JP5197009B2 - シアル酸誘導体 - Google Patents
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Classifications
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Description
a)末端シアル酸の非還元末端でタンパク質反応性アルデヒドを形成するために過ヨウ素酸ナトリウムでのCA(大腸菌由来のα-2,8結合PSA)の酸化を示す。
R1はリンカー基であり、
Xは官能基を表す。)
と反応する反応工程が続き、それによりエステル基は切断され、中間体のアミン又はヒドラジン基は誘導体を形成するために-CO-R1-Xによってアシル化される。
この第一の実施形態で、開始化合物は次の式を有し、
この実施形態による化合物の形成は図6で示されており、ここで試薬Iはbis-NHS架橋剤である。
第二の実施形態で開始化合物は、その8-炭素原子を介してもう一方の部分に結合した還元末端シアル酸を有し、ここで予備的段階は、それによりビシナルジオールを有する基が形成されるケタール環の開環還元段階を伴い、その後、ビシナルジオール基がアルデヒドに酸化される選択的酸化段階が行われ、次いで中間体を形成するためにH2NR4またはその酸付加塩との還元的アミノ化が行われる。
この実施形態で開始の化合物は次の式を有し
式Vの化合物の形成は図2に示されている。
第四の実施形態では開始化合物は、8-炭素原子を介してもう一方の部分に結合している還元末端終末シアル酸を有し、予備的段階はケタール環の開環還元段階を伴い、それによりビシナルジオールを有する基が形成され、その後、ビシナルジオール基がアルデヒド基に酸化される選択的酸化段階がなされ、次いで中間体を形成するためにヒドラジンとの反応と還元がなされる。
式IXの化合物を生産する反応スキームの例は図5で示され、そこでの二官能性試薬Iはbis-NHSである。
である。
N-(α-マレイミドアセトキシ)スクシンイミドエステル(AMAS),
N-(β-マレイミドプロピルオキシ)スクシンイミドエステル(BMPS),
N-(ε-マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミドエステル(EMCS)またはそのスルホアナログ,
N-(γ-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミドエステル(GMBS)またはそのスルホアナログ,
スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシ-(6-アミドカプロアート)(LC-SMCC),
m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)またはそのスルホアナログ,
スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート(carboxyate)(SMCC)またはそのスルホアナログ,
スクシンイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB)またはそのスルホアナログ,
スクシンイミジル-6-(β-マレイミド-プロピオンアミド)ヘキサノエート(SMPH),
N-(κ-マレイミドウンデカノイルオキシ)スルホスクシンイミド-エステル(sulfo-KMUS),
スクシンイミジル6-[3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキサノエート(LC-SPDP)またはそのスルホアナログ,
4-スクシンイミジルオキシカルボニル-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)トルエン(SMPT)またはそのスルホ-LCアナログ,
N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP),
N-スクシンイミジル(4-ビニルスルホニル)ベンゾアート(SVSB),
スクシンイミジル3-(ブロモアセトアミド)プロピオネート(SBAP),
N-スクシンイミジルヨードアセタート(SIA),及び
N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾアート(SIAB)またはそのスルホアナログ。
N-5-アジド-2-ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド水不溶性(ANB-NOS),
N-ヒドロキシスクシンイミジル-4-アジドサリチル酸水不溶性,非開裂性(NHS-ASA),
N-スクシンイミジル(4-アジドフェニル)-1,3’-ジチオプロピオネート(SADP),
スルホスクシンイミジル2-(7-アジド-4-メチル-クマリン-3-アセトアミド)エチル-1,3’-ジチオプロピオネート(SAED),
スルホスクシンイミジル2-(m-アジド-o-ニトロ-ベンズアミド)エチル-1,3′-ジチオプロピオネート(SAND),
N-スクシンイミジル6-(4′-アジド-2′-ニトロ-フェニルアミノ)ヘキサノエート(SANPAH),
スルホスクシンイミジル2-(p-アジド-o-サリチルアミド)エチル-1,3′-ジチオプロピオネート(SASD),
スルホスクシンイミジル-(ペルフルオロアジドベンズアミド)エチル-1,3′-ジチオプロピオネート(SFAD),
N-ヒドロキシスルホスクシンイミジル-4-アジドベンゾアート(Sulfo-HSAB)。
ビス[2-(スクシンイミジルオキシカルボニル-オキシ)エチル]スルホン(BSOCOES)又はそのスルホアナログ,
ビス(スルホスクシンイミジル)スベラート(BS3),
ジスクシンイミジルグルタラート(DSG),
ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)(DSP),
ジスクシンイミジルスベラート(DSS),
ジスクシンイミジルタートラート(DST)またはそのスルホアナログ、
3,3′-ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(DTSSP),及び
エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシナート)(EGS)又はそのスルホアナログ
から選択されてもよい。
メタ過ヨウ素酸ナトリウムと分子量マーカーはSigma Chemical Laboratory, UKから購入した。使用したCAである直鎖のα-(2,8)-結合E. coli K1 PSA(平均22.7kDa,多分散度(p.d.) 1.34; 39kDa, p.d.1.4;11kDa, p.d. 1.27)はCamida, Irelandから購入した。他の材料は2,4ジニトロフェニルヒドラジン(Aldrich Chemical Company,UK); 透析チューブ(3.5kDaと10kDaがカットオフ限度(Medicell International Limited,UK); Sepharose SP HiTrap, PD-10カラム(Pharmacia, UK); XK50 カラム(Amersham Biosciences, UK); Sepharose Q FF(Amersham Biosciences); トリス-グリシンポリアクリルアミドゲル(4-20%と16%), トリス-グリシンドデシル硫酸ナトリウムランニングバッファーとローディングバッファー(Novex, UK)を含んでいる。脱イオン水はElgastatOption4waterunit(Elga Limited, UK)から購入した。使用したすべての試薬はアナリティカルグレードのものである。プレートリーダー(Dynex Technologies, UK)はタンパク質の分光光度測定とCA分析に使用した。
タンパク質とCAの測定
シアル酸のようなCAの定量的推定は他でも述べられているように[Gregoriadis et. al., 1993;Fernandes and Gregoriadis, 1996, 1997]レゾルシノール法[Svennerholm 1957]によって行われた。GHはビシンコニン酸(BCA)比色定量法によって測定された。
XK50カラムに900 ml Sepharose Q FFを詰め、フローレート50 ml/minの3カラム容量の洗浄バッファー(20mMトリエタノールアミン; pH 7.4)で平衡化した。CA(洗浄バッファー200ml中に25g)がシリンジ口を介して50ml/minでカラムにかけられた。この後に1.5カラム容量(1350ml)の洗浄バッファーでカラムを洗浄した。
新たに調製された0.02Mメタ過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4;CAより6倍モル過剰)溶液を20℃でCAと混合し反応混合物は(図3の最初の段階で示されているように)暗所で15分間磁気攪拌した。酸化されたCAは70%(最終濃度)のエタノールを用い、20分間3000gで混合物を遠心分離することによって沈降させた。上清は取り除き、ペレットは最小量の脱イオン水に溶解した。CAは再度70%エタノールを用いて沈殿させ、次いで12,000gで遠心分離した。ペレットは最小量の水に溶かし、凍結乾燥して次の使用まで-20℃で保存した。
CAの酸化度の定量的推定は2,4ジニトロフェニルヒドラジン(2,4-DNPH)を用いて行われ、それはカルボニル化合物と相互作用してわずかに溶解性の2,4ジニトロフェニルヒドラゾンを生じる。酸化されていないもの(CA)と酸化されたCA(CAO)(各々5mg)は2,4-DNPH試薬(1.0ml)に加えられ、溶液は振盪後に結晶の沈澱が観察されるまで37℃に放置した[Shriner et. al., 1980]。CA酸化の(定量的な)程度はアルカリ溶液中でのフェリシアン化物イオンのフェロシアン化第二鉄(ペルシアブルー)への還元に基づいた方法[Park and Johnson, 1949]で測定され、それは次いで630nmで測定された。この実施例では、グルコースがスタンダードとして使用された。
参考例2で調製された10-100 mg/mlのCAOは300倍モル過剰のNH4Clを含む脱イオン水2mlに50mlチューブ中で溶解された後に、NaCNBH4(1N NaOH(aq)中に5Mストックを含む)が最終濃度5mg/mlで加えられた(図4、最初の段階)。混合物は5日間室温でインキュベートした。コントロール反応はCAOの代わりにCAで行った。生成物のコロミン酸アミン誘導体は氷冷したエタノール5mlの添加により沈澱させた。沈澱物はベンチトップ型の遠心分離機で4000rpm、30分間、室温での遠心分離により回収した。ペレットは確保し、脱イオン水2ml中に再懸濁し、10mlの超遠心管で氷冷エタノール5mlを加えて再度沈澱させた。沈澱は室温で30分間30,000rpmで遠心分離することにより集められた。ペレットは再度脱イオン水2mlで懸濁し、凍結乾燥した。
TNBS(ピクリルスルホン酸,すなわち2,4,6-トリ-ニトロ-ベンゼンスルホン酸)分析は生成物に存在するアミノ基の量を測定するために使用された[Satake et. al., 1960]。
上の参考例4aで合成されたCA-NH2(35kDa)(15-20mg)は0.15MのPBS(350μL, pH7.2)に溶解され、PBS(150μL,pH7.2)中のBS3が50か75モル当量加えられる。混合物は5秒間ボルテックスされた後に、20℃で30分間反応される。これは一般的にはホモ二官能性の架橋剤で図4の二番目の段階で示されており、より詳細にはBS3について図7で示されている。CA-NHS生成物は溶離液としてPBS(pH7.2)を使用してPD-10カラムによって精製し、直ぐにタンパク質とペプチドのNH2基への位置特異的複合体化のために使用した。PD10分画からのCA濃度の測定はレゾルシノール分析を使用したシアル酸含有量を分析することによってなされた。CAポリマーでのNHS含有量は260nmでCAとNHSの反応液を分析することによりUV分光器によって、並びに254nmで可視化させる薄層クロマトグラフィーによって測定された。
重炭酸ナトリウム(pH7.4)中のGHは過剰なBS3を用いた参考例4bからのCA-NHS(35kDa)に共有結合した。その反応は20℃で30分間モル比が25:1か50:1のCA-NHS:GHを使用して0.15M PBS(pH7.2; 1.5ml)中で行われた。ポリシアリル化GHはSDS-PAGEによって特性を示され、その複合体収量はFPLCサイズ排除クロマトグラフィーにより測定された。コントロールはCA-NHSの非存在下でBS3を使用してネイティブのタンパク質を結合手順に供することを含んでいた。CA-NH2はまたネイティブのGHの非存在下でBS3を使用して複合体化手順に供された。
CAとその誘導体(22.7kDa)は異なる%集団と46kDaまでの分子量平均を有する1.1未満の多分散度の様々な狭いスピーシーズに首尾よく分別された。テーブル2は22.7kDaの物質を分離した結果を示す。
[より大きなポリマーの分別(CA,39kDa, pd 1.4)は90kDaまでのスピーシーズを生じた。この方法はポリマーの大きなバッチでさえ分別のために首尾よく使用できる。イオン交換分画は狭く分散されることを結果が示す。これはGPCデータに一致する。]
すべての狭分画は20mMの過ヨウ素酸塩で首尾よく酸化され、生産過程の異なる段階から取られてGPCとnative PAGEにより分析されたサンプルは分子量と多分散度に変化がないことを示した。
(参考例2で述べた)ように1mlのPBS pH7.4に溶解した40mgのコロミン酸アミン(85mol%アミン)に5mgのN-スクシンイミジルヨードアセタート(SIA)を加えた。混合物は暗所で25℃1時間反応させた後、過剰なSIAはPBSで溶出する5mlのHightrapTM Desalting column(AP Bioscience)のゲル濾過によって取り除いた。0.5mlの分画がカラムから集められ、各々の分画からのサンプルはコロミン酸含有量(レゾルシノール分析)とヨウ化物を示すシステインとの反応性(Ellman’s Assay)について試験された。ヨウ化物とCAの両方で陽性だった分画は集められた。
1mlのPBS中の大腸菌β-ガラクトシダーゼ(5.0mg, 4.3x10-8 mol)に15mgのCAIを加えた(6.59x10-7mol,15モル当量)。チューブはホイルで包んでシールし、反応は室温で1時間穏やかに撹拌しながら進行させた。結果の複合体はSDS-PAGEで分析し、フリーのCAIを除去するために認められたプロトコルに従い精製した。サンプルは上で概略を述べているようにポリマーとタンパク質の含有量を分析した。
60μg/mlから3.75μg/mlまでの新たなβ-ガラクトシダーゼのスタンダードをPBS中で調製した。CAM-β-galのサンプルは同じバッファー中で60μg/mlに希釈した。複合体の酵素活性は次のように測定された:
マイクロタイタープレート中で、サンプルまたはスタンダードの100μlに100μlのAll-in-One β-gal substrate(Pierce)を加えた。プレートは37℃で30分間インキュベートし、405nmで吸光度を読んだ。検量線はスタンダードから作成され、サンプルの活性は検量線の線形回帰の式から計算した。
分画3-6はポリマーとヨードアセタート化物の両方が陽性でありプールされた。SDS-PAGE(4-12%ビス/トリスゲル;図12)はヨードアセトアミド誘導体と共にインキュベートされたサンプルの見かけの分子量の増加を示したが、コントロールのポリマーでは示さなかった。タンパク質とポリマー分析から結合比は1.63CAI:1β-galであることが測定された。β-gal活性はフリーの酵素と比較して複合体化サンプルでは100.9%であることが計算された。
4.1合成
50mgの酸化コロミン酸(19kDa)を20mM酢酸ナトリウムバッファー,pH5.5の400μl中でヒドラジン(液体)の2.6mgと25℃で2時間反応させた。コロミン酸は70%エタノールで沈澱させた。沈殿物は350μlリン酸緩衝食塩水,pH7.4中で再溶解し、NaCNBH3が5mg/mlまで加えられた。混合物は25℃で4時間反応させて、一晩凍結させた。NaCNBH3と反応副生成物は、移動相として0.15M NH4HCO3を使用したSephadex G25を詰めたPD10カラムのゲル浸透クロマトグラフィーによって除去された。分画(各々0.5ml)はTNBS分析(アミノ基特異的:上に記載)により分析された。分画6,7,8,9(空隙容量分画)はバックグラウンド以上の強いシグナルを有していた。バックグラウンドはNH4 +イオンの存在のために高かった。分画6,7,8,9はまたコロミン酸を含んでいた。これらの4個の分画はCA-ヒドラジド(CAH)を回収するために凍結乾燥した。
19kDa CAヒドラジド10mgは室温で30分間PBS(pH7.4)400μl中のBS3 9mgと反応させた。反応混合物は0.5ml分画を集めるSephadex G25を詰めたPD-10カラムに適用した。BSA 0.1mgは5から9の間の各々の分画に加えられた。分画は2時間室温でBSAと反応させた。これらのサンプルはSDS-PAGEとSEC HPLCによって分析した。
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Claims (31)
- シアル酸化合物の誘導体を形成する方法であって、末端シアル酸ユニットを含む開始化合物が酸化と還元またはその逆の連続的な段階を含む予備的中間体形成段階に供され、ここで第一級アミン、第二級アミン及びヒドラジンから選択される基が末端シアル酸ユニット上に形成され、その後反応段階が続き、ここで、該中間体は式Iの二官能性試薬と反応され、
R1はリンカー基であり、
Xはビニルスルホン、N-マレイミド、N-ヨードアセトアミド、オルトピリジルジスルフィド、アジド、又は基
それによりエステル基は開裂され、中間体のアミン又はヒドラジン基は誘導体を形成するために-CO-R1-Xによってアシル化される、方法。 - 開始化合物がその2-炭素原子を介して他の部分に結合している末端のシアル酸ユニットを有し、予備的段階はアルデヒド基を作成するためにシアル酸の7,8-ジオール基の酸化を伴い、その後、中間体を形成するためにR4がH又は低級アルキルであるH2NR4又はその酸付加塩との還元的アミノ化が行われる請求項1に記載の方法。
- 開始化合物はその8-炭素原子を介して他の部分に結合した還元末端にシアル酸を有し、予備的段階はビシナルジオールを有する基がそれにより形成されるケタール環の開環還元段階と、その後、ビシナルジオール基がアルデヒド基に酸化される選択的酸化段階を含み、次いで中間体を形成するためのR4がH又は低分子アルキルであるH2NR4またはその酸付加塩での還元的アミノ化が行われる請求項1に記載の方法。
- 開始化合物はその2-炭素原子を介して他の部分に結合される末端シアル酸ユニットを有し、予備的段階はアルデヒド基を形成するためのシアル酸の7,8-ジオール基の酸化を伴い、その後、中間体を形成するためのヒドラジンとの反応と還元がなされる請求項1に記載の方法。
- 開始化合物はその8-炭素原子を介して他の部分に結合している還元末端シアル酸を有し、予備的段階はケタール環の開環還元段階を伴い、それによりビシナルジオールを有する基が形成され、その後、ビシナルジオール基がアルデヒド基に酸化される選択的酸化段階が行われ、その後中間体を形成するためのヒドラジンとの反応と還元がなされる請求項1に記載の方法。
- 式Iの試薬と接触する前に中間体が予備的段階の生成物の混合物から実質的に分離されている請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- 中間体と一般式Iの試薬との反応は非プロトン性溶媒中で行われる請求項1から10のいずれかに記載の方法。
- 非プロトン性溶媒がジメチルスルホキシドである請求項11記載の方法。
- 式Iの試薬は中間体との反応で化学量論的に過剰量が存在する請求項1から12のいずれかに記載の方法。
- 式Iの試薬が中間体との化学量論反応で少なくとも2倍量存在する請求項13に記載の方法。
- 式Iの試薬が中間体との化学量論反応で少なくとも5倍量存在する請求項13に記載の方法。
- 式Iの試薬が
ビス[2-(スクシンイミジルオキシカルボニル-オキシ)エチル]スルホン(BSOCOES)またはそのスルホアナログ,
ビス(スルホスクシンイミジル)スベラート(BS3),
ジスクシンイミジルグルタラート(DSG),
ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)(DSP),
ジスクシンイミジルスベラート(DSS),
ジスクシンイミジルタートラート(DST)またはそのスルホアナログ、
3,3′-ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(DTSSP),および
エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシナート)(EGS)またはそのスルホアナログ
からなる群から選択される請求項1から15のいずれかに記載の方法。 - 試薬が
N-(α-マレイミドアセトキシ)スクシンイミドエステル(AMAS),
N-(β-マレイミドプロピルオキシ)スクシンイミドエステル(BMPS),
N-(ε-マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミドエステル(EMCS)またはそのスルホアナログ,
N-(γ-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミドエステル(GMAS)またはそのスルホアナログ,
スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシ-(6-アミドカプロアート)(LC-SMCC),
m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)またはそのスルホアナログ,
スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート(carboxyate)(SMCC)またはそのスルホアナログ,
スクシンイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB)またはそのスルホアナログ,
スクシンイミジル-6-(β-マレイミド-プロピオンアミド)ヘキサノエート(SMPH),
N-(κ-マレイミドウンデカノイルオキシ)スルホスクシンイミド-エステル(sulfo-KMUS),
スクシンイミジル6-[3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキサノエート(LC-SPDP)またはそのスルホアナログ,
4-スクシンイミジルオキシカルボニル-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)トルエン(SMPT),
N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP),
N-スクシンイミジル(4-ビニルスルホニル)ベンゾアート(SVSB),
スクシンイミジル3-(ブロモアセトアミド)プロピオネート(SBAP),
N-スクシンイミジルヨードアセタート(SIA),および
N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾアート(SIAB)またはそのスルホアナログ
からなる群から選択される請求項1から15のいずれかに記載の方法。 - R1がアルカンジイル、アリーレン、アルカリーレン、ヘテロアリーレン、アルカリヘテロアリーレンからなる群から選択され、そのうちのいずれかがカルボニル、エステル、スルフィド、エーテル、アミド及び/又はアミン結合によって置換及び/又は割り込まれていてもよい請求項1から17のいずれかに記載の方法。
- R1がC3-C6アルカンジイルである請求項18に記載の方法。
- 生成物誘導体は過剰な試薬から実質的に完全に分離されている請求項1〜19のいずれかに記載の方法。
- 生成物アミド又はヒドラジド誘導体が生成物混合物から実質的に完全に分離されている請求項20に記載の方法。
- 溶媒を取り除くために減圧下での乾燥の段階で生成物の回収が完了する請求項21に記載の方法。
- 前記開始化合物が多糖である請求項1から22のいずれかに記載の方法。
- 前記多糖が末端にシアル酸ユニットを有する請求項23に記載の方法。
- 前記多糖がシアル酸ユニットからなる請求項23に記載の方法。
- R1がアルカンジイル、アリーレン、アルカリーレン、ヘテロアリーレン及びアルキルヘテロアリーレンからなる群から選択され、そのうちのいずれかがカルボニル、エステル、スルフィド、エーテル、アミド及び/またはアミン結合によって割り込まれていてもよい請求項26又は27に記載の化合物。
- R1がC3-C6アルカンジイルである請求項28に記載の化合物。
- R3がオリゴ糖または多糖である請求項26に記載の化合物。
- 前記オリゴ糖または多糖がオリゴシアル酸またはポリシアル酸である請求項30に記載の化合物。
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