高的物质的显著富集。
以CA为例,结合常数是分子平均电荷的结果。结合常数的差异取决于不同物质的电荷差异。具有41个电荷的物质和具有40个电荷的物质之间的电荷比与具有11个电荷的物质和具有10个电荷的物质之间的电荷比相比要小得多。随着电荷量增加(并因此)单体量增加,结合常数之间的差异减小。当分子量较大时,该差异实际可忽略。
因此线性梯度可获得低分子量种类的良好分离度,但随着分子量升高(因此电荷增加),分离度下降。相对地,分级梯度方法的每次冲洗 都洗出比高分子量物质更多的低分子量物质。因此分级梯度可在分子量范围中较高一端获得较低分散级分,在分子量范围的中部和起始端获得较高分散级分。
一些参数可影响分离。
1)pH:聚合物上的电荷与pH相关;降低pH可使电荷减少并在分子量范围的较高一端获得较好的分离度。
2)分级冲洗体积:冲洗体积越大,较高分子量种类的回收量越少,但其多分散系数越低。
3)洗脱步数:洗脱步数也是一个重要参数。略过先前几步会导致每个级分的平均分子大小的降低以及多分散系数的升高,该升高程度随分子量增加而越来越不明显。如果使用更多步骤,可以提高多数级分的分离度,但会降低每个级分中CA的平均量。
4)温度。较低温度可提高结合强度并可降低每个级分中洗出的分子的大小。
本发明中,多分散多糖可为天然存在的多糖、其水解产物或上述二者的官能化衍生物。本发明特别用于分离天然存在的多糖,例如细菌多糖,例如多糖抗原。本发明特别用于分离唾液酸聚合物和共聚物,例如聚(2,8-连接唾液酸)、聚(2,9-连接唾液酸)或交替的2,8-2,9-连接PSA。优选多糖为多聚乙酰神经氨酸(CA)或其氧化物、还原物、胺化物和/或酰肼衍生物。
多分散多糖分子量的多分散系数(即重均分子量除以数均分子量)应至少为1.1,优选至少为2.0。我们发现本方法可特别用于当多分散多糖的重均分子量至少为1kDa、优选为至少10kDa、再优选为至少100kDa的情形。
本方法可用于制造多分散系数非常低的多糖级分。例如,从洗脱级分中回收的多糖产品优选具有小于1.5的多分散系数,最优选小于1.25,例如为1.1或更低。我们发现可以获得低至1.01左右的多分散系数。
优选多糖原料具有至少1、更优选至少5、更优选至少10个糖单元,例如至少50个糖单元。优选多糖为含有以α(2,8)或α(2,9)彼此连接的唾液酸单元的聚唾液酸(PSA)。
对于待分级的多分散多糖的大小没有具体的上限。但对于PSA,我们发现多数的有用聚合物具有最高至150kDa的重均分子量。
PSA可为任何来源,优选来自天然来源例如细菌来源,例如大肠杆菌K1或K92、B组脑膜炎球菌,或者甚至为牛奶或N-CAM。唾液酸聚合物可以为杂聚物,例如脑膜炎奈瑟菌的135组或V组,或者可以为合成的聚合物。PSA可以为盐或游离酸形式。可以为水解形式,即从细菌来源中回收后降低其分子量。PSA可为分子量宽泛分布的物质,例如多分散系数大于1.3(例如高达2或更大)的物质。优选分子量的多分散系数小于1.2,例如低至1.01。
以下说明描述了本发明的方法对多糖PSA的优选实施方式,本发明特别适用于所述多糖PSA。
具有宽泛的分子量分布的PSA总体可被分级为一些具有低多分散系数的级分,即分为具有不同平均分子量的级分。分级过程优选为使用适合的碱性缓冲液进行洗脱的阴离子交换色谱过程。当多糖具有羧酸基团时,特别需要进行阴离子交换。我们发现了适合的阴离子交换介质;一种制备的介质,例如基于活性琼脂糖的强离子交换材料,该材料具有季铵离子侧基(即强碱)。介质的选择取决于分级过程是通过pH还是离子强度,并且对于本领域技术人员来说是显而易见的。缓冲洗脱液是无反应活性的,并且优选为挥发性的,从而使得可以通过蒸发从每个级分的碱中回收需要的产物。适合的实例为胺,例如三乙醇胺。回收过程可以为例如冻干。分级方法适用于PSA原料以及其衍生物。因此本技术可用于下述文献所述相关发明中的基本处理步骤之前或之后,所述文献为PCT/GB 04/03488、同一天提交的申请(代理机构案号:HMJ03971)中以及同一天提交的申请(代理机构案号:HMJ03871),其中我们描述了聚唾液酸的各种衍生反应以及其中形成的中间体。
据信这是IEC首次用于分级分子量约5kDa以上的离子多糖,特别是具有这样的分子量的PSA。
本发明另一方面提供一种使用IEC对分子量高于5kDa的离子多糖进行分级的方法,该方法使用碱或酸的缓冲洗脱液,该碱或酸优选为挥发性的。
多糖优选具有羧酸基团,离子交换优选为阴离子交换。缓冲洗脱液 优选含有胺,更优选含有三乙醇胺。最优选通过干燥从级分中回收多糖,优选在减压下干燥,最优选为冻干。
本方法可用于对具有在水中稳定的活性部分(马来酰亚胺或碘乙酸盐等)的CA以及其他天然荷电聚合物(例如硫酸葡聚糖)和合成荷电聚合物(例如聚谷氨酸、多熔素、透明质酸)进行分级。阳离子交换色谱和阴离子交换色谱均可以使用盐梯度或pH梯度用于分级荷电聚合物。
据信这也是首次使用IEC与沉淀技术和/或超滤方法相结合用于分离离子多糖。
IEC方法可去除残留在市售PSA和CA中的副产物,例如内毒素。
离子对色谱和疏水相互作用色谱也可用于对聚合物和蛋白质-聚合物缀合物进行分级。
本发明中提供一种新的生产一系列具有窄的多分散系数(pd<1.1)的多糖制剂(级分)的方法,所述多糖优选PSA化合物(天然的或经过活化的),其中高度多分散的、带负电的原料结合在阴离子交换树脂上,各级分采用一系列较短的冲洗液洗脱,每种冲洗液具有逐渐升高的离子强度。
在一种可替代的实施方式中,可分别通过阳离子交换色谱或阴离子交换色谱将带+ve电荷和-ve电荷的宽泛分布的聚合物和蛋白质-多糖缀合物分级。
本发明另一方面提供一种使用与上述相同的IEC和分级梯度方法将聚唾液酸化的大分子分级为具有窄的多分散系数的制剂的新方法,所述聚唾液酸化大分子由于缀合连接在大分子上的聚唾液酸原料的多分散性而为多分散的。
在本方法中,优选对聚唾液酸化大分子(为例)的分级过程的参数(例如基质的用量,上样量、温度、流速、梯度等)进行优化,其中所述分级过程使用与上述相同的IEC和分级梯度方法将聚唾液酸化大分子分级为具有窄的多分散系数的制剂,所述聚唾液酸化大分子由于缀合连接在大分子上的PSA原料的多分散性而为多分散的。这些步骤实施的条件使得基本不对长链(聚合物)原料的骨架进行链中分割,即没有发生显著的分子量减少。
窄分散的多糖可用于生成活性基团。例如,醛基适用于缀合连接至含有胺基团的底物或肼化合物上。描述了其中氧化步骤的活性产物随后缀合连接到底物化合物上的方法。优选地,缀合连接反应(如上述我们较早的出版物中所述)包括将PSA与胺缀合连接以形成席夫碱,优选之后进行还原以形成仲胺部分。本方法特别有利于蛋白质的衍生,所述蛋白质中胺基基团适宜地为赖氨酸基团的ε胺基基团或N-末端氨基。本方法特别有利于蛋白质或肽的治疗活性剂的衍生,所述蛋白质或肽的治疗活性剂例如细胞因子、生长激素、酶、激素、抗体或片断。图1和图2显示了这种反应的反应路线,其中多糖为PSA。
或者,本方法还可以用于药物递送系统例如脂质体的衍生,例如通过使醛与脂质体构成成分的胺基团反应而实现。其他药物递送系统在我们较早的申请US-A-5846951中有记载。其他可进行衍生的材料包括病毒、微生物、细胞——包括动物细胞,以及合成聚合物。
或者,底物也可具有肼基团,这种情况下产物为腙。如果需要增加稳定性,也可将其还原为烷基酰肼。
蛋白质和药物递送系统的衍生可获得半衰期的增加、稳定性的提高、免疫原性的降低和/或对溶解度的控制以及由此的对生物利用度和药物代谢动力学性质的控制,或者可提高活性物质的溶解度或改善含有衍生的活性物质的溶液的粘度。
优选地,从洗脱级分中回收的多糖化合物包含唾液酸单元,最优选其由唾液酸单元组成。更优选多糖具有1-1000个唾液酸单元,例如10-500个,更优选具有10至50个唾液酸单元。洗脱级分可由单体、二聚体或更大的聚合物组成。优选地,级分的多分散系数小于1.26,理想地为小于1.2,理想地在1.01至1.10的范围内。
据信这是首次分离出分子量多分散系数低于1.26的聚唾液酸、特别是CA。因此,本发明的另一方面提供分子量多分散系数低于1.26、优选不高于1.2、最优选在1.01至1.10范围内的聚唾液酸。聚唾液酸可以是CA,或者其氧化物、还原物、胺化物和/或酰肼衍生物。优选地,聚唾液酸具有至少5kDa、优选至少10kDa的分子量。
我们这里所述的分级方法为可线性缩放的并且具有可再现性。它适用于工业规模生产和控制CA的多分散系数。这里所述的分级技术使得 可以将CA以及其他多糖(优选为带电的)、蛋白质-聚合物缀合物和疫苗进行分级,将其制备为均匀的(单分散的)聚合物链长度。
图1a为显示单官能CA的制备的反应路线图;
图1b为显示使用早前缀合连接方法制备产物的反应路线图;
图2为显示蛋白质-CA缀合物的制备的反应路线图;
图3显示了CA的凝胶渗透色谱的结果;
图4显示了不同的CA级分的%量;
图5显示了带分子量的CA的典型非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE);
图6显示了CA(22.7KDa;pd1.34)的native-PAGE;
图7显示了CA级分的典型色谱图;
图8显示了来自不同分级步骤的CA样品;
图9显示了不同量的CA样品的上样情况;
图10显示了CA的分级(150mg CA;5ml基质);
图11显示了CA的分级(200mg;5ml);
图12显示了CA-NH2的分级;
图13显示了氧化的CA(22.7KDa)的阴离子交换色谱;
图14显示了单官能的CA的阴离子交换色谱;
图15显示了宽分散和窄分散的聚合物的蛋白质-聚合物缀合物制剂的SDS PAGE;
图16显示了阴离子交换色谱对CA进行分级与过滤法对CA进行分级的native-PAGE结果对比;
图17显示了通过乙醇沉淀对CA进行分级的情形;
图18显示了通过超滤对CA进行分级的情形;
图19显示了GH-CA缀合物的阴离子交换色谱;
图20显示了CA(35KDa)的NMR表征;
图21显示了CA(39kDa;pd1.4)的大规模IEC分级的%量;
图22显示了CA(39kDa;12.5g)的IEC级分的native-PAGE;
图23显示了CA(39kDa;pd1.4)的小规模IEC分级的%量;
图24显示了CA(39kDa;200mg)的IEC级分的native-PAGE;
图25显示了窄分散CA的典型GPC色谱图;
图26显示了CA的native-PAGE分析的优化;
图27显示了由IEC获得的CA级分的native-PAGE;
图28显示了使用递增的三乙醇胺离子强度获得的CA(22.7kDa)的IEC级分的native-PAGE;
图29显示了使用递增的三乙醇胺乙酸盐离子强度对CA(22.7kDa)进行Q FF分级的native-PAGE;
图30显示了使用pH梯度体系进行CA(22.7kDa)的DEAE分级的native-PAGE。
通过所附的实施例进一步说明本发明。
实施例
材料
由英国Sigma Chemical Laboratory获得碳酸铵、乙二醇、PEG(8KDa)、氰基硼氢化钠(纯度>98%)、偏高碘酸钠、三乙醇胺、氯化钠、硝酸钠、叠氮化钠、PBS片剂以及分子量标准参照物。所用的CA为线性α-(2→8)连接的大肠杆菌K1 PSA(平均分子量22.7kDa,高多分散系数1.34;39kDa,p.d.1.4;11kDa,p.d.1.27),来自爱尔兰的Camida。其他材料包括2,4二硝基苯基肼(2,4DNPH)(AldrichChemical Company,英国)、透析管(3.5kDa和10kDa截留范围(cutoff limit);Medicell International Limited,英国)、琼脂糖SPHiTrap、PD-10柱(Pharmacia,英国)、Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(4-20%)、Tris-甘氨酸十二烷基硫酸钠运行缓冲液和加样缓冲液(Novex,英国)、琼脂糖Q FF和DEAE(Amersham Biosciences,英国)、Tris-硼酸盐-EDTA(TBE)聚丙烯酰胺凝胶(4-20%和20%)、TBE缓冲液和加样缓冲液(Invitrogen,英国)。去离子水从Elgastat Option 4水净化设备(Elga Limited,英国)获得。所用的全部反应试剂为分析级。平板读取器(plate reader)(Dynex Technologies,英国)用于蛋白质或CA检测的光谱测定。
方法
蛋白质和多聚乙酰神经氨酸的测定
PSA(作为唾液酸)的定量测定通过别处[Gregoriadis等,1993;Fernandes和Gregoriadis,1996,1997]所述的间苯二酚方法[Svennerholm 1957]进行。蛋白质通过双金鸡宁酸(bicinchoninicacid,BCA)比色法检测。
实施例1:单官能PSA的制备:
1a CA的活化
20℃下将新制备的0.02M偏高碘酸钠(NaIO4;相对于CA过量6倍摩尔数)溶液与CA混合,将反应混合物避光磁力搅拌15分钟。用70%(最终浓度)的乙醇将氧化的CA沉淀并将混合物在3000g下离心20分钟。去除上清液,将颗粒物用最小量的去离子水溶解。再用70%的乙醇将CA沉淀,然后在12,000g下离心。将颗粒物用最小量的水溶解,冻干并在-20℃下储存直至下一步使用(图1;步骤1)。
1b CA的还原
在硼氢化钠的存在下将氧化的CA(CAO;22.7kDa)还原。20℃下将新制备的15mM硼氢化钠(NaBH4;溶于0.1M NaOH中,用稀H2SO4溶液稀释到pH 8-8.5)与CAO(100mg CA/ml)混合,将反应混合物避光搅拌最多2小时。反应结束时pH降至7。4℃下用pH7的0.01%碳酸铵缓冲液将氧化的/还原的CA(CAOR)进行透析(透析管的截留分子量为3.5kDa)。使用超速离心将来自透析管的CAOR溶液浓缩。将滤液冻干并在4℃下保存直至下一步需要。醛含量的测定如“CA氧化的测定”中所述进行(图1;步骤2)。
1c CA的再氧化
确定不存在醛成分后,按照“CA的活化”中所述的方法将CAOR再氧化,除了区别在于CAOR在高碘酸盐溶液中培育更长时间(直至1小时)。也对这一步骤中获得的冻干粉末进行CAORO产物的氧化程度测量(图1;步骤3)。
1d CA和衍生物的氧化级的测定
用2,4DNPH进行多聚乙酰神经氨酸氧化程度的定性测量,2,4DNPH通过与羰基化合物相互作用获得难溶的2,4二硝基苯基腙。将非氧化态(CA)、氧化态(CAO)、还原态(CAOR)和再氧化态(CAORO)(每种 5mg)加入至2,4-DNPH反应试剂(1.0ml)中,振荡溶液然后将其在37℃下静置直至观察到晶体沉淀[Shriner等,1980]。CA的氧化程度(定量)通过其原理基于碱溶液中的铁氰化物离子还原为亚铁氰化物(波斯蓝)的方法[Park和Johnson,1949]测量,然后在630nm下进行测量。在这种情况下,葡萄糖被用作标准物。
1e CA-NH2的制备
将CAO(10-100mg/ml)以及300倍摩尔数过量的NH4Cl在50ml的试管中溶于2ml去离子水,然后将NaCNBH4(5M的母液溶于1N NaOH(水溶液)中)以5mg/ml的最终浓度加入。在室温下将混合物培育3天。用多聚乙酰神经氨酸代替CAO进行对照反应。通过加入5ml冰冷的乙醇将产物多聚乙酰神经氨酸胺衍生物沉淀。通过在台式离心机中在4000rpm的转速下室温离心30分钟从而将沉淀物回收。保留颗粒物并将其重新悬浮于2ml去离子水中,然后在10ml超速离心管中再次使用5ml冰冷的乙醇进行沉淀。通过在室温下在30,000rpm的转速下离心30分钟从而收集沉淀物。将颗粒物再次重新悬浮在2ml去离子水中并冻干。
1f胺含量的检测
采用TNBS(苦基磺酸,即2,4,6-三硝基苯磺酸)检测测定产物中存在的氨基基团的数量[Satake等,1960]。在微量滴定板的孔中将TNBS(15mM的TNBS 0.5μl)加入至90μl pH为9.5的0.1M硼酸盐缓冲液中。向上述混合物中加入10μl 50mg/ml的CA-酰胺溶液。将板在室温下静置20分钟,然后在405nm下读取吸光度。使用甘氨酸作为标准物,浓度范围为0.1至1mM。TNBS将伯胺基团三硝基苯基化。可检测到胺的TNP加合物。使用TNBS检测法对用冷乙醇沉淀纯化过两次的产物进行检测,显示出接近90%的转化率。
1g马来酰亚胺聚合物(CA-M)的制备
20℃下使上述实施例1c中合成的CAORO与5摩尔当量的N-[β-马来亚酰胺基丙酸]酰肼在0.1M乙酸钠中反应2小时。在乙醇中将产物腙沉淀,将其重新悬浮在乙酸钠中并再次用乙醇沉淀,然后将其重新溶于水并冻干。产物可用于与蛋白质和肽中的半胱氨酸部分的硫醇基团进行位点专一性缀合连接。
1h凝胶渗透色谱法
将CA样品(CA、CAO、CAOR和CAORO)溶解在NaNO3(0.2M)、CH3CN(10%;5mg/ml)中,使用2×GMPWXL柱进行色谱分析检测折光率(GPC系统:VE1121 GPC溶剂泵、VE3580 RI检测器,使用Trisec3软件(Viscotek Europe公司)进行检验)。样品(5mg/ml)用0.45μm尼龙膜过滤,流动相为0.2M NaNO3和CH3CN(10%),流速为0.7cm/min(图3)。
实施例1的结果:单官能PSA的制备
通过GPC分析高碘酸盐和硼氢化物处理后内部的α-2,8连接的Neu5Ac残基的完整性,将获得的氧化态(CAO)、氧化还原态(CAOR)、二次氧化态(CAORO)、氨基CA(CA-NH2)物质的色谱图与天然CA的色谱图进行比较。发现(图3)氧化态(15分钟)(CAO)、还原态(CAOR)、二次氧化态(1小时)(CAORO)和天然CA显示出几乎相同的洗脱曲线,没有证据表明后续的氧化步骤和还原步骤对聚合物链有显著的断裂作用。小峰代表缓冲盐。
使用铁氰化物对二次氧化过程中的CA中间体进行定量检测的结果与使用2,4DNPH进行的定性检测的结果一致,从而在室温下反应十分钟后获得深黄色沉淀;其中使用2,4DNPH检测时与天然CA获得淡黄色沉淀,与含醛形式的聚合物获得深黄色沉淀。
通过2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)检测发现聚合物中的胺化物含量为85%。PSA醛衍生物也可与具有酰肼部分和N-马来酰亚胺部分的连接化合物反应生成具有活性马来酰亚胺的稳定的腙,所述活性马来酰亚胺能与硫醇基团反应。通过马来酰亚胺检测发现聚合物的马来酰亚胺含量为95%。
实施例2-通过IEC对多聚乙酰神经氨酸(CA,22.7KDa,pd1.34)进行分级
2.1大规模分级
用900ml琼脂糖Q FF(Amersham Biosciences,英国)填充XK50柱(Amersham Biosciences)并用3个柱体积的缓冲冲洗液(20mM三乙醇胺;pH 7.4)以50ml/min的流速进行平衡。通过注射器孔以每分钟 50ml的量将CA(25克溶于200ml缓冲冲洗液)上样到柱上。然后用1.5个柱体积(1350ml)的缓冲冲洗液对柱进行冲洗。
用1.5柱体积的不同缓冲洗脱液(三乙醇胺缓冲液,20mM,pH7.4,以级之间25mM NaCl的步长从0mM变化到475mM NaCl)将结合的CA洗脱,最终用溶有1000mM NaCl的相同缓冲溶液洗脱以移出所有残留的CA和其他残留物(如果存在)。流速为7ml/min。
通过高压超滤使用3-10kDa的膜(Vivascience,英国)将样品浓缩到20ml。在4℃下通过重复超滤将这些样品从缓冲液中交换到去离子水中。通过GPC(如实施例1h中所述)和native-PAGE(用爱茜蓝染色)分析这些样品的平均分子量和其他参数[表1和2;图4、5、6]。
实施例2.2:中等规模和较小规模的分级
以较小规模(1-75ml基质;0.2-3克多聚乙酰神经氨酸)使用相同的冲洗液和梯度体系对以下样品进行分级:
从头至尾监测所产生的CA(CA,22.7kDa,pd1.34;CA,39KDa,pd1.4)、CAO(CAO,22.7kDa,pd1.34)、单官能CAO(RO,22.7kDa;pd1.34)、CA-NH2(22.7kDa,pd1.34)、CAM(按照实施例1g)。
用20mM高碘酸盐将使用上述步骤产生的CA的窄分散级分氧化,并用凝胶渗透色谱(GPC)和native-PAGE分析聚合物的总体变化(图7、8)。
实施例2的结果:大规模、中等规模和小规模的分级
成功地将CA及其衍生物(22.7kDa)分级为各种多分散系数小于1.1的、平均分子量最高为46kDa的、%量不同的窄分散分子种类(表1-2和图4-8)。表1显示了在75ml规模对22.7kDa的材料进行分级的结果。图7为GPC结果,图4-6为CA级分的native-PAGE。
表1:IEC(22.7KDa;75ml基质;3g CA)
缓冲洗脱液(20mM 三乙醇胺缓冲液+mM NaCl, pH7.4) | 分子量 | Pd | %量 |
325mM | 12586 | 1.091 | 77.4% |
350mM | 20884 | 1.037 | 3.2% |
375mM | 25542 | 1.014 | 5.0% |
400mM | 28408 | 1.024 | 4.4% |
425mM | * | * | 7.4% |
450mM | 43760 | 1.032 | 2.3% |
475mM | 42921 | 1.096 | 0.2% |
*未实施
表2:CA的阴离子交换色谱(22.7KDa;pd1.34):大规模(900基质)
样品(20mM 三乙醇胺缓冲液 +mM NaCl, pH7.4) | 分子量(Pd) 12.5g批量 | 分子量(Pd) 25g批量 |
350mM | 15490(1.008) | 10.470(1.173) |
375mM | 19960(1.010) | 24659(1.019) |
400mM | 25829(1.019) | 29573(1.018) |
425mM | 33763(1.023) | 34160(1.011) |
450mM | 46880(1.058) | 44400(1.013) |
475mM 400+425mM(混合) | - 26418(1.082) | 28500(1.376) - |
该方法可在1ml至900ml基质之间缩放,而每种规模的分级曲线几乎相同(未显示全部结果)。
对较大聚合物(CA,39kDa,pd1.4)的分级产生最高至90kDa的分子种类。本方法可成功地用于对更大批量的聚合物进行分级。图8显示了所提供的3种CA样品的native-PAGE结果以及表3中所分析的离子交换所分离的级分的native-PAGE结果。PAGE结果显示了离子交换所得的级分分散狭窄。这与图7中所示的GPC数据一致,显示了由22.7kDaCA分离出的三个级分的结果(表3)。
表3
样品 | MW | Mn | PD |
1 2 3 | 18727 27677 40950 | 15016 25095 40279 | 1.25(初始CA) 1.10(分级的CA) 1.02(分级的CA) |
更大规模地分离22.7kDa材料。使用GPC分析离子交换获得的级分。
所有窄分散的级分均成功地被20mM高碘酸盐氧化,对生产过程中不同阶段取样并进行GPC分析和native-PAGE分析,结果显示在分子量和多分散性上没有差别。一些样品的数据如图8所示。
实施例3影响CA分级的因素
研究了影响CA分级的各种因素(例如冲洗体积等)[图7-14]。
实施例3的结果:影响CA分级的因素
研究了影响CA分级的各种因素。通过向柱上(5ml基质)装载50、100、150和200mg CA进行了结合性研究。使用200mg CA时,99%以上的CA结合到柱上(图9)。当使用一个柱体积的缓冲洗脱液对柱进行分级梯度冲洗时,发现聚合物的多分散系数大于1.1(图11)。用1.5个柱体积对柱进行冲洗时得到多分散系数低于1.1的CA级分(图10)。
氨基CA(CA-NH2;图12)、氧化的CA(图13)和单官能CA可成功地被分级为多分散系数为1.1的级分。
实施例4-生长激素(GH)-CA缀合物(宽分散和窄分散)的合成
将CAO(22.7kDa)和对照实施例2制备的窄分散CAO(27.7kDapd=1.09;40.9kDa,pd=1.02)用于GH缀合物的制备。
生长激素-CA缀合物的制备
将生长激素溶于0.15M的PBS(pH7.4)中并共价连接于不同的CA(CAO和NCAO)上。以CA∶GH摩尔比(12.5∶1)分别将不同的CA(22kDa,CAO;27.7kDa & 40.9kDa,NCA)加入GH(2mg)中,以4mg/ml的最终浓度加入氰基硼氢化钠。将反应混合物密封并在35±2℃下磁力搅拌24小时。然后通过持续搅拌下缓慢加入硫酸铵((NH4)2SO4)至达到70%w/v饱和度从而使混合物盐沉淀,4℃下搅拌1小时,然后旋转(5000×g) 15分钟,将颗粒物重新悬浮在饱和(NH4)2SO4溶液中,再旋转15分钟(5000×g)。回收沉淀并重新溶解在1ml pH7.4的PBS中,4℃下用相同的缓冲液充分透析(24小时)。对照实验包括,使天然蛋白质在存在未氧化CA或不存在CA的条件下进行缀合连接步骤。将振荡保持在最小以避免同时发生蛋白质变性。用SDS-PAGE表征聚唾液酸化的GH。使聚唾液酸化的GH经过阴离子交换色谱,将产物级分进行SDS PAGE(图15)。
实施例4的结果:GH-CA缀合物(宽分散和窄分散)的合成
成功地合成出GH-CA缀合物。SDS-PAGE结果(图15)表明对照实验中(带有GH)样品的迁移与新鲜GH的迁移相近。在缀合物的泳道中,谱带有偏移,通常说明聚唾液酸化的GH的质量增加。对于窄分散聚合物的缀合物,与宽分散聚合物的缀合物相比,谱带宽度显著变窄。此外,通过阴离子交换色谱成功地将GH缀合物(聚合物为宽分散)分离成不同的分子种类(图19)。
实施例5:CA的沉淀
使用乙醇示差沉淀将具有不同链长的多聚乙酰神经氨酸沉淀[图16、17]。
实施例5的结果:CA的沉淀
使用不同浓度的乙醇不能将CA(22.7;pd1.34)沉淀为窄分散的级分(图17)。但是乙醇示差沉淀表明较小的窄分散CA需要更多的乙醇(EtOH)。使用70%的EtOH对宽分散的22.7kDa聚合物进行沉淀,可获得>80%收率的产物聚合物。而将>80%的分子量为6.5KDa的较低分子量聚合物(pd<1.1)沉淀出来则需要浓度为80%的EtOH。此过程也可去除一部分污染产物的盐。
实施例6:用超滤法对CA进行分级
使用具有不同截留分子量的膜(5、10、30、50和100kDa)通过超滤将22.7kDa的样品纯化。通过GPC和native-PAGE检测各种情况下的截留物[图18]。
实施例6的结果:用超滤法对CA进行分级
使用具有不同截留分子量的膜通过超滤将22.7kDa的样品纯化,表明随着膜截留分子量的增加,聚合物的多分散系数有所降低,并且向高分子量偏移(图18)。图16显示了通过阴离子交换色谱(左图)和过滤(右图)对CA进行分级的情况。IEC过程生成的CA级分与过滤分级相比,CA级分的分散窄得多。
实施例7:通过核磁共振光谱进行表征
通过1H(400MHz)和13C(100MHz)核磁共振光谱使用D2O对经过分级的CA聚合物中的杂质(如果存在)进行表征(图20)。
实施例7的结果:通过核磁共振光谱进行表征
经过分级的窄分散聚合物的1H和13C核磁共振谱表明不含杂质。此外,1H核磁共振谱中的H-3质子和13C核磁共振谱中的C-2碳原子的化学位移证实聚合物确实是所需的α-2,8连接的唾液酸。
实施例8:通过IEC对CA(39kDa,pd1.4)进行分级
8.1大规模的分级
将900ml琼脂糖Q FF填充XK50柱(Amersham Biosciences,英国)并用3个柱体积的缓冲冲洗液(20mM三乙醇胺;pH7.4)以50ml/min的流速进行平衡。通过注射器孔以每分钟50ml的量将CA(12.5g溶于200ml缓冲冲洗液)上样到柱上。然后用1.5个柱体积(1350ml)的缓冲冲洗液对柱进行冲洗。
用含有不同盐浓度(0、200、250、300、350、375、400、425、450、475、500和525mM NaCl)的1.5个柱体积的缓冲洗脱液(三乙醇胺,20mM,pH7.4)将结合的CA洗脱,最后用溶有1000mM NaCl的相同缓冲液洗脱以去除所有残留的CA和其他残留物(如果存在)。
通过使用3或10kDa的膜(Vivascience,英国)进行高压超滤、或通过使用3kDa截留分子量的膜(Vivascience,英国)进行Vivaflow50渗滤(通过使样品持续经过膜从而进行过滤)将样品浓缩到约20ml。在4℃下通过重复超滤或Vivaflow将这些样品从缓冲液交换到去离子水中。通过GPC(如实施例2中所述)和native-PAGE(用爱茜蓝染色的4-20%Tris-甘氨酸凝胶)分析这些样品的平均分子量和其他参数(图 21和22)。
8.2小规模的分级
用琼脂糖Q FF(5ml基质,预装填;Amersham Biosciences,英国)用含有不同盐浓度(0、200、250、300、350、375、400、425、450、475、500、525、550和575mM NaCl)的相同的缓冲液体系(20mM三乙醇胺;pH7.4)进行较小规模的CA分级。用1.5个柱体积(7.5ml)以1ml/min的流速对柱进行冲洗,洗脱出结合的CA,最后用溶有1000mM
NaCl的惯常三乙醇胺缓冲液对柱进行冲洗。
通过Vivaspin膜过滤(截留分子量3kDa)(Vivascience,英国)将样品浓缩到约0.75ml。在8℃下通过重复膜过滤将缓冲液交换为去离子水,然后进行冻干。通过native-PAGE(用爱茜蓝染色的4-20%Tris-甘氨酸凝胶)分析这些样品(图23和24)。
实施例8的结果:成功地将多分散CA(39kDa;pd1.4)分级为各种平均分子量从7至97kDa的、%量不同的窄分散种类(图21-24和表4)。
表4:对分级得到的各种CA进行的GPC分析
CA级分 | Mw(kDa) | pd |
475 | 97.2 | 1.285 |
450 | 52.3 | 1.109 |
425 | 37.9 | 1.062 |
400 | 28.0 | 1.048 |
375 | 19.0 | 1.080 |
350* | 14.5 | - |
300* | 10.0 | - |
250* | 7.0 | - |
在分析过程中,所用的溶剂为溶有0.2M NaNO3的MECN,用PEG和葡聚糖作为标准物。温度为22℃,注入体积为100μL,流速为0.7mL/min。
*由native-PAGE测量的近似值
图21和23分别显示出对39kDa的CA聚合物进行大规模(12.5g CA;900ml基质)和小规模(200mg CA;5ml基质)分级所得到的各种级分的CA%CA%量。图22和24是对CA进行大规模和小规模分级后获得的native-PAGE。表4为用不同的盐浓度进行I EC所获得的级分的GPC结果。GPC数据显示出该分级方法获得了最高至97kDa的物质(更详细内容参见实施例9)。这些较大分子量的聚合物在下述磷酸盐检测中与它们的低分子量相应物质相比显示出在CA还原端具有较高百分比的磷酸盐部分,所述磷酸盐检测可检测无机磷酸盐的存在(Rouser等.1970)。
实施例9:通过GPC对经过分级的CA进行表征
将新制备的CA样品用GPC进行分析,所述CA样品通过例如将CA、CAO、CAOR或CAORO(4-5mg/ml)溶于0.2M NaNO3/0.1%NaN3/10%乙腈(1ml)(或为10mM PBS,pH7.4)并将所得溶液用0.2ìm尼龙膜(Whattman,英国)过滤而制得。
用2×GMPW×1(250×4.6mm)柱以及三重检测GPC(SEC3)系统(Viscotek Europe公司,英国)对样品进行色谱分析。检测器由Viscotek Laser折光计(折射率)和Viscotek 270双检测器(直角光散射检测器,配有4-毛细管粘度计检测器)组成,用Omni SEC 3.1工作站(Viscotek Europe公司)进行检验。
所采用的分析条件为:洗脱液:用于溶解CA样品的缓冲液;流速:0.7ml/min;上样量:100μl;温度:22℃。系统用窄分散分子量的聚乙二醇和宽分散分子量的葡聚糖作为参比物质进行校准。
通过使用各种检测器将聚合物从GPC柱中洗脱所需的时间转化为其分子量。光散射检测器提供对绝对分子量的直接测量,并且不必对柱进行校准(检测器给出的响应与分子量和浓度成正比)。当使用单一角度进行检测时不计算回转半径。粘度计提供对固有粘度的直接检测和对分子大小、构象和结构的测定(检测器给出的响应与分子密度成反比)。来自折光率检测器的响应与聚合物浓度成正比:比例常数为dn/dc(光散射所需的折射率(specific refractive index)增量相同)。
上述的GPC系统使得能够测定出许多CA参数。例如可获得数均分子量(Mn)和重均分子量(Mw),由这些数据可计算出CA的多分散系数。其他从GPC数据中获得的信息包括CA的回收百分比以及聚合物的枝化度(如果存在)。还可通过dn/dc值确定样品的确切浓度(或者可由聚合物的已知确切浓度计算出dn/dc值)。
实施例9的结果:表5显示了通过对CA(39kDa,pd1.4)的IEC分级级分(400mM NaCl溶于20mM三乙醇胺,pH7.4)进行分析所得的一些参数的典型数值。在此表中,使用了以下定义:
Mn=数均分子量
Mw=重均分子量
Mz=Z均分子量
Mp=峰均(peak average)分子量
Mv=粘均分子量
Mw/Mn=分子量分布(多分散系数)
Rh=流体力学半径
IV=固有粘度
dn/dc=折射率随样品浓度的变化
表5:由IEC获得的CA级分(400mM NaCl溶于20mM三乙醇胺,pH7.4)的典型GPC数据
参数 | 值 |
Mn(Da) | 26,666 |
Mw(Da) | 27,956 |
Mz(Da) | 31,129 |
Mp(Da) | 22,969 |
Mw/Mn | 1.048 |
IV(dl/g) | 0.2395 |
Rh(nm) | 4.683 |
支链 | 0.00 |
样品浓度(mg/ml) | 5.600 |
样品回收率(%) | 90.71 |
dn/dc(ml/g) | 0.156 |
dA/dc(ml/g) | 0.000 |
Mark-Houwink a | -0.048 |
Mark-Houwink logK | -0.425 |
[0200] 例如,27,956和26,666Da分别为Mw和Mn的值,从而可得多分散系数为1.048。表4显示了对多分散CA(39kDa;pd1.4)的IEC分级结果进行GPC分析所得的窄分散分子量的范围,而图25显示了窄分散CA样品的粘度计、折光计和光散射曲线相结合的典型GPC色谱图。
实施例10:优化研究
10.1对CA的native-PAGE分析的优化
使用TBE和Tris-甘氨酸凝胶对经过分级的CA和未分级的CA进一步进行native-PAGE分析,以优化这些聚合物在凝胶上的分离度。一般地,在凝胶上的每个孔中以含有10ìl加样缓冲液的20ìl溶液形式上样40ìg窄分散的或宽分散的CA。凝胶使用三种不同的速度(150、25或15mV/cm)进行电泳,然后使用爱茜蓝染色,之后用2%的乙酸脱色。
实施例10.1的结果:图26表明了对于不同分子量的CA使用4-20%Tris-甘氨酸、4-20%和20%的TBE凝胶可获得不同的分离度。从凝胶可看出,通过使用4-20%和20%的TBE凝胶可观察到高分子量和低分子量CA的良好分离,使用20%TBE凝胶时分离度特别好。当使用25或15mV/cm的速度进行凝胶电泳时,与150mV/cm的凝胶速度相比可最好地观察到窄谱带。
10.2CA的浓缩
将CA(22.7kDa,pd 1.34)经I EC分级并经高压超滤得到的滤液用Vivaflow(截留分子量3kDa)进行浓缩。通过native-PAGE用4-20%TBE凝胶(图27)对来自相应的高压超滤过滤器的CA样品分析其聚合物的降解。
实施例10.2的结果:Vivaflow纯化滤液得到的CA样品的native-PAGE结果(图27)显示出两种材料具有相同分子量。这种在高压超滤的滤液中观察到CA的现象可能是由于所谓的潜移作用(reptation),其中由于CA聚合物的柔性、可变形性和其棒状构象,聚合物可透过膜,从而使CA存在于滤液中。凝胶也证明了Vivaflow和超滤均可成功地用于处理从CA的IEC分级获得的级分。
实施例11:使用离子强度渐增的三乙醇胺/HCl通过IEC对CA (22.7kDa,pd1.34)进行分级
还使用了pH7.4的一定浓度范围的三乙醇胺在不存在任何盐例如NaCl的条件下通过琼脂糖Q FF(1ml基质,预装填)对多分散CA进行分级。因此,将CA(40mg;1ml)(22.7kDa;pd1.34)上样到Q FF柱上(1ml基质;预装填;Amersham Biosciences)。使每种1ml的三乙醇胺缓冲液(50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100和1200mM三乙醇胺)以1ml/min的流速流经色谱柱并最后使用2000mM三乙醇胺对柱进行冲洗,从而将结合的CA洗脱。将样品直接冻干,然后用native-PAGE分析(TBE凝胶,用爱茜蓝染色)。
实施例11的结果:图28表明了可使用pH7.4的浓度变化的三乙醇胺获得CA的分级。
实施例12:使用离子强度渐增的三乙醇胺乙酸盐通过IEC对CA(22.7kDa,pd1.34)进行分级
还使用了pH7.4的一定浓度范围的三乙醇胺乙酸盐在不存在任何盐例如NaCl的条件下通过琼脂糖Q FF(1ml基质,预装填)对多分散CA进行分级。通过用三乙醇胺并使用乙酸将pH调整到7.4,从而制备三乙醇胺乙酸盐缓冲液。将多分散CA(40mg;1ml)(22.7kDa;pd1.34)上样到Q FF柱上(1ml基质;预装填)。使每种1ml的三乙醇胺乙酸盐缓冲液(300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400和1500mM三乙醇胺乙酸盐)以1ml/min的流速流经色谱柱并最后使用2000mM三乙醇胺乙酸盐对柱进行冲洗,从而将结合的CA洗脱。然后将每个级分的小份样品(20ìl)通过微量膜透析系统与水进行缓冲液交换,冻干然后用native-PAGE分析(20%TBE凝胶,用爱茜蓝染色)。
实施例12的结果:图29表明了可使用pH7.4的浓度变化的三乙醇胺成功获得CA的分级。
实施例13:使用pH梯度对CA(22.7kDa,pd1.34)进行分级
用HEPES和乙醇胺缓冲液体系制造pH分级梯度。用浓度从10至50mM逐渐增加的HEPES并用NaOH将pH设定到合适的值,从而获得 pH7.6、7.8和8.0的缓冲液。钠离子浓度不超过36mM。将适量的1M乙醇胺(最终浓度为20至70mM)与50mM的HEPES(最终浓度为10至50mM)混合并用NaOH设定pH,从而制备出pH为8.2、8.3、8.5、8.7、8.9、9.1、9.3、9.5和9.7的缓冲液,同时确保钠离子浓度不超过30mM。最后一种缓冲液为70mM的乙醇胺,pH为11。
将30mg多分散CA(22.7kDa,pd1.34)溶于pH7.6的缓冲液中(1mL)并同样用pH7.6的缓冲液将其上样到DEAE琼脂糖柱上(1ml基质,预装填)。先用5ml pH7.6的缓冲液(流速1ml/min)对柱进行冲洗,然后使每种2ml的缓冲液流经柱子,收集1ml级分。将每个洗脱级分各500ìl一定量冻干,然后重新溶于50ìl去离子水,用于进行native-PAGE分析(20%TBE凝胶,用爱茜蓝染色)。
实施例12的结果:图30表明了可以使用渐增的pH强度成功获得CA的分级。DEAE琼脂糖是一种具有叔氨基团——N-二乙基-氨基-乙基——的阴离子交换基质,其在高pH下释放电荷。因此用高pH将基质去质子化、改变其带电状态并将通过离子相互作用连接在柱上的所有种类洗脱。也可使用混合梯度,这种情况下首先用pH梯度分级出较低分子量的分子种类,然后用离子强度梯度洗脱较高分子量的分子种类。
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Claims (42)
1.一种将带离子电荷的多分散多糖分级为级分的方法,其中将多分散多糖的水溶液与柱中的离子交换树脂接触,然后用水性缓冲洗脱液进行选择性洗脱,并从洗脱的各级分中回收多糖,其特征在于选择性洗脱包括用至少三种缓冲洗脱液依次冲洗柱中的树脂,所述至少三种缓冲洗脱液各自具有不同的且恒定的离子强度和/或pH,并且第二种缓冲液和其后的缓冲液与相邻的前一种缓冲液相比具有较高的离子强度和/或pH,并且其中洗脱级分各自具有不同平均分子量和小于1.5的多分散系数。
2.权利要求1的方法,其中各级分具有小于1.25的多分散系数。
3.权利要求1的方法,其中各级分具有1.1或更小的多分散系数。
4.权利要求1的方法,其中缓冲洗脱液均具有相同的pH。
5.权利要求1的方法,其中连续步骤之间离子强度的差异是基本相同的。
6.权利要求5的方法,其中所述差异为0.005至0.1M。
7.权利要求6的方法,其中所述差异为0.025M。
8.上述权利要求中任意一项的方法,其中通过改变强无机酸和强无机碱的盐的浓度使离子强度改变。
9.权利要求8的方法,其中所述盐为氯化钠。
10.权利要求1的方法,其中缓冲洗脱液具有相继升高的pH值。
11.权利要求10的方法,其中连续步骤之间的pH差异是基本相同的。
12.权利要求11的方法,其中所述差异为0.2pH单位。
13.权利要求1的方法,其中每种缓冲液的pH均在7.4-13的范围内。
14.权利要求10的方法,其中第二种缓冲液和其后的缓冲液与相邻的前一种缓冲液相比具有较高的离子强度和pH。
15.权利要求1的方法,其中每种缓冲洗脱液的用量为至少1.0柱体积。
16.权利要求15的方法,其中每种缓冲洗脱液的用量为至少1.5柱体积。
17.权利要求1的方法,其中洗脱缓冲液含有挥发性酸或碱,并且其中回收步骤包括使挥发性酸或碱从洗脱的级分中挥发。
18.权利要求17的方法,其中缓冲液含有碱,所述碱为胺。
19.权利要求18的方法,其中所述碱为三乙醇胺。
20.权利要求1的方法,其中多分散多糖的重均分子量至少为5kDa。
21.权利要求20的方法,其中多分散多糖的重均分子量至少为10kDa。
22.权利要求1的方法,其中选择性洗脱过程包括至少五步。
23.权利要求22的方法,其中选择性洗脱过程包括6至12步。
24.权利要求1的方法,其中包括在与离子交换树脂接触之前进行非溶剂沉淀预备步骤。
25.权利要求1的方法,其中多糖为天然存在的多糖、其水解产物或上述二者的官能化衍生物。
26.权利要求25的方法,其中天然存在的多糖为细菌多糖。
27.权利要求25或26的方法,其中多糖为唾液酸聚合物或共聚物。
28.权利要求27的方法,其中所述唾液酸聚合物或共聚物为水解形式。
29.权利要求27的方法,其中所述多糖为聚(2,8-连接唾液酸)、聚(2,9-连接唾液酸)或交替的2,8-2,9-连接PSA。
30.权利要求27的方法,其中多糖为CA或其氧化物、还原物、胺化物和/或酰肼衍生物。
31.权利要求27的方法,其中各级分具有小于1.2的多分散系数。
32.权利要求1的方法,其中多分散多糖的分子量多分散系数至少为1.5。
33.权利要求32的方法,其中多分散多糖的分子量多分散系数至少为2.0。
34.权利要求1的方法,包括将已分级的多糖缀合至蛋白质。
35.权利要求1的方法,用于分离多分散的带离子电荷的蛋白质-多糖缀合物。
36.由权利要求1的方法制备的由唾液酸单元组成的具有小于1.26的分子量多分散系数Mw/Mn的聚唾液酸。
37.权利要求36的聚唾液酸,其中多分散系数不超过1.2。
38.权利要求37的聚唾液酸,其中多分散系数在1.01至1.10范围内。
39.权利要求36至38中任意一项的聚唾液酸,所述聚唾液酸为CA或者其氧化物、还原物、胺化物和/或酰肼衍生物。
40.权利要求36的聚唾液酸,所述聚唾液酸具有至少5kDa的分子量。
41.权利要求40的聚唾液酸,所述聚唾液酸具有至少10kDa的分子量。
42.一种化合物,含有权利要求36至41中任意一项的聚唾液酸和蛋白质的缀合物。
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