CN106554425B - 一种聚唾液酸的脂质接枝衍生物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂领域，具体涉及到一种聚唾液酸的脂质接枝衍生物，其制备方法及应用，尤其是用于微粒制剂的制备和修饰。所述的聚唾液酸中各个唾液酸单元间通过α‑2,8‑糖苷键连接，脂质片段与唾液酸单元的羟基通过酯键连接，结构式为：其中SA表示唾液酸单元，x为接枝在聚唾液酸分子中脂质片段的数目，m为聚唾液酸分子中唾液酸单元的数目，1≤m≤100，1≤x≤30；x/m为5%‑30%。基团R‑CO‑来自R‑COOH，R‑COOH是含有羧基基团的脂质化合物。使用该种化合物修饰或制备的微粒制剂的免疫原性极低，具有优秀的体内药动学性质。

Description

一种聚唾液酸的脂质接枝衍生物及其应用

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种聚唾液酸的脂质接枝衍生物，其合成方法以及应用，尤其是用于微粒制剂的制备和修饰。

背景技术

在药物递送系统(drug delivery system，DDS)发展历史中，载体及药物分子的聚乙二醇化(PEGylation，又称为PEG化)技术具有里程碑式的意义。PEG化可以降低单核巨噬细胞系统(mononuclear phagocyte system，MPS)对所修饰载体/分子的识别，延长血液循环时间，从而利用高渗透长滞留效应(enhanced permeability and retention effect，简称EPR效应)实现肿瘤部位的靶向。PEG对载体的保护作用取决于聚合物在修饰物表面形成的保护层性质，然而研究发现这一保护层带来以下三方面问题：①细胞摄取受阻现象，即PEG修饰所带来的表面水化层会在一定程度上阻碍药物与肿瘤细胞间相互作用，难以使药物进入适当的细胞内隔室，导致PEG化大分子不易被肿瘤细胞摄取；②加速血液清除现象，PEG化脂质体、PEG化胶束和PEG化纳米粒等PEG化载体经重复注射时，会在首次注射诱导机体产生抗体，导致第二次注射的PEG化载体快速从血液中清除，并大量聚集于肝脾，此现象被称为“加快血液清除(accelerated blood clearance，ABC)”。(佘振南,翟文君,邓意辉.“加速血液清除”现象中的免疫机制分析[J].沈阳药科大学学报,2011,28(9):760-768.)本课题组的研究表明，PEG化乳剂和PEG化固体脂质纳米粒的重复注射均可导致小鼠、大鼠和比格犬产生强烈的ABC现象(国家自然科学基金资助项目No.81072602)，其中比格犬在出现ABC现象时往往伴随有严重的类似过敏的反应，如呕吐、腹泻、面部严重水肿等，部分比格犬甚至因此死亡。我们的研究还证明，在低剂量注射时，PEG化阿霉素脂质体、PEG化表阿霉素脂质体和PEG化拓扑替康脂质体均会导致强烈的ABC现象，这给PEG化制剂的连续低剂量注射治疗方案敲响了警钟。ABC现象的产生不仅导致各种PEG化载体的治疗价值极大降低，甚至由于强烈的免疫反应而引起用药对象死亡(Semple SC,Harasym TO,Clow KA,etal.Immunogenicity and rapid blood clearance of liposomes containingpolyethylene glycol-lipid conjugates and nucleic acid[J].Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics,2005,312(3):1020)；③安全性，PEG是合成聚合物，它在细胞色素P450酶催化下以极低速率氧化为醛和酮，并且其高/低分子量形式都倾向于在组织内蓄积，大量长期注射时会造成毒性积累，对人体有害。大剂量使用PEG化制剂时，如正在研究的血红蛋白脂质体(人造血液，含有DSPE-PEG2000)，这类问题可能带来极为严重的后果。所以患者大剂量使用PEG化制剂时，ABC现象的产生及PEG的蓄积可能带来极为严重的后果。

因此，探索一种同时具有生物相容性和生物可降解性的材料，以帮助进入体内的药物对免疫系统“隐形”，成为DDS设计和开发过程中急需解决的关键问题。

唾液酸(sialic acid，SA)又称糖酸，是一类九碳单糖，它主要以短链残基的形式通过α-糖苷键连接于糖蛋白、糖脂和寡糖的末端。SA普遍存在于哺乳动物的细胞膜表面，其中红细胞及血管内皮细胞表面被高度唾液酸化。研究表明，红细胞经唾液酸酶处理后其寿命从原来的120天锐减到短短数小时。另外，许多病原体利用SA“装扮”自身，以掩蔽自身抗原表位，抑制补体的旁路激活途径，降低免疫原性进而成功逃脱宿主免疫系统的攻击。选择素能够在人体肿瘤部位的血管内皮细胞显著表达，并决定肿瘤的转移与侵袭，而SA是选择素的配体，因此使用SA修饰载体在肿瘤靶向治疗中具有一定的价值，利用受体-配体介导的内吞作用，将SA所携带的药物转运到细胞中，这种受体介导的内吞作用具有特异性高、亲和力强的特点，能大大增加药物转运效率，由此可以解决细胞摄取受阻问题(JAYANT S,KHANDARE J J,WANG Y,et al.Targeted Sialic Acid–Doxorubicin Prodrugs forIntracellular Delivery and Cancer Treatment[J].Pharmaceutical research,2007,24(11):2120-2130.)。本课题组表明SA修饰的脂质体治疗组的S180荷瘤鼠在经过约4-5次给药后，肿瘤组织从接种部位“脱落”(6只荷瘤鼠中有3只出现该现象)，并且之后伤口痊愈。该3只小鼠在随后观察的2个月内没有复发。体内药效实验中所表现出来的卓越的疗效和特殊的肿瘤“脱落”现象可能更多的归功于对肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的杀灭。这为肿瘤治疗提供了一种新的思路(国家自然科学基金资助项目NO.81373334)。聚唾液酸(polysialicacid，PSA)是多个SA单体以α-2,8和/或α-2,8连接的同聚物，其中以α-2,8连接的PSA无免疫原性且可生物降解。实验证明，PSA能够赋予所修饰分子较长的血液循环时间，目前的研究发现其在蛋白分子的修饰方面表现出较好的效果。有研究指出，PSA化门冬酰氨酶无免疫原性，且门冬酰氨酶的活性几乎不受影响，但使用PEG修饰后活性严重下降。另外，PSA在消除所修饰蛋白/多肽的免疫原性和抗原性的同时似乎并不影响它们与相应受体的结合。例如，PSA修饰的肿瘤特异性抗体Fab片段不仅显示出较长的循环时间，而且在肿瘤部位的分布量增加。鉴于此，Gregoriadis等撰文指出PSA是PEG的最佳替代物，可以利用PSA改善蛋白质药物的药代动力学性质并且降低毒性(GREGORIADIS G,JAIN S,PAPAIOANNOU I,etal.Improving the therapeutic efficacy of peptides and proteins:a role forpolysialic acids[J].International journal of pharmaceutics,2005,300(1-2):125-130.)。因此，SA/PSA作为一种无免疫原性和生物可降解的新型材料，具有减弱或消除PEG化制剂ABC现象的潜力。

目前PSA在药物传递系统中的应用主要被限于蛋白多肽类药物的修饰，其实现产业化的PSA修饰技术平台为technology(Lipoxen PLC，London，UK)，该技术已经应用于胰岛素(临床Ⅱ期)、alfa2β-interferon粒细胞集落刺激因子(StimuXenTM)和促红细胞生长素中。由Lipoxen公司开发的PSA修饰制剂长效胰岛素和长效促红细胞生成素在英国已经进入了2期临床研究。将PSA或结构类似的多糖连接在蛋白或多肽上的方法可见US-A-5846951或WO-A-0187922，这些方法中的依靠对聚合物“非还原”端的化学衍生以生成醛基，并借助此醛基实现PSA与蛋白多肽的缀合。但为了获得满意的反应收率需要在较高温度下进行一定的时间，这不利于所修饰的蛋白多肽等药物的稳定(例如干扰素α-2b)。本课题组将SA/PSA通过对聚合物“非还原”端的氧化得到醛基，并通过希夫碱反应进一步还原得到稳定脂质衍生物，方法合成可见CN103509066A，将PSA/SA衍生物用于药物载体的修饰，再将药物载入载体，将能够克服药物的不稳定性与PSA化反应所需条件间的矛盾，而且将药物装载于SA/PSA衍生物修饰载体中，相比于将SA/PSA衍生物与药物直接相连的策略，往往能获得较高的载药量。本课题组采用零度EDC/NHS偶联进一步通过侧链合成SA/PSA脂质衍生物，得到嵌段聚合物是两亲性物质，其可以在水中自组装形成胶束，作为药物载体装载或增溶难溶性物质，同时单独或与其他物质联合用于脂质体、囊泡、乳剂、纳米粒等液体微粒制剂的制备和修饰，并且作为选择素的配体，其在肿瘤炎症部位治疗应用中具有极大优势。

发明内容

为了开拓唾液酸衍生物在药物载体中的应用，我们研发了一种可广泛用于微粒制剂修饰的一种聚唾液酸的脂质接枝衍生物，其特征在于，聚唾液酸中各个唾液酸单元间通过α-2,8-糖苷键连接，脂质片段与唾液酸单元的羟基通过酯键连接。

本发明中所述的聚唾液酸脂质接枝衍生物具有如下结构

其中SA表示唾液酸单元，x为接枝在聚唾液酸分子中的脂质片段的数目，m为聚唾液酸分子中唾液酸单元的数目，1≤m≤100，1≤x≤30；x/m为5％-30％。

优选地，2≤m≤100，10≤x≤15，x/m为10％-15％。

基团R-CO-在聚唾液酸分子的唾液酸单元中所占的百分数为接枝率，即x/m，接枝率为5％-30％，优选为10％-15％。

本发明的聚唾液酸脂质接枝衍生物是通过唾液酸与R-COOH接枝得到。其中R-COOH是含有羧基基团的脂质化合物，其中R为R-COOH去羧基后的残基。

所述的R-COOH的羧基可与SA上的4、7或9位碳上的羟基成酯。根据空间位阻和电荷性分析，最佳以及最优反应位置是与9位碳上的羟基成酯。

所述的R-COOH选自十二烷基二甲基甜菜碱、十二烷基二羟乙基甜菜碱、十四烷基二甲基甜菜碱、十六烷基二甲基甜菜碱、十八烷基二甲基甜菜碱、十八烷基二羟乙基甜菜碱、月桂酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、十八酰胺基丙基甜菜碱、辛酸/癸酸酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺羟磺甜菜碱、十八酸、十六酸、十四酸、十二酸。

作为优选的化合物，所述的R-COOH是十二烷基二甲基甜菜碱、十四烷基二甲基甜菜碱、十六烷基二甲基甜菜碱、十八烷基二甲基甜菜碱、十八酸、十六酸、十四酸、十二酸。

作为最优，本发明中化合物R-COOH是十八烷基二甲基甜菜碱和十八酸。

本发明中任何一项所述的聚唾液酸脂质接枝衍生物可用于胶束、脂质体、囊泡、乳剂、纳米粒等微粒给药制剂的制备及修饰。

化合物接枝方法：聚唾液酸脂质接枝衍生物是由聚唾液酸与含羧基基团的脂质化合物通过催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)偶联所得到的产物，室温反应48h后，将反应液透析，冻干得到白色絮状物质，产物用¹H-NMR(Bruker 600-MHz)和FT-IR(Bruker IFS 55)表征。

本发明的聚唾液酸脂质接枝衍生物可以用于制备脂质体，其脂质体组方为：药物、磷脂、其他脂质、建立梯度物质、PSA脂质衍生物、注射用水和乙醇；其中，药物与磷脂的质量比为1:3～1:80，优选为1:6～1:20，其他脂质与磷脂的质量比为1:1～1:30，优选为1:1～1:10，PSA脂质衍生物与磷脂的摩尔比为1:1～1:100，优选为1:10～1:30，PSA衍生物修饰包封细胞毒性药物脂质体制剂中乙醇残留量为制剂终体积的0％～10％(v/v)。

本发明的优点：

(1)本发明合成的聚唾液酸脂质接枝衍生物是一种两亲性物质，其在水中可自组装形成胶束，负载和增溶难溶性药物；(2)利用本发明所提供的聚唾液酸脂质接枝衍生物除形成胶束，还可广泛应用于脂质体、囊泡、乳剂和纳米粒等微粒制剂的制备，所得的制剂在体内循环时间长，可以更好的利用EPR效应实现靶向性；(3)唾液酸作为内源性物质是选择素的配体，而选择素能够在人体肿瘤部位的血管内皮细胞显著表达，并决定肿瘤的转移与侵袭因此使用SA修饰载体在肿瘤靶向治疗中具有一定的价值；(4)相比于经典的聚乙二醇化制剂，聚唾液酸脂质接枝衍生物修饰制剂免疫原性较低，在重复注射时不会产生ABC现象；同时在体内可生物降解，无毒性；(5)聚唾液酸的聚合度可控，而且侧链合成脂质衍生物工艺简单，成本低廉，产物易于纯化，产率高，具有工业化生产的可能性。

附图说明

图1：PSA红外光谱图；

图2：BS18红外光谱图；

图3：PSA-BS18红外光谱图；

图4：PSA ¹HNMR光谱图；

图5：PSA-BS18¹HNMR光谱图(溶剂为DMSO-d₆)；

图6：PSA^-TBA⁺红外光谱图；

图7：PSA^-TBA⁺¹HNMR光谱图(溶剂为D₂O)；

图8：OSA红外光谱图；

图9：PSA-OSA红外光谱图；

图10：PSA-OSA ¹HNMR光谱图(溶剂为DMSO-d₆)；

图11：大鼠尾静脉注射不同给药组血浆中NBD-PE浓度；

图12：重复注射后脂质体在体内血浆药动曲线(A)及肝脾聚集量(B)；

图13：注射脂质体后第7天血清中抗-PEG(PSA)IgM的含量，n＝3.*p<0.05,**p<0.01；

图14：荷瘤小鼠肿瘤生长曲线；

图15：肿瘤脱落后愈合图(A)，伤口局部放大图(B)；

图16：荷瘤小鼠体重生长曲线；

图17：荷瘤小鼠中卫生存曲线。

具体实施例：

实施例中所用各成分的简称如下：

氢化大豆磷脂(HSPC)

二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)

胆固醇(CH)

维生素烟酸酯(TN)

中链甘油三酸酯(MCT)

大豆磷脂S75(S75)

钙黄绿素(CF)

十八(烷)酸丙三醇酯(GMS)

聚乙二醇(PEG)

四丁基溴化铵(TBAB)

1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)

N-羟基丁二酰亚胺(NHS)

N，N-二甲基甲酰胺(DMF)

二甲基亚砜(DMSO)

氘带二甲基亚砜(DMSO-d₆)

氘带水(D₂O)

甲酰胺(FA)

唾液酸(SA)

聚唾液酸(PSA，平均分子量30.0kDa，2≤m≤100)

十八烷基二甲基甜菜碱(BS18)

十八酸(OSA)

聚乙二醇₂₀₀₀-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE)

表阿霉素(EPI)

N-(7-硝基苄基-2-氧杂-1,3-重氮-4-基)磷脂酰乙醇胺(NBD-PE)，NBD-PE是荧光磷脂，在实施例中作为部分载体的示踪分子。

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入。

材料来源：

本发明中，所用PSA为线性α-2,8-连接的大肠杆菌K1PSA(平均分子量30.0kDa，多分散指数(p.d.)1.34，来自carbosynth，英国。

mPEG2000-DSPE、DSPG、HSPC、NBD-PE购买自Avanti，美国。

BS18，OSA，EDC，NHS为分析纯，购买自国药集团。

实施例1：十八烷基二甲基甜菜碱BS18与PSA的合成

将BS18(39.4mg，0.01mmoL)溶在4mL的FA中，加入EDC/NHS，活化90min，此时体系澄清，将溶解在5mL的FA中的PSA^-Na⁺(60mg，0.02mmoLSA单体)加入反应体系中，室温搅拌48h，反应溶液澄清，略变黄。

后处理：将透析袋(截留分子量1000Da)里的物质稀释至40mL后，透析介质为乙醇-水(V/V，1:2)体系，体积为2250mL透析，60℃透析，4h换3次透析介质，过夜透析之后，之后8h换2次透析介质，再过夜，共48h，整个过程透析袋里物质澄清。真空旋转出部分水-乙醇，冻干，得到白色絮状物质，即为合成物质PSA-BS18。

反应中使用硅胶薄层色谱(TLC)进行反应进度监测和纯度分析。间苯二酚和碘熏显色(展开体系，正丙醇：饱和氨水：水＝6：1：25)。BS18：Rf＝0.36；PSA：Rf＝0.60；PSA-BS18：Rf＝0.43，产物Rf值介于PSA和BS18之间，极性符合预期。反应结束后，反应液中仅有PSA-BS18。

使用IFS-55傅立叶变换红外光谱仪(Bruker公司，瑞士)对所得产物进行红外分析，测试谱图见附图：附图1为PSA；附图2为BS18；附图3为PSA-BS18。在IR光谱中，PSA-BS18在1730.9cm^-1处出现一个吸收峰，是生成酯的羰基(v_C＝O)振动峰，同时相对于PSA，其在2919.6，2850.5cm^-1处烷基链的伸缩振动峰加强，同时在721cm^-1处有直链碳数大于7的峰。

使用BRUKER AVANCE-600MHz超导核磁共振仪(Bruker公司，瑞士)对所得产物溶解在DMSO-d₆中进行氢谱分析,测试谱图见附图4和附图5。PSA的特征峰(–NHCOCH₃)在δ1.90ppm可以检测到。δ1.20ppm和δ0.95ppm处的两个峰分别对应于BS18中的-CH₂-和-CH₃上的H，其余各峰与PSA相似。

接枝率(degrees of substitution，DS)＝x/m

DS可通过¹H-NMR谱图中BS18上的1.20ppm的特征-CH₂-基质子峰与PSA单元上的1.90ppm乙酰基质子的相对强度之比获得：

通过¹H-NMR上积分换算可得：

δ1.20ppm＝1.50 δ1.90ppm＝1.00

DS＝1.50×3/1.00×30×100％＝15.0％(此公式中，x为15，m为100。)

实施例2.十八酸(OSA)与PSA合成

3g H型阳离子交换树脂，加入含有5g TBAB水溶液15mL，室温搅拌2h，将搅拌混悬液过柱，用去离子水洗涤，将得到的阳离子交换树脂与PSA^-Na⁺(200mg，0.65mmoL)去离子水溶液混合，室温搅拌过夜。取出搅拌液，离心，收集离心液冻干，得到物质即为PSA^-TBA⁺，溶解度为4mg PSA^-TBA⁺/1mL DMF。

使用IFS-55傅立叶变换红外光谱仪(Bruker公司，瑞士)对所得产物PSA^-TBA⁺进行红外分析，测试谱图见附图：附图6为PSA^-TBA⁺。在IR光谱中，同时相对于PSA，其在2918.1，2849.8cm^-1处烷基链的伸缩振动峰加强。

使用BRUKER AVANCE-600MHz超导核磁共振仪(Bruker公司，瑞士)对所得产物溶解在D₂O中进行氢谱分析,测试谱图见附图7。PSA的特征峰(–NHCOCH₃)在δ2.00ppm可以检测到。δ1.40ppm和δ0.90ppm处的两个峰分别对应于TBAB中的-CH₂-和-CH₃上的H，其余各峰与PSA相似。

OSA(30mg，0.1mmoL)溶解在2mL DMF中，室温超声溶解，加入EDC/NHS，活化90min，反应溶液澄清，加入溶解在15mL DMF的PSA^-TBA⁺(60mg，0.2mmoL)，搅拌48h，反应溶液澄清透明。

后处理，用热水浴50℃，无水乙醇洗涤反应液，得到的沉淀物离心，取出透析，用截留分子量1000Da透析，透析介质为蒸馏水，透析液冻干。

反应中使用硅胶薄层色谱(TLC)进行反应进度监测和纯度分析。间苯二酚和碘熏显色(展开体系，正丙醇：饱和氨水：水＝6：1：25)。PSA：Rf＝0.60；OSA：Rf＝0.20；PSA-OSA：Rf＝0.35，产物Rf值介于PSA和OSA之间，极性符合预期。反应结束后，反应液中仅有PSA-OSA。

使用IFS-55傅立叶变换红外光谱仪(Bruker公司，瑞士)对所得产物进行红外分析，测试谱图见附图：附图8为OSA；附图9为PSA-OSA。在IR光谱中，PSA-OSA在1747.6cm^-1处出现一个吸收峰，是生成酯的羰基(vC＝O)振动峰，同时相对于PSA，其在2919.9，2850.1cm^-1处烷基链的伸缩振动峰加强，同时在721.7cm^-1处有直链碳数大于7的峰。

使用BRUKER AVANCE-600MHz超导核磁共振仪(Bruker公司，瑞士)对所得产物溶解在DMSO-d₆中进行氢谱分析,测试谱图见附图10。PSA的特征峰(–NHCOCH₃)在δ1.95ppm可以检测到。δ1.20ppm和δ0.90ppm处的两个峰分别对应于OSA中的-CH₂-和-CH₃上的H，其余各峰与PSA相似。通过¹H-NMR上积分换算可得：

δ1.20ppm＝1.50 δ1.95ppm＝1.00

本实施例中DS为10.0％(此公式中，x为10，m为100。)

实施例3.PSA衍生物临界胶束浓度(CMC)的测定

由于PSA-BS18分子结构中具有亲水基团和亲脂基团，作为高分子嵌段物能够在水中自发形成胶束，可以利用荧光探针法测定其临界胶束浓度。

精密移取0.1mL浓度为1×10^-5M芘工作液若干份于西林瓶中，氮气吹干，精密称取PSA-BS18若干份，置于上述西林瓶中，分别加10mL纯水，得到芘工作液的浓度为10^-7M(芘在水中的饱和溶解度为7×10^-7M)，水浴超声30min，放置过夜，即得到浓度分别为5×10^-4，1×10^-3，3×10^-3，5×10^-3，1×10^-2，3×10^-2，5×10^-2，1×10^-1，5×10^-1，1,5g/L的PSA-BS18溶液。将上述芘的水溶液以393nm作为发射波长在300nm-350nm波长范围内扫描，叠加各激发波长图谱并记录数据。以340nm和335nm的荧光强度(I₃₄₀/I₃₃₅)之比为纵坐标，对数浓度值为横坐标作图，曲线的拐点即为PSA-BS18的CMC值，PSA-BS18的CMC值为52μg/mL.。

实施例4.紫杉醇PSA-BS18胶束制备、

称取一定量的紫杉醇、PSA-BS18共同溶解在DMSO中，药物与载体的质量比为1:15、1:30及1:50，在磁力搅拌下缓慢滴入去离子水，继续搅拌30min。将所得的溶液装入透析袋中，室温下，用去离子水透析48h，除去DMSO，过0.45和0.22μm的微孔滤膜除去未包封的紫杉醇。采用PSSNICOMP 380激光测定仪测定各组制剂的平均粒径在50-80nm之间，小于100nm，其中在比例为1:30中载药量为0.008，包封率为23.6，72小时内未见结晶析出，稳定性良好。

实施例5.PSA-BS18修饰脂质体的制备

处方1(SL)

称取处方量膜材，加入3mL无水叔丁醇和0.5mL蒸馏水于60℃超声溶解，得到澄清透明溶液，将处方量PSA-BS18溶在适量叔丁醇-水(V/V，1/1)体系中，两溶液混合，加入NBD-PE叔丁醇溶液，超声均匀，将所得液体冻干。取出冻干物，以约0.5mL·s^-1的速度注入5mL预热至相同温度的水化介质，60℃水浴搅拌20min，得脂质体初品。将初品头超声8min(200w×2min及400w×6min)后，依次通过0.8、0.45和0.22μm的微孔滤膜，即得PSA修饰NBD-PE脂质体(SL)混悬液(PSA-BS18的修饰率为10％，mol/mol)。脂质体粒径和Zeta电位使用PSSNICOMP 380激光粒度测定仪进行测定。处方中脂质体平均粒径为102.4±2.8nm，Zeta电位为--19.7±1.5mV，呈负电性。

处方2(CL)

称取处方量膜材，加入3mL无水叔丁醇和0.5mL蒸馏水于60℃超声溶解，得到澄清透明溶液，将所得液体超声混合均匀，冻干。取出冻干物，以约0.5mL·s^-1的速度注入5mL预热至相同温度的水化介质，60℃水浴搅拌20min，得空白脂质体初品。将初品探头超声8min(200w×2min及400w×6min)后，依次通过0.80、0.45和0.22μm的微孔滤膜，即得空白脂质体(CL)混悬液。

脂质体粒径和Zeta电位使用PSS NICOMP 380激光粒度测定仪进行测定。处方中脂质体平均粒径为108.2±1.7nm，Zeta电位为-27.1±2.1mV，呈负电性。

处方3(PL)

称取处方量膜材，加入3mL无水叔丁醇和0.5mL蒸馏水于60℃超声溶解，得到澄清透明溶液，将所得液体超声混合均匀，冻干。取出冻干物，以约0.5mL·s^-1的速度注入5mL预热至相同温度的水化介质，60℃水浴搅拌20min，得空白脂质体初品。将初品探头超声8min(200w×2min及400w×6min)后，依次通过0.80、0.45和0.22μm的微孔滤膜，即得空白脂质体(PL)混悬液。

脂质体粒径和Zeta电位使用PSS NICOMP 380激光粒度测定仪进行测定。处方中脂质体平均粒径为98.6±3.5nm，Zeta电位为-29.7±1.8mV，呈负电性。

本实验采用荧光磷脂NBD-PE标记脂质体，其作为一种磷脂衍生物，能够稳定的存在于脂质体双分子层中，且荧光基团连接在PE的头基上，不会引起双分子层结构的明显扰动。同时它具有较强的荧光信号，借助荧光检测器可以较方便的对其含量进行测定。荧光磷脂标记脂质体为后面实施例中脂质体在大鼠体内药动学行为和ABC现象的研究提供了一种新的检测方案。

实施例6：PSA-BS18修饰乳剂的制备

PSA-BS18修饰乳剂

制备工艺：将处方量水相55℃预热备用。将处方量油相(TN、MCT、S75、PSA-BS18)于55℃下搅拌至全部溶解。搅拌下将预热至相同温度的水相加入油相，高速分散，即得初乳。探头超声(200w×2min；400w×6min)处理后，过0.22μm微孔滤膜除菌即得(修饰密度约为总磷脂量的10％，mol/mol)。实验结果表明，所得TN乳剂的平均粒径为124±3.8nm，4℃放置1个月粒径无明显变化，也无分层和乳滴合并现象，制剂稳定性良好。

实施例7：PSA-BS18修饰纳米粒的制备

PSA-BS18修饰固体脂质纳米粒

制备方法：适量乙醇溶解处方量的GMS，S75，TN，PSA-BS18并于65℃搅拌下熔融/溶解；挥干乙醇，恒速注入相同温度的5％葡萄糖溶液，孵育10min；之后转入预热的探头管中在水浴条件下探头超声8min，超声工艺为200w条件下2min，400w条件下3min，过0.22μm微孔滤膜。实验结果表明，固体纳米粒的粒径为156.8±3.2nm，包封率为90.6±1.7％，4℃放置1个月粒径和包封率无明显变化，稳定性良好。

实施例8：PSA-OSA修饰的囊泡

囊泡处方

约60℃下将处方量吐温80、司盘80、CH、PSA-BS18用适量乙醇溶解，挥干乙醇后，搅拌条件下加入溶解有CF的5％葡萄糖注射液，使用凝胶层析除去外水相的CF即得到包封有CF的由PSA脂质衍生物修饰的囊泡。实验结果表明，所得囊泡的平均粒径为100.6±2.8nm，4℃放置1个月粒径无明显变化，制剂稳定性良好。

实施例9：PSA-BS18修饰脂质体在大鼠体内药动学行为研究

采用“实施例5”所制备的PSA-BS18脂质体给大鼠进行给药，研究修饰制剂的体内药动学行为。

样品处理：N-(7-硝基苄基-2-氧杂-1,3-重氮-4-基)磷脂酰乙醇胺(NBD-PE)在大鼠体内荧光分光光度分析方法的建立

①血浆样品的处理

取大鼠血浆0.1mL，置于1.5mL EP管中，加入甲醇溶液0.9mL，涡旋5min混匀。所得混悬液10000r/min离心10min，取上清液转移至另一1.5mL EP管中，继续10000r/min离心10min，取200μL上清液测定。

②组织样品的处理

取0.5g组织样品于7.0mL EP管中，加入1mL生理盐水5000r/min高速分散匀浆，精密移取组织匀浆液0.2mL，加入甲醇溶液0.8mL，涡旋5min混匀。所得混悬液10000r/min离心10min，取上清液转移至1.5mL EP管中，继续10000r/min离心10min，取200μL上清液测定。

③标准曲线的绘制

精密移取大鼠空白血浆0.1mL(组织匀浆液0.2mL)，加入不同浓度的NBD-PE贮备液0.1mL，按上述方法处理，得到NBD-PE提取液。平行移取200μL上清液加入96孔板中，在λ_ex＝488nm，λ_em＝540nm波长下测定荧光强度F。用样品F值减去空白血浆F值(组织样品F值)，得到ΔF值，并以此ΔF值对NBD-PE浓度C(ng/mL)进行线性回归，结果见表1。

表1 NBD-PE的标准曲线(ΔF-C)

结果表明，血浆和组织在相应的浓度区间内线性关系良好。同时采用此方法进行了精密度及回收率考察，结果均符合方法学要求。

给药方案：

取6只雄性Wistar大鼠，体重200～240g，随机分成2组，A组：尾静脉注射普通脂质体(CL)；B组：尾静脉注射PSA修饰脂质体(SL)注射剂量均为磷脂剂量5μmol/kg。给药后，分别在0.0166、0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8及12h经眼眶静脉丛取血，4500r·min^-1离心10min获取血浆，12h取血后将大鼠脱颈处死，取出心、肝、脾、肾和脑，生理盐水洗去残留血液后以滤纸吸干水分。按“血浆样品处理”项下方法处理血浆，于酶标仪荧光分光光度计上测定F值，样品F值减去空白血浆F值得△F值，由标准曲线计算血浆药物浓度。

结果：

测定大鼠静脉注射普通脂质体(CL)和PSA修饰脂质体(SL)后在体内的血药浓度，所得的药-时数据用DASS程序进行曲线拟合，结果表明，二组制剂经大鼠注射后，根据AIC判断和不同权重系数综合判断二组制剂在大鼠体内药动学行为与二室房室模型拟合最好，其药动学参数见表2，统计矩处理计算结果见表3，药时曲线见图11。

表2 不同给药组后在大鼠体内药动学参数

表3 统计矩处理计算结果

利用统计矩计算药动学参数见表3可知，比较SL和CL两组制剂，药时曲线面积(AUC)和半衰期(t_1/2)SL分别是CL的5.2倍和1.5倍。清除率(CL)中CL是SL的7.2倍。从所得数据来看，PSA-BS18可以延长所修饰脂质体在体内的循环时间。

实施例10：体内重复注射ABC现象的考察

为了考察重复注射在大鼠体内的药动学及组织分布，给药方案如表4。首次注射，SL和PL以磷脂剂量为0.1μmol/kg尾静脉注射，间隔7天以5μmol磷脂/kg的剂量二次注射NBD-PE脂质体。对照组首次注射5％的葡萄糖注射液。二次给药后分别于0.0166、0.083、0.25、0.5、1、2、4h经眼眶静脉丛取血，4500rpm离心10min获取血浆。4h后处死动物，取出肝脾，生理盐水洗净，滤纸吸干，所得血浆及组织样品于-20℃冷冻保存待用。

结果：如图12所示，重复注射PL后其NBD-PE的血浆浓度迅速降低(P<0.01)，肝脾聚集量显著增加，即PL会引起严重的ABC现象。然而，SL的药动曲线首次和二次基本相似。肝脾聚集量没有差异，结果表明，SL重复注射不会诱导ABC现象。

表4 给药方案

ABC index被用来评价ABC现象强弱。ABC index＝AUC_二次注射/AUC_首次注射。ABC index越大，表明诱导ABC现象越弱，本研究中，PSA修饰脂质体的ABC index_(0–30min)为0.97±0.06，而PEG修饰脂质体为0.19±0.03，两者具有显著性差异(P<0.01)。结果表明PSA修饰脂质体会避免ABC现象的发生。

实施例11：IgM的测定

方法：将mPEG2000-DSPE和PSA-BS18制成浓度为0.2mmol·L^-1的溶液，取50μL加入96孔板中，室温状态下待96孔板完全干燥后，加入含有1％BSA的Tris缓冲液(50mmol·L^-1的Tris，0.14mmol·L^-1的NaCl，pH8.0)100μL封闭1h，然后用含有0.05％Tween20的Tris缓冲液连续清洗三次。将血清样品稀释100倍，每孔中加入100μL，室温孵育1h，用含有0.05％Tween20的Tris缓冲液连续清洗五次，每孔中加入1μg·mL^-1的辣根过氧化连接的抗大鼠IgM或辣根过氧化酶连接的抗小鼠IgM，室温孵育15min，同样清洗五次。加入1mg·mL^-1的邻苯二胺100μL显色5～10min，最后加入2mol·L^-1的硫酸100μL，终止反应，采用酶标仪于490nm处测定吸光度。

结果：抗-PEG IgM的产生量与ABC现象呈正相关。因此，首次注射后，在二次注射之前检测体内的抗体IgM。血清中的抗-PEG(PSA)IgM通过经典ELISA测定。如图13所示，PL诱导产生了大量的抗-PEG IgM，与对照组具有显著性差异(P<0.05)。而SL并没有产生对应的抗-PSA IgM。

实施例12：装载EPI脂质体的药效学研究

方法：本研究使用S180作为肿瘤模型来评价EPI制剂的疗效。将30只接种S180肿瘤的小鼠随机分为6组，即5％Glu、EPI-S(EPI溶液组)、EPI-CL(装载EPI普通脂质体组)、EPI-SL(装载EPI的PSA-BS18修饰脂质体组)和EPI-PL(装载EPI的mPEG-DSPE修饰脂质体组)，每组6只。于接种后第4、7、10、13、16和19天分别尾静脉注射给药。各给药组的EPI剂量均为5.0mg·kg^-1，对照组给予相同体积5％Glu。在整个试验过程中，记录肿瘤体积、体质量和死亡事件，基于上述数据对各个制剂的疗效进行全面评价。其中肿瘤体积使用游标卡尺测量，公式如下

V(mm³)＝0.5(a*b²)

a代表长泾，b表示短径。

结果：选用免疫系统完善的昆明小鼠建立S180肿瘤模型来评价各种EPI脂质体的抗肿瘤疗效。如图14所示，在30天中，与对照组相比，EPI-S、EPI-CL、EPI-SL和EPI-PL均表现出显著的抗肿瘤效果(p<0.05)。值得注意的是，在第30天，EPI-SL的肿瘤抑制率是100％，而EPI-PL的为78.2％。两者之间具有显著性差异(p<0.05)，尽管体内循环时间EPI-PL要长于EPI-SL，但是其抗肿瘤效果却劣于EPI-SL。产生这一差别的原因可能是PEG在EPI-PL表面形成的空间位阻会阻碍细胞摄取。

令人惊奇的是，在接种肿瘤24天后EPI-SL治疗组的荷瘤小鼠肿瘤体积是0，同时肿瘤抑制率为100％。本研究中，EPI-SL组的荷瘤鼠在给药后，相继出现肿瘤组织从生长部位“脱落”的现象(6只荷瘤鼠全部脱落)，随后伤口痊愈。该6只小鼠在后续观察的2个月内没有肿瘤复发迹象。图15中展示了肿瘤脱落后伤口愈合的详细情况：由于肿瘤从生长部位脱落，该部位出现一个洞状的伤口(图15B II)；肿瘤脱落2天后，脱落部位形成一个深红色的扁平状结痂(图15B III)；脱落后第4天，结痂的面积缩减到第2天的约1/2(图15B IV)；脱落后第8天，伤口完全愈合，脱落部位留下一个非常小的红色疤痕(图15BV)；脱落后的第10天，所形成的疤痕几乎完全消失，该部位的伤口愈合(图15B VI)。

我们尝试解释上述“肿瘤脱落”这一神奇现象。PSA能够延长其修饰脂质体在体内的循环时间，EPI-SL可以被动靶向蓄积到肿瘤组织。并且，肿瘤为了逃脱免疫系统的识别，需要从周围环境招募PSA，在此情况下，PSA修饰的脂质体又可以主动靶向到肿瘤组织。综上，在抗肿瘤试验中，EPI-SL在肿瘤组织高聚集和细胞摄取得到了最好的治疗效果。

接瘤后隔日测量荷瘤小鼠体质量，待各组小鼠死亡后剥离皮下肿瘤，称重并计算肿瘤密度。根据各组小鼠肿瘤密度计算接瘤后不同时间肿瘤质量，绘制扣除肿瘤质量后小鼠的净体质量变化曲线，结果见图16。与对照组相比，EPI-S治疗组体重增加最为缓慢，表明脂质体作为载体可以降低所装载细胞毒性药物的免疫系统毒性(P<0.05)，而EPI-SL治疗组荷瘤小鼠的体重增加最快(P<0.01)。EPI-SL治疗组小鼠肿瘤得到脱落，所以称得小鼠的体重即为净重。结果表明，EPI-SL治疗组荷瘤小鼠细胞毒性最小，同时生存质量最好。在饲养期间，我们观察到，EPI-SL治疗组的小鼠健康、活泼并且毛发光滑，甚至要好于未荷瘤的正常小鼠。

瘤鼠的死亡事件，使用GraphPad PrismTM 5绘制生存分析曲线并借助Kaplan-Meier分析法计算生存时间，结果见图17。

对照组和EPI-S组的中位生存时间分别为20.5天和17.0天，与EPI-CL、EPI-PL和EPI-SL组的中位生存时间分别为23.5天(相比对照组p<0.05)、24.5天(相比对照组p<0.05)和多于30天(相比对照组p<0.01)，说明将EPI包封于脂质体中能显著延长荷瘤鼠的生存时间。注射EPI-SL可以显著延长荷瘤鼠的生存时间(相比对照组p<0.01)，在30天的观察周期中生存率为100％。在接下2个月内肿瘤脱落并且痊愈的小鼠并没有复发迹象。

Claims (19)

1.一种聚唾液酸的脂质接枝衍生物，其特征在于，聚唾液酸中各个唾液酸单元间通过α-2,8-糖苷键连接，脂质片段与唾液酸单元的羟基通过酯键连接，结构式为：

其中SA表示唾液酸单元，x为接枝在聚唾液酸分子中脂质片段的数目，m为聚唾液酸分子中唾液酸单元的数目，1≤m≤100，1≤x≤30；x/m为5％-30％；

基团R-CO-来自R-COOH，R-COOH是含有羧基基团的脂质化合物。

2.如权利要求1所述的聚唾液酸的脂质接枝衍生物，其特征在于，2≤m≤100，10≤x≤15。

3.如权利要求1或2所述的聚唾液酸的脂质接枝衍生物，其特征在于，x/m为10％-15％。

4.如权利要求1-2任何一项所述的聚唾液酸的脂质接枝衍生物，其特征在于，所述R-COOH的羧基与SA上的4、7或9位碳上羟基成酯。

5.如权利要求3所述的聚唾液酸的脂质接枝衍生物，其特征在于，所述R-COOH的羧基与SA上的4、7或9位碳上羟基成酯。

6.如权利要求1-2任何一项所述的聚唾液酸脂质接枝衍生物，其特征在于，所述R-COOH的羧基与SA上的9位碳上的羟基成酯。

7.如权利要求3所述的聚唾液酸脂质接枝衍生物，其特征在于，所述R-COOH的羧基与SA上的9位碳上的羟基成酯。

8.如权利要求1-2、5或7所述的聚唾液酸脂质接枝衍生物，其特征在于，所述R-COOH选自十二烷基二甲基甜菜碱、十二烷基二羟乙基甜菜碱、十四烷基二甲基甜菜碱、十六烷基二甲基甜菜碱、十八烷基二甲基甜菜碱、十八烷基二羟乙基甜菜碱、月桂酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、十八酰胺基丙基甜菜碱、辛酸/癸酸酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺羟磺甜菜碱、十八酸、十六酸、十四酸、十二酸。

9.如权利要求3所述的聚唾液酸脂质接枝衍生物，其特征在于，所述R-COOH选自十二烷基二甲基甜菜碱、十二烷基二羟乙基甜菜碱、十四烷基二甲基甜菜碱、十六烷基二甲基甜菜碱、十八烷基二甲基甜菜碱、十八烷基二羟乙基甜菜碱、月桂酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、十八酰胺基丙基甜菜碱、辛酸/癸酸酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺羟磺甜菜碱、十八酸、十六酸、十四酸、十二酸。

10.如权利要求4所述的聚唾液酸脂质接枝衍生物，其特征在于，所述R-COOH选自十二烷基二甲基甜菜碱、十二烷基二羟乙基甜菜碱、十四烷基二甲基甜菜碱、十六烷基二甲基甜菜碱、十八烷基二甲基甜菜碱、十八烷基二羟乙基甜菜碱、月桂酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、十八酰胺基丙基甜菜碱、辛酸/癸酸酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺羟磺甜菜碱、十八酸、十六酸、十四酸、十二酸。

11.如权利要求6所述的聚唾液酸脂质接枝衍生物，其特征在于，所述R-COOH选自十二烷基二甲基甜菜碱、十二烷基二羟乙基甜菜碱、十四烷基二甲基甜菜碱、十六烷基二甲基甜菜碱、十八烷基二甲基甜菜碱、十八烷基二羟乙基甜菜碱、月桂酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、十八酰胺基丙基甜菜碱、辛酸/癸酸酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺羟磺甜菜碱、十八酸、十六酸、十四酸、十二酸。

12.根据权利要求1-2、5或7所述的聚唾液酸脂质接枝衍生物，其特征在于，所述R-COOH选自十八烷基二甲基甜菜碱，十八酸。

13.如权利要求3所述的聚唾液酸脂质接枝衍生物，其特征在于，所述R-COOH选自十八烷基二甲基甜菜碱，十八酸。

14.如权利要求4所述的聚唾液酸脂质接枝衍生物，其特征在于，所述R-COOH选自十八烷基二甲基甜菜碱，十八酸。

15.如权利要求6所述的聚唾液酸脂质接枝衍生物，其特征在于，所述R-COOH选自十八烷基二甲基甜菜碱，十八酸。

16.权利要求1-15中任何一项所述的聚唾液酸脂质接枝衍生物在微粒给药制剂的制备和修饰中的应用。

17.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述的微粒给药制剂为胶束、脂质体、囊泡、乳剂或纳米粒。

18.如权利要求16或17所述的应用，其特征在于，所述的微粒给药制剂中，药物与聚唾液酸脂质接枝衍生物的质量比为1:3～1:80。

19.如权利要求16或17所述的应用，其特征在于，所述的微粒给药制剂中，药物与聚唾液酸脂质接枝衍生物的质量比为1:10～1:20。