CN101015699A - 聚乙二醇－磷脂酰乙醇胺聚合物或它的药用酸加成盐及在制药中的应用 - Google Patents

Abstract

聚乙二醇－磷脂胆碱聚合物或它的药用酸加成盐及在制药中的应用属于纳米药物制备的技术领域，聚乙二醇－磷脂胆碱聚合物或它的药用酸加成盐，由下述通式(I)表示，即在甲氧基聚乙二醇与磷脂胆碱之间，通过连接拉手“link”相联，拉手“link”为取代亚甲基或对氧醚基取代苯甲叉基或草酰基：该聚合物可作为药物载体，尤其是制备抗肿瘤药物脂质体制剂时，能使抗肿瘤药物在肿瘤部位主动或被动靶向浓集。提供通式(I)的聚合物或其药用酸加成盐在制备治疗肿瘤、心脑血管疾病、炎症感染、哮喘等疾病的药物中的应用。

Description

聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物或它的药用酸加成盐及在制药中的应用

技术领域

本发明属于聚乙二醇(PEG)和磷脂酰乙醇胺的聚合物、其药用酸加成盐，及其制备方法，以及作为药物载体在制备药物中的应用，属于纳米药物制备的技术领域。

背景技术

脂质体具有靶向性、较长的血液滞留时间和较高的器官分布选择性，能提高药物的疗效和减少毒副作用。

脂质体主要作为静脉给药药物的载体，然而，网状内皮组织(简称RES)细胞可快速清除脂质体，严重限制了其作为血管给药载体的使用选择范围。一般一次静脉注射后，RES系统可在一小时之内清除80％-95％的脂质体，远远高于预定的靶部位对它的摄取速度。因此，脂质体对病变组织的治疗被主要限制在对病变的RES系统的治疗。

聚乙二醇修饰的长循环脂质体，增加了脂质体的血液循环时间，不但能够逃避网状内皮系统的捕获，还能提高脂质体的被动靶向性。聚乙二醇价廉易得、可大规模生产，制备使用聚乙二醇—磷脂衍生物，使药物制剂工艺相对简单，目前已成为高分子修饰脂质体的研究重点。

聚乙二醇修饰的脂质体阿霉素(doxorubicin)已于1995年在美国上市，商品名为Doxil，用于治疗与AIDS相关的Kaposi肉瘤(KS)，其他临床研究的适应症有晚期乳腺癌、子宫癌、头颈部恶性肿瘤和小细胞肺癌。

STEALTH^是Doxil的脂质体载体，其主要成分为甲氧基聚乙二醇-全氢大豆卵磷脂胆碱(MPEG-DSPE)，结构式如下：

即甲氧基聚乙二醇(MPEG分子量约为2000)与全氢大豆卵磷脂胆碱(DSPE)之间，通过羰基相联。PEG和DSPE都分别是已批准的药物敷料或载体，它们中间通过羰基相联所得到的产物，在毒副作用等方面都有较大的可靠性，奠定了MPEG-DSPE最终被美国FDA批准的物质基础。

STEALTH^脂质体作为抗肿瘤药物阿霉素的载体，其优越的载药性能、纳米粒子表面稳定性能以及降低药物毒副作用和提高药物稳定性作用，使药品Doxil得到广泛认可。但其在中国的售价非常昂贵，约为6000元人民币/支，大大限制了其使用。同时，STEALTH^脂质体在体内停留时间过长(在人体的半衰期约为55小时)。

发明内容

技术问题：本发明的目的是为解决上述问题，提供一类聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物或它的药用酸加成盐及在制药中的应用。该聚合物可作为药物载体，尤其是制备抗肿瘤药物脂质体制剂时，能使抗肿瘤药物在肿瘤部位主动或被动靶向浓集。本发明的另一目的在于提供通式(I)的聚合物或其药用酸加成盐在制备治疗肿瘤、心脑血管疾病、炎症感染、哮喘等疾病的药物中的应用。

技术方案：本发明以常用药物敷料聚乙二醇和磷脂酰乙醇胺为起始原料，引入前药原理和抗肿瘤主动靶向性设计(pH)原理(利用肿瘤细胞的pH值较一般正常细胞低、酸性更强的特点，在聚乙二醇结构和磷脂酰乙醇胺结构的结合部位插入酸敏感结合基团，如缩醛或缩酮在酸性条件下易水解；席夫氏碱在酸性条件下易水解)，改变聚乙二醇和磷脂酰乙醇胺之间的化学键连接方式，所制备的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物，作用机制与MPEG-DSPE相似，进入肿瘤细胞后，由于较酸的pH环境，聚乙二醇与磷脂酰乙醇胺之间的化学键相对容易断裂，抗肿瘤药物释放出来。而在正常组织细胞中该化学键相对稳定，抗肿瘤药物不会释放出来，从而达到抗肿瘤药物靶向性的目的。

本发明的目的可通过以下措施来达到：

本发明的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物或它的药用酸加成盐由下述通式(I)表示，即在甲氧基聚乙二醇与磷脂酰乙醇胺之间，通过连接拉手“link”相联，拉手“link”为取代亚甲基或对氧醚基取代苯甲叉基或草酰基：

其中，n为10-100的整数，m或ml为3-20的整数，P为磷原子。

拉手“link”为取代亚甲基，由下述通式(II)表示，

其中，R或R₁为H或C1-C6的烷基或相连的烷基；n为10-100的整数；m或ml为3-20的整数，P为磷原子。

拉手“link”为对氧醚基取代苯甲叉基，由下述通式(III)表示：

其中，R为H或C1-C4的烷基或C1-C4的烷氧基；n为10-100的整数；m或ml为3-20的整数，P为磷原子。

拉手“link”为草酰基，由下述通式(IV)表示：

其中，n为10-100的整数；m或ml为3-20的整数，P为磷原子。

该聚合物或它的药用酸加成盐用作药物组合物或药物载体制备药物脂质体。

该聚合物或它的药用酸加成盐用作抗肿瘤药物脂质体制剂时，抗肿瘤药物被包裹在脂质体中，平均粒径在70-160纳米之间，能使抗肿瘤药物在肿瘤部位主动或被动靶向浓集。

本发明的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物或它的药用酸加成盐在制药中的应用有以下几方面：

该聚合物或其药用酸加成盐作为药物载体用于制备治疗肿瘤疾病的药物中的应用；

该聚合物或其药用酸加成盐作为药物载体用于制备治疗心脑血管疾病的药物中的应用。

该聚合物或其药用酸加成盐作为药物载体用于制备治疗炎症感染疾病的药物中的应用；

该聚合物或其药用酸加成盐作为药物载体用于制备治疗哮喘疾病的药物中的应用；

本发明的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物通式(II)或它的药用酸加成盐的制备方法采用缩醛或缩酮的常规制备方法，催化剂为质子酸或路易斯酸，无水条件控制得好坏是至关重要的。如实施例1所示。

本发明的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物通式(III)或其药用酸加成盐的制备方法是先将取代对羟基苯甲醛的醛基与磷脂酰乙醇胺的氨基部分脱水形成席夫氏碱亚胺，再在强酸酐(优选三氟甲磺酸酐)的作用下，有机或无机碱作为催化剂或缚酸剂，取代对羟基苯甲醛的酚羟基与聚乙二醇的醇羟基脱水形成苯醚键，同时制得通式(III)的聚合物。如实施例2所示。

本发明的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物通式(IV)或其药用酸加成盐的制备方法有两种，一种是草酸酐与聚乙二醇反应得到聚乙二醇草酸酯，后者在氯化剂(优选氯化亚砜)作用下，制得酰氯，酰氯再在磷脂酰乙醇胺的氨基上发生酰化反应，制得通式(IV)的聚合物。如实施例3方法一所示。另一种是用草酰氯先酯化聚乙二醇，再酰胺化磷脂酰乙醇胺制得通式(IV)的聚合物。如实施例3方法二所示。

本发明的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物或它的药用酸加成盐用作药物组合物或药物载体制备药物脂质体时，该脂质体的组成包括：

药物(优选抗肿瘤药物)；本发明的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物或其药用酸加成盐；卵磷脂或大豆卵磷脂；胆固醇；维生素E；组氨酸；柠檬酸；柠檬酸钠；无水碳酸钠；硫酸铵；海藻糖或蔗糖；注射用水。

包裹在脂质体中的药物优选蒽醌类抗肿瘤药物如阿霉素、表阿霉素等；铂类抗肿瘤药物如顺铂、草酸铂等。

包裹在脂质体中的药物可选择心脑血管药物如尼莫地平、氨氯地平、非洛地平、维拉帕米、颉沙坦、洛沙坦等。

包裹在脂质体中的药物还可选择抗生素如两性霉素B，万古霉素，阿昔洛韦，氟康唑，青霉素类，头孢菌素类等。

该脂质体的优选制备方法为：

该脂质体被制成均一的大小在70-160纳米之间的脂质体。该范围内的脂质体可以穿过血管进入肿瘤组织，适合于药物在体内的传输，也适于滤过除菌。小于70纳米的脂质体可以轻易穿过血管进入组织，但其包裹药物的能力太差；上限160纳米并不是可穿过血管囊泡的最大尺度，而是注射前过滤除菌步骤要求的最大上限尺寸。

控制脂质体大小的方法是将脂质体的水悬浮液积压通过孔径大小均一的聚碳酸酯膜。孔径大小一般在30-200纳米之间，常见的有50、80、100纳米。膜的孔径大小与通过这个膜的脂质体的最大大约尺寸一致。也可使用高压压挤和脂质体均一化方法。

药物的包封可采用被动和主动方法。

被动方法如常规脂质体制备方法。

主动方法是在较高浓度的硫酸铵溶液中制备脂质体。在“裁减”好脂质体的大小后，用硫酸铵溶液处理脂质体悬浮液从而在脂质体的膜表面制造出从内到外的铵离子浓度梯度。通过不含铵的介质(如等渗的葡萄糖介质)的透析或透析过滤，或是凝胶层析(0.15M的NaCl或是KCl饱和的SG-50柱)的方法制造出铵离子梯度。这样可以用钠离子或钾离子或非电解质置换出表层的硫酸铵。或者，也可以用不含铵离子的溶液稀释脂质体悬浮液，这样也可减少表面的铵离子浓度。脂质体内部的铵离子浓度要比外部的浓度大至少10倍，最好的有100-1000倍。

脂质体的硫酸铵浓度梯度制造出了一种化学梯度，使得其易于捕获未电离的胺，这样药物就被脂质体内部的亲水相所捕获。将20-200mg/ml浓度的脂质体悬浮液与药物的水溶液混合，搅拌几小时使其均匀。温度可保持在室温到60度之间(取决于脂质转变到脂质体所需的相转移温度)。

常规通用的方法是，将浓度为50μmol/ml的脂质体悬浮液与同体积的浓度在5-8mg/ml的药物相混合。最后，除去游离的药物。除去游离的药物的方法优选通过离子交换树脂，如Dowex 50wx-4，它可以与游离的药物结合，但不与脂质体包封的药物结合。

制得的药物脂质体包封率在90％以上。制得的药物脂质体可以在低温下(8℃以下)保存。

使用本发明的载体制备脂质体包封阿霉素的优选处方如下：

阿霉素20克，本发明的聚合物(II)(m＝ml＝12，n＝45，R＝R1＝H)3.4克，大豆卵磷脂9.5克，胆固醇3.2克，维生素E8毫克，硫酸铵2克，组氨酸3克，蔗糖80克，注射用水1000ml，用HCl和NaOH调节pH为6.5。

采用硫酸铵梯度法制备上述阿霉素脂质体的方法如下：

旋转真空蒸发形成透明脂膜；

脂膜水化后，形成脂质体粗混悬液；

挤压法使较大粒径的脂质体变成较小粒径的脂质体；

透析法使脂质体膜内外形成硫酸铵梯度；

空白脂质体装载阿霉素。

本发明制备的阿霉素脂质体冻干后，产品质量稳定。

有益效果：本发明制备的阿霉素脂质体用于治疗肿瘤的动物实验：

将小鼠100只称重，随机分成10组，每组10只；H22从传代小鼠腹腔中抽出，计数，稀释至5×10⁶个·ml^-1，接种于小鼠右侧腋皮下(0.2ml·只^-1)。为平行对照起见，本发明阿霉素脂质体、阿霉素普通脂质体和普通阿霉素注射液(阳性对照药)都使用相同剂量，为5mg·kg^-1，空白对照组注射等体积的生理盐水。给药次数为单次给药。给药时间分别为接种后第2天和接种后第5天。给药部位为尾静脉注射给药。接种两周后，将小鼠拉断颈锥处死，剥离瘤体，称重。

结果：

肿瘤细胞接种后第2天给予本发明阿霉素脂质体5mg·kg^-1剂量治疗，其瘤重抑制率达67％，显著高于普通脂质体和普通阿霉素给药组；普通脂质体给药组的瘤重抑制率约为43％，显著高于普通阿霉素给药组的瘤重抑制率(31％)。本发明阿霉素脂质体治疗组与空白对照组及普通阿霉素治疗组相比，两组之间小鼠的瘤重有显著性差异；与普通脂质体治疗组相比，两组小鼠的瘤重有显著性差异。

肿瘤细胞接种后第5天给予本发明阿霉素脂质体5 mg·kg^-1剂量治疗，其瘤重抑制率达70％，显著高于普通脂质体给药组的瘤重抑制率(57％)；显著高于普通阿霉素给药组的瘤重抑制率(37％)。本发明阿霉素脂质体治疗组与空白对照组、普通阿霉素治疗组分别相比，两组之间小鼠的瘤重有显著性差异；与普通脂质体治疗组相比，两组小鼠的瘤重有显著性差异。

研究结果表明，本发明的药物载体可明显提高药物在肿瘤部位的浓度，明显提高药物的抗肿瘤治疗效果。

具体实施方式

本发明的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物或它的药用酸加成盐由下述通式(I)表示，即在甲氧基聚乙二醇与磷脂酰乙醇胺之间，通过连接拉手“link”相联，拉手“link”为取代亚甲基或对氧醚基取代苯甲叉基或草酰基：

其中，n为10-100的整数，m或ml为3-20的整数，P为磷原子。

拉手“link”为取代亚甲基，由下述通式(II)表示：

其中，R或R₁为H或C1-C6的烷基或相连的烷基；n为10-100的整数；m或ml为3-20的整数，P为磷原子。

拉手“link”为对氧醚基取代苯甲叉基，由下述通式(III)表示：

其中，R为H或C1-C4的烷基或C1-C4的烷氧基；n为10-100的整数；m或ml为3-20的整数，P为磷原子。

拉手“link”为草酰基，由下述通式(IV)表示：

其中，n为10-100的整数；m或ml为3-20的整数，P为磷原子。

该聚合物或其药用酸加成盐可用作药物组合物或药物载体制备药物脂质体。

该聚合物及其药用酸加成盐用作抗肿瘤药物脂质体制剂时，抗肿瘤药物被包裹在脂质体中，平均粒径在70-160纳米之间，能使抗肿瘤药物在肿瘤部位主动或被动靶向浓集。

实施例1

聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物通式(II)的制备通法

在1000ml三颈瓶中，加入MPEG-2000(20g；0.01mol)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(0.01mol)及氯仿500ml，再加入多聚甲醛(3g，0.1mol)，搅拌下，加热回流，慢慢滴入浓盐酸10ml，继续反应，TLC监测反应进程，展开剂为2-丁酮/醋酸/水＝40/25/5，v/v/v，碘显色，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的Rf值为0.68，10小时后，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺已大部分反应完全，将反应液蒸干，残留物用10ml二氯甲烷溶解，进行剃度柱层析，洗脱液为二氯甲烷及甲醇。合并产物组分，浓缩得11g无色蜡状甲氧基聚乙二醇2000-亚甲基-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。

实施例2

聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物通式(III)的制备通法

在1000ml三颈瓶中，加入脑磷脂(0.01mol)、对羟基苯甲醛(1.22g，0.01mol)及无水甲苯300ml，回流带水至蒸出的甲苯澄清，TLC监测反应进程，待用。

在500ml三颈瓶中，加入MPEG-1900(19g；0.01mol)及无水氯仿300ml，用冰盐浴冷却，慢慢加入三乙胺10ml和三氟甲磺酸酐3ml，惰性气体保护，搅拌过夜。次日，将反应液慢慢滴入上述反应液中，逐渐升温蒸去氯仿，于110℃反应16小时，将反应液蒸干，残留物用10ml二氯甲烷溶解，进行剃度柱层析，洗脱液为二氯甲烷及甲醇。合并产物组分，浓缩得3g无色蜡状甲氧基聚乙二醇1900-氧基苯甲叉-脑磷脂。

实施例3

聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物通式(IV)的制备通法

方法一：

在500ml三颈瓶中，加入MPEG-1500(15g；0.01mol)及无水苯300ml，搅拌下，慢慢滴入草酸酐(1.4g，0.02mol)，继续回流反应4小时，冷却至室温，加入新蒸二氯亚砜10ml，继续回流反应4小时，逐渐升温蒸发至干，加无水苯带酸3次，用无水苯300ml溶解待用。

在1000ml三颈瓶中，加二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或脑磷脂(0.01mol)、三乙胺10ml及无水苯300ml，搅拌下，冰盐浴中，慢慢滴加上述溶液，滴毕，继续回流反应6小时，将反应液蒸干，残留物用10ml二氯甲烷溶解，进行剃度柱层析，洗脱液为二氯甲烷及甲醇。合并产物组分，得8g无色蜡状甲氧基聚乙二醇1500-草酰-脑磷脂或5g无色蜡状甲氧基聚乙二醇1500-草酰-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。

方法二：

在1000ml三颈瓶中，加草酰氯(1.26g；0.01mol)及无水苯100ml，冰盐浴中，慢慢滴入MPEG-1500(15g；0.01mol)在无水苯200ml的溶液，滴毕，继续室温反应1小时，再慢慢滴入脑磷脂(0.01mol)在无水苯200ml的溶液，继续回流反应2小时，将反应液蒸干，残留物用10ml二氯甲烷溶解，进行剃度柱层析，洗脱液为二氯甲烷及甲醇。合并产物组分，得2g无色蜡状甲氧基聚乙二醇1500-草酰-脑磷脂。

实施例4

阿霉素脂质体的制备一：

在500ml磨口梨形瓶中，精密称取卵磷脂、胆固醇和本发明的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物或其药用酸加成盐(摩尔比为1∶0.18∶0.15)溶于氯仿200ml，恒温水浴中，旋转蒸发仪减压蒸除有机溶剂氯仿，形成均匀类脂薄膜，冷却至室温，加乙醚150ml溶解，制得类脂溶液。将阿霉素0.2g溶于无水乙醇10ml中，加入类脂溶液，然后再加入pH6.8的磷酸缓冲液，超声分散，恒温35℃下减压除去有机溶剂，加适量的水合介质，超声3min，100nm微孔滤膜过滤整粒，用SephadexG50葡聚糖凝胶层析分离游离药物，分装到西林瓶内，冷冻干燥，即得本发明阿霉素脂质体成品。

阿霉素脂质体的制备二：

在500ml磨口梨形瓶中，精密称取卵磷脂、本发明的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物或其药用酸加成盐(摩尔比为1∶0.18∶0.15)溶于氯仿200ml，恒温水浴中，旋转蒸发仪减压蒸除有机溶剂氯仿，形成均匀类脂薄膜，冷却至室温，将浓度为100mmol·L^-1(NH₄)₂SO₄溶液200ml加入类脂膜中，超声10min，得空白脂质体混悬液，将此混悬液过合适的微孔滤膜过滤整粒，即得粒径70-160nm的空白脂质体。将空白脂质体置透析袋中透析3次，透析液为5％葡萄糖溶液，取出后重新放入500ml磨口梨形瓶中，另精密称取阿霉素0.2g，溶于水中，将此溶液加入至空白脂质体混悬液，于60℃放置30min，不时振摇，用SephadexG50葡聚糖凝胶层析分离游离药物，分装到西林瓶内，冷冻干燥，即得本发明阿霉素脂质体成品。普通脂质体的制备同阿霉素脂质体的制备一或二，仅在膜材中不加本发明的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物或其药用酸加成盐。

Claims (10)

1.一种聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物或它的药用酸加成盐，其特征在于该聚合物或它的药用酸加成盐由下述通式(I)表示，即在甲氧基聚乙二醇与磷脂酰乙醇胺之间，通过连接拉手“link”相联，拉手“link”为取代亚甲基或对氧醚基取代苯甲叉基或草酰基：

其中，n为10-100的整数，m或ml为3-20的整数，P为磷原子。

2.根据权利要求1所述的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物或它的药用酸加成盐，其特征在于拉手“link”为取代亚甲基，由下述通式(II)表示：

其中，R或R₁为H或C1-C6的烷基或相连的烷基；n为10-100的整数；m或ml为3-20的整数，P为磷原子。

3.根据权利要求1所述的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物或它的药用酸加成盐，其特征在于拉手“link”为对氧醚基取代苯甲叉基，由下述通式(III)表示：

其中，R为H或C1-C4的烷基或C1-C4的烷氧基；n为10-100的整数；m或ml为3-20的整数，P为磷原子。

4.根据权利要求1所述的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物或它的药用酸加成盐，其特征在于拉手“link”为草酰基，由下述通式(IV)表示：

其中，n为10-100的整数；m或ml为3-20的整数，P为磷原子。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物或它的药用酸加成盐，其特征在于该聚合物或其药用酸加成盐用作药物组合物或药物载体制备药物脂质体。

6.根据权利要求1或2或3或4所述的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物或它的药用酸加成盐，其特征在于该聚合物及其药用酸加成盐用作抗肿瘤药物脂质体制剂时，抗肿瘤药物被包裹在脂质体中，平均粒径在70-160纳米之间，能使抗肿瘤药物在肿瘤部位主动或被动靶向浓集。

7.一种如权利要求1或2或3或4所述的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物或它的药用酸加成盐在制药中的应用，其特征在于该聚合物或其药用酸加成盐作为药物载体用于制备治疗肿瘤疾病的药物中的应用。

8.一种如权利要求1或2或3或4所述的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物或它的药用酸加成盐在制药中的应用，其特征在于该聚合物或其药用酸加成盐作为药物载体用于制备治疗心脑血管疾病的药物中的应用。

9.一种如权利要求1或2或3或4所述的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物或它的药用酸加成盐在制药中的应用，其特征在于该聚合物或其药用酸加成盐作为药物载体用于制备治疗炎症感染疾病的药物中的应用。

10.一种如权利要求1或2或3或4所述的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺聚合物或它的药用酸加成盐在制药中的应用，其特征在于该聚合物或其药用酸加成盐作为药物载体用于制备治疗哮喘疾病的药物中的应用。