CN103479578B

CN103479578B - 一种马来酸匹杉琼的脂质体制剂及其制备工艺

Info

Publication number: CN103479578B
Application number: CN201210195910.0A
Authority: CN
Inventors: 邓意辉; 翟文君; 宋冠杉; 骆翔; 佘振南; 欧瀚杰
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2012-06-14
Filing date: 2012-06-14
Publication date: 2016-08-03
Anticipated expiration: 2032-06-14
Also published as: CN103479578A

Abstract

本发明属于药物制剂领域，公开了一种马来酸匹杉琼的脂质体制剂及其制备工艺。本制剂由马来酸匹杉琼、磷脂、胆固醇及梯度建立物质制备而成。该制备工艺包括制备空白脂质体、梯度脂质体、装载药物等步骤。制备工艺简单易行，所得制剂稳定性好，包封率高，并可提高药物的肿瘤靶向性并降低其毒副作用。

Description

一种马来酸匹杉琼的脂质体制剂及其制备工艺

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种马来酸匹杉琼脂质体制剂及其制备工艺。

背景技术

匹杉琼（Pixantrone）是新一代蒽环类抗生素，与米托蒽醌具有相似的结构及相当的抗肿瘤活性，同时心脏毒性较小。它可以嵌入到DNA碱基之间从而阻断DNA合成与转录，导致DNA链的交联和链结构的破坏；同时能够抑制II型拓扑异构酶的活性，从而导致基因组DNA的崩解。目前该化合物的药用形式是其马来酸盐，即马来酸匹杉琼（BBR2778，CAS号144675-97-8）。该药物最初由佛蒙特州大学的研究员MilesP.Hacker以及PaulA.Krapcho合成并进行体外细胞毒实验，之后由意大利Novuspharma公司进行开发并申请了注射剂专利（INJECTABLEPHARMACEUTICALCOMPOSITIONSOFANANTHRACENEDIONEDERIVATIVEWITHANTI-TUMORALACTIVITY.US20060199831A1），该专利提供了一种含有BBR2778的冻干粉针剂。2003年，美国CellTherapeutics公司并购Novuspharma而获得该药物。BBR2778的现有剂型为注射剂，美国FDA正在对其治疗复发或顽固性侵润性非霍其金淋巴瘤的上市申请进行复审，预计在2012年将会获得批准，BBR2778用于实体瘤的治疗亦在临床研究当中。

马来酸匹杉琼（BBR2778）的结构见下：

尽管BBR2778有着广阔的临床应用前景，但它依然存在许多毒副作用，如发热、感染、贫血等，以及中性粒细胞、白细胞和血小板的减少（OverviewofPixantroneDimaleateActivityinNon-Hodgkin'sLymphoma.RHVanderJagt,RPettengell,FHurtadodeMendoza,GNarayanan）。而且当以静脉注射的方式给予CD1小鼠40或60mg/kg的BBR2778时，在治疗期间或治疗后立即观察到一些动物死亡，这类死亡与BBR2778的下列因素有关：改变血凝参数，导致血栓和广泛性凝血；诱导过敏性休克；中枢神经系统毒性；导致心律失常；破坏电解质平衡。（US5587382、US5717099、US5506232、J.MED.CHEM1994，37：828-837）。最为严重的是，当BBR2778以常规注射液形式进行临床给药时出现严重的蓄积性心脏毒性反应（LownJW,MorganAR,YenSF,WangYH,WilsonWD.Characteristicsofthebindingoftheanticanceragentsmitoxantroneandametantroneandrelatedstructurestodeoxyribonucleicacids.Biochemistry1985;24:4028-35.DennyWA,WakelinLP.Kineticsofthebindingofmitoxantrone,ametantroneandanaloguestoDNA:relationshipwithbindingmodeandanti-tumouractivity.AnticancerDrugDes1990;5:189-200.）。这些毒性反应与药物在体内的分布相关并存在剂量依赖性的特点，严重阻碍了BBR2778的临床应用。因此，有必要开发具有靶向和/或缓释作用的BBR2778制剂，以提高其疗效并降低其毒副反应。

脂质体（liposomes）属于靶向给药系统中的一种新剂型，是由磷脂分子分散在水中形成的类球状、包封一部分水相的封闭囊泡。脂质体通常含一层或多层类似于生物膜的磷脂双层膜，每层膜厚度约4nm，脂质体粒径大小通常在20nm至数十μm间。一般将磷脂膜内部所包封的水相称为脂质体的内水相，反之称为脂质体外水相。脂质体通过静脉注射进入体内后主要被网状内皮系统（MPS）吞噬，激活机体的自身免疫功能。相比与溶液制剂，脂质体也能极大程度地改变被包封药物的体内分布。当脂质体作为抗肿瘤药物（尤其是化疗药物）的载体时，往往可以增加药物在肿瘤组织的蓄积量并减少药物在正常组织的分布，这与肿瘤的生理特点有关。肿瘤由于快速生长，其血管间隙可达到100~800nm，而正常血管内皮细胞之间的间隙通常在2nm左右。因此，如果脂质体可以在血液中较长时间的循环，并且脂质体的粒径＜200nm，它就易于蓄积在肿瘤区。这被称为实体肿瘤的EPR效应（Enhancedpermeabilityandretentioneffect）。此外，为实现EPR效应，脂质体药物在体内的循环时间需要达到6h或以上，这就要求一种相对较慢的药物释放速度和较长的载体循环时间。

在制备含药脂质体时，根据药物被装载机理的不同，可分为被动载药和主动载药两大类。传统上，人们使用较多的是被动载药法，即将药物溶于水相或有机相中，然后按适宜方法（如薄膜分散法、逆相蒸发法等）制备含药脂质体，该法适于脂溶性强或水溶性强的药物。而对于两亲性药物，例如某些弱酸弱碱，其油水分配系数受pH和离子强度的影响较大，用被动载药法一般难以制得包封率较高的脂质体。而主动载药法通过构建内外水相间的不同离子或化合物梯度进行载药，所得两亲性药物脂质体包封率高、渗漏少。主动载药得以进行主要依托于下列条件：（1）脂质体磷脂双层膜可以选择性的将脂质体内外的水溶性物质，包括正电荷的质子和K+/Na+等各种离子有效地分隔开来，形成脂质体内外相对独立的环境；（2）亲脂性的弱碱或弱酸性化合物在非离子态呈脂溶性，可以嵌入磷脂双层膜，并根据离子梯度透过磷脂膜进入脂质体内水相。生物体系中，离子梯度也是很多物质进出细胞的动力。

虽然很多药物都可以通过被动载药或主动载药的方式制备为脂质体制剂，但并没有任何脂质体体系已经被证实能普遍用于改善治疗指数和治疗剂的活性，即使装载于脂质体中的药物可能通过EPR效应增加其在实体瘤的富集，要想获得比溶液剂型更高的疗效也是不容易的。一般来说，一个成功的脂质体制剂应当满足下列条件：（1）药物能够以有效的包封效率和足够的载药量包封在脂质体内；（2）在体外贮存期间内，药物不会从脂质体中释放；（3）脂质体药物在血液循环的过程中，药物不会发生显著的渗漏；（4）当脂质体聚集在肿瘤区以后，药物能够有效的释放，从而发挥药物的治疗作用。目前关于BBR2778的脂质体制剂仅有Novuspharma公司的专利“6,9－二－[(2－氨基乙基)氨基]苯并[g]异喹啉－5,10－二酮二马来酸酯的脂质体制剂，ZL00814600.4（权利已经终止）”进行了报道，该专利中使用被动载药技术将BBR2778装载于脂质体内部，但是BBR2778作为一个水溶性分子，当采用常规的被动载药工艺载入脂质体内水相后，很容易从脂质体内部泄露。这样就会产生两方面的问题，一方面，制剂进入体内后药物很快从脂质体中泄露，从而难以借助EPR效应更好地实现肿瘤靶向；另一方面，通过被动载药技术制备的BBR2778脂质体在放置过程中即发生药物与脂质体的分离，导致该发明并不能实现降低BBR2778注射急性毒性反应的作用；再者，由于常规脂质体对于单核巨噬细胞吞噬系统（RES）的趋向性，其装载的药物可能因此大量聚集在肝脏等部位而造成不期望的毒副作用。此外，我们的研究工作表明，以被动载药工艺（包括薄膜分散法和逆向蒸发法）制备BBR2778脂质体时（药物/磷脂重量比为1:15），药物包封率均小于10%（见实施例部分）。对于该药物而言，如此低的包封率几乎不具备临床应用价值。再者，专利ZL00814600.4采用薄膜分散法制备BBR2778脂质体，该法难以适应工业化生产的规模，而且其技术方案中使用的氯仿亦具有较大的毒性和爆炸性，所以其制备工艺不具产业化潜力。

发明内容：

为解决现有匹杉琼（Pixantrone，BBR2778）制剂的不足，本发明提供了一种采用离子梯度载药技术制备的BBR2778脂质体制剂，该制剂具有药物滞留性强、体内抗肿瘤疗效优、且放置稳定性好的优点，相应的制备工艺条件可控、易于实现工业化放大。本发明所提供的BBR2778脂质体比BBR2778溶液和专利（ZL00814600.4）报道的采用被动载药法制备的BBR2778脂质体具有更优的抑瘤效果和更低的毒性。

为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种马来酸匹杉琼的脂质体制剂，其特征在于脂质体含有马来酸匹杉琼、磷脂、胆固醇、梯度建立物质；同时满足，胆固醇与磷脂的重量比为1:2~1:10，磷脂与马来酸匹杉琼的重量比为3:1~30:1。

一般而言，我们将脂质体脂双层膜的构成材料称为脂质体的膜材。对于脂质体而言，膜材可以单独由磷脂构成，也可以在其中加入胆固醇。另外，为了使脂质体获得一些特殊的体内性质，其膜材中还可以加入一些磷脂的衍生物，如具有亲水片段的磷脂DSPE-mPEG。膜材中胆固醇的加入有助于维持脂质体的体内循环稳定性。但是在另一方面，膜材中胆固醇与磷脂的比例也影响药物的装载。在本发明中，我们发现胆固醇与磷脂的重量比为1:2~1:10，优选为1:2~1:6，更优选为1:2~1:3时，所获得脂质体具有较好的包封率。此外，由于脂质体载药量过小时不利于临床用药，过大时则难以获得较高的包封率，所以我们还应当选择合适的载药量。因此，作为优选方案：BBR2778脂质体中磷脂与BBR2778的重量比优选为8:1~30:1；作为更优选的方案，磷脂与BBR2778的重量比为15:1~25:1。

本发明中所述磷脂为甘油磷脂或鞘磷脂，选自天然磷脂、半合成磷脂以及人工合成磷脂中的一种或多种。即所述磷脂选择自天然的、半合成的或全合成的磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酸（PA）、心肌磷脂（cardiolipin）、鞘磷脂（SM）中的一种或多种。

优选的，本发明所述磷脂选自下列磷脂中的一种或多种的组合：大豆磷脂（SoyPC）、氢化大豆磷脂(HSPC)、蛋黄磷脂（EggPC）、氢化蛋黄磷脂（HEPC）、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）、二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）、二反式油酰磷脂酰胆碱(DEPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）、二山嵛酰磷脂酰胆碱（DBPC）、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱（POPC）、单棕榈酰磷脂酰胆碱（MPPC）、单硬酯酰胆碱（MSPC）、蛋黄脂酰磷脂酰乙醇胺（EggPE）、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（DMPE）、蛋黄磷脂酰甘油（EggPG）、大豆磷脂酰甘油（SoyPG）、二硬脂酰磷脂酰甘油（DSPG）、二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）、二油酰磷脂酰甘油（DOPG）、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG）、大豆磷脂酰丝氨酸（SoyPS）、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸（DSPS）、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸（DPPS）、二油酰磷脂酰丝氨酸（DOPS）、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸（DMPS）、蛋黄鞘磷脂（EggSM）、二硬脂酰鞘磷脂（DSSM）、二棕榈酰鞘磷脂（DPSM）、大豆磷脂酰肌醇（SoyPI）、二棕榈酰磷脂酰肌醇（DPPI）、二油酰磷脂酰肌醇（DOPI）、大豆磷脂酸（SoyPA）、蛋黄磷脂酸（EggPA）、二肉豆蔻酰磷脂酸（DMPA）、二棕榈酰磷脂酸（DPPA）。

更优选的，本发明所述磷脂选自下列磷脂中的一种或多种的组合：大豆磷脂（SoyPC）、氢化大豆磷脂(HSPC)、蛋黄磷脂（EggPC）、氢化蛋黄磷脂（HEPC）、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）、二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）、二反式油酰磷脂酰胆碱(DEPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）、二山嵛酰磷脂酰胆碱（DBPC）、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱（POPC）、单棕榈酰磷脂酰胆碱（MPPC）、单硬酯酰胆碱（MSPC）、蛋黄脂酰磷脂酰乙醇胺（EggPE）、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（DMPE）、蛋黄磷脂酰甘油（EggPG）、大豆磷脂酰甘油（SoyPG）、二硬脂酰磷脂酰甘油（DSPG）、二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG）、大豆磷脂酰丝氨酸（SoyPS）、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸（DSPS）、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸（DPPS）、蛋黄鞘磷脂（EggSM）、二硬脂酰鞘磷脂（DSSM）、二棕榈酰鞘磷脂（DPSM）、大豆磷脂酰肌醇（SoyPI）、二棕榈酰磷脂酰肌醇（DPPI）、大豆磷脂酸（SoyPA）、蛋黄磷脂酸（EggPA）、二棕榈酰磷脂酸（DPPA）。

作为最优选，磷脂选自EPC、HSPC、HEPC、DPPC、DSPC、MPPC、MSPC、DSPE、DPPE、EPG、DSPG、DPPG、EggSM、SoyPA中的一种或多种。

意外的是，本发明中，磷脂组成中含有磷脂酰甘油（PG）时，特别是含有DPPG时，所制备得到的马来酸匹杉琼脂质体在体内药效实验中体现出较好的抑瘤效果。其中最为典型的磷脂组成为HSPC:DPPG=2:1（wt/wt）。

另外，在本发明中，还可以加入“磷脂以外的脂质”，这里指具有由长链烷基等构成的疏水性基团、且分子内不含磷酸基团的脂质，没有特殊的限定，可以举出甘油糖脂质、神经鞘糖脂质等，或者是如1,2-Dioleoyl-3-trimethylammoniumpropanechloride(商品名COATSOMECL-8181TA，日本NOF)。在本发明所述马来酸匹杉琼脂质体的膜材中加入一定比例的“磷脂以外的脂质”，仍然可以制备出包封率高、药物滞留稳定、抗肿瘤效果良好的BBR2778脂质体。

本发明中，所述的马来酸匹杉琼（BBR2778）脂质体系采用主动载药法制备，虽然专利ZL00814600.4（权利已经终止）已经报道了使用常规的被动载药技术制备的BBR2778脂质体，但我们的研究工作发现，使用被动载药法制备的BBR2778脂质体药物易泄露且包封率低（从另一个角度可以理解为载药量低），也就是说几乎不能发挥脂质体作为一个靶向药物递送载体的优势，并且较低的载药量亦使该制剂失去临床实用价值。因此，需要一种更优的BBR2778脂质体制剂及其制备方法。我们研究发现，通过在脂质体内外水相间构建离子梯度，并利用此离子梯度进行BBR2778的装载，可以获得较好的载药量和药物滞留效果，所制备得到的BBR2778脂质体还具有较好的体内抗肿瘤效果。具体来说，本发明中所用的离子梯度主要为跨膜质子梯度，该质子梯度可以通过pH梯度法或胺（铵）离子梯度法构建，铵离子即NH₄ ⁺，而胺离子表示含有质子化氨基的有机化合物。离子梯度的实现需要在梯度建立物质的参与下完成。在本发明中，我们采用如下策略构建离子梯度用于BBR2778的装载：（1）在脂质体内外水相间构建直接的质子梯度，系指使用具有酸性的溶液（即梯度建立物质溶液）制备脂质体，然后在脂质体外水相中加入pH调节剂。（2）通过胺（铵）离子梯度法构建间接质子梯度，以经典的硫酸铵梯度为例，它是利用硫酸铵（ammoniumsulfate）溶液（等同于本发明中所述的梯度建立物质溶液）作为水化介质制备脂质体，再借助透析或分子排阻色谱等方法除去脂质体外水相的硫酸铵，随之建立的跨膜硫酸铵梯度会诱导间接pH梯度的产生，即内水相中的铵离子（NH₄ ⁺）电离产生NH₃和H⁺，由于NH₃跨膜速率远大于NH₄ ⁺、H⁺及SO₄ ^2-（渗透系数：NH₃1.3×10^-1cm/s；H⁺10^-3~10^-5cm/s；NH₄ ⁺10^-6~10^-7cm/s；SO₄ ^2-10^-13cm/s），所以当1个NH₃离开脂质体内部时，就会在内水相留下1个H⁺，此跨膜质子梯度可驱使弱碱性药物进入内水相。（3）使用具有酸性的梯度建立物质溶液制备脂质体，然后直接除去脂质体外水相中的梯度建立物质。（4）使用具有酸性的梯度建立物质溶液制备脂质体，然后直接除去脂质体外水相中的梯度建立物质，再向脂质体外水相中加入pH调节剂。（5）在已经建立胺（铵）离子梯度的脂质体外水相中加入pH调节剂。

在本发明中，我们构建跨膜离子梯度的具体方法如下：

当使用枸橼酸-枸橼酸钠溶液、酒石酸-酒石酸钠溶液、苹果酸-苹果酸钠溶液、磷酸二氢钠溶液、枸橼酸铵溶液、枸橼酸三乙胺溶液、磷酸二氢铵、蔗糖八硫酸酯三乙胺溶液中的一种或多种作为梯度建立物质时，除去脂质体外水相的梯度建立物质后即进行载药可获得较好的药物装载效果。当然，我们也可以在除去脂质体外水相的梯度建立物质后进一步向脂质体外水相中加入pH调节剂将脂质体外水相pH值调节至6~8，之后再进行药物装载。

当使用枸橼酸-枸橼酸钠溶液、酒石酸-酒石酸钠溶液、苹果酸-苹果酸钠溶液、磷酸二氢钠溶液中的一种或多种作为梯度建立物质时，我们也可以在不除去脂质体外水相梯度建立物质的情况下直接加入pH调节剂将脂质体外水相pH值调节至6~8，之后再进行药物装载。

本发明所述pH调节剂选自磷酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠或氢氧化钠中的一种或多种。pH调节剂的作用在于调节脂质体外水相的pH值以帮助跨膜质子梯度的构建，本发明中，通过将pH调节剂加入的到脂质体混悬液中以实现此目的，虽然pH调节剂是加入到脂质体混悬液这个体系中，但其作用主要是通过调节脂质体外水相的pH值来实现的。

在本研究工作中，我们发现在脂质体内水相中加入多阴离子大分子可以增加药物在脂质体内的滞留能力，这里所述的多阴离子大分子是指在一定条件下能够提供单价至多价阴离子的物质，例如植酸及其各种药学上可以接受的盐或复合物。在此还可以举出能提供下列阴离子的物质：SO₄ ^2-、PO₄ ^3-、HPO₄ ^2-、H₂PO₄ ^-、Cl^-、枸橼酸根、醋酸根、EDTA^4-、六偏磷酸根、三聚磷酸根、焦磷酸根、甘油磷酸根、果糖二磷酸根、三磷酸腺苷根、植酸根、邻苯二甲酸根、间苯二甲酸根、对苯二甲酸根、苯甲酸根、间苯二甲酸根、间苯三甲酸根、乳糖酸根、二巯基丁二酸根、二乙三胺五乙酸根、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸根或氨基三乙酸根。本发明中，多阴离子大分子选自海藻酸、右旋糖酐硫酸酯、硫酸葡聚糖、聚谷氨酸、植酸、乳糖酸、果糖酸、透明质酸或它们的盐及复合物中的一种或多种。作为优选，我们在脂质体内水相中加入海藻酸、右旋糖酐硫酸酯、植酸、硫酸葡聚糖或它们的盐及复合物中的一种或多种。以上所述的多阴离子大分子可以作为梯度建立物质中的成分用于制备脂质体，之后在脂质体跨膜离子梯度的建立过程中，外水相的多阴离子大分子亦被除去。

本发明中，我们采用的是离子交换法、透析法、凝胶过滤或者是这些技术的结合来除去脂质体外水相中的梯度建立物质。具体的手段如使用离子交换树脂或离子交换纤维，使用切向流过滤装置，使用凝胶过滤色谱柱等，但不限于这些方法。

本发明所述的马来酸匹杉琼脂质体，其处方中可以选择性的加入聚乙二醇与磷脂连接形成的亲水性高分子脂质衍生物、聚乙二醇与胆固醇连接形成的亲水性高分子脂质衍生物、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）与脂质相连形成的亲水性高分子脂质衍生物，亲水性高分子脂质衍生物与磷脂的摩尔比为1:10~1:40，更优选为1:10~1:20。

作为优选，亲水性高分子脂质衍生物具体选择聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（mPEG-DSPE）、聚乙二醇-胆固醇半琥珀酸酯（mPEG-CHS）、聚乙二醇单甲醚-二棕榈酰磷脂酰胆碱乙醇胺（mPEG-DPPE）、聚乙二醇单甲醚-二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（mPEG-DMPE）、聚乙二醇单甲醚-二油酰磷脂酰乙醇胺（mPEG-DOPE）；聚乙烯吡咯烷酮硬脂酸衍生物（PVP-S）。

作为更优选，亲水性高分子脂质衍生物使用mPEG₂₀₀₀-DSPE（PEG链的分子量为2000）、mPEG₅₀₀₀-DSPE（PEG链的分子量为5000）、mPEG₂₀₀₀-CHS（PEG链的分子量为2000）、mPEG₅₀₀₀-CHS（PEG链的分子量为5000）、mPEG₂₀₀₀-DPPE（PEG链的分子量为2000）、mPEG₅₀₀₀-DPPE（PEG链的分子量为5000）；作为最优选，使用mPEG₂₀₀₀-DSPE（PEG链的分子量为2000）、mPEG₅₀₀₀-DSPE（PEG链的分子量为5000）、mPEG₂₀₀₀-CHS（PEG链的分子量为2000）、mPEG₅₀₀₀-CHS（PEG链的分子量为5000）。

本发明提供了马来酸匹杉琼脂质体的制备工艺，该工艺含有以下步骤：

（a）制备空白脂质体：

在50~70℃下，优选为在55~65℃下以乙醇、乙醇-水混合溶剂作为溶媒溶解磷脂、胆固醇和可以选择性加入的亲水性高分子脂质衍生物的混合物，得到脂质混合物，磷脂重量与溶媒的体积之比约为1:1~1:6（g/mL）；作为优选，磷脂重量与乙醇的体积之比约为1:1~1:3（g/mL）；在此步骤中，脂质混合物还可以采用如下方法制备：在50~70℃下使用叔丁醇或叔丁醇-水混合溶剂作为溶媒溶解磷脂、胆固醇和可以选择性加入的亲水性高分子脂质衍生物的混合物，将此混合物进行冻干得到脂质混合物；

在50~70℃下，优选为在55~65℃下将脂质混合物与浓度为0.05~0.4mol·L^-1的梯度建立物质溶液混合并搅拌，得到脂质体初品，其中梯度建立物质溶液的浓度优选为0.15~0.35mol·L^-1，更优选为0.20~0.30mol·L^-1；将所得的脂质体初品通过微射流、挤出、高压均质或超声减小粒径，得到空白脂质体。

（b）：建立脂质体跨膜离子梯度，获得梯度脂质体。

（c）：将（b）所得的梯度脂质体混悬液与马来酸匹杉琼溶液混合，于55-65℃下孵育8-30min，得到马来酸匹杉琼脂质体。

进一步的，本发明还提供了含有马来酸匹杉琼脂质体的药物组合物，所述组合物含有本发明所提供的马来酸匹杉琼脂质体以及至少一种药学上可接受的附加剂，附加剂在这里可以是冻干保护剂、金属离子螯合剂、抗氧化剂等。此外，对于本发明所述的马来酸匹杉琼脂质体，还可以在其脂质膜表面缀合靶向基团，获得主动靶向马来酸匹杉琼脂质体；这里的靶向基团可以但不限于RGD、iRGD、转铁蛋白、乳铁蛋白、叶酸、半乳糖、葡萄糖、肿瘤坏死因子。或是在脂质体内水相中载入磁性颗粒，从而获得磁性靶向马来酸匹杉琼脂质体。

长期稳定性实验表明，本发明所得马来酸匹杉琼脂质体在4℃下放置6个月，包封率与粒径均无显著性变化。药效学实验表明，马来酸匹杉琼脂质体的抑瘤率显著高于其溶液，且毒性明显降低。表明本发明所制得马来酸匹杉琼脂质体制剂达到了包封率高、稳定性好、抗肿瘤活性强、毒副作用小的目的。

由于工业化生产过程中各项参数出现±10%的波动是难以避免的，所以在本专利所述的处方组成和工艺参数的±10%范围内仍将认为是本专利的保护范围。

本发明带来的有益结果：

本发明所提供的马来酸匹杉琼脂质体具有较好的肿瘤靶向性，在相同的给药剂量下，相比于溶液剂型，该发明所提供的脂质体能使BBR2778在肿瘤部位的分布量提高35倍，同时心脏分布降低至1/5，活体动物药效试验也证实了抗肿瘤效果的提高。

此外，采用常规被动载药工艺制备的BBR2778脂质体包封率低于10%（药脂比1:15，w/w），而本发明所提供的采用离子梯度法制备的BBR2778脂质体的药物包封率高达80%以上（药脂比1:15，w/w），最优处方甚至高达99%以上。

再者，相比于被动载药工艺制备的BBR2778脂质体，本发明所提供的BBR2778脂质体具有较慢的药物释放速度，能够更好地借助EPR效应实现肿瘤靶向。

具体实施方式

实施例中所用各成分的简称如下：

马来酸匹衫琼（BBR2778）、大豆磷脂（SPC）、氢化大豆磷脂(HSPC)、蛋黄磷脂（EPC）、氢化蛋黄磷脂（HEPC）、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）、二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）、二反式油酰磷脂酰胆碱(DEPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）、二山嵛酰磷脂酰胆碱（DBPC）、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱（POPC）、单棕榈酰磷脂酰胆碱（MPPC）、单硬酯酰胆碱（MSPC）、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（DMPE）、蛋黄磷脂酰甘油（EPG）、二硬脂酰磷脂酰甘油（DSPG）、二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）、二油酰磷脂酰甘油（DOPG）、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG）、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸（DSPS）、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸（DPPS）、二油酰磷脂酰丝氨酸（DOPS）、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸（DMPS）、二硬脂酰鞘磷脂（DSSM）、二棕榈酰鞘磷脂（DPSM）、二棕榈酰磷脂酰肌醇（DPPI）、二油酰磷脂酰肌醇（DOPI）二肉豆蔻酰磷脂酸（DMPA）、二棕榈酰磷脂酸（DPPA）、聚乙二醇单甲醚-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（mPEG-DSPE）、聚乙二醇单甲醚-胆固醇半琥珀酸酯（mPEG-CHS）、聚乙二醇单甲醚-二棕榈酰磷脂酰胆碱乙醇胺（mPEG-DPPE）、聚乙二醇单甲醚-二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（mPEG-DMPE）、胆固醇（CH）、d-α生育酚琥珀酸聚乙二醇酯（TPGS）。

马来酸匹衫琼（BBR2778）购买自南京科优医药科技有限公司，纯度≥99%。

BBR2778脂质体的包封率采用阳离子交换树脂柱－紫外分光光度法进行测定，即利用阳离子交换树脂吸附游离药物，将游离药物与脂质体分离，并以紫外分光光度法测定BBR2778的含量。具体方法如下：

量取1.5mL（湿视体积）常规酸碱处理后的钠型732强酸性阳离子交换树脂，装于2.5mL注射器中，以蒸馏水平衡，2000rpm离心4min，弃去滤液，制成阳离子交换树脂微柱。阳离子交换树脂柱对空白脂质体的吸附、对BBR2778溶液的吸附、对梯度脂质体与药物物理混合液中BBR2778的吸附均符合测定要求。取已制备好的BBR2778脂质体100μL各两份。一份用90%异丙醇（含1M·L^-1盐酸）稀释至5mL，摇匀，于641nm处测定吸光度值，计算药物浓度（记为C_before）。另一份加于阳离子交换树脂柱顶端，2000rpm离心4min，继续加400μL重蒸水于柱的顶端,2000r·min^-1离心4min洗脱，连续操作3次，合并洗脱液，加入90%异丙醇（含1M·L^-1盐酸）稀释至5mL，摇匀，于641nm处测定吸光度值（专属性、精密度、线性均符合测定要求），计算药物浓度（记为C_after）。包封率以公式E%=C_after/C_before×100%计算。

本发明中磷脂浓度使用ELSD-HPLC测定，脂质体粒径使用PSSNICOMP380激光粒度测定仪测定。

本发明中：使用氢氧化钠溶液将枸橼酸、酒石酸、苹果酸溶液调节至相应pH值得到枸橼酸-枸橼酸钠溶液、酒石酸-酒石酸钠溶液、苹果酸-苹果酸钠溶液。

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

实施例1BBR2778脂质体

脂质体膜材组成为HSPC:CH:mPEG2000-DSPE=3:1:1（w/w），梯度建立物质为枸橼酸-枸橼酸钠溶液（浓度为200mM，pH为4.0）。

60~65℃水浴中，用乙醇溶解膜材（即HSPC、CH和mPEG₂₀₀₀-DSPE的混合物），磷脂重量与乙醇的体积之比约为1:2，挥去部分乙醇后，以中速注入预热至相同温度的梯度建立物质溶液，孵育20min，制得脂质体初品，经200W超声初步混合处理2min后，400W超声分散4min（工作1s，间歇1s），依次通过0.8、0.45μm的微孔滤膜，即得空白脂质体混悬液。取空白脂质体混悬液若干，加入适量Na₃PO₄溶液（浓度为500mM）及灭菌注射用水，混合均匀，调节外水相pH至7.0，即得梯度脂质体混悬液。以药脂比1：15（w/w）将梯度脂质体混悬液与BBR2778溶液（浓度为4.0mg/mL）混合，60~65℃下水浴搅拌孵育10min后取出置于冰水浴中终止载药即得BBR2778脂质体。测得该脂质体制剂包封率为99.8%，粒径为110nm。所得BBR2778脂质体在4℃避光放置60天，外观均一、透明、有乳光，无沉淀，无菌，且粒径及包封率无明显变化。

实施例2

脂质体膜材为DSPC:CH=2:1（w/w），梯度建立物质溶液为苹果酸-苹果酸钠溶液（浓度为100mM，pH为4.0）。

50℃水浴中，用乙醇溶解处方量膜材，磷脂重量与乙醇的体积之比约为1:6，挥去部分乙醇后，以中速注入预热至相同温度的梯度建立物质溶液，孵育20min，制得脂质体初品，经200W超声初步混合处理2min后，400W超声分散4min（工作1s，间歇1s），依次通过0.8、0.45μm的微孔滤膜，即得空白脂质体混悬液。取空白脂质体混悬液若干，加入适量Na₃PO₄溶液（浓度为500mM）及灭菌注射用水，混合均匀，调节外水相pH至8.0，即得梯度脂质体混悬液。以药脂比1：15（w/w）将梯度脂质体混悬液与BBR2778溶液（浓度为4.0mg/mL）混合，60℃下水浴搅拌孵育8min后取出置于冰水浴中终止载药即得BBR2778脂质体。测得该脂质体制剂包封率为87.8%，粒径为173nm。该脂质体在4℃避光放置60天，外观均一、透明、有乳光，无沉淀，无菌，且粒径及包封率无明显变化。

实施例3

脂质体膜材同“实施例1”，梯度建立物质分别选用酒石酸-酒石酸钠溶液（200mM，pH4.0）和磷酸二氢钠溶液（200mM，pH4.0）。脂质体初品的制备工艺同“实施例1”，将脂质体初品用微射流进行处理（12000psi处理2个循环，14000psi处理2个循环），之后依次通过0.8、0.45、0.22、0.10、0.05μm的微孔滤膜，即得空白脂质体混悬液。使用Na₃PO₄（500mM）调节空白脂质体混悬液的pH值至8.0，以药脂比1：15（w/w）将梯度脂质体混悬液与BBR2778溶液（浓度为4.0mg/mL）混合，60~65℃下水浴搅拌孵育20min后取出置于冰水浴中终止载药即得BBR2778脂质体。使用酒石酸-酒石酸钠溶液作为梯度建立物质所得BBR2778脂质体的包封率为92.1%，粒径68nm；使用磷酸二氢钠溶液作为梯度建立物质所得BBR2778脂质体的包封率为98.2%，粒径71nm。

在BBR2778脂质体中加入海藻糖作为冻干保护剂（海藻糖与磷脂的干重量之比为4）后按照常规工艺进行冻干，可得到BBR2778冻干脂质体制剂。复溶时，向冻干脂质体中加入注射用水复溶，即得外观带有明显蓝色乳光的BBR2778脂质体制剂。其中，使用酒石酸-酒石酸钠溶液作为梯度建立物质所得BBR2778脂质体复溶后的包封率为75.1%，粒径74nm；使用磷酸二氢钠溶液作为梯度建立物质所得BBR2778脂质体复溶后的包封率为81.2%，粒径93nm。

实施例4

脂质体膜材为S100:CH:mPEG2000-DSPE=3:1:1（w/w），梯度建立物质为枸橼酸-枸橼酸钠和苹果酸-苹果酸钠溶液的混合物溶液（pH4.0，枸橼酸根浓度为150mM，苹果酸根浓度为100mM）。按“实施例1”所述工艺制备脂质体初品。将所得到的脂质体初品通过挤出仪（LIPEXExtruder，10mL，NorthernLipids，加拿大）进行挤出处理，60~65℃下，200nm聚碳酸酯膜挤出2次，100nm聚碳酸酯膜挤出2次，50nm聚碳酸酯膜挤出2次，所得空白脂质体平均粒径约为35nm。使用Na₃PO₄（500mM）调节空白脂质体混悬液的pH值，并按“实施例1”的药脂比和载药条件进行载药。所得BBR2778脂质体的平均粒径约为32nm，包封率为92.6%。

实施例5

脂质体膜材为HSPC:HEPC:CH=2:1:1（w/w），梯度建立物质为枸橼酸-枸橼酸钠溶液（pH4.0，350mM）。按“实施例1”所述工艺制备脂质体初品。将所得到的脂质体初品通过挤出仪（LIPEXExtruder，10mL，NorthernLipids，加拿大）进行挤出处理，60~65℃下，200nm聚碳酸酯膜挤出10次，所得空白脂质体平均粒径约为215nm。使用Na₃PO₄和NaHCO₃的混合溶液（其中Na₃PO₄浓度为300mM，NaHCO₃浓度为300mM）调节空白脂质体混悬液的pH值至7.0，并按“实施例1”的药脂比和载药条件进行载药。所得BBR2778脂质体的平均粒径约为202nm，包封率为97.2%。

实施例6

脂质体膜材组成为HSPC:DPPG:CH:mPEG₂₀₀₀-DSPE=2:1:1:1（wt/wt），梯度建立物质为枸橼酸-枸橼酸钠溶液（pH4.0，300mM）。

65~70℃下，用含有的10%水的乙醇-水体系作为溶媒溶解膜材，磷脂重量乙醇-水体系体积之比为1:1，得脂质相；将预热至65~70℃的梯度建立物质溶液注入脂质相，孵育10min，制得脂质体初品。再经12000psi高压均质处理降低脂质体粒径，之后依次通过0.8、0.45、0.22μm的微孔滤膜，即得空白脂质体混悬液。使用Na₃PO₄和Na₂CO₃的混合溶液（其中Na₃PO₄浓度为400mM，NaOH浓度为50mM）调节空白脂质体混悬液的pH值至6.0，并按“实施例1”的药脂比和载药条件进行载药。所得BBR2778脂质体的平均粒径约为92nm，包封率为97.6%。

在本实施例，使用相同重量的DSPG代替DPPG，其余条件不变，制得BBR2778脂质体的平均粒径约为108nm，包封率为98.8%。

实施例7

脂质体膜材

EPC1.5g

CH0.5g

mPEG₂₀₀₀-CHS0.25g

梯度建立物质为50ml的枸橼酸-枸橼酸钠溶液（pH4.0，300mM）。

称取处方量的EPC、CH、mPEG₂₀₀₀-CHS，50~55℃下用5ml乙醇溶解膜材，得脂质相；将预热至50~55℃的梯度建立物质溶液注入脂质相，孵育10min，制得脂质体初品，再经10000psi高压均质处理，降低脂质体粒径至90nm，依次通过0.8、0.45、0.22μm的微孔滤膜，即得空白脂质体混悬液。

建立梯度脂质体：根据交换容量计算，1.2ml（湿视体积）阴离子树脂（OH-）（717型阴离子树脂）即可以完全交换300mM枸橼酸-枸橼酸钠溶液1ml。本实施例采用1ml（湿视体积）阴离子树脂（OH-）（717型阴离子树脂）处理1ml空白脂质体，其pH值为6.8。

主动载药：将得到的梯度脂质体分为3份，第一份直接载药，第二份用Na₃PO₄溶液（浓度为500mM）调节pH至7.0后进行载药，第三份用Na₂CO₃（浓度为500mM）调节pH至7.0后进行载药。BBR2778与EPC的重量比为1：20。

结果，直接载药的包封率为95.6%，以Na₃PO₄溶液调节外水相pH值的梯度脂质体载药的包封率为99.2%，以Na₂CO₃溶液调节外水相pH值的梯度脂质体载药的包封率为97.1%。BBR2778脂质体充氮后于4℃避光放置60天后，外观均一、透明、有乳光，无沉淀，无菌；粒径和包封率无显著改变。

实施例8pH调节剂的影响

空白脂质体膜材处方组成及制备工艺同“实施例1”，分别采用不同pH调节剂（浓度均为500mmol·L^-1）调节脂质体外水相pH为7.0后，载药，测定包封率（E%），并充氮，4℃避光放置60天，考察其放置稳定性。结果见表1。

以Na₃PO₄、NaOH、Na₂CO₃、NaHCO₃为外水相pH调节剂时，脂质体包封率较高，均可达到90.0％以上；而以Na₂HPO₄为外水相pH调节剂时包封率较低。放置60天后，只有Na₂HPO₄为外水相pH调节剂的BBR2778脂质体出现部分沉淀，其余制剂外观均良好。但是以NaOH、Na₂CO₃为外水相pH调节剂时，BBR2778脂质体放置60天后的包封率略有下降，因此优选Na₃PO₄或NaHCO₃作为外水相pH调节剂。

实施例9

脂质体膜材为SPC:CH:mPEG₂₀₀₀-CHS=3:0.5:0.5（w/w），梯度建立物质为枸橼酸铵溶液（300mM，pH6.5），60~65℃水浴中，用乙醇溶解脂质体膜材，磷脂重量与乙醇的体积之比约为1:6，挥去部分乙醇后，以中速注入预热至相同温度的梯度建立物质溶液，孵育20min，制得脂质体初品，将脂质体初品用微射流进行处理（12000psi处理2个循环，14000psi处理2个循环），之后依次通过0.8、0.45、0.22、0.10、0.05μm的微孔滤膜，即得空白脂质体混悬液。在室温下，用10%（w/v）蔗糖溶液对空白脂质体进行透析，所用装置为中空纤维透析器（膜孔径30KD，大连化学物理研究所），透析完成后用铵离子选择性电极（Corning250pH/ionanalyzer；CorningScienceProducts,Corning,NewYork,U.S.A.）测定脂质体外水相的铵离子浓度，外水相中99%以上的枸橼酸铵均被除去，得到梯度脂质体，磷脂浓度约为25mg/mL。将梯度脂质体与BBR2778溶液混合进行载药，其中BBR2778与SPC的重量比为1：20。所得脂质体包封率为97.0%，粒径为150nm。

在本实施例中，在相同的实验操作下，使用枸橼酸三乙胺溶液（300mM，pH6.5）或磷酸二氢铵溶液（200mM，pH6.5）作为梯度建立物质，所制备得到的脂质体包封率分别为92.4%和93.4%。

实施例10硫酸铵梯度法和乙二胺四乙酸铵梯度法制备马来酸匹杉琼脂质体

使用硫酸铵溶液（200mM）和乙二胺四乙酸铵溶液（200mM）作为梯度建立物质，空白脂质体、梯度脂质体及载药过程同“实施例9”。使用硫酸铵梯度法和乙二胺四乙酸铵梯度法制备得到的BBR2778脂质体包封率均小于10%。

BBR2778是典型的两亲性弱碱性药物。一般而言，硫酸铵梯度和乙二胺四乙酸铵梯度非常适合于装载两亲性弱碱性药物，但该实验证明使用硫酸铵和乙二胺四乙酸铵作为梯度建立物质并不适合于BBR2778的装载。

实施例11不同磷脂种类对BBR2778脂质体包封率和粒径的影响

处方组成：磷脂/CH/mPEG₂₀₀₀-CHS的重量比例为3：1：1，工艺同“实施例1”。磷脂种类分别为HSPC、DEPC、DMPC、DPPC、DBPC、POPC、EPG、SM。制得BBR2778脂质体，测定其粒径及包封率，结果见表2-1及表2-2。

上述结果表明，相同工艺条件下，采用不同磷脂制得的马来酸匹杉琼脂质体包封率均大于90%。

实施例12不同种类亲水性高分子脂质衍生物

脂质体膜材由HSPC、CH和亲水性高分子脂质衍生物组成，其中HSPC/CH=3:1（w/w），并且亲水性高分子脂质衍生物选自mPEG₂₀₀₀-DSPE（分子量：2788.8Da）、mPEG₂₀₀₀-CHS（分子量：2450.0Da）、TPGS1000（分子量：1513.0Da）、mPEG₂₀₀₀-DPPE（分子量：2732.7Da）、mPEG₂₀₀₀-DMPE（分子量：2676.7Da）、mPEG₂₀₀₀-DOPE（分子量：2785.8Da）、吐温20（分子量：1227.5Da）、吐温80（分子量：1309.5Da），PVP硬脂酸衍生物，按文献（TorchilinVP,LevchenkoTS,WhitemanKR,etal.Amphiphilicpoly-N-vinylpyrrolidones:synthesis,propertiesandliposomesurfacemodification.Biomaterials.2001;22:3035–44）所述方法合成。所加入亲水性高分子脂质衍生物的摩尔量为HSPC摩尔量的10%。按照“实施例1”所述方法制备BBR2778脂质体，所得脂质体包封率及粒径见表3。

上述结果表明，相同工艺条件下，采用不同亲水性高分子脂质衍生物制得的马来酸匹杉琼脂质体包封率均大于90%。

实施例13不同含量亲水性高分子脂质衍生物

脂质体膜材由HSPC、CH和mPEG₂₀₀₀-DSPE组成，其中HSPC/CH=3:1（w/w），并且mPEG₂₀₀₀-DSPE的与HSPC的摩尔含量之比分别为1:5、1:10、1:20、1:40以及不加入mPEG₂₀₀₀-DSPE。按照“实施例1”所述方法制备BBR2778脂质体，所得脂质体包封率及粒径见表4。

表中，“—”表示由于处方中mPEG₂₀₀₀-DSPE含量过高，未制备出脂质体或是所制备得到的脂质体全部快速转变为胶束，因此未测定包封率。

当mPEG₂₀₀₀-DSPE/HSPC的比例小于1:10时，可以制备得到粒径较小且包封率高于90%的BBR2778脂质体，并且其在充氮后于4℃下避光放置60天，外观、粒径及包封率均无显著变化，具有较好的放置稳定性。

在本实施例中，使用相同质量的HEPC、DPPC、和SPC替换HSPC时，得到相似的实验结果，亦证明当亲水性高分子脂质衍生物与磷脂的摩尔含量之比不大于1:10时，按照本发明所述工艺可以得到包封率大于90%的BBR2778脂质体。

实施例14不同胆固醇含量对脂质体包封率和稳定性的影响

脂质体膜材为HSPC和CH，CH与HSPC的质量比分别为1:2、1:4、1:6、1:10，并制备不加入CH的脂质体。按照“实施例1”所述方法制备BBR2778脂质体，所得脂质体包封率及粒径见表5。

由表5可知，处方中胆固醇含量对BBR2778脂质体的包封率及粒径有着较大的影响。当处方中不含有CH含量时，BBR2778脂质体的包封率小于10.0%；随着胆固醇含量增加，药物的包封程度也逐渐增加，当处方中CH/HSPC的质量之比为1:4时，BBR2778脂质体的包封率达到99.2%；继续增加胆固醇含量则包封率略有下降，当处方中CH/HSPC的质量之比为1:1时，BBR2778脂质体的包封率降低为7.4%。

当将脂质体膜材中的HSPC更换为同样重量的DSPC、SPC或者EPC时，也得到了相似的实验结果。因此，BBR2778脂质体处方中胆固醇与磷脂的重量比选择为1:2~1:10。

实施例15被动载药制备马来酸匹杉琼脂质体

薄膜分散法：

脂质体膜材为HSPC：CH：mPEG₂₀₀₀-CHS=3:1:1（w/w），将脂质体膜材溶于2mL无水乙醇中，然后减压旋转除去乙醇，使脂质在器壁上形成薄膜，按1：15（w/w）的药脂比加入浓度为4.0mg/mL的BBR2778溶液，65℃水浴搅拌20min，得BBR2778脂质体。测得该脂质体制剂包封率为8.2%。该方法同专利ZL00814600.4所描述的载药方法一致。

逆相蒸发法：

在茄型瓶中以3.0mL乙醚溶解膜材（HSPC：CH：PEG₂₀₀₀-CHS=3：1：1，w/w），以1：15（w/w）的药脂比加入浓度为4.0mg/mL的马来酸匹杉琼溶液1mL，在温度小于10℃的水浴中超声3min，至形成均匀分散体。将混合物置于旋转蒸发仪中，室温减压除去有机溶剂，加入一定量水化介质（pH为6.8，浓度为100mM的PBS），继续减压蒸发15min，除去残余乙醚，即得马来酸匹杉琼脂质体。测得该脂质体制剂包封率为7.5%。

实施例16梯度建立物质浓度的影响

空白脂质体处方组成见表1，其中梯度建立物质采用枸橼酸-枸橼酸钠溶液，pH为4.0，浓度分别为10、50、100、200、300、400、450mM。采用浓度为500mM的Na₃PO₄溶液作为pH调节剂。制备工艺同“实施例1”。制得马来酸匹杉琼脂质体，测定其包封率，结果见表6。

由以上结果可知，当梯度建立物质溶液的浓度在50-450mM范围内时，马来酸匹杉琼脂质体包封率均大于85%，其中浓度在100-300mM更优。

在本实施例中，当梯度建立物质使用pH为4.0的酒石酸-酒石酸钠溶液，浓度分别为50、100、150、200、250、300、400mM/L时，制得马来酸匹杉琼脂质体的包封率均大于80%。

实施例17载药温度对脂质体包封率的影响

空白脂质体处方组成及制备工艺同“实施例1”，工艺中载药孵育温度分别采用30、40、50、60及70℃。所得马来酸匹杉琼脂质体包封率见表7。

结果可知，载药温度在50℃-70℃之间时，包封率较高，考虑到磷脂在高温下不稳定，因此选择60℃为最优载药温度。

实施例18载药时间对脂质体包封率的影响

空白脂质体处方组成见表1，制备工艺同“实施例1”，以药脂比1:20取梯度脂质体和药物溶液，于60℃分别水浴搅拌5、8、10、15、20及30min，制得的马来酸匹杉琼脂质体，测定其包封率，结果见表8。

结果可知，当载药时间≥8min时，脂质体包封率均大于90%；当载药时间为10min时包封率大于95%，继续增加载药时间包封率无明显提高。

实施例19不同药脂比的考察（1:3）

按照“实施例1”所述方法制备枸橼酸-枸橼酸钠（200mM，pH4.0）为梯度建立物质、Na₃PO₄（500mM）为pH调节剂的梯度脂质体混悬液。分别按照药脂比（w/w）1：1、1：3、1:5、1：10、1：15、1：20、1：25、1：30进行载药，制得的马来酸匹杉琼脂质体，测定其包封率，结果见表9。

由表9可知，当药脂比≤1：3时，脂质体包封率均大于80%；当药脂比在1：10-1：30范围内时，脂质体包封率大于95%。

按照“实施例9”所述方法制备以枸橼酸铵（300mM，pH6.5）为梯度建立物质的梯度脂质体混悬液，分别按照药脂比（w/w）1:1、1:3、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30进行载药，制得的马来酸匹杉琼脂质体，测定其包封率，结果见表10.

由表10可知，当药脂比≤1：3时，脂质体包封率均大于80%；当药脂比在1：10-1：30范围内时，脂质体包封率大于95%。

实施例20典型的BBR2778脂质体

脂质体膜材为HSPC:CH:mPEG₂₀₀₀-DSPE=3:1:1，脂质体膜材以适量无水乙醇0.5mL于65℃水浴搅拌溶解，以中速注入5mL预热至相同温度的枸橼酸-枸橼酸钠溶液（200mmol·L^-1，pH4.0），65℃水浴搅拌20min，得到空白脂质体初品。将初品探头超声，超声功率和时间为200w×2min+400w×4min，然后依次通过0.8、0.45μm微孔滤膜，即得空白脂质体混悬液。

取空白脂质体混悬液1.0mL，加入磷酸钠溶液（500mmol·L^-1）0.4mL及灭菌注射用水1.1mL，混合均匀，即得pH梯度脂质体（磷脂浓度为20mg·mL^-1）。

按照药脂比1：15将上述梯度脂质体与BBR2778溶液（4.0mg·mL^-1）混合，60℃水浴搅拌孵育，搅拌速度为200rpm，10min后取出置于冰水浴中终止载药即得BBR2778脂质体。包封率99.2%，粒径98nm。

实施例21

脂质体膜材为150mgHSPC、50mgCH和50mgmPEG₂₀₀₀-CHS，脂质体膜材以0.3mL无水乙醇于65℃水浴溶解，搅拌挥去部分乙醇后，以中速注入预热至相同温度的梯度建立物质溶液，65℃水浴搅拌20min，得到空白脂质体初品（磷脂浓度约为50mg/mL）。将初品探头超声，超声功率和时间为200w×2min+400w×4min，然后依次通过0.8、0.45、0.22μm微孔滤膜，即得空白脂质体混悬液。

梯度建立物质溶液如下：

A：200mmol·L^-1，pH4.0的枸橼酸-枸橼酸钠，含有50mmol/L海藻酸钠

B：200mmol·L^-1，pH4.0的枸橼酸-枸橼酸钠，含有50mmol/L肝素钠

C：50mol/LCu²⁺缓冲溶液

D：50mol/LMn²⁺缓冲溶液

梯度建立物质溶液的配制

A：称1.0507g枸橼酸于25mL烧杯中，加入约15mL重蒸水溶解，加入海藻酸钠15mg，以NaOH溶液调pH至4.0后，将溶液转移至25mL量瓶中，加水定容，0.22μm滤膜过滤。

B：称1.0507g枸橼酸于25mL烧杯中，加入约15mL重蒸水溶解，加入肝素钠15mg/50mmol，以NaOH溶液调pH至4.0后，将溶液转移至25mL量瓶中，加水定容，0.22μm滤膜过滤。

C：称1.25mmol硫酸铜于25mL烧杯中，加入约15mL重蒸水溶解，将溶液转移至25mL量瓶中，加水定容，0.22μm滤膜过滤，得50mmol·L^-1，pH3.7Cu²⁺溶液。

D：称1.25mmol硫酸锰于25mL烧杯中，加入约15mL重蒸水溶解，用氨水调节至pH4.0，将溶液转移至25mL量瓶中，加水定容，0.22μm滤膜过滤，得50mmol·L^-1，pH4.0Mn²⁺溶液。

使用阴阳混合纤维填充柱(湿视体积3mL)，加空白脂质体0.3mL顶端，2000rpm离心4min洗脱，继续加水225μL，2000rpm离心4min洗脱，连续加水2次，合并洗脱液0.75mL梯度脂质体（磷脂浓度为20mg·mL^-1）。

按照药脂比1:20将上述梯度脂质体与BBR2778溶液（4.0mg/mL）混合（即加入梯度脂质体0.8mL，BBR2778溶液〈4.0mg/mL〉0.2mL）60℃水浴搅拌孵育，10min后取出置于冰水浴中终止载药即得BBR2778脂质体。

结果，使用枸橼酸-枸橼酸钠-海藻酸钠溶液作为梯度建立物质制备得到的脂质体粒径为112nm，包封率96.6%；但在梯度建立物质中加入一般来说有益于药物装载和滞留的肝素，即使用枸橼酸-枸橼酸钠-肝素钠溶液作为梯度建立物质时，制备得到的脂质体包封率仅为3.4%；使用CuSO4溶液作为梯度建立物质制备得到的脂质体粒径为95nm，包封率7.0%；使用MnSO4溶液作为梯度建立物质制备得到的脂质体粒径为92nm，包封率4.5%。所以并非所有的、或者是经典的多阴离子大分子都有益于BBR2778的装载。

此外，在200mmol/L，pH4.0的枸橼酸-枸橼酸钠溶液中，分别加入50mmol/L的植酸、透明质酸、乳糖酸、果糖酸、聚谷氨酸、右旋糖酐硫酸酯或硫酸葡聚糖时，以药脂比1:15（w/w）进行载药，脂质体包封率亦能达到90%以上。

实施例22

分别使用200mmol·L^-1，pH4.0的苹果酸-苹果酸钠，植酸-植酸钠，乳酸-乳酸钠，草酸-草酸钠溶液作为梯度建立物质，按“实施例20”所述方法和参数制备制备梯度脂质体进行载药。测定包封率及粒径，见表11。

注：植酸-植酸钠梯度放置2h后载药脂质体出现沉淀

实施例23

处方1

HSPC100mg

DPPG50mg

CH15mg

mPEG₂₀₀₀-DSPE50mg

梯度建立物质为3mL浓度250mmol·L^-1，pH4.0的枸橼酸-枸橼酸钠溶液

处方2

HSPC100mg

MPPC50mg

CH15mg

mPEG₂₀₀₀-DSPE50mg

处方3

HSPC100mg

MSPC50mg

CH15mg

mPEG₂₀₀₀-DSPE50mg

处方4

DPPC100mg

MSPC50mg

CH15mg

mPEG₂₀₀₀-DSPE50mg

以上4个处方均按“实施例20”所述方法和参数制备为制备梯度脂质体，并进行载药。测定包封率及粒径。处方1粒径95nm，包封率为97.3%；处方2粒径89nm，包封率为96.3%；处方3粒径88nm，包封率为89.3%；处方4粒径86nm，包封率为92.3%。

实施例24

脂质体膜材为HSPC:CH:mPEG2000-DSPE=3:1:1（wt/wt）。在50~70℃下使用叔丁醇作为溶媒膜材，将此混合物进行冻干得到脂质混合物。

在55~65℃下将脂质混合物与枸橼酸-枸橼酸钠溶液（pH4.0，300mM）混合并搅拌，得到脂质体初品。之后按照“实施例1”所述方法制备空白脂质体，建立跨膜离子梯度并装载BBR2778。所得脂质体粒径93nm，包封率98.7%。

实施例25主动靶向BBR2778脂质体

膜材EPC0.15g

CH0.05g

DSPE-mPEG₂₀₀₀-EGF0.01g

DSPE-mPEG₂₀₀₀0.04g

梯度建立物质为枸橼酸铵溶液（200mM，pH6.5）5mL。

制备空白脂质体：称取处方量的EPC、CH、DSPE-mPEG₂₀₀₀-EGF（EGF为表皮生长因子）、DSPE-mPEG₂₀₀₀，55℃，用1ml乙醇溶解膜材，挥除部分乙醇后，注入预热至同温度的梯度建立物质溶液，孵育10min，制得脂质体初品，探头超声降低脂质体粒径至110nm，依次通过0.8、0.45、0.22μm的微孔滤膜，即得空白脂质体混悬液。

滤过离子交换法建立梯度：取空白脂质体1mL装于截留分子量为10万的透析袋中，透析介质为等渗木糖醇溶液，透析介质用量为脂质体混悬液体积的150倍；透析介质中加入混合离子交换剂（采用四种离子交换剂，732阳离子交换树脂、ZB-1阳离子交换纤维、717阴离子交换树脂和ZB-2阴离子交换纤维，其混合比例为湿视体积1：1：1：1v/v）；透析袋、透析介质和离子交换剂置于同一烧杯内，离子交换剂在磁力搅拌的作用下在透析介质中均匀分布，离子交换剂用量为水化介质中阴阳离子所需交换容量的30倍，所用时间为1h。

在60℃，将BBR2778溶液（4mg/mL）与梯度脂质体混悬液（药脂比1:20，w/w）混匀，孵育10min，得到具有EGF靶向配基的BBR2778脂质体，测得包封率92%。

我们还可以在脂质体膜材中加入缀合有RGD、iRGD、转铁蛋白、乳铁蛋白、叶酸、半乳糖、葡萄糖、肿瘤坏死因子作为靶向基团的磷脂，按上述步骤制备转载有BBR2778的主动靶向脂质体。

实施例26体外释放实验

分别精密吸取1.0mL的BBR2778溶液、按“实施例1”采用离子梯度载药的BBR2778脂质体以及按“实施例15”中被动载药法（薄膜分散法）制备的BBR2778脂质体，加入预处理过的透析袋（截留分子量为0.8-1.4万）中，两端夹好后置于盛有100mLpH7.4PBS溶液（配制方法参照Ch.P2005第二部附录ⅩⅤ）的溶出仪内，避光，37±0.5℃恒温、50rpm搅拌，进行体外释放实验。取透析液测定荧光强度，计算透析液中药物浓度和累计释放率。

实验结果表明，游离药物4h可完全透过透析袋（累积释放量达100.0%）；采用被动载药技术制备的BBR2778脂质体在4小时的累积释放量为56.0%；离子梯度载药法制备的BBR2778脂质体在4小时的累积释放量为6.0%，24小时累积释放量为18.3%。即采用离子梯度法制备的BBR2778脂质体具有较好的药物滞留能力及缓释效果。

使用pH6.8的PBS作为释放介质时，药物释放结果相近。

实施例27长期稳定性实验

取3批“实施例1”马来酸匹杉琼脂质体制剂分装于西林瓶中，充氮、密封，在4±2℃条件下，避光放置，分别于0、1、2、3个月取样，观察各制剂的状态并测定制剂粒径及包封率，结果见表12。

注：+表示制剂状态均匀，无沉淀，无相分离，未长菌。

表12结果表明，实施例1中的匹杉琼或马来酸匹杉琼脂质体4±2℃条件下，3个月内粒径保持稳定，包封率无显著变化。

实施例28马来酸脂质体抗肿瘤及体内分布实验

抑瘤效果评价

将30只接种S₁₈₀肿瘤的小鼠随机分为5组，每组6只。第0天接种，接种后于第3、6、9天分别尾静脉注射生理盐水（NS）、BBR2778溶液（BBR2778-S：10mg/kg）、BBR2778脂质体（按“实施例1”处方制备）低、中、高剂量（BBR2778-L-L：5mg/kg、BBR2778-L-M：10mg/kg、BBR2778-L-H：15mg/kg）。给药后动物正常饲养，隔日称量小鼠体质量，同时观察小鼠生长状态。于接种后第10天小鼠眼眶取血（4000rpm离心10min制备成血浆）后处死动物，完整剥离皮下肿瘤，同时取出小鼠脏器，包括心、肝、脾、肺、肾、胸腺，称取肿瘤、脾脏及胸腺质量。

抑瘤率%=(W_N-W_S)/W_N×100%。其中，W_N：对照组平均瘤质量；W_S：给药组瘤质量；胸腺指数（脾指数）=胸腺（脾）质量/小鼠体质量（mg·g^-1）。并对结果进行统计学分析，结果见表13。

^apvaluevs.NStreatedmice.

^bpvaluevs.BBR2778-Streatedmice.

^cpvaluevs.BBR2778-L-Ltreatedmice.

^dpvaluevs.BBR2778-L-Mtreatedmice.

由表可知，抑瘤率大小为：BBR2778-L-M组>BBR2778-L-H组>BBR2778-L-L组>BBR2778-S组。与NS组相比，除溶液组外其它各脂质体组均有显著的抑瘤效果（P<0.05），中、高剂量的脂质体组具有极显著的抑瘤效果（P<0.01）；与药物溶液组相比，同等剂量下脂质体组的抑瘤率有显著提高（P<0.05）；而各脂质体组之间抑瘤率均无显著性差异（P>0.05）。

免疫系统损伤评价

胸腺是T淋巴细胞分化成熟的中枢免疫器官，而脾脏是体内最大的淋巴器官，也是具有免疫活性的T、B细胞移居和接受抗原刺激后产生免疫应答的重要场所，因此胸腺指数和脾指数是衡量免疫功能的重要指标，其数值高低的变化可以反映机体免疫功能的状态。因此，本实验采用胸腺指数及脾指数为评价指标，比较各组制剂对荷瘤小鼠免疫功能的影响，并对其进行统计学分析，结果见表14及15。

由表14可知，当以脾指数为评价指标时，与生理盐水组相比，溶液组脾指数极显著下降（P<0.01），而各脂质体组脾指数无显著变化（P>0.05）。由表15可知，当以胸腺指数为评价指标时，溶液组与生理盐水组相比表现出极显著的胸腺重量下降（P<0.01），且与低、中剂量脂质体组相比，溶液组胸腺指数也有显著减小（P<0.05）。这些结果表明将BBR2778制备成脂质体后可以显著改善游离药物对机体免疫系统的损害。

荷瘤小鼠组织分布实验

荷瘤小鼠3次给药24h后血浆及各组织脏器内BBR2778浓度，结果见表16、表17。

由以上结果可知，三次注射24h后BBR2778溶液组在肾脏、肺、胸腺、肝、脾及心脏中均检测到较高的药物含量，而在肿瘤及血液中分布较少，其中肾脏、肺和胸腺含量最高，分别为52.91±14.97、50.22±8.21及20.17±1.83μg·g^-1，说明游离BBR2778易在肾脏、肺及胸腺等组织聚集。相比之下，同等剂量的BBR2778脂质体组在肿瘤和血液中的含量分别是溶液组的36.80和13.58倍，表明BBR2778脂质体具有一定长循环特性及显著的肿瘤靶向性；而药物在心、肺、肾、胸腺等正常组织中则比溶液组分别减少了79%、79%、53%、96%。同时，BBR2778脂质体表现出一定的肝脾聚集现象，同等剂量下脂质体组在肝、脾组织中药物含量分别是溶液组的2.29和3.50倍。

实施例29急毒实验

取昆明种小白鼠20只，随机分成2组，每组10只，以35mg/kg的剂量分别尾静脉注射浓度为1mg/mL的BBR2778溶液、或按“实施例1”制备的BBR2778脂质体，观察15天内动物的毒性反应，记录小鼠体重变化及死亡数，结果见表18。

从实验结果可以看出，给药后第6天，BBR2778溶液组小鼠死亡率已高达70%，而脂质体组仅有40%小鼠死亡；到第15天，溶液组小鼠全部死亡，脂质体组则依然有30%小鼠存活，这表明将BBR2778制备成脂质体后显著降低了该药物的毒性。

Claims

1.一种马来酸匹杉琼脂质体，其特征在于，脂质体含有马来酸匹杉琼、磷脂、胆固醇、梯度建立物质；同时满足，胆固醇与磷脂的重量比为1:2～1:10，磷脂与马来酸匹杉琼的重量比为10:1～30:1，所述磷脂为甘油磷脂或鞘磷脂，选自天然磷脂、半合成磷脂以及人工合成磷脂中的一种或多种，所述梯度建立物质选自枸橼酸-枸橼酸钠溶液、酒石酸-酒石酸钠溶液、苹果酸-苹果酸钠溶液、磷酸二氢钠溶液中的一种或多种，梯度建立物质溶液的浓度为100-300mM，脂质体中加入磷酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠中的一种或多种作为pH调节剂，并通过如下方法制备：

（a）制备空白脂质体：

在50～70℃下以乙醇、乙醇-水混合溶剂作为溶媒溶解磷脂、胆固醇和可以选择性加入的亲水性高分子脂质衍生物的混合物，得到脂质混合物，磷脂重量与溶媒的体积之比按g/mL计为1:1～1:6；在此步骤中，脂质混合物还可以采用如下方法制备：在50～70℃下使用叔丁醇或叔丁醇-水混合溶剂作为溶媒溶解磷脂、胆固醇和可以选择性加入的亲水性高分子脂质衍生物的混合物，将此混合物进行冻干得到脂质混合物；

在50～70℃下将脂质混合物与浓度为100-300mM的梯度建立物质溶液混合并搅拌，得到脂质体初品；将所得的脂质体初品通过微射流、挤出、高压均质或超声减小粒径，得到空白脂质体；

（b）：建立脂质体跨膜离子梯度，获得梯度脂质体；

2.如权利要求1所述的马来酸匹杉琼脂质体，其特征在于，所述磷脂选自大豆磷脂、氢化大豆磷脂、蛋黄磷脂、氢化蛋黄磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二反式油酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二山嵛酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、单棕榈酰磷脂酰胆碱、单硬酯酰胆碱、蛋黄脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、蛋黄磷脂酰甘油、大豆磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、大豆磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二油酰磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、蛋黄鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂、大豆磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇、大豆磷脂酸、蛋黄磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸中的一种或多种。

3.如权利要求1所述的马来酸匹杉琼脂质体，其特征在于，所述脂质体中进一步含有多阴离子大分子，多阴离子大分子选自海藻酸、右旋糖酐硫酸酯、硫酸葡聚糖、聚谷氨酸、植酸、乳糖酸、果糖酸、透明质酸或它们的盐及复合物中的一种或多种。

4.如权利要求1所述的马来酸匹杉琼脂质体，其特征在于，其中进一步包含亲水性高分子脂质衍生物，所述亲水性高分子脂质衍生物选自聚乙二醇与磷脂连接形成的亲水性高分子脂质衍生物、聚乙二醇与胆固醇连接形成的亲水性高分子脂质衍生物、聚乙烯吡咯烷酮与脂质相连形成的亲水性高分子脂质衍生物，亲水性高分子脂质衍生物与磷脂的摩尔比为1:10～1:40。

5.一种药物组合物，其含有权利要求1至权利要求4中任何一项中所述的马来酸匹杉琼脂质体以及至少一种药学上可接受的附加剂。